WO2023085440A1

WO2023085440A1 - 難治性ウイルス感染症の治療剤

Info

Publication number: WO2023085440A1
Application number: PCT/JP2022/042459
Authority: WO
Inventors: 道法小原; 直樹山本; 靖人田中; 悠介佐藤
Original assignee: 公益財団法人東京都医学総合研究所; 国立大学法人熊本大学
Priority date: 2021-11-10
Filing date: 2022-11-09
Publication date: 2023-05-19
Also published as: CN118215486A

Abstract

肝細胞からcccDNAを減少させる又は排除することができる、難治性ウイルス感染症の治療剤等を提供する。本発明に係る難治性ウイルス感染症治療剤は、薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体に、ポリＩ若しくはポリＩアナログ、及びポリＣ若しくはポリＣアナログを包含する複合体であって、該担体表面に肝細胞への集積能を付与する分子がコンジュゲートされた前記複合体を含有することを特徴とする。

Description

難治性ウイルス感染症の治療剤

　本発明は、難治性ウイルス感染症治療剤等に関する。

　難治性ウイルス感染症といわれるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、肝実質細胞の核内において二本鎖閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）構造で安定的に維持されることで持続感染化する（非特許文献１）。従って、感染細胞からのＨＢＶ完全排除にはｃｃｃＤＮＡの消失が必要である。これまで治療に使われていた、逆転写酵素阻害剤（核酸アナログ製剤）（非特許文献２）では、ｃｃｃＤＮＡを効果的に減少させることはできず、また、Ｐｅｇ−ＩＦＮα（非特許文献３）では、標的組織を限定できないため重篤な副反応を伴う上、ｃｃｃＤＮＡを排除することはできず、そのため、治療薬からの離脱が重要な課題となっており、ｃｃｃＤＮＡを効果的に減少させる手法は未だ確立されていない。

Ｎａｓｓａｌ　Ｍ．ＨＢＶ　ｃｃｃＤＮＡ：ｖｉｒａｌ　ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ　ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ　ａｎｄ　ｋｅｙ　ｏｂｓｔａｃｌｅ　ｆｏｒ　ａ　ｃｕｒｅ　ｏｆ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ．Ｇｕｔ．２０１５　Ｄｅｃ；６４（１２）：１９７２−１９８４Ｄｅ　Ｆｒａｇａ　ＲＳ，Ｖａｎ　Ｖａｉｓｂｅｒｇ　Ｖ，Ｍｅｎｄｅｓ　ＬＣＡ，Ｃａｒｒｉｌｈｏ　ＦＪ，Ｏｎｏ　ＳＫ．Ａｄｖｅｒｓｅ　ｅｖｅｎｔｓ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｏｓ（ｔ）ｉｄｅ　ａｎａｌｏｇｕｅｓ　ｆｏｒ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ：ａ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｒｅｖｉｅｗ．Ｊ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ　２０２０；５５：４９６−５１４．Ｃｒａｘｉ　Ａ，Ａｎｔｏｎｕｃｃｉ　Ｇ，Ｃａｍｍａ　Ｃ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｐｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ＨＢＶ．Ｊ　Ｈｅｐａｔｏｌ．２００６；４４（１　Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ７７−８３

　このような状況下において、肝細胞（肝実質細胞）からｃｃｃＤＮＡを減少させる又は排除することができる、難治性ウイルス感染症の治療剤等の開発が望まれていた。

　本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、難治性ウイルス感染症治療剤等を提供するものである。

（１）薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体に、ポリＩ若しくはポリＩアナログ、及びポリＣ若しくはポリＣアナログを包含する複合体であって、該担体表面に肝細胞への集積能を付与する分子がコンジュゲートされた前記複合体を含有する、難治性ウイルス感染症治療剤。
（２）前記肝細胞への集積能を付与する分子が、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、及びラクトースからなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（１）に記載の治療剤。
（３）前記薬物担体が、脂質ナノ粒子、カチオン性リポソーム、アテロコラーゲン、及び高分子ミセルからなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（１）又は（２）に記載の治療剤。

（４）前記ポリＩ、ポリＩアナログ、ポリＣ、及びポリＣアナログの各鎖長が、各々独立して５０~１０００塩基数の範囲内である、前記（１）~（３）のいずれか１項に記載の治療剤。
（５）前記難治性ウイルスが肝炎ウイルスである、前記（１）~（４）のいずれか１項に記載の治療剤。
（６）前記肝炎ウイルスがＢ型肝炎ウイルスである、前記（５）に記載の治療剤。
（７）医薬上許容される他のウイルス感染症治薬をさらに含む、又は、当該他のウイルス感染症治療薬と併せて用いられるものであり、好ましくは前記他のウイルス感染症治療薬が核酸アナログ製剤である、前記（１）~（６）のいずれか１項に記載の治療剤。

（８）薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体に、ポリＩ若しくはポリＩアナログ、及びポリＣ若しくはポリＣアナログを包含する複合体であって、該担体表面に肝細胞への集積能を付与する分子がコンジュゲートされた前記複合体を含有する、難治性ウイルス感染症治療用医薬組成物。
（９）医薬上許容される他のウイルス感染症治療薬をさらに含む、又は、当該他のウイルス感染症治療薬と併せて用いられるものであり、好ましくは前記他のウイルス感染症治療薬が核酸アナログ製剤である、前記（８）に記載の医薬組成物。
（１０）前記（１）~（７）のいずれか１項に記載の治療剤又は前記（８）又は（９）に記載の医薬組成物を、難治性ウイルス感染症の患者に投与することを含む、難治性ウイルス感染症の治療方法。
（１１）薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体に、ポリＩ若しくはポリＩアナログ、及びポリＣ若しくはポリＣアナログを包含する複合体であって、該担体表面に肝細胞への集積能を付与する分子がコンジュゲートされた前記複合体を含有する、ＩＦＮλ誘導剤。

（１２）肝細胞においてＩＦＮλを誘導するものである、前記（１１）に記載の誘導剤。
（１３）肝細胞に対して、前記（１１）又は（１２）に記載の誘導剤を作用させる工程を含む、ＩＦＮλ誘導方法。
（１４）薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体に、ポリＩ若しくはポリＩアナログ、及びポリＣ若しくはポリＣアナログを包含する複合体であって、該担体表面に肝細胞への集積能を付与する分子がコンジュゲートされた前記複合体を含有する、ＩＲＦ１発現亢進剤。

（１５）肝細胞においてＩＲＦ１の発現を亢進させるものである、前記（１４）に記載の亢進剤。
（１６）肝細胞に対して、前記（１４）又は（１５）に記載の亢進剤を作用させる工程を含む、ＩＲＦ１発現亢進方法。
（１７）薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体に、ポリＩ若しくはポリＩアナログ、及びポリＣ若しくはポリＣアナログを包含する複合体であって、該担体表面に肝細胞への集積能を付与する分子がコンジュゲートされた前記複合体を含有する、Ｄｏｃｋ１１発現抑制剤。

（１８）肝細胞においてＤｏｃｋ１１の発現を抑制させるものである、前記（１７）に記載の抑制剤。
（１９）肝細胞に対して、前記（１７）又は（１８）の抑制剤を作用させる工程を含む、Ｄｏｃｋ１１発現抑制方法。
（２０）ＩＦＮλ及び／又はＩＲＦ１を含む、難治性ウイルス感染症の治療剤。

（２１）ＩＦＮλ及び／又はＩＲＦ１を含む、難治性ウイルス感染症治療用医薬組成物。
（２２）ＩＦＮλ及び／又はＩＲＦ１を含む、難治性ウイルスのＤＮＡ量又はｃｃｃＤＮＡ量の低減剤。
（２３）ＩＦＮλ及び／又はＩＲＦ１を、肝細胞に作用させる、又は肝細胞において発現させることを含む、難治性ウイルスのＤＮＡ量又はｃｃｃＤＮＡ量の低減方法。
発明の効果

　本発明によれば、難治性ウイルス感染症、特に肝炎ウイルス感染症（なかでもＢ型肝炎ウイルス感染症）に対する治療剤や、治療用医薬組成物、治療方法を提供することができる。当該治療剤等は、肝細胞（肝実質細胞）からウイルス由来のｃｃｃＤＮＡを減少させる又は排除することができる点で、難治性ウイルス感染症の根治を目指すことができ、極めて有用なものである。さらに本発明によれば、当該ｃｃｃＤＮＡの減少又は排除を期待できる、ＩＦＮλ誘導剤、ＩＲＦ１発現亢進剤、Ｄｏｃｋ１１発現抑制剤等を提供することもできる。また、本発明によれば、難治性ウイルスのＤＮＡ量又はｃｃｃＤＮＡ量の低減剤や、難治性ウイルスのＤＮＡ量又はｃｃｃＤＮＡ量の低減方法を提供することもできる。

　図１：従来の肝実質細胞指向性ｐＨ応答脂質ナノ粒子の特性を示す図である。
　脂質（ＹＳＫ１３−Ｃ３／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧ＝５０／５０／３，７．５ｍＭ）が溶解した９０％　ｔｅｒｔ−ｂｕｔａｎｏｌ（ｔ−ＢｕＯＨ）溶液４００μＬにｓｉＲＮＡ　８０μｇが溶解した超純水２００μＬを混合した後、２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）２ｍＬを激しく攪拌しているところに全量注入した。Ｄ−ＰＢＳ（−）で希釈した後、限外濾過フィルターユニット（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−１５，ＭＷＣＯ　５０ｋＤａ）を用いて２５℃，１，０００ｇ，２３ｍｉｎで遠心した。Ｄ−ＰＢＳ（−）１０ｍＬ加えて再び同様の条件で遠心し、ｓｉＲＮＡ搭載の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を得た。
　ＩＣＲマウス（４週齢、雄性）にｓｉＲＮＡ搭載ＬＮＰを１~７ｍｇ　ｓｉＲＮＡ／ｋｇで静脈内投与し、２４時間後に採血し、血漿を得た。ＡＬＴ／ＡＳＴ測定キット（トランスアミナーゼＣＩＩ−テストワコー）を用い、付属プロトコールに従い、血漿中ＡＬＴ／ＡＳＴ値を測定した。
　脂質溶解した９０％　ｔｅｒｔ−ｂｕｔａｎｏｌ（ｔ−ＢｕＯＨ）溶液にＤｉＤを総脂質量の０．５ｍｏｌ％となるように加えて上述のＬＮＰ調製を行うことにより、ＤｉＤ標識ＬＮＰを得た。
　ＩＣＲマウス（４週齢、雄性）にｓｉＲＮＡ搭載ＬＮＰを１~７ｍｇ　ｓｉＲＮＡ／ｋｇで静脈内投与し、３０分後に肝臓、脾臓、肺、腎臓を採取した。各臓器を細切し、Ｍｉｃｒｏ　Ｓｍａｓｈ　ＭＳ−１００Ｒを用いて組織湿重量の１０倍量の１％ＳＤＳ溶液中でホモジナイズした。ホモジネート溶液中のＤｉＤ蛍光量をＥｎｓｐｉｒｅ　２３００　Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ　Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて測定した（励起波長：６５０ｎｍ、蛍光波長：６８０ｎｍ）。検量線から投与量当たりの各組織への移行量を算出した。
　ＩＣＲマウス（４週齢、雄性）にｓｉＲＮＡ搭載ＬＮＰを７ｍｇ　ｓｉＲＮＡ／ｋｇで静脈内投与し、３０分後に肝臓を採取した。ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ　Ｂ４をＰＢＳ（−）で５０μｇ／ｍＬになるように希釈した溶液に採取した肝臓を入れ、氷冷下、２０ｍｉｎ染色した。冷ＰＢＳ（−）で洗浄後、Ｎｉｋｏｎ　Ａ１を用いて観察した。血管を緑、ＬＮＰを青で示す。
　その結果、ＬＮＰは投与後速やかに約９０％が肝臓に集積していた（図１の左下図）。
　しかし、高用量の投与において、肝毒性を示す高値のＡＬＴとＡＳＴが認められた（図１の右上図）。
　また、ＬＮＰは肝臓内において、血管細胞にも取り込まれており、肝障害の要因となっていた（図１の右下図）。
　図２：肝障害を低減するための肝実質細胞指向性ｐＨ応答脂質ナノ粒子の改良を示す図である。
　脂質（ＹＳＫ１３−Ｃ３／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ−ＤＳＧ＝５０／５０／２．５／０．５，７．５ｍＭ）が溶解した９０％　ｔｅｒｔ−ｂｕｔａｎｏｌ（ｔ−ＢｕＯＨ）溶液４００μＬにｓｉＲＮＡ　８０μｇが溶解した超純水２００μＬを混合した後、２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）２ｍＬを激しく攪拌しているところに全量注入した（ここで、「ＧａｌＮＡｃ」は、Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅのことである。）。Ｄ−ＰＢＳ（−）で希釈した後、限外濾過フィルターユニット（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−１５，ＭＷＣＯ　５０ｋＤａ）を用いて２５℃，１，０００ｇ，２３ｍｉｎで遠心した。Ｄ−ＰＢＳ（−）１０ｍＬ加えて再び同様の条件で遠心し、ｓｉＲＮＡ搭載ＧａｌＮＡｃ修飾ＬＮＰを得た。脂質溶解した９０％　ｔｅｒｔ−ｂｕｔａｎｏｌ（ｔ−ＢｕＯＨ）溶液にＤｉＤを総脂質量の０．５ｍｏｌ％となるように加えることにより、ＤｉＤ標識ＧａｌＮＡｃ修飾ＬＮＰを得た。
　ＩＣＲマウス（４週齢、雄性）にＧａｌＮＡｃ修飾ＬＮＰを７ｍｇ　ｓｉＲＮＡ／ｋｇで静脈内投与し、２４時間後に採血し、血漿を得た。ＡＬＴ／ＡＳＴ測定キット（トランスアミナーゼＣＩＩ−テストワコー）を用い、付属プロトコールに従い、血漿中ＡＬＴ／ＡＳＴ値を測定した。
　ＩＣＲマウス（４週齢、雄性）にＤｉＤ標識ＧａｌＮＡｃ修飾ＬＮＰを７ｍｇ　ｓｉＲＮＡ／ｋｇで静脈内投与し、３０分後に肝臓を採取した。ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ　Ｂ４をＰＢＳ（−）で５０μｇ／ｍＬになるように希釈した溶液に採取した肝臓を入れ、氷冷下、２０ｍｉｎ染色した。冷ＰＢＳ（−）で洗浄後、Ｎｉｋｏｎ　Ａ１を用いて観察した。
　その結果、ＧａｌＮＡｃ修飾ＬＮＰは、血管（血管内皮細胞）への非特異な取り込みが減少し、肝実質細胞への特異性が向上した（図２の左図）。
　またＧａｌＮＡｃ修飾により血漿中ＡＬＴとＡＳＴ値の増加が認められなくなった（図２の右図）。
　図３：ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣがキメラマウスでＨＢＶ複製を抑制した結果を示す図である。
　図４：ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣがキメラマウス肝臓内ｃｃｃＤＮＡ量を低下させる結果を示す図である。
　図５：ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣがキメラマウス肝臓でＩＦＮλを誘導する結果を示す図である。
　図６：ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣが肝実質細胞においてＩＦＮλ発現を誘導する結果を示す図である。
　図７：ＩＮＦλがｃｃｃＤＮＡ量を減少させる結果を示す図である。
　図８：ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ投与によりキメラマウス肝臓内でＩＲＦ１とＩＦＮλの発現が亢進する結果を示す図である。
　図９：ＩＲＦ１がｃｃｃＤＮＡ量の減少を導く結果を示す図である。
　図１０：ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ投与キメラマウス肝臓でＤｏｃｋ１１の発現が低下している結果を示す図である。
　図１１：ＩＲＦ１がＤｏｃｋ１１の発現制御に関与していることを示す図である。
　図１２Ａ：各プロモーター解析用ベクターの構築の概要を示す図である。
　図１２Ｂ：ＩＲＦ１がＤｏｃｋ１１のプロモーター活性を制御している結果を示す図である。
　図１３：ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣとエンテカビルとの併用効果を示す図である。

　以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０２１−１８３３２９号明細書（２０２１年１１月１０日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。

１．本発明の概要
　難治性ウイルス感染症、なかでもその代表的な原因であるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、肝実質細胞の核内において二本鎖閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）構造で安定的に維持されることで持続感染化する。従って、感染細胞からのウイルス排除にはｃｃｃＤＮＡの消失が必要であるが、これまでに治療に使われている逆転写酵素阻害剤（核酸アナログ製剤）ではｃｃｃＤＮＡを効果的に減少させることはできないため、治療薬からの離脱が重要な課題となっている。本発明においては、肝実質細胞特異的に自然免疫応答を惹起することによりｃｃｃＤＮＡ量を減少させる又は排除することを目的とした。この目的を達成する方法として、まずは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ：Ｌｉｐｉｄ　ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）にｐｏｌｙ−ＩＣ（Ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｉｃ−ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）を封入した複合体を調製し、ＨＢＶが持続感染しているヒト肝臓キメラマウスに投与したところ、ウイルス量の低下は認められたが、投与量がわずかでも多すぎると強い肝障害が惹起されてしまい、実用化できるものではなかった。本発明者は、その肝障害の原因について解析を行ったところ、上記複合体が血管内皮細胞へ侵入し細胞を傷害していることが原因であることを明らかにした（図１）。そこで、本発明者は、ＬＮＰの表面に、Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（ＧａｌＮＡｃ）を導入した複合体を調製し（図２）、肝細胞表面に存在しているａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＡＳＧＰＲ）を介して、当該複合体に（ＬＮＰに）封入したｐｏｌｙ−ＩＣを特異的に肝細胞内に導入することとした（図３、図４）。その結果、肝障害を惹起すること無しに、ヒト肝臓キメラマウスに持続感染している血清中ＨＢＶ量および肝臓中ＨＢＶとｃｃｃＤＮＡを顕著に減少させることに成功した（図３、図４）。以上の結果に基づいて、かかる複合体が、難治性ウイルス感染症の治療剤として用い得ることが見出された。本発明はこのようにして完成されるに至ったものである。

　なお、本発明において、「Ｉ」はイノシン酸、「Ｃ」はシチジル酸を、それぞれ意味する。また、ポリＩアナログ、ポリＣアナログは、当業者には周知であるが、各々、効果の増強や安定性の向上などを目的として、核酸を構成する糖、核酸塩基又はリン酸バックボーンの全部又は一部が改変されたものを意味する。

２．難治性ウイルス感染症治療剤
　本発明に係る難治性ウイルス感染症治療剤（「難治性ウイルス感染症治療用医薬組成物」ともいう。以下、総称して「本発明の治療剤」という。）は、前述のとおり、薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体（以下、単に「薬物担体」という。）に、ポリＩ若しくはポリＩアナログ、及びポリＣ若しくはポリＣアナログを包含する複合体であって、薬物担体表面に肝細胞への集積能を付与する分子がコンジュゲートされた複合体（以下、「本複合体」ということがある。）を含有することを特徴とするものである。

　本発明の治療剤において、治療対象となる難治性ウイルス感染症としては、当該ウイルス感染により直接発症する炎症、症状及び疾患に限らず、その後これら炎症に起因して発症する各種症状及び疾患等も含まれる。難治性ウイルス感染症としては、限定はされないが、例えば、肝炎ウイルス感染症等が好ましく挙げられ、具体的には、肝炎に包含される各種炎症、症状、疾患や、さらには肝硬変及び各種肝癌が挙げられる。ここで、肝炎ウイルスとしては、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）等が挙げられ、詳しくは、ＨＢＶの遺伝子型としてはＣ型が、代表的なものとして挙げられる。
　本発明に用いられる「薬物担体」としては、医薬上許容され、合成ＲＮＡを包含することができ、包含された合成ＲＮＡを細胞内に移送することができるものであれば、特に限定されない。かかる薬物担体として、例えば、脂質ナノ粒子、カチオン性リポソーム、アテロコラーゲン、及び高分子ミセルを挙げることができる。

　具体的には、脂質ナノ粒子として、例えば、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｒｅｌｅａｓｅ　２６６：２１６−２２５，２０１７に記載のカチオン性脂質ＹＳＫ１３−Ｃ３（２−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｏｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ（１２Ｚ，１５Ｚ）−３−（（９Ｚ，１２Ｚ）−ｏｃｔａｄｅｃａ−９，１２−ｄｉｅｎ−１−ｙｌ）ｈｅｎｉｃｏｓａ−２，１２，１５−ｔｒｉｅｎｏａｔｅ）を含むものや、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｒｅｌｅａｓｅ　２９５：１４０−１５２，２０１９に記載のカチオン性脂質群、特にカチオン性ＣＬ４Ｈ６（７−（４−（ｄｉｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ）ｂｕｔｙｌ）−７−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｉｄｅｃａｎｅ−１，１３−ｄｉｙｌｄｉｏｌｅａｔｅ）を含むものを挙げることができる。

　また、カチオン性リポソームとして、例えば、オリゴフェクトアミン（登録商標）、リポフェクチン（登録商標）、リポフェクトアミン（登録商標）、リポフェクトアミン２０００（登録商標）、リポフェクトエース（登録商標）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（登録商標）、ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）、ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）、ＴｒａｎｓＩＴ　ＴＫＯ（登録商標）や、国際公開第９４／１９３１４号公報に開示されている薬物担体、すなわち、以下の一般式［Ｉ］で表される化合物［例えば、２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、３−Ｏ−（４−ジメチルアミノブタノイル）−１，２−Ｏ−ジオレイルグリセロール、３−Ｏ−（２−ジメチルアミノエチル）カルバモイル−１，２−Ｏ−ジオレイルグリセロール及び３−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，２−Ｏ−ジオレイルグリセロール等］とリン脂質とを必須構成成分として形成される薬物担体（以下、「本グリセロール担体」という。）を挙げることができる。

〔式［Ｉ］中、Ｒ^１、Ｒ^２は、異なって、ＯＹ、又は、−Ａ−（ＣＨ_２）ｎ−Ｅを表す。ｎは０~４の整数を表す。ここで、Ｅは、ピロリジノ、ピペリジノ、置換若しくは無置換のピペラジノ、モルホリノ、置換若しくは無置換のグアニジノ、又は下記式：

（式中、Ｒ^３、Ｒ^４は、同一又は異なって、水素、炭素数１~４の低級アルキル、炭素数１~４のヒドロキシ低級アルキル、又はモノ若しくはジ低級アルキルアミノアルキル（炭素数２~８）を表す。）で示される基を表し、Ａは、下記式：

で示されるいずれかの基（（ｉ））~（ｖｉｉ）で示されるいずれかの基）を表す。また、Ｒ、Ｙは、同一又は異なって、炭素数１０~３０の飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基、又は炭素数１０~３０の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を表す。〕

　本グリセロール担体中のリン脂質としては、医薬上許容されるリン脂質であれば特に限定されないが、具体例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、レシチン等を挙げることができる。また、水素添加されたリン脂質も挙げることができる。好ましいリン脂質としては、卵黄ホスファチジルコリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、卵黄ホスファチドを挙げることができる。これらの１種又は２種以上のリン脂質を用いることができる。

　さらに、高分子ミセルとして、例えば、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、キトサン、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）や、それらのポリエチレングリコール付加体の、いずれか１種、または２種以上の材料を任意に組み合わせて構成されるミセル等を挙げることができる。

　ポリＩアナログ、ポリＣアナログは、もとの核酸（例えばポリＩアナログならポリＩ）の機能を著しく損なわないものであれば特に限定されないが、具体例としては、ポリ（７−デアザイノシン酸）、ポリ（２’−アジドイノシン酸）、ポリ（シチジン−５’−チオリン酸）、ポリ（１−ビニルシチジル酸）、ポリ（シチジル酸、ウリジル酸）コポリマー、ポリ（シチジル酸、４−チオウリジル酸）コポリマーを挙げることができる。

　ポリＩ、ポリＩアナログ、ポリＣ、ポリＣアナログの各鎖長は、特に限定されないが、各々独立して、５０~２，０００塩基数の範囲内にあるものが適当であり、１００~６００塩基数の範囲内にあるものが好ましく、２００~５００塩基数の範囲内にあるものがより好ましい。５０塩基数未満でも、また２，０００塩基数より長くても本発明の効果を奏し得るが、場合により、５０塩基数未満では有効性に問題が生じるおそれがあり、２，０００塩基数より長いと毒性が生じるおそれがある。

　なお、ポリＩやポリＣ等の合成ＲＮＡは、通常様々な鎖長からなる一定の分布をもって存在するので、前記各鎖長は最大分布の塩基数を意味する。
　本複合体中における薬物担体と、ポリＩ及びポリＣ等の合成ＲＮＡとの構成比率は、用いる薬物担体や合成ＲＮＡの種類や鎖長、ウイルスの種類や増殖程度等によって異なるが、薬物担体１０重量部に対して、合成ＲＮＡ０．０５~１０重量部が適当であり、０．１~４重量部が好ましく、０．３~２重量部がより好ましい。

　本複合体は、薬物担体の表面に、肝細胞への集積能を付与する分子がコンジュゲートされたものである。肝細胞への集積能を付与する分子は、限定はされないが、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、及びラクトースなどが好ましく挙げられる。Ｎ−アセチルガラクトサミンは、Ｄ体（すなわち、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン）が好ましい。このように、肝細胞への集積能を付与する分子が薬物担体の表面にコンジュゲートされることにより、本複合体が血管内皮細胞に侵入し細胞を障害することを抑制することができ、肝実質細胞特異的に自然免疫応答を惹起させることができる。
　本複合体中における薬物担体と、肝細胞への集積能を付与する分子との構成比率は、用いる薬物担体や上記集積能を付与する分子の種類等によって異なるが、薬物担体１００重量部に対して、上記集積能を付与する分子０．１~３０重量部が適当であり、０．５~２０重量部が好ましく、１~１０重量部がより好ましい。

　本発明の治療剤の好ましい態様としては、薬物担体が脂質ナノ粒子である場合、カチオン性脂質、コレステロール、ＰＥＧ脂質等を必須構成成分として形成される脂質ナノ粒子に、各合成ＲＮＡの鎖長が５０~１０００塩基数（特に好ましくは１００~４００塩基数）の範囲内にある、ポリＩ若しくはポリＩアナログ及びポリＣ若しくはポリＣアナログを包含し、薬物担体表面にＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンがコンジュゲートされた複合体を含有するものを挙げることができる。

　また、本発明の治療剤の別の好ましい態様としては、薬物担体がカチオン性リポソームである場合、２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールと、リン脂質としてのレシチンとを必須構成成分として形成されるカチオン性リポソームに、各合成ＲＮＡの鎖長が５０~１０００塩基数（特に好ましくは１００~４００塩基数）の範囲内にある、ポリＩ若しくはポリＩアナログ及びポリＣ若しくはポリＣアナログを包含し、薬物担体表面にＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンがコンジュゲートされた複合体を含有するものを挙げることができる。

３．ＩＮＦλ誘導剤、ＩＲＦ１発現亢進剤、Ｄｏｃｋ１１発現抑制剤
　本発明に係るＩＮＦλ誘導剤（以下、「本発明の誘導剤」という。）は、前述のとおり、薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体に、ポリＩ若しくはポリＩアナログとポリＣ若しくはポリＣアナログとを包含を包含する複合体であって、薬物担体表面に肝細胞への集積能を付与する分子がコンジュゲートされた複合体を含有することを特徴とするものである。本発明の誘導剤は、肝細胞においてＩＦＮλを誘導するものであることが好ましい。

　本発明に係るＩＲＦ１発現亢進剤（以下、「本発明の亢進剤」という。）は、前述のとおり、薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体に、ポリＩ若しくはポリＩアナログとポリＣ若しくはポリＣアナログとを包含を包含する複合体であって、薬物担体表面に肝細胞への集積能を付与する分子がコンジュゲートされた複合体を含有することを特徴とするものである。本発明の亢進剤は、肝細胞においてＩＲＦ１の発現を亢進するものであることが好ましい。

　本発明に係るＤｏｃｋ１１発現抑制剤（以下、「本発明の抑制剤」という。）は、前述のとおり、薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体に、ポリＩ若しくはポリＩアナログとポリＣ若しくはポリＣアナログとを包含を包含する複合体であって、薬物担体表面に肝細胞への集積能を付与する分子がコンジュゲートされた複合体を含有することを特徴とするものである。本発明の抑制剤は、肝細胞においてＤｏｃｋ１１の発現を抑制するものであることが好ましい。

　ここで、本発明の誘導剤、本発明の亢進剤、及び本発明の抑制剤の各構成成分等については、上記２．項に記載の本発明の治療剤に関する説明が全て適用できる。

４．本発明の治療剤、及び本発明の誘導剤等の使用形態
　本発明の治療剤、並びに、本発明の誘導剤、本発明の亢進剤、及び本発明の抑制剤（以下、「本発明の誘導剤等」という。）は、例えば、液剤（注射剤、点滴剤等）やその凍結乾燥製剤の形態をとることができる。

　本発明の治療剤、及び本発明の誘導剤等は、医薬上許容される任意の添加剤及び賦形剤、例えば、乳化補助剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤を適当量含有していてもよい。具体的には、炭素数６~２２の脂肪酸（例、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸）やその医薬上許容される塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩）、アルブミン、デキストラン等の乳化補助剤、コレステロール、ホスファチジン酸等の安定化剤、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース等の等張化剤、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン等のｐＨ調整剤などを挙げることができる。
　また、本発明の治療剤、及び本発明の誘導剤等は、限定はされないが、医薬上許容される他のウイルス感染症治療薬等さらに含むものであってもよいし、あるいは、当該他のウイルス感染症治療薬等と併せて用いられるものであってもよい。当該他のウイルス感染症治療薬等は、本発明の治療剤、及び本発明の誘導剤等の効果を著しく損なわない範囲の量で、適宜含有する又は用いることができる。当該他のウイルス感染症治療薬等としては、限定はされないが、例えば、エンテカビル、テノホビル、ラミブジン、及びアデホビルといった核酸アナログ製剤、ＰＥＧ−ＩＦＮα、及びＰＥＧ−ＩＦＮλ、並びにそれらのプロドラッグの、１種又は２種以上を用いることができる。例えば、テノホビルのプロドラッグとしては、テノホビルアラフェナミドフマル酸塩や、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩などが挙げられる。

　本発明の治療剤、及び本発明の誘導剤等は、薬物担体ないしその原料化合物とポリＩやポリＣ等の合成ＲＮＡとを、常法により混合、攪拌、分散等を行うことにより製造することができ、例えば、脂質ナノ粒子やリポソームの一般的な製法と同様な方法により製造することができる。具体的には、薬物担体又はその原料化合物と、例えば二本鎖ポリＩ・ポリＣ（すなわちｐｏｌｙ−ＩＣ（Ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｉｃ−ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ　ａｃｉｄ））ないしは一本鎖ポリＩと一本鎖ポリＣとを、水溶液中で適当な分散機により分散処理することにより製造することができる。また、当該原料化合物をまず分散処理して薬物担体を形成し、続いて例えば二本鎖ポリＩ・ポリＣないしは一本鎖ポリＩと一本鎖ポリＣとを加え再度分散処理して製造することもできる。この際、例えば、肝細胞への集積能を付与する分子（Ｎ−アセチルガラクトサミン等）を、予め薬物担体の原料化合物となる分子とコンジュゲートしておき、それを薬物担体の形成に用いることで、形成された薬物担体の表面に肝細胞への集積能を付与する分子がコンジュゲートされた状態とすることができる。

　分散処理時の水溶液としては、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液等を挙げることができる。適当な分散機としては、例えば、ホモミキサー、ホモジナイザー、超音波分散器、超音波ホモジナイザー、高圧乳化分散機、マイクロフルイダイザー（商品名）、ナノマイザー（商品名）、アルティマイザー（商品名）、デビー（商品名）、マントン−ガウリン型高圧ホモジナイザーを挙げることができる。また、当該分散処理は、粗分散を経るなど数段階に分けて行うこともできる。

　薬物担体は、市販のものをその指示に従って用いることができ、また適当に加工して用いることもできる。
　医薬上（薬理学上）許容される任意の添加剤は、分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。

　本発明の治療剤、及び本発明の誘導剤等の凍結乾燥製剤は、常法により製造することができる。例えば、液状である本発明の治療剤、及び本発明の誘導剤等を滅菌し、所定量をバイアル瓶に分注する。次いで、約−４０℃~−２０℃の条件で予備凍結を約２時間程度行い、約０℃~１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、さらに約１５℃~２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥する。その後、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して、本発明の治療剤、及び本発明の誘導剤等の凍結乾燥製剤を得ることができる。

　本発明の治療剤、及び本発明の誘導剤等の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５~２倍量、又は５００ｍＬ以下が適当である。

　本発明の治療剤は、限定はされず、難治性のウイルス感染症を引き起こし得る各種ウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルス等への使用が考えられる。本発明の治療剤による抗ウイルス効果は、投与期間中を通して持続し得る。後述する実施例から明らかな通り、本発明の治療剤は、例えば、ヒト肝臓キメラマウスに持続感染している血清中ＨＢＶ量及び肝臓中ＨＢＶと、ｃｃｃＤＮＡとを顕著に減少させる。加えて、本発明の治療剤は、肝細胞中でのＩＦＮλの発現を誘導し、またＩＲＦ１の発現を亢進させ、さらにＤｏｃｋ１１の発現を抑制する（Ｄｏｃｋ１１の発現を低下させる）。これらの効果はいずれも、肝細胞中のｃｃｃＤＮＡ量を有意に低下させることに関係するものである。

　従って、本発明の治療剤としては、ＩＦＮλ及び／又はＩＲＦ１を含む、難治性ウイルス感染症（例えばＢ型肝炎等）の治療剤や該感染症の治療用医薬組成物も含まれ得る。
　さらに、本発明においては、難治性ウイルス（例えばＢ型肝炎ウイルス等）のＤＮＡ量やそのｃｃｃＤＮＡ量の低減剤や、ＩＦＮλ及び／又はＩＲＦ１を、肝細胞に作用させる、又は肝細胞において発現させることを含む、難治性ウイルス（例えばＢ型肝炎ウイルス等）のＤＮＡ量やそのｃｃｃＤＮＡ量の低減方法も提供される。なお、肝細胞にＩＦＮλやＩＲＦ１を作用させる方法は、特に限定はされず、肝臓ひいては肝細胞への公知の薬剤投与方法を利用することができ、また、肝細胞にＩＦＮλやＩＲＦ１を発現させる方法は、特に限定はされず、公知の遺伝子組換え技術や遺伝子導入・発現技術を利用することができる。

　本発明の治療剤、及び本発明の誘導剤等は、ヒトを含む動物に対して有効であり、特に肝細胞に対して作用させる場合に有効である。
　本発明の治療剤、及び本発明の誘導剤等の投与方法としては、例えば、静脈内投与、皮下投与、肝動脈内投与、局所投与（例、経粘膜投与、経鼻投与、吸入投与）を挙げることができる。

　本発明の治療剤、及び本発明の誘導剤等の投与量は、用いる薬物担体、合成ＲＮＡの種類や組成及び鎖長、ウイルスの種類や進行状況、患者の年齢、動物種差、投与経路、投与方法等によって異なるが、ポリＩ及びポリＣ等の合成ＲＮＡの投与量として、１回当たり通常１μｇ~５０ｍｇ／ヒトが適当であり、１０μｇ~１０ｍｇ／ヒトが好ましい。本発明の治療剤、及び本発明の誘導剤等は、１日１~３回を、連日、隔日、１週毎又は２週毎等に、１ショット投与や点滴投与等することができる。

　本発明においては、前述した本発明の治療剤を難治性ウイルス感染症の患者に投与することを含む難治性ウイルス感染症の治療方法や、難治性ウイルス感染症を治療するための本発明の治療剤の使用や、難治性ウイルス感染症を治療するための薬剤を製造するための本複合体の使用についても提供することができる。本発明の治療剤は、難治性ウイルス感染症の予防剤（予防用医薬組成物）としても用いることができる。

　本発明においては、肝細胞に対して本発明の誘導剤を作用させることを含む、ＩＮＦλ誘導方法や、肝細胞においてＩＮＦλ誘導するための本発明の誘導剤の使用や、ＩＮＦλ誘導剤を製造するための本複合体の使用についても提供することができる。

　本発明においては、肝細胞に対して本発明の亢進剤を作用させることを含む、ＩＲＦ１発現亢進方法や、肝細胞においてＩＲＦ１の発現を亢進させるための本発明の亢進剤の使用や、ＩＲＦ１発現亢進剤を製造するための本複合体の使用についても提供することができる。

　本発明においては、肝細胞に対して本発明の抑制剤を作用させることを含む、Ｄｏｃｋ１１発現抑制方法や、肝細胞においてＤｏｃｋ１１の発現を抑制するための本発明の抑制剤の使用や、Ｄｏｃｋ１１発現抑制剤を製造するための本複合体の使用についても提供することができる。

　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜方法＞
　肝実質細胞指向性の脂質ナノ粒子にｐｏｌｙ−ＩＣを封入した複合体としての「ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ」を作製した。具体的には、脂質ナノ粒子の表面にＮ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（ＧａｌＮＡｃ）を導入し、肝細胞表面に存在しているａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＡＳＧＰＲ）を介して、脂質ナノ粒子に封入したｐｏｌｙ−ＩＣを特異的に肝細胞内に導入することができる、「ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ」を作製した。ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣを、ＨＢＶ持続感染ヒト肝臓キメラマウスに静脈内投与し、肝障害性を評価すると共に、肝臓内ｃｃｃＤＮＡへの影響を検討した（図３）。さらに、キメラマウスの肝臓を用いてＲＮＡマイクロアレイ解析を実施した（図８）。ＨＢＶ持続感染初代ヒト肝細胞とＨＢＶ安定発現ＨｅｐＧ２細胞を用いて、ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣによるｃｃｃＤＮＡ量の減少機序を解析した（図９，図１０，図１１）。ｈＩＦＮＬ１プロモーター（−２０１５から＋１８６ｂｐ）とｈＤｏｃｋ１１プロモーター（−２０２２から＋１３０ｂｐ）を初代ヒト肝細胞のｇＤＮＡを鋳型としてＱ５　Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で増幅し、ｐＧＬ４．５１ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＦｉｒｅｆｌｙ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子の上流にＦｉｒｅｆｌｙ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅと融合タンパク質になるように挿入した。ＩＦＮλ１タンパク質のＮ末端５７アミノ酸、またはＤｏｃｋ１１タンパク質のＮ末端３４アミノ酸がそれぞれＬｕｃｉｆｅｒａｓｅタンパク質のＮ末端にインフレームで連結している。Ｄｏｃｋ１１プロモーター内の推定される３つのＩＲＦ１結合配列（−１２８５、−１１２１、及び−４５３ｂｐ）を欠失（ＴＴＴＣまたはＧＡＡＡ）させた変異ベクターシリーズを構築した（図１２Ａ）。ＨｕＨ７細胞（１．６ｘ１０^６　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を４８穴プレートに播種した。翌日、プロモーター／Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅベクター（２５ｎｇ／ｗｅｌｌ）はｐｈＲＬ−ＴＫ（Ｉｎｔ−）（１０ｎｇ／ｗｅｌｌ，Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にＩＲＦ１プラスミド（２５０ｎｇ／ｗｅｌｌ）またはＥｍｐｔｙプラスミドとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて導入した。４８時間後の細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）７０μＬで溶解した。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ及びＲｅｎｉｌｌａ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のプロトコールに従って、Ｆｉｒｅｆｌｙ及びＲｅｎｉｌｌａ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性をＥｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で測定した。Ｆｉｒｅｆｌｙ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性値は、Ｒｅｎｉｌｌａ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性値を用いて標準化した。Ｅｍｐｔｙプラスミド導入細胞に対するＩＲＦ１プラスミド導入細胞のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性比をグラフで示した（図１２Ｂ）。

＜結果＞
　ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣは、ヒト肝臓キメラマウスの肝臓において肝障害を呈することなく、持続感染している血清中ＨＢＶ量及び肝臓中ＨＢＶとｃｃｃＤＮＡとを顕著に減少させた（図３，図４）。
　この際、ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣは、肝細胞中でＩＦＮλの発現を誘導し、ｃｃｃＤＮＡ量を有意に減少させた（図５）。しかし、ＩＦＮβはほとんど誘導されていなかった（図５）。このＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣによるＩＦＮλ誘導は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏのＨＢＶ持続感染初代ヒト肝細胞でも同様に認められた（図６）。そこで、ＨＢＶ持続感染初代ヒト肝細胞にＩＦＮλを添加したところ、ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ投与時と同様に、当該細胞中のｃｃｃＤＮＡ量を有意に減少させた（図７）。
　ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ投与ヒト肝臓キメラマウスの肝臓のマイクロアレイ解析から、自然免疫応答に関わる多数の遺伝子発現を制御する転写因子であるＩＲＦ１とＩＦＮλの発現が亢進していることが明らかになった（図８）。そこで、ＨＢＶ安定発現ＨｅｐＧ２細胞にＩＲＦ１発現プラスミドを導入したところ、ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ投与時と同様に、ｃｃｃＤＮＡ量を有意に減少させた（図９）。さらに、ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ投与ヒト肝臓キメラマウスの肝臓のマイクロアレイ解析から、ｃｃｃＤＮＡの安定的な維持に関わるＤｏｃｋ１１の発現が低下していることを見いだした（図１０）。Ｄｏｃｋ１１の発現低下にはＩＲＦ１が関与しており（図１１）、ＩＦＮλとは異なる経路でＨＢＶのｃｃｃＤＮＡ量が抑制制御されていることが明らかとなった。すなわち、ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣにより誘導される２つのｃｃｃＤＮＡ抑制経路が判明した。また、ＩＲＦ１はＩＦＮＬ１プロモーターを活性化させた。一方、ＩＲＦ１はＤｏｃｋ１１プロモーター活性を抑制した。ＩＲＦ１結合配列を欠失させたプラスミドを用いた実験から、ＩＲＦ１はＤｏｃｋ１１プロモーターに結合することで負に制御していることが示唆された（図１２Ｂ）。

＜各図の詳細な説明＞
　上記の方法及び結果の欄において示した各図について、以下に詳細に説明する。

（１）図３
　方法：
　脂質（ＹＳＫ１３−Ｃ３／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧ＝５０／５０／３，７．５ｍＭ）が溶解した９０％　ｔｅｒｔ−ｂｕｔａｎｏｌ（ｔ−ＢｕＯＨ）溶液４００μＬにｐＩＣ（ＳＩＧＭＡ社，Ｐ１５３０）　８０μｇが溶解した生理食塩水２００μＬを混合した後、２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）２ｍＬを激しく攪拌しているところに全量注入した。Ｄ−ＰＢＳ（−）で希釈した後、限外濾過フィルターユニット（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−１５，ＭＷＣＯ　５０ｋＤａ）を用いて２５℃，１，０００ｇ，２３ｍｉｎで遠心した。生理食塩水１０ｍＬ加えて再び同様の条件で遠心した後、生理食塩水を加えて７５０μＬに調整することでｐＩＣ搭載ＬＮＰ（４ｍＭ　ｌｉｐｉｄ）を得た。総脂質量に対してそれぞれ２．５ｍｏｌ％および０．５ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＤＳＧおよびＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ−ＤＳＧを含む溶液（２０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液，１３０ｍＭ　ＮａＣｌ，２０％ＥｔＯＨ，ｐＨ６．０）７５０μＬにｐＩＣ搭載ＬＮＰを全量加え、４５℃，８００ｒｐｍ，４５ｍｉｎでＰＥＧ修飾反応を行った。Ｄ−ＰＢＳ（−）で希釈した後、再度上記と同様の条件で限外濾過を行うことでｐＩＣ搭載ＧａｌＮａｃ修飾ＬＮＰを得た。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社）を用いてＬＮＰの粒子径、多分散度指数（ＰＤＩ）およびζ電位を測定した。ｐＩＣ搭載ＧａｌＮａｃ修飾ＬＮＰは粒子径１１７ｎｍ（ζ平均）、ＰＤＩ　０．０４３、ζ電位−０．９７ｍＶであった。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ　ａｓｓａｙによるｐＩＣの回収率および封入率はそれぞれ６５．６％および９８．１％であった。
　ＨＢＶ持続感染ヒト肝臓キメラマウスに対するＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ投与試験は、（株）フェニックスバイオで実施した。
　ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰにポリＩＣを封入したＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣをＨＢＶ持続感染ヒト肝臓キメラマウスに０．０１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで１４日間連日静脈内投与した。
　ＶｅｈｉｃｌｅはＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）を投与した。
　投与から１、７、１４日目に血液を採取し、血清中のｈ−ＡＬＴとｒｃＤＮＡ（ｒｅｌａｘｅｄ　ｃｉｒｃｕｌａｒ　ＤＮＡ）を測定した。
　血清中ｈ−ＡＬＴ１濃度は，（株）特殊免疫研究所においてＥＬＩＳＡ法で測定した．
　血清中ＤＮＡはヨウ化ナトリウム法で抽出した。血清１μＬを２００μＬのＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，５００ｍＭ　２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，７５ｍＭ　ＫＣｌ，５％　Ｓａｒｃｏｓｙｌ，０．１μｇ／μＬ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｋ，ｐＨ８．０）と混合し、５５℃で２０分間加熱した。
　ＮａＩ溶液（４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ，７．６Ｍ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ，共沈剤）を３００μＬ添加し、室温で１５分静置した。アルコール混合液（４０％　Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ，６０％　１−ｂｕｔａｎｏｌ）を６００μＬ添加し、氷上で１５分間冷却した。４℃、１５，０００ｘｇで２０分間遠心し、ＤＮＡを沈殿させた。７０％　Ｅｔｈａｎｏｌで２回洗浄し、ＴＥ　ｂｕｆｆｅｒで溶解した。
　ｒｃＤＮＡは、ＨＢＶを標的とした、
　２００ｎＭ　Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＡＧＧＡＣＣ−３’（配列番号１））、
　２００ｎＭ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＡＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＧＡＧ−３’（配列番号２））、
　３００ｎＭ　Ｐｒｏｂｅ（５’ＦＡＭ−ＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣ−３’ＴＡＭＲＡ（配列番号３））を用いて、ｇＤＮＡ　２５０ｎｇ相当をＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　Ｐｒｏｂｅ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）のプロトコールに従って測定した。ｒｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲは、ＣＦＸ９５　Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて５０℃２分、９５℃１分の後、９５℃２０秒と６０℃１分のサイクルを、５４サイクルで実施した。

　結果：
　ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ投与個体の血清中ＡＬＴはＶｅｈｉｃｌｅ投与個体と有意な差は認められなかった。
　ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ投与により７日後には血清中ｒｃＤＮＡが９０％以上有意に低下した。

（２）図４
　方法：
　ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣまたはＶｅｈｉｃｌｅ投与１４日後のヒト肝臓キメラマウス肝臓内のｒｃＤＮＡとｃｃｃＤＮＡを定量した。
　凍結肝臓にＨｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（０．１４Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５）１ｍＬを加えホモジネートした。Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．３Ｍ　ＮａＣｌ、２％ＳＤＳ、０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５）１ｍＬとＰｒｏｔｅａｓｅ　Ｋ（２０ｍｇ／ｍＬ）３０μＬ添加し、３７℃で一晩消化した。ｇＤＮＡはフェノール・クロロホルム処理により分離し、エタノール沈殿で回収した。
　７０％Ｅｔｈａｎｏｌで２回洗浄し、ＴＥ　ｂｕｆｆｅｒで溶解して５０ｎｇ／μＬとした。
　５０ｎｇ／μＬのｇＤＮＡ溶液５μＬをＰｌａｓｍｉｄ−Ｓａｆｅ　ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）１０Ｕでプロトコールに従って１時間処理し、ｃｃｃＤＮＡ定量に用いた。
　ｒｃＤＮＡは、ＨＢＶを標的とした、
　２００ｎＭ　Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＡＧＧＡＣＣ−３’（配列番号１））、
　２００ｎＭ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＡＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＧＡＧ−３’（配列番号２））、
　３００ｎＭ　Ｐｒｏｂｅ（５’ＦＡＭ−ＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣ−３’ＴＡＭＲＡ（配列番号３））を用いて、ｇＤＮＡ　２５０ｎｇ相当をＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　Ｐｒｏｂｅ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）のプロトコールに従って測定した。
　ｃｃｃＤＮＡは、
　３００ｎＭ　Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＧＣＴＴＧＡＡＣ−３’（配列番号４））、
　５００ｎＭ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ａｃｇｇｇｇｃｇｃａｃｃｔｃｔｃｔｔｔａｃｇｃｇｇ−３’（配列番号５））、
　３００ｎＭ　Ｐｒｏｂｅ（５’ＦＡＭ−ＣＣＧＴＧＴＧＣＡＣＴＴＣＧＣＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＣ−３’ＴＡＭＲＡ（配列番号６））を用いて、Ｐｌａｓｍｉｄ−Ｓａｆｅ　ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＤＮａｓｅ　処理産物（全ＤＮＡ　５０ｎｇ相当）をＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　Ｐｒｏｂｅ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）のプロトコールに従って測定した。
　ｒｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲは、ＣＦＸ９５　Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて５０℃２分、９５℃１分の後、９５℃２０秒と６０℃１分のサイクルを、５４サイクルで実施した。ｃｃｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲは、５０℃２分、９５℃５分の後、９５℃２０秒と６５℃１分のサイクルを、５４サイクルで実施した。

　結果：
　ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ投与により肝臓内ｒｃＤＮＡとｃｃｃＤＮＡがそれぞれ有意に低下した。

（３）図５
　方法：
　ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣまたはＶｅｈｉｃｌｅ投与１４日後の肝臓内ＩＦＮＢ１とＩＦＮＬ１　ｍＲＮＡをそれぞれリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量した。
　凍結肝臓をＧｕａｎｉｄｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ溶液（６Ｍ　Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、３７．５ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ、０．７５％　Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ、１．４％　２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）１ｍＬでホモジネートした。
　３Ｍ　Ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅを２７μＬ添加した後、酸性飽和フェノール４００μＬと混合した。クロロホルム８０μＬを混和し１５分間氷上で冷却した後、遠心（４℃、２００００ｘｇ、２０分間）で分離させた水層２２０μＬを新しいチューブに移した。
　３Ｍ　Ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ　２２μＬと９９％　Ｅｔｈａｎｏｌ　６６０μＬとを混合し、−２０℃で２時間冷却した。遠心（４℃、２００００ｘｇ、１０分間）でＲＮＡを回収した。
　回収したＲＮＡはＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）のプロトコールに従って再精製した。
　ＩＦＮＢ１とＩＦＮＬ１　ｍＲＮＡはＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｈｓ００２７７１８８ｓ１とＨｓ００６０１６７７＿ｇ１）を用いて、ＡＢＩ　ＴａｑＭａｎ　ＥＺ　ＲＴ−ＰＣＲ　ＣＯＲＥ　ＲＥＡＧＥＮＴＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のプロトコールに従って測定した。
　内在性コントロールとしてＨｕｍａｎ　Ａｃｔｉｎ　ｂｅｔａ　ｍＲＮＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４３５２９３５Ｅ）を利用して測定値を標準化した。
　リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＣＦＸ９５　Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて５０℃２分、６０℃３０分、９５℃５分の後、９５℃２０秒と６２℃１分のサイクルを、５０サイクルで実施した。

　結果：
　ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ投与によるＩＦＮＢ１　ｍＲＮＡの発現誘導は約６倍にとどまり、低い発現レベルのままだった。
　一方、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与個体におけるＩＦＮＬ１　ｍＲＮＡは検出感度未満だったのに対してＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ投与により３．５ｘ１０^４　ｃｏｐｉｅｓ／ｕｇ　ＲＮＡまで劇的に増加した。

（４）図６
　方法：
　ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣをＨＢＶ持続感染初代ヒト肝細胞に投与し、１２時間後のＩＦＮＬ１　ｍＲＮＡを定量した。
ＨＢＶを２２日間以上持続感染させた初代ヒト肝細胞（フェニックスバイオ）にＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣを投与し、１２時間後に細胞を回収した。ＲＮＡはＲｅｌｉａＰｒｅｐ　ＲＮＡ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のプロトコールに従って抽出した。
　ｃＤＮＡはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩＩ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従って合成した。ＩＦＮＬ１　ｍＲＮＡはＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｈｓ００６０１６７７＿ｇ１）を用いて、ＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ＩＩ，ｗｉｔｈ　ＵＮＧ（Ｔｈｅｒｍｏ）のプロトコールに従って定量した。内在性コントロールとしてＨｕｍａｎ　Ａｃｔｉｎ　ｂｅｔａ　ｍＲＮＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４３５２９３５Ｅ）を利用して測定値を標準化した。
　リアルタイムＰＣＲは、ＣＦＸ９５　Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて５０℃２分、９５℃１０分の後、９５℃１５秒と６０℃１分のサイクルを、５０サイクルで実施した。

　結果：
　ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ投与量依存的にＩＦＮＬ１　ｍＲＮＡの発現が誘導されていた。

（５）図７
　方法：
　ＨＢＶ持続感染初代ヒト肝細胞をＩＦＮλ１タンパク質で１５日間処理し、ｒｃＤＮＡとｃｃｃＤＮＡを定量した。
　ＨＢＶを２２日間以上持続感染させた初代ヒト肝細胞（フェニックスバイオ）にＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＩＦＮ−ｌａｍｂｄａ　１（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培地で５日おきに培地交換し、１５日後に細胞を回収した。
　細胞内ＤＮＡはヨウ化ナトリウム法で抽出した。
　細胞を２００μＬのＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，５００ｍＭ　２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，７５ｍＭ　ＫＣｌ，５％　Ｓａｒｃｏｓｙｌ，０．１μｇ／μＬ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｋ，ｐＨ８．０）と混合し、５５℃で２０分間加熱した。ＮａＩ溶液（４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ，７．６Ｍ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ，共沈剤）を３００μＬ添加し、室温で１５分静置した。アルコール混合液（４０％　Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ，６０％　１−ｂｕｔａｎｏｌ）を６００μＬ添加し、氷上で１５分間冷却した。４℃、１５，０００ｘｇで２０分間遠心し、ＤＮＡを沈殿させた。７０％　Ｅｔｈａｎｏｌで２回洗浄し、ＴＥｂｕｆｆｅｒで溶解した。
　ｒｃＤＮＡは、ＨＢＶを標的とした、
　２００ｎＭ　Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＡＧＧＡＣＣ−３’（配列番号１））、
　２００ｎＭ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＡＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＧＡＧ−３’（配列番号２））、
　３００ｎＭ　Ｐｒｏｂｅ（５’ＦＡＭ−ＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣ−３’ＴＡＭＲＡ（配列番号３））を用いて、ｇＤＮＡ　２５０ｎｇ相当をＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　Ｐｒｏｂｅ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）のプロトコールに従って測定した。
　ｃｃｃＤＮＡは、
　３００ｎＭ　Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＧＣＴＴＧＡＡＣ−３’（配列番号４））、
　５００ｎＭ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ａｃｇｇｇｇｃｇｃａｃｃｔｃｔｃｔｔｔａｃｇｃｇｇ−３’（配列番号５））、
　３００ｎＭ　Ｐｒｏｂｅ（５’ＦＡＭ−ＣＣＧＴＧＴＧＣＡＣＴＴＣＧＣＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＣ−３’ＴＡＭＲＡ（配列番号６））を用いて、Ｐｌａｓｍｉｄ−Ｓａｆｅ　ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＤＮａｓｅ処理産物（全ＤＮＡ　５０ｎｇ相当）をＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　Ｐｒｏｂｅ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）のプロトコールに従って測定した。
　ｒｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲは、ＣＦＸ９５　Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて５０℃２分、９５℃１分の後、９５℃２０秒と６０℃１分のサイクルを、５４サイクルで実施した。ｃｃｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲは、ＣＦＸ９５　Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて５０℃２分、９５℃５分の後、９５℃２０秒と６５℃１分のサイクルを、５４サイクルで実施した。

　結果：
　ｒｃＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡ量はＩＦＮλ１タンパク質量依存的に減少した。

（６）図８
　方法：
　ＶｅｈｉｃｌｅまたはＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ（０．０１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を投与したＨＢＶ持続感染ヒト肝臓キメラマウスの肝臓からＲＮＡを抽出し、マイクロアレイ解析を実施した。
　凍結肝臓をＧｕａｎｉｄｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ溶液（６Ｍ　Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、３７．５ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ、０．７５％　Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ、１．４％　２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）１ｍＬでホモジネートした。
　３Ｍ　Ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅを２７μＬ添加した後、酸性飽和フェノール４００μＬと混合した。クロロホルム８０μＬを混和し１５分間氷上で冷却した後、遠心（４℃、２００００ｘｇ、２０分間）で分離させた水層２２０μＬを新しいチューブに移した。
　３Ｍ　Ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ　２２μＬと９９％　Ｅｔｈａｎｏｌ　６６０μＬとを混合し、−２０℃で２時間冷却した。遠心（４℃、２００００ｘｇ、１０分間）でＲＮＡを回収した。
　回収したＲＮＡはＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）のプロトコールに従って再精製した。
　マイクロアレイ解析は、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｗｈｏｌｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　ｖｅｒ．２．０（４ｘ４４ｋ　ｔｙｐｅ）で実施した。

　結果：
　ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ投与により、肝臓内ではＩＩＩ型ＩＦＮのｍＲＮＡが特異的に発現誘導されていた（ＩＦＮＬ１（ＩＬ２９）４．１、ＩＦＮＬ２（ＩＬ２８Ａ）９．９、ＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）１５．７）。なお、本実施例及び各図面において、「ＩＦＮＬ」は「ＩＦＮλ」をコードする遺伝子を意味する。
　また、ＩＲＦファミリーにおいてはＩＲＦ１　ｍＲＮＡの発現だけが誘導されていた（ＩＲＦ１４．９）。

（７）図９
　方法：
　ＨＢＶ感染感受性を付与したＨｅｐＧ２細胞（ＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ−３０細胞）にＨＢＶ遺伝子型Ｃの１．３倍長の遺伝子を導入することでＨＢＶを安定発現する細胞を作成した。
　初代ヒト肝細胞由来のＨｕｍａｎ　ＩＲＦ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ００２１９８．３）をｐＣＩ−ｎｅｏ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、ＩＲＦ１プラスミドを構築した。
　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＢＶ安定発現ＨｅｐＧ２細胞（２ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、４８穴プレート）にＩＲＦ１プラスミド（０．５μｇ／ｗｅｌｌ）をリバーストランスフェクションで導入した。
　ＥｍｐｔｙプラスミドはｐＣＩ−ｎｅｏ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒを用いた。
　ＩＲＦ１プラスミドまたはＥｍｐｔｙプラスミド（０．５μｇ／ｗｅｌｌ）を導入したＨＢＶ安定発現ＨｅｐＧ２細胞（２ｘ１０^５　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、４８穴プレート）の培養上清を用いて、プラスミドを導入していないＨＢＶ安定発現ＨｅｐＧ２細胞（２ｘ１０^５　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、４８穴プレート）を５日間連日処理した。また、ＨＢＶ安定発現ＨｅｐＧ２細胞をＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＩＦＮ−ｌａｍｂｄａ　１（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培地で５日間処理した。
　細胞内ＤＮＡはヨウ化ナトリウム法で抽出した。
　細胞を２００μＬのＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，５００ｍＭ　２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，７５ｍＭ　ＫＣｌ，５％　Ｓａｒｃｏｓｙｌ，０．１μｇ／μＬ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｋ，ｐＨ８．０）と混合し、５５℃で２０分間加熱した。
　ＮａＩ溶液（４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ，７．６Ｍ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ，共沈剤）を３００μＬ添加し、室温で１５分静置した。アルコール混合液（４０％　Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ，６０％　１−ｂｕｔａｎｏｌ）を６００μＬ添加し、氷上で１５分間冷却した。４℃、１５，０００ｘｇで２０分間遠心し、ＤＮＡを沈殿させた。７０％　Ｅｔｈａｎｏｌで２回洗浄し、ＴＥ　ｂｕｆｆｅｒで溶解した。
　ｃｃｃＤＮＡは、
　３００ｎＭ　Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＧＣＴＴＧＡＡＣ−３’（配列番号４））、
　５００ｎＭ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ａｃｇｇｇｇｃｇｃａｃｃｔｃｔｃｔｔｔａｃｇｃｇｇ−３’（配列番号５））、
　３００ｎＭ　Ｐｒｏｂｅ（５’ＦＡＭ−ＣＣＧＴＧＴＧＣＡＣＴＴＣＧＣＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＣ−３’ＴＡＭＲＡ（配列番号６））を用いて、Ｐｌａｓｍｉｄ−Ｓａｆｅ　ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＤＮａｓｅ処理産物（全ＤＮＡ　５０ｎｇ相当）をＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　Ｐｒｏｂｅ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）のプロトコールに従って測定した。
　ｃｃｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲは、ＣＦＸ９５　Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて５０℃２分、９５℃５分の後、９５℃２０秒と６５℃１分のサイクルを、５４サイクルで実施した。

　結果：
　ＩＲＦ１発現細胞において５日間でｃｃｃＤＮＡの有意な低下が認められた。一方、ＩＲＦ１発現細胞培養上清及びＩＦＮλ１処理細胞では、この期間ではｃｃｃＤＮＡは減少しなかった。

（８）図１０
　方法：
　ＶｅｈｉｃｌｅまたはＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ（０．０１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を投与したＨＢＶ持続感染ヒト肝臓キメラマウスの肝臓からＲＮＡを抽出し、マイクロアレイ解析を実施した。
　凍結肝臓をＧｕａｎｉｄｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ溶液（６Ｍ　Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、３７．５ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ、０．７５％　Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ、１．４％　２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）１ｍＬでホモジネートした。
　３Ｍ　Ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅを２７μＬ添加した後、酸性飽和フェノールを４００μＬと混合した。クロロホルム８０ｕＬを混和し１５分間氷上で冷却した後、遠心（４℃、２００００ｘｇ、２０分間）で分離させた水層２２０μＬを新しいチューブに移し、３Ｍ　Ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ　２２μＬと９９％　Ｅｔｈａｎｏｌ　６６０μＬとを混合し、−２０℃で２時間冷却した。遠心（４℃、２００００ｘｇ、１０分間）でＲＮＡを回収した。
　回収したＲＮＡはＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）のプロトコールに従って再精製した。
　マイクロアレイ解析は、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｗｈｏｌｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　ｖｅｒ．２．０（４ｘ４４ｋ　ｔｙｐｅ）で実施した。
　ｃｃｃＤＮＡの維持に重要な因子として報告されているＤｏｃｋ１１　ｍＲＮＡの発現を比較した。

　結果：
　肝細胞内のＤｏｃｋ１１　ｍＲＮＡはＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ投与により低下した。

（９）図１１
　方法：
　ＨＢＶ安定発現ＨｅｐＧ２細胞（ＨｅｐＧ２．２．１５細胞）にＩＲＦ１発現プラスミドまたはＥｍｐｔｙプラスミドを導入し、４８時間後のＤｏｃｋ１１　ｍＲＮＡを定量した。
　ＩＲＦ１プラスミド（０．５μｇ／ｗｅｌｌ）またはｐＣｌ−ｎｅｏプラスミドをＨｅｐＧ２．２．１５細胞（２ｘ１０^５　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、４８穴プレート）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてリバーストランスフェクションで導入し、４８時間後に細胞を回収した。
　ＲＮＡはＲｅｌｉａＰｒｅｐ　ＲＮＡ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のプロトコールに従って抽出した。
　Ｈｕｍａｎ　Ｄｏｃｋ１１の測定は、１００ｎｇのＲＮＡに
　３００ｎＭ　Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＴＧＧＡＧＡＴＴＴＴＴＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣ−３’（配列番号７））と
　３００ｎＭ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＡＧＡＣＣＴＣＴＴＣＡ−３’（配列番号８））
を加え、ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）のプロトコールに従って実施した。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＣＦＸ９５　Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて９０℃３０秒、６１℃２０分、９５℃１分の後、９５℃１５秒と７４℃３０秒のサイクルを、４５サイクルで実施した。
　３００ｎＭ　Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴＣＧＣＣＴＴ−３’（配列番号９））と
　３００ｎＭ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＣＴＴＧＣＡＣＡＴＧＣＣＧＧＡＧ−３’（配列番号１０））
を用いて内在性コントロールとしてＨｕｍａｎ　Ａｃｔｉｎ　ｂｅｔａ　ｍＲＮＡを測定することで、Ｄｏｃｋ１１の値を標準化した。

　結果：
　ＩＲＦ１発現によりＤｏｃｋ１１　ｍＲＮＡの発現が低下した。

（１０）図１２Ａ
　方法：
　ｈＩＦＮＬ１プロモーター（−２０１５から＋１８６ｂｐ）とｈＤｏｃｋ１１プロモーター（−２０２２から＋１３０ｂｐ）を初代ヒト肝細胞のｇＤＮＡを鋳型としてＱ５　Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で増幅し、ｐＧＬ４．５１ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＦｉｒｅｆｌｙ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子の上流にＦｉｒｅｆｌｙ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅと融合タンパク質になるように挿入した。
　ＩＦＮλ１タンパク質のＮ末端５７アミノ酸、またはＤｏｃｋ１１タンパク質のＮ末端３４アミノ酸がそれぞれＬｕｃｉｆｅｒａｓｅタンパク質のＮ末端にインフレームで連結している。
　Ｄｏｃｋ１１プロモーター内の推定される３つのＩＲＦ１結合配列（−１２８５、−１１２１、及び−４５３ｂｐ）を欠失（ＴＴＴＣまたはＧＡＡＡ）させた変異ベクターシリーズを構築した。

（１１）図１２Ｂ
　方法：
　ＨｕＨ７細胞（１．６ｘ１０^６　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を４８穴プレートに播種した。
　翌日、プロモーター／Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅベクター（２５ｎｇ／ｗｅｌｌ）はｐｈＲＬ−ＴＫ（Ｉｎｔ−）（１０ｎｇ／ｗｅｌｌ，Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にＩＲＦ１プラスミド（２５０ｎｇ／ｗｅｌｌ）またはＥｍｐｔｙプラスミドとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて導入した。
　４８時間後の細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）７０μＬで溶解した。
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ及びＲｅｎｉｌｌａ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のプロトコールに従って、Ｆｉｒｅｆｌｙ及びＲｅｎｉｌｌａ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性をＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で測定した。
　Ｆｉｒｅｆｌｙ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性値は、Ｒｅｎｉｌｌａ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性値を用いて標準化した。
　Ｅｍｐｔｙプラスミド導入細胞に対するＩＲＦ１プラスミド導入細胞のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性比をグラフで示した。

　結果：
　ＩＲＦ１はＩＦＮＬ１プロモーターを活性化させた。一方、ＩＲＦ１はＤｏｃｋ１１プロモーターの活性を抑制した。ＩＲＦ１結合配列を欠失させたプラスミドを用いた実験から、ＩＲＦ１はＤｏｃｋ１１プロモーターに結合することで負に制御していることが示唆された。

＜考察＞
　ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣは、ヒト肝臓キメラマウス肝臓細胞において肝障害を惹起すること無しに、ＩＦＮλを効果的に誘導する自然免疫誘導剤であることが示された。また、ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣはＩＲＦ１の発現を亢進させ、ＩＦＮλ誘導を含む複数の経路でＨＢＶのｃｃｃＤＮＡ量を効果的に減少させていると考えられた。従って、本発明の治療剤に係るＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣは、難治性ウイルス感染症治療剤、特にＢ型肝炎の治療剤として有用なものであることが実証された。同時に、ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣは、特に肝細胞における、ＩＦＮ−λ誘導剤、ＩＲＦ１発現亢進剤、及びＤｏｃｋ１１発現抑制剤としても有用なものであることが実証された。

　実施例１において作製した「ＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ」と、Ｂ型慢性肝炎治療用の逆転写酵素阻害剤の一つである「エンテカビル」（一般名：エンテカビル水和物；ブリストル・マイヤーズスクイブ社製）との併用による、ＨＢＶのｒｃＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡの減少効果を確認した。

＜方法＞
　ＨＢＶ持続感染初代ヒト肝細胞を、エンテカビル（ＥＴＶ）１ｎＭのみ（単剤）、あるいはエンテカビル（ＥＴＶ）１ｎＭとＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣ　０．１ｎｇ／ｍＬとの併用で、３日おきに培地交換しながら１５日間処理し、１５日後に細胞を回収し、ｒｃＤＮＡとｃｃｃＤＮＡを定量した（図１３の上の図を参照）。
　細胞内ＤＮＡはヨウ化ナトリウム法で抽出した。
　細胞を２００μＬのＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，５００ｍＭ　２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，７５ｍＭ　ＫＣｌ，５％　Ｓａｒｃｏｓｙｌ，０．１μｇ／μＬ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｋ，ｐＨ８．０）と混合し、５５℃で２０分間加熱した。ＮａＩ溶液（４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ，７．６Ｍ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ，共沈剤）を３００μＬ添加し、室温で１５分静置した。アルコール混合液（４０％　Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ，６０％　１−ｂｕｔａｎｏｌ）を６００μＬ添加し、氷上で１５分間冷却した。４℃、１５，０００ｘｇで２０分間遠心し、ＤＮＡを沈殿させた。７０％　Ｅｔｈａｎｏｌで２回洗浄し、ＴＥ　ｂｕｆｆｅｒで溶解した。

　ｒｃＤＮＡは、ＨＢＶを標的とした、
　２００ｎＭ　Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＡＧＧＡＣＣ−３’（配列番号１））、
　２００ｎＭ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＡＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＧＡＧ−３’（配列番号２））、
　３００ｎＭ　Ｐｒｏｂｅ（５’ＦＡＭ−ＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣ−３’ＴＡＭＲＡ（配列番号３））を用いて、ｇＤＮＡ　２５０ｎｇ相当を、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　Ｐｒｏｂｅ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）のプロトコールに従って測定した。
　ｃｃｃＤＮＡは、
　３００ｎＭ　Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＧＣＴＴＧＡＡＣ−３’（配列番号４））、
　５００ｎＭ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（５’−ａｃｇｇｇｇｃｇｃａｃｃｔｃｔｃｔｔｔａｃｇｃｇｇ−３’（配列番号５））、
　３００ｎＭ　Ｐｒｏｂｅ（５’ＦＡＭ−ＣＣＧＴＧＴＧＣＡＣＴＴＣＧＣＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＣ−３’ＴＡＭＲＡ（配列番号６））と、Ｐｌａｓｍｉｄ−Ｓａｆｅ　ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＤＮａｓｅ処理産物（ＤＮＡ　５０ｎｇ相当）をＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　Ｐｒｏｂｅ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて定量した。

　ｒｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲは、ＣＦＸ９５　Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて５０℃２分、９５℃１分の後、９５℃２０秒と６０℃１分のサイクルを、５４サイクルで実施した。ｃｃｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲは、ＣＦＸ９５　Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて５０℃２分、９５℃５分の後、９５℃２０秒と６５℃１分のサイクルを、５４サイクルで実施した。

＜結果＞
　図１３（下の２つのグラフ）に示すとおり、ｒｃＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡ量は、エンテカビル単剤よりも、エンテカビル（ＥＴＶ）１ｎＭとＧａｌＮＡｃ−ＬＮＰ／ｐＩＣとの併用により効果的に減少した。特にｃｃｃＤＮＡ量は、併用による減少効果が著しかった。

　配列番号１：合成ＤＮＡ
　配列番号２：合成ＤＮＡ
　配列番号３：合成ＤＮＡ
　配列番号４：合成ＤＮＡ
　配列番号５：合成ＤＮＡ
　配列番号６：合成ＤＮＡ
　配列番号７：合成ＤＮＡ
　配列番号８：合成ＤＮＡ
　配列番号９：合成ＤＮＡ
　配列番号１０：合成ＤＮＡ

Claims

　薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体に、ポリＩ若しくはポリＩアナログ、及びポリＣ若しくはポリＣアナログを包含する複合体であって、該担体表面に肝細胞への集積能を付与する分子がコンジュゲートされた前記複合体を含有する、難治性ウイルス感染症治療剤。
　前記肝細胞への集積能を付与する分子が、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、及びラクトースからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の治療剤。
　前記薬物担体が、脂質ナノ粒子、カチオン性リポソーム、アテロコラーゲン、及び高分子ミセルからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の治療剤。
　前記ポリＩ、ポリＩアナログ、ポリＣ、及びポリＣアナログの各鎖長が、各々独立して５０~１０００塩基数の範囲内である、請求項１~３のいずれか１項に記載の治療剤。
　前記難治性ウイルスが肝炎ウイルスである、請求項１~４のいずれか１項に記載の治療剤。
　前記肝炎ウイルスがＢ型肝炎ウイルスである、請求項５に記載の治療剤。
　医薬上許容される他のウイルス感染症治療薬をさらに含む、又は、当該他のウイルス感染症治療薬と併せて用いられるものであり、好ましくは前記他のウイルス感染症治療薬が核酸アナログ製剤である、請求項１~６のいずれか１項に記載の治療剤。
　薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体に、ポリＩ若しくはポリＩアナログ、及びポリＣ若しくはポリＣアナログを包含する複合体であって、該担体表面に肝細胞への集積能を付与する分子がコンジュゲートされた前記複合体を含有する、難治性ウイルス感染症治療用医薬組成物。
　医薬上許容される他のウイルス感染症治療薬をさらに含む、又は、当該他のウイルス感染症治療薬と併せて用いられるものであり、好ましくは前記他のウイルス感染症治療薬が核酸アナログ製剤である、請求項８に記載の医薬組成物。
　請求項１~７のいずれか１項に記載の治療剤又は請求項８又は９に記載の医薬組成物を、難治性ウイルス感染症の患者に投与することを含む、難治性ウイルス感染症の治療方法。
　薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体に、ポリＩ若しくはポリＩアナログ、及びポリＣ若しくはポリＣアナログを包含する複合体であって、該担体表面に肝細胞への集積能を付与する分子がコンジュゲートされた前記複合体を含有する、ＩＦＮλ誘導剤。
　肝細胞においてＩＦＮλを誘導するものである、請求項１１に記載の誘導剤。
　肝細胞に対して、請求項１１又は１２に記載の誘導剤を作用させる工程を含む、ＩＦＮλ誘導方法。
　薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体に、ポリＩ若しくはポリＩアナログ、及びポリＣ若しくはポリＣアナログを包含する複合体であって、該担体表面に肝細胞への集積能を付与する分子がコンジュゲートされた前記複合体を含有する、ＩＲＦ１発現亢進剤。
　肝細胞においてＩＲＦ１の発現を亢進させるものである、請求項１４に記載の亢進剤。
　肝細胞に対して、請求項１４又は１５に記載の亢進剤を作用させる工程を含む、ＩＲＦ１発現亢進方法。
　薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体に、ポリＩ若しくはポリＩアナログ、及びポリＣ若しくはポリＣアナログを包含する複合体であって、該担体表面に肝細胞への集積能を付与する分子がコンジュゲートされた前記複合体を含有する、Ｄｏｃｋ１１発現抑制剤。
　肝細胞においてＤｏｃｋ１１の発現を抑制させるものである、請求項１７に記載の抑制剤。
　肝細胞に対して、請求項１７又は１８の抑制剤を作用させる工程を含む、Ｄｏｃｋ１１発現抑制方法。
　ＩＦＮλ及び／又はＩＲＦ１を含む、難治性ウイルス感染症の治療剤。
　ＩＦＮλ及び／又はＩＲＦ１を含む、難治性ウイルス感染症治療用医薬組成物。
　ＩＦＮλ及び／又はＩＲＦ１を含む、難治性ウイルスのＤＮＡ量又はｃｃｃＤＮＡ量の低減剤。
　ＩＦＮλ及び／又はＩＲＦ１を、肝細胞に作用させる、又は肝細胞において発現させることを含む、難治性ウイルスのＤＮＡ量又はｃｃｃＤＮＡ量の低減方法。