CN114072506A - 用于调节免疫应答的二聚CpG寡核苷酸 - Google Patents

Abstract

包含CpG寡核苷酸、缓冲剂和总盐浓度为约80‑130mM的一种或多种盐的药物组合物。组合物中的大部分CpG寡核苷酸为二聚体形式。本文还提供了药物组合物用于调节需要治疗的受试者(例如癌症患者)的免疫应答的用途。

Description

用于调节免疫应答的二聚CpG寡核苷酸

背景技术

CpG寡核苷酸是包含“CpG”基序的短合成核酸分子，其中C和G分别代表胞苷残基和鸟苷残基，“p”代表C和G残基之间的磷酸二酯键。发现未甲基化的CpG寡核苷酸会激活各种免疫细胞(例如T细胞或B细胞)上的刺激性免疫受体(例如Toll样受体或TLR)，从而刺激先天性免疫应答。

据报道，在肿瘤部位或其附近局部注射CpG寡核苷酸将刺激局部抗肿瘤免疫应答，导致肿瘤体积缩小。然而，这种抗肿瘤活性通常是局部的。参见，例如，Rava等人，《科学转化医学》(Science Translational Medicine)，10(426):eaan8723(2018)。

发明内容

本公开至少部分基于意外发现，即二聚体形式的CpG寡核苷酸在肿瘤部位局部注射后成功诱导全身抗肿瘤免疫应答。因此，二聚体CpG寡核苷酸有望通过局部给药表现出全身抗肿瘤活性。

因此，本公开一个方面提供了一种药物组合物，其包含基因序列为5’-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTT-3’(SEQ ID NO:1)的CpG寡核苷酸、缓冲剂和一种或多种盐。组合物中的总盐浓度可为约80-130mM。组合物中至少80％的CpG寡核苷酸为二聚体形式。

在一些实施方式中，可以修饰CpG寡核苷酸。例如，CpG寡核苷酸可包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施例中，CpG寡核苷酸是MBS513，其包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列和硫代磷酸酯核苷酸间键、甲基膦酸酯键或硼烷磷酸酯键。

所述药物组合物包含缓冲剂以稳定组合物的pH值。示例性缓冲剂包括但不限于HEPES、DPBS或PBS。在一些实施方式中，所述药物组合物的pH值可为7-8。

此外，所述药物组合物包含总浓度为约80-130mM的一种或多种盐。用于本公开的示例性盐包括但不限于KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2或其组合。

本文公开的任何药物组合物可以包含本文公开的浓度为至少500μM的CpG寡脱氧核苷酸(例如，SEQ ID NO:1所示的二聚体形式)。在一些情况下，CpG寡脱氧核苷酸的浓度可以为约500μM至5000μM(例如，500μM至2000μM)。

本公开的另一方面涉及二聚寡核苷酸复合物，其包含两个CpG寡核苷酸分子，其中至少一个包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。在一些情况下，所述二聚寡核苷酸复合物可以为同型二聚体，其中两个CpG寡核苷酸分子都包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在另一方面，本公开提供了一种用于刺激免疫应答的方法，包括向有需要的受试者给予有效量的任何药物组合物，所述药物组合物包含如本文所述的CpG寡核苷酸或二聚寡核苷酸复合物。在一些情况下，通过局部注射(例如，瘤内注射)将药物组合物或二聚寡核苷酸复合物给予受试者。

在一些实施方式中，受试者可以是患有、怀疑患有癌症或有患癌症的风险的人类患者。示例性目标癌症包括但不限于黑素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌和淋巴瘤。在一些实施例中，CpG寡核苷酸可以100μg/kg至4000μg/kg的剂量给予患者。或者，CpG寡核苷酸可以约40nmol至约150nmol(例如，约50nmol)的剂量给予患者。

本公开内容还包括用于治疗本文公开的任何目标疾病(例如，癌症)的任何二聚体CpG寡核苷酸复合物或包含该复合物的药物组合物，以及用于制造用于癌症治疗的药物的包含所述CpG寡核苷酸的药物组合物。

在以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施方式的细节。本发明的其他特征或优点从以下附图和若干实施方式的详细描述以及也从所附权利要求中将变得显而易见。

附图说明

图1A-1B是示出CpG寡核苷酸MBS513的性质和功能的图表。图1A是DNA凝胶图像，示出MBS513在溶于SELEX缓冲液时呈二聚体形式，在溶于蒸馏去离子水(ddH₂O)中时呈单体形式。图1B是示出MBS513以剂量依赖性方式激活TLR9信号传导的图表。

图2A-2E是示出在小鼠模型中MBS513对抑制肿瘤的体内作用的图表。图2A是示例性实验设计的示意图。图2B(局部肿瘤)和图2C(远处肿瘤)是示出MBS513对肿瘤体积的影响的图表。图2D和图2E是示出在12.5nmol、25nmol和50nmol下通过MBS513-1和MBS513-2(两个不同批次的MBS513，参见下面的实施例2)进行的局部(图2D)和远处(图2E)肿瘤抑制的图表。

图3是示出在所示的不同浓度下MBS513的二聚体/单体比率的图表。

具体实施方式

CpG寡核苷酸(CpG DNA)是一类能够刺激有效的、协调的免疫应答(例如，抗肿瘤免疫应答)的药剂。CpG寡核苷酸的局部给药在减少局部肿瘤生长方面表现出满意效果；然而，这种局部给药通常不会导致针对肿瘤的全身免疫应答。参见，例如，Sagiv-Barfi等人，《科学转化医学》(Science Translational Medicine)，10(426):eaan4488(2018)。

本公开至少部分基于意外发现，即适当的盐浓度在二聚体CpG寡核苷酸的形成中起重要作用，并且当在肿瘤部位局部注射时，此类二聚体寡核苷酸诱导针对肿瘤细胞的全身免疫应答。

因此，本文描述了药物组合物，其包含合适总浓度的CpG寡核苷酸和一种或多种盐，使得大多数CpG寡核苷酸(例如，至少80％)呈二聚体形式。本文还提供此类药物组合物用于诱导免疫应答(例如，全身抗肿瘤免疫应答)的用途，即使当所述药物组合物在局部位点(例如，在肿瘤部位)给药时。

一、保持CpG寡核苷酸二聚体形式的药物组合物

本公开一方面提供了一种药物组合组，其包含CpG寡核苷酸、缓冲剂和一种或多种盐。在一些情况下，药物组合物可以是等渗溶液。

组合物中的总盐浓度可为约80-130mM。此类药物组合物可以保持其中包含的CpG寡核苷酸的二聚体形式，例如，至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或以上)的CpG寡核苷酸呈二聚体形式。如本文所用，二聚体或二聚体形式是指包含两个CpG寡核苷酸分子的核苷酸复合物。在一些情况下，本文公开的二聚体或二聚体形式是同型二聚体或同型二聚体形式，即包含两个相同的寡核苷酸分子(例如本文公开的那些)。

(i)CpG寡核苷酸

“CpG”是指通过磷酸键(“p”)连接的5'胞嘧啶(“C”)和3'鸟嘌呤(“G”)。如本文所用，术语“CpG寡核苷酸”是指能够激活免疫细胞(免疫刺激剂)的任何含CpG的寡核苷酸。至少5'CpG 3'的C必须是未甲基化的。CpG寡核苷酸可以按照常规技术通过化学合成制备，也可以从商业供应商处获得。

在一些实施方式中，本公开中使用的CpG寡核苷酸的长度可为20-100个核苷酸(nts)(例如，25-100nts)。在一些实施方式中，CpG寡核苷酸的长度可为25-100、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40或25-30个核苷酸。

在一些实施方式中，本文所述的CpG寡核苷酸可以是DNA(CpG寡脱氧核苷酸或CpGODN)分子、DNA/DNA双链体、RNA分子或DNA/RNA杂合分子。在一些实施例中，CpG寡核苷酸可以是线性的或环状的。在一些实施例中，CpG寡核苷酸可以是部分环状的或可以形成发夹环。在一些实施例中，CpG寡核苷酸可以是单链的。在其他实施例中，CpG寡核苷酸可以是双链的。

本文所述的CpG寡核苷酸包括具有一种或多种修饰的CpG寡核苷酸。修饰包括但不限于碱基修饰、糖修饰和骨架修饰。此类修饰可使CpG寡核苷酸在某些条件下更稳定和/或更不易降解。例如，在一些实施方式中，CpG寡核苷酸是耐核酸酶的。

在一些实施方式中，本公开的CpG寡核苷酸具有同质骨架(例如，完全磷酸二酯或完全硫代磷酸酯)或异质(或嵌合)骨架。硫代磷酸酯骨架修饰可使寡核苷酸对核酸酶的敏感性降低，从而在某些条件下更稳定(与天然磷酸二酯骨架核酸相比)。可为本公开的核酸提供更高稳定性的其他键包括但不限于二硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键、甲基硫代磷酸酯键、硼膦酸酯键、肽键、烷基键和脱磷型键。因此，在一些实施方式中，CpG寡核苷酸具有非天然存在的骨架。在一些实施方式中，CpG寡核苷酸具有完全是硫代磷酸酯的骨架。如本文所述，可以使用任何类别的CpG寡核苷酸。在一些实施方式中，CpG寡核苷酸可选自由A类CpG寡核苷酸、B类CpG寡核苷酸和C类CpG寡核苷酸组成的组。

在一些实施方式中，A类CpG寡核苷酸的特征在于能够诱导高水平的干扰素-α，同时对B细胞活化具有最小影响。在一些实施方式中，A类CpG寡核苷酸可包含六聚体回文GACGTC、AGCGCT或AACGTT。参见Yamamoto等人，《免疫学杂志》(J Immunol)148:4072-6(1992)。在一些实施方式中，A类CpG寡核苷酸具有富含聚G的5'和3'末端以及回文中心区域。在一些实施方式中，A类CpG寡核苷酸在5'和3'末端具有稳定的核苷酸间键，并且中心回文区具有磷酸二酯键。在一些实施方式中，A类CpG寡核苷酸可能缺少一个或多个聚G末端和回文中心。在一些实施方式中，A类CpG寡核苷酸可具有全部硫代磷酸酯或全部磷酸二酯核苷酸间键。A类CpG寡核苷酸已在例如PCT申请WO 2001/022990中进行了描述，其相关公开内容以引用的方式并入其中，以用于其中公开的目的或主题。

在一些实施方式中，B类CpG寡核苷酸强烈激活人B细胞，但干扰素-α的诱导作用最小，无需进一步修饰。在一些实施方式中，B类CpG寡核苷酸包括序列5'X₁CGX₂ 3'，其中X₁是T、G或A；X₂是T、C或A。在一些实施方式中，在某些优选碱基范围中完全稳定并包括未甲基化的CpG二核苷酸的B类CpG寡核苷酸在活化B细胞方面是有效的，但在诱导IFN-α和NK细胞活化方面相对较弱。B类CpG寡核苷酸已在例如美国专利第6,194,388号、第6,207,646号、第6,214,806号、第6,218,371号、第6,239,116号和第6,339,068号中描述，其中的相关公开内容通过引用并入本文，以用于其中公开的目的或主题。

在一些实施方式中，B类CpG寡核苷酸至少由下式表示：

5'X₁X₂CGX₃X₄ 3',，

其中X₁、X₂、X₃和X₄是核苷酸。在一些实施方式中，X₂是腺嘌呤、鸟嘌呤或胸腺嘧啶。在一些实施方式中，X₃是胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶。

在一些实施方式中，B类CpG寡核苷酸至少由下式表示：

5'N₁X₁X₂CGX₃X₄N₂ 3'，

其中X₁、X₂、X₃和X₄是核苷酸，N是任意核苷酸，N₁和N₂是各自由约0-25个核苷酸组成的核酸序列。在一些实施方式中，X₁X₂是选自由以下组成的组的二核苷酸：GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT和TpG；X₃X₄是选自由以下组成的组的二核苷酸：TpT、ApT、TpG、ApG、CpG、TpC、ApC、CpC、TpA、ApA和CpA。在一些实施方式中，X₁X₂是GpA或GpT并且X₃X₄是TpT。在一些实施方式中，X₁或X₂或两者都为嘌呤且X₃或X₄或两者都为嘧啶或X₁X₂为GpA且X₃或X₄或两者都为嘧啶。在一些实施方式中，X₁X₂是选自由以下组成的组的二核苷酸：TpA、ApA、ApC、ApG和GpG。在一些实施方式中，X₃X₄是选自由以下组成的组的二核苷酸：TpT、TpA、TpG、ApA、ApG、GpA和CpA。在一些实施方式中，X₁X₂是选自由以下组成的组的二核苷酸：TpT、TpG、ApT、GpC、CpC、CpT、TpC、GpT和CpG；X₃是选自由A和T组成的组的核苷酸，并且X₄是核苷酸，但其中当X₁X₂是TpC、GpT或CpG时，X₃X₄不是TpC、ApT或ApC。

在一些实施方式中，C类CpG寡核苷酸包含至少两个不同的基序，其对免疫系统的细胞具有独特且理想的刺激作用。在一些实施方式中，C类CpG寡核苷酸具有传统的“刺激性”CpG序列和“富含GC”或“B细胞中和”基序。因此，在一些实施方式中，C类CpG寡核苷酸具有免疫刺激作用，其介于与B类CpG寡核苷酸相关的作用和与A类CpG寡核苷酸相关的作用之间，其中B类CpG寡核苷酸是B细胞激活和树突细胞(DC)激活的强诱导剂；A类CpG寡核苷酸是IFN-α和自然杀伤(NK)细胞激活的强诱导剂，但是为B细胞和DC激活的相对差诱导剂。参见Krieg AM等人，《自然》(Nature)374:546-9(1995)；Ballas ZK等人，《免疫学杂志》(JImmunol)157:1840-5(1996)；Yamamoto S等人，《免疫学杂志》(JImmunol)148:4072-6(1992)。虽然典型的B类CpG寡核苷酸通常具有硫代磷酸酯骨架并且典型的A类CpG寡核苷酸具有混合或嵌合骨架，但典型的C类CpG寡核苷酸可具有稳定的例如硫代磷酸酯、嵌合或磷酸二酯骨架，并且在一些实施方式中，它们具有半软骨架，例如C和G核苷酸之间的磷酸二酯核苷酸间键和其他核苷酸间键具有硫代磷酸酯键。C类CpG寡核苷酸已在例如美国专利第7,566,703号、第8,198,251号和第8,834,900号中描述，其中的相关公开内容通过引用并入本文。

在一些实施方式中，C类CpG寡核苷酸中的刺激基序由下式定义：5'X₁DCGHX₂ 3'，其中D是除C之外的核苷酸，C为胞嘧啶，G为鸟嘌呤，H为除G之外的核苷酸，且X₁和X₂是0到10个核苷酸长的任意核酸序列。X₁可以包括CG，在这种情况下，CG前面最好有一个T。在一些实施方式中，DCG是TCG。X₁的长度优选为0至6个核苷酸。在一些实施方式中，X₂不包含任何聚G或聚A基序。在一些实施方式中，C类CpG寡核苷酸在5'末端或3'末端具聚T序列。如本文所用，“聚A”或“聚T”分别是指三个或更多个连续的A或T的一段序列，例如5'AAAA 3'或5'TTTT3'。如本文所用，“聚G”是指出现在核酸的5'末端或3'末端的三个或更多个连续的G的一段序列，例如5'GGG 3'。在一些实施方式中，C类CpG寡核苷酸的B细胞刺激结构域包括TTTTTCG、TCG、TTCG、TTTCG、TTTTCG、TCGT、TTCGT、TTTCGT或TCGTCGT。

在一些实施方式中，C类CpG寡核苷酸中的“富含GC的”或“B细胞中和”基序被称为P或N并且位于紧接X₁的5’末端或紧接X₂的3’末端。

N是B细胞中和序列，以CGG三核苷酸开始，长度至少为10个核苷酸。B细胞中和基序包括至少一个CpG序列，其中CG前面有一个C或后面有一个G(参见Krieg AM等人，《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci USA)95:12631-12636)(1998)，或者是含有CG的DNA序列，其中CG的C被甲基化。中和基序是当存在于其他非刺激基序中时具有一定程度免疫刺激能力的基序，但是当存在于其他免疫刺激基序中时，其用于降低其他基序的免疫刺激潜力。

P是一个富含GC的回文，包含至少10个核苷酸长的序列。如本文所用，“回文”和等效的“回文序列”是指反向重复序列，即诸如ABCDEE'D'C'B'A'的序列，其中A和A'、B和B'等是指能够形成通常的Watson-Crick碱基对的碱基。如本文所用，“富含GC的回文”是指具有至少三分之二G和C碱基组成的回文。在一些实施方式中，富含GC的结构域优选为“B细胞刺激结构域”的3'末端。对于10个碱基长的富含GC的回文，回文至少含有8个G和C碱基。对于12个碱基长的富含GC的回文，回文也至少含有8个G和C碱基。对于14个链节的富含GC的回文，回文中至少10个碱基为G和C。在一些实施方式中，富含GC的回文仅由G和C组成。

在一些实施方式中，富含GC的回文具有至少81％的G和C的碱基组成。对于这种10个碱基长的富含GC的回文，回文因此仅由G和C组成。对于这种12个碱基长的富含GC的回文，优选回文中至少10个碱基(83％)是G和C。在一些优选的实施方式中，12个碱基长的富含GC的回文仅由G和C组成。对于14个链节的富含GC的回文，回文中至少12个碱基(86％)为G和C。在一些优选的实施方式中，14个碱基长的富含GC的回文仅由G和C组成。富含GC的回文的C可以是未甲基化的，也可以是甲基化的。

通常，该结构域具有至少3个C和G，更优选各4个，最优选各5个或更多。该结构域中的C和G的数量不必相同。优选地，C和G的排列使得它们能够形成自互补双链体或回文，例如CCGCGCGG。这可以被A或T中断，但优选的是，至少部分地保留了自互补性，例如在基序CGACGTTCGTCG或CGGCGCCGTGCCG中。当互补性未被保留时，优选非互补碱基对是TG。在一个优选的实施方式中，不属于回文的连续碱基不超过3个，优选不超过2个，最优选仅1个。在一些实施方式中，富含GC的回文包括至少一种CGG三聚体、至少一种CCG三聚体或至少一种CGCG四聚体。

在一实施例中，本文公开的CpG寡核苷酸包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。此类CpG寡核苷酸可包含一种或多种本领域已知或本文公开的化学修饰。在一个实施例中，包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的CpG寡核苷酸可含有硫代磷酸酯核苷酸间键。

任何CpG寡核苷酸都可以是二聚体形式。在一些情况下，CpG寡核苷酸的二聚体形式可以是包含两个相同CpG寡核苷酸分子的同型二聚体。例如，同型二聚体可以包含两个CpG寡核苷酸，其中每个都包含(例如由以下序列组成)：SEQ ID NO:1。在其他情况下，CpG寡核苷酸的二聚体可以是包含两个不同CpG寡核苷酸分子的异二聚体。这两种CpG寡核苷酸分子的长度可以不同，核苷酸序列可以不同，或者两者都不同。本文公开的任何二聚CpG寡核苷酸复合物也在本公开的范围内。

本文公开的药物组合物可包含浓度≥400μM的任何CpG寡核苷酸，例如≥500μM、≥600μM、≥700μM、≥800μM、≥900μM、≥1000μM、≥1200μM、≥1500μM、≥1800μM、≥2000μM、≥2500μM、≥3000μM、≥3500μM、≥4000μM、≥4500μM或≥5000μM。在一些实施方式中，本文公开的药物组合物可包含浓度为约400μM至约5000μM的任何CpG寡核苷酸，例如约500μM至约4000μM、约500μM至约3500μM、约500μM至约3000μM、约500μM至约2500μM、约500μM至约2000μM、约500μM至约1500μM、约500μM至约1000μM或约500μM至约800μM。

(ii)缓冲剂

本文公开的含CpG的药物组合物可进一步包含合适的缓冲剂。缓冲剂是一种弱酸或弱碱，用于在加入另一种酸或碱后将溶液的pH值保持在选定的值附近。在一些实施例中，本文公开的缓冲剂可以是能够维持生理pH值的缓冲剂，尽管二氧化碳浓度发生变化(由细胞呼吸产生)。示例性缓冲剂包括但不限于4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)缓冲液、Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)缓冲液或磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液。此类缓冲剂可以包括磷酸氢二钠和氯化钠，或磷酸二氢钾和氯化钾。

本文所述的药物组合物中缓冲剂的浓度可以在约20mM至约100mM的范围内。例如，缓冲剂的浓度可以是约20-30mM、约30-40mM、约30-50mM、约30-60mM、约30-70mM、约30-80mM、约30-90mM或约30-100mM。在一些实施例中，缓冲剂的浓度可为约40mM。

一般而言，术语“约”和“大约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内。“约”可以表示小于给定值的±30％的范围，优选小于±20％，更优选小于±10％，更优选小于±5％，并且更优选小于±1％。

在一些实施方式中，本文所述药物组合物中的缓冲剂的pH值可维持在约7-8。例如，药物组合物的pH值可以为约7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。在一具体实施例中，药物组合物的pH值为约7.5。

(iii)盐类

本文所述的药物组合物包含总浓度为约80-130mM的一种或多种合适的盐。盐是一种离子化合物，可以通过酸和碱的中和反应形成。(参见Skoog,DA、West,DM、Holler,JF和Crouch,SR(2004)；第14-16章。《分析化学基础》(Fundamentals of AnalyticalChemistry)第8版))。盐由相关数量的阳离子(带正电荷的离子)和阴离子(负离子)组成，因此产品呈电中性(没有净电荷)。如本文所述，离子是获得或失去一个或多个价电子的原子或分子，使离子具有净正电荷或负电荷。如果化学物质的质子多于电子，则其带有净正电荷。如果电子多于质子，则该物质带负电荷。

如本文所述，阳离子(+)是电子比质子少的离子，其具有正电荷。(参见DouglasW.Haywick(2007–2008)《元素化学》(Elemental Chemistry))。带一个正电荷的阳离子可称为一价阳离子；带有一个以上正电荷的阳离子可称为多价或多价阳离子。一价阳离子的非限制性实施例是氢(H⁺)、钠(Na⁺)、钾(K⁺)、铵(NH4⁺)、锂(Li⁺)、亚铜(Cu⁺)、银(Ag⁺)等。多价阳离子的非限制性实施例是镁(Mg²⁺)、钙(Ca²⁺)、钡(Ba²⁺)、铍(Be²⁺)、铜(Cu²⁺)、亚铁(Fe²⁺)、铁(Fe³⁺)、铅(II)(Pb²⁺)、铅(IV)(Pb⁴⁺)、锰(II)(Mn²⁺)、锶(Sr²⁺)、锡(IV)(Sn⁴⁺)、锌(Zn²⁺)等。

如本文所述，阴离子是电子多于质子的离子，其具有净负电荷。阴离子的非限制性实施例是叠氮化物(N₃ ^-)、溴化物(Br^-)、氯化物(Cl^-)、氟化物(F^-)、氢化物(H^-)、碘化物(I^-)、氮化物(N^-)、氧化物(O^2-)、硫化物(S^2-)、碳酸盐(CO₃ ^2-)、碳酸氢盐(HCO₃ ^-)、硫酸氢盐(HSO^4-)、氢氧化物(OH^-)、磷酸二氢盐(H2PO₄ ^-)、硫酸盐(SO₄ ^2-)、亚硫酸盐(SO₃ ^2-)、硅酸盐(SiO3^2-)等。

适用于本文所述药物组合物的盐可包含一价阳离子和一价或多价阴离子。或者，用于本文所述药物组合物的盐可包含一价或多价阳离子和一价阴离子。示例性盐包括但不限于氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl₂)、氯化镁(MgCl₂)、硫酸镁(MgSO₄)、碳酸氢钠(NaHCO₃)、硫酸铵((NH₄)₂SO₄)、碳酸钙(Ca₂CO₃)或其组合。在一些实施方式中，本文所述的药物组合物包含KCl、NaCl、CaCl₂、MgCl₂或其组合。

本文所述的药物组合物中的总盐浓度可以在约80mM至约130mM的范围内，例如约80-120mM、约80-100mM、约80-90mM、约90-130mM、约100-130mM、约110-130mM或约120-130mM。在一具体实施例中，总盐浓度为约120mM。

所公开浓度范围的盐有助于将其中包含的大部分CpG寡核苷酸保持为二聚体形式。在一些情况下，组合物中超过80％(例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上)的CpG寡核苷酸呈二聚体形式。二聚体CpG寡核苷酸的形成可以通过常规方法或通过以下实施例中公开的方法来测量。

(iv)其他组分

本文所述的药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体(赋形剂)，以形成用于治疗目标疾病的药物组合物。“可接受的”意指载体必须与组合物的活性成分相容(并且优选地，能够稳定活性成分)并且对待治疗的受试者无害。药学上可接受的赋形剂(载体)包含缓冲液，所述缓冲液是本领域熟知的。参见例如，《雷明顿：药学科学与实践(Remington:TheScience and Practice of Pharmacy)》第20版，(2000)，利平科特·威廉姆斯&威尔金斯公司(Lippincott Williams and Wilkins)，K.E.Hoover编辑。

用于本发明方法的药物组合物可以包括冻干调配物或水溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。参见，例如，《雷明顿：药学科学与实践(Remington:TheScience and Practice of Pharmacy)》第20版，(2000)，利平科特·威廉姆斯&威尔金斯公司，K.E.Hoover编辑)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且可以包括：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

在一些实施例中，本文所述的药物组合物包括包含含有二聚体形式的任何CpG寡核苷酸的脂质体，所述脂质体可以通过本领域已知的方法制备，如以下文献中所描述的方法：Epstein等人，《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci USA)82:3688(1985)；Hwang等人，《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci USA)77:4030(1980)；以及美国专利第4,485,045号和第4,544,545号。美国专利第5,013,556号中公开了具有增强的循环时间的脂质体。可以用包括磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物来通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。通过具有限定孔径的过滤器将脂质体挤出以产生具有期望直径的脂质体。

还可以将本文所述的CpG寡核苷酸包埋在例如通过凝聚法技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊)中、胶状药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或粗乳液中。这些技术都是本领域已知的，参见例如，《雷明顿：药学科学与实践》第20版，马克出版公司(Mack Publishing)(2000)。

在其它实施例中，可以以缓释型格式调配本文所述的药物组合物。缓释型制剂的合适的实施例包含含有CpG寡核苷酸的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成型制品，例如薄膜或微胶囊的形式。缓释型基质的实施例包含聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和L-谷氨酸-7-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)等可降解的乳酸-乙醇酸共聚物、乙酸异丁酸蔗糖酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。

用于体内给药的药物组合物必须是无菌的。这通过例如无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常将含CpG寡核苷酸的组合物放入具有无菌进入端的容器中，例如，具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。

本文所述的药物组合物可以采用单位剂型，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液或悬浮液或栓剂，以用于口服、肠胃外或直肠施用或者通过吸入或吹入施用。

为了制备如片剂等固体组合物，可以将主要活性成分与药物载体例如常规压片成分(如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)和如水等其它药物稀释剂混合，以形成含有本发明的化合物的均相混合物固体预调配组合物或无毒的其药学上可接受的盐。在称这些预调配组合物均相时，这意指活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得组合物可以容易地细分成等效单位剂型，如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将这个固体预调配组合物细分成上述类型的单位剂型，所述单位剂型含有0.1至约500mg本发明的活性成分。可以包覆或以其它方式配混新组合物的片剂或丸剂以提供给出延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包括内剂量组分和外剂量组分，后者在前者之上采用包膜的形式。这两种组分可以通过肠溶层分开，所述肠溶层用于抵抗胃中的崩解并且允许内组分完整地传递进入十二指肠或被延迟释放。多种材料可以用于这种肠溶层或包衣，这种材料包含多种聚合酸以及聚合酸与如虫胶、十六醇和乙酸纤维素等此类材料的混合物。

合适的表面活性剂具体地包含非离子剂，如聚氧乙烯山梨聚糖(例如，Tween^TM 20、40、60、80或85)和其它山梨聚糖(例如，Span^TM 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包括介于0.05％与5％之间的表面活性剂，并且可以介于0.1％与2.5％之间。应当理解，如果有必要，可以添加其它成分，例如甘露醇或其它药学上可接受的媒剂。

可以使用如Intralipid^TM、Liposyn^TM、Infonutrol^TM、Lipofundin^TM和Lipiphysan^TM等市售的脂肪乳剂来制备合适的乳剂。活性成分可以溶解在预混合的乳剂组合物中，或者可替代地，活性成分可以溶解在油(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)和在与磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合时形成的乳剂中。应当理解，可以添加其它成分，例如甘油或葡萄糖，以调整乳剂的张力。合适的乳剂通常将含有高达20％的油，例如，介于5％与20％之间。脂肪乳剂可以包含具有合适尺寸的脂肪滴并且可以具有在5.5至8.0范围内的pH值。

乳剂组合物可以是通过将CpG寡核苷酸与Intralipid^TM或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而制备的那些乳剂组合物。

用于吸入或吹入的药物组合物包含药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液以及粉末。液体或固体组合物可以含有如上文所列出的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，通过口服或鼻腔呼吸途径施用组合物以产生局部或全身作用。

可以通过使用气体来雾化优选地无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物。可以直接从雾化装置中呼吸雾化溶液，或者雾化装置可以附着到面罩、帐篷或间歇正压呼吸机。可以从以适当方式递送调配物的装置优选地通过口服或鼻腔施用溶液、悬浮液或粉末组合物。

二、治疗应用

本文公开的包含二聚体形式的CpG寡核苷酸的药物组合物可用于刺激免疫活性，例如抗肿瘤免疫反应或抗感染免疫反应。

为了实践本文所公开的方法，可以通过合适的途径向需要治疗的受试者(例如，人)施用有效量的本文所述的药物组合物，所述合适的途径如静脉内给药(例如，如推注或通过一段时间内的连续输注)、通过瘤内、肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或局部途径。包含喷射雾化器和超声雾化器的用于液体调配物的可商购获得的雾化器可用于给药。液体调配物可以直接雾化并且冻干粉可以在重构之后雾化。可替代地，本文所述的含CpG寡核苷酸的药物组合物可以使用碳氟化合物调配物和计量吸入器来雾化或者作为冻干粉和研磨粉吸入。在一些实施例中，本文所述的药物组合物被配制用于瘤内注射。在特定实施例中，可通过局部途径将含有CpG寡核苷酸的药物组合物施用于受试者(例如，人类患者)，例如注射至局部部位(例如肿瘤部位或感染部位)。

如本文所使用的，“有效量”是指单独地或与一种或多种其它活性剂组合地赋予受试者治疗效果所需的每种活性剂的量。在一些实施方式中，治疗效果是减少肿瘤负荷、减少癌细胞或增加免疫活性。确定一定量的CpG寡核苷酸是否达到治疗效果对于本领域的技术人员而言将会是显而易见的。如本领域的技术人员所认识到的，有效量有所不同，这取决于正在治疗的特定病状、病状的严重程度、包含年龄、身体状况、大小、性别和体重在内的个体患者参数、治疗持续时间、同时疗法的性质(如果有的话)、具体施用途径和在健康从业者的知识和专业技能内的相似因素。这些因素是本领域的普通技术人员所熟知的并且可以仅通过常规实验来解决。通常优选使用个别组分或其组合的最大剂量，也就是说，根据合理的医学判断的最高安全剂量。

经验考虑，诸如半衰期通常会有助于确定剂量。施用频率可以在治疗过程中确定并进行调整，并且通常但不一定是基于目标疾病/病症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。可替代地，二聚体形式的CpG寡核苷酸的持续连续释放制剂可能是合适的。用于实现持续释放的各种调配物和装置是本领域已知的。

在一些实施例中，本文所述的CpG寡核苷酸的剂量可以在给予一次或多次抗体施用的个体中凭经验确定。给予个体递增剂量的CpG寡核苷酸。为了评估CpG寡核苷酸的功效，可以遵循疾病/病症的指标。

通常，对于本文所述的任何含有CpG寡核苷酸的药物组合物的给药，初始候选剂量可以是约100μg/kg的CpG寡核苷酸。出于本公开的目的，典型的日剂量的范围根据上述因素可以为约0.1μg/kg到1μg/kg、到10μg/kg、到100μg/kg、到1mg/kg、到2mg/kg、到4mg/kg、到40mg/kg、到100mg/kg或更多中的任何剂量。在一些情况下，CpG寡核苷酸可以约40nmol至约1500nmol的剂量范围施用于受试者(例如，人类癌症患者)，例如约50nmol至约1000nmol，约50nmol至约800nmol，约50nmol至约500nmol，约50nmol至约300nmol，约50nmol至约200nmol，或约50nmol至约100nmol。

对于在若干天或更长时间内的重复施用，根据病状持续治疗，直至出现期望的症状抑制或直至达到足以减轻目标疾病或病症或其症状的治疗水平。示例性给药方案包括施用约2mg/kg的初始剂量，之后施用约1mg/kg的每周维持剂量或者之后每隔一周施用约1mg/kg的维持剂量。

然而，根据从业者希望实现的药代动力学衰变模式，其它剂量方案可能是有用的。例如，设想每周给药一到四次。在一些实施方式中，可以使用约100g/mg至约4mg/kg范围对本文所述的含CpG寡核苷酸的药物组合物进行给药(例如约1g/kg、约10g/kg、约30g/kg、约100g/kg、约300g/kg、约1mg/kg、约2mg/kg和约4mg/kg)。在一些实施方式中，给药频率为每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次或每10周一次；或每月一次、每2个月一次或每3个月一次或更久一次。通过常规技术和测定，容易地监测这一疗法的进展。所用CpG寡核苷酸的给药方案可随时间变化。

在一些实施方式中，对于正常体重的成年患者，可以施用的剂量范围为约0.3到5.0mg/kg。特定的给药方案，即剂量、定时和重复，将取决于特定个体和所述个体的病史以及个别药剂的性质(如药剂的半衰期和本领域所熟知的其它考虑)。

在一些实施方式中，本文所述的方法包括向需要治疗的受试者(例如，人类患者)施用一个或多个剂量的含CpG寡核苷酸的药物组合物。

出于本公开的目的，本文所述的CpG寡核苷酸的适当剂量将取决于所采用的特异性CpG寡核苷酸、疾病/病症的类型和严重程度、CpG寡核苷酸是否出于预防或治疗目的而施用、既往疗法、患者的临床病史和对CpG寡核苷酸的应答以及主治医生的判定。临床医生可以施用CpG寡核苷酸，直到达到所需结果的剂量。在一些实施方式中，期望的结果是肿瘤负荷减少、癌细胞减少或免疫活性增加。确定剂量是否产生期望结果的方法对于本领域的技术人员而言将会是显而易见的。一种或多种CpG寡核苷酸的施用可以是连续或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况、施用目的是治疗性的还是预防性的以及熟练从业者已知的其它因素。CpG寡核苷酸的施用可以在预选时间段内基本上是连续的，或者可以例如在发展目标疾病或病症之前、期间或之后采用一系列间隔剂量。

如本文所使用的，术语“治疗”是指向受试者施加或施用包含一种或多种活性剂的组合物，所述受试者患有目标疾病或病症、疾病/病症的症状或对疾病/症状有易感性，其目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响病症、疾病的症状或对疾病或病症的易感性。

减轻目标疾病/病症包含延迟疾病的发展或进展或者降低疾病严重程度。减轻疾病不一定需要治愈的结果。如本文所用，“延迟”目标疾病或疾患的发展意指推迟、阻碍、减缓、妨碍、稳定和/或延缓疾病的进展。这种延迟可以具有不同的时间长度，这取决于疾病的历史和/或所治疗的个体。“延迟”或减轻疾病的发展或者延迟疾病的发作的方法是降低在给定时间帧内发展疾病的一种或多种症状的可能性和/或与不使用所述方法相比在给定时间帧内降低症状的程度的方法。这种比较通常是基于临床研究，使用足以给出统计学上显著的结果的许多受试者。

疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或后续进展。疾病的发展可以是可检测到的并且可以使用如本领域熟知的标准临床技术进行评估。然而，发展还指可能无法检测到的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包含发生、复发和发作。如本文所使用的，目标疾病或病症的“发作”或“发生”包含初始发作和/或复发。

在一些实施方式中，在体内以足以减少肿瘤负荷或癌细胞增长至少5％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或以上)的量向需要治疗的受试者施用本文所述的CpG寡核苷酸。在其他实施方式中，以有效将免疫活性提高至少5％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或以上)的量施用本文所述的CpG寡核苷酸。

根据待治疗的疾病的类型或疾病的位点，可以使用医学领域的普通技术人员已知的常规方法来向受试者施用药物组合物。这种组合物还可以通过其它常规途径施用，例如口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、颊、阴道或通过植入式储药器施用。如本文所使用的术语“肠胃外”包含皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。另外，可以通过可注射的贮库施用途径向受试者施用组合物，如使用1个月、3个月或6个月贮库可注射或可生物降解材料和方法。在一些实施例中，眼内或玻璃体内施用药物组合物。

可注射组合物可以含有各种载体，如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，可以通过滴注方法施用本文所述含CpG寡核苷酸的水溶性组合物，由此输注含有二聚体形式的CpG寡核苷酸和生理学上可接受的赋形剂的药物调配物。生理学上可接受的赋形剂可以包含例如5％葡萄糖、0.9％盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)或其它合适的赋形剂。肌肉内制剂(例如，CpG寡核苷酸的合适的可溶性盐形式的无菌调配物)可以在如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液等药物赋形剂中溶解和施用。

在一些实施方式中，本文所述的含CpG寡核苷酸的药物组合物可通过位点特异性或靶向局部递送技术施用。位点特异性或靶向局部递送技术的实施例包括含CpG寡核苷酸的药物组合物的各种可植入的长效来源或局部递送导管，诸如输注导管、留置导管或针导管、合成移植物、外膜包裹、分流器和支架或其他可植入装置、位点特异性载体、直接注射或直接施加。参见例如，PCT公开号WO 00/53211和美国专利号5,981,568。

也可以使用含有寡核苷酸的治疗组合物的靶向递送。受体介导的DNA递送技术在以下文献中描述，例如Findeis等人，《生物技术趋势》(Trends Biotechnol)(1993)11:202；Chiou等人，《基因疗法：基因直接转移的方法及应用》(Gene Therapeutics:Methods AndApplications Of Direct Gene Transfer)(J.A.Wolff编辑)(1994)；Wu等人，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)(1988)263:621；Wu等人，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)(1994)269:542；Zenke等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1990)87:3655；Wu等人，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)(1991)266:338。

通过本文所述方法治疗的受试者可以是哺乳动物，例如农场动物、比赛动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。在一个实施例中，受试者是人类。如本文所述的含有CpG寡核苷酸的组合物可用于增强需要治疗的受试者的免疫活性(例如，T细胞活性)。

在一些实施例中，受试者可以是患有、怀疑患有癌症或有患癌症的风险的人类患者。癌症的非限制性实施例可以是鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝肿瘤、胃癌、黑色素瘤和各种类型的头颈癌(包括鳞状细胞头颈癌)。在一些实施方式中，癌症可以是肺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、肾细胞癌、尿路上皮癌或霍奇金淋巴瘤。

在其他实施例中，受试者可以是患有或怀疑患有传染病或有患传染病的风险的人类患者，其中这些传染病与各种病原微生物有关。病原微生物可以是细菌、真菌、寄生虫或病毒。引起传染病的病原微生物的非限制性实施例可以是百日咳博德特氏菌、白色念珠菌、沙眼衣原体、大肠杆菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟氏菌、阴道加德菌、杜克雷嗜血杆菌、卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、牛分枝杆菌、人支原体、生殖支原体、梅毒螺旋体、解脲支原体、鼠疫杆菌、人乳头瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、多瘤病毒、铜绿假单胞菌、利什曼原虫和弓形虫。

具有目标疾病或病症(例如，癌症或传染病)的受试者可以通过常规医学检查(例如实验室测试、器官功能测试、CT扫描或超声波)来鉴定。疑似患有任何这样的目标疾病/病症的受试者可能示出该疾病/病症的一种或多种症状。处于疾病/病症风险的受试者可以是具有与该疾病/病症相关的一种或多种风险因素的受试者。此类受试者也可通过常规医学实践进行识别。

本文所述的方法中使用的特定给药方案，即剂量、定时和重复，将取决于特定受试者(例如，人类患者)和所述受试者的病史。

目标疾病/病症的治疗功效可以通过例如以下实施例中描述的方法来评估。

在一些实施方式中，含CpG寡核苷酸的药物组合物可以与另一种合适的治疗剂(例如，抗癌剂、抗病毒剂或抗菌剂)和/或用于增强和/或补充CpG寡核苷酸的免疫刺激作用的其他试剂共同使用。在这样的联合治疗中，含CpG寡核苷酸的组合物和另外的治疗剂(例如，抗癌治疗剂或本文所述的其它治疗剂)可以按顺序施用于需要治疗的受试者，即，每种治疗剂在不同的时间施用。可替代地，这些治疗剂或至少两种药剂基本上同时施用于受试者。

每种药剂的顺序或基本同时施用可以受到任何适当途径，包括但不限于口服途径、静脉内途径、肌内、皮下途径以及通过粘膜组织的直接吸收的影响。可以通过相同途径或通过不同途径来施用药剂。例如，第一种药剂(如本文所述的含CpG寡核苷酸的药物组合物)可以瘤内给药，第二种药剂(如抗癌剂)可以静脉内或口服给药。

如本文所用，除非另外指明，否则术语“顺序的”意指以规则的序列或顺序为特征，例如，如果剂量方案包括含CpG寡核苷酸的组合物和抗癌剂的施用，顺序剂量方案可以包括在抗癌剂的施用之前、同时、基本上同时或之后施用CpG寡核苷酸，但是每种药剂将以规则的序列或顺序施用。

除非另有说明，否则术语“分开”意指彼此分离。除非另有说明，否则术语“同时”意指在同时发生或完成，即，同时施用本发明的药剂。术语“基本上同时”意指药剂在彼此的几分钟之内(例如，在彼此的10分钟之内)施用，并且旨在包括联合施用以及连续施用，但是如果施用是连续的，则其仅在短时间段内(例如，执业医师分别施用两种药剂将所需要的时间)在时间上分开。如本文所用，同时施用和基本上同时施用可互换使用。顺序施用是指本文所述的药剂在时间上分开的施用。

联合疗法还可以包括本文所述的药剂(例如式(I)的含CpG寡核苷酸的组合物和抗癌剂)与其他生物活性成分(例如，不同的抗癌剂)和非药物疗法(例如，外科手术)进一步组合的施用。

应当理解，可以以任何顺序使用含有CpG寡核苷酸的组合物和另一种抗癌剂(例如，化疗剂)的任何组合来治疗癌症。可以基于多种因素来选择本文所述的组合，所述因素包括但不限于减少肿瘤形成或肿瘤生长、减少癌细胞、增加免疫活性和/或减轻至少一种与癌症相关症状的有效性，或减轻所述组合中另一种药剂的副作用的有效性。例如，本文所述的联合疗法可以减少与组合的每个单独成员相关的任何副作用，例如，与抗癌剂相关的副作用。

在一些实施方式中，另一种抗癌疗法是化学疗法、放射疗法、手术疗法和/或免疫疗法。化疗剂的实施例包括但不限于卡铂或顺铂、多西他赛、吉西他滨、白蛋白结合型紫杉醇、紫杉醇、培美曲塞和长春瑞滨。放射疗法的实施例包括但不限于电离辐射、伽马辐射、中子束放射疗法、电子束放射疗法、质子疗法、近距离放射疗法、全身放射性同位素和放射增敏剂。手术疗法的实施例包括但不限于治愈性手术(例如，肿瘤切除手术)、预防性手术、腹腔镜手术和激光手术。免疫疗法的实施例包括但不限于过继细胞转移和治疗性癌症疫苗。

化学疗法的其他实施例包括但不限于铂类药物，例如卡铂、奥沙利铂、顺铂、奈达铂、赛特铂、洛巴铂、特瑞铂、四硝酸酯、吡铂、Prolindac、阿罗铂和其他衍生物；拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱、托泊替康、伊立替康/SN38、鲁比替康、贝洛替康等衍生物；拓扑异构酶II抑制剂，例如依托泊苷(VP-16)、柔红霉素、多柔比星药剂(例如，多柔比星、盐酸多柔比星、多柔比星类似物或脂质体中的多柔比星及其盐或类似物)、米托蒽醌、阿柔比星、表柔比星、伊达比星、氨柔比星、吡柔比星、缬柔比星、佐柔比星、替尼泊苷等衍生物；抗代谢药，例如叶酸家族(甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞、氨蝶呤和相关的药物)；嘌呤拮抗剂(硫鸟嘌呤、氟达拉滨、克拉屈滨、6-巯基嘌呤、喷司他丁、氯法拉滨和相关的药物)和嘧啶拮抗剂(阿糖胞苷、氟尿苷、阿扎胞苷、替加氟、卡莫氟、卡培他滨、吉西他滨、5-氟脲嘧啶(5FU)和相关的药物)；烷化剂，例如氮芥(例如，环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、氮芥、异环磷酰胺、曲磷胺、泼尼莫司汀、苯达莫司汀、尿喃唳氮芥、雌莫司汀和相关的药物)；亚硝基脲类(例如，卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、福莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、链脲佐菌素和相关的药物)；三氮烯类(例如，达卡巴嗪、六甲蜜胺、替莫唑胺和相关的药物)；烷基磺酸盐(例如，白消安、甘露舒凡、曲奥舒凡和相关的药物)；丙卡巴肼；二溴甘露醇和氮丙啶(例如，卡巴醌、三亚胺醌、噻替派、三亚乙基蜜胺和相关的药物)；抗生素，如羟基脲、蒽环类抗生素(如阿霉素、柔红霉素、表柔比星及其他衍生物)；蒽二酮(例如，米托蒽醌和相关的药物)；链霉菌属(例如，博来霉素、丝裂霉素C、放线菌素、普卡霉素)；和紫外线。

三、用于调节免疫应答的试剂盒

本公开还提供了用于调节(例如，增强)免疫活性(例如，T细胞活性)、减轻癌症(例如，肺癌、黑色素瘤、结直肠癌或肾细胞癌)，和/或治疗或降低患癌症的风险的试剂盒。此类试剂盒可包括一个或多个容器，所述容器包含含有CpG寡核苷酸的药物组合物，例如本文所述的组合物中的任一种。

在一些实施方式中，试剂盒可以包括用于根据本文所述的任何方法使用的说明书。例如，包含的说明书可以包括对施用用于治疗、延迟发作或减轻如本文所述的那些目标疾病等目标疾病的含CpG寡核苷酸的组合物的描述。试剂盒可以进一步包括对基于鉴定个体是否患有目标疾病来选择适于治疗的所述个体的描述。在仍其它实施方式中，说明书包括对向具有目标疾病风险的个体施用含CpG寡核苷酸的组合物的描述。

与含CpG寡核苷酸的组合物的使用有关的说明书通常包含关于用于预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的用法说明通常是在标签或包装插页(例如，试剂盒中包括的纸张)上的书面用法说明，但是机器可读的用法说明(例如，载于磁盘或光存储磁盘上的用法说明)也是可接受的。

标签或包装插页指示组合物用于治疗、延迟发作和/或减轻如本文所述的那些目标疾病等与癌症相关的目标疾病或病症。可以提供说明书以用于实践本文所述的任何方法。

本文所述的试剂盒放置于合适的包装中。合适的包装包含但不限于小瓶、瓶、广口瓶、软包装(例如，密封的密拉(Mylar)或塑料袋)等。还设想了与具体装置(如吸入器、鼻腔施用装置(例如，雾化器)或输注装置(如微型泵))组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌进口端(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。容器也可以具有无菌进口端(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是含CpG寡核苷酸的组合物，例如本文所述的那些组合物。

试剂盒可以任选地提供如缓冲液等另外的组分以及解释性信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关的标签或一个或多个包装插页。在一些实施方式中，本发明提供了包括上文所述的试剂盒的内容物的制品。

四、通用技术

除非另有指示，否则本发明的实践将采用在本领域技术范围内的分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版(Sambrook等人，1989)，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)(MJGait编辑，1984)；《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)，瑚玛娜出版社(Humana Press)；《细胞生物学：实验室笔记簿》(Cell Biology:A Laboratory Notebook)(JE Cellis编辑，1998)，学术出版社(Academic Press)；《动物细胞培养》(Animal CellCulture)(R.I.Freshney编辑，1987)；《细胞和组织培养简介》(Introduction to Cell andTissue Culture)(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)，普莱纽姆出版社(Plenum Press)；《细胞和组织培养：实验室程序》(Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures)(A.Doyle、J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑，1993-8)，约翰威立父子集团(J.Wiley andSons)；《酶学方法》(Methods in Enzymology)(学术出版社公司)(Academic Press,Inc.)；《实验免疫学手册》(Handbook of Experimental Immunology)(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；《哺乳动物细胞的基因转移载体》(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)(J.M.Miller和M.P.Calos编辑，1987)；《分子生物学实验指南》(Current Protocols inMolecular Biology)(F.M.Ausubeld等人编辑，1987)；《PCR：聚合酶链式反应》(PCR:ThePolymerase Chain Reaction)，(Mullis等人编辑，1994)；《免疫学实验指南》(CurrentProtocols in Immunology)(J.E.Coligan等人编辑，1991)；《精编分子生物学实验指南》(Short Protocols in Molecular Biology)(威立父子集团(Wiley and Sons)，1999)；《免疫生物学》(Immunobiology)(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；《抗体》(Antibodies)(P.Finch，1997)；《抗体：实用方法》(Antibodies:a practical approach)(D.Catty编辑，IRL出版社，1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法》(Monoclonal antibodies:a practicalapproach)(P.Shepherd和C.Dean编辑，牛津大学出版社(Oxford University Press)，2000)；《使用抗体：实验室手册》(Using antibodies:a laboratory manual)(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))，1999)；《抗体》(The Antibodies)(M.Zanetti和J.D.Capra编辑，哈伍德学术出版社(Harwood AcademicPublishers)，1995)。无需进一步阐述，据信本领域技术人员能够基于以上描述最大程度地利用本发明。因此，以下具体实施方式应被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文所提及的目的或主题，本文所引用的所有出版物均通过引用并入。

无需进一步详细阐述，相信本领域的技术人员可以基于以上描述在最大程度上利用本发明。因此，以下具体实施方式应被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文所提及的目的或主题，本文所引用的所有出版物均通过引用并入。

实施例

实施例1：CpG寡核苷酸MBS513的制备和评价

MBS513是一种单链25bpCpG寡脱氧核苷酸(CpG DNA)，具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列和硫代磷酸酯核苷酸间键。通过将CpG DNA粉末溶解在15mg/ml(1.87mM)的过滤蒸馏去离子水(ddH₂O)中制备MBS513贮备溶液。MBS513原液在-20℃下保存备用。为获得MBS513工作溶液，将储备溶液在SELEX缓冲液(40mM HEPES、5mM KCl、111mM NaCl、1mMCaCl₂、1mM MgCl₂，pH 7.5)中进一步稀释至所需浓度，用于后续实验。

为了比较MBS513在溶液中的状态，将MBS513溶于2μM的ddH2O或SELEX缓冲液中。在琼脂糖凝胶上观察DNA，以测定两种溶液中单体或二聚体形式的MBS513的量。如图1A所示，溶于SELEX缓冲液的MBS513以与50bp标记相同的水平在凝胶上运行，表明SELEX缓冲液中的MBS513主要呈二聚体形式。相比之下，溶于ddH2O的MBS513大多呈单体形式，在琼脂糖凝胶上的运行速度比溶于SELEX缓冲液的MBS513更快。在SELEX缓冲液或ddH₂O中进行的MBS513HPLC分析获得了相似的结果；SELEX缓冲液中仅有10％的MBS513是单体，而ddH₂O中100％的MBS513是单体。

此外，使用HEK-Blue^TM hTLR9细胞(InvivoGen)在TLR9激活测定中测试了MBS513的功能。HEK-Blue^TM-hTLR9细胞表达人TLR9和诱导型SEAP(分泌型胚胎碱性磷酸酶)报告基因。SEAP基因处于融合到五个NF-κB和AP-1结合位点的IFN-β最小启动子的控制之下。用TLR9配体刺激可激活NF-κB和AP-1，从而诱导SEAP的产生。SEAP水平可以通过肉眼很容易地观察到，并且可以通过使用分光光度计在620-655nm处读取光密度(OD)来量化。MBS513以每孔20μl的量添加到平底96孔板中。将每孔接种20μl无菌、无内毒素的ddH₂O的孔作为阴性对照。从培养物中取出HEK-Blue^TM hTLR9细胞，冲洗并解离，以获得在预热的PBS中每毫升具有450000个细胞的单细胞悬浮液。将180μl的细胞悬液(约80000个细胞)加入到含有MBS513或ddH₂O的96孔板的每个孔中。反应终体积为200μl，并且反应中测试的MBS513最终浓度为0.2μM和1μM。然后将细胞在37℃下于5％CO2中培养6-16小时。SEAP的产量代表了TLR9激活的程度。图1B示出了MBS513以剂量依赖性方式激活TLR9信号传导。

从该实施例获得的结果表明盐，任选地在合适溶液中的其他组分，可以将大部分CpG寡核苷酸保持为二聚体形式。

实施例2：MBS513在体内抑制肿瘤生长的作用

为了评价MBS513在体内肿瘤生长中的作用，设计了如下实验，如图2A所示。分别将5×10⁵CT26肿瘤细胞皮下注射到BALB/c小鼠腹部的左右两侧。当肿瘤大小达到200cm³时，在肿瘤植入后10、12和14天，仅在动物右侧以50μl体积将12.5nmol、25nmol或50nmol的MBS513注射到肿瘤中。每2-3天测量腹部两侧的肿瘤体积。根据指南，当肿瘤体积达到25000cm³时处死小鼠。如图2B和图2C所示，MBS513不仅抑制局部肿瘤(右侧)的生长，而且抑制腹部另一侧(左侧)的远处肿瘤的生长。高剂量的MBS513(例如50nmol)在诱导导致肿瘤抑制的全身免疫应答方面表现出更好的有效性。图2D。

为进一步验证MBS513的远处肿瘤抑制作用，对两个不同批次的MBS513(MBS513-1和MBS513-2)进行了测试。如上所述进行了类似的实验，并使用不同剂量(12.5nmol、25nmol和50nmol)的MBS513治疗携带肿瘤的小鼠。有趣的是，与MBS513-2相比，MBS513-1对局部肿瘤和远处肿瘤均表现出更好的肿瘤抑制作用。图2D和图2E。

为了确定两个批次的MBS513之间的肿瘤抑制差异的影响因素，通过HPLC分析对MBS513-1和MBS513-2进行了比较。将200μg MBS513-1和MBS513-2分别溶解于50μl的SELEX缓冲液中，并进行HPLC分析。表1显示MBS513-1含有85.7％的二聚体和14.2％的单体，而MBS513-2含有73.3％的二聚体和11.1％(AU*min/AU*min)的单体。这些结果表明MBS513-1中较高的二聚体含量有助于更好地抑制局部肿瘤和远处肿瘤。

表1.两个批次MBS513中二聚体和单体的含量

	MBS513-1	MBS513-2
			二聚体	85.7％	73.3％
单体	14.2％	11.1％

同样，将MBS513-1对局部和远处肿瘤的肿瘤抑制作用与SD-101进行了比较，其中SD-101是目前正在临床试验中评估的CpG DNA。在以下文献中对SD-101的效果进行了评估：Sagiv-Barfi等人，《科学转化医学》(Science Translational Medicine)，2018年1月31日：第10卷，第426期，eaan4488。结果表明，SD-101可缩小局部肿瘤的体积，但不能对远处的肿瘤产生抑瘤作用。相比之下，MBS513-1能够缩小局部和远处肿瘤的肿瘤体积。

总之，从该审查员处获得的结果表明：与单体对应物相比，呈二聚体形式的CpG寡核苷酸显示出更好的抗肿瘤效果。更令人惊讶的是，局部注射二聚体CpG寡核苷酸诱导了全身性抗肿瘤免疫应答，导致未注射CpG寡核苷酸的远处肿瘤的体积缩小。

实施例3：二聚CpG寡核苷酸的形成与浓度相关

将MBS513溶解于不同浓度(包括20μM、100μM和500μM)的SELEX缓冲液、PBS缓冲液或生理盐水中。如此形成的溶液在所示的各种温度下培养(图3)并且通过HPLC分析溶液中二聚体MBS513和单体MBS513的含量。通过HPLC测定的二聚体面积(AU*min)/单体面积(AU*min)来计算二聚体MBS513与单体MBS513之间的比率(ds/ss)。

如图3所示，二聚体CpG复合体的形成是与浓度相关的。SELEX缓冲液和PBS缓冲液中的CpG寡核苷酸显示相似的dd/ss比率。

其它实施方式

本说明书中公开的所有特征可以以任何组合来组合。本说明书中公开的每个特征可以被用于相同、等效或类似目的的替代性特征替换掉。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅仅是等效或类似特征的通用系列的实施例。

通过以上描述，本领域的技术人员可以很容易地确定本发明的实质特性，并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适于各种用途和条件。因此，其它实施方式也在权利要求范围内。

等效物

尽管本文已经描述和展示了若干个本发明实施方式，但本领域的普通技术人员将容易想到用于执行功能和/或获得结果和/或本文所述的优点中的一个或多个优点的各种其它装置和/或结构，并且此类变异和/或修改中的每一个均被视为在本文所述的本发明实施方式的范围内。更一般地，本领域的技术人员将容易地理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和配置意味着示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于使用本发明教导的一种或多种具体应用。仅使用常规实验，本领域的技术人员将认识到或能够确定本文所述的具体本发明实施方式的许多等效物。因此，应理解，前述实施方式仅以实施例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等效物的范围内，可以以不同于具体描述的和要求保护的方式来实践本发明实施方式。本公开的本发明实施方式涉及本文所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法并不相互矛盾，则两个或更多个此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合包含在本公开的发明范围内。

本文中定义和使用的所有定义都应当理解为对字典定义的控制、通过引用并入的文件中的定义和/或定义术语的普通含义。

本文公开的所有参考文献、专利和专利申请相对于各自所引用的主题而并入本文，在一些情况下，其可能涵盖整个文件。

除非清楚地相反地指出，否则如本文中在说明书和权利要求中使用的不定冠词“一个(a)”和“一种(an)”应理解为意指“至少一个”。

如本文中在说明书和权利要求中所使用的，短语“和/或”应当理解为意指如此联合的要素中的“任一个或两个”，即要素在一些情况下结合地存在而在其它情况下分开存在。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式理解，即如此联合的要素中的“一个或多个”。除了通过“和/或”从句具体标识的要素之外，还可以任选地存在其它要素，而无论是与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实施例，当与开放式语言，如“包括”结合使用时，对“A和/或B”的引用在一个实施方式中可以仅指代A(任选地包含除了B之外的要素)；在另一个实施方式中，仅指代B(任选地包含除了A之外的要素)；在又另一个实施方式中，指代A和B两者(任选地包含其它要素)等。

如本文中在说明书和权利要求中所使用的，“或”应被理解为具有与如上文定义的“和/或”相同的含义。例如，当将列表中的项目分开时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即，包含多个要素或要素列表中的至少一个要素、但是还包含多于一个要素，以及任选地另外未列出的项。只有明确地指示相反的术语，如“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”或者在权利要求中使用时“由……组成”将指代包含多个要素或要素列表中的恰好一个要素。通常，当之前有排他性术语，如“任一个”、“……之一”、“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”时，如本文中所使用的术语“或”应当仅被解释为指示排他性替代方案(即“一个或另一个而非两者”)。当在权利要求中使用时，“基本上由……组成”应具有如在专利法领域中所使用的普通含义。

如本文中在说明书和权利要求中所使用的，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应被理解为意指选自要素列表中的任何一个或多个要素的至少一个要素，但不必要包含要素列表内具体列出的每个要素中的至少一个并且不排除要素列表中的要素的任何组合。这个定义还允许可以任选地存在除了短语“至少一个”所指代的要素列表内具体标识的要素之外的要素，无论与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实施例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方式中可以指代至少一个，任选地包含多于一个A，而不存在B(并且任选地包含除了B之外的要素)；在另一个实施方式中指代至少一个、任选地包含多于一个B，而不存在A(并且任选地包含除了A之外的要素)；在又另一个实施方式中指代至少一个、任选地包含多于一个A，以及至少一个、任选地包含多于一个B(并且任选地包含其它要素)等。

还应该理解，除非明确相反地指出，否则在本文要求保护的包含多于一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不一定限于叙述方法的步骤或动作的顺序。

Claims (20)

1.一种药物组合物，包括：

(i)CpG寡核苷酸；

(ii)缓冲剂；和

(iii)总浓度为约80-130mM的一种或多种盐；

其中组合物中至少80％的CpG寡核苷酸为二聚体形式。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述CpG寡核苷酸包含核苷酸序列5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTT-3'(SEQ ID NO:1)。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中CpG寡核苷酸是修饰的寡核苷酸。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键、甲基膦酸酯键或硼烷磷酸酯键。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂为HEPES、DPBS或PBS缓冲液。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物中缓冲剂的浓度为30-60mM。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH值为7-8。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的药物组合物，其中盐的总浓度为约120mM。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的药物组合物，其中所述一种或多种盐包括KCl、NaCl、CaCl₂、MgCl₂或其组合。

10.据权利要求1-9中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含浓度至少为约500μM的CpG寡脱氧核苷酸。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述CpG寡脱氧核苷酸的浓度为约500μM至5000μM。

12.一种二聚寡核苷酸复合物，其包含两个CpG寡核苷酸分子，其中至少一个包含SEQID NO:1所示的核苷酸序列。

13.根据权利要求12所述的二聚寡核苷酸复合物，其中所述两个CpG寡核苷酸分子均包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

14.一种用于刺激受试者免疫应答的方法，包括：

向有需要的受试者施用有效量的根据权利要求1-9任一项所述的药物组合物或根据权利要求12-13任一项所述的二聚寡核苷酸复合物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述受试者是患有或疑似患有癌症或传染病的人类患者。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述人类患者患有选自黑色素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌和淋巴瘤的癌症。

17.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中以100μg/kg至4000μg/kg CpG寡核苷酸的剂量向所述受试者施用所述药物组合物或所述二聚寡核苷酸复合物。

18.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中以约40nmol至约150nmol的剂量向所述受试者施用所述药物组合物或所述二聚寡核苷酸复合物。

19.根据权利要求18所述的方法，其中以约50nmol的剂量向所述受试者施用所述药物组合物或所述二聚寡核苷酸复合物。

20.根据权利要求14-19中任一项所述的方法，其中通过瘤内注射将所述药物组合物施用于所述受试者。

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