CN108026533B - 拮抗性pdl1适体及其在癌症治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于结合并拮抗PDL1的适体，以及其在增强免疫活性(例如促进T细胞增生)、治疗癌症及/或感染性疾病方面的用途，感染性疾病为诸如肠病毒、HBV或HCV感染所致的感染。

Description

拮抗性PDL1适体及其在癌症治疗中的应用
相关申请案的交叉引用
本申请案请求在2015年9月1日提申的名为“拮抗性PDL1适体及其在癌症治疗中的应用”的美国临时申请第62/212,772号的申请日权益，其整体内容以引用的方式并入本文。
背景技术
免疫系统是一种由数个免疫检查点路径(immune checkpoint pathway)所调节的复杂信号网络，其涉及免疫细胞上的共刺激分子和共抑制分子，它们会阻止自身反应性和过度活化的信号传递。程序性细胞死亡-1蛋白(PD-1)是一个检查点分子，其在感染的发炎性反应时抑制周边组织中的T细胞活性，从而限制T细胞自体免疫性。
PD-1主要表现于T细胞上，且其表现在T细胞活化期间受到诱导。除了T细胞，PD-1也表现于其他免疫细胞(例如B细胞、树突细胞、天然杀手细胞和巨噬细胞)上。当被其配体之一(如程序性死亡配体1(PDL1))结合时，PD-1透过磷酸酶SHP1和SHP2来抑制参与T细胞活化的激酶，例如PI3K和AKT。此外，PD-1：PDL1的接合已显示会抑制T细胞葡萄糖消耗、下调细胞介素释放，并抑制T细胞增生。
PDL1表现于抗原呈现细胞(APC)上，抗原呈现细胞包括B细胞、树突细胞和巨噬细胞。此外，已经在各种类型的癌细胞上检测到PDL1表现，包括实体肿瘤(如非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、乳癌、结肠癌、胰脏癌、胃癌)以及血液恶性病(如急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病与其他)。癌细胞上的PDL1过度表现可能是透过增加PD-1：PDL1交互作用而导致肿瘤免疫逃避，这显著地损害T细胞功能。同样地，PDL1表现与癌症患者治疗结果以及在临床环境中的总体存活成反比。因此，需要干扰PD-1：PDL1交互作用并拮抗PD-1细胞内信号传递路径的新颖治疗剂，例如适体。
适体是能够形成二级结构或甚至复杂三维结构，并对靶蛋白具有特异性结合活性的短核酸(DNA或RNA)分子。适体技术自1990年代初期发现以来进展极大。适体具有若干使它们适于治疗应用的优点，包括分子量较低(这使得与抗体相比更容易穿透组织)、化学合成费用低、已建立的修饰方法和稳定性高。因此，开发对靶蛋白具有高亲和力的合适适体是非常有意义的。
发明概述
本案所揭示内容是以开发抗PDL1核酸适体为基础，该抗PDL1核酸适体在活体外成功阻止PD-1和PDL1之间的交互作用并且在活体内抑制肿瘤生长。
因此，本案所揭示内容的一个方面的特征在于结合PDL1并中和PDL1之抑制活性的核酸适体(抗-PDL1适体)。本案所揭示内容的任一核酸适体的长度可以为30-62个核苷酸(nt)。
在一些具体例中，核酸适体包含具有核苷酸序列5'-CGGGCCACAT-3'(SEQ ID NO：1)的核酸基序。此一抗PDL1适体可包含与ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT(SEQ ID NO：2)至少85％(例如至少90％，至少95％或以上)一致的核酸序列。在一个实例中，核酸适体包含SEQ ID NO：2的核酸序列。在另一个实例中，核酸适体由SEQ ID NO：2的核酸序列组成。
在其他具体例中，核酸适体可包含与以下至少85％(例如，至少90％，至少95％或更高)一致的核酸序列：
(i)ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT(SEQ ID NO：2)；
(ii)CACTCAATAATTCCACTGCTACATACGTTT(SEQ ID NO：3)；
(iii)AAACTAGGGTCCATTTGTGTACCTGCGA(SEQ ID NO：4)；
(iv)ACATCAACTTGATAGACAACTGCGTCCACT(SEQ ID NO：5)；
(v)CATCTGGTACCTTACGACGCTTCATCTCCC(SEQ ID NO：6)；
(vi)CATGTTTTCGAAAGACAATCCGCTGCCCTG(SEQ ID NO：7)；或
(vii)CATGTTCCTTTCGTTCTGCCTTTTCCTTCC(SEQ ID NO：8)。
在一些具体例中，核酸适体包含SEQ ID NO：2-8中任一的核酸序列。在其他具体例中，核酸适体由SEQ ID NO：2-8中任一的核酸序列组成。
本案所揭示内容的另一方面的特征在于医药组成物，其包含本文所述的任一抗PDL1适体以及医药上可接受的载剂。
在另一方面中，本案所揭示内容提供一种用于治疗癌症(例如黑色素瘤、非小细胞肺癌、结肠直肠癌或肾细胞癌)的方法，包含向有治疗需要的个体给予有效量的任一本文所述医药组成物。在一些具体例中，个体可以是患有癌症、疑似患有癌症或处于癌症风险下的人类患者，例如本文所述者。
在另一方面中，本案所揭示内容提供一种治疗感染性疾病的方法，包含向有需要的个体给予有效量的任一本文所述医药组成物。在一些具体例中，个体可以是患有感染或疑似患有感染的人类患者(感染为例如由肠病毒、HBC、HCV、HAV、HDV或HEV所致的感染)。
此外，本案所揭示内容提供一种在有治疗需要的个体中增强免疫活性的方法，该方法包含向有需要的个体给予有效量(例如有效提高T细胞活化)的含任一抗PDL1适体的本文所述医药组成物。
亦在本案所揭示内容范畴内的是(a)用于治疗癌症(例如，肺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌，或肾细胞癌)，或感染性疾病(如肠病毒、HBV、HCV、HAV、DV或HEV感染)的医药组成物，其中该医药组成物包含任一本文所述的抗PDL1适体与医药上可接受的载剂；以及(b)抗PDL1适体在制备用于治疗癌症(如本文所述癌症)或感染性疾病(如本文所述彼等疾病)的药物中的用途。
在下面说明中阐述本发明一个或多个实施例的详细内容。由下面附图和几个实施例的详细说明，还有从随附的申请专利范围，本发明的其他特征或优点将会是清楚的。
图式简单说明
图1是显示经由SELEX选择结合至PDL1的核酸适体的过程示意图。在该例示性示意图中，显示用于筛选人类PDL1靶向适体的硝基纤维素滤膜SELEX方法。
图2是显示候选适体(包括AP14、AP22、AP32、AP33、AP36和AP48)对PDL1的相对结合能力的图。
图3是一个图表，描绘用于在竞争分析中阻断PDL1和PD-1交互作用的候选PDL1适体的效力。
图4包括显示AP14(左图)和AP32(右图)作为PDL1拮抗适体的50％有效剂量(ED50)。AP14的ED50为41nM(左图)。AP32的ED50为12nM(右图)。
图5包括显示一个62-nt(左图，SEQ ID NO：9)、一个45-nt(中图，SEQ ID NO：2)，和一个30-nt(右图，SEQ ID NO：10)抗-PDL1适体的序列和二级结构的图。使用Mfold预测每个适体的二级结构。
图6是表示使用竞争分析，抗PDL1适体(图5的62-nt，45-nt以及30-nt)阻断PD-1：PDL1交互作用的效力。
图7包括数据的图形呈现，显示AptPDL1对A549(左上图)和HOP92(右上图)人类癌细胞的结合能力，其分别显示出高的和低的PDL1表现水平。作为对照，显示了抗PDL1抗体对A549(左下图)和HOP92(右下图)人类癌细胞的结合能力。
图8包括数据的图形呈现，显示AptPDL1对CT26(左上图)和LL/2(右上图)小鼠癌细胞的结合能力，其分别显示出高的和低的PDL1表现水平。作为对照，显示了抗PDL1抗体对CT26(左下图)和LL/2(右下图)小鼠癌细胞的结合能力。
图9包括数据的图形呈现，显示aptPDL1对CT26(左图)和LL2(右图)小鼠癌细胞的解离常数。
图10是显示使用同基因小鼠模型，aptPDL1在活体内对CT26结肠直肠癌细胞的抑制效果的图。当用透过瘤内注射给予的aptPDL1治疗小鼠时，数据显示肿瘤生长抑制约50％。
图11是显示使用同基因小鼠模型，aptPDL1在活体内对CT26结肠直肠癌细胞的抑制效果的抑制效果的图(左图)。当用透过腹膜内注射给予的aptPDL1治疗小鼠时，数据显示肿瘤生长抑制约73％。来自用aptPDL1(底排肿瘤)或对照随机序列(顶排肿瘤)治疗的小鼠的肿瘤图像(右图)显示在右图中。
图12是显示使用同基因小鼠模型，aptPDL1在活体内对LL/2肺癌细胞的抑制效果的图(上图)。数据显示，腹膜内给予aptPDL1的连续给药导致接种LL/2的小鼠有显著的肿瘤抑制效应。来自用aptPDL1(底排肿瘤)或对照随机序列(顶排肿瘤)治疗的小鼠的肿瘤图像(下图)显示在下图中。
图13是显示使用活体外细胞生存力分析，aptPDL1对抗CT26(左图)和LL/2(右图)的细胞毒性的图。数据显示aptPDL1对CT26(左)和LL/2(右)癌细胞没有直接的细胞毒性。
图14是显示IFNγ与趋化因子CXCL9/10/11在经aptPDL1处理的CT26(左图)和LL/2(右图)肿瘤中的表现水平的图。IFNγ和趋化因子CXCL9/10/11表现水平是使用从组织中萃取并透过逆转录定量PCR定量RNA来测定。数据显示在经aptPDL1处理的CT26(左)和LL/2(右)肿瘤中的IFNγ、CXCL9、CXCL10，和CXCL11的水平升高。
图15是显示趋化因子CXCL9/10/11在经aptPDL1处理的CT26和LL/2肿瘤中的表现水平的免疫墨点。使用从组织和蛋白质特异性抗体萃取的蛋白质测定趋化因子CXCL9/10/11的表现水平。进行β肌动蛋白水平的分析作为对照。数据显示在经aptPDL1处理的CT26(左)和LL/2(右)肿瘤中CXCL9、CXCL10和CXCL11的水平升高。
图16包括显示经对照和aptPDL1治疗的肿瘤中的CD31阳性肿瘤内微血管荧光图，以及肿瘤内微血管密度量化图。A：显示用对照适体(左)和aptPDL1(右)治疗的小鼠中，CD31-阳性肿瘤内微血管荧光影像讯号的照片。B：定量图A中所示的荧光影像讯号的图。数据显示在经aptPDL1治疗的组别中，CD31阳性肿瘤内微血管的长度和密度均显著降低。
发明的详细说明
PDL1，免疫抑制受体PD-1的配体，表现于许多实体肿瘤上。PDL1：PD-1的接合会触发免疫抑制路径并损害免疫细胞的抗肿瘤活性。本文提供的拮抗PDL1适体可以阻断PDL1和PD-1之间的交互作用并诱导免疫细胞的抗肿瘤活性。
大部分针对PDL1的靶向治疗剂是单株抗体。与抗体和其他基于蛋白质的传统药物相比，本文提供的基于核酸的PDL1靶向适体具有更高的稳定性和更低的大规模合成费用。此外，PDL1适体易于进行化学修饰以提高生物可用度和稳定性，但批次效应很少。
如本文所述的适体可以是核酸分子(例如单链DNA或RNA)，其可在生理条件下形成特定二级和三级结构。本文所述的例示性PDL1拮抗适体(aptPDL1)是一个有45个核苷酸长的DNA寡核苷酸，其透过Mfold预测形成两个柄-环结构(图5)。aptPDL1对PDL1的解离常数为约5nM，指出aptPDL1以比PD1蛋白(对PDL1的解离常数为770nM)高出许多的亲和力结合至PDL1。aptPDL1显示在活体外使用竞争分析中能有效地防止PD-1结合PDL1。aptPDL1阻断PD-1：PDL1交互作用的50％有效剂量(ED50)为约12nM。在同基因小鼠模型中，肿瘤内和腹膜内注射aptPDL1显著抑制表现PDL1的CT26结肠直肠肿瘤的生长。此外，腹膜内给予aptPDL1的连续给药导致在LL/2鼠同基因肿瘤模型中有明显肿瘤抑制效用。
本文提供的结果表明，抗PDL1适体(例如aptPDL1)是PDL1拮抗单株抗体的有前景替代品。基于核酸的治疗剂(如抗PDL1适体(例如aptPDL1))在合成、稳定性和患者耐受性方面有优势。适体可以容易地通过化学反应合成，与抗体合成相比，其费用更低、批次效应更低且纯度更高。适体可以粉末形式保存，而不会丧失药物功效和稳定性。此外，基于核酸的治疗剂(例如基于DNA或RNA的治疗剂)在动物研究和临床前试验中已显示毒性很低且免疫原性低。
抗PDL1适体(如aptPDL1)可靶向细胞表面上的PDL1细胞外结构域。与靶向细胞内SHP1和SHP2磷酸酶结构域的小化学药物或降解PDL1mRNA的siRNA相比，这种适体分子将具有更高的靶可接近性。此外，抗PDL1适体可以容易地修饰以增加对PDL1的亲和力和特异性、抵抗在血流中的内切或外切核酸酶的降解，并延长在循环系统中的血清半衰期。要达到一个或多个此类目的的基于核酸的分子的合适修饰是本技术中已知的或本文揭示的。例如，抗PDL1适体(如aptPDL1)的可行修饰可以包括在抗PDL1适体的5'-或3'-端引入官能基、将经修饰碱基引入核苷酸序列，及/或修饰相邻核苷酸间的键结键。
因此，本揭示内容是以开发许多抗PDL1核酸适体并且透过例示性抗PDL1适体成功抑制PD-1/PDL1交互作用为基础。如本文所揭示，抗PDL1适体(例如aptPDL1)当在接种有CT26结肠直肠癌细胞或LL/2肺癌细胞的小鼠体内肿瘤内或腹膜内给予时能显著降低肿瘤的生长。因此，抗PDL1适体(如本文所述)将有效地增强免疫活性和预防肿瘤生长，从而提供对癌症的有效治疗。这样的抗PDL1适体也可有效抑制感染，因此有益于治疗感染性疾病(例如肠病毒或HBV感染)。
因此，本文所述为抗PDL1适体、包含抗PDL1适体的医药组成物，以及使用本文揭示的抗PDL1适体增强免疫活性及/或治疗疾病(例如癌症和感染性疾病)的方法。
抗PDL1适体
本文揭示结合至PDL1并抑制其活性，从而增强免疫活性(例如T细胞活性)的核酸适体(抗-PDL1适体)。因此，本文揭示的抗PDL1适体将会是癌症和感染性疾病的有益治疗。
如本文所用的核酸适体是指对特定靶分子(例如PDL1)具有结合活性的核酸分子(DNA或RNA)。适体可以结合至特定靶分子，从而经由例如阻断靶分子结合至同源配体、造成靶分子的构形改变及/或阻断靶分子的活性中心来抑制靶分子的活性。本案所揭示内容的抗PDL1适体(呈线性或环状形式)可以是RNA、DNA(例如单股DNA)、经修饰核酸，或其混合物。抗PDL1适体可以是非天然分子(例如含有的核苷酸序列不存在于天然基因中或含有自然界不存在的经修饰核苷酸)。或者或另外，抗PDL1适体可以不含有编码功能肽的核苷酸序列。
PDL1，指程序性死亡配体1蛋白(也称为CD274或B7-H1)，是一种在抑制免疫系统中扮演重要角色的细胞表面蛋白，例如在怀孕、组织同种异体移植、自体免疫疾病，感染和癌症期间。PDL1结合至其受体PD-1，PD-1表现于活化的T细胞、B细胞和骨髓细胞上以调节活化或抑制。在人类中，PDL1由CD274基因编码。人类PDL1的例示性胺基酸序列可以按照基因库(GenBank)登录号NP_001254635找到。
本文所揭示的抗PDL1核酸适体可以包含具有“5-CGGGCCACAT-3”(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列的核酸基序。SEQ ID NO：1的基序预期是与PDL1交互作用并阻断其与PD-1交互作用的关键结构域。因此，含有该基序的核酸分子预期是如本文所述的抗PDL1适体。包含SEQ ID NO：1基序的抗PDL1核酸适体可包含一个与ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACT GCCCGT(SEQ ID NO：2)至少85％(例如90％、95％或98％)一致的核苷酸序列，其中SEQ ID NO：1的基序(motif)加底线。在SEQ ID NO：1的基序外的任何残基处可以发生高达15％的变化。在一些具体例中，抗PDL1核酸适体可包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列。在一些具体例中，抗PDL1核酸适体由SEQ ID NO：2组成。
在其他实例中，本文揭示的抗PDL1核酸适体可包含与以下至少85％(例如90％、95％或98％)一致的核苷酸序列：
ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT(SEQ ID NO：2)，
CACTCAATAATTCCACTGCTACATACGTTT(SEQ ID NO：3)，
AAACTAGGGTCCATTTGTGTACCTGCGA(SEQ ID NO：4)，
ACATCAACTTGATAGACAACTGCGTCCACT(SEQ ID NO：5)，
CATCTGGTACCTTACGACGCTTCATCTCCC(SEQ ID NO：6)，
CATGTTTTCGAAAGACAATCCGCTGCCCTG(SEQ ID NO：7)，或
CATGTTCCTTTCGTTCTGCCTTTTCCTTCC(SEQ ID NO：8)。
本文揭示的此抗PDL1核酸适体可包含以下核苷酸序列或由其组成：
ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT(SEQ ID NO：2)，
CACTCAATAATTCCACTGCTACATACGTTT(SEQ ID NO：3)，
AAACTAGGGTCCATTTGTGTACCTGCGA(SEQ ID NO：4)，
ACATCAACTTGATAGACAACTGCGTCCACT(SEQ ID NO：5)，
CATCTGGTACCTTACGACGCTTCATCTCCC(SEQ ID NO：6)，
CATGTTTTCGAAAGACAATCCGCTGCCCTG(SEQ ID NO：7)，或
CATGTTCCTTTCGTTCTGCCTTTTCCTTCC(SEQ ID NO：8)。
两个核酸的“一致性百分比”是使用Karlin和Altschul美国科学学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87:2264-68,1990，如在Karlin和Altschul美国科学学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:5873-77,1993中经修改的算法来决定。此算法并入至Altschul,等分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。BLAST核苷酸搜寻可以用NBLAST程序来进行，得分＝100，字长-12，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。当两个序列之间存在空位时，如Altschul等,核酸研究(Nucleic Acids Res.)25(17):3389-3402,1997中所述使用空位(Gapped)BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序的默认参数(例如XBLAST和NBLAST)。
在其他具体例中，本文所述的抗PDL1适体相较于参考序列可含有至多8个(例如最多7、6、5、4、3、2，或1个)核苷酸变化，如SEQ ID NO：1-8中的任意一个。可以引入此等变化的位置可以基于例如适体的二级结构来决定，而适体的二级结构是使用计算机算法来进行预测，如Mfold。作为一个实例，可引入这种变化的位置可以基于以下的二级结构来决定：TCCCTACGGCGCTAACACATCAACTTGATAGACAACTGCGTCCACTGCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO：9)、ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT(SEQ ID NO：2)，或CACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCC(SEQ ID NO：10)，如图5中所示。举例来说，在双股柄区中的碱基对可能突变成不同的碱基对。这种突变将使得碱基对维持在该位置的双股区内，并因此对适体的整体二级结构没有显著影响。这种类型的突变是本领域技术人员熟知的。例如，A-T对可以突变成T-A对。或者，其可以突变为G-C或C-G对。在另一个实例中，G-C对可以突变成C-G对。或者，其可以突变成A-T对或T-A对。
本文揭示的任一抗PDL1适体可含有约30-80个核苷酸(nt)的长度。在一些具体例中，包含一个核酸基序的核酸适体是大约40-80个nt、40-65个nt、40-62个nt、50-80个nt、60-80个nt，或70-80个nt。在一些具体例中，包含一个核酸基序的核酸适体是大约30-70个nt、30-65个nt、30-62个nt、30-60个nt、30-50个nt，或30-40个nt。在一些特定实例中，抗PDL1适体的长度范围可以在约50个nt至约60个nt内。
一般来说，术语“约”和“大约”是指经技术中具有通常技术者确定的特定值的可接受误差范围内。“约”可以表示少于给定值的±30％、较佳少于±20％、更佳少于±10％、更佳少于±5％，且又更佳少于±1％的范围。
在一些具体例中，本文所述抗PDL1适体可以低于20nM的解离常数(Kd)结合至PDL1(例如人类PDL1)(例如15nM、10nM、5nm、1nm或更少)。抗PDL1适体可以特异性结合人类PDL1。或者，适体可以结合至不同物种(例如人类和小鼠)的PDL1分子。当结合至表现于细胞表面上的PDL1分子时，此一适体可抑制PDL1活性(因而增加T细胞活性)达至少20％(例如40％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、100倍或1,000倍)。抗PDL1适体对PDL1的抑制活性(并因此在提高T细胞活性方面的活化)可以透过本技术中已知的方法来进行测定，已知的方法为例如T细胞增生分析，其先前已描述过，例如在Clay T.M.,等,癌症主动免疫治疗中细胞免疫反应的监测方法，临床癌症研究(Assays for Monitoring Cellular Immune Responsesto Active Immunotherapy of Cancer,Clin Cancer Res).,2001年五月,7,1127中；其相关教示以引用的方式并入本文。应当理解，本文提供用于测量T细胞活性的方法是例示性的，并不意味着限制。
下面提供了许多例示性抗PDL1适体：
aptPDL1：ACGGGCCACATCAACTCATTGATAGACAATGCGTCCACTGCCCGT(SEQ ID NO：2)
AP14：TCCCTACGGCGCTAACCACTCAATAATTCCACTGCTACATACGTTTGCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO：11)
AP22：TCCCTACGGCGCTAACAAACTAGGGTCCATTTGTGTACCTGCGAGCCACCGTGCTACAAC(SEQID NO：12)
AP32：TCCCTACGGCGCTAACACATCAACTTGATAGACAACTGCGTCCACTGCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO：9)
AP33：TCCCTACGGCGCTAACCATCTGGTACCTTACGACGCTTCATCTCCCGCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO：13)
AP36：TCCCTACGGCGCTAACCATGTTTTCGAAAGACAATCCGCTGCCCTGGCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO：14)
AP48：TCCCTACGGCGCTAACCATGTTCCTTTCGTTCTGCCTTTTCCTTCCGCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO：15)
在上述例示性抗-PDL1适体中，5'-和3'-端的斜体区是5'和3'引物区(参见下面的实例1)，其可以被替换或修饰而对这些适体的PDL1结合活性没有显著影响。
在一些具体例中，本文所述的任一抗PDL1适体可含有非天然核碱基、糖或共价核苷间键结(骨架)。这种经修饰的寡核苷酸赋予期望性质，例如，细胞摄入增强、对靶核酸的亲和力增进，以及活体内稳定性增加。
在一个实例中，本文所述适体具有经修饰的骨架，包括那些保有磷原子的(参见例如美国专利第3,687,808号；第4,469,863号；第5,321,131号；第5,399,676号；以及第5,625,050号)，与那些不具有磷原子的(参见例如美国专利第5,034,506号；第5,166,315号；以及第5,792,608号)。含磷经修饰骨架的实例包括，但不限于具有3’-5’键结或2’-5’键结的硫代磷酸酯、对掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基-磷酸三酯、磷酸甲基酯与其他磷酸烷基酯(包括3’-磷酸伸烷基酯、5’-磷酸伸烷基酯与对掌性磷酸酯)、亚磷酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基磷酸酯与氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰代氨基磷酸酯、硫羰代烷基磷酸酯、硫羰代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯，以及硼烷磷酸酯。此等骨架也包括那些具有相反极性者，亦即3’至3’、5’至5’或2’至2’键结。不包括磷原子的经修饰骨架是由短链烷基或环烷基核苷间键结，混合杂原子与烷基或环烷基核苷间键结，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键结所形成。此等骨架包括那些具有吗啉基键结者(部分由核苷的糖部分所形成)；硅氧烷骨架；硫化物；亚砜和砜骨架；甲酰乙酰基(formacetyl)和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；核糖乙酰基骨架；含烯骨架；磺酰胺骨架；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及其他具有混合的N、O、S和CH2组成部分的骨架。
在另一个实例中，本文所述适体包括一个或多个经置换糖部分。这些经置换糖部分可在其2’位置处包括下列基团之一：OH；F；O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基；O-炔基、S-炔基、N-炔基及O-烷基-O-烷基。在这些基团中，烷基、烯基及炔基可以是未经置换或经置换C1至C10烷基或C2至C10烯基与炔基。它们也可以在其2’位置处包括杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、经置换硅烷基、RNA切割基团、报导子基团、嵌入剂、增进寡核苷酸的药动学特性的基团，或增进寡核苷酸的药效学特性的基团。较佳的经置换糖部分包括那些具有2’-甲氧基乙氧基、2’-二甲基胺基氧基乙氧基，及2’-二甲基胺基乙氧基乙氧基。参见Martin等,瑞士化学(Helv.Chim.Acta),1995,78,486-504。
另外或此外，本文所述适体包括一个或多个经修饰天然核碱基(亦即腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)。经修饰核碱基包括那些描述在美国专利第3,687,808号中的。简明高分子科学与工程百科全书(Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering),第858-859页,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley&Sons,1990、Englisch等,德国应用化学(国际版)(Angewandte Chemie,International Edition),1991,30,613，以及Sanghvi,Y.S.,第15章,反义研究与应用(Antisense Research and Applications),第289-302页,CRC出版社,1993。这些核碱基中的某一些尤其适用于增加适体分子对其靶位点的结合亲和力。这些包括5-经置换的嘧啶、6-氮杂嘧啶及N-2、N-6与O-6经置换嘌呤(例如2-氨基丙基-腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶与5-丙炔基胞嘧啶)。参见Sanghvi,等,eds.,反义研究与应用(Antisense Research and Applications),CRC出版社,伯克莱屯(Boca Raton),1993,第276-278页)。
另外或此外，如本文所述的抗PDL1适体可包含一个或多个锁定核酸(LNA)。通常称为不可接近RNA的LNA是经修饰RNA核苷酸，其中核糖部分用连接2'氧和4'碳的额外桥修饰。这种桥“锁定”3'-内(北)构形的核糖，其通常在A型双螺旋中发现。LNA核苷酸可用于本文所述的任一抗PDL1适体中。在一些实例中，在抗PDL1适体中高达50％(例如40％、30％、20％，或10％)的核苷酸是LNA。在一些实例中，抗PDL1适体可包含10、8、6、5、4、3、2或1个LNA。
任一本文所述适体可藉由习知方法制备，例如化学合成或活体外转录。如本文所述，其所期望的生物活性可经例如那些描述于下面实例中的来进行验证。用于表现任一抗-PDL1适体的载体也落在本揭示内容的范畴内。
任一本文所述适体可经由共价键结、非共价键结或两者接合至一个或多个聚醚部分，诸如聚乙二醇(PEG)部分。因此，在一些具体例中，本文所述适体经聚乙二醇化。本揭示内容不是要限制特定分子量的PEG部分。在一些具体例中，聚乙二醇部分具有范围自5kDa至100kDa、10kDa至80kDa、20kDa至70kDa、20kDa至60kDa、20kDa至50kDa，或30kDa至50kDa的分子量。在一些实例中，PEG部分具有40kDa的分子量。接合至本文所述抗PDL1适体的PEG部分可以是线性或具分支。其可接合至核酸适体的5’端、适体的3’端或两者。若需要的话，PEG部分可以共价接合至核酸适体的3’端。
将PEG部分接合至核酸的方法为技术中已知且先前已描述于例如PCT公开案第WO2009/073820号中，其相关教示以引用的方式并入本文中。应理解，本文所述接合PEG的核酸适体以及用于将PEG接合至核酸适体的方法为例示性且无意为限制性。
医药组成物
如本文所述一个或多个抗-PDL1适体，或其PEG接合物可与医药上可接受之载剂(赋形剂)混合而形成医药组成物，用于治疗目标疾病。“可接受”表示载剂必须是与组成物的活性成分兼容(且较佳能够稳定活性成分)并对待治疗个体无害。医药上可接受的赋形剂(载剂)包括技术中所熟知的缓冲剂。参见例如雷明顿：药学的科学与实践(Remington:TheScience and Practice of Pharmacy)第20版(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover。
使用于本发明方法中的医药组成物可包含医药上可接受之载剂、赋形剂或稳定剂，呈冻干调配物或水溶液的形式。参见例如雷明顿：药学的科学与实践(Remington:TheScience and Practice of Pharmacy)第20版(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所用剂量与浓度下对接受者来说无毒，且可包含缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐与其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸与甲硫胺酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基芐基氯化铵；氯化六甲双铵；氯化芐二甲烃铵、氯化本索宁；苯酚、丁基或芐基醇；对羟苯甲酸烷基酯，诸如对羟苯甲酸甲基酯或对羟苯甲酸丙基酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及m-甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，诸如甘胺酸、麸酰胺酸、天冬酰胺酸、组胺酸、精胺酸，或离胺酸；单糖、双糖，及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或右旋糖；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐相对离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；及/或非离子性界面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一些实例中，本文所述医药组成物包含含有PDL1结合适体(或用于生成该适体的载体)的脂质体，其可藉由技术中所熟知的方法制备，诸如描述于Epstein,等,美国科学学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82:3688(1985)；Hwang,等,美国科学学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77:4030(1980)；以及U.S.专利第4,485,045号与第4,544,545号中的。具有循环时间提高的脂质体描述于美国专利第5,013,556号中的。尤其适用的脂质体可以使用含有磷脂酰胆碱、胆固醇与PEG衍生之磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组成物藉由逆相蒸发法来生成。脂质体被挤压穿过具有限定孔隙的过滤器，产生具有期望直径的脂质体。
如本文所述抗-PDL1适体亦可陷入于制备的微胶囊中(例如分别藉由凝聚技术或藉由接口聚合作用(例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊及聚-(甲基甲基丙烯酸酯)微胶囊)、在胶体药物投递系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、奈米颗粒及奈米胶囊)中或巨乳液中。这些技术为技术中所熟知，参见例如Remington,The Science and Practice ofPharmacy第20版麦克出版(Mack Publishing)(2000)。
在其他实例中，本文所述医药组成物可调配成持续释放形式。持续释放制品的适当实例包括含有PDL1结合适体的固体疏水性聚合物的半通透性基质，该基质是呈有形物品的形式(例如薄膜或微胶囊)。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯基醇))、聚乳酸交酯(美国专利第3,773,919号)、L-麸胺酸与7-麸胺酸乙基酯的共聚物、非可分解性乙烯-乙酸乙烯酯、可分解性乳酸-乙醇酸共聚物，诸如LUPRON DEPOTTM(乳酸-乙醇酸共聚物和柳菩林(leuprolide)乙酸酯组成的可注射微球)、蔗糖乙酸异丁酸酯，及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
使用于活体内给予的医药组成物必须是无菌的。此为透过例如滤过无菌滤膜而轻易达到。治疗性PDL1结合适体组成物可以放置在具有无菌出入口的容器(例如静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头穿刺的挡塞的小管)。
本文所述医药组成物可以呈诸如锭剂、丸剂、胶囊、粉剂、颗粒、溶液或悬浮液，或栓剂的单位剂型，供用于经口、非经口或直肠给予，或是藉由吸入或吹入给予。
关于制备固体组成物(诸如锭剂)，主要活性成分可与医药载剂混合以形成含有本发明化合物的均匀混合物的固体预调配组成物，或其医药上可接受的无毒盐，医药载剂为例如已知制锭成分，诸如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或胶，以及其他医药稀释剂，例如水。当提到这些预调配组成物为均匀时，表示活性成分平均分散在组成物中，使得组成物可容易分成等效单位剂型，诸如锭剂、丸剂与胶囊。此固体预调配组成物接而被分成上述类型的单位剂型，含有0.1至约500mg本发明活性成分。新颖组成物的锭剂或丸剂可经包覆或以其他方式经化合而提供给予延长作用益处的剂型。例如，锭剂或丸剂可包含内剂量以及外剂量组分，后者呈包覆前者的包衣形式。两种组分可被在胃中耐受崩解并允许内组分完整通过进入十二指肠或延迟释放的肠衣层所分隔。此肠衣层或包衣可使用各种材料，诸如包括一些聚合酸及聚合酸与如虫胶、十六醇及乙酸纤维素之材料的混合物。
适当表面活性剂尤其包括非离子性试剂，诸如聚氧乙烯山梨糖醇(例如TweenTM20、40、60、80或85)以及其他山梨糖醇(例如SpanTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组成物将已知地包含0.05％与5％表面活性剂，且可介于0.1％与2.5％。应理解，若需要的话可添加其他成分，例如甘露糖醇或其他医药上可接受媒剂。
可使用商业可购得脂质乳液来制备适当乳液，脂质乳液为诸如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM及LipiphysanTM。活性成分可溶解于预先混合的乳液组成物中或者其可溶解于油(例如大豆油、葵花油、棉仔油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中，在与磷脂(例如蛋磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合之后形成乳液。应理解，可添加其他成分来调整乳液的张力，其他成分为例如甘油或葡萄糖。适当乳液通常含有至多20％油，例如5％与20％之间。脂质乳液可包含脂质小滴，具有适当大小且具有范围在5.5至8.0的pH。
乳液组成物可以是藉由将抗-PD-1适体与IntralipidTM或其组分(例如大豆油、蛋磷脂、甘油与水)混合来制备者。
用于吸入或吹入的医药组成物包括于医药上可接受水性或有机溶剂或其混合物中的溶液及悬浮液，及粉剂。液体或固体组成物可含有上列适当医药上可接受的赋形剂。在一些具体例中，用于局部或全身性效用的组成物是藉由经口或鼻呼吸路径给予。
较佳于无菌医药上可接受溶剂中的组成物可以藉由使用气体而被雾化。可直接从喷雾装置吸入雾化溶液或可将雾化装置附接到面罩、遮棚或间歇式正压呼吸器。溶液、悬浮液或粉剂组成物较佳经口或经鼻自以适当方式递送调配物的装置给予。
治疗方法
如本文所述任一抗-PD-1适体或其PEG接合物可用来提高免疫活性，尤其是促进T细胞增生，从而有效治疗癌症或诸如病毒性(例如肠病毒、HBV、HCV、HAV、HDV或HEV)感染或细菌感染的感染性疾病。
为实施本文揭示的方法，有效量地含有至少一种抗-PDL1适体的本文所述医药组成物可经由适当途径被给予给有治疗需要的个体(例如人类)，适当途径为诸如静脉内给予(例如快速推注)或经由连续输注一段时间、藉由肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、经口、吸入或局部路径。用于液体调配物的商用喷雾器包括可用于给予的喷射喷雾器以及超音波喷雾器。液体调配物可直接被雾化而冻干粉末可以在还原之后被雾化。或者，如本文所述含有抗-PDL1适体的组成物可使用氟碳调配物及定量吸入器(metereddose inhaler)被气溶胶化，或者如冻干且研磨的粉末被吸入。
如本文所用，“有效量”意指各活性剂对个体赋予治疗效用所需的数量，不论是单独或与一个或多种其他活性剂组合。在一些具体例中，治疗效用为降低肿瘤负荷、减少癌细胞，或增加免疫活性。决定何量PDL1结合适体达到治疗效用对于本领域技术人员来说将会是明显的。如本领域技术人员所认知，有效量会改变，取决于待治疗的特定病况、病况的严重性、个别患者参数(包括年龄、身体状况、身高、性别与体重)、治疗持续时间、现有治疗(若有的话)的特性、特定给予路径及健康从业人员知识与专业内的类似因素。这些因素为本领域那些普通技术人员所熟知且可在不超出惯常实验的情况下获得处理。通常较佳为使用个别组分或其组合的最大剂量，其依据周全医学判断为最高安全剂量。
经验上的考虑(诸如半衰期)通常有助于剂量的决定。可决定给予频率并随着治疗过程而调整，且大体上(但非必须)是基于治疗及/或抑制及/或改善及/或延迟目标疾病/病症。或者，PDL1结合适体的持续连续释放调配物可能是适合的。用于达到持续释放的各种调配物及装置本领域中是熟知的。
在一个实例中，如本文所述抗PDL1适体在个体中的剂量可以按经验来决定，该个体已经被给予一次或多次PDL1结合适体。给予个体的拮抗剂剂量渐增。为评估拮抗剂的效力，可追踪疾病/病症的指标。
大体上，就给予本文所述抗PDL1适体来说，初始候选剂量可为约2mg/kg。就本揭示内容的目的而言，典型日剂量范围约0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg，至30mg/kg至100mg/kg或更多中任一种，取决于上述因素。就重复给予数日或更久，持续治疗直到发生期望症状抑制或直到达到充分治疗程度以减轻目标疾病或病症或其症状为止，端视病况而定。例示性给药方案包含给予约2mg/kg的初始剂量，接着每周约1mg/kg PDL1结合适体的维持剂量，或着接着每隔一周约1mg/kg的维持剂量。但是，亦可采用其他剂量方案，取决于从业人员希望达到的药动学衰退型态而定。例如，预计一周给药一至四次。在一些具体例中，可采用范围自3μg/mg至约2mg/kg(诸如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg，及约2mg/kg)的给药。在一些具体例中，给药频率为为每周、每2周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周，或每10周一次；或每个月、每2个月，或每3个月或更久一次。此治疗的进程可简单地透过常规技术及分析进行监控。给药方案(包括所用PDL1结合适体)可随着时间而有所改变。
在一些具体例中，就具有正常体重的成人患者来说，可给予范围自约0.3至5.00mg/kg的剂量。具体剂量方案(亦即剂量、时间安排及重复)将取决于特定个体以及个体病史，还有个别药剂的特性(诸如药剂半衰期，以及其他在本领域中所熟知的考虑因素)。
就本揭示内容的目的，如本文所述PDL1结合适体的适当剂量将取决于特定PDL1结合适体、疾病/病症的类型与严重性、PDL1结合适体是因为预防或治疗目的而给予、先前治疗、患者的临床病史以及对拮抗剂的反应，和参与临床医师的斟酌而定。临床人员可给予PDL1结合适体直至达到期望结果之剂量。在一些具体例中，期望结果为肿瘤负荷降低、癌细胞减少或免疫活性增加。决定剂量是否造成期望结果的方法对于本领域技术人员来说是明显的。可连续或间歇给予一个或多个PDL1结合适体，取决于例如接受者的生理状况、给予目的为治疗或预防，以及其他熟练技术的操作人员所熟知的因素。给予PDL1结合适体基本上可为在预选时间段里连续或者是呈连续间隔剂量，例如在目标疾病或病症长成之前、期间或之后。
如本文所用，术语“治疗”意指对个体施用或给予包括一或多种活性剂的组成物，该个体患有目标疾病或病症、该疾病/病症的症状，或有罹患该疾病/病症的倾向、目的是要治愈、治疗、减轻、缓解、改变、治疗、改善、增进或影响病症、疾病症状，或罹患该疾病或病症的倾向。
减轻目标疾病/病症包括延迟疾病生成或进展，或降低疾病严重性。减轻疾病不一定需要治疗结果。如本文所用，“延迟”目标疾病或病症生成表示推迟、阻碍、减缓、延迟、稳定/或推迟疾病的进展。这个延迟可以是时间长度的改变，取决于待治疗疾病及/或个体的病史而定。“延迟”或减轻疾病生成，或延迟疾病发生的方法是当与未使用该方法相比时，在一个给定时间框内降低生成该疾病的一个或多个症状的可能性及/或在给定时间框内降低症状程度的方法。这些比对通常是基于临床研究，使用一些足以提供统计上显著结果的个体。
疾病的“生成”或“进展”表示疾病的初始病征及/或之后的进展。可使用如本领域所熟知的标准临床技术来侦测疾病的生成并予以评估。但是，生成也意指不能被侦测到的进展。就本揭示内容的目的，生成或进展意指症状的生物过程。“生成”包括发生、复发或出现。如本文所用，目标疾病或病状的“出现”或“发生”包括起初出现及/或复发。
在一些具体例中，本文所述PDL1结合适体呈在活体内足以降低肿瘤负荷或癌细胞生长达至少5％(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的数量被给予给有治疗需要的个体。在其他具体例中，PDL1结合适体呈有效降低PDL1活性水平达至少5％(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的数量被给予。在其他具体例中，PDL1结合适体呈有效增加免疫活性达至少5％(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的数量被给予。
医学领域中普通技术人员所熟知的常规方法可用来将医药组成物给予给个体，取决于待治疗疾病类型或疾病部位。这个组成物也可以经由其他常规路径被给予(例如经口、非经口、藉由吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、颊内、阴道或经由植入贮器给予)。术语“非经口”如本文所用包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内及颅内注射或输注技术。此外，可经由可注射贮器给予路径给予给个体，诸如使用1-、3-或6-个月贮器可注射或生物分解材料及方法。在一些实例中，医药组成物经眼内或经玻璃体内给予。
可注射组成物可含有各种载剂，诸如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇，及多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇，与类似物)。关于静脉内注射，可藉由滴注方法给予水溶性PDL1结合适体，从而输注含有PDL1结合适体及生理学上可接受赋形剂的医药调配物。生理学上可接受的赋形剂可包括例如5％右旋糖、0.9％食盐水、林格氏溶液或其他适当赋形剂。肌肉内制品(例如适当可溶盐形式之PDL1结合适体的无菌调配物)可溶解于诸如注射用水、0.9％食盐水或5％葡萄糖溶液的医药赋形剂中并在其中给予。
在一个具体例中，经由部位特异性或靶定局部投递技术来给予PDL1结合适体。部位特异性或靶定局部投递技术的实例包括具有PDL1结合适体的各种可植入贮器来源或局部投递导管，诸如输注导管、留置导管或针头导管、合成移植物、外包套、分流器及支架或其他可植入装置、部位特异性载剂、直接注射或直接施用。参见例如PCT公开案第WO 00/53211号及U.S.专利第5,981,568号。
也可以使用含有反义聚核苷酸、表达载体或次基因体聚核苷酸的治疗性组成物的靶定递送。受体媒介的DNA递送技术描述于例如Findeis等,生物技术趋势(TrendsBiotechnol.)(1993)11:202；Chiou等,基因治疗：直接基因转移的方法和应用(GeneTherapeutics:Methods And Applications Of Direct Gene Transfer)(J.A.Wolff,ed.)(1994)；Wu等,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)(1988)263:621；Wu等,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)(1994)269:542；Zenke等,美国科学学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1990)87:3655；Wu等,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)(1991)266:338中。
含有聚核苷酸(例如本文所述PDL1结合适体或用于生产该结合适体的载体)的治疗性组成物可在约100ng至约200mg DNA的范围内在基因治疗程序中被供局部给予。在一些具体例中，也可用在基因治疗程序期间使用浓度范围约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg，及约20μg至约100μg或更多的DNA。
要依据本文所述方法治疗的个体可以是哺乳动物，诸如农场动物、运动动物、宠物、灵长类、马、狗、猫、小鼠及大鼠。在一个实例中，该个体为人类。含有抗-PDL1适体的组成物可用于在有治疗需要的个体中提高免疫活性，例如T细胞活性。在一些实例中，个体可为患有癌症、疑似患有癌症或处于癌症风险下的人类患者，癌症为诸如肺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌，或肾细胞癌。在其他实例中，个体可以是患有或疑似患有肠病毒、HBV、HCV、HDV或HEV感染的人类患者。此一患者也可以透过惯常医学实务予以鉴定。
患有目标疾病或病症(例如癌症或诸如HBV感染之病毒性感染或细菌性感染)的个体可以透过惯常医学检验予以鉴定，医学检验为例如实验室测试、器官功能测试、CT扫描或超音波。怀疑患有此等目标疾病/病症任一的个体可能表现出该疾病/病症的一种或多种症状。处于该疾病/病症风险下的个体可能是带有与那个疾病/病症有关之一或多个风险因子的个体。此一个体也可以透过惯常医学实务予以鉴定。
在本文所述方法中使用的具体剂量方案(亦即剂量、时间安排及重复)将取决于特定个体(例如人类患者)以及个体病史。
在一些具体例中，抗-PDL1适体可与另一种适当治疗剂(例如抗癌剂、抗病毒剂，或抗菌剂)共同使用。另外或此外，抗-PDL1适体也可以与其他用来增强及/或补充药剂有效性的药剂组合使用。
目标疾病/病症的治疗效力可以透过例如下面实例中所述方法进行评估。
用于减轻目标疾病的套组
本揭示内容亦提供用于提高免疫活性(例如T细胞活性)、减轻癌症(例如肺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌，或肾细胞癌)，及/或治疗或降低肠病毒、HBV、HCV、HAV、HDV或HEV感染风险的套组。这些套组可包括一个或多个含有例如本文所述那些任一种结合PDL1之适体的容器。
在一些具体例中，套组可包含与使用本文所述方法任一的一致的使用说明。所纳入的使用说明可包含给予如本文所述那些要治疗目标疾病、延迟目标疾病发生，或减轻目标疾病之适体的说明。套组可进一步包含筛选适合治疗的个体的说明，其是基于鉴别那个个体是否患有目标疾病。在又其他具体例中，使用说明包含向处于目标疾病风险下的个体给予适体的说明。
与使用PDL1结合适体有关的使用说明通常包括期望治疗之剂量、给药时间表，以及给予路径的信息。容器可以是单位剂量、散装(例如多剂量包装)或次单位剂量。在本发明套组中所提供的使用说明通常是标签上的书面说明或包装插页(例如套组中所包括的纸张)，但机器可读说明(例如磁性或光学储存盘片上所传达的说明)也是可接受的。
标签或包装插页指明该等组成物是用于治疗癌症相关疾病或病症(诸如本文所述彼等癌症)、延迟癌症相关疾病或病症发生及/或减轻癌症相关疾病或病症。可提供使用说明供实施本文所述任一方法。
本发明套组可以以适当包装。适当包装包括，但不限于小瓶、瓶、罐、可挠性包装(例如密封麦拉膜(Mylar)或塑料袋)，以及类似物。也预期包装可用于与特定装置组合，特定装置为诸如吸入器，鼻给予装置(例如雾化器)或诸如迷你泵的输注装置。套组可具有无菌出入口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头穿刺过的挡塞的小瓶)。容器也可以具有无菌出入口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头穿刺过的挡塞的小瓶)。组成物中的至少一种活性剂是如本文所述彼等PDL1结合适体。
套组可视情况提供额外组分，诸如缓冲剂或说明信息。通常，套组包含容器及标签或包装插页在容器上或附接在容器上。在一些具体例中，本发明提供包含上述套组内含物的制品。
一般性技术
除非另有说明，否则本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、免疫学的常规技术，其落在本领域技术中。贩子克隆：实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第二版(Sambrook,等,1989)冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait,ed.,1984)；分子生物方法(Methods in Molecular Biology),胡马纳出版社(HumanaPress)；细胞生物学：实验室手册(Cell Biology:A Laboratory Notebook)(J.E.Cellis,ed.,1998)美国学术出版社(Academic Press)；动物细胞培养(Animal Cell Culture)(R.I.Freshney,ed.,1987)；细胞与组织培养实验手册(Introduction to Cell andTissue Culture)(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)殷实出版社(Plenum Press)；细胞与组织培养：实验室程序(Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures)(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-8)J.Wiley and Sons；酶学方法(Methods inEnzymology)(美国学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.))；实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.)；哺乳动物细胞基因传递载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)(J.M.Miller andM.P.Calos,eds.,1987)；最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols inMolecular Biology)(F.M.Ausubel,等,eds.,1987)；PCR：聚合酶链式反应(PCR:ThePolymerase Chain Reaction),(Mullis,等,eds.,1994)；最新免疫学实验方法汇编(Current Protocols in Immunology)(J.E.Coligan等,eds.,1991)；精编分子生物学实验方法(Short Protocols in Molecular Biology)(Wiley and Sons,1999)；免疫生物学(Immunobiology)(C.A.Janeway and P.Travers,1997)；抗体(Antibodies)(P.Finch,1997)；抗体：实用方法(Antibodies:a practical approach)(D.Catty.,ed.,IRL出版社(Press),1988-1989)；单克隆抗体：实用方法(Monoclonal antibodies:a practicalapproach)(P.Shepherd and C.Dean,eds.,牛津大学出版社(Oxford University Press),2000)；使用抗体：实验室手册(Using antibodies:a laboratory manual)(E.Harlow andD.Lane(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),1999)；抗体(TheAntibodies)(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,哈伍德学术出版社(Harwood AcademicPublishers),1995)。在没有进一步详细说明的情况下，相信本领域技术人员能够基于上述说明利用本发明至其最大程度。因此，下列特定具体例要理解为仅为示范性，且无论如何皆不以任何方式限制本发明的其余部分。本文引用的所有公开数据就本文参照的目的或主体以引用方式并入本文中。
实例1：藉由硝基纤维素滤膜SELEX鉴定人类PDL1靶向适体
人类PDL1靶向适体是基于硝基纤维素滤膜SELEX进行鉴定(图1)。合成单股DNA库由具有62个核苷酸的单股DNA组成，包含30个随机核苷酸([N]30N＝A、T、G、C)，两侧为TCCCTACGGCGCTAAC(SEQ ID NO：16)的引物序列(其至随机核苷酸的5’)以及GCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO：17)的引物序列(其至随机核苷酸的3’)。在第一回合SELEX，ssDNA库的1015个分子与重组人PDL1蛋白一起培育。然后，藉由硝基纤维素滤膜收集结合至PDL1蛋白的ssDNA，而未结合ssDNA是透过反复洗涤除去。结合PDL1的ssDNA是透过加热洗脱并透过PCR用生物素标记的正向引物扩增。ssDNA是透过链亲和素珠粒分离，并进行下一回合选择。从第二到第八回合选择，牛血清白蛋白(BSA)用于负选择。简言之，结合至PDL1蛋白的洗脱ssDNA与BSA一起培育，然后通过硝基纤维素滤膜。收集流出物并透过PCR扩增。经过八个回合选择，结合PDL1的ssDNA进行次世代定序。
实例2：使用硝基纤维素滤膜结合分析来评估候选PDL1适体的相对结合能力
依据次世代定序的读出值对候选PDL1靶定适体的序列进行排序，并且分析读出值超过100的序列。其中，排名前50个候选适体序列占85％以上读出值。为了评估其对PDL1的结合能力，合成这前50个候选适体并经由硝基纤维素滤膜结合分析进行分析。对BSA的结合能力用作阴性对照。简言之，候选适体分别与PDL1或BSA培育。适体-蛋白复合物是藉由硝基纤维素滤膜收集并透过加热洗脱。洗脱的适体数量是透过定量PCR予以量化并透过将PDL1组的讯号除以BSA组的讯号而常规化。为了找出特异性更高的PDL1适体，截止值设定为5。结果显示有六个候选PDL1适体通过这个标准，包括AP14、AP22、AP32、AP33、AP36、AP48(图2)。
实例3：使用基于ELISA的竞争分析来鉴定拮抗PDL1适体
为了调查候选PDL1适体作为拮抗剂的效力，进行基于ELISA的竞争分析。人类PDL1重组蛋白(2μg/ml)涂布于96孔ELISA盘的孔中，并透过BSA(10mg/ml)予以阻断。人类PD-1蛋白(0.6μg/ml)和适体(500nmol/l)同时添加到孔中。洗去未结合的人类PD-1蛋白质后，透过HRP标记抗人类IgG抗体侦测留在孔中的PD-1蛋白。TMB用作为HRP受质以供呈色，并且透过ELISA盘读取器侦测652nm下的吸亮度。使用透过连续稀释人类PD-1蛋白构建的标准曲线来量化剩余的人类PD-1蛋白量。没有PDL1涂覆的孔用作阴性对照。结果表明，六个候选PDL1适体阻断12％至30％的PD-1：PDL1交互作用(图3)。其中，AP14和AP32揭示了最高潜力作为PDL1阻断拮抗适体。
为了进一步调查AP14和AP32作为PDL1阻断剂的50％有效剂量，将从12.5nmol/l连续稀释至500nmol/l的AP14和AP32用于前面提到的基于ELISA的竞争分析中。50％有效剂量是透过GraphPad Prism 5，使用方程式Y＝B最大xX/(ED50+X)来进行计算。B最大是受到PDL1拮抗适体阻断之人类PD1蛋白的最大百分比。AP14和AP32的ED50分别为41nmol/l和12nmol/l(图4)。
为了找出PDL1结合所需的最小AP32序列，产生与AP32有关的适体序列截短。依据Mfold的预测结构，AP32在5’端与3’端的序列形成长柄，其余序列形成的两个短柄环(图5，左图)。设计出有关AP32适体的两个截短适体，45个核苷酸长(图5，中图)和30个核苷酸长(图5，中图)并由先前提到的基于ELISA的竞争分析检验它们的拮抗功能。相比62个核苷酸长的适体，45个核苷酸长的截短适体显示出拮抗功能增加(分别为35％和65％)(图6)。然而，随着进一步的序列截短，30个核苷酸长的截短适体显示出对PD-1：PDL1交互作用的阻断能力降低。这个45个核苷酸长的截短AP32适体在下文称为aptPDL1。
实例4：透过流式细胞分析调查PDL1适体对人类和小鼠癌细胞的结合能力
为了调查aptPDL1对PDL1表达细胞的结合能力，使用两种人类癌细胞，其具有不同PDL1表达水平。经荧光标记的aptPDL1(100nmol/l)分别与A549(PDL1低表达)和HOP92(PDL1高表达)一起培育，并透过流式细胞仪侦测从细胞发射出的荧光强度。标记有荧光染料的随机序列用作阴性对照。与PDL1表达相一致，从PDL1高度表达的细胞HOP92检测到更强的荧光强度，而从PDL1表达较低的A549检测到较弱的信号(图7)。
使用CT26和LL/2小鼠癌细胞来评估aptPDL1对小鼠PDL1表达细胞的结合能力(图8)。AptPDL1可以结合CT26和LL/2细胞，解离常数分别约250nmol/l以及155nmol/l(图9)。
实例5：在同基因动物模型中检验PDL1拮抗适体的抗肿瘤效力
为了调查PDL1拮抗适体作为免疫治疗剂对抗癌进展的效力，使用同基因小鼠模型。Balb/c小鼠皮下接种CT26小鼠结肠直肠癌细胞(2×105个细胞)。当肿瘤长达到5mm，给予药物。关于瘤内注射组，每两天肿瘤内递送6ug随机序列(n＝5)或aptPDL1(n＝5)历时总共4次注射。关于腹膜内注射组，每两天腹膜内递送30ug随机序列(n＝7)或aptPDL1(n＝7)历时总共4次注射。AptPDL1透露对肿瘤生长有显著抑制作用；在肿瘤内注射组中为50％抑制(图10)，而在腹膜内注射组中为73％抑制(图11)。
实例6：在同基因动物模型中检验PDL1拮抗适体的抗肿瘤效力
在aptPDL1活体内肿瘤抑制功能的研究中采用LL/2鼠同基因肿瘤模型。C57BL/6小鼠皮下接种LL/2(1x105个细胞)。当肿瘤长轴达到约5mm，每2天腹膜内给予30μg的随机序列寡核苷酸(n＝7)或aptPDL1(n＝7)。数据显示，腹膜内aptPDL1投药的连续剂量导致经LL/2接种C57BL/6小鼠有显著肿瘤抑制效果(图12)。为了要排除aptPDL1对CT26和LL/2细胞的直接细胞毒性，进行活体外细胞生存力分析。CT26或LL/2细胞(2x103个细胞)接种到96孔盘的孔中，将随机序列的寡核苷酸或aptPDL1(1μM)加入到各孔中。24、48或72小时后，用MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-联苯溴化四唑)分析遵循下列标准程序分析细胞生存力。这些实验显示，aptPDL1对癌细胞没有直接的细胞毒性(图13)。
实例7：在经PDL1拮抗适体治疗的肿瘤组织中检验细胞介素表达
对阿特珠单抗(Atezolizumab)(罗氏(Roche))的反应分子(抗PDL1抗体)的分析，揭示了在治疗后肿瘤中的IFNγ和趋化因子CXCL9/10水平增加。因此，检验在经aptPDL1治疗的CT26和LL/2肿瘤中是否会观察到类似的现象。RNA，从小鼠解剖的组织中萃取，使用常规TRIzol(英杰生命技术有限公司(Invitrogen))方法按照制造商的程序进行纯化。cDNA用寡(dT)12-18引物以及SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)从总RNA合成cDNA。在LightCycler 480系统(罗氏应用科学，德国的曼海姆(Roche Applied Science,MannheimGermany))上使用cDNA作为模板以及下列引物对(DNA整合技术公司(Integrated DNATechnologies))进行qPCR：IFNγ，5'-GAGGAACTGGCAAAAGGATG-3'(正向；SEQ ID NO：18)和5'-TTCAAGACTTCAAAGAGTCTGAGGTA-3'(反向；SEQ ID NO：19)；CXCL9，5'-CTTTTCCTCTTGGGCATCAT-3'(正向；SEQ ID NO：20)和5'-GCATCGTGCATTCCTTATCA-3'(反向；SEQ ID NO：21)；CXCL10，5'-GCTGCCGTCATTTTCTGC-3'(正向；SEQ ID NO：22)和5'-TCTCACTGGCCCGTCATC-3'(反向；SEQ ID NO：23)；CXCL11，5'-GCTGCTGAGATGAACAGGAA-3'(正向；SEQ ID NO：24)和5'-CCCTGTTTGAACATAAGGAAGC-3'(反向；SEQ ID NO：25)；及β-肌动蛋白，5'-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3'(正向；SEQ ID NO：26)和5'-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3'(反向；SEQ ID NO：27)。蛋白质是使用补充有蛋白酶抑制剂混合物(罗氏应用科学(RocheApplied Science))的RIPA缓冲液从肿瘤组织中萃取。以1：500稀释度使用对抗鼠蛋白质CXCL9、CXCL10，和CXCL11的一级抗体(研发系统有限公司(R&D Systems),明尼阿波利斯(Minneapolis),明尼苏达州(MN),USA)。以1：10000稀释度使用对抗β肌动蛋白的一级抗体(圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology),圣克鲁斯(Santa Cruz),加州(CA),USA)。以1：5000稀释度使用HRP标记的二级抗体(圣克鲁斯生物技术公司(Santa CruzBiotechnology))。
这些先前研究结果一致，逆转录定量PCR和免疫墨点分析显示IFNγ、CXCL9、CXCL10以及CXCL11水平在经aptPDL1治疗的肿瘤中升高(图14和15)。
实例8：检验在经PDL1拮抗适体治疗的肿瘤组织中的微血管形成
肿瘤内CXCL9/10已经报导发挥抗肿瘤效用。趋化因子CXCL9/10/11也已知会透过它们结合至内皮趋化因子(C-X-C基序)受体3(CXCR3)来抑制血管生成。因此，研究了aptPDL1治疗在肿瘤内微血管方面的效用。将经福尔马林固定、石蜡包埋的组织再水合，并在柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中进行抗原检索过程。以1：100稀释度使用针对CD31的一级抗体(艾美捷科技有限公司(Abcam))。以1：500稀释度使用Alexa Fluor 647标记的二级抗体(艾美捷科技有限公司(Abcam))。细胞核用Fluoroshiled包埋介质(艾美捷科技有限公司(Abcam))中的DAPI染色。如在图16中所示，aptPDL1治疗组中的CD31阳性肿瘤内微血管的长度和密度均显著降低。
等效物及范围
在申请专利范围中，除非有相反的指示，或从上下文另有明显，否则诸如“一”、“一种”和“该”的冠词可表示一或一个以上。除非指出从上下文相反或从上下文另有明显，若一种、多于一种或全部的组成员都存在于、用于，或以其他方式与给定的产品或方法相关，则包括“或”的一组中的一个或多个成员之间的申请专利范围或说明被认为是充分的。本发明包括具体例，其中该组的正好一个成员存在于、用于，或以其他方式与给定的产品或方法相关。本发明包括数个具体例，其中超过一个，或所有组成员都存在于、用于，或以其他方式与给定的产品或方法相关。
此外，本发明含括所有变化、组合及排列，其中所列申请专利范围的一个或更多的限制、要素、条款以及描述性术语被引入另一个申请专利范围。例如，任何申请专利范围是依附于另一项申请专利范围，可经修改以包括在任何其他依附于相同基础申请专利范围之申请专利范围中所找到的一或多个限制条件。若以条列呈现组件，例如以马库西组合的形式，则亦揭示组件的每个子组合，还有任何组件(等)可以从该组合中删除。应理解，大体上当本发明或本发明的态样被称为包含特定要素及/或特征时，本发明的某些具体例或本发明的态样由此等组件及/或特征组成或基本上由其组成。为了简要起见，本文没有用这样的话提出这些具体例。还要注意，术语“包含”和“含有”希望是开放性并且允许纳入其他组件或步骤。凡给定范围者，包括端点在内。此外，除非另有说明或从本领域普通技术人员之一的背景和理解为明显的，表示为范围的数值可假定在本发明的不同具体例之指定范围内的任何特定值或子范围，至该范围下限的单位的十分之一，除非上下文另有明确说明。
本申请案指各种已授权的专利、已公开的专利申请案、期刊文章和其他出版物，所有这些都透过引用并入本文。如果任何并入的参考文献和本说明书之间相冲突，以本说明书为准。另外，落入先前技术中的本发明的任何特定具体例可以明确地从申请专利范围的任何一或多者排除。因为这样的具体例被认为是技术中具有通常技术者之一所熟知，它们可能被排除，即使本文未明确说明排除。本发明的任何特定具体例可以基于任何原因从任何申请专利范围中排除，不管是否与存在先前技术有关。
那些本领域技术人员将认知到或能够使用不超出惯常实验来确定许多等同于本文描述的特定具体例。本文所描述的具体例范围并不希望被限定于上述的说明，而是阐述于随附的申请专利范围中。那些本领域技术人员将会理解，各种变化和修改对本描述可以在不脱离本发明的精神或范畴的情况下作出，如在下面的申请专利范围中所限定。
序列表
<110> “中央研究院”
台湾大学
<120> 拮抗性PDL1适体及其在癌症治疗中的应用
<130> A0988.70073WO00
<140> 尚未分派
<141> 尚未分派
<150> US 62/212,772
<151> 2015-09-01
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
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accagaggca tacagggaca 20

Claims (8)

1.一种能够结合程序性死亡-配体蛋白1(PDL1)的核酸适体，其中该适体由SEQ ID NO:2的核苷酸序列组成。
2.一种医药组合物，包含(i)如权利要求1所述的核酸适体；以及(ii)医药上可接受载剂。
3.一种如权利要求2所述医药组合物在制造用于治疗癌症或感染性疾病的药物中的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其中该癌症为黑色素瘤、非小细胞肺癌、结肠直肠癌或肾细胞癌。
5.如权利要求3所述的用途，其中该感染性疾病是由肠病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、A型肝炎病毒、D型肝炎病毒或E型肝炎病毒所致。
6.一种如权利要求1所述的核酸适体在制造用于治疗癌症或感染性疾病的药物中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其中该癌症为黑色素瘤、非小细胞肺癌、结肠直肠癌或肾细胞癌。
8.如权利要求6所述的用途，其中该感染性疾病是由肠病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、A型肝炎病毒、D型肝炎病毒或E型肝炎病毒所致。
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