CN111093678A - 用于治疗IL-17a相关疾病和病状的SBE适体 - Google Patents

Abstract

本文提供了使用结合ACT1蛋白的SEFIR结构域的SBE核酸序列治疗IL‑17a相关疾病和病状的组合物、系统、试剂盒和方法。

Description

用于治疗IL-17a相关疾病和病状的SBE适体

本申请要求2017年7月21日提交的美国临时申请62/535,559的优先权，该临时申请通过引用整体并入本文。

关于联邦资助的声明

本发明是在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的P01HL103453、P01CA062220、P01 HL 029582和RG5130A2/1号资助下受政府支持进行的。政府享有本发明的某些权利。

技术领域

本文提供了使用结合ACT1蛋白的SEFIR结构域的SBE核酸序列治疗IL-17a相关疾病和病状的组合物、系统、试剂盒和方法。

背景技术

白细胞介素17(IL-17，也称为IL-17A)是Th17细胞的关键签名细胞因子并且也是由先天免疫细胞产生的(Harrington等人，2005；Park等人，2005；Cua和Tato，2010)。虽然IL-17是宿主防御细胞外微生物所必需的(Cho等人，2010；Conti等人，2009；Kolls和Khader，2010；Milner和Holland，2013)，但IL-17在自身免疫性和炎性疾病(包括银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化症和哮喘)的发病机制中起着至关重要的作用(Swaidani等人，2009；Kang等人，2010；Bulek等人，2011；Patel等人，2013)。

IL-17通过由IL-17RA和IL-17RC组成的异二聚体受体复合物发出信号(Shen和Gaffen，2008；Toy等人，2006)。IL-17RA和IL-17RC两者都属于SEFIR蛋白家族，SEFIR蛋白家族是通过保守性细胞质SEFIR结构域的存在来定义的(Novatchkova等人，2003)。Act1(也称为CIKS)是IL-17信号传导中必不可少的组分，也是SEFIR蛋白家族的成员(Li等人，2000；Chang等人，2006；Qian等人，2007)。在IL-17刺激后，Act1通过SEFIR依赖性相互作用被募集到IL-17R。Act1又与TRAF家族的成员接合，从而激活NFkB、C/EBP和MAPK途径。IL-17-Act1介导的信号传导导致促炎性和嗜中性粒细胞动员细胞因子和趋化因子(包括CXCL1、TNF、IL-6和GM-CSF)的转录(Gu等人，2013)。

虽然IL-17激活细胞因子和趋化因子的基因转录，但IL-17稳定原本不稳定的mRNA以诱导促炎基因同样重要。细胞因子和趋化因子mRNA的半衰期较短，这是因为它们的3'UTR中含有包括富含AU的元件(ARE)和茎环(SL)结构在内的保守性顺式元件(Leppek等人，2013；Stoecklin等，2006a)。3'UTR内的ARE可以被RNA结合蛋白(包括TTP、AUF1、KSRP和SF2)识别，所述RNA结合蛋白起到介导RNA的依序脱腺苷化、脱帽和最终核酸外切降解的作用(Schoenberg和Maquat，2012；Stumpo等人，2010)。值得注意的是，P小体是mRNA降解的位点。应激颗粒响应于应力而形成，是RNA分类的位点，并且可以将mRNA递送至P小体以使其衰减。最近的研究报道称，RNA结合蛋白Roquin和Regnase-1破坏了免疫相关mRNA中存在的SL(包括TNF和IL-6)的稳定性。Roquin破坏了在加工小体(P小体)和应激颗粒中积聚的无翻译活性的mRNA的稳定性。Regnase-1特异性地切割并降解与多核糖体结合的有翻译活性的mRNA(Mino等人，2015)。尽管已经发现了多种mRNA去稳定机制，但是在关于炎症基因的mRNA如何被选择性地稳定并响应于炎症刺激例如IL-17刺激而被成功翻译的知识仍然存在很大的空白。

发明内容

本文提供了使用结合ACT1蛋白的SEFIR结构域的SBE核酸序列治疗IL-17a相关疾病和病状的组合物、系统、试剂盒和方法。

在一些实施方案中，本文提供了治疗IL-17a相关疾病或病状的方法，其包括：用组合物治疗患有IL-17a相关疾病或病状的受试者，其中所述组合物包含第一核酸序列，其中所述第一核酸序列包含结合ACT1蛋白的SEFIR结构域的SBE核酸序列。在某些实施方案中，所述治疗减轻或消除了与所述IL-17a相关疾病或病状相关的至少一种症状。在进一步实施方案中，所述IL-17a相关疾病选自由以下组成的组：银屑病、慢性斑块、哮喘、自身免疫性疾病、炎性病状、类风湿性关节炎和多发性硬化症。在特定实施方案中，所述受试者是人或其它哺乳动物。

在另外的实施方案中，本文提供了包含第一核酸序列的组合物，其中所述第一核酸序列包含结合ACT1蛋白的SEFIR结构域的SBE核酸序列，并且其中所述第一核酸序列包含经修饰的碱基以提高体内稳定性。

在特定实施方案中，本文提供了包含第一核酸序列的组合物，其中所述第一核酸序列包含结合ACT1蛋白的SEFIR结构域的SBE核酸序列，并且其中所述SBE核酸序列包含SEQID NO:1、2或103中所示的，但不是天然存在的序列。

在进一步的实施方案中，所述SBE核酸序列的至少一部分来自于选自CXCL1、GM-CSF、IL-6和TNF的基因。在进一步的实施方案中，所述SBE核酸序列包含SEQ ID NO:1-2、49-61、88-94和99-129中所示的序列。关于SEQ ID NO:1和2，这些序列中的N'独立地选自A、G、C、T、U以及经修饰的和非规范的核苷酸碱基。可以在与实施例1中采用的测定相同的测定中筛选基于SEQ ID NO:1、2和103的变异性构建的候选序列，以确定它们是否结合ACT1蛋白的SEFIR结构域。

在某些实施方案中，SBE核酸序列包含RNA碱基(例如，SBE核酸序列的全部或大部分由RNA碱基组成)。在其它实施方案中，SBE核酸序列包含DNA碱基(例如，SBE核酸序列的全部或大部分由DNA碱基组成)。在一些实施方案中，所述SBE核酸序列包含以下，由或基本上由以下组成：CXCL1基因的核苷酸810-857，ii)CXCL1基因的核苷酸830-856，或iii)CXCL1基因的核苷酸800-835。在进一步实施方案中，所述SBE核酸序列来自于人基因，或与来自于人基因的SBE序列相比具有1或2个保守性氨基酸取代。

在一些实施方案中，ACT1蛋白是人ACT1蛋白或其它哺乳动物ACT1蛋白。在进一步实施方案中，所述第一核酸序列的长度介于12与70个核苷酸之间。在另外的实施方案中，所述第一核酸以当被施用给患有IL-17a相关疾病或病状的受试者(例如，向人施用)时具有治疗作用的水平存在于所述组合物中。

附图说明

图1.IL-17在细胞核和细胞质颗粒中诱导不同的Act1-RNP。A.用强力霉素诱导24小时，随后用IL-17刺激0、1或2小时的HeLa Tet-On稳定细胞系中的Act1-GFP的共聚焦成像。细胞核用DAPI染色。条形图示出了在存在和不存在IL-17刺激的情况下表现出Act1在细胞质颗粒中的定位或细胞核定位的细胞的百分比。基于对50多个受到或未受到IL-17刺激的表达细胞的分析进行量化，随后进行双尾学生t检验。数据表示平均值±标准偏差；*，p<0.05，**，p<0.01。B.用如所指示的带有GFP或RPF标签的表达构建体共转染的HeLa细胞的共聚焦成像。细胞核用DAPI染色。条形图示出了其中两种表达蛋白(Act1/Dcp1；Act1/TIA1和Dcp1/IRAK1)共定位的细胞的百分比。基于对50多个表达细胞的分析进行量化，随后进行双尾学生t检验。数据表示平均值±标准偏差；**，p＜0.01。C.未处理或用IL-17(50ng/ml)处理1小时的HeLa细胞中的原位PLA。将抗Act1和抗Dcp1用作小鼠一抗，随后使用PLA探针。红点表示内源Act1和Dcp1的相互作用。细胞核用DAPI染成蓝色。条形图示出了在存在和不存在IL-17刺激的情况下PLA阳性细胞的百分比。基于对50个受到和未受到IL-17刺激的细胞的分析进行量化，随后进行双尾学生t检验。数据表示平均值±标准偏差；**，p＜0.01。D.使用抗Act1对来自于经IL-17(50ng/ml)刺激所指示时间点的HeLa细胞(未经处理或用RNA酶A处理)的裂解物进行免疫沉淀(IP)，接着用所示抗体进行蛋白质印迹(Western blot)分析。以上所有数据代表至少两次独立实验。E.用如图所指示的带有GFP和RPF标签的表达构建体共转染的HeLa细胞的共聚焦成像。细胞核用DAPI染色。条形图示出了其中两种表达蛋白(Act1/Dcp1；Dcp1/HuR和Dcp1/SF2)共定位的细胞的百分比。基于对50多个表达细胞的分析进行量化，随后进行双尾学生t检验。数据表示平均值±标准偏差；**，p＜0.01。F.用所指示表达构建体转染的HeLa细胞中的原位PLA分析。使用针对Flag标签的小鼠一抗和针对HA标签的兔抗体。红点表示两种蛋白(包括Dcp1-Flag/Act1-HA、IL-17-RA-Flag/Act1-HA、HuR-Flag/Act1-HA和SF2-Flag/Act1-HA)的相互作用。将IRAK1-Flag和Act1-HA的共转染用作PLA测定的阴性对照。细胞核用DAPI染色。还通过成像数据下方示出的蛋白质印迹分析来分析经转染的构建体的表达水平。G.条形图示出了F中所示PLA阳性细胞的百分比。基于对50个细胞的分析进行量化，随后进行双尾学生t检验。数据表示平均值±标准偏差；**，p＜0.01。H.条形图示出了其中Dcp1与全长Act1或Act1缺失突变体共定位的细胞的百分比。基于对50多个表达细胞的分析进行量化，随后进行双尾学生t检验。数据表示平均值±标准偏差；*，p<0.05，**，p<0.01。I.将通过用带FLAG标签的小鼠野生型Act1(WT)或SEFIR1缺失突变体进行逆转录病毒感染而重建的Act1-/-MEF用IL-17(50ng/ml)处理所指示的时间。将细胞裂解物用抗FLAG进行免疫沉淀(IP)，随后使用如所指示的抗体进行蛋白质印迹分析。数据代表两次独立实验。

图2.Act1通过SEFIR结构域A与CXCL1 3’UTR直接结合。Act1-SEFIR的结构模型是通过采用SWISS-Model，使用IL-17RA-SEFIR晶体结构作为模板来建立的(Zhang等人，2014)(PDBcode:4NUX)。Act1-SEFIR(a)和IL-17RA-SEFIR(c)的表面表示形式(surfacerepresentation)被静电势遮蔽。用卡通表示形式(cartoon representation)标记Act1-SEFIR(b)和IL-17RA-SEFIR(d)的关键二级结构元件和残基。B.在体外通过REMSA检查纯化的重组His-MBP-Act1 SEFIR(残基379-538)、His-IL-17RA SEFIR(残基378-536)和His-MBP与CXCL1 3'UTR(残基720-940)和Gpx4 3'UTR(残基775-962)的结合。将放射性标记的RNA探针与如所指示的不断增加的量的蛋白一起孵育。通过天然PAGE将游离RNA与RNA-蛋白复合物分离。图表指示出CXCL1 3’UTR(720-940，如图3A所示的CXCL1 220)的表观Kd，该表观Kd是作为实现RNA 50％结合所必需的Act1-SEFIR蛋白浓度计算的。数据代表三次独立实验(平均值和标准偏差)。C.纯化的重组His-MBP-Act1 SEFIR以及ΔSEFIR1、ΔSEFIR2、ΔSEFIR3、ΔSEFIR4和ΔSEFIR5与如(B)中所述的CXCL13’UTR(核苷酸720-940)的结合。D.表格示出了CXCL1 3’UTR(720-940，CXCL1 220)与C中指示的蛋白结合的表观Kd。数据代表三次独立实验(平均值和标准偏差)。E.将带FLAG标签的小鼠Act1或SEFIR缺失突变体转染到具有带V5标签的IL-17RA的Hela细胞中。使用抗V5对经转染细胞的细胞裂解物进行免疫沉淀(IP)，随后使用所指示的抗体进行蛋白质印迹分析。数据代表两次独立实验。F.将通过用带FLAG标签的小鼠野生型Act1(WT)或SEFIR缺失突变体进行逆转录病毒感染而重建的Act1-/-MEF用IL-17A(50ng/ml)处理所指示的时间。用所指示的抗体通过蛋白质印迹法分析细胞裂解物。G.将通过用带FLAG标签的小鼠野生型Act1(WT)或SEFIR缺失突变体进行逆转录病毒感染而重建的Act1-/-MEF不加以处理或用IL-17A(50ng/ml)刺激0、2、6或24小时。分别通过RT-PCR(上图)和Elisa(下图)分析mRNA和蛋白质水平。数据代表两次独立实验(平均值和标准偏差，根据学生t检验，*，p<0.05，**，p<0.01)。H.将野生型Act1、SEFIR缺失突变体或空载体与pTRE2(CXCL1 220，核苷酸720-940，Datta等人，2010)一起共转染到HeLaTet-Off细胞中，随后用强力霉素进行处理。从经转染细胞制备RNA样品，并对该RNA样品进行RNA印迹分析。图表给出了针对GAPDH作归一化并以半衰期形式表示的CXCL1 mRNA水平。数据代表两次独立实验。(平均值和标准偏差，根据学生t检验，*，p<0.05)。I.如同(B)中一样，通过REMSA检查纯化的重组His-MBP-Act1 SEFIR和ΔSEFIR1与CXCL1 3’UTR(720-940)、TNF 3’UTR(1362-1507)和GM-CSF 3’UTR(513-785)的结合。表格给出了CXCL1 3’UTR(720-940)、TNF 3’UTR(1362-1507)和GM-CSF 3’UTR(513-785)的表观Kd，该表观Kd是作为实现RNA 50％结合所必需的His-MBP-Act1 SEFIR和ΔSEFIR1的浓度计算的(量化参见材料和方法)。数据代表三次独立实验(平均值和标准偏差)。J.将用flag-Act1重建的Act1-/-MEF用TNF预处理1小时，然后用IL-17处理0和60分钟，随后用抗FLAG进行RNA免疫沉淀，并对所指示的mRNA进行RT-PCR分析。给出的值是针对来自IgG免疫沉淀的水平的相对值。K.通过用带FLAG标签的小鼠野生型Act1(WT)或SEFIR缺失突变体进行逆转录病毒感染而重建，用TNF预处理1小时，然后单独地(NT)或在IL-17A(50ng/ml)的存在下用放线菌素D处理的Act1-/-MEF中的RNA衰减。将所指示的mRNA水平针对GAPDH作归一化，并以随时间变化的衰减(左)和半衰期(右)的形式表示。数据代表两次独立实验。(平均值和标准偏差，根据学生t检验，*，p<0.05)。

图3.Act1 SEFIR与CXCL1 3’UTR中的茎环结构结合。A.小鼠CXCL1 3'UTR，以及来自所指示物种的CXCL1 3'UTR中的含保守性茎环的区域的比对的图示。比对物包括小鼠(SEQ ID NO:81)、大鼠(SEQ ID NO:82)、人(SEQ ID NO:83)、黑猩猩(SEQ ID NO:84)、仓鼠(SEQ ID NO:85)、马(SEQ ID NO:86)和豚鼠(SEQ ID NO:87)。用阴影框指示出形成保守性茎环的核苷酸。小鼠CXCL1序列是相对于UTR的第一个核苷酸进行编号的。B.执行REMSA以检查纯化的重组His-MBP-Act1 SEFIR与来自CXCL1 220(720-940)(如A中所指示的)的两端的连续缺失突变体的结合。表格示出了连续缺失突变体CXCL1 120(780-900)、CXCL1 110(780-890)、CXCL1 90(790-880)、CXCL1 80(800-880)、CXCL1 70(800-870)的表观Kd，该表观Kd是作为实现RNA 50％结合所必需的His-MBP-Act1 SEFIR浓度计算的(量化参见材料和方法)。数据代表三次独立实验(平均值和标准偏差)。C.通过REMSA检查纯化的重组His-MBP-Act1 SEFIR与SEFIR结合元件(SBE WT，如A中所指示的CXCL1 47)以及茎环B和茎环C破坏突变体(SBE突变体B和SBE突变体C，材料和方法中的表2)的结合。D.用pTRE2(CXCL1 220，核苷酸720-940，Datta等人，2010)、茎环B或茎环C破坏突变体(SBE突变体B和SBE突变体C，表2)转染，用强力霉素单独地或与IL-17(50ng/ml)一起处理0、45或90分钟的HeLa Tet-Off细胞中的CXCL1和GAPDH mRNA的实时PCR分析。将CXCL1 mRNA水平针对GAPDH作归一化，并以半衰期的形式表示。数据代表2次独立实验(平均值和标准偏差，根据学生t检验，*，p<0.05)。E.在不存在或存在Act1的情况下，孵育5'末端标记的CXCL1 SBE。然后用如所指示的RNA酶T1、A或V1部分消化反应物。通过变性凝胶电泳分析产物。左侧泳道中示出了测序(G和C+U)和碱梯。凝胶左侧的数字使用(F)中的编号表示核苷酸的位置。C46上方的条带是由在限制性内切酶切隔后，质粒模板中的剩余序列产生的。指示出SBE的不同区域。所示凝胶是来自于3次独立实验的代表性实例。红色方框表示SBE中的一直观察到的受保护的核苷酸。F.示出了来自小鼠CXCL1 mRNA的SEFIR结合元件的结构(SEQID NO:80)。星号表示受到保护而免受RNA酶A和V1切割的核苷酸。G.通过REMSA检查纯化的重组His-MBP-Act1 SEFIR与茎环C和突变体的结合。

图4.针对3’UTR的Act1-RNA结合通过TBK1介导的Dcp1磷酸化而抑制脱帽。A.(a-d)使用纯化的Dcp1/Dcp2利用不断增加的量的纯化Act1 WT或Act1ΔSEFIR1，在存在或不存在TBK1抑制剂(MRT67307)的情况下，对Cap(m7GDP)标记的报告RNA[CXCL1 220(a)和无茎环C的突变体(CXCL1 220-茎环C突变体，c)]进行脱帽测定。蛋白质的纯化在材料和方法中有描述。EDTA和煮沸作为阴性对照包括在内，以灭活Dcp1/Dcp2酶活性。通过密度测定法对放射图进行量化。B.图表示出通过将释放的Cap量化为由纯化Dcp1/2催化的Cap的量的百分比而计算出的脱帽活性。数据代表三次独立实验(平均值和标准偏差)。C.利用抗-TBK1对来自于用或未用野生型Act1(WT和Act1 KO)重建的Act1-/-MEF的细胞裂解物进行免疫沉淀(IP)，随后使用如所指示的抗体进行蛋白质印迹分析。数据代表两次独立实验。D.用抗-Act1对来自于未经处理和经IL-17处理的HeLa细胞的细胞裂解物进行免疫沉淀(IP)，随后使用如所指示的抗体进行蛋白质印迹分析。数据代表两次独立实验。E.对来自于用GFP腺病毒(CTRL)或Cre-GFP腺病毒(Cre)感染的未经处理或经IL-17A处理的小鼠肾上皮细胞(来自于TBKf/fKKi-/-和TBKf/f IKKi+/-小鼠)的裂解物的蛋白质印迹分析。数据代表两次独立实验。使用ImageJ通过密度测定法对蛋白质印迹进行量化。F.使用来自于用带FLAG标签的Dcp1转染的HeLa细胞的Dcp1免疫沉淀物，利用重组TBK1对Dcp1进行体外激酶测定。G.将带V5标签的野生型Dcp1(左图)或S315A突变体(右图)转染到具有带HA标签的TBK1和/或带FLAG标签的Dcp2的HeLa细胞中。将细胞裂解物使用抗FLAG进行免疫沉淀(IP)，随后使用所指示抗体进行蛋白质印迹分析。数据代表两次独立实验。使用ImageJ通过密度测定法对蛋白质印迹进行量化。H.利用抗-Act1对来自于未经处理以及在有或无TAK1抑制剂(MRT67307)存在的情况下用IL-17处理的MEF的细胞裂解物进行免疫沉淀(IP)，随后使用如所指示的抗体进行蛋白质印迹分析。数据代表两次独立实验。使用ImageJ通过密度测定法对蛋白质印迹进行量化。I.如所指示的，将与(E)中所描述的细胞相同的细胞不加以处理或用IL-17A(50ng/ml)刺激0、2、6或24小时。然后分别通过RT-PCR(上图)和Elisa(下图)分析mRNA和蛋白质水平。数据代表两次独立实验(平均值和标准偏差，根据学生t检验，*，p<0.05，**，p<0.01)。

图5.Act1与Dcp1/Dcp2、SF2和HuR形成不同的RNP。A.用所指示表达构建体转染的HeLa细胞中原位PLA的共聚焦成像。使用针对Flag标签的小鼠一抗和针对HA标签的兔抗体。红点指示两种蛋白质(包括Act1-HA/SF2-Flag、Act1ΔSEF-HA/SF1-Flag、Act1-HA/HuR-Flag和Act1-ΔSEF-HA/HuR-Flag)的相互作用。细胞核用DAPI染色。还通过成像数据下方示出的蛋白质印迹分析来分析经转染的构建体的表达水平。B.条形图示出了A中所示PLA阳性细胞的百分比。基于对50个细胞的分析进行量化，随后进行双尾学生t检验。数据表示平均值±标准偏差；*，p<0.05。C.将通过用带FLAG标签的小鼠野生型Act1(WT)或SEFIR1缺失突变体进行逆转录病毒感染而重建的Act1-/-MEF用TNF预处理1小时，然后用IL-17处理0和60分钟，随后用抗SF2或抗HuR进行RNA免疫沉淀，随后对所指示的mRNA进行RT-PCR分析。给出的值是针对IgG对照作归一化的相对值(材料和方法)。D.小鼠CXCL1 3’UTR的图示。指示出HuR、Act1和SF2结合区。E.通过REMSA检查纯化的重组SF2与SEFIR结合元件(SBE WT，如A中所示的CXCL1 47)以及茎环B和茎环C破坏突变体(SBE突变体B和SBE突变体C，表2)的结合。F.使用探针CXCL1 220II(含有如D中所指示的SF2和Act1结合位点)进行Act1-SEFIR和SF2RNA结合竞争。如所指示的，在与或不与纯化SF2共同孵育的情况下，将放射性标记的RNA探针与不断增加的量的Act1-SEFIR一起孵育。通过天然PAGE将游离RNA与RNA-蛋白复合物分离。图表指示出在与不断增加的量的Act1-SEFIR一起孵育后SF2-CXCL1 220II的解离，所述解离是通过量化在指示量的Act1-SEFIR存在的情况下剩余的SF2-CXCL1 220II复合物来计算的。数据代表三次独立实验(平均值和标准偏差)。G.将来自于通过用带FLAG标签的小鼠野生型Act1(WT)或SEFIR1缺失突变体进行逆转录病毒感染而重建，用IL-17(50ng/ml)刺激所指示的时间的Act1-/-MEF的细胞质和细胞核级分裂解物用抗FLAG进行免疫沉淀，并用所指示抗体进行蛋白质印迹分析。重复实验两次。H.使用纯化的重组SF2作为底物对纯化的重组IKKi进行体外激酶测定。I.执行REMSA以检查IKKi-磷酸化SF2(p-SF2)和非磷酸化SF2(-IKKi和-ATP)与SEFIR结合元件(SBE WT，如图3A所指示的CXCL1 47)的结合。图表指示出CXCL1 47(图3A)的表观Kd，该表观Kd是作为实现RNA 50％结合所必需的SF2蛋白浓度计算的(材料和方法)。数据代表三次独立实验(平均值和标准偏差)。J.通过REMSA检查纯化的重组HuR与如D中所指示的CXCL1 220-I(含有HuR结合位点)和CXCL1 220 II(含有SF2和Act1结合位点)的结合。K.使用CXCL1 220(含有如D中所指示的HuR和Act1结合位点)和CXCL1220II(含有如D中所指示的Act1，但不含有如D中所指示的HuR结合位点)作为探针，通过REMSA检查纯化的重组HuR和Act1-SEFIR与CXCL1 3'UTR的同时结合。在探针CXCL1-220情况下观察到共同结合的Act1-HuR，但在CXCL-220II情况下未观察到。L.如所指示的在蔗糖密度梯度上分离成不同级分的RNP和多核糖体复合物的紫外吸收曲线。M.将通过用带FLAG标签的小鼠野生型Act1(WT)或SEFIR1缺失突变体进行逆转录病毒感染而重建，用TNF预处理1小时，然后用IL-17处理0和90分钟的Act1-/-MEF的细胞质提取物经过10–50％蔗糖梯度(如L中所述)进行分级分离，并用所指示抗体通过蛋白质印迹分析进行分析。N.通过RT-PCR分析来自于L的有翻译活性的库和无翻译活性的库的CXCL1和GAPDH mRNA，并将其针对β-肌动蛋白作归一化。图表示出了来自于有翻译活性/无翻译活性的库的mRNA的比率。数据代表三次独立实验。(平均值和标准偏差，根据学生t检验，*，p<0.05，**，p<0.01)。O.mRNA稳定化中的Act1-RNP模型：Act1与炎症基因的mRNA直接结合从而形成多个RNP，RNP响应于IL-17刺激而控制不同的mRNA代谢步骤。在IL-17刺激后，Act1易位到细胞核中，在细胞核中Act1与靶mRNA(RNP1)中3’UTR中的茎环结构结合。Act1的结合通过使IKKi磷酸化SF2而将SF2从mRNA上竞争掉，从而阻止SF2介导的mRNA衰减。然后，Act1跟随mRNA到达P小体(RNP2)，从而通过采用TBK1来磷酸化Dcp1而抑制Dcp1/2介导的mRNA脱帽。最后，将Act1-mRNA转移到多核糖体上，以促进HuR与mRNA结合(RNP3)以进行蛋白质翻译。

图6.SBE RNA适体消除了IL-17诱导的CXCL1、GM-CSF和TNF的mRNA稳定化。A.SBERNA适体被用于与CXCL1 220探针竞争结合Act1-SEFIR。将纯化的重组His-MBP-Act1 SEFIR(200ng)与CXCL1 220一起在所指示倍数的过量SBE适体存在下孵育，随后进行REMSA。在竞争测定中使用SBE WT(如图3A中所指示的CXCL1 47)、SBE突变体B和SBE突变体C(表2)。图表量化了在所指示浓度的SBE适体存在的情况下剩余的被Act1-SEFIR结合的CXCL1 220探针。将IC50作为从Act1-SEFIR中置换50％被结合的CXCL1 220探针的适体的浓度来计算。数据代表三次独立实验(平均值和标准偏差)。B.使用共聚焦成像分析RFP-Act1和荧光素亚酰胺标记的SBE适配体(SBE-FAM)的定位。用Act1-RFP转染HeLa细胞，随后在24小时后用SBE-FAM进行第二次转染。在SBE-FAM转染后的所指示小时时固定细胞，并使用共聚焦显微镜术进行分析。用DAPI对细胞核染色。图表指示出在SBE-FAM转染后5、10和20小时时每个细胞的SBE-FAM阳性、Act1-RFP阳性和SBE-FAM/Act1-RFP双阳性颗粒的平均数目。基于对50个表达细胞的分析进行量化，随后进行双尾学生t检验。数据表示平均值±标准偏差；*，p<0.05，**，p<0.01。C.用100pmol/ml未标记的SBE适体转染的Dcp1-RFP和Act1-GFP表达细胞的共聚焦成像。用Dcp1-RFP和Act1-GFP共转染HeLa细胞，随后在24小时后用未标记的SBE适体进行第二次转染。在SBE适体转染后24小时固定细胞，并使用共聚焦显微镜术进行分析。用DAPI对细胞核染色。图表指示出在SBE-FAM转染后24小时每个细胞的Dcp1-RFP阳性、Act1-GFP阳性和Dcp1-RFP/Act1-GFP双阳性颗粒的平均数目。基于对50个表达细胞的分析进行量化，随后进行双尾学生t检验。数据表示平均值±标准偏差；*，p<0.05。D.SBE RNA适体被用于与GM-CSF3’UTR(513-785)和TNF 3’UTR(1362-1507)探针竞争结合Act1-SEFIR。将纯化的重组His-MBP-Act1SEFIR(200ng)与GM-CSF和TNF 3’UTR探针一起在所指示倍数的过量SBE适体的存在下孵育，随后进行REMSA。在竞争测定中使用SBE WT(如图3A中所指示的CXCL1 47)和SBE突变体C(表2)。E.用或未用100pmol/ml SBE RNA适体(WT或突变体C)转染，用TNF(10ng/ml)预处理1小时，然后单独地(NT)或在IL-17(50ng/ml)的存在下用放线菌素D处理45和90分钟的HeLa细胞中的RNA衰减。通过RT-PCR测量人CXCL1、GM-CSF和TNF mRNA，将其针对GAPDH作归一化，并以半衰期的形式表示。F.将用或未用100pmol/ml SBE RNA适体(WT或突变体C)转染的HeLa细胞用TNF(10ng/ml)预处理1小时，随后用IL-17A(50ng/ml)刺激6、8或24小时。然后通过ELISA分析经处理的细胞的上清液。数据代表两次独立实验，并通过双尾学生t检验进行分析。数据表示平均值±标准偏差；*，p<0.05，**，p<0.01。

图7.SBE RNA适体抑制IL-17依赖性皮肤增生。A.皮内注射IL-17A(500ng)或PBS连同甲基化(材料和方法)SBE RNA适体[作为阴性对照的SBE突变体C(1nmol)或SBE WT适体(1nmol)]连续6天的C57BL/6J小鼠的耳部皮肤组织的H&E染色。B.对来自A的耳部皮肤的石蜡切片进行针对Ly6G的免疫组织化学染色。C.以任意单位测量来自A的耳部皮肤的表皮厚度，并对来自B的每个切片的Ly6G+细胞的平均数目进行计数。在20X放大倍数下对每只小鼠分析5个视野。比例尺为100μm。通过双尾学生t检验分析数据；*，p＜0.05，t检验。数据表示生物学重复的平均值±S.E.M(n＝6只小鼠/组)。D.如A中所述从耳部皮肤组织分离的mRNA的RT-PCR分析。将Act1-靶基因的表达作为超过PBS+对照适体处理组的平均诱导倍数用图表表示。数据表示生物学重复的平均值±SEM(n＝6只小鼠/组)。使用双尾学生t检验来分析数据。**，p<0.01，*，p<0.05。

图8示出了在自身免疫和炎性疾病的发病机制中影响炎症基因表达的ACT-1介导的mRNA稳定化的假设的非限制性机制，以及用选择性结合ACT1、对IL-17具有抑制活性的核酸序列进行的治疗性干预。

图9示出了使用适体介导的Act1-mRNA破坏来治疗炎性和自身免疫性疾病如银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎症性肠病和全身性狼疮的假设的非限制性机制。

图10示出了来自于小鼠CXCL1 mRNA的2'-O-甲基化的SBE(SEQ ID NO:80)，其包括由该序列形成的茎环二级结构。

图11示出了示例性SBE核酸适体(SEQ ID NO:1)的共有结构。这些序列中的N′独立地选自A、G、C、T、U以及经修饰的和非规范的核苷酸碱基。可以看出，如果选择特定的N，则与之杂交的碱基必须是相应的碱基(例如，如果选择“G”，则杂交碱基将为“C”)。

图12示出了示例性SBE核酸适体(SEQ ID NO:2)的共有结构。这些序列中的N′独立地选自A、G、C、T、U以及经修饰的和非规范的核苷酸碱基。

图13示出了七种示例性SBE核酸适体(SEQ ID NO:88-94)。

图14示出了四种示例性SBE核酸适体(SEQ ID NO:99-102)。

图15示出了示例性SBE核酸适体(SEQ ID NO:103)的共有结构，其中三个“W”是A或U(例如，AAA、AUA、UUA、UUU、UAU等)。

图16示出了八种示例性SBE核酸序列(SEQ ID NO:104-111)，这些序列在本公开实施方案开发期间进行的工作中经EMSA测试时显示出阳性结果。

具体实施方式

本文提供使用结合ACT1蛋白的SEFIR结构域的SBE核酸序列治疗IL-17a相关疾病和病状的组合物、系统、试剂盒和方法。在某些实施方案中，SBE核酸序列(适体)包含RNA和/或DNA，并且长度在10至65个核苷酸之间。在某些实施方案中，SBE适体形成茎环型结构。

促炎细胞因子IL-17，是自身免疫的主要驱动因子，通过与含SEFIR的衔接子Act1相互作用的异二聚体受体复合物(IL-17RA和IL-17RC)发出信号。在本文所述实施方案开发期间进行的工作发现，Act1具有作为RNA结合蛋白的非规范功能，能响应于IL-17刺激(包括CXCL1、TNF、GM-CSF以及IL-6)稳定促炎基因的原本不稳定的mRNA。结构功能分析显示SEFIR结构域对于Act1的RNA结合活性是必需和足够的。虽然本发明不限于任何特定机制，并且对机制的了解不是实践本发明所必需的，但是据信Act1与P小体中mRNA的3'UTR中的茎环结构直接结合，从而通过使激酶TBK1磷酸化并破坏Dcp1/Dcp2复合物来抑制它们脱帽。含有Act1RNA结合基序的RNA寡核苷酸消除了Act1在P小体内的定位，并阻止Act1介导的mRNA稳定化。总的来说，这些结果支持一种新范例，其中受体近端衔接子Act1直接控制mRNA代谢，从而为炎症期间受体介导的mRNA稳定化选择性提供了一种机制。

本文进行的工作表明，Act1是一种白细胞介素17(IL-17)受体复合物衔接子，结合并稳定编码关键炎症蛋白的mRNA。Act1 SEFIR结构域结合CXCL1 3'UTR中的茎环结构SBE(SEFIR结合元件)。值得注意的是，被mRNA结合的Act1指导三种分区不同的RNP的形成，这些RNP调节炎症mRNA代谢中的三个不同事件，即阻止细胞核中SF2介导的mRNA衰减，抑制P小体中Dcp1/2介导的mRNA脱帽，并促进HuR与多核糖体mRNA结合以促进翻译。SBE RNA适体减少体外IL-17介导的mRNA稳定化，以及IL-17诱导的皮肤炎症，从而为自身免疫性疾病和相关病状提供了新的治疗策略。虽然本发明不限于任何特定的机制，并且对机制的理解不是实践本发明所必需的，但是据信，总的来说，这些结果揭示了一种特别的网络，其中Act1在选择mRNA的3'UTR上组装RNP以控制炎症期间受体介导的mRNA稳定化和翻译。

在某些实施方案中，本文提供了可用于治疗IL-17a疾病或病状的SBE适体。在某些实施方案中，SBE适体是与ACT1结合并抑制IL-17a活性的单链RNA或DNA寡核苷酸(例如，12mer-70mer，如56-mer)。在某些实施方案中，与抗体相比，SBE适体的尺寸更小，是亲脂性的并且更容易进入细胞，并且具有更低的免疫原性。在特定实施方案中，SBE适体抑制IL-17介导的mRNA稳定化。在特定实施方案中，SBE适体利用特异性识别ACT-1(通过结合)。在某些实施方案中，SBE适体抑制体内IL-17而不会失去IL-17的抗菌和抗真菌功能。在某些实施方案中，将SBE适体进一步化学修饰以提高亲和力和/或增加稳定性(例如，2'-O-甲基化)。在一些实施方案中，在2'-糖或碱基处进行SBE适体在一个或多个嘧啶核苷酸处的修饰，以提高亲和力和/或稳定性。

IL-17a是许多炎症和自身免疫性疾病发病机制中的已知靶标。COSENTYX(苏金单抗(secukinumab))与IL-17选择性结合，在欧盟被批准用于治疗银屑病。本文的SBE适体可用作苏金单抗的替代疗法，用于治疗银屑病或其它自身免疫性疾病。

在某些实施方案中，SBE核酸适体序列选自图12和13以及下表4中所示的SEQ IDNO:2和88-94。

表4

在某些实施方案中，SBE核酸适体序列选自下表7中所示的SEQ ID NO：112-129(其中N选自A、T、G、C和U)。

表7

NNNNNNNNNNNNAGAUAAUAUCUNNNNNNNNNNNNN	SEQ ID NO：112
		NNNNNNNNNNNNCGAUAAUAUCGNNNNNNNNNNNNN	SEQ ID NO：113
NNNNNNNNNNNNAGCUAAUGUCUNNNNNNNNNNNNN	SEQ ID NO：114
		NNNNNNNNNNNNCGCUAAUAGCGNNNNNNNNNNNNN	SEQ ID NO：115
NNNNNNNNNNNNUGAUAAUAUCANNNNNNNNNNNNN	SEQ ID NO：116
		NNNNNNNNNNNNUGUUAAUAACANNNNNNNNNNNNN	SEQ ID NO：117
NNNNNNNNNNNNGGAUAAUAUCCNNNNNNNNNNNNN	SEQ ID NO：118
		NNNNNNNNNNNNAGGUAAUACCUNNNNNNNNNNNNN	SEQ ID No：119
NNNNNNNNNNNNGGGUAAUACCCNNNNNNNNNNNNN	SEQ ID NO：120
		NNNNNNNNNNNNAGUUAAUAACUNNNNNNNNNNNNN	SEQ ID NO：121
NNNNNNNNNNNAAGAAAAUCUUNNNNNNNNN	SEQ ID NO：122
		NNNNNNNNNNNAAGAAUAUCUUNNNNNNNNN	SEQ ID No：123
NNNNNNNNNNNAAGAAAUUCUUNNNNNNNNN	SEQ ID NO：124
		NNNNNNNNNNNAAGAAUUUCUUNNNNNNNNN	SEQ ID NO：125
NNNNNNNNNNNAAGAUAAUCUUNNNNNNNNN	SEQ ID NO：126
		NNNNNNNNNNNAAGAUAUUCUUNNNNNNNNN	SEQ ID NO：127
NNNNNNNNNNNAAGAUUAUCUUNNNNNNNNN	SEQ ID NO：128
		NNNNNNNNNNNAAGAUUUUCUUNNNNNNNNN	SEQ ID NO：129

在某些实施方案中，对SEQ ID NO:88-94和99-129进行一个、两个或三个核苷酸取代，如基本上不改变图13或14所示的茎环结构的保守性取代。在其它实施方案中，从SEQ IDNO:88-94和99-129的5'末端、3'末端，或5'和3'末端二者中删除一个、两个或三个核苷酸以产生其截短型式。

在一些实施方案中，可以鉴定结合ACT1 SEFIR结构域的另外的SBE核酸序列适体。下表6中提供了在培养的角质形成细胞中通过IL-17刺激而稳定化的644种转录物。可以针对结合ACT1 SEFIR结构域的SBE序列筛选这些转录物以及SEQ ID NO:88-94和99-129的突变型式。例如，通过使用电泳迁移率变动测定(EMSA)、表面等离子体共振测定或微尺度热泳测定(对于条件和程序，进一步参见下面的实施例1)测量含有源自上述3'UTR的序列的RNA适体与纯化Act1 SEFIR蛋白(SEQ ID NO:95，rkvfitysmdtamevvkfvnfllvngfqtaidifedrirgidiikwm erylrdktvmiivaispkykqdvegaesqldedehglhtkyihrmmqiefisqgsmnfrfipvlfpnakkeh vptwlqnthvyswpknkknillrllree)的结合，可从表6的基因列表中的转录物的3'UTR中鉴定出SBE适体。将与Act1-SEF IR蛋白结合的候选RNA适体视为具有改善IL-17介导的疾病的潜力的SBE适体。

可以进一步测试所鉴定的SBE抑制IL-17诱导的mRNA稳定性的能力。为此，可以用或不用100pmol/ml SBE RNA适体转染HeLa细胞，用TNF(10ng/ml)预处理1小时，然后用放线菌素D单独地(NT)或在IL-17(50ng/ml)的存在下处理45和90分钟。可以通过RT-PCR测量人CXCL1、GM-CSF和TNF mRNA，将其针对GAPDH作归一化，并以半衰期的形式表示。通过ELISA分析经处理的细胞的上清液。可以减少CXCL1、GM-CSF和TNF转录物的半衰期并钝化其蛋白质表达的SBE适体是可以用于治疗IL-17介导的疾病如银屑病、严重哮喘和癌症的真正SBE适体。

表5

从表6中的转录物的3’UTR中鉴定出的示例SBE元件

表6

实施例

实施例1

在该实施例中，报道了Act1的一种令人兴奋的新型作用，Act1起到直接RNA结合蛋白的作用，响应于IL-17刺激而稳定促炎基因(包括CXCL1、TNF和GM-CSF)的原本不稳定的mRNA。诱变研究表明，Act1与CXCL1的3'UTR中的茎环结构直接结合，而Act1中的SEFIR结构域对于RNA结合活性是必需和足够的。支持这一点的是，含有茎环结构的示例性RNA适体(称为SBE)抑制Act1与靶mRNA的结合，并减弱IL-17介导的mRNA稳定化。而且，同时SBE RNA适体抑制IL-17诱导的皮肤炎症。

虽然本发明不限于任何特定机制，并且对机制的了解不是实践本发明所必需的，但是据信，从机制上讲，Act1与炎症基因的mRNA直接结合从而形成多种控制mRNA代谢的不同步骤的RNP(蛋白质-RNA复合物)。Act1与细胞核中的mRNA结合(RNP1)，从而通过将SF2与mRNA的结合竞争掉而阻止SF2介导的mRNA衰减，并且Act1跟随mRNA到达P小体(RNP2)，从而通过采用TBK1磷酸化Dcp1而抑制Dcp1/2介导的mRNA脱帽。最后，被Act1结合的mRNA通过促进HuR与mRNA结合(RNP3)而转移到多核糖体上进行蛋白质翻译。总的来说，该实施例提供了在mRNA代谢中起直接作用的受体相互作用的衔接子分子Act1的第一实例，并阐明了受体介导的mRNA稳定化和翻译选择性的新机制。

材料和方法：

动物：IKKi缺陷小鼠是来自于T.Maniatis的礼物。TBK1 flox小鼠获自MilleniumPharmaceuticals,Inc.，将6周龄的小鼠用于原代肾细胞分离。将LSL–HA–Act1敲入小鼠培育成UBC-Cre-ERT2小鼠(Ruzankina等人，2007)。克利夫兰诊所机构动物护理和使用委员会(Cleveland Clinic Institutional Animal Care and Use Committee)审查并批准了动物实验。

细胞培养和试剂：针对Act1、GAPDH和β-肌动蛋白的抗体来自于Santa CruzBiotechnology。抗血凝素(HA)来自于Sigma；TBK1抗体、M2、V5、p-JNK、JNK、p-IkBa、p-p65、p65、IKKi、IKKα/β、pERK和pIkB抗体购自Cell Signaling Technology。p-S315 Dcp1a抗体是来自于Elisa Izaurralde博士的礼物。Dcp1抗体是来自于Jens-Lykke Andersen博士的礼物。TBK1抑制剂MRT67307购自Sigma Aldrich。如先前所述的那样分离小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、HeLa Tet-Off细胞和原代肾上皮细胞的细胞培养物(Herjan等人，2013)。如前所述的那样用空载体、带flag标签的mAct1或带flag标签的mAct1缺失突变体通过逆转录病毒感染重建Act1-/-MEF(Liu等人，2011)。根据制造商的说明(Duolink^TMAssay，SigmaAldrich)在Hela细胞中进行基于邻近度的连接测定。

转染、腺病毒和逆转录病毒感染：所有转染均用Lipofectamine 2000(Invitrogen)根据制造商的说明进行。为了将Act1重建为Act1-/-MEF，如先前所述，用逆转录病毒上清液感染细胞(Qian等人，2007)。简言之，通过用5μg源自pMSCV-IRES-GFP的逆转录病毒构建体转染Phoenix细胞48小时而获得病毒上清液。用病毒上清液感染MEF24小时，并分选出GFP阳性细胞以建立稳定的细胞系用于下游测定。腺病毒感染：将原代肾上皮细胞分到60mm培养皿中，并且通过将它们暴露于每毫升含有2x 10⁵个腺病毒感染单位/空斑形成单位的培养基中过夜来进行感染。

定量实时PCR：用TRIzol试剂(Invitrogen)分离总RNA。用随机六聚体(AppliedBiosystems)和M-MLV逆转录酶(Promega)合成cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(Applied Biosystems)进行实时PCR。所有基因表达结果均通过循环变化阈值(ΔCT)方法计算得出，其中ΔCT＝靶基因的CT值-Actb(编码β-肌动蛋白)的CT值，并以2-ΔCT的形式表示。表3列出了用于qPCR的引物。

构建体：对于GFP报告基因构建体，将hAct1、hDcp1a、hIKKi、hTBK1和hTIA1的全长cDNA克隆到pEGFP-N1载体(Clontech)中。对于RFP报告基因构建体，将hAct1、hIRAK1和hDcp1a的全长cDNA克隆到pDsRed-单体-Hyg-N1载体(Clontech)中。对于构建体V5-hDcp1a、FLAG-hDcp1a、FLAG-hDcp2、FLAG-hIRAK1、V5-IL-17RA、HA-hAct1和HA-hAct1ΔSEFIR，将具有相应标签的cDNA克隆到pcDNA3.1载体中。将野生型(FLAG-hAct1)和Act1缺失突变体(ΔSEFIR1，氨基酸残基391至420缺失；ΔSEFIR，氨基酸残基391至537缺失)加上flag标签并克隆到pcDNA3.1中。

用于体外转录的构建体：通过PCR生成含有CXCL1 220(核苷酸720-940)和截短片段CXCL1 120(核苷酸780-900)、CXCL1 110(核苷酸780-890)、CXCL1 90(核苷酸790-880)、CXCL1 80(核苷酸800-880)、CXCL1 70(核苷酸800-870)；SBE WT(CXCL1 47，核苷酸810-857)、SBE突变体B(CXCL1 47，核苷酸810-857，具有表2所示改变的序列)、SBE突变体C(CXCL1 47，核苷酸810-857，具有表2所示改变的序列)、茎环B(CXCL1，800-835)和茎环C(CXCL1，830-856)的3'UTR序列以及TNF(核苷酸1361-1507)、GM-CSF(核苷酸513-785)和GPx1(核苷酸775-962)的3'UTR序列的片段，并使用EcoRI和BamHI位点克隆到pGEM-3ZF(+)载体(Promega)中。含有小鼠TNF的3'UTR的质粒是Vigo Heissmeyer博士的礼物。使用QuikChange II定点诱变试剂盒(Stratagene)根据制造商的说明引入所有突变。表1中列出了用于产生所有构建体的引物。

表1.用于PCR的引物

SEQ ID NO：

表2.选定的REMSA探针

体外转录和帽标记：在37℃下用T7 RNA聚合酶，使用1mM GTP、1mM ATP、1mM CTP、0.005mM UTP和25μCi 32P标记的UTP，由BamHI线性化质粒(参见用于体外转录的构建体)模板经3小时合成REMSA放射性标记的3’UTR RNA探针。探针经DNA酶I处理20分钟，然后用苯酚:氯仿提取。根据制造商的说明(BioRad)，使水相通过Micro Bio-Spin P30柱。对于体外脱帽，如上所述的那样，但是使用未标记的1mM CTP来合成探针，用DNA酶处理并加以纯化。在[α-32P]GTP的存在下，使用牛痘病毒加帽体系(NEB)根据制造商的说明进行帽标记。

对于RNA酶足迹实验，将冷的合成转录物用SuperSAP(Affymetrix)进行去磷酸化，纯化，然后将其重悬于无核酸酶的水中。在[γ32P]ATP(3000Ci/mmol；Perkin Elmer EasyTides)和20单位/pmol RNA的T4 PNK(NEB)的存在下，对去磷酸化的转录物进行末端标记。将转录物在8％丙烯酰胺(19:1)/7M尿素凝胶上进行凝胶纯化，并在4℃下在10mM Tris HCl(pH 7.5)、1mM EDTA(pH 8)、300mM NaAc(pH 5.5)中洗脱过夜。将纯化RNA于-20℃下储存在10mM Tris HCl(pH 7.5)中。

RNA酶足迹

将末端标记的32P标记的CXCL1 SBE RNA加热至95℃，然后缓慢冷却至室温。在30℃下将RNA(2.5nM)在存在或不存在小鼠Act1 SEFIR蛋白(1.5μM)的情况下在L30结合缓冲液(30mM Tris HCl(pH 8.0)、75mM KCl、5mM MgCl2、1mM DTT、0.04μg/μL BSA(NEB)、10％甘油和50ng/μL酵母tRNA)中孵育10分钟。在2分钟内使反应物冷却至室温，然后在22℃下放置2-5分钟。将指量化的RNA酶T1、A或V1(Ambion)添加到适当样品中，并且在22℃下孵育5分钟。用30μL灭活/沉淀缓冲液(Ambion)淬灭酶促反应，并根据制造商的指导进行纯化。将样品重悬于10μL上样缓冲液(Ambion)中，在95℃下热变性5分钟，并且在变性的8％(19:1)聚丙烯酰胺/7M尿素凝胶中进行分离。用磷屏成像仪或在膜上目测检查干燥的凝胶。

通过在补充了50ng/μL酵母tRNA的1X测序缓冲液(Ambion)中孵育末端标记的32P标记的CXCL1 SBE RNA(2.5nM)制备测序梯。将RNA在50℃下孵育5分钟，冷却至22℃，并添加指量化的RNA酶T1和A。如上所述的那样孵育、淬灭和纯化样品。通过将末端标记的32P标记的PHGPx SECIS RNA(2.5nM)在100mM NaOH、2mM EDTA(pH 8.0)和2μg/μL酵母tRNA(其中添加有0.2M Tris HCl,pH8.0(最终))中于37℃下孵育3分钟来制备碱梯。将样品在干冰上冷冻，并与等体积的上样缓冲液组合。

RNA电泳迁移率变动测定(REMSA)：将不断增加的量的纯化蛋白和标记探针(10fmol，参见体外转录)组合在结合缓冲液中,保持30分钟。REMSA结合缓冲液最终浓度为140mM KCl、10mM HEPES(pH 7.9)、5％甘油、1mM DTT和0.33mg/ml tRNA。反应中还补充了15μg鲑鱼精DNA，以减少裂解物的非特异性相互作用。将复合物在4％或6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离。干燥凝胶，并通过暴露于BioMax MR膜来目测检查复合物的外观。通过使用ImageJ软件量化被蛋白质结合的级分，并相对蛋白质浓度(nM)作图来确定解离常数(Kd)。从Graph PAD Prism软件(OriginLab)中拟合为双曲线函数的图中提取Kd值。

表面等离子体共振：在Biacore 3000上进行结合亲和力测定。将生物素化的RNA固定在链霉亲和素包被的传感器芯片上。根据标准方案激活和阻滞SA传感器芯片。将RNA在HBS-EP缓冲液(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20)中稀释至1mM，在80℃下加热10分钟，冷却至室温以使茎退火，在运行缓冲液中稀释500倍。将RNA以10μL/分钟的流速注入，在SA芯片上捕获～40个共振单位的RNA。为了研究RNA/Act1的相互作用，将蛋白质稀释于运行缓冲液中，并以传感图中指示的浓度注入。在25℃下以30μl/分钟的流速进行结合实验。通过以20μl/分钟注入2M NaCl 60秒来去除3分钟解离期后仍然被结合的任何蛋白质，这使RNA表面再生完全。用BIAcore 3000评估软件分析数据，并用“1:1以漂移基线结合(1:1binding with drifting baseline)”模型拟合曲线。

脱帽测定：通过使用抗FLAG/M2珠粒(Sigma)，从用10ug带FLAG标签的Dcp1和带FLAG标签的Dcp2(来自于Andersen博士的礼物)或用10ug带FLAG标签的Act1共转染的HeLa细胞(2x 106)中纯化出Dcp1/Dcp2复合物和Act1蛋白，以50ul使用3x FLAG肽(Sigma)进行洗脱，并通过与已知浓度的Act1 SEFIR蛋白进行比较来估计蛋白质浓度。将10fmol的[32P]帽标记RNA底物与纯化的Dcp1/Dcp2复合物(每种蛋白质100ng)和不断增加的量的纯化Act1蛋白(0、100和300ng)一起在补充有0.5mM新MnCl2的脱帽缓冲液(10mM Tris(pH 7.5)、100mM KOAc、2mM MgOAc、2mM DTT)中在37℃下孵育30分钟。通过添加1ul的0.5M EDTA终止反应。分离反应产物，并且通过在450mM(NH4)2SO4中显色的对纤维素片进行的TLC来鉴定反应产物。将7meGMP和7meGDP(20μg)与反应样品一起按常规点样在TLC板上，以用作可以通过紫外线遮蔽可视化的标志物。

皮内注射：在皮内实验之前的14天和7天，向LSL–HA–Act1敲入/UBC-Cre-ERT2小鼠注射他莫昔芬(tamoxifen)(～5mg/25g体重)。在存在或不存在5nmol的SBE WT适体或SBE突变体C适体(对于序列，请参见表2)的情况下，对8周龄雌性小鼠的耳部皮内注射20ul单独的PBS或含有0.5mg重组小鼠IL-17A的PBS。连续6天每天为小鼠注射。注射后六天，收集皮肤组织进行RNA和染色分析。对于H&E和DAB(3,3'-二氨基联苯胺，BD phamagen)染色，将皮肤组织在10％福尔马林中固定，然后加工成石蜡块。通过ImageJ软件对表皮厚度进行量化。

适体设计：含有SBE WT和SBE突变体C的序列(参见表2)的适体是从IntegratedDNA Technologies订购的。将来自5'和3'末端的前三个残基甲基化(2'-O-甲基RNA碱基)以便增强稳定性。为了检测，用6-FAM或Atto647荧光染料在5'末端对适体进一步修饰。

组织学分析：从经受鼻内施用荧光标记的SBE RNA适体的LSL-Act1-HA KI Cre-ERT2小鼠收集气管，在OCT培养基中速冻并以5μm冷冻切片。将冷冻的组织切片固定并用含有0.2％Triton X-100的4％多聚甲醛溶液透性化处理10分钟。将切片与兔抗HA抗体一起孵育，然后用Alexa Fluor 488缀合的山羊抗小鼠抗体(绿色)染色并进行显微镜分析。

ELISA测定：使用Duoset ELISA试剂盒(R&D system)，根据制造商的说明，收集细胞培养物的上清液并测量小鼠细胞因子CXCL1和TNFα的水平。

RNA结合测定RIP：如先前所述的那样评估Act1在体内与RNA结合的能力(Datta等人，2008)。简言之，将10x 106个通过用带M2标签的小鼠野生型Act1(WT)进行逆转录病毒感染而重建的Act1-/-MEF不加以处理或用IL-17(50ng/ml)处理1小时。将细胞经胰蛋白酶处理，洗涤两次，并重悬于10ml冰冷的PBS中。在室温下将细胞在0.1％甲醛中固定15分钟，接着用甘氨酸(pH 7；0.25M)终止交联反应。然后将细胞用冰冷的PBS洗涤两次，重悬于2mlRIPA缓冲液(50mM Tris-HCl[pH 7.5]、1％Nonidet P-40、0.5％脱氧胆酸钠、0.05％SDS、1mM EDTA、150mM NaCl和蛋白酶抑制剂)中，然后进行超声处理。将裂解物离心(15分钟，4℃，16,000x g)，并在4℃下使用与20ug抗M2或抗IgG抗体一起预孵育的Dynabead(invitrogen)对1ml的每种上清液进行免疫沉淀过夜。将珠粒用1ml RIPA缓冲液洗涤五次并重悬于150ul洗脱缓冲液(50mM Tris-Cl[pH 7]、5mM EDTA、10mM DTT、1％SDS)中。通过在70℃下孵育45分钟使交联逆转，根据制造商的说明用Trizol(Invitrogen)从免疫沉淀物中纯化RNA并用无RNA酶的DNA酶进行处理，合成cDNA并对10％(2微升)的逆转录酶产物进行定量实时PCR。表3列出了用于定量实时PCR的引物。

表3.用于定量实时PCR的引物。 SEQ ID NO:

RIP数据分析：将每个RIP RNA级分的Ct值针对相同qPCR测定(ΔCt)的输入RNA级分Ct值作归一化，以解释RNA样品制品的差异。然后，针对归一化背景(抗IgG)[非特异性(NS)抗体]级分Ct值(ΔΔCt)来调整归一化RIP级分Ct值(ΔCt)。通过ΔΔCt的线性转换来计算富集倍数[RIP/非特异性(NS)]。以下是用于计算的公式：ΔCt[归一化RIP]＝Ct[RIP]–(Ct[输入]–Log2(所保存的输入RNA的级分)))；ΔΔCt[RIP/NS]＝ΔCt[归一化RIP]–ΔCt[归一化NS]；富集倍数＝2(-ΔΔCt[RIP/NS])。

免疫印迹、免疫沉淀和核分级分离：收获细胞并将其在含有0.5％Triton X-100、20mM Hepes(pH 7.4)、150mM NaCl、12.5mM甘油磷酸酯、1.5mM MgCl2、10mM NaF、2mM二硫苏糖醇、1mM原钒酸钠、2mM EGTA、20mM抑肽酶和1mM苯甲基磺酰氟的裂解缓冲液中于冰上裂解20分钟，随后以12,000rpm离心15分钟以提取澄清的裂解物。为了进行免疫沉淀，将细胞裂解物与1μg抗体和A-琼脂糖珠粒在4度下孵育过夜。孵育后，将珠粒用裂解缓冲液洗涤四次，并用2x样品缓冲液洗脱沉淀物。将洗脱物和全细胞提取物在SDS-PAGE上分离，然后用抗体进行免疫印迹分析。使用购自Sigma的NUCLEI EZ PREP试剂盒，根据制造商的说明进行核分级分离。将核团块悬浮在30μl含有新鲜制备的1mM DTT和蛋白酶抑制剂混合物的核提取缓冲液(20mM HEPES、400mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA水溶液，pH 7.9)中。于冰浴上在间歇涡旋下孵育1.5小时后，将提取物离心并收集上清液进行免疫沉淀。

His-IL-17RA SEFIR、His-MBP-mAct1-SEFIR和His-MBP蛋白的表达和纯化：将编码人IL17RA的含SEFIR结构域的片段(His-IL-17RA SEFIR，氨基酸残基351至616)的cDNA亚克隆到具有N端6x His标签和烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)识别位点(ENLYFQG)的经修饰的pET-28载体中。如先前(Deng等人，2004)所述的那样，表达IL17RA SEFIR结构域并通过双镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)亲和方法纯化。在superdex s200高分辨率柱上进行的尺寸排阻色谱法用作纯化的最终步骤。将编码含有小鼠Act1片段(氨基酸残基391至537)的SEFIR结构域及其SEFIR结构域的缺失突变体(命名为SEFIR1至SEFIR5)(基于编码SEFIR结构域的区域的五个外显子：410至439、440至462、463至501、502至526和527至552)的cDNA克隆到经修饰的pET28b载体中，该载体表达具有N端6x His标签和C端TEV识别位点的麦芽糖结合蛋白(MBP)。如先前(Deng等人，2008)所述的那样表达并纯化重组mAct1-SEFIR或MBP蛋白。在superdex s200高分辨率柱上进行的尺寸排阻色谱法用作纯化的最终步骤。

体外激酶测定：将重组IKKi和TBK1(100nM)分别与纯化SF2和Dcp1(10nM)一起在含有25mM Tris(pH 7.5)、5mMβ-甘油磷酸酯、2mM DTT、0.1mM Na3VO4、10mM MgCl2，且补充有100nM ATP和1ul[γ-32P]-ATP(PerkinElmer)(10μCi)的激酶测定缓冲液中于37℃下孵育30分钟。将样品进行SDS-PAGE，随后进行放射自显影。

mRNA衰减测定：通过使用放线菌素D(5mg/mL)抑制转录来确定内源性mRNA的半衰期。如先前(Datta等人，2010)所述的那样在HeLa Tet-off细胞中进行脉冲追踪mRNA衰减测定。如先前(KCΔ4；Datta等人，2010)所述的那样，通过将CXCL1 220(720-940)克隆到含有CXCL1的5'UTR和编码区的pTRE2(Clontech)中而获得用于该测定的报告基因RNA构建体。按照制造商的说明，用TRIzol试剂(Invitrogen)分离总RNA，随后进行RT-PCR。将值针对稳定的β-肌动蛋白mRNA作归一化。

统计分析：在适当的情况下，通过曼-惠特尼检验(Mann–Whitney test)或学生t检验进行统计分析。

结果

IL-17在细胞核和细胞质颗粒中诱导不同的Act1-RNP。

未参与翻译的信使RNA可以聚集到称为P小体的细胞质mRNP颗粒和应激颗粒中(Anderson等人，2015；Erickson和Lykke-Andersen，2011)。IL-17刺激诱导IL-17R的关键衔接子Act1组装成显微镜下可见的细胞质颗粒并诱导核定位[图1A和(Velichko等人，2016)]。Act1与Dcp1脱帽酶(P小抗体的一种组分)共定位(图1B)；但不与TIA1(应激颗粒的标志物)共定位(图1B)。作为阴性对照，无关信号分子IRAK1(白细胞介素1相关激酶1)也与Dcp1共表达，Dcp1不能与Dcp1脱帽酶共定位。响应于IL-17刺激，通过原位邻位连接测定(PLA，其检测直接的蛋白质-蛋白质相互作用)，针对Act1-Dcp1之间的相互作用检测到强信号，表明Act1与Dcp1紧邻(图1C)。我们响应于IL-17刺激，通过免疫共沉淀进一步验证了Act1-Dcp1的相互作用(图1D)。用RNA酶预处理裂解物使检测到的Act1-Dcp1相互作用消除，这一事实表明Act1-Dcp1相互作用依赖于RNA(图1D)。这些结果暗示了IL-17-Act1轴在P小体的mRNA代谢中的可能作用。

我们检查了SF2和HuR是否在Act1-Dcp1细胞质颗粒中。有趣的是，我们发现SF2和HuR既不与Dcp1共定位，也不与Dcp1免疫共沉淀(图1E)。另一方面，通过PLA确实分别在细胞核和细胞质颗粒中检测到Act1-SF2和Act1-HuR相互作用(图1F-G)。这些结果表明，P小体内Act1与Dcp1的相互作用可能与Act1-SF2和Act1-HuR复合物无关。重要的是，与Act1-Dcp1相互作用类似，用RNA酶预处理裂解物使检测到的Act1-SF2和Act1-HuR相互作用消除，这表明Act1与SF2和HuR的相互作用也依赖于RNA(图1D)。总的来说，这些结果暗示IL-17-Act1轴通过形成包括Act1-SF2(RNP1)、Act1-Dcp1(RNP2)和Act1-HuR(RNP3)在内的不同的含Act1的RNP而在mRNA代谢中起作用。

Act1的SEFIR结构域是形成Act1-RNP所必需的

缺失分析表明，Act1的SEIFR结构域是Act1组装成颗粒并与Dcp1共定位必需和足够的(图1H)。然后，我们分析了命名为SEFIR1至SEFIR5(基于编码SEFIR结构域的区域的五个外显子：410至439、440至462、463至501、502至526和527至552)的SEFIR结构域的内部缺失突变体。SEFIR2、3或4的缺失对Act1与Dcp1的共定位没有影响。尽管Act1的SEFIR3(氨基酸463-501)是它与IL-17R相互作用所必需的(Liu等人，2011)，但ΔSEFIR3仍然定位于P小体中(图1H)。虽然ΔSEFIR5显示出与P小体的共定位减少，但ΔSEFIR1完全不能留在P小体中(图1H和补充图2)。一致地，在免疫共沉淀实验中，ΔSEFIR1也不能与Dcp1相互作用(图1I)。然而，ΔSEFIR1和ΔSEFIR5都保持了与IL-17R相互作用的能力(图2E)。然后，我们检查了Act1的SEFIR突变体形成Act1-SF2和Act1-HuR RNP的能力。虽然SEFIR1的缺失损害了与SF2的相互作用，但是ΔSEFIR1与HuR的结合也大大减少(图1I)。这些结果表明Act1的SEFIR结构域是形成Act1-RNP所必需的。

Act1通过SEFIR结构域与CXCL1 3’UTR直接结合

由于SEFIR1，以及SEFIR5(在较小程度上)是形成Act1-RNP所必需的，所以问题是这些SEFIR亚区是如何参与Act1-RNP的形成。我们使用IL-17RA-SEFIR晶体结构作为模板，通过SWISS-Model对Act1的SEFIR结构域进行建模。有趣的是，来自SEFIR1的螺旋αA和来自SEFIR5的螺旋αE紧邻地定位在形成带正电荷的表面的Act1 SEFIR结构域中(图2Aa-b)。另一方面，来自IL-17RA的相应螺旋αA和螺旋αE不定位在同一表面上，并且螺旋αE带负电荷(图2Ac-d)。介导蛋白质-RNA相互作用的蛋白质表面通常以用于与RNA中带负电荷的磷酸盐基团互补的正的静电位为特征。因此，Act1中SEFIR1+SEFIR5带正电荷的表面可能会提供与带负电荷的mRNA相互作用的界面。我们推测Act1 SEFIR可与IL-17诱导的mRNA直接结合，IL-17诱导的mRNA然后可允许被结合的mRNA的Act1靶向性稳定化和翻译。

为了测试此类可能性，我们对Act1 SEFIR和IL-17RA SEFIR进行关于CXCL1 3'UTR的RNA电泳迁移率变动测定(REMSA)，经证实CXCL1 3'UTR受IL-17-Act1-轴调控以稳定CXCL1 mRNA(Hart upee等人，2007)。将纯化的重组Act1 SEFIR(rkvfitysmdtamevvkfvnfllvngfqtaidifedrirgidiikwm erylrdktvmiivaispkykqdvegaesqldedehglhtkyihrmmqiefisqgsmnfrfipvlfpnakkeh vptwlqnthvyswpknkknillrllree；SEQID NO:95)或IL-17RA SEFIR与放射性标记的RNA探针一起孵育，该探针对应于CXCL1 3’UTR的核苷酸720-940(CXCL1 220)，含有IL-17敏感基序(Datta等人，2010)。然后在非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质-RNA复合物。我们发现Act1 SEFIR而非IL-17RA SE FIR与CXCL1探针结合，Kd＝50.2±7.8nM(图2B)。Act1 SEFIR与CXCL1 mRNA的结合具有特异性，因为即使在高Act1SEFIR浓度下，与谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)的富含GC的3'UTR相对应的R NA探针仍未被结合。虽然ΔSEFIR2、ΔSEFIR3和ΔSEFIR4保持了与RNA结合的能力，但是ΔSEFIR1和ΔSEFIR5与RNA的结合大大减少(图2C-D)，这表明SEFIR1和SEFIR5确实参与Act1与CXCL1mRNA的直接结合。SEFIR1(K407A)和SEFIR5(K524A、K526A和K527A)中带正电荷的氨基酸残基的突变大大减少了Act1 SEFIR与R NA的结合，这支持图2Ab中的所提出的Act1 SEFIR的RNA相互作用界面。ΔSEFIR1和ΔSEFIR5的RNA结合受损与它们无法进入P小体和形成RNP有关(图1H)，这与图1D中所示依赖RNA的Act1与Dcp1、SF2和HuR的相互作用一致。

Act1通过与其3'UTR直接结合而介导CXCL1、GM-CSF和TNF的mRNA稳定化

与ΔSEFIR1仍然保持其与IL-17R的相互作用这一事实一致(图2E)，ΔSEFIR1能够像野生型Act1那样介导IL-17诱导的NFkB和JNK激活(图2F)。然而，在mRNA和蛋白水平上，与野生型Act1相比，在用ΔSEFIR1转导的MEF中IL-17诱导的基因表达(包括CXCL1、GM-CSF和TNF)均显著降低(图2G)。由于Act1对于IL-17介导的促炎基因的这些原本不稳定的mRNA稳定化是必需的，因此我们检查了ΔSEFIR1在介导mRNA稳定化方面是否可能存在缺陷。我们用报告基因构建体pTRE2 CXCL1转染稳定表达四环素反式激活蛋白的HeLa细胞(HeLa Tet-Off)，该构建体含有编码CXCL1和截短3'UTR(核苷酸720-940，CXCL1 220)的区域，其赋予不稳定性和IL-17-Act1诱导的稳定化(Datta等人，2010)。CXCL1 mRNA容易被检测到，并且在添加强力霉素进行转录阻断后以30-40分钟的半衰期迅速衰减(Datta等人，2010)。虽然野生型Act1的转染使CXCL1 mRNA的半衰期延长到2-3小时，但是ΔSEFIR1和ΔSEFIR1不能像载体对照那样稳定CXCL1 mRNA(图2H)。这些结果表明，ΔSEFIR1与CXCL13’UTR的RNA结合受损与其无法稳定CXCL1 mRNA有关。

由于ΔSEFIR1也丧失了介导IL-17诱导的GM-CSF和TNF表达的能力，因此我们检查了Act1 SEFIR与其3'UTR的可能结合。Act1 SEFIR以与CXCL1 3'UTR相似的亲和力结合GM-CSF 3'UTR(核苷酸716-1010)和TNF 3'UTR(核苷酸1362-1507)，但是ΔSEFIR1未能如此(图2I)。为了评估细胞中Act1的RNA结合，我们从未经处理或用IL-17处理的MEF中免疫沉淀Act1，随后进行RT-PCR分析。与来自于IgG免疫沉淀对照的免疫沉淀物相比，在Act1免疫沉淀物中检测到富集的CXCL1、GM-CSF和TNF mRNA(图2J)，表明IL-17诱导细胞中的Act1-RNA结合。为了检查Act1-RNA结合的功能影响，我们用TNF处理用野生型Act1或ΔSEFIR1重建的Act1缺陷型MEF(持续0.5小时)，以促进炎症基因转录，随后用放线菌素D(用于阻滞转录)和IL-17(用于诱导mRNA稳定化)处理。在最初用TNF处理后，在用野生型Act1或ΔSEFIR1重建的Act1缺陷型MEF中，诱导CXCL1、GM-CSF和TNF mRNA达到相似水平。然而，与用野生型Act1重建的Act1缺陷型MEF相比，用ΔSEFIR1重建的Act1缺陷型MEF中CXCL1、GM-CSF和TNF mRNA的衰减更快(图2K)。ΔSEFIR1不能结合CXCL1、GM-CSF和TNF的3'UTR的事实(图2I)有助于解释IL-17介导的那些mRNA稳定化的丧失(图2K)，这暗示了Act1-RNA结合在mRNA稳定化中至关重要的作用。

Act1 SEFIR与CXCL1 3’UTR中的茎环结构结合

然后，我们旨在进一步限定CXCL1 3'UTR上的被Act1 SEFIR识别和结合的序列。Act1 SEFIR以相似的亲和力(3A-B)结合CXCL13'UTR的核苷酸720-940(CXCL1 220，图2A)和核苷酸780-900(CXCL1 120)。二级结构预测(RNAfold web server)表明，核苷酸780-900可能形成具有四个茎环(命名为A-D，图3B)的二级结构。通过从两个末端产生连续缺失，我们将Act1结合区缩小到核苷酸800-870(CXCL1 70，图3A-B)，其含有保留了茎环B和C的进化保守区(核苷酸810-857，CXCL1 47)(图3A)。有趣的是，Act1 SEFIR确实能够与这个保守的47个核苷酸序列(核苷酸810-857，CXCL1 47)结合，然后将该保守的序列命名为SEFIR结合元件(SBE)(图3A和3C)。通过表面等离子体共振证实了Act1与SBE的结合，表面等离子体共振揭示Kd为59.5nM。

然后，我们检查了茎环B和茎环C在SBE与Act1 SEFIR结合中的相对重要性。虽然茎环B的破坏对Act1 SEFIR的结合没有影响，但茎环C的损伤却完全阻止了Act1 SEFIR的结合(图3C)。为了测试茎环C的功能重要性，我们分别破坏了报告基因构建体pTRE2 CXCL1的CXCL1的3'UTR中的茎环B和C，该构建体含有编码CXCL1和截短3'UTR(核苷酸720-940，CXCL1220)的区域，其赋予不稳定性和IL-17-Act1诱导的稳定化(Datta等人，2010)。在用pTRE2CXCL1或茎环B突变体转染的HeLa Tet-Off细胞中，IL-17刺激能够减弱在添加强力霉素进行转录阻断后的CXCL1 mRNA衰减(图3D)。然而，IL-17刺激不能减弱用茎环C突变体转染的HeLa Tet-Off细胞中的CXCL1 mRNA衰减(图3D)。总的来说，我们的结构功能数据暗示，IL-17诱导的CXCL1 mRNA稳定化需要Act1 SEFIR与CXCL1的3'UTR中的茎环C结合。

为了直接对Act1-SEFIR结合位点作图，我们对Act1 SEFIR-SBE复合物进行了酶促RNA足迹分析。通过在不存在或存在Act1-SEFIR的情况下进行SBE RNA的部分消化来鉴定参与Act1-SBE相互作用的核苷酸。然后用不同的核糖核酸酶部分消化天然RNA和RNA:蛋白复合物，并通过电泳进行分析。天然RNA的切割结果(图3E的左图)与图3C所示的预测结构一致。在单链C和U碱基处切割的RNA酶A在U13、U22、U23、U26、U33和U41-44(在图3F中标记为黄色)处切割。在单链G碱基后面切割的RNA酶T1切割G14、G21、G24和G25(在图3F中标记为紫色)。在双链区切割的RNA酶V1在茎B和茎C中的多个位置(在图3F中标记为蓝色)处切割。几个核苷酸(U19、C31和U33)被单链和双链核酸酶切割，表明这些区域可能会呼吸。当SBE与Act1-SEFIR一起孵育时，我们观察到特定核苷酸受部分保护而免受RNA酶A(U36、U41-44)和RNA酶V1(27-29、C31、36-40)的切割(在图3E右图中框出)。偶尔观察到核苷酸19-23之间的较小保护作用，但这在实验之间并不一致。有趣的是，碱基U10-12变得更易受RNA酶A切割，这表明Act1与茎环C的结合可导致茎环B的构象变化(图3E中的括号)。

总的来说，足迹结果验证了茎环C是Act1 SEFIR的接触位点。茎环C中茎的破坏(将CCC置换为GGG)消除了Act1 SEFIR与RNA的结合，而对茎环C茎中序列的置换并未改变Act1SEFIR的结合，表明它是二级结构而不是对Act1 SEFIR的识别起关键作用的一级序列(图3G)。然而，用AGU置换茎环C的整个环TAA(不影响茎环的形成)也消除了SEFIR结合，证明了环序列对于Act1 SEFIR-RNA结合的重要性(图3G)。

针对3’UTR的Act1-RNA结合抑制脱帽

下一个问题是含Dcp1的P小体中的Act1-RNA结合如何介导IL-17诱导的促炎基因的原本不稳定的mRNA稳定化。值得注意的是，翻译和mRNA降解过程实际上是有联系的(Hu等人，2009；Mukherjee等人，2012)。翻译的起始通常涉及翻译起始因子与大多数哺乳动物mRNA上存在的5'端m7G帽的相互作用。mRNA被Dcp1/Dcp2脱帽酶脱帽，然后被外切核酸酶Xrn1从5'至3'降解(She等人，2008；Wang等人，2002)。由于免疫共沉淀和原位PLA均显示Act1与Dcp1结合，因此我们假设Act1与其驻留在P小体中的mRNA靶标特异性结合，在P小体中Act1通过与Dcp1的相互作用减弱脱帽作用。为了检验这一假设，我们检查了Act1与Dcp1的结合是否会影响Dcp1/Dcp2复合物的脱帽活性。将来自于经转染的HeLa细胞的纯化Dcp1/Dcp2和Act1与加帽的CXCL1 3’UTR(核苷酸720-940)一起孵育。Act1对Dcp1/Dcp2复合物的脱帽效率确实具有剂量依赖性抑制作用(图4Aa、4B)。ΔSEFIR1不能减弱脱帽作用，这可能是由于它无法结合CXCL1 3'UTR(图4Ab和4B)。为了证实Act1-RNA结合对于Act1抑制脱帽的重要性，我们破坏CXCL1 3’UTR(核苷酸720-940，CXCL1 220)的帽标记片段中的茎环C并且发现Act1不能再阻滞这种突变报告基因转录物脱帽(图4Ac和4B)。

Act1使TBK1磷酸化与Dcp2解离的Dcp1

经证实，脱帽活性的灭活需要Dcp1在S315处磷酸化(Aizer等人，2013；Rzeczkowski等人，2011)。使用抗p-S315抗体，我们发现IL-17处理确实诱导Dcp1在S315处磷酸化。IL-17诱导的Dcp1磷酸化在Act1缺陷型细胞中受损(图4C)。最近的研究报道了两种Act1相互作用激酶：IKKi和TBK1(Bulek等人，2011；Qu等人，2012)。因此，我们检验了这些激酶是否参与Act1介导的Dcp1调控。通过免疫沉淀，我们证实在IL-17刺激后，IKKi和TBK1均与Act1相互作用(图4D)。有趣的是，虽然IKKi和TBK1与Act1共定位，但只有TBK1表现出与Dcp1共定位。一致地，IL-17刺激诱导TBK1与Dcp1的相互作用，这种相互作用在Act1缺陷型细胞中被消除(图4C)，这表明IL-17诱导的TBK1-Dcp1相互作用依赖Act1。虽然IL-17诱导的Dcp1磷酸化(而不是p-JNK或p-p65)在TBK1缺陷型细胞中削弱，但IKKi缺陷的影响很小(图4E)。重组TBK1在体外激酶测定中能够磷酸化Dcp1，暗示TBK1可能是Dcp1的直接激酶(图4F)。一致地，TBK1过表达削弱了Dcp1和Dcp2之间的相互作用，而TBK1不能从Dcp2中去除Dcp1 S315A突变体(图4G)。有趣的是，我们观察到在TBK1抑制剂的存在下，IL-17诱导的Act1-Dcp1相互作用得到增强并且更持久，从而证实了TBK1激酶活性对Dcp1从Act1-RNP复合物的解离的影响(图4H)。基于这些发现，我们认为Act1将TBK1带到P小体内的mRNA靶标处，在P小体中TBK1磷酸化Dcp1，从而导致Dcp1从Act1-RNP的解离，mRNA的脱帽抑制和稳定化。支持这一点的是，TBK1抑制剂有效地消除了Act1介导的对CXCL1 3’UTR(核苷酸720-940，CXCL1 220)的帽标记片段的脱帽的抑制作用(图4Ad和4B)。蛋白质分析证实TBK1确实与用于脱帽测定的Act1共同纯化。一致地，我们发现TBK1缺陷确实在mRNA和蛋白质水平上显著降低了IL-17诱导的CXCL1、GM-CSF和TNF表达(图4I)。

Act1与Dcp1/Dcp2、SF2和HuR形成不同的RNP

我们在这里描述的结果定义了由Act1-TBK1-Dcp1/2组成的Act1-RNP，命名为RNP2。虽然成像研究表明SF2和HuR不与Dcp1共定位(图1F)，但我们进行了免疫沉淀实验，以仔细检查不同的Act1-RNP。通过使用来自于未经处理和经IL-17处理的表达Act1的MEF的裂解物，用抗Dcp1进行免疫共沉淀，我们证实虽然IL-17以RNA依赖性方式(对RNA酶处理敏感)诱导Dcp1-Act1-TBK1相互作用，但是在该RNP(RNP2)中未检测到SF2和HuR。IL-17诱导的Act1-SF2复合物(RNP1)也对RNA酶预处理敏感，但是在该Act1-SF2-RNP中未发现Dcp1-TBK1和HuR(补充图1B)。同样，我们未能在IL-17诱导的Act1-HuR RNP(RNP3)中检测到Dcp1-TBK1和SF2。总的来说，这些结果表明Act1-SF2、Act1-Dcp1/2和Act1-HuR代表三种独立的RNP。重要的是，SEFIR1的缺失(ΔSEFIR1)消除了所有三种RNP的形成，这暗示Act1与mRNA结合对于这些Act1-RNP的形成的重要性(补充图1A-C)。支持这一点的是，PLA成像显示SEFIR1的缺失(ΔSEFIR1)也损害了Act1-SF2相互作用(细胞核中)和Act1-HuR相互作用(胞浆中)(图5A-B)。

已经证实SF2会介导细胞因子和趋化因子mRNA的衰减。据报道，在不存在IL-17刺激的情况下，SF2结合趋化因子mRNA(由TNF诱导)(Sun等人，2011)，而在用IL-17刺激后SF2-mRNA相互作用以Act1依赖性方式大大降低(图5C)。有趣的是，我们现在发现，IL-17不能降低用ΔSEFIR1恢复的Act1缺陷型细胞中SF2与CXCL1的结合，这表明SF2与mRNA解离可能需要Act1的RNA结合(图5C)。一个重要的问题是Act1与mRNA的结合如何促进SF2与mRNA的解离。我们检查了SF2结合所必需的CXCL1序列。令人惊讶的是，我们发现SF2能够与Act1结合CXCL1的同一区域：SEFIR结合元件(SBE)；茎环C受损完全阻止了SF2的结合(图5D-E)。向RNA结合反应中添加不断增加的量的Act1会减弱SF2与SBE的结合(图5F)。值得注意的是，已经暗示SF2磷酸化是它与mRNA靶标解离的机制(Huynh等人，2009)。虽然成像和分级分离实验均表明Act1-SF2 RNP1驻留在细胞核中(图5A-B和5G)，但响应于IL-17刺激,IKKi(IL-17介导的mRNA稳定化所必需的激酶(Bulek等人，2011))易位到细胞核内并且在Act1-SF2 RNP1中被检测到(图5G)。重要的是，IKKi确实能够在体外磷酸化SF2(图5H)，将重组IKKi与SF2一起孵育降低了SF2结合CXCL1 mRNA的能力(图5I)，暗示IKKi阻止SF2与mRNA的结合。尽管在用ΔSEFIR1恢复的Act1缺陷型MEF中，IL-17诱导的IKKi-SF2和Act1-SF2相互作用被消除(图5C和图5G)，但胞浆和细胞核中的Act1-IKKi相互作用均保留在这些细胞中(图5G)。这些结果表明，IL-17在Act1和IKKi易位到细胞核中之前诱导Act1-IKKi相互作用，并且Act1与细胞核中被SF2结合的mRNA的结合使IKKi能够磷酸化SF2，从而减弱SF2与mRNA靶标的结合。

另一方面，HuR牵涉于将靶mRNA转移至多核糖体中进行蛋白质翻译，并且IL-17刺激诱导Act1-HuR向多核糖体的共转移(Herjan等人，2013；Tiedje等人，2012)。值得注意的是，IL-17诱导表达Act1的MEF中HuR与CXCL1的结合，这种结合在用ΔSEFIR1恢复的Act1缺陷型MEF中被消除，表明Act1的RNA结合可能也是HuR被募集到靶mRNA所必需的(图5C)。我们检查了HuR结合所必需的CXCL1序列，发现HuR与CXCL1 220-I(核苷酸720-830)结合，但不与CXCL1 220-II(核苷酸830-940)结合(图5D和5J)。有趣的是，我们发现HuR和Act1可以同时与CXCL1 220(核苷酸720-940)结合(图5D和5K)。从CXCL1 220去除核苷酸720-829消除了HuR结合，而Act1结合得以保留[CXCL1 220-II(核苷酸830-940)]，表明HuR和Act1在CXCL1上具有它们独立的结合序列(图5D和5K)。这些结果表明，除了阻滞RNP2(Act1-TBK1-Dcp1/2)中的脱帽，Act1-RNA结合还通过形成RNP1(Act1-SF2)和RNP3(Act1-HuR)而具有另外的功能。由于HuR不是RNP1(Act1-SF2)的一部分(图5A-C)，因此Act1在将SF2从靶mRNA竞争掉之后，可促进体内HuR与CXCL1的结合。支持这一点的是，在用ΔSEFIR1恢复的Act1缺陷型MEF中，IL-17诱导的Act1-HuR向多核糖体的共转移被消除(Herjan等人，2013)(图5L-M)。一致地，在用ΔSEFIR1恢复的Act1缺陷型MEF中，有翻译活性多核糖体中的CXCL1 mRNA与无活性级分中的CXCL1 mRNA的比率显著降低(图5M-N)。基于这些结果，我们提出了下面的针对Act1-RNA结合作用的模型(图5O)：首先，IL-17诱导Act1与细胞核(RNP1)中的mRNA(如CXCL1)结合，从而通过将SF2与mRNA的结合竞争掉来阻止SF2-介导的mRNA衰减，这受到IKKi介导的SF2磷酸化进一步促进。其次，Act1跟随mRNA到达P小体(RNP2)，从而通过采用TBK1来磷酸化Dcp1而抑制Dcp1/2介导的mRNA脱帽。最后，通过促进HuR与mRNA(RNP3)结合使Act1-mRNA转移到多核糖体上进行蛋白质翻译。

SBE RNA适体消除了IL-17诱导的CXCL1、GM-CSF和TNF的mRNA稳定化

我们的结果表明，Act1与炎症基因的3'UTR直接结合，形成Act1-RNP以抑制mRNA衰减并促进蛋白质翻译。基于这些发现，我们假设对应于SBE(SEFIR结合元件)的RNA寡核苷酸可能会抑制Act1在限定的RNP和炎症基因表达中的作用。有趣的是，在茎环B中有突变或无突变的SBE RNA适体确实都能够将Act1 SEFIR与CXCL1 3’UTR的结合竞争掉(图6A)。另一方面，具有突变茎环C的SBE RNA适体不能将Act1 SEFIR与CXCL1 3’UTR的结合竞争掉(图6A)。为了测试SBE RNA适体在细胞培养物和体内模型中的抑制作用，我们制取了经荧光标记且部分修饰的SBE RNA适体，其中前三个5'和三个3'核苷酸被甲基化(2'-OH)。我们将荧光SBERNA适体与SF2-HA或Act1-RFP一起共转染到HeLa细胞中。转染的荧光SBE RNA适体主要驻留在细胞质中，并在Act1颗粒中被检测到(图6B)。有趣的是，我们观察到在用SBE RNA适体转染的细胞中，Act1颗粒随时间推移而显著减少，暗示该SBE RNA适体可能正破坏Act1与P小体的共定位(图6B)。我们确实发现SBE RNA适体，而不是具有突变茎环C的SBE适体，消除了Act1颗粒的形成以及Act1与Dcp1的共定位(图6C)。这些结果表明，SBE RNA适体介导的Act1的RNA结合活性抑制还可影响除CXCL1外的其它转录物。支持这一点的是，SBE RNA适体还能够将Act1 SEFIR与GM-CSF和TNF的3'UTR的结合竞争掉(图6D和补充图6B),表明SBE RNA适体与Act1 SEFIR的结合会阻滞Act1与mRNA靶标的结合。这些结果表明，SBE RNA适体具有成为阻滞IL-17诱导的炎症反应的抑制剂的潜力。我们确实发现SBE RNA适体的转染减少了IL-17介导的mRNA稳定化以及CXCL1、GM-CSF和TNF的产生(图6E-F)。

SBE RNA适体抑制IL-17依赖性皮肤增生

苏金单抗(抗IL-17A)对银屑病显示出巨大功效，并已获得FDA批准用于治疗银屑病。异常的角质形成细胞增殖和嗜中性粒细胞炎症是银屑病发病机制的公知标志。为了检查SBE RNA适体对IL-17A诱导的表皮增殖和炎症的影响，向WT C57BL/6雌性小鼠的耳部皮内注射IL-17A与SBE RNA适体或SBE突变体适体(突变茎环C作为阴性对照)连续6天。我们发现，SBE RNA适体大幅减少耳部IL-17A依赖性的表皮增生和嗜中性粒细胞浸润，而突变体适体未能如此(图7A-C)。同样，SBE RNA适体大大削弱了耳部IL-17A诱导的cxcl1、gm-csf和tnf表达，而突变体适体未能如此(图7D)。总的来说，这些数据表明IL-17A诱导角质形成细胞增殖和嗜中性粒细胞浸润，从而导致表皮增生，这受到SBE RNA适体有效地阻滞。

SEFIR结构域，是存在于IL-17受体亚基和衔接子Act1的胞质区中的保守性基序，能介导Act1在IL-17刺激后被募集至受体。在这里，我们意外地鉴定出Act1的SEFIR是直接的RNA结合结构域，其致使Act1 RNA结合活性响应于IL-17刺激稳定促炎基因(CXCL1、TNF和GM-CSF)的原本不稳定的mRNA。我们发现Act1与炎症mRNA的3'-UTR直接结合，从而在几个亚细胞区室(包括控制mRNA代谢的P小体)中形成不同的RNP。结构功能分析显示，Act1 SEFIR与CXCL1 3’UTR中的茎环结构(命名为SBE)结合。含有SBE的RNA适体消除了Act1与靶mRNA的结合，并减弱了IL-17介导的mRNA稳定化。我们发现SBE RNA适体抑制IL-17诱导的皮肤炎症，说明了Act1的RNA结合活性的生理相关性。虽然本发明不限于任何特定机制，并且对机制的了解不是实践本发明所必需的，但是据信，该研究证明受体近端衔接子Act1与mRNA直接结合以控制RNA代谢的步骤，这通过选定炎症基因的受体特异性mRNA稳定化提供了新型的炎症反应分子机制。而且，Act1非规范功能的发现将允许开发针对自身免疫性炎性疾病的新治疗策略。

除了炎症基因的mRNA外，半衰期短也允许动态调节其表达也需要被快速地开启和关闭的多种转录物，包括转录因子、信号传导组分和细胞周期蛋白(Schoenberg和Maquat，2012)。这些不稳定的mRNA在其3'UTR中具有去稳定化序列(包括富含AU的元件和茎环)，这些序列被RNA结合蛋白(ARE和SL结合蛋白)识别，以通过脱腺苷化、脱帽和核酸外切降解介导mRNA降解(Mino等人，2015；Schoenberg和Maquat，2012；Stumpo等人，2010)。虽然发现了多种mRNA去稳定化机制，但尚不清楚半衰期较短的不同类别的mRNA是如何在细胞环境中以刺激特异性方式稳定的。尽管ARE结合蛋白SF2和HuR先前牵涉于IL-17诱导的mRNA稳定化，但它们无法解释选定炎症基因的受体特异性mRNA稳定化(Brennan和Steitz，2001；Herjan等人，2013)。值得注意的是，HuR具有广泛的mRNA靶标，包括转录因子、信号传导组分和细胞周期蛋白，而IL-17刺激不会稳定所有的HuR mRNA靶标(Mitchell和Parker，2014；Schoenberg和Maquat，2012；Mukherjee等人，2011)。同样，SF2也牵涉于RNA代谢的各个方面，包括RNA剪接、mRNA输出和无义介导的衰减(Cao等人，1997；Krainer等人，1990；Lemaire等人，2002；Reed和Cheng，2005；Sun等人，2011；Zhong等人，2009)。因此，Act1是直接的RNA结合蛋白的发现是我们了解短半衰期mRNA如何通过受体介导的直接机制以刺激特异性方式稳定的概念性进展。

在真核生物中，mRNA衰减途径是由通过CCR4-CAF1-NOT脱腺苷酶复合物进行的脱腺苷化引发的(Chen和Shyu，2011)。外切核酸酶复合物(外来体)可在脱腺苷化后沿3'-5'方向降解mRNA；并且Dcp1/Dcp2脱帽酶使mRNA遭受使用外切核酸酶Xrn1进行的从5'末端的降解，同时关闭翻译起始(Arribas-Layton等人，2013；Franks和Lykke-Andersen，2008；Schoenberg和Maquat，2012)。先前的研究显示，靶向脱帽的mRNA涉及翻译受抑的mRNP的形成，该mRNP可靶向P小体和应激颗粒(Anderson等人，2015；Arribas-Layton等人，2013；Franks和Lykke-Andersen，2008)。在这里我们发现，含有Act1的RNP中的一种定位于P小体中(RNP2，而不是定位于应激颗粒中)，并且Act1能够通过使激酶TBK1磷酸化Dcp1并破坏Dcp1/Dcp2复合物来抑制Dcp1/Dcp2复合物的脱帽活性。因此，被Act1结合的mRNA(包括CXCL1、TNF和GM-CSF)得以稳定和翻译。我们的发现与以下概念一致：翻译和mRNA衰减相互竞争并且翻译和mRNA降解过程是有联系的。因此，我们认为Act1-RNP介导的脱帽抑制释放截留在P小体中的mRNA，以恢复翻译。支持Act1在将mRNA稳定化与蛋白质翻译联系起来的潜在作用，先前有报道称IL-17刺激诱导Act1-HuR向多核糖体共转移(Herjan等人，2013)。重要的是，现在我们发现用RNA酶预处理裂解物使检测到的Act1-HuR相互作用被消除，这表明Act1与HuR的相互作用也依赖于RNA。一致地，我们发现HuR和Act1可以同时与CXCL1结合；并且IL-17诱导的HuR与CXCL1的结合在用ΔSEFIR1恢复的Act1缺陷型细胞中被消除。这些结果表明，HuR募集到靶mRNA需要Act1的RNA结合。基于这些发现，我们认为通过促进HuR与mRNA结合(RNP3)使被Act1结合的mRNA转移到多核糖体上进行蛋白质翻译。支持这一点的是，我们确实发现在用ΔSEFIR1恢复的Act1缺陷型细胞中，IL-17刺激诱导的Act1-HuR向多核糖体的共转移被消除。

尽管细胞质mRNA衰减似乎是真核生物中mRNA周转的主要途径，但最近的研究暗示细胞核中的mRNA稳定性受到调控。据估计，真核生物中只有一小部分(约30％)的转录物被加工成mRNA并输出到细胞质中(Jackson等人，2000)。虽然异常的RNA加工有助于将核转录物截留在细胞核中，但是已在细胞核中发现了3'至5'和5'至3'外切核糖核酸(Brannan等人，2012；Bresson等人，2017；Gudipati等人，2012)。因此，可以想像，为了大量生产和翻译mRNA，需要积极干预以阻止核转录物降解。支持这一点的是，虽然已经证实SF2会介导mRNA衰减，但我们发现Act1在细胞核中与SF2形成RNP(RNP1)。IL-17刺激诱导SF2从mRNA靶标解离，这在用ΔSEFIR1恢复的Act1缺陷型细胞中被消除，表明Act1的RNA结合是阻止SF2依赖性mRNA衰减所必需的。有趣的是，我们发现SF2能够与Act1结合相同的CXCL1区域。向RNA结合反应中添加不断增加的量的Act1能减弱SF2与靶mRNA的结合，表明这两种蛋白直接竞争着与相同的靶mRNA结合。另外，已经暗示SF2磷酸化是它与mRNA靶标解离的机制(Cao等人，1997；Xiao和Manley，1997)。支持这一点的是，我们发现IL-17诱导Act1-IKKi的核易位并且Act1与细胞核中被SF2结合的mRNA的结合使IKKi能够磷酸化SF2，从而阻止SF2与mRNA靶标的结合。然而，SF2如何介导mRNA衰减尚不清楚。SF2介导的mRNA衰减可能是通过外切核酸酶的主动募集来实现的。可替代地，被SF2结合的mRNA可仅仅被截留在细胞核中并随时间降解。在任何情况下，在IKKi的帮助下，Act1与mRNA的结合均会驱散SF2，从而导致mRNA稳定化。

总的来说，虽然本发明不限于任何特定机制，但我们为IL-17诱导的炎症反应提出了下面的针对Act1-RNA结合作用的模型。在IL-17刺激后，多个信号传导途径(包括NFkB和MAPKs)被激活，以诱导细胞因子和趋化因子的基因转录。然后，Act1直接结合细胞因子和趋化因子的mRNA从而稳定这些原本不稳定的mRNA以产生促炎介质。Act1与炎症基因mRNA的结合导致形成多种控制mRNA代谢的不同步骤的RNP。首先，Act1与细胞核中的mRNA结合(RNP1)，从而通过将SF2与mRNA的结合竞争掉而抑制SF2介导的mRNA降解，这受到IKKi介导的SF2磷酸化进一步促进。细胞核中Act1-RNP1的可能作用之一是保护新生核转录物的降解和/或截留。第二，Act1在P小体中形成RNP(RNP2)，从而通过募集TBK1来磷酸化Dcp1而阻滞Dcp1/2介导的mRNA脱帽。Act1-RNP2可代表如何解决mRNA翻译与降解之间的竞争的作用。最后，Act1-mRNA与HuR共转移到多核糖体(RNP3)中进行蛋白质翻译。总的来说，这里的研究提供了与受体相互作用的衔接子分子Act1的第一实例，Act1在mRNA代谢中起直接作用，协调了受体介导的mRNA稳定化和翻译的选择性。另外，令人兴奋地发现SBE RNA适体能够破坏Act1与P小体的共定位。

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说明书中提及的和/或下面列出的所有出版物和专利均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所描述的方法和系统的各种修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的。尽管已结合具体实施方案对本发明进行了描述，但是应当理解所要求保护的本发明不应当不适当地限于此类具体实施方案。事实上，对于相关领域的技术人员明显的，对描述的用于实施本发明的模式的各种修改旨在属于本文所述的范围之内。

序列表

<110> 克里夫兰诊所基金会(THE CLEVELAND CLINIC FOUNDATION)

<120> 用于治疗IL-17a相关疾病和病状的SBE适体

<130> CCF-34963/WO-2/ORD

<150> US 62/535,559

<151> 2017-07-21

<160> 129

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(4)

<223> n为a、c、g、t或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n为a、c、g、t或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n为a、c、g、t或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(17)

<223> n为a、c、g、t或u

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<220>

<223> 合成

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<222> (1)..(1)

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<223> 合成

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<211> 31

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ggaaggatcc ctctgtcccg agcgagacga g 31

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<220>

<223> 合成

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<211> 29

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<220>

<223> 合成

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<210> 13

<211> 29

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<220>

<223> 合成

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ggaaggatcc gaccaggaga aacagggtt 29

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<211> 34

<212> DNA

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<220>

<223> 合成

<400> 14

ggaaggatcc acagggttaa agaatgtaaa aggg 34

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 15

ggaagaattc ccttggacat tttgtgtc 28

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<211> 29

<212> DNA

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<220>

<223> 合成

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<210> 17

<211> 23

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<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 17

ctggtatctg ggcttggtga tgg 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

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ctggtatctg ggcttggtga tgg 23

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<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

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ggaaggatcc tgtaaaaggg cattatgcc 29

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 20

ggaaggatcc gcttatgttt aaaacaaaat at 32

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 21

ggaagaattc gaccggccag atgaggctgg cc 32

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

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ggaaggatcc cttgaataaa tatggaatat g 31

<210> 23

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

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ggaagctagc atgcctcctc agcttcaag 29

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

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ggaagtcgac tgcaagggaa ccacctgaag 30

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 25

ggaagaattc atggaggcgc tgagtcgagc 30

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<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

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ggaagtcgac tgtaggttgt ggttgtcttt gttc 34

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

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<223> 合成

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ggaagctagc atgcagagca cagccaatta c 31

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<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 28

ggaagtcgac tggacatcag gaggtgctgg g 31

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<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

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ggaaggtacc atgcagagca cttctaatc 29

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 30

ggaagtcgac tgaagacagt caacgttgcg 30

<210> 31

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

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ggaagctagc atggaggacg agatgccc 28

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

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ggaagtcgac tgctgggttt cataccctgc cac 33

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

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ggaagctagc atgcctcctc agcttcaag 29

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 34

ggaagtcgac tgcaagggaa ccacctgaag 30

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<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 35

ggaagctagc atggccgggg ggccgggccc g 31

<210> 36

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 36

ggaagtcgac tggctctgaa attcatcact ttc 33

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 37

ggaactcgag atggaggcgc tgagtcgagc 30

<210> 38

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 38

ggaagtcgac tgtaggttgt ggttgtcttt gttc 34

<210> 39

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 39

ggaagctagc gccaccatgg attacaagga tgacgatgac aagatggagg cgctgagtcg 60

agc 63

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

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ggaagaattc tcataggttg tggttgtc 28

<210> 41

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 41

ggaagctagc gccaccatgg attacaagga tgacgatgac aagatggagg cgctgagtcg 60

agc 63

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<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 42

ggaagaattc tcataggttg tggttgtc 28

<210> 43

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 43

ggaagctagc gccaccatgg attacaagga tgacgatgac aagatggaga ccaaacgggt 60

ggag 64

<210> 44

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

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ggaaggatcc tcaaaggtcc aagattttc 29

<210> 45

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 45

ggaagctagc gccaccatgg attacaagga tgacgatgac aagatggccg gggggccggg 60

cccg 64

<210> 46

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 46

ggaagaattc tcagctctga aattcatcac t 31

<210> 47

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 47

ggaagctagc atgcctcctc agcttcaag 29

<210> 48

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 48

ggaagaattc tcacaaggga accacctgaa g 31

<210> 49

<211> 220

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 49

cuguguuugu augucuugaa aagaauguca guuauuuauu gaaagucguc uuucauauug 60

uauggucaac acgcacgugu ugacgcuucc cuuggacauu uugugucuag uugguagggc 120

auaaugcccu uuuacauucu uuaacccugu uucuccuggu cucgucucgc ucgggacaga 180

gacguucaaa ggacuguuac aaaugaagua aaaauaaaag 220

<210> 50

<211> 234

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 50

guauggucaa cacgcacgug uugacgcuuc ccuuggacau uuugugucua guugguaggg 60

cauaaugccc uuuuacauuc uuuaacccug uuucuccugg ucucgucucg cucgggacag 120

agguaugguc aacacgcacg uguugacgcu ucccuuggac auuuuguguc uaguugguag 180

ggcauaaugc ccuuuuacau ucuuuaaccc uguuucuccu ggucucgucu cgcu 234

<210> 51

<211> 112

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 51

guauggucaa cacgcacgug uugacgcuuc ccuuggacau uuugugucua guugguaggg 60

cauaaugccc uuuuacauuc uuuaacccug uuucuccugg ucucgucucg cu 112

<210> 52

<211> 82

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 52

uugacgcuuc ccuuggacau uuugugucua guugguaggg cauaaugccc uuuuacauuc 60

uuuaacccug uuucuccugg uc 82

<210> 53

<211> 82

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 53

uugacgcuuc ccuuggacau uuugugucua guugguaggg cauaaugccc uuuuacauuc 60

uuuaacccug uuucuccugg uc 82

<210> 54

<211> 47

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 54

ccuuggacau uuugugucua guugguaggg cauaaugccc uuuuaca 47

<210> 55

<211> 47

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 55

ccuuggacau uuugugucua guugguaggg cauaaugccc uuuuaca 47

<210> 56

<211> 47

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 56

ccuuggacau uuugugucua guugguaaaa cauaaugccc uuuuaca 47

<210> 57

<211> 47

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 57

ccuuggacau uuugugucua guugguaggg caaguugccc uuuuaca 47

<210> 58

<211> 47

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 58

ccuuggacau uuugugucua guugguaccc cauaaugggg uuuuaca 47

<210> 59

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 59

uugacgcuuc ccuuggacau uuugugucua guuggu 36

<210> 60

<211> 26

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 60

guugguaggg cauaaugccc uuuuac 26

<210> 61

<211> 220

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 61

cuguguuugu augucuugaa aagaauguca guuauuuauu gaaagucguc uuucauauug 60

uauggucaac acgcacgugu ugacgcuucc cuuggacauu uugugucuag uugguagggc 120

auaaugcccu uuuacauucu uuaacccugu uucuccuggu cucgucucgc ucgggacaga 180

gacguucaaa ggacuguuac aaaugaagua aaaauaaaag 220

<210> 62

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 62

ctggccacag gggcgcctat c 21

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 63

ggacaccttt tagcatcttt 20

<210> 64

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 64

ggccttggaa gcatgtagag g 21

<210> 65

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 65

ggagaactcg ttagagacga ctt 23

<210> 66

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 66

catcttctca aaattcgagt gacaa 25

<210> 67

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 67

tgggagtaga caaggtacaa ccc 23

<210> 68

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 68

gccttccgtg ttcctaccc 19

<210> 69

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 69

tgcctgcttc accaccttc 19

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 70

ggtcatcact attggcaacg 20

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 71

acggatgtca acgtcacact 20

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 72

aaccgaagtc atagccacac 20

<210> 73

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 73

gttggatttg tcactgttca gc 22

<210> 74

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 74

cactgctgct gagatgaatg aaa 23

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 75

gtctgtaggc aggtcggctc 20

<210> 76

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 76

tcagcaagga cagcagag 18

<210> 77

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 77

gtatgtgaga ggaagagaac c 21

<210> 78

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 78

gtcggtatgg gtcagaaag 19

<210> 79

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 79

ctcgttgtag aaggtgtgg 19

<210> 80

<211> 46

<212> RNA

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 80

ccuuggacau uuugugucua guugguaggg cauaaugccc uuuuac 46

<210> 81

<211> 72

<212> DNA

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 81

ttgacgcttc ccttggacat tttgtgtcta gttggtaggg cataatgccc ttttacattc 60

tttaaccctg tt 72

<210> 82

<211> 69

<212> DNA

<213> 挪威大鼠(Rat norvegicus)

<400> 82

ttgaagcttc ccttggacat tttatgtcta gtttgtaggg cacaatgcct tttatattct 60

ttaaccaat 69

<210> 83

<211> 75

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 83

tctaaatatc ccttggacat tttatgtctt tcttgtaagg catactgcct tgtttaatgg 60

tagttttaca gtgtt 75

<210> 84

<211> 75

<212> DNA

<213> 黑猩猩(Pan troglodytes)

<400> 84

tctaaatatc ccttggacat cttatgtctt tcttgtaagg catactgcct tgtttaatgg 60

tagttttaca gtgtt 75

<210> 85

<211> 73

<212> DNA

<213> 金黄地鼠(Mesocricetus auratus)

<400> 85

ttgaagtttc ccttggacat tttatgtcta ctttgtaggg catagtgccc tgttatattc 60

tttaaccaat gtt 73

<210> 86

<211> 75

<212> DNA

<213> 家马(Equus ferus caballus)

<400> 86

tctaaatatc ccttggacat tttatgtctt ccttgtaagg cataatgcct tgtttagcgt 60

taattatgca gtatt 75

<210> 87

<211> 75

<212> DNA

<213> 豚鼠(Cavia porcellus)

<400> 87

tctaattatc ccttggacat tttatgtctt ctttgtaagg cacaatgcct tgtttagcca 60

taactgtgac ctgtt 75

<210> 88

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 88

guugguaggg cauaaugccc uuuu 24

<210> 89

<211> 47

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 89

ccuuggacau uuugugucua guugguaggg cauaaugccc uuuuaca 47

<210> 90

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 90

uuugugucua guugguaccc cauaaugggg uuuuacauuc uuua 44

<210> 91

<211> 37

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 91

uuuucucucu aguugguaag gcauaaugcc auuuuac 37

<210> 92

<211> 37

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 92

uugccuccuc uuuuuuaugc uuaaagcaaa auauuua 37

<210> 93

<211> 48

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 93

uuuauugaua auuuauauaa auaaccuuaa agguaaaaua ugauugau 48

<210> 94

<211> 47

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 94

ccuuggacau uuuguauaua guugguaggg cauaaugccc uuuuaca 47

<210> 95

<211> 147

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 95

Arg Lys Val Phe Ile Thr Tyr Ser Met Asp Thr Ala Met Glu Val Val

1 5 10 15

Lys Phe Val Asn Phe Leu Leu Val Asn Gly Phe Gln Thr Ala Ile Asp

20 25 30

Ile Phe Glu Asp Arg Ile Arg Gly Ile Asp Ile Ile Lys Trp Met Glu

35 40 45

Arg Tyr Leu Arg Asp Lys Thr Val Met Ile Ile Val Ala Ile Ser Pro

50 55 60

Lys Tyr Lys Gln Asp Val Glu Gly Ala Glu Ser Gln Leu Asp Glu Asp

65 70 75 80

Glu His Gly Leu His Thr Lys Tyr Ile His Arg Met Met Gln Ile Glu

85 90 95

Phe Ile Ser Gln Gly Ser Met Asn Phe Arg Phe Ile Pro Val Leu Phe

100 105 110

Pro Asn Ala Lys Lys Glu His Val Pro Thr Trp Leu Gln Asn Thr His

115 120 125

Val Tyr Ser Trp Pro Lys Asn Lys Lys Asn Ile Leu Leu Arg Leu Leu

130 135 140

Arg Glu Glu

145

<210> 96

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 96

cttttgctta tgtttaaaac aaaat 25

<210> 97

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 97

agtaaacttt aagttaattt aug 23

<210> 98

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 98

ctgaccctga tacaggcatg gca 23

<210> 99

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 99

gauaauuuaa auaaguaaac uuuaaguuaa uuuaugauug 40

<210> 100

<211> 35

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 100

aucgccgcuu uugauaauca acugggcuga acacu 35

<210> 101

<211> 50

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 101

gacccugaua caggcauggc agaagaaugg gaauauuuua uacugacaga 50

<210> 102

<211> 47

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 102

ucucuaccuu guugccuccu cuuuugcuua uguuuaaaac aaaauau 47

<210> 103

<211> 11

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(7)

<223> N = A或U

<400> 103

aagannnucu u 11

<210> 104

<211> 152

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 104

ggaagagaac accucuuuau ggcuuacccu cuagaauuuc uaauuuaugu guucuguuga 60

aauuuuuguu uuuuuaccuu uauugaaaca acaaaaaguc aguauugaaa cauaucuucc 120

uguuuucugu ugucaaauga ugauaaugug cc 152

<210> 105

<211> 316

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 105

gagcuguacc cagagagucc ugugcugaau guggacucaa ucccuagggc uggcagaaag 60

ggaacagaaa gguuuuugag uacggcuaua gccuggacuu uccuguuguc uacaccaaug 120

cccaacugcc ugccuuaggg uagugcuaag aggaucuccu guccaucagc caggacaguc 180

agcucucucc uuucagggcc aauccccagc ccuuuuguug agccaggccu cucucaccuc 240

uccuacucac uuaaagcccg ccugacagaa accacggcca cauuugguuc uaagaaaccc 300

ucugucauuc gcuccc 316

<210> 106

<211> 257

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 106

cccucuguca uucgcuccca cauucugaug agcaaccgcu ucccuauuua uuuauuuauu 60

uguuuguuug uuuuauucau uggucuaauu uauucaaagg gggcaagaag uagcaguguc 120

uguaaaagag ccuaguuuuu aauagcuaug gaaucaauuc aauuuggacu ggugugcucu 180

cuuuaaauca aguccuuuaa uuaagacuga aaauauauaa gcucagauua uuuaaauggg 240

aauauuuaua aaugagc 257

<210> 107

<211> 105

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 107

cauguauuug uuugcauagg ugaucucauu uaauccucuc aaccaccuuu cagauaacug 60

uuauuuauaa ucacuuuuuu ccacauaagg aaacuggguu ccugc 105

<210> 108

<211> 222

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 108

cacagaggca aaaggagaaa aucauguuga aacaaaccga aaauggacau ugagauacua 60

ucauuaacau uaggaccuua gaauuuuggg uauuguaauc ugaaguaugg uauuacaaaa 120

caaacaaaca aacaaaaaac ccauguguua aaauacucag ugcuaaacau ggcuuaaucu 180

uauuuuaucu ucuuuccuca auauaggagg gaagauuuuu cc 222

<210> 109

<211> 143

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 109

ggaacuuaaa uaaugugaaa cuggauuaaa cuuaaucuaa auggaaccac ucuaucaagu 60

auuauaccuu uuuuagaguu gauacuacag uuuguuagua ugaggcauuu guuugaacug 120

auaaagauga gugagcaugc ccc 143

<210> 110

<211> 267

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 110

caccugcagu guguauugag ucugcuggac uccaggaccu agacagagcu cucuaaaucu 60

gauccaggga ucuuagcuaa cggaaacaac uccuuggaaa accucguuug uaccucucuc 120

cgaaauauuu auuaccucug auaccucagu ucccauucua uuuauucacu gagcuucucu 180

gugaacuauu uagaaagaag cccaauauua uaauuuuaca guauuuauua uuuuuaaccu 240

guguuuaagc uguuuccauu ggggaca 267

<210> 111

<211> 231

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 111

cucuuugacc aauuaauuau ucuuucugac uaauuagcca agacugugau ugcgggguug 60

uaucuggggg ugggggacag ccaagcggcu gacugaacuc agauuguagc uuguaccuuu 120

acuucacuga ccaauaagaa acauucagag cugcagugac cccgggaggu gcugcugaug 180

ggaggagaug ucuacacucc gggccagcgc uuuaacagca ggccagacag c 231

<210> 112

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> n为a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(36)

<223> n为a、c、g或u

<400> 112

nnnnnnnnnn nnagauaaua ucunnnnnnn nnnnnn 36

<210> 113

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> n为a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(36)

<223> n为a、c、g或u

<400> 113

nnnnnnnnnn nncgauaaua ucgnnnnnnn nnnnnn 36

<210> 114

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> n为a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(36)

<223> n为a、c、g或u

<400> 114

nnnnnnnnnn nnagcuaaug ucunnnnnnn nnnnnn 36

<210> 115

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> n为a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(36)

<223> n为a、c、g或u

<400> 115

nnnnnnnnnn nncgcuaaua gcgnnnnnnn nnnnnn 36

<210> 116

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> n为a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(36)

<223> n为a、c、g或u

<400> 116

nnnnnnnnnn nnugauaaua ucannnnnnn nnnnnn 36

<210> 117

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> n为a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(36)

<223> n为a、c、g或u

<400> 117

nnnnnnnnnn nnuguuaaua acannnnnnn nnnnnn 36

<210> 118

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> n为a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(36)

<223> n为a、c、g或u

<400> 118

nnnnnnnnnn nnggauaaua uccnnnnnnn nnnnnn 36

<210> 119

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> n为a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(36)

<223> n为a、c、g或u

<400> 119

nnnnnnnnnn nnagguaaua ccunnnnnnn nnnnnn 36

<210> 120

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> n为a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(36)

<223> n为a、c、g或u

<400> 120

nnnnnnnnnn nnggguaaua cccnnnnnnn nnnnnn 36

<210> 121

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> n为a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(36)

<223> n为a、c、g或u

<400> 121

nnnnnnnnnn nnaguuaaua acunnnnnnn nnnnnn 36

<210> 122

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(11)

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<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(31)

<223> n为a、c、g或u

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nnnnnnnnnn naagaaaauc uunnnnnnnn n 31

<210> 123

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(11)

<223> n为a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(31)

<223> n为a、c、g或u

<400> 123

nnnnnnnnnn naagaauauc uunnnnnnnn n 31

<210> 124

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(11)

<223> n为a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(31)

<223> n为a、c、g或u

<400> 124

nnnnnnnnnn naagaaauuc uunnnnnnnn n 31

<210> 125

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(11)

<223> n为a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(31)

<223> n为a、c、g或u

<400> 125

nnnnnnnnnn naagaauuuc uunnnnnnnn n 31

<210> 126

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(11)

<223> n为a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(31)

<223> n为a、c、g或u

<400> 126

nnnnnnnnnn naagauaauc uunnnnnnnn n 31

<210> 127

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(11)

<223> n为a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(31)

<223> n为a、c、g或u

<400> 127

nnnnnnnnnn naagauauuc uunnnnnnnn n 31

<210> 128

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(11)

<223> n为a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(31)

<223> n为a、c、g或u

<400> 128

nnnnnnnnnn naagauuauc uunnnnnnnn n 31

<210> 129

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(11)

<223> n为a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(31)

<223> n为a、c、g或u

<400> 129

nnnnnnnnnn naagauuuuc uunnnnnnnn n 31

Claims (20)

1.一种治疗IL-17a相关疾病或病状的方法，其包括：

用组合物治疗患有IL-17a相关疾病或病状的受试者，其中所述组合物包含第一核酸序列，其中所述第一核酸序列包含结合ACT1蛋白的SEFIR结构域的SBE核酸序列。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述SBE核酸序列的至少一部分来自于选自CXCL1、GM-CSF和TNF的基因。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述SBE核酸序列包含SEQ ID NO:1-2、49-61、88-94和99-129中所示的序列。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述SBE核酸序列包含RNA碱基。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述SBE核酸序列包含DNA碱基。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述治疗减轻或消除了与所述IL-17a相关疾病或病状相关的至少一种症状。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述IL-17a相关疾病选自由以下组成的组：银屑病、慢性斑块、哮喘、自身免疫性疾病、炎性病状、类风湿性关节炎和多发性硬化症。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述SBE核酸序列包含以下，由或基本上由以下组成：所述CXCL1基因的核苷酸810-857，ii)所述CXCL1基因的核苷酸830-856，或iii)所述CXCL1基因的核苷酸800-835。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者为人。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述SBE核酸序列来自于人基因。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述ACT1蛋白为人ACT1蛋白。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述第一核酸序列的长度介于12与70个核苷酸之间。

13.一种包含第一核酸序列的组合物，其中所述第一核酸序列包含结合ACT1蛋白的SEFIR结构域的SBE核酸序列，并且其中所述第一核酸序列包含经修饰的碱基以提高体内稳定性。

14.如权利要求13所述的组合物，其中所述SBE核酸序列来自于选自CXCL1、GM-CSF和TNF的基因。

15.如权利要求13所述的组合物，其中所述第一核酸序列不超过70个碱基，并且至少包含：i)所述CXCL1基因的核苷酸830-856，或ii)所述CXCL1基因的核苷酸810-857。

16.如权利要求13所述的组合物，其中所述第一核酸序列由RNA碱基组成。

17.如权利要求13所述的组合物，其中所述第一核酸以当被施用给患有IL-17a相关疾病或病状的受试者时具有治疗作用的水平存在于所述组合物中。

18.一种包含第一核酸序列的组合物，其中所述第一核酸序列包含结合ACT1蛋白的SEFIR结构域的SBE核酸序列，并且其中所述SBE核酸序列包含SEQ ID NO:1、2或103中所示的，但不是天然存在的序列。

19.如权利要求18所述的组合物，其中所述第一核酸序列包含经修饰的碱基以提高体内稳定性。

20.如权利要求18所述的组合物，其中所述第一核酸序列以当被施用给患有IL-17a相关疾病或病状的受试者时具有治疗作用的水平存在于所述组合物中。

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