TW201723178A

TW201723178A - 具拮抗ｐｄｌ１功能的適體分子於癌症治療之應用

Info

Publication number: TW201723178A
Application number: TW105127972A
Authority: TW
Inventors: 楊泮池; 賴薇云; 黃舶滄
Original assignee: 中央研究院; 國立臺灣大學
Priority date: 2015-09-01
Filing date: 2016-08-31
Publication date: 2017-07-01
Also published as: EP3344772A4; US20180258431A1; US10584341B2; WO2017040620A1; CN108026533A; CN108026533B; EP3344772A1; EP3344772B1; TWI721008B

Abstract

本發明係關於結合並拮抗PDL1的適體，以及其在增強免疫活性(例如促進T細胞增生)、治療癌症及/或感染性疾病方面的用途，感染性疾病為諸如腸病毒、HBV或HCV感染所致的感染。

Description

具有拮抗PDL1功能的適體分子於癌症治療之應用

相關申請案的交叉引用

本申請案請求於2015年9月1日提申之名為「ANTAGONISTIC PDL1 APTAMERS AND THEIR APPLICATIONS IN CANCER THERAPY」的美國臨時申請第62/212,772號的申請日權益，其整體內容以引用的方式併入本文。

免疫系統是一種由數個免疫檢查點路徑(immune checkpoint pathway)所調節的複雜信號網路，其涉及免疫細胞上的共刺激分子和共抑制分子，它們會阻止自身反應性和過度活化的信號傳遞。程式性細胞死亡-1蛋白(PD-1)是一個檢查點分子，其在感染的發炎性反應時抑制周邊組織中的T細胞活性，從而限制T細胞自體免疫性。

PD-1主要表現於T細胞上，且其表現在T細胞活化期間受到誘導。除了 T細胞，PD-1也表現於其他免疫細胞(例如B細胞、樹突細胞、天然殺手細胞和巨噬細胞)上。當被其配體之一(如程式性死亡配體1(PDL1))結合時，PD-1透過磷酸酶SHP1和SHP2來抑制參與T細胞活化的激酶，例如PI3K和AKT。此外，PD-1：PDL1的接合已顯示會抑制T細胞葡萄糖消耗、下調細胞介素釋放，並抑制T細胞增生。

PDL1表現於抗原呈現細胞(APC)上，抗原呈現細胞包括B細胞、樹突細胞和巨噬細胞。此外，已經在各種類型的癌細胞上檢測到PDL1表現，包括實體腫瘤(如非小細胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、乳癌、結腸癌、胰臟癌、胃癌)以及血液惡性病(如急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病與其他)。癌細胞上的PDL1過度表現可能是透過增加PD-1：PDL1交互作用而導致腫瘤免疫逃避，這顯著地損害T細胞功能。同樣地，PDL1表現與癌症患者治療結果以及在臨床環境中的總體存活成反比。因此，需要干擾PD-1：PDL1交互作用並拮抗PD-1細胞內信號傳遞路徑的新穎治療劑，例如適體。

適體是能夠形成二級結構或甚至複雜三維結構，並對靶蛋白具有特異性結合活性的短核酸(DNA或RNA)分子。適體技術自1990年代初期發現以來進展極大。適體具有若干使它們適於治療應用的優點，包括分子量較低(這使得與抗體相比更容易穿透組織)、化學合成費用低、已建立的修飾方法和穩定性高。因此，開發對靶蛋白具有高親和力的合適適體是非常有意義的。

本案所揭示內容是以開發抗PDL1核酸適體為基礎，該抗PDL1核酸適體在活體外成功阻止PD-1和PDL1之間的交互作用並且在活體內抑制腫瘤生長。

因此，本案所揭示內容的一個態樣特徵在於結合PDL1並中和PDL1之抑制活性的核酸適體(抗-PDL1適體)。本案所揭示內容的任一核酸適體的長度可以為30-62個核苷酸(nt)。

在一些具體例中，核酸適體包含具有核苷酸序列5'-CGGGCCACAT-3'(SEQ ID NO：1)的核酸基序。此一抗PDL1適體可包含與ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT(SEQ ID NO：2)至少85%(例如至少90%，至少95%或以上)一致的核酸序列。在一個實例中，核酸適體包含SEQ ID NO：2的核酸序列。在另一個實例中，核酸適體由SEQ ID NO：2的核酸序列組成。

在其他具體例中，核酸適體可包含與以下至少85%(例如，至少90%，至少95%或更高)一致的核酸序列：(i)ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT(SEQ ID NO：2)；(ii)CACTCAATAATTCCACTGCTACATACGTTT(SEQ ID NO：3)；(iii)AAACTAGGGTCCATTTGTGTACCTGCGA(SEQ ID NO：4)；(iv)ACATCAACTTGATAGACAACTGCGTCCACT(SEQ ID NO：5)；(v)CATCTGGTACCTTACGACGCTTCATCTCCC(SEQ ID NO：6)；(vi)CATGTTTTCGAAAGACAATCCGCTGCCCTG(SEQ ID NO：7)；或(vii)CATGTTCCTTTCGTTCTGCCTTTTCCTTCC(SEQ ID NO：8)。

在一些具體例中，核酸適體包含SEQ ID NO：2-8中任一者的核酸序列。在其他具體例中，核酸適體由SEQ ID NO：2-8中任一者的核酸序列組成。

本案所揭示內容的另一態樣特徵在於醫藥組成物，其包含本文所述的任一抗PDL1適體以及醫藥上可接受的載劑。

在又另一個態樣中，本案所揭示內容提供一種用於治療癌症(例如黑色素瘤、非小細胞肺癌、結腸直腸癌或腎細胞癌)的方法，包含向有治療需要的個體投予有效量的任一本文所述醫藥組成物。在一些具體例中，個體可以是患有癌症、疑似患有癌症或處於癌症風險下的人類患者，例如本文所述者。

在另一個態樣中，本案所揭示內容提供一種治療感染性疾病的方法，包含向有需要的個體投予有效量的任一本文所述醫藥組成物。在一些具體例中，個體可以是患有感染或疑似患有感染的人類患者(感染為例如由腸病毒、HBC、HCV、HAV、HDV或HEV所致的感染)。

此外，本案所揭示內容提供一種在治療需要的個體中增強免疫活性的方法，該方法包含向有需要的個體投予有效量(例如有效提高T細胞活化)的含任一抗PDL1適體的本文所述醫藥組成物。

亦在本案所揭示內容範疇內的是(a)用於治療癌症(例如，肺癌、黑色素瘤、結腸直腸癌，或腎細胞癌)，或感染性疾病(如腸病毒、HBV、HCV、HAV、DV或HEV感染)的醫藥組成物，其中該醫藥組成物包含任一本文所述的抗PDL1適體與醫藥上可接受的載劑；以及(b)抗PDL1適體在製備用於治療癌症(如本文所述癌症)或感染性疾病(如本文所述彼等疾病)的藥物中的用途。

在下面說明中闡述本發明一或多個實施例的詳細內容。由下面附圖和幾個實施例的詳細說明，還有從隨附的申請專利範圍，本發明的其他特徵或優點將會是清楚的。

圖1是顯示經由SELEX選擇結合至PDL1的核酸適體的過程示意圖。在該例示性示意圖中，顯示用於篩選人類PDL1靶向適體的硝基纖維素濾膜SELEX方法。

圖2是顯示候選適體(包括AP14、AP22、AP32、AP33、AP36和AP48)對PDL1的相對結合能力的圖。

圖3是一個圖表，描繪用於在競爭分析中阻斷PDL1和PD-1交互作用的候選PDL1適體的效力。

圖4包括顯示AP14(左圖)和AP32(右圖)作為PDL1拮抗適體的50%有效劑量(ED₅₀)。AP14的ED₅₀為41nM(左圖)。AP32的ED₅₀為12nM(右圖)。

圖5包括顯示一個62-nt(左圖，SEQ ID NO：9)、一個45-nt(中圖，SEQ ID NO：2)，和一個30-nt(右圖，SEQ ID NO：10)抗-PDL1適體的序列和二級結構的圖。使用Mfold預測每個適體的二級結構。

圖6是表示使用競爭分析，抗PDL1適體(圖5的62-nt，45-nt以及30-nt)阻斷PD-1：PDL1交互作用的效力。

圖7包括數據的圖形呈現，顯示AptPDL1對A549(左上圖)和HOP92(右上圖)人類癌細胞的結合能力，其分別顯示出高的和低的PDL1表現水平。作為對照，顯示了抗PDL1抗體對A549(左下圖)和HOP92(右下圖)人類癌細胞的結合能力。

圖8包括數據的圖形呈現，顯示AptPDL1對CT26(左上圖)和LL/2(右上圖)小鼠癌細胞的結合能力，其分別顯示出高的和低的PDL1表現水平。作為對照，顯示了抗PDL1抗體對CT26(左下圖)和LL/2(右下圖)小鼠癌細胞的結合能力。

圖9包括數據的圖形呈現，顯示aptPDL1對CT26(左圖)和LL2(右圖)小鼠癌細胞的解離常數。

圖10是顯示使用同基因小鼠模型，aptPDL1在活體內對CT26結腸直腸癌細胞的抑制效果的圖。當用透過瘤內注射投予的aptPDL1治療小鼠時，數據顯示腫瘤生長抑制約50%。

圖11是顯示使用同基因小鼠模型，aptPDL1在活體內對CT26結腸直腸癌細胞的抑制效果的抑制效果的圖(左圖)。當用透過腹膜內注射投予的aptPDL1治療小鼠時，數據顯示腫瘤生長抑制約73%。來自用aptPDL1(底排腫瘤)或對照隨機序列(頂排腫瘤)治療的小鼠的腫瘤圖像(右圖)顯示在右圖中。

圖12是顯示使用同基因小鼠模型，aptPDL1在活體內對LL/2肺癌細胞的抑制效果的圖(上圖)。數據顯示，腹膜內投予aptPDL1的連續給藥導致接種LL/2的小鼠有顯著的腫瘤抑制效應。來自用aptPDL1(底排腫瘤)或對照隨機序列(頂排腫瘤)治療的小鼠的腫瘤圖像(下圖)顯示在下圖中。

圖13是顯示使用活體外細胞生存力分析，aptPDL1對抗CT26(左圖)和LL/2(右圖)的細胞毒性的圖。數據顯示aptPDL1對CT26(左)和LL/2(右)癌細胞沒有直接的細胞毒性。

圖14是顯示IFNγ與趨化因子CXCL9/10/11在經aptPDL1處理的CT26(左圖)和LL/2(右圖)腫瘤中之表現水平的圖。IFNγ和趨化因子CXCL9/10/11表現水平是使用從組織中萃取並透過逆轉錄定量PCR定量RNA來測定。數據顯示在經aptPDL1處理的CT26(左)和LL/2(右)腫瘤中的IFNγ、CXCL9、CXCL10，和CXCL11的水平升高。

圖15是顯示趨化因子CXCL9/10/11在經aptPDL1處理的CT26和LL/2腫瘤中的表現水平的免疫墨點。使用從組織和蛋白質特異性抗體萃取的蛋白質測定趨化因子CXCL9/10/11的表現水平。進行β肌動蛋白水平的分析作為對照。數據顯示在經aptPDL1處理的CT26(左)和LL/2(右)腫瘤中CXCL9、CXCL10和CXCL11的水平升高。

圖16包括顯示經對照和aptPDL1治療的腫瘤中的CD31陽性腫瘤內微血管螢光圖，以及腫瘤內微血管密度量化圖。A：顯示用對照適體(左)和aptPDL1(右)治療的小鼠中，CD31-陽性腫瘤內微血管螢光影像訊號的照片。B：定量圖A中所示的螢光影像訊號的圖。數據顯示在經aptPDL1治療的組別中，CD31陽性腫瘤內微血管的長度和密度均顯著降低。

PDL1，免疫抑制受體PD-1的配體，表現於許多實體腫瘤上。PDL1：PD-1的接合會觸發免疫抑制路徑並損害免疫細胞的抗腫瘤活性。本文提供的拮抗PDL1適體可以阻斷PDL1和PD-1之間的交互作用並誘導免疫細胞的抗腫瘤活性。

大部分針對PDL1的靶向治療劑是單株抗體。與抗體和其他基於蛋白質的傳統藥物相比，本文提供之基於核酸的PDL1靶向適體具有更高的穩定性和更低的大規模合成費用。此外，PDL1適體易於進行化學修飾以提高生物可用度和穩定性，但批次效應很少。

如本文所述的適體可以是核酸分子(例如單鏈DNA或RNA)，其可在生理條件下形成特定二級和三級結構。本文所述的例示性PDL1拮抗適體(aptPDL1)是一個有45個核苷酸長的DNA寡核苷酸，其透過Mfold預測形成兩個柄-環結構(圖5)。aptPDL1對PDL1的解離常數為約5nM，指出aptPDL1以比PD1蛋白(對PDL1的解離常數為770nM)高出許多的親和力結合至PDL1。aptPDL1顯示在活體外使用競爭分析中能有效地防止PD-1結合PDL1。aptPDL1阻斷PD-1：PDL1交互作用的50%有效劑量(ED₅₀)為約12nM。在同基因小鼠模型中，腫瘤內和腹膜內注射aptPDL1顯著抑制表現PDL1的CT26結腸直腸腫瘤的生長。此外，腹膜內投予aptPDL1的連續給藥導致在LL/2鼠同基因腫瘤模型中有明顯腫瘤抑制效用。

本文提供的結果表明，抗PDL1適體(例如aptPDL1)是PDL1拮抗單株抗體的有前景替代品。基於核酸的治療劑(如抗PDL1適體(例如aptPDL1))在合成、穩定性和患者耐受性方面有優勢。適體可以容易地透過化學反應合成，與抗體合成相比，其費用更低、批次效應更低且純度更高。適體可以粉末形式保存，而不會喪失藥物功效和穩定性。此外，基於核酸的治療劑(例如基於DNA或RNA的治療劑)在動物研究和臨床前試驗中已顯示毒性很低且免疫原性低。

抗PDL1適體(如aptPDL1)可靶向細胞表面上的PDL1細胞外結構域。與靶向細胞內SHP1和SHP2磷酸酶結構域的小化學藥物或降解PDL1 mRNA的siRNA相比，這種適體分子將具有更高的靶可接近性。此外，抗PDL1適體可以容易地修飾以增加對PDL1的親和力和特異性、抵抗在血流中的內切或外切核酸酶的降解，並延長在循環系統中的血清半衰期。要達到一或多個此類目的之基於核酸的分子的合適修飾是本技術中已知的或本文揭示的。例如，抗PDL1適體(如aptPDL1)的可行修飾可以包括在抗PDL1適體的5'-或3'-端引入官能基、將經修飾鹼基引入核苷酸序列，及/或修飾相鄰核苷酸間的鍵結鍵。

因此，本揭示內容是以開發許多抗PDL1核酸適體並且透過例示性抗PDL1適體成功抑制PD-1/PDL1交互作用為基礎。如本文所揭示，抗PDL1適體(例如aptPDL1)當在接種有CT26結腸直腸癌細胞或LL/2肺癌細胞的小鼠體內腫瘤內或腹膜內投予時能顯著降低腫瘤的生長。因此，抗PDL1適體(如本文所述者)將有效地增強免疫活性和預防腫瘤生長，從而提供對癌症的有效治療。這樣的抗PDL1適體也可有效抑制感染，因此有益於治療感染性疾病(例如腸病毒或HBV感染)。

因此，本文所述為抗PDL1適體、包含抗PDL1適體的醫藥組成物，以及使用本文揭示的抗PDL1適體增強免疫活性及/或治療疾病(例如癌症和感染性疾病)的方法。

抗PDL1適體

本文揭示結合至PDL1並抑制其活性，從而增強免疫活性(例如T細胞活性)的核酸適體(抗-PDL1適體)。因此，本文揭示的抗PDL1適體將會是癌症和感染性疾病的有益治療。

如本文所用的核酸適體是指對特定靶分子(例如PDL1)具有結合活性的核酸分子(DNA或RNA)。適體可以結合至特定靶分子，從而經由例如阻斷靶分子結合至同源配體、造成靶分子的構形改變及/或阻斷靶分子的活性中心來抑制靶分子的活性。本案所揭示內容的抗PDL1適體(呈線性或環狀形式)可以是RNA、DNA(例如單股DNA)、經修飾核酸，或其混合物。抗PDL1適體可以是非天然分子(例如含有的核苷酸序列不存在於天然基因中或含有自然界不存在的經修飾核苷酸)。或者或另外，抗PDL1適體可以不含有編碼功能肽的核苷酸序列。

PDL1，指程式性死亡配體1蛋白(也稱為CD274或B7-H1)，是一種在抑制免疫系統中扮演重要角色的細胞表面蛋白，例如在懷孕、組織同種異體移植、自體免疫疾病，感染和癌症期間。PDL1結合至其受體PD-1，PD-1表現於活化的T細胞、B細胞和骨髓細胞上以調節活化或抑制。在人類中，PDL1由CD274基因編碼。人類PDL1的例示性胺基酸序列可以按照GenBank登錄號NP_001254635找到。

本文所揭示的抗PDL1核酸適體可以包含具有「5-CGGGCCACAT-3」(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列的核酸基序。SEQ ID NO：1的基序預期是與PDL1交互作用並阻斷其與PD-1交互作用的關鍵結構域。因此，含有該基序的核酸分子預期是如本文所述的抗PDL1適體。包含SEQ ID NO：1基序的抗PDL1核酸適體可包含一個與ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT(SEQ ID NO：2)至少85%(例如90%、95%或98%)一致的核苷酸序列，其中SEQ ID NO：1的基序(motif)加底線。在SEQ ID NO：1的基序外的任何殘基處可以發生高達15%的變化。在一些具體例中，抗PDL1核酸適體可包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列。在一些具體例中，抗PDL1核酸適體由SEQ ID NO：2組成。

在其他實例中，本文揭示的抗PDL1核酸適體可包含與以下至少85%(例如90%、95%或98%)一致的核苷酸序列： ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT(SEQ ID NO：2)，CACTCAATAATTCCACTGCTACATACGTTT(SEQ ID NO：3)，AAACTAGGGTCCATTTGTGTACCTGCGA(SEQ ID NO：4)，ACATCAACTTGATAGACAACTGCGTCCACT(SEQ ID NO：5)，CATCTGGTACCTTACGACGCTTCATCTCCC(SEQ ID NO：6)，CATGTTTTCGAAAGACAATCCGCTGCCCTG(SEQ ID NO：7)，或CATGTTCCTTTCGTTCTGCCTTTTCCTTCC(SEQ ID NO：8)。

本文揭示的此抗PDL1核酸適體可包含以下核苷酸序列或由其組成：ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT(SEQ ID NO：2)，CACTCAATAATTCCACTGCTACATACGTTT(SEQ ID NO：3)，AAACTAGGGTCCATTTGTGTACCTGCGA(SEQ ID NO：4)，ACATCAACTTGATAGACAACTGCGTCCACT(SEQ ID NO：5)，CATCTGGTACCTTACGACGCTTCATCTCCC(SEQ ID NO：6)，CATGTTTTCGAAAGACAATCCGCTGCCCTG(SEQ ID NO：7)，或CATGTTCCTTTCGTTCTGCCTTTTCCTTCC(SEQ ID NO：8)。

兩個核酸的「一致性百分比」是使用Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68,1990，如在Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77,1993中經修改的演算法來決定。此演算法併入至Altschul,et al.J.Mol.Biol.215：403-10,1990的NBLAST和XBLAST程式(2.0版)中。BLAST核苷酸搜尋可以用NBLAST程式來進行，得分=100，字長-12，以獲得與本發明核酸分子同源的核苷酸序列。當兩個序列之間存在空位時，如Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402,1997中所述使用Gapped BLAST。當使用BLAST和Gapped BLAST程式時，可以使用各個程式的預設參數(例如XBLAST和NBLAST)。

在其他具體例中，本文所述的抗PDL1適體相較於參考序列可含有至多8個(例如最多7、6、5、4、3、2，或1個)核苷酸變化，如SEQ ID NO：1-8中的任一者。可以引入此等變化的位置可以基於例如適體的二級結構來決定，而適體的二級結構是使用電腦演算法來進行預測，如Mfold。作為一個實例，可引入這種變化的位置可以基於以下的二級結構來決定：TCCCTACGGCGCTAACACATCAACTTGATAGACAACTGCGTCCACTGCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO：9)、ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT(SEQ ID NO：2)，或CACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCC(SEQ ID NO：10)，如圖5中所示。舉例來說，在雙股柄區中的鹼基對可能突變成不同的鹼基對。這種突變將使得鹼基對維持在該位置的雙股區內，並因此對適體的整體二級結構沒有顯著影響。這種類型的突變是習於技術者熟知的。例如，A-T對可以突變成T-A對。或者，其可以突變為G-C或C-G對。在另一個實例中，G-C對可以突變成C-G對。或者，其可以突變成A-T對或T-A對。

本文揭示的任一抗PDL1適體可含有約30-80個核苷酸(nt)的長度。在一些具體例中，包含一個核酸基序的核酸適體是大約40-80個nt、40-65個nt、40-62個nt、50-80個nt、60-80個nt，或70-80個nt。在一些具體例中，包含一個核酸基序的核酸適體是大約30-70個nt、30-65個nt、30-62個nt、30-60個nt、30-50個nt，或30-40個nt。在一些特定實例中，抗PDL1適體的長度範圍可以在約50個nt至約60個nt內。

一般來說，術語「約」和「大約」是指經技術中具有通常技術者確定的特定值的可接受誤差範圍內。「約」可以表示少於給定值的±30%、較佳少於±20%、更佳少於±10%、更佳少於±5%，且又更佳少於±1%的範圍。

在一些具體例中，本文所述抗PDL1適體可以低於20nM的解離常數(Kd) 結合至PDL1(例如人類PDL1)(例如15nM、10nM、5nm、1nm或更少)。抗PDL1適體可以特異性結合人類PDL1。或者，適體可以結合至不同物種(例如人類和小鼠)的PDL1分子。當結合至表現於細胞表面上的PDL1分子時，此一適體可抑制PDL1活性(因而增加T細胞活性)達至少20%(例如40%、50%、80%、100%、2倍、5倍、10倍、100倍或1,000倍)。抗PDL1適體對PDL1的抑制活性(並因此在提高T細胞活性方面的活化)可以透過本技術中已知的方法來進行測定，已知的方法為例如T細胞增生分析，其先前已描述過，例如在Clay T.M.,et al.,Assays for Monitoring Cellular Immune Responses to Active Immunotherapy of Cancer,Clin Cancer Res.,May 2001,7,1127中；其相關教示以引用的方式併入本文。應當理解，本文提供用於測量T細胞活性的方法是例示性的，並不意味著限制。

下面提供了許多例示性抗PDL1適體：

aptPDL1：ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT(SEQ ID NO：2)

AP14： TCCCTACGGCGCTAACCACTCAATAATTCCACTGCTACATACGTTTGCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO：11)

AP22： TCCCTACGGCGCTAACAAACTAGGGTCCATTTGTGTACCTGCGAGCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO：12)

AP32： TCCCTACGGCGCTAACACATCAACTTGATAGACAACTGCGTCCACTGCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO：9)

AP33： TCCCTACGGCGCTAACCATCTGGTACCTTACGACGCTTCATCTCCCGCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO：13)

AP36： TCCCTACGGCGCTAACCATGTTTTCGAAAGACAATCCGCTGCCCTGGCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO：14)

AP48： TCCCTACGGCGCTAACCATGTTCCTTTCGTTCTGCCTTTTCCTTCCGCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO：15)

在上述例示性抗-PDL1適體中，5'-和3'-端的斜體區是5'和3'引子區(參見下面的實例1)，其可以被替換或修飾而對這些適體的PDL1結合活性沒有顯著影響。

在一些具體例中，本文所述的任一抗PDL1適體可含有非天然核鹼基、糖或共價核苷間鍵結(骨架)。這種經修飾的寡核苷酸賦予期望性質，例如，細胞攝入增強、對靶核酸的親和力增進，以及活體內穩定性增加。

在一個實例中，本文所述適體具有經修飾的骨架，包括彼等保有磷原子者(參見例如美國專利第3,687,808號；第4,469,863號；第5,321,131號；第5,399,676號；以及第5,625,050號)，與彼等不具有磷原子者(參見例如美國專利第5,034,506號；第5,166,315號；以及第5,792,608號)。含磷經修飾骨架的實例包括，但不限於具有3’-5’鍵結或2’-5’鍵結的硫代磷酸酯、對掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基-磷酸三酯、磷酸甲基酯與其他磷酸烷基酯(包括3’-磷酸伸烷基酯、5’-磷酸伸烷基酯與對掌性磷酸酯)、亞磷酸酯、胺基磷酸酯(包括3’-胺基磷酸酯與胺基烷基胺基磷酸酯)、硫羰代胺基磷酸酯、硫羰代烷基磷酸酯、硫羰代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯，以及硼烷磷酸酯。此等骨架也包括彼等具有相反極性者，亦即3’至3’、5’至5’或2’至2’鍵結。不包括磷原子的經修飾骨架是由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵結，混合雜原子與烷基或環烷基核苷間鍵結，或一或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵結所形成。此等骨架包括彼等具有嗎啉基鍵結者(部分由核苷的糖部分所形成)；矽氧烷骨架；硫化物；亞碸和碸骨架；甲醯乙醯基(formacetyl)和硫代甲醯乙醯基骨架；亞甲基甲醯乙醯基和硫代甲醯乙醯基骨架；核糖乙醯基骨架；含烯骨架；胺基磺酸酯骨架；亞甲基亞胺基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺醯胺骨架；醯胺骨架；以及其他具有混合的N、 O、S和CH2組成部分的骨架。

在另一個實例中，本文所述適體包括一或多個經置換糖部分。此等經置換糖部分可在其2’位置處包括下列基團之一：OH；F；O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基；O-炔基、S-炔基、N-炔基及O-烷基-O-烷基。在這些基團中，烷基、烯基及炔基可以是未經置換或經置換C1至C10烷基或C2至C10烯基與炔基。它們也可以在其2’位置處包括雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經置換矽烷基、RNA切割基團、報導子基團、嵌入劑、增進寡核苷酸之藥動學特性的基團，或增進寡核苷酸之藥效學特性的基團。較佳的經置換糖部分包括彼等具有2’-甲氧基乙氧基、2’-二甲基胺基氧基乙氧基，及2’-二甲基胺基乙氧基乙氧基者。參見Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504。

另外或此外，本文所述適體包括一或多個經修飾天然核鹼基(亦即腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)。經修飾核鹼基包括彼等描述於美國專利第3,687,808號中者。Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley & Sons,1990、Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613，以及Sanghvi,Y.S.,Chapter 15,Antisense Research and Applications,pages 289-302,CRC Press,1993。這些核鹼基中的某一些尤其適用於增加適體分子對其靶位點的結合親和力。這些包括5-經置換的嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6與O-6經置換嘌呤(例如2-胺基丙基-腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶與5-丙炔基胞嘧啶)。參見Sanghvi,et al.,eds.,Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)。

另外或此外，如本文所述的抗PDL1適體可包含一或多個鎖定核酸(LNA)。通常稱為不可接近RNA的LNA是經修飾RNA核苷酸，其中核糖部分用連接2'氧和4'碳的額外橋修飾。這種橋「鎖定」3'-內(北)構形的核糖，其通常在A型雙螺旋中發現。LNA核苷酸可用於本文所述的任一抗PDL1適體中。在一些實例中，在抗PDL1適體中高達50%(例如40%、30%、20%，或10%)的核苷酸是LNA。在一些實例中，抗PDL1適體可包含10、8、6、5、4、3、2或1個LNA。

任一本文所述適體可藉由習知方法製備，例如化學合成或活體外轉錄。如本文所述，其所期望的生物活性可經例如彼等描述於下面實例中者來進行驗證。用於表現任一抗-PDL1適體的載體也落在本揭示內容的範疇內。

任一本文所述適體可經由共價鍵結、非共價鍵結或兩者接合至一或多個聚醚部分，諸如聚乙二醇(PEG)部分。因此，在一些具體例中，本文所述適體經聚乙二醇化。本揭示內容不是要限制特定分子量的PEG部分。在一些具體例中，聚乙二醇部分具有範圍自5kDa至100kDa、10kDa至80kDa、20kDa至70kDa、20kDa至60kDa、20kDa至50kDa，或30kDa至50kDa的分子量。在一些實例中，PEG部分具有40kDa的分子量。接合至本文所述抗PDL1適體的PEG部分可以是線性或具分支。其可接合至核酸適體的5’端、適體的3’端或兩者。若需要的話，PEG部分可以共價接合至核酸適體的3’端。

將PEG部分接合至核酸的方法為技術中已知且先前已描述於例如PCT公開案第WO 2009/073820號中，其相關教示以引用的方式併入本文中。應理解，本文所述接合PEG的核酸適體以及用於將PEG接合至核酸適體的方法為例示性且無意為限制性。

醫藥組成物

如本文所述一或多個抗-PDL1適體，或其PEG接合物可與醫藥上可接受之載劑(賦形劑)混合而形成醫藥組成物，用於治療目標疾病。「可接受」表示載劑必須是與組成物的活性成分相容(且較佳能夠穩定活性成分)並對待治療個體無害。醫藥上可接受之賦形劑(載劑)包括技術中所熟知的緩衝劑。參見例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover。

使用於本發明方法中的醫藥組成物可包含醫藥上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑，呈凍乾調配物或水溶液的形式。參見例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)。可接受的載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量與濃度下對接受者來說無毒，且可包含緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽與其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸與甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基芣基氯化銨；氯化六甲双銨；氯化芐二甲烴銨、氯化本索寧；苯酚、丁基或芣基醇；對羥苯甲酸烷基酯，諸如對羥苯甲酸甲基酯或對羥苯甲酸丙基酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及m-甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸，或離胺酸；單糖、雙糖，及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或右旋糖；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬複合物(例如Zn-蛋白複合物)；及/或非離子性界面活性劑，諸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

在一些實例中，本文所述醫藥組成物包含含有PDL1結合適體(或用於生成該適體的載體)的脂質體，其可藉由技術中所熟知的方法製備，諸如描述於Epstein,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；以及U.S.專利第4,485,045號與第4,544,545號中者。具有循環時間提高的脂質體描述於美國專利第5,013,556號中。尤其適用的脂質體可以使用含有磷脂醯膽鹼、膽固醇與PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂質組成物藉由逆相蒸發法來生成。脂質體被擠壓穿過具有限定孔隙之過濾器，產生具有期望直徑的脂質體。

如本文所述抗-PDL1適體亦可陷入於製備的微膠囊中(例如分別藉由凝聚技術或藉由介面聚合作用(例如羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚-(甲基甲基丙烯酸酯)微膠囊)、於膠體藥物投遞系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或巨乳液中。此等技術為技術中所熟知，參見例如Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing(2000)。

在其他實例中，本文所述醫藥組成物可調配成持續釋放形式。持續釋放製品的適當實例包括含有PDL1結合適體之固體疏水性聚合物的半通透性基質，該基質是呈有形物品的形式(例如薄膜或微膠囊)。持續釋放基質的實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯基醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與7-麩胺酸乙基酯的共聚物、非可分解性乙烯-乙酸乙烯酯、可分解性乳酸-乙醇酸共聚物，諸如LUPRON DEPOTTM(乳酸-乙醇酸共聚物和柳菩林(leuprolide)乙酸酯組成的可注射微球)、蔗糖乙酸異丁酸酯，及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。

使用於活體內投予的醫藥組成物必須是無菌的。此為透過例如濾過無菌濾膜而輕易達到。治療性PDL1結合適體組成物可以放置在具有無菌出入口的容器(例如靜脈內溶液袋或具有可被皮下注射針頭穿刺之擋塞的小管)。

本文所述醫藥組成物可以呈諸如錠劑、丸劑、膠囊、粉劑、顆粒、溶液或懸浮液，或栓劑的單位劑型，供用於經口、非經口或直腸投予，或是藉由吸入或吹入投予。

關於製備固體組成物(諸如錠劑)，主要活性成分可與醫藥載劑混合以形成含有本發明化合物之均勻混合物的固體預調配組成物，或其醫藥上可接受之無毒鹽，醫藥載劑為例如習知製錠成分，諸如玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或膠，以及其他醫藥稀釋劑，例如水。當提到這些預調配組成物為均勻時，表示活性成分平均分散在組成物中，使得組成物可容易分成等效單位劑型，諸如錠劑、丸劑與膠囊。此固體預調配組成物接而被分成上述類型的單位劑型，含有0.1至約500mg本發明活性成分。新穎組成物的錠劑或丸劑可經包覆或以其他方式經化合而提供給予延長作用益處的劑型。例如，錠劑或丸劑可包含內劑量以及外劑量組分，後者呈包覆前者的包衣形式。兩種組分可被在胃中耐受崩解並允許內組分完整通過進入十二指腸或延遲釋放的腸衣層所分隔。此腸衣層或包衣可使用各種材料，諸如包括一些聚合酸及聚合酸與如蟲膠、十六醇及乙酸纖維素之材料的混合物。

適當表面活性劑尤其包括非離子性試劑，諸如聚氧乙烯山梨糖醇(例如Tween^TM 20、40、60、80或85)以及其他山梨糖醇(例如Span^TM 20、40、60、80或85)。具有表面活性劑的組成物將習知地包含0.05%與5%表面活性劑，且可介於0.1%與2.5%。應理解，若需要的話可添加其他成分，例如甘露糖醇或其他醫藥上可接受媒劑。

可使用商業可購得脂質乳液來製備適當乳液，脂質乳液為諸如Intralipid^TM、Liposyn^TM、Infonutrol^TM、Lipofundin^TM及Lipiphysan^TM。活性成分可溶解於預先混合的乳液組成物中或者其可溶解於油(例如大豆油、葵花油、棉仔油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中，在與磷脂(例如蛋磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合之後形成乳液。應理解，可添加其他成分來調整乳液的張力，其他成分為例如甘油或葡萄糖。適當乳液通常含有至多20%油，例如5%與20%之間。脂質乳液可包含脂質小滴，具有適當大小且具有範圍在5.5至8.0的pH。

乳液組成物可以是藉由將抗-PD-1適體與Intralipid^TM或其組分(例如大豆油、蛋磷脂、甘油與水)混合來製備者。

用於吸入或吹入的醫藥組成物包括於醫藥上可接受水性或有機溶劑或其混合物中的溶液及懸浮液，及粉劑。液體或固體組成物可含有上列適當醫藥上可接受之賦形劑。在一些具體例中，用於局部或全身性效用的組成物是藉由經口或鼻呼吸路徑投予。

較佳於無菌醫藥上可接受溶劑中的組成物可以藉由使用氣體而被霧化。可直接從噴霧裝置吸入霧化溶液或可將霧化裝置附接到面罩、遮棚或間歇式正壓呼吸器。溶液、懸浮液或粉劑組成物較佳經口或經鼻自以適當方式遞送調配物的裝置投予。

治療方法

如本文所述任一抗-PD-1適體或其PEG接合物可用來提高免疫活性，尤其是促進T細胞增生，從而有效治療癌症或諸如病毒性(例如腸病毒、HBV、HCV、HAV、HDV或HEV)感染或細菌感染的感染性疾病。

為實施本文揭示的方法，有效量之含有至少一種抗-PDL1適體的本文所述醫藥組成物可經由適當途徑被投予給有治療需要的個體(例如人類)，適當途徑為諸如靜脈內投予(例如快速推注)或經由連續輸注一段時間、藉由肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、經口、吸入或局部路徑。用於液體調配物的商用噴霧器包括可用於投予的噴射噴霧器以及超音波噴霧器。液體調配物可直接被霧化而凍乾粉末可以在還原之後被霧化。或者，如本文所述含有抗-PDL1適體的組成物可使用氟碳調配物及計量計量吸入器被氣溶膠化，或者如凍乾且研磨的粉末被吸入。

如本文所用，「有效量」意指各活性劑對個體賦予治療效用所需的數量，不論是單獨或與一或多種其他活性劑組合。在一些具體例中，治療效用為降低腫瘤負荷、減少癌細胞，或增加免疫活性。決定何量PDL1結合適體達到治療效用對於習於技術者來說將會是明顯的。如技術中具有通常技術者所認知，有效量會改變，取決於待治療的特定病況、病況的嚴重性、個別患者參數(包括年齡、身體狀況、身高、性別與體重)、治療持續時間、現有治療(若有的話)的特性、特定投予路徑及健康從業人員知識與專業內的類似因素。這些因素為技術中彼等具有通常技術者所熟知且可在不超出慣常實驗的情況下獲得處理。通常較佳為使用個別組分或其組合的最大劑量，其依據周全醫學判斷為最高安全劑量。

經驗上的考量(諸如半衰期)通常有助於劑量的決定。可決定投予頻率並隨著治療過程而調整，且大體上(但非必須)是基於治療及/或抑制及/或改善及/或延遲目標疾病/病症。或者，PDL1結合適體的持續連續釋放調配物可能是適合的。用於達到持續釋放的各種調配物及裝置在技術中是熟知的。

在一個實例中，如本文所述抗PDL1適體在個體中的劑量可以按經驗來決定，該等個體經給予一或多次PDL1結合適體投予。給予個體的拮抗劑劑量漸增。為評估拮抗劑的效力，可追蹤疾病/病症的指標。

大體上，就投予本文所述抗PDL1適體來說，初始候選劑量可為約2mg/kg。就本揭示內容之目的而言，典型日劑量範圍約0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg，至30mg/kg至100mg/kg或更多中任一者，取決於上述因素。就重複投予數日或更久，持續治療直到發生期望症狀抑制或直到達到充分治療程度以減輕目標疾病或病症或其症狀為止，端視病況而定。例示性給藥方案包含投予約2mg/kg的初始劑量，接著每週約1mg/kg PDL1結合適體的維持劑量，或著接著每隔一週約1mg/kg的維持劑量。但是，亦可採用其他劑量方案，取決於從業人員希望達到的藥動學衰退型態而定。例如，預計一週給藥一至四次。在一些具體例中，可採用範圍自3μg/mg至約2mg/kg(諸如約3μg/mg、約10μg/mg、約30μg/mg、約100μg/mg、約300μg/mg、約1mg/kg，及約2mg/kg)的給藥。在一些具體例中，給藥頻率為為每週、每2週、每4週、每5週、每6週、每7週、每8週、每9週，或每10週一次；或每個月、每2個月，或每3個月或更久一次。此治療的進程可簡單地透過習知技術及分析進行監控。給藥方案(包括所用PDL1結合適體)可隨著時間而有所改變。

在一些具體例中，就具有正常體重的成人患者來說，可投予範圍自約0.3至5.00mg/kg的劑量。具體劑量方案(亦即劑量、時間安排及重複)將取決於特定個體以及個體病史，還有個別藥劑的特性(諸如藥劑半衰期，以及其他在技術中所熟知的考量因素)。

就本揭示內容之目的，如本文所述PDL1結合適體的適當劑量將取決於特定PDL1結合適體、疾病/病症的類型與嚴重性、PDL1結合適體是因為預防或治療目的而投予、先前治療、患者的臨床病史以及對拮抗劑的反應，和參與臨床醫師的斟酌而定。臨床人員可投予PDL1結合適體直至達到期望結果之劑量。在一些具體例中，期望結果為腫瘤負荷降低、癌細胞減少或免疫活性增加。決定劑量是否造成期望結果的方法對於習於技術者來說是明顯的。可連續或間歇投予一或多個PDL1結合適體，取決於例如接受者的生理狀況、投予目的為治療或預防，以及其他習於技術的操作人員所熟知的因素。投予PDL1結合適體基本上可為在預選時間段裡連續或者是呈連續間隔劑量，例如在目標疾病或病症長成之前、期間或之後。

如本文所用，術語「治療」意指對個體施用或投予包括一或多種活性劑的組成物，該個體患有目標疾病或病症、該疾病/病症的症狀，或有罹患該疾病/病症的傾向、目的是要治癒、治療、減輕、緩解、改變、治療、改善、增進或影響病症、疾病症狀，或罹患該疾病或病症的傾向。

減輕目標疾病/病症包括延遲疾病生成或進展，或降低疾病嚴重性。減輕疾病不一定需要治療結果。如本文所用，「延遲」目標疾病或病症生成表示推遲、阻礙、減緩、延遲、穩定/或延緩疾病的進展。這個延遲可以是時間長度的改變，取決於待治療疾病及/或個體的病史而定。「延遲」或減輕疾病生成，或延遲疾病發生的方法是當與未使用該方法相比時，在一個給定時間框內降低生成該疾病的一或多個症狀的可能性及/或在給定時間框內降低症狀程度的方法。此等比對通常是基於臨床研究，使用一些足以提供統計上顯著結果的個體。

疾病的「生成」或「進展」表示疾病的初始病徵及/或之後的進展。可使用如技術中所熟知的標準臨床技術來偵測疾病的生成並予以評估。但是，生成也意指不能被偵測到的進展。就本揭示內容之目的，生成或進展意指症狀的生物過程。「生成」包括發生、復發或出現。如本文所用，目標疾病或病狀的「出現」或「發生」包括起初出現及/或復發。

在一些具體例中，本文所述PDL1結合適體呈在活體內足以降低腫瘤負荷或癌細胞生長達至少5%(例如10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高)的數量被投予給有治療需要的個體。在其他具體例中，PDL1結合適體呈有效降低PDL1活性水平達至少5%(例如10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高)的數量被投予。在其他具體例中，PDL1結合適體呈有效增加免疫活性達至少5%(例如10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高)的數量被投予。

醫學領域中具有通常技術者所熟知的習知方法可用來將醫藥組成物投予給個體，取決於待治療疾病類型或疾病部位。這個組成物也可以經由其他習知路徑被投予(例如經口、非經口、藉由吸入噴霧、局部、直腸、經鼻、頰內、陰道或經由植入貯器投予)。術語「非經口」如本文所用包括皮下、皮內、靜脈內、肌肉內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞘內、病灶內及顱內注射或輸注技術。此外，可經由可注射貯器投予路徑投予給個體，諸如使用1-、3-或6-個月貯器可注射或生物分解材料及方法。在一些實例中，醫藥組成物經眼內或經玻璃體內投予。

可注射組成物可含有各種載劑，諸如植物油、二甲基乙醯胺、二甲基甲醯胺、乙酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、乙醇，及多元醇(甘油、丙二醇、液體聚乙二醇，與類似物)。關於靜脈內注射，可藉由滴注方法投予水溶性PDL1結合適體，從而輸注含有PDL1結合適體及生理學上可接受賦形劑的醫藥調配物。生理學上可接受的賦形劑可包括例如5%右旋糖、0.9%食鹽水、林格氏溶液或其他適當賦形劑。肌肉內製品(例如適當可溶鹽形式之PDL1結合適體的無菌調配物)可溶解於諸如注射用水、0.9%食鹽水或5%葡萄糖溶液的醫藥賦形劑中並在其中投予。

在一個具體例中，經由部位特異性或靶定局部投遞技術來投予PDL1結合適體。部位特異性或靶定局部投遞技術的實例包括具有PDL1結合適體的各種可植入貯器來源或局部投遞導管，諸如輸注導管、留置導管或針頭導管、合成移植物、外包套、分流器及支架或其他可植入裝置、部位特異性載劑、直接注射或直接施用。參見例如PCT公開案第WO 00/53211號及U.S.專利第5,981,568號。

也可以使用含有反義聚核苷酸、表現載體或次基因體聚核苷酸的治療性組成物的靶定遞送。受體媒介的DNA遞送技術描述於例如Findeis et al.,Trends Biotechnol.(1993)11：202；Chiou et al.,Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer(J.A.Wolff,ed.)(1994)；Wu et al.,J.Biol.Chem.(1988)263：621；Wu et al.,J.Biol.Chem.(1994)269：542；Zenke et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87：3655；Wu et al.,J.Biol.Chem.(1991)266：338中。

含有聚核苷酸(例如本文所述PDL1結合適體或用於生產該結合適體的載體)的治療性組成物可在約100ng至約200mg DNA的範圍內在基因治療程序中被投予供局部投予。在一些具體例中，也可用在基因治療程序期間使用濃度範圍約500ng至約50mg、約1μg至約2mg、約5μg至約500μg，及約20μg至約100μg或更多的DNA。

要依據本文所述方法治療的個體可以是哺乳動物，諸如農場動物、運動動物、寵物、靈長類、馬、狗、貓、小鼠及大鼠。在一個實例中，該個體為人類。含有抗-PDL1適體的組成物可用於在有治療需要的個體中提高免疫活性，例如T細胞活性。在一些實例中，個體可為患有癌症、疑似患有癌症或處於癌症風險下的人類患者，癌症為諸如肺癌、黑色素瘤、結腸直腸癌，或腎細胞癌。在其他實例中，個體可以是患有或疑似患有腸病毒、HBV、HCV、HDV或HEV感染的人類患者。此一患者也可以透過慣常醫學實務予以鑑定。

患有目標疾病或病症(例如癌症或諸如HBV感染之病毒性感染或細菌性感染)的個體可以透過慣常醫學檢驗予以鑑定，醫學檢驗為例如實驗室測試、器官功能測試、CT掃描或超音波。懷疑患有此等目標疾病/病症任一者的個體可能表現出該疾病/病症的一或多種症狀。處於該疾病/病症風險下的個體可能是帶有與那個疾病/病症有關之一或多個風險因子的個體。此一個體也可以透過慣常醫學實務予以鑑定。

在本文所述方法中使用的具體劑量方案(亦即劑量、時間安排及重複)將取決於特定個體(例如人類患者)以及個體病史。

在一些具體例中，抗-PDL1適體可與另一種適當治療劑(例如抗癌劑、抗病毒劑，或抗菌劑)共同使用。另外或此外，抗-PDL1適體也可以與其他用來增強及/或補充藥劑有效性的藥劑組合使用。

目標疾病/病症的治療效力可以透過例如下面實例中所述方法進行評估。

用於減輕目標疾病的套組

本揭示內容亦提供用於提高免疫活性(例如T細胞活性)、減輕癌症(例如肺癌、黑色素瘤、結腸直腸癌，或腎細胞癌)，及/或治療或降低腸病毒、HBV、HCV、HAV、HDV或HEV感染風險的套組。此等套組可包括一或多個含有例如本文所述彼等任一種結合PDL1之適體的容器。

在一些具體例中，套組可包含與使用本文所述方法任一者一致的使用說明。所納入的使用說明可包含投予如本文所述那些要治療目標疾病、延遲目標疾病發生，或減輕目標疾病之適體的說明。套組可進一步包含篩選適合治療之個體的說明，其是基於鑑別那個個體是否患有目標疾病。在又其他具體例中，使用說明包含向處於目標疾病風險下的個體投予適體的說明。

與使用PDL1結合適體有關的使用說明通常包括期望治療之劑量、給藥時間表，以及投予路徑的資訊。容器可以是單位劑量、散裝(例如多劑量包裝)或次單位劑量。在本發明套組中所提供的使用說明通常是標籤上的書面說明或包裝插頁(例如套組中所包括的紙張)，但機器可讀說明(例如磁性或光學儲存碟片上所傳達的說明)也是可接受的。

標籤或包裝插頁指明該等組成物是用於治療癌症相關疾病或病症(諸如本文所述彼等癌症)、延遲癌症相關疾病或病症發生及/或減輕癌症相關疾病或病症。可提供使用說明供實施本文所述任一方法。

本發明套組可以呈適當包裝。適當包裝包括，但不限於小瓶、瓶、罐、可撓性包裝(例如密封麥拉膜(Mylar)或塑膠袋)，以及類似物。也預期包裝可用於與特定裝置組合，特定裝置為諸如吸入器，鼻投予裝置(例如霧化器)或諸如迷你泵的輸注裝置。套組可具有無菌出入口(例如容器可以是靜脈內溶液袋或具有可被皮下注射針頭穿刺過之擋塞的小瓶)。容器也可以具有無菌出入口(例如容器可以是靜脈內溶液袋或具有可被皮下注射針頭穿刺過之擋塞的小瓶)。組成物中的至少一種活性劑是如本文所述彼等PDL1結合適體。

套組可視情況提供額外組分，諸如緩衝劑或說明資訊。通常，套組包含容器及標籤或包裝插頁在容器上或附接在容器上。在一些具體例中，本發明提供包含上述套組內含物的製品。

一般性技術

除非另有說明，否則本發明之實施將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學、免疫學的習知技術，其落在技術技能中。Molecular Cloning：A Laboratory Manual,second edition(Sambrook,et al.,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-8)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,et al.,eds.,1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis,et al.,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)。在沒有進一步詳細說明的情況下，感信習於技術者能夠基於上述說明利用本發明至其最大程度。因此，下列特定具體例要理解為僅為示範性，且無論如何皆不以任何方式限制本發明的其餘部分。本文引用的所有公開資料就本文參照之目的或主體以引用方式併入本文中。

實例1：藉由硝基纖維素濾膜SELEX鑑定人類PDL1靶向適體

人類PDL1靶向適體是基於硝基纖維素濾膜SELEX進行鑑定(圖1)。合成單股DNA庫由具有62個核苷酸的單股DNA組成，包含30個隨機核苷酸([N]₃₀ N=A、T、G、C)，兩側為TCCCTACGGCGCTAAC(SEQ ID NO：16)的引子序列(其至隨機核苷酸的5’)以及GCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO：17)的引子序列(其至隨機核苷酸的3’)。在第一回合SELEX，ssDNA庫的10¹⁵個分子與重組人PDL1蛋白一起培育。然後，藉由硝基纖維素濾膜收集結合至PDL1蛋白的ssDNA，而未結合ssDNA是透過反覆洗滌除去。結合PDL1的ssDNA是透過加熱洗脫並透過PCR用生物素標記的正向引子擴增。ssDNA是透過鏈親和素珠粒分離，並進行下一回合選擇。從第二到第八回合選擇，牛血清白蛋白(BSA)用於負選擇。簡言之，結合至PDL1蛋白的洗脫ssDNA與BSA一起培育，然後通過硝基纖維素濾膜。收集流出物並透過PCR擴增。經過八個回合選擇，結合PDL1的ssDNA進行次世代定序。

實例2：使用硝基纖維素濾膜結合分析來評估候選PDL1適體的相對結合能力

依據次世代定序的讀出值對候選PDL1靶定適體的序列進行排序，並且分析讀出值超過100的序列。其中，排名前50個候選適體序列佔85%以上讀出值。為了評估其對PDL1的結合能力，合成這前50個候選適體並經由硝基纖維素濾膜結合分析進行分析。對BSA的結合能力用作陰性對照。簡言之，候選適體分別與PDL1或BSA培育。適體-蛋白複合物是藉由硝基纖維素濾膜收集並透過加熱洗脫。洗脫的適體數量是透過定量PCR予以量化並透過將PDL1組的訊號除以BSA組的訊號而常規化。為了找出特異性更高的PDL1 適體，截止值設定為5。結果顯示有六個候選PDL1適體通過這個標準，包括AP14、AP22、AP32、AP33、AP36、AP48(圖2)。

實例3：使用基於ELISA的競爭分析來鑑定拮抗PDL1適體

為了調查候選PDL1適體作為拮抗劑的效力，進行基於ELISA的競爭分析。人類PDL1重組蛋白(2μg/ml)塗佈於96孔ELISA盤的孔中，並透過BSA(10mg/ml)予以阻斷。人類PD-1蛋白(0.6μg/ml)和適體(500nmole/l)同時添加到孔中。洗去未結合的人類PD-1蛋白質後，透過HRP標記抗人類IgG抗體偵測留在孔中的PD-1蛋白。TMB用作為HRP受質以供呈色，並且透過ELISA盤讀取器偵測652nm下的吸光度。使用透過連續稀釋人類PD-1蛋白構建的標準曲線來量化剩餘的人類PD-1蛋白量。沒有PDL1塗覆的孔用作陰性對照。結果表明，六個候選PDL1適體阻斷12%至30%的PD-1：PDL1交互作用(圖3)。其中，AP14和AP32揭示了最高潛力作為PDL1阻斷拮抗適體。

為了進一步調查AP14和AP32作為PDL1阻斷劑的50%有效劑量，將從12.5nmole/l連續稀釋至500nmole/l的AP14和AP32用於前面提到的基於ELISA的競爭分析中。50%有效劑量是透過GraphPad Prism 5，使用方程式Y=Bmax xX/(ED50+X)來進行計算。Bmax是受到PDL1拮抗適體阻斷之人類PD1蛋白的最大百分比。AP14和AP32的ED50分別為41nmole/l和12nmole/l(圖4)。

為了找出PDL1結合所需的最小AP32序列，產生與AP32有關的適體序列截短。依據Mfold的預測結構，AP32在5’端與3’端的序列形成長柄，其餘序列形成的兩個短柄環(圖5，左圖)。設計出有關AP32適體的兩個截短適體，45個核苷酸長(圖5，中圖)和30個核苷酸長(圖5，中圖)並由先前提到的基於ELISA的競爭分析檢驗它們的拮抗功能。相比62個核苷酸長的適體，45個核苷酸長的截短適體顯示出拮抗功能增加(分別為35%和65%)(圖6)。然而，隨著進一步的序列截短，30個核苷酸長的截短適體顯示出對PD-1：PDL1交互作用的阻斷能力降低。這個45個核苷酸長的截短AP32適體在下文稱為aptPDL1。

實例4：透過流式細胞分析調查PDL1適體對人類和小鼠癌細胞的結合能力

為了調查aptPDL1對PDL1表現細胞的結合能力，使用兩種人類癌細胞，其具有不同PDL1表現水平。經螢光標記的aptPDL1(100nmole/l)分別與A549(PDL1低表現)和HOP92(PDL1高表現)一起培育，並透過流式細胞儀偵測從細胞發射出的螢光強度。標記有螢光染料的隨機序列用作陰性對照。與PDL1表現相一致，從PDL1高度表現的細胞HOP92檢測到更強的螢光強度，而從PDL1表現較低的A549檢測到較弱的信號(圖7)。

使用CT26和LL/2小鼠癌細胞來評估aptPDL1對小鼠PDL1表現細胞的結合能力(圖8)。AptPDL1可以結合CT26和LL/2細胞，解離常數分別約250nmole/l以及155nmole/l(圖9)。

實例5：在同基因動物模型中檢驗PDL1拮抗適體的抗腫瘤效力

為了調查PDL1拮抗適體作為免疫治療劑對抗癌進展的效力，使用同基因小鼠模型。Balb/c小鼠皮下接種CT26小鼠結腸直腸癌細胞(2×10⁵個細胞)。當腫瘤長達到5mm，投予藥物。關於瘤內注射組，每兩天腫瘤內遞送6ug隨機序列(n=5)或aptPDL1(n=5)歷時總共4次注射。關於腹膜內注射組，每兩天腹膜內遞送30ug隨機序列(n=7)或aptPDL1(n=7)歷時總共4次注射。AptPDL1透露對腫瘤生長有顯著抑制作用；在腫瘤內注射組中為50%抑制(圖10)，而在腹膜內注射組中為73%抑制(圖11)。

實例6：在同基因動物模型中檢驗PDL1拮抗適體的抗腫瘤效力

在aptPDL1活體內腫瘤抑制功能的研究中採用LL/2鼠同基因腫瘤模型。C57BL/6小鼠皮下接種LL/2(1x10⁵個細胞)。當腫瘤長軸達到約5mm，每2天腹膜內投予30μg的隨機序列寡核苷酸(n=7)或aptPDL1(n=7)。數據顯示，腹膜內aptPDL1投藥的連續劑量導致經LL/2接種C57BL/6小鼠有顯著腫瘤抑制效果(圖12)。為了要排除aptPDL1對CT26和LL/2細胞的直接細胞毒性，吾人進行活體外細胞生存力分析。CT26或LL/2細胞(2x10³個細胞)接種到96孔盤的孔中，將隨機序列的寡核苷酸或aptPDL1(1μM)加入到各孔中。24、48或72小時後，用MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-聯苯溴化四唑)分析遵循下列標準程序分析細胞生存力。這些實驗顯示，aptPDL1對癌細胞沒有直接的細胞毒性(圖13)。

實例7：在經PDL1拮抗適體治療的腫瘤組織中檢驗細胞介素表現

對阿特珠單抗(Atezolizumab)(Roche)的反應分子(抗PDL1抗體)的分析，揭示了在治療後腫瘤中的IFNγ和趨化因子CXCL9/10水平增加。因此，吾人檢驗在經aptPDL1治療的CT26和LL/2腫瘤中是否會觀察到類似的現象。RNA，從小鼠解剖的組織中萃取，使用習知TRIzol(Invitrogen)方法按照製造商的程序進行純化。cDNA用寡(dT)_12-18引子以及SuperScript III逆轉錄酶(Invitrogen)從總RNA合成cDNA。在LightCycler 480系統(Roche Applied Science,Mannheim Germany)上使用cDNA作為模板以及下列引子對(Integrated DNA Technologies)進行qPCR：IFNγ，5'-GAGGAACTGGCAAAAGGATG-3'(正向；SEQ ID NO：18)和5'-TTCAAGACTTCAAAGAGTCTGAGGTA-3'(反向；SEQ ID NO：19)；CXCL9，5'-CTTTTCCTCTTGGGCATCAT-3'(正向；SEQ ID NO：20)和5'-GCATCGTGCATTCCTTATCA-3'(反向；SEQ ID NO：21)；CXCL10，5'-GCTGCCGTCATTTTCTGC-3'(正向；SEQ ID NO：22)和 5'-TCTCACTGGCCCGTCATC-3'(反向；SEQ ID NO：23)；CXCL11，5'-GCTGCTGAGATGAACAGGAA-3'(正向；SEQ ID NO：24)和5'-CCCTGTTTGAACATAAGGAAGC-3'(反向；SEQ ID NO：25)；及β-肌動蛋白，5'-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3'(正向；SEQ ID NO：26)和5'-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3'(反向；SEQ ID NO：27)。蛋白質是使用補充有蛋白酶抑制劑混合物(Roche Applied Science)的RIPA緩衝液從腫瘤組織中萃取。以1：500稀釋度使用對抗鼠蛋白質CXCL9、CXCL10，和CXCL11的一級抗體(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)。以1：10000稀釋度使用對抗β肌動蛋白的一級抗體(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)。以1：5000稀釋度使用HRP標記的二級抗體(Santa Cruz Biotechnology)。

這些先前研究結果一致，逆轉錄定量PCR和免疫墨點分析顯示IFNγ、CXCL9、CXCL10以及CXCL11水平在經aptPDL1治療的腫瘤中升高(圖14和15)。

實例8：檢驗在經PDL1拮抗適體治療的腫瘤組織中的微血管形成

腫瘤內CXCL9/10已經報導發揮抗腫瘤效用。趨化因子CXCL9/10/11也已知會透過它們結合至內皮趨化因子(C-X-C基序)受體3(CXCR3)來抑制血管生成。因此，吾人研究了aptPDL1治療在腫瘤內微血管方面的效用。將經福馬林固定、石蠟包埋的組織再水合，並在檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)中進行抗原檢索過程。以1：100稀釋度使用針對CD31的一級抗體(Abcam)。以1：500稀釋度使用Alexa Fluor 647標記的二級抗體(Abcam)。細胞核用Fluoroshiled包埋介質(Abcam)中的DAPI染色。如在圖16中所示，aptPDL1治療組中的CD31陽性腫瘤內微血管的長度和密度均顯著降低。

等效物及範圍

在申請專利範圍中，除非有相反的指示，或從上下文另有明顯，否則諸如「一」、「一種」和「該」的冠詞可表示一或一個以上。除非指出從上下文相反或從上下文另有明顯，若一種、多於一種或全部的組成員都存在於、用於，或以其他方式與給定的產品或方法相關，則包括「或」的一組中的一個或多個成員之間的申請專利範圍或說明被認為是充分的。本發明包括具體例，其中該組的正好一個成員存在於、用於，或以其他方式與給定的產品或方法相關。本發明包括數個具體例，其中超過一個，或所有組成員都存在於、用於，或以其他方式與給定的產品或方法相關。

此外，本發明含括所有變化、組合及排列，其中所列申請專利範圍的一個或更多的限制、要素、條款以及描述性術語被引入另一個申請專利範圍。例如，任何申請專利範圍是依附於另一項申請專利範圍，可經修改以包括在任何其他依附於相同基礎申請專利範圍之申請專利範圍中所找到的一或多個限制條件。若以條列呈現元件，例如以馬庫西組合的形式，則亦揭示元件的每個子組合，還有任何元件(等)可以從該組合中刪除。應理解，大體上當本發明或本發明的態樣被稱為包含特定要素及/或特徵時，本發明的某些具體例或本發明的態樣由此等元件及/或特徵組成或基本上由其組成。為了簡要起見，本文沒有用這樣的話提出這些具體例。還要注意，術語「包含」和「含有」希望是開放性並且允許納入其他元件或步驟。凡給定範圍者，包括端點在內。此外，除非另有說明或從通常技術人員中的一者的背景和理解為明顯的，表示為範圍的數值可假定在本發明的不同具體例之指定範圍內的任何特定值或子範圍，至該範圍下限的單位的十分之一，除非上下文另有明確說明。

本申請案指各種已授權的專利、已公開的專利申請案、期刊文章和其他出版物，所有這些都透過引用併入本文。如果任何併入的參考文獻和本說明書之間相衝突，以本說明書為準。另外，落入先前技術中的本發明的任何特定具體例可以明確地從申請專利範圍的任何一或多者排除。因為這樣的具體例被認為是技術中具有通常技術者之一所熟知，它們可能被排除，即使本文未明確說明排除。本發明的任何特定具體例可以基於任何原因從任何申請專利範圍中排除，不管是否與存在先前技術有關。

那些習於技術者將認知到或能夠使用不超出慣常實驗來確定許多等同於本文描述的特定具體例。本文所描述的具體例範圍並不希望被限定於上述的說明，而是闡述於隨附的申請專利範圍中。那些習於技術者將會理解，各種變化和修改對本描述可以在不脫離本發明的精神或範疇的情況下作出，如在下面的申請專利範圍中所限定。

<110> 中央研究院 Academia Sinica 國立臺灣大學 National Taiwan University

<120> 具拮抗PDL1功能的適體分子於癌症治療之應用ANTAGONISTIC PDL1 APTAMERS AND THEIR APPLICATIONS IN CANCER THERAPY

<130> A0988.70073WO00

<140> 尚未分派

<141> 同此

<150> US 62/212,772

<151> 2015-09-01

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<400> 1

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<400> 2

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<400> 3

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<400> 4

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成聚核苷酸

<400> 5

<210> 6

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成聚核苷酸

<400> 6

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<212> DNA

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<223> 合成聚核苷酸

<400> 7

<210> 8

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<212> DNA

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<223> 合成聚核苷酸

<400> 8

<210> 9

<211> 62

<212> DNA

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<223> 合成聚核苷酸

<400> 9

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<213> 人工序列

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<223> 合成聚核苷酸

<400> 10

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<213> 人工序列

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<223> 合成聚核苷酸

<400> 11

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<210> 16

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<400> 26

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成聚核苷酸

<400> 27

Claims

一種能夠結合程式性死亡-配體蛋白1(PDL1)的核酸適體，其中該適體包含具有核苷酸序列5’-CGGGCCACAT-3’(SEQ ID NO：1)的核酸基序(motif)。
如請求項1之核酸適體，其中該核酸適體為約30至62個核苷酸(nt)長。
如請求項1或2之核酸適體，其中該核酸適體包含與ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT(SEQ ID NO：2)至少85%一致的核酸序列。
如請求項3之核酸適體，其中該核酸適體包含與SEQ ID NO：2至少90%一致的核酸序列。
如請求項3之核酸適體，其中該核酸適體包含與SEQ ID NO：2至少95%一致的核酸序列。
如請求項3之核酸適體，其中該核酸適體包含SEQ ID NO：2的核酸序列。
如請求項6之核酸適體，其中該核酸適體由SEQ ID NO：2的核苷酸序列組成。
一種能夠結合程式性死亡-配體蛋白1(PDL1)的核酸適體，其中該適體包含與下列至少85%一致的核酸序列：(i)ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT(SEQ ID NO：2)；(ii)CACTCAATAATTCCACTGCTACATACGTTT(SEQ ID NO：3)；(iii)AAACTAGGGTCCATTTGTGTACCTGCGA(SEQ ID NO：4)；(iv)ACATCAACTTGATAGACAACTGCGTCCACT(SEQ ID NO：5)；(v)CATCTGGTACCTTACGACGCTTCATCTCCC(SEQ ID NO：6)；(vi)CATGTTTTCGAAAGACAATCCGCTGCCCTG(SEQ ID NO：7)；或 (vii)CATGTTCCTTTCGTTCTGCCTTTTCCTTCC(SEQ ID NO：8)。
如請求項8之核酸適體，其中該適體包含與下列至少90%一致的核酸序列：(i)ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT(SEQ ID NO：2)；(ii)CACTCAATAATTCCACTGCTACATACGTTT(SEQ ID NO：3)；(iii)AAACTAGGGTCCATTTGTGTACCTGCGA(SEQ ID NO：4)；(iv)ACATCAACTTGATAGACAACTGCGTCCACT(SEQ ID NO：5)；(v)CATCTGGTACCTTACGACGCTTCATCTCCC(SEQ ID NO：6)；(vi)CATGTTTTCGAAAGACAATCCGCTGCCCTG(SEQ ID NO：7)；或(vii)CATGTTCCTTTCGTTCTGCCTTTTCCTTCC(SEQ ID NO：8)。
如請求項9之核酸適體，其中該適體包含與下列至少95%一致的核酸序列：(i)ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT(SEQ ID NO：2)；(ii)CACTCAATAATTCCACTGCTACATACGTTT(SEQ ID NO：3)；(iii)AAACTAGGGTCCATTTGTGTACCTGCGA(SEQ ID NO：4)；(iv)ACATCAACTTGATAGACAACTGCGTCCACT(SEQ ID NO：5)；(v)CATCTGGTACCTTACGACGCTTCATCTCCC(SEQ ID NO：6)；(vi)CATGTTTTCGAAAGACAATCCGCTGCCCTG(SEQ ID NO：7)；或(vii)CATGTTCCTTTCGTTCTGCCTTTTCCTTCC(SEQ ID NO：8)。
如請求項10之核酸適體，其中該適體包含下列核酸序列：(i)ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT(SEQ ID NO：2)；(ii)CACTCAATAATTCCACTGCTACATACGTTT(SEQ ID NO：3)； (iii)AAACTAGGGTCCATTTGTGTACCTGCGA(SEQ ID NO：4)；(iv)ACATCAACTTGATAGACAACTGCGTCCACT(SEQ ID NO：5)；(v)CATCTGGTACCTTACGACGCTTCATCTCCC(SEQ ID NO：6)；(vi)CATGTTTTCGAAAGACAATCCGCTGCCCTG(SEQ ID NO：7)；或(vii)CATGTTCCTTTCGTTCTGCCTTTTCCTTCC(SEQ ID NO：8)。
如請求項8至11中任一項之核酸適體，其中該核酸適體為約30至62個核苷酸(nt)長。
一種醫藥組成物，包含(i)如請求項1至12中任一項之核酸適體；以及(ii)醫藥上可接受載劑。
一種用於治療癌症或感染的醫藥組成物，其包含(i)如請求項1至12中任一項之核酸適體；以及(ii)醫藥上可接受載劑。
一種如請求項1至12中任一項之核酸適體於製造用以治療癌症或感染的藥物的用途。
一種治療癌症的方法，包含向有需要的個體投予有效量之如請求項13的醫藥組成物。
如請求項16之方法，其中該個體為患有癌症、疑似患有癌症或處於癌症風險下的人類患者。
如請求項16或17之方法，其中該癌症為黑色素瘤、非小細胞肺癌、結腸直腸癌或腎細胞癌。
一種提高個體之免疫活性的方法，該方法包含向有需要的個體投予有效量之如請求項13的醫藥組成物。
如請求項19之方法，其中該個體為患有癌症、疑似患有癌症或處於癌症風險下的人類患者。
如請求項20之方法，其中該癌症為黑色素瘤、非小細胞肺癌、結腸直腸癌或腎細胞癌。
如請求項19之方法，其中該個體為患有或疑似患有感染性疾病的人類患者。
如請求項22之方法，其中該感染性疾病是由腸病毒、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、A型肝炎病毒(HAV)、D型肝炎病毒(HDV)或E型肝炎病毒(HEV)所致。
如請求項19至23中任一項之方法，其中該醫藥組成物之量有效增加T細胞、B細胞、樹突細胞、天然殺手細胞或巨噬細胞中之一或多者的活化。
如請求項19至24中任一項之方法，其中該醫藥組成物之量有效增加CD8陽性T細胞的增生。