CN117771361A

CN117771361A - 一种聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物的脂质纳米佐剂及其制备方法与应用

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Publication number: CN117771361A
Application number: CN202410214864.7A
Authority: CN
Inventors: 孟思; 刘泽; 高辉
Original assignee: Tianjin Zhongyi Anjian Biotechnology Co ltd
Current assignee: Tianjin Zhongyi Anjian Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-02-27
Filing date: 2024-02-27
Publication date: 2024-03-29
Anticipated expiration: 2044-02-27
Also published as: CN117771361B

Abstract

本发明公开了一种聚肌苷酸‑聚胞苷酸复合物的脂质纳米佐剂及其制备方法与应用。属于疫苗佐剂技术领域。聚肌苷酸‑聚胞苷酸复合物为LMW Poly I:C、HMW Poly I:C、聚肌胞注射液中的一种或几种。脂质纳米颗粒包裹通过微流体药物制备系统制备，纳米佐剂的粒径为80~300nm，PDI为0.05~0.3，能够表面结合特异性抗原蛋白。试验证明，此佐剂能降低抗原使用剂量，提高体液免疫和细胞免疫。另外，此佐剂可与皂苷类佐剂或其他佐剂物质联用，组成免疫原性更强的复合佐剂。本发明的制备工艺简单高效，易于重复和大量生产，各组分原料可全部国产化取代，制备的脂质纳米佐剂安全性高，免疫刺激效果明显。

Description

一种聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物的脂质纳米佐剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及疫苗佐剂技术领域，更具体的说是涉及一种聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物的脂质纳米佐剂及其制备方法与应用。

背景技术

佐剂，即非特异性免疫增生剂，指那些同抗原一起或预先注入机体内能增强机体对抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质。铝佐剂是目前应用最广泛的佐剂，其安全性良好，能够引起较强的体液免疫，但也存在着难以引起细胞免疫的明显劣势。因此，为了弥补铝佐剂的局限性，近年来许多新型佐剂逐渐被开发，并且被广泛用于各类疫苗研发，包括核酸类、多糖、聚合物、脂质体和免疫刺激复合物等。

脂质纳米颗粒(LNP)是一种具有均匀脂质核心的脂质囊泡，广泛用于小分子和核酸药物的递送，因其作为COVID-19 mRNA疫苗递送平台的巨大成功而备受关注。LNP的封装可以保护RNA不受细胞外RNA酶的影响，并协助RNA的胞内递送。LNP中的阳离子脂质或者可电离脂质通过静电作用与基因类药物或疫苗结合，将目的基因包裹于其核中，保护基因类药物或疫苗不被降解。在到达细胞膜时，阳离子脂质与带负电荷的细胞膜触发膜融合，细胞膜去稳定化，促进核酸分子的递送。当LNP被细胞内吞后，胞内pH值降低形成偏酸环境，此时可离子化的脂质质子化，LNP的双层结构遭受破坏，释放核酸。LNP还可以和肝细胞表面受体结合，通过细胞内吞作用释放药物，起到靶向肝细胞的目的。因此，与其他传统药物载体相比，LNP具有良好的生物相容性、能够有效帮助核酸进行转染、靶向递送、组织穿透性强、细胞毒性低等优势。

聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly I:C)简称聚肌胞，是一种人工合成的双链核糖核酸(dsRNA)，能够激活免疫细胞淋巴细胞，是一种高效的干扰素诱导剂，具有一定的抗病毒作用，此外还有调节机体免疫功能，促进人体非特异性免疫功能和某些特异性免疫功能，达到抗肝细胞坏死和抗肿瘤作用等。Poly I:C作为TLR3激动剂，可以通过不同的模式识别受体(PRR)途径激活先天免疫，促进多种效应分子的表达，如趋化因子、炎性细胞因子等，以此增强机体的免疫反应。Poly I:C通过触发TLR3通路诱导IL-12和I型IFN，而刺激RIG-1/MDA-5可增强I型IFN的产生。作为聚肌胞应用的一种，聚肌胞注射液早已被临床获批使用，用于病毒性角膜炎、单纯疱疹，慢性病毒性肝炎的辅助治疗。虽然Poly I:C具有明确的佐剂效应，但其作为佐剂单独应用时，佐剂效果并不太理想。

综上，如何提供一种效果好的Poly I:C佐剂是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物的脂质纳米佐剂及其制备方法与应用。

本发明对聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物的使用方式进行了优化，将聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物用脂质纳米颗粒包裹后，实现了胞内的高效递送，从而显著增强了佐剂效果。

本发明将脂质纳米颗粒包裹技术运用于聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物，实现了胞内的高效递送，显著提高了其作为佐剂的效果。在制备上，采用“质量比”替换“氮磷比”的参数控制，使制备步骤得到简化。此纳米佐剂粒径均一、安全稳定，采用的制备方式安全简单、产量高效，作为佐剂使用，能够表面结合特异性抗原蛋白分子，帮助疫苗产生较强的免疫效果，减少抗原的使用量，降低疫苗的生产成本。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物的脂质纳米佐剂，包括聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物和脂质纳米颗粒；

所述聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物为LMW Poly I:C、HMW Poly I:C、聚肌胞注射液中的一种或几种。

其中，LMW代表低分子量，HMW代表高分子量。

进一步的，所述聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物的分子量为0.1kb~8kb。

进一步的，所述脂质纳米颗粒包括阳离子脂质、中性脂质和胆固醇，其中阳离子脂质占脂质总摩尔数的10~70%。

进一步的，所述脂质纳米颗粒还包括PEG脂质。

进一步的，所述聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物与阳离子脂质的质量比为0.01:1~1:1。

进一步的，所述佐剂可以表面结合特异性抗原蛋白分子。

进一步的，所述佐剂的粒径为80~300nm，多分散性指数PDI为0.05~0.3，优选的，所述佐剂的粒径为90~120 nm，多分散性指数PDI在0.1以下。

其中，PDI代表聚合物分散性指数，用于描述聚合物分子量分布。

上述的佐剂的制备方法，采用微流控药物制备系统制备。

进一步的，包括如下步骤：

（1）将脂质纳米颗粒溶解在无水乙醇中，作为有机相；

（2）将聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物溶解在酸性缓冲液中，作为水相；

（3）采用微流控药物制备系统将两相进行混合；

（4）将混合液用中性缓冲液稀释后超滤浓缩，即得成品。

进一步的，所述步骤（3）中有机相和水相的体积比为1:1~1:6，可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6，优选1:3。

进一步的，所述步骤（3）的制备速度在0.1~20mL/min，可以是8 mL/min、10 mL/min、12 mL/min、14 mL/min、16 mL/min，优选12 mL/min。

进一步的，所述酸性缓冲液为醋酸钠缓冲液或柠檬酸缓冲液。

进一步的，所述酸性缓冲液的pH为3.0~5.0，优选pH=4.0。

进一步的，所述中性缓冲液为PBS缓冲液或Tris-Hcl缓冲液。

上述的佐剂在制备疫苗中的应用。

进一步的，所述疫苗包括人用疫苗、兽用疫苗。

进一步的，所述疫苗包括灭活疫苗、毒活疫苗、重组蛋白疫苗。

进一步的，所述佐剂可与皂苷类佐剂进行联用，组成复合佐剂。

进一步的，所述皂苷类佐剂为QuilA、QS-21、QS-18、QS-7或远志皂苷，优选为QS-21。

进一步的，所述皂苷类佐剂的添加量为1~1000μg/剂。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：

(1)Poly I:C是双链RNA(dsRNA)的合成类似物，是I型IFN的强诱导剂。根据其在细胞中的位置，Poly I:C可以通过不同的模式识别受体(PRR)途径激活先天免疫，其中内体Poly I:C激活TLR3，而胞质TLR3激活RIG-1/MDA-5和PKR。Poly I:C通过触发TLR3通路诱导IL-12和I型IFN，而刺激RIG-1/MDA-5可增强I型IFN的产生。Poly I:C通过诱导IL-12和I型IFN促进Th1显性免疫。虽然Poly I:C具有强大的佐剂效应，但其单独使用时，存在容易被降解的弊端，使其难以发挥充分的佐剂效应，本发明采用脂质纳米颗粒将其包裹的形式，尽可能的避免了这些弊端，并且结合脂质纳米颗粒本身的佐剂效应，大大提高了免疫效果。

(2)聚肌胞注射液是早已被国家获批的一种药品，用于病毒性角膜炎、单纯疱疹，慢性病毒性肝炎的辅助治疗。脂质纳米颗粒在mRNA疫苗上应用广泛，已被验证安全可靠。本发明使用的材料十分安全，价格低廉，能够大幅降低疫苗的生产成本。

(3)本发提供的一种包含聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物的脂质纳米佐剂，经动物试验证明，安全性良好，在降低抗原使用量的情况下，依然能保持非常高的免疫效果，表明此纳米颗粒具有强大的佐剂效应。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1制备的LNP-Poly I:C佐剂粒径分布图；

图2为本发明实施例2制备的LNP-Poly I:C佐剂粒径分布图；

图3为本发明实施例3制备的LNP-聚肌胞佐剂粒径分布图；

图4为本发明实施例7的ELISPOT斑点图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；

未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。

实施例1

一种聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物的脂质纳米佐剂，制备方法如下：

1、有机相的准备

根据所需量，将Dlin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇和PEG-DMG四种脂质按照50:10:38.5:1.5的摩尔比进行称量，混合在一起后，用无水乙醇将脂质完全溶解，即得。总脂质浓度为10mg/mL。

2、水相的准备

用柠檬酸缓冲液(50 mM，pH4.0)将LMW Poly I:C进行溶解，配制成100 μg/mL的LMW Poly I:C水溶液，即得。

3、混合

采用微流控纳米药物制备系统将两相进行混合。有机相与水相体积比为1:3，制备速度V=12 mL/min。

4、超滤浓缩

将混合液用PBS缓冲液稀释50倍后放入超滤管中，采用高速冷冻离心机进行离心，2~8℃，3000 rpm离心1小时，即得成品LNP-Poly I:C佐剂。

5、表征

使用纳米粒径检测仪检测LNP-Poly I:C佐剂的粒径和多分散性指数。

LNP-Poly I:C佐剂的粒径为85.42 nm，PDI为0.098，见附图1。

实施例2

1、有机相的准备

2、水相的准备

用柠檬酸缓冲液(50mM，pH4.0)将LMW Poly I:C进行溶解，配制成300 μg/mL的LMWPoly I:C水溶液，即得。

3、混合

4、超滤浓缩

5、表征

LNP-Poly I:C佐剂的粒径为102.9 nm，PDI为0.112，见附图2。

实施例3

1、有机相的准备

2、水相的准备

用柠檬酸缓冲液(50mM，pH4.0)将聚肌胞注射液进行稀释，配制成300 μg/mL的聚肌胞水溶液，即得。

3、混合

4、超滤浓缩

将混合液用PBS缓冲液稀释50倍后放入超滤管中，采用高速冷冻离心机进行离心，2~8℃，3000 rpm离心1小时，即得成品LNP-聚肌胞佐剂。

5、表征

使用纳米粒径检测仪检测LNP-聚肌胞佐剂的粒径和多分散性指数。

LNP-聚肌胞佐剂的粒径为94.57 nm，PDI为0.114，见附图3。

实施例4

一种聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物的脂质纳米佐剂与皂苷类物质进行联用的复合佐剂，制备方法如下：

1、聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物的脂质纳米佐剂的制备：按实施例3制备纳米佐剂。

2、QS-21溶液配制：采用PBS缓冲液将QS-21进行溶解，浓度1mg/mL。

3、复合佐剂制备：将实施例3制备的LNP-聚肌胞佐剂按聚肌胞为10μg/剂的量计算，取相应量的LNP-聚肌胞。QS-21按20μg/剂的量计算，取相应量的QS-21溶液。二者混合即得。

实施例5

免疫原性实验

以四价流感病毒亚单位疫苗为例，对包含聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物的脂质纳米佐剂进行免疫原性评价。

1、疫苗配制

10μg LNP-Poly I:C+5μg抗原组：按实施例2制备纳米佐剂，按Poly I:C为10μg/剂的量计算，取相应量的LNP-Poly I:C，与四价流感抗原(5μg H1、5μg H3、5μg BV、5μg BY)进行混合。

30μg LNP-Poly I:C+5μg抗原组：按实施例2制备纳米佐剂，按Poly I:C为30μg/剂的量计算，取相应量的LNP-Poly I:C，与四价流感抗原(5μg H1、5μg H3、5μg BV、5μg BY)进行混合。

30μg LNP-聚肌胞+5μg抗原组：按实施例3制备纳米佐剂，按聚肌胞为30μg/剂的量计算，取相应量的LNP-聚肌胞，与四价流感抗原(5μg H1、5μg H3、5μg BV、5μg BY)进行混合。

30μg聚肌胞+5μg抗原组：按聚肌胞为30μg/剂的量计算，取相应量的聚肌胞注射液，与四价流感抗原(5μg H1、5μg H3、5μg BV、5μg BY)进行混合。

0.5mg铝佐剂+5μg抗原组：按0.5mg/剂氢氧化铝计算，将氢氧化铝佐剂与四价流感抗原(5μg H1、5μg H3、5μg BV、5μg By)进行混合。

成品疫苗组：含有四价流感抗原，H1、H3、BV、BY各19μg/剂。

5μg抗原组：将四价流感抗原(5μg H1、5μg H3、5μg BV、5μg BY)进行混合。

30μg LNP-Poly I:C组：按实施例2制备纳米佐剂，按Poly I:C为30μg/剂的量计算，取相应量的LNP-Poly I:C。

30μg LNP-聚肌胞组：按实施例3制备纳米佐剂，按聚肌胞为30μg/剂的量计算，取相应量的LNP-聚肌胞。

2、疫苗粒径及多分散性指数测定

对30μg LNP-Poly I:C组、30μg LNP-聚肌胞组、10μg LNP-Poly I:C+5μg抗原组、30μg LNP-Poly I:C+5μg抗原组和30μg聚肌胞+5μg抗原组进行粒径和分散系数测定。

结果表明，各组别的粒径均在100nm左右，PDI小于0.20。因流感病毒亚单位疫苗HA的粒径约90nm，疫苗和佐剂混合后的粒径保持大小不变。

3、动物分组及免疫程序

BALB/c小鼠，雌性，6周龄，体重15~18 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。6只/组，全程只免疫1针剂，在免疫后28天对小鼠摘眼球取血，进行检测。

4、血凝抑制试验

血清分离与处理：

将采好的全血在常温下放置2小时，使用高速离心进行离心，1000 rpm，10 min。取上层血清于1.5 mL离心管中，添加相应的受体破坏酶(RDE)（血清与RDE的体积比为1:5）对血清进行非特异性处理，37℃过夜，随后转到56℃水浴30 min。

血凝抑制：

(1)稀释血清：于血凝板第1~12孔各加生理盐水25μL，然后于第1孔中加入25μL待检血清，反复吹吸3~5次混匀后，取25μL至第2孔混匀，再吸取25μ1至第3孔……，依次稀释至第12孔，最后弃去25μL，血清的稀释度为2^-1~2^-12。

(2)加抗原：于第1~12孔各加4个血凝单位的病毒悬液25μL，室温静置30 min。

(3)加红细胞：于各孔加入1%红细胞悬液25μL，室温静置30 min，观察结果。

抗体滴度及阳转率如下表所示。

结果分析：

1）与成品疫苗组相比，在降低四分之一抗原使用量的情况下，三种纳米佐剂组的抗体滴度仍然明显增强。

2）抗体滴度随纳米佐剂的剂量增加而提高，具有剂量依赖性。

3）在使用聚肌胞注射液时，纳米佐剂效应最强。同样使用剂量时，滴度高于PolyI:C组2~9倍。

4）单独使用聚肌胞注射液时，佐剂效应较弱。

5）抗原使用量为5μg时，与纳米佐剂相比，铝佐剂未表现出优势。

5、结论

聚肌胞本身具有佐剂效应，但这类产品在单独使用时，效果并不理想。在采用脂质纳米颗粒将聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物进行包裹后，形成的此类纳米佐剂与未包裹的聚肌胞和铝佐剂相比，具有明显优势。在本实施例使用剂量范围内，未见不良反应，安全性与佐剂效应良好。

实施例6

脂质纳米颗粒组分筛选实验

以四价流感病毒亚单位疫苗为例，对包含聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物的脂质纳米佐剂的脂质纳米颗粒组分进行筛选。

1、疫苗配制

含阳离子脂质组：按实施例2制备纳米佐剂，按Poly I:C为10μg/剂的量计算，取相应量的LNP-Poly I:C，与四价流感抗原(5μg H1、5μg H3、5μg BV、5μg BY)进行混合。

无阳离子脂质组：根据所需量，将DOPC脂质和胆固醇按照4:1的质量比进行称量，其余步骤按实施例2制备。按Poly I:C为10μg/剂的量计算，取相应量的LNP-Poly I:C，与四价流感抗原(5μg H1、5μg H3、5μg BV、5μg BY)进行混合。

2、疫苗粒径及多分散性指数测定

两种脂质纳米颗粒的粒径均在100nm左右，PDI小于0.20。

3、动物分组及免疫程序

4、血凝抑制试验

步骤与实施例5相同。抗体滴度及阳转率结果如下。

结果分析：

无阳离子脂质组的抗体滴度较低，且阳转率不能完全达标。

5、结论

用于包裹聚肌苷酸-聚胞苷酸的脂质纳米颗粒需含有阳离子脂质，当成分简化为传统的中性脂质与胆固醇的组合时，免疫原性较差。

实施例7

免疫原性实验

以重组带状疱疹(RZV)疫苗为例，对包含聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物的脂质纳米佐剂、与皂苷类物质进行联用的复合佐剂进行体液免疫与细胞免疫评价，进一步表明其免疫原性。

1、疫苗配制

10μg LNP-聚肌胞+50μg抗原组：按实施例3制备纳米佐剂，按聚肌胞为10μg/剂的量计算，取相应量的LNP-聚肌胞，与50μg RZV抗原进行混合。

复合佐剂+50μg抗原组：按实施例4制备复合佐剂，聚肌胞为10μg/剂，QS-21为20μg/剂，与50μg RZV抗原进行混合。

0.5mg铝佐剂+50μg抗原组：按0.5mg/剂氢氧化铝计算，将氢氧化铝佐剂与50μgRZV抗原进行混合。

50μg抗原组：50μg RZV抗原/剂。

10μg LNP-聚肌胞组：按实施例3制备纳米佐剂，按聚肌胞为10μg/剂的量计算，取相应量的LNP-聚肌胞。

DPBS组：只含有DPBS。

2、疫苗粒径及多分散性指数测定

对10μg LNP-聚肌胞组和10μg LNP-聚肌胞+50μg抗原组进行粒径和多分散性指数测定。

各组别的粒径均在100nm左右，PDI小于0.20。佐剂与50μg抗原结合前后，粒径未发生明显改变。

3、动物分组及免疫程序

C57BL/6小鼠，雌性，6周龄，体重20 g左右，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。6只/组，在0、21天进行免疫，在第二次免疫后14天对小鼠进行检测。

4、免疫原性检测

1）体液免疫

血清分离与处理：

将采好的全血在常温下放置2小时，使用高速离心进行离心，1000 rpm，10 min。取上层血清于1.5 mL离心管中，待检。

ELISA检测：

（1）包被抗原：将重组蛋白gE蛋白，使用碳酸氢钠缓冲液稀释至：200μg/mL；包被ELISA板子，100μL/孔，4℃条件下包被过夜。

（2）封闭：配制2%的牛血清白蛋白（BSA），300μL/孔，37℃条件下孵育4 h。

（3）洗板：小心揭开封板膜。弃去孔中液体，每孔加入300 μL 1×Washing Buffer，浸泡30 s，共洗板3次。

（4）稀释待测血清：将分离好的血清先用生理盐水稀释1000倍，然后进行倍比稀释，最终稀释为5.12×10⁶。100μL/孔，37℃条件下孵育1h。

（5）洗板：小心揭开封板膜。弃去孔中液体，每孔加入300 μL 1×Washing Buffer，浸泡30 s，共洗板3次。

（6）加入结合抗体：配制Streptavidin-HRP工作液：用1×Dilution Buffer将Streptavidin-HRP进行2000倍稀释，该工作液避光保存，100µL/孔(1.4µL+2.8mL)。100μL/孔，37℃条件下孵育1h。

（7）洗板：小心揭开封板膜。弃去孔中液体，每孔加入300 μL 1×Washing Buffer，浸泡30 s，共洗板3次。

（8）显色：将微孔板拍干，每孔加入100 μL Substrate Solution。用封板膜封板，室温避光孵育20 min。

（9）终止：每孔加入50 μL Stop Solution，轻轻震荡酶标板至混合均匀。

（10）读数：用酶标仪测定各孔在450 nm和630 nm波长的吸光值，请在终止后5分钟内读数。

抗体滴度如下表所示。

2）细胞免疫

分离淋巴细胞：

（1）断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1~2分钟。

（2）在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子去除小鼠脾脏，注意无菌操作。

（3）在60mm培养皿中放入4~5mL小鼠淋巴细胞分离液，用镊子把尼龙网固定在皿上，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞通过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。

（4）把悬有脾脏细胞的分离液转移到离心管中，然后覆盖上大约1mL的1640培养基。

注意：细胞悬液上面加盖1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。

如果试验者一次实验要处理大量样本（很多只小鼠）时注意，在离心之前，样本细胞浸泡在分离液中的时间不得超过1个小时。

（5）800g离心30min。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层。

（6）吸出淋巴细胞层，加入10mL 1640培养基洗涤一次，250g离心10分钟，倾倒上清液，加入3~5mL培养基重悬，细胞计数。

（7）对获得的小鼠脾脏淋巴细胞进行ELISPOT检测或者其他处理。

ELISPOT试验

刺激物：gE抗原。

检测操作：第一天：接种细胞，加入刺激物，培养（严格注意无菌操作）。

试剂配制：阳性刺激物：现配现用。培养基：含5~10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。

操作步骤：

（1）预包被板的活化：200μL/well加入RPMI-1640培养基，室温静置5~10分钟后将其扣出。

（2）加入细胞悬液：将调整好浓度的细胞悬液加入各实验孔，100μL/well。

正对照孔：细胞浓度可采用1×10⁵cells/well；

负对照孔：细胞浓度由实验者根据实验自行调整，跟实验孔保持一致；

背景负对照：加入不含细胞的重悬细胞所用的培养基；

实验孔：细胞浓度由实验者根据实验自行调整。

（3）加入刺激物：10μL/well，具体如下：

正对照孔：加入工作浓度的阳性刺激物；

负对照孔：不加阳性刺激物；

背景负对照孔：不加阳性刺激物；

实验孔：加入实验者自己的刺激物（用RPMI1640配制成10×终浓度）。

（4）孵育：所有样品和刺激物加完后，盖好板盖。放入37℃，5%CO₂培养箱静置培养16~24小时。

第二天：培养后操作（不再需要无菌操作）

试剂配制：

注意：1×工作液及显色液现配现用。

Washing Buffer（50×）：用去离子水稀释（1∶50），制成1×Washing Buffer工作液备用。

生物素标记的抗体（Biotinylated Antibody）：用Dilution Buffer R (1×)稀释（1∶100），制成1×Biotinylated Antibody工作液。

酶联亲和素（Streptavidin-HRP）：用Dilution Buffer R (1×)稀释（1∶100），制成1×Streptavidin-HRP工作液。

AEC显色液：在洁净的容器内将AEC Dilution、AEC Solution Ⅰ (20×)、AECSolution Ⅱ (20×)、AEC Solution Ⅲ (200×)按照180∶10∶10∶1的比例混匀，即为工作液。可参见下表。AEC显色液工作液室温下的半衰期约30分钟，使用时现用现配。

总体积AEC Dilution AEC Solution Ⅰ (20×) AEC Solution Ⅱ (20×) AECSolution Ⅲ (200×)

操作步骤

（1）裂解细胞：倾倒孔内细胞及培养基。加入冰冷的去离子水，200 μL/well，4℃冰箱放置10分钟低渗裂解细胞。

（2）洗板：甩出孔内液体，加入1×Washing Buffer工作液，260 μL/well，停留1分钟后弃去孔内液体，重复六次，每一次在吸水纸上扣干。

（3）检测抗体孵育：将1×Biotinylated Antibody工作液加入各实验孔，100 μL/well。37℃孵育1小时。洗板：重复步骤2。

（4）酶联亲和素孵育：将1×Streptavidin-HRP工作液加入各实验孔，100 μL/well37℃孵育1小时。

（5）洗板：甩出孔内液体，加入1×Washing Buffer工作液，260 μL/well，停留1分钟后弃去孔内液体，重复五次，

（6）每一次在吸水纸上扣干，洗涤完成后揭开板底座，用去离子水/自来水洗涤膜底面及底座，用吸水纸小心吸干底座及膜底残留的水迹，合上底座，加入1×WashingBuffer工作液，260 μL/well，停留1分钟后弃去孔内液体，彻底扣干孔内液体。

（7）显色：将现配的AEC显色液加入各实验孔，100 μL/well。室温避光静置5~30分钟，根据斑点生成情况选择终止显色时间。若室温低于20℃，建议在37℃孵箱做显色，每隔5~10分钟检查一次。

（8）终止显色：倾倒孔内液体，揭开板底座，用去离子水/自来水洗涤各实验孔正反面及底座3~5遍，终止显色。将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座。

（9）ELISPOT板斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析。

斑点数计数结果和小鼠安全性评价如下表所示。

ELISPOT斑点图见图4。

结果分析：

1）在体液免疫上，铝佐剂具有一定的免疫原性，与单纯的抗原组相比，可以使IgG值提高80倍。但是在细胞免疫上，铝佐剂未能引起细胞免疫。

2）在体液免疫上，LNP-聚肌胞佐剂组与单纯的抗原组相比，使IgG值提高了280倍，抗体滴度是铝佐剂的3.5倍。并且在细胞免疫上，LNP-聚肌胞佐剂引起了高效的免疫原性，在每孔细胞数为2×10⁵时，采用病毒刺激后，几何平均斑点数高达1145。

3）与QS-21联用形成复合佐剂后，进一步发挥其佐剂效应。免疫原性在原本基础上又提高了2倍以上。

5、结论

在采用脂质纳米颗粒将聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物进行包裹后，形成的此类纳米佐剂能够引起高效的体液免疫和细胞免疫，具有铝佐剂无法替代的明显优势。另外，如果与其他佐剂物质进行联用，还能够更好地发挥其佐剂效应。实际应用时，可根据需求选择性的使用单独的纳米佐剂或者联用其他佐剂物质。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物的脂质纳米佐剂，其特征在于，包括聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物和脂质纳米颗粒；

2.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，所述聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物的分子量为0.1kb~8kb。

3.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，所述脂质纳米颗粒包括阳离子脂质、中性脂质和胆固醇，其中阳离子脂质占脂质总摩尔数的10~70%。

4.如权利要求3所述的佐剂，其特征在于，所述聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物与阳离子脂质的质量比为0.01:1~1:1。

5.权利要求1~4任一所述的佐剂的制备方法，其特征在于，采用微流控药物制备系统制备。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将脂质纳米颗粒溶解在无水乙醇中，作为有机相；

（3）采用微流控药物制备系统将两相进行混合；

（4）将混合液用中性缓冲液稀释后超滤浓缩，即得成品。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中有机相和水相的体积比为1:1~1:6。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）的制备速度在0.1~20mL/min。

9.权利要求1~4任一所述的佐剂在制备疫苗中的应用，其特征在于，所述疫苗包括人用疫苗和兽用疫苗。