KR102560134B1 - 세포투과성 Regnase-1 재조합 단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포투과성 Regnase-1 재조합 단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 Regnase-1을 구성하는 도메인으로 재조합된 단백질 중 AP-NTD-PIN 재조합 단백질이 처리된 세포군에서는 LPS에 의해 유도되는 IL-6, IL-12 및 RANTES를 현저하게 감시킨 반면, AP-PIN 또는 AP-PIN-ZF 재조합 단백질이 처리된 세포군에서는 LPS에 의해 유도된 IL-6, IL-12 및 RANTES의 발현이 억제되지 않은 것으로 확인됨에 따라, Regnase-1의 NTD-PIN 도메인을 포함하는 재조합 단백질은 항염증용 조성물로 제공될 수 있다.
Description
본 발명은 세포투과성 Regnase-1 재조합 단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 단백질, DNA와 같은 고분자로 된 생물학적 활성 물질은 친수성 및 소수성의 인지질 이중층을 통과할 수 없기 때문에 세포막을 투과해 세포 내로 들어갈 수 없다. 하지만 수용체와 같은 다른 분자의 도움 없이 세포막을 가로지를 수 있는 세포투과성 펩티드(Cell penetrating peptide)가 알려져 있다.
세포투과성 펩티드 (Cell Permeable Peptide)는 일종의 신호 펩티드 (Signal Peptide)로서 단백질, DNA, RNA 등과 같은 고분자 물질을 세포내로 전달하고자 하는 목적으로 사용되는 일종의 특정 아미노산 서열의 조합인 펩티드이다. 주로 약 7 내지 30여개 정도의 아미노산 서열로 이루어지며, 수송대상체에 결합된 형태 또는 혼합된 형태로 세포막을 통과해 단백질, DNA, RNA 등의 운반 대상을 세포 내로 뿐만 아니라 세포질, 세포내 소기관, 핵 안 까지 운반할 수 있다.
Regnase-1 (Regulatory RNase 1)은 사이토카인과 케모카인의 mRNA를 분해하여 항염증 작용하는 RNase으로 알려져있다. 이러한 Regnase-1은 N-말단 도메인 (NTD), PilT N-말단 유사 (PIN) 도메인, 징크 핑거 (ZF) 도메인 및 C- 말단 도메인 (CTD)의 네 가지 도메인으로 구성되어 있으며, PIN-PIN 결합으로 dimer를 형성하여 타겟 mRNA를 분해한다.
본 발명은 세포투과성 Regnase-1 재조합 단백질을 제공하며, 상기 Regnase-1 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물을 항염증용 조성물로 제공하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 세포투과성 펩티드 아미노산 서열을 인코딩하는 유전자 및 서열번호 3으로 표시되는 Regnase-1 (Regulatory RNase 1)의 N-말단 도메인 (NTD)과 PilT N-말단 유사 (PIN) 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터을 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포주를 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 세포주로부터 발현되는 세포투과성 Regnase-1 재조합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포투과성 Regnase-1 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, Regnase-1을 구성하는 도메인으로 재조합된 단백질 중 AP-NTD-PIN 재조합 단백질이 처리된 세포군에서는 LPS에 의해 유도되는 IL-6, IL-12 및 RANTES를 현저하게 감시킨 반면, AP-PIN 또는 AP-PIN-ZF 재조합 단백질이 처리된 세포군에서는 LPS에 의해 유도된 IL-6, IL-12 및 RANTES의 발현이 억제되지 않은 것으로 확인됨에 따라, Regnase-1의 NTD-PIN 도메인을 포함하는 재조합 단백질은 항염증용 조성물로 제공될 수 있다.
도 1은 재조합 단백질 구조를 나타낸 모식도로, 도 1(a)는 Regnase-1의 원형 단백질로, NTD, PIN, ZF, CTD 도메인으로 구성되어 있으며, 도 1(b)는 세포투과성단백질인 AP에 EGFP와 His tag을 넣어서 제작된 AP_EGFP이며, 도 1(c)는 AP-Regnase-1 재조합단백질로서 각각의 도메인을 나타낸 것이다.
도 2는 골수세포 유래 대식세포에 AP-PIN, AP-NTD-PIN 및 AP-PIN-ZF 재조합 단백질을 5 μM 처리 후 LPS 유도 사이토카인과 케모카인의 생성 수준을 확인한 결과이다.
도 3은 재조합 AP 단백질 발현벡터의 개열지도이다.
도 4는 재조합 AP_PIN 단백질 발현벡터의 개열지도이다.
도 5는 재조합 AP_NTD-PIN 단백질 발현벡터의 개열지도이다.
도 6은 재조합 AP_PIN-ZF 단백질 발현벡터의 개열지도이다.
도 2는 골수세포 유래 대식세포에 AP-PIN, AP-NTD-PIN 및 AP-PIN-ZF 재조합 단백질을 5 μM 처리 후 LPS 유도 사이토카인과 케모카인의 생성 수준을 확인한 결과이다.
도 3은 재조합 AP 단백질 발현벡터의 개열지도이다.
도 4는 재조합 AP_PIN 단백질 발현벡터의 개열지도이다.
도 5는 재조합 AP_NTD-PIN 단백질 발현벡터의 개열지도이다.
도 6은 재조합 AP_PIN-ZF 단백질 발현벡터의 개열지도이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 Regnase-1은 PilT N-terminus like(PIN) 도메인과 CCCH-type zinc-finger(ZF) 도메인으로 구성된 RNase로, PIN domain은 RNase 활성을 가지고, NTD가 이의 활성화를 촉진하고, ZF는 RNA 결합을 증진시키는 역할을 한다. 본 발명의 발명자들은 상기 Regnase-1의 PIN 도메인 단독으로는 항염증 작용을 나타내기에 충분하지 않고, NTD의 동시발현이 필수적임을 확인함에 따라, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 세포투과성 펩티드 아미노산 서열을 인코딩하는 유전자 및 서열번호 3으로 표시되는 Regnase-1 (Regulatory RNase 1)의 N-말단 도메인 (NTD)과 PilT N-말단 유사 (PIN) 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공할 수 있다.
상기 세포투과성 펩티드는 AP (astrotactin 1-derived peptide)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 재조합 발현벡터는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 세포투과성 Regnase-1 재조합 단백질을 발현하는 것일 수 있다.
상기 발현벡터는 도 5에 도시된 개열지도를 갖는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포주를 제공할 수 있다.
본 발명은 상기 재조합 세포주로부터 발현되는 세포투과성 Regnase-1 재조합 단백질을 제공할 수 있다.
상기 세포투과성 Regnase-1 재조합 단백질은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열으로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포투과성 Regnase-1 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
상기 세포투과성 Regnase-1 재조합 단백질은 LPS에 의해 유되는 IL-6, IL-12 및 RANTES 생성을 억제하는 것일 수 있다.
상기 염증 질환은 류머티스성 관절염 (Rheumatoid Arthritis: Chabaud, M., Durand, J. M., Buchs, N., Fossiez, F., Page, G., Frappart, L., & Miossec, P. (1999). Human interleukin-17: AT cell-derived proinflammatory cytokine produced by the rheumatoid synovium. Arthritis & Rheumatism: Official Journal of the American College of Rheumatology, 42(5), 963-970. Katsikis, P. D., Chu, C. Q., Brennan, F. M., Maini, R. N., & Feldmann, M. (1994). Immunoregulatory role of interleukin 10 in rheumatoid arthritis. The Journal of experimental medicine, 179(5), 1517-1527.), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis: Maimone D, Guazzi GC, Annunziata P. IL-6 detection in multiple sclerosis brain. J Neurol Sci. 1997 Feb 27;146(1):59-65. doi: 10.1016/s0022-510x(96)00283-3. PMID: 9077497.), 건선 (Psoriasis: Shaker, O. G., Moustafa, W., Essmat, S., Abdel-Halim, M., & El-Komy, M. (2006). The role of interleukin-12 in the pathogenesis of psoriasis. Clinical biochemistry, 39(2), 119-125.) 및 전신 경화증 (Systemic Sclerosis: Distler, O., Rinkes, B., Hohenleutner, U., Scholmerich, J., Landthaler, M., Lang, B., ... & Muller-Ladner, U. (1999). Expression of RANTES in biopsies of skin and upper gastrointestinal tract from patients with systemic sclerosis. Rheumatology international, 19(1-2), 39-46.)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 재조합 단백질의 항염증 효과를 확인하기 위해, 마우스 골수세포 유래 대식세포에 LPS를 처리한 후 AP-Regnase-1 재조합 단백질(2 μM)을 처리하였다. 2시간 후 세포를 수거하여 사이토카인과 케모카인 생성을 RT-PCR 방법으로 mRNA 수준을 확인한 결과, 도 2와 같이 AP-NTD-PIN이 처리된 세포군에서는 LPS 유도 IL-6, IL-12 및 RANTES 생성이 통계학적으로 유의하게 감소한 것으로 확인된 반면, AP-PIN 또는 AP-PIN-ZF 처리된 세포군에서는 LPS 유도 IL-6, IL-12 및 RANTES의 생성이 유의하게 억제되지 않았다.
상기 결과로부터 Regnase-1의 NTD-PIN 도메인을 세포내로 주입할 경우, IL-6, IL-12 및 RANTES와 같은 염증사이토카인과 케모카인의 생성이 억제되는 것이 확인됨에 따라, Regnase-1의 NTD-PIN 도메인이 Regnase-1의 항염증 작용을 담당하는데 있어서 필수적인 도메인임이 확인되었다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 세포투과성 Regnase-1 재조합 단백질의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 투과성 펩티드는 매우 작은 펩티드이므로 혹시 발생할 수 있는 활성 물질에 대한 생물학적 간섭을 최소화할 수 있다. 상기 세포 투과성 펩티드와 생물학적 활성 물질의 융합체는 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내 전달될 수 있다.
본 발명에 있어서, “벡터”는 클론유전자를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA 분자를 의미한다.
본 발명에 있어서, “발현벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능한게 연결된 코팅 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다.
그 예로는 앰피실린(ampicilin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 세포배양
C57BL/6 마우스로부터 종래 알려진 방법[Journal of immunology (Baltimore, Md. :1950) 186, 499-507, 2011]에 따라 골수를 분리한 후 골수-유래 프라이머리 대식세포 (BMDMs)를 준비하였다. 상기 대식세포는 10%(v/v) 태아소혈청 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10,000 unit/ml의 페니실린 및 10,000 mg/ml의 스트렙토마이신 (invitrogen)을 함유한 DMEM 배지에서 배양하였다.
2. 시약처리
Escherichia coli로부터 정제된 LPS는 List Biological Laboratory Inc. (Campbell, CA, USA)에서 수득하여 endotoxin-free water에 용해하여 사용하였다.
분화된 골수 유래 대식세포(BMDM)를 2×106 세포/ml의 밀도로 6-웰 플레이트 상에 분주하고 100 ng/ml의 LPS (Purified LPS from Escherichia coli; List Biological Laboratory Inc., Campbell, CA)를 1시간 동안 처리하고 PBS로 세척하여 LPS를 제거한 후, PBS에 녹인 재조합 단백질(2 μM)을 2시간 동안 처리하고 세포를 수거하였다.
3. RNA 추출 및 정량적 역전사-PCR 분석
세포로부터 총 RNA를 공급자의 지시에 따라 시약(Tizol reagent, 15596018, Invitrogen, CA, USA)을 이용하여 추출하였다. 유전자 발현을 정량적 역전사 (quantitaive reverse transcription)-PCR 분석법을 이용하여 정량하였다. 프라이머(Primers), 아닐링 온도(annealing temperatures) 및 관련된 유전자의 생성 길이 세트(production lengths set)는 하기 표 1과 같다.
| Gene name | Tm(C) | Size(bp) | Sequence 5'-3' Sequence 3'-5' |
| IL-6 | 53.2 | 19 | TTC CTC TCT GCA AGA GAC T |
| 51.1 | 19 | TGT ATC TCT CTG AAG GAC T | |
| IL-12 | 56.2 | 21 | TGG TTT GCC ATC GTT TTG CTG |
| 56.4 | 22 | ACA GGT GAG GTT CAC TGT TTC T | |
| CCL5/RANTES | 60.4 | 24 | GCC CAC GTC AAG TAT TTC TAC |
| 60.2 | 23 | AGG ACT AGA GCA AGC GAT GAC AG | |
| TNF-α | 57 | 24 | AAA ATT CGA GTG ACA AGC CTG TAG |
| 62.1 | 24 | CCC TTG AAG AGA ACC TGG GAG TAG |
4. 통계 분석
각 그룹간의 차이는 One-way ANOVA 후 Tukey’s multiple comparison test로 검증하였다. p<0.05를 유의적인 데이터로 해석하였다.
<실시예 1> 재조합 단백질 제조 및 확인
재조합 단백질(Bionics, Seoul, Korea)은 pET28a(Novagen, 69864-3) Vector를 사용하여 Large scale (main) 배양 및 IPTG induction 후 Ni-NTA 정제(Purification)하였다. 정제된 생성물의 수율 및 순도를 확인하고, 투석하여 버퍼를 교체하고 Sample Packing 과정을 통하여 AP_EGFP(AP_EGFP Recombinant with C-terminal 6xHis-tag), AP_PIN(AP_PIN Recombinant with C-terminal 6xHis-tag), AP_NTD-PIN(AP_NTD-PIN Recombinant with C-terminal 6xHis-tag) 및 AP_PIN-ZF(AP_PIN-ZF Recombinant with C-terminal 6xHis-tag) 도 1과 같은 구조의 재조합 단백질을 수득하였으며, 상기 재조합 단백질의 서열은 다음과 같다.
1) AP(astrotactin 1-derived peptide)-EGFP 중 AP의 서열 (서열번호 1)
RRRWCKRRR
2) PIN 서열 (서열번호 2)
DLRPVVIDGSNVAMSHGNKEVFSCRGILLAVNWFLERGHTDITVFVPSWRKEQPRPDVPITDQHILRELEKKKILVFTPSRRVGGKRVVCYDDRFIVKLAFESDGVVVSNDTYRDLQGERQEWKRFIEERLLMYSFVNDKFMPPDDPLGRHGPSLDNFLRKK
3) NTD-PIN 서열 (서열번호 3)
TSELQMKVDFFRKLGYSSSEIHSVLQKLGVQADTNTVLGELVKHGSATERECQALTAPSPQPPLVPRGGSTPKPSTLEPSLPEEDREGSDLRPVVIDGSNVAMSHGNKEVFSCRGILLAVNWFLERGHTDITVFVPSWRKEQPRPDVPITDQHILRELEKKKILVFTPSRRVGGKRVVCYDDRFIVKLAFESDGVVVSNDTYRDLQGERQEWKRFIEERLLMYSFVNDKFMPPDDPLGRHGPSLDNFLRKK
4) PIN-ZF 서열 (서열번호 4)
DLRPVVIDGSNVAMSHGNKEVFSCRGILLAVNWFLERGHTDITVFVPSWRKEQPRPDVPITDQHILRELEKKKILVFTPSRRVGGKRVVCYDDRFIVKLAFESDGVVVSNDTYRDLQGERQEWKRFIEERLLMYSFVNDKFMPPDDPLGRHGPSLDNFLRKKPLPSEHRKQPCPYGKKCTYGIKCRFFHPERP
5) AP-PIN (서열번호 5)
RRRWCKRRRDLRPVVIDGSNVAMSHGNKEVFSCRGILLAVNWFLERGHTDITVFVPSWRKEQPRPDVPITDQHILRELEKKKILVFTPSRRVGGKRVVCYDDRFIVKLAFESDGVVVSNDTYRDLQGERQEWKRFIEERLLMYSFVNDKFMPPDDPLGRHGPSLDNFLRKK
6) AP-NTD-PIN (서열번호 6)
RRRWCKRRRTSELQMKVDFFRKLGYSSSEIHSVLQKLGVQADTNTVLGELVKHGSATERECQALTAPSPQPPLVPRGGSTPKPSTLEPSLPEEDREGSDLRPVVIDGSNVAMSHGNKEVFSCRGILLAVNWFLERGHTDITVFVPSWRKEQPRPDVPITDQHILRELEKKKILVFTPSRRVGGKRVVCYDDRFIVKLAFESDGVVVSNDTYRDLQGERQEWKRFIEERLLMYSFVNDKFMPPDDPLGRHGPSLDNFLRKK
7) AP-PIN-ZF (서열번호 7)
RRRWCKRRRDLRPVVIDGSNVAMSHGNKEVFSCRGILLAVNWFLERGHTDITVFVPSWRKEQPRPDVPITDQHILRELEKKKILVFTPSRRVGGKRVVCYDDRFIVKLAFESDGVVVSNDTYRDLQGERQEWKRFIEERLLMYSFVNDKFMPPDDPLGRHGPSLDNFLRKKPLPSEHRKQPCPYGKKCTYGIKCRFFHPERP
<실시예 2> 재조합 단백질의 항염증 효과 확인
재조합 단백질의 항염증 효과를 확인하기 위해, 마우스 골수세포 유래 대식세포에 LPS를 처리한 후 AP-Regnase-1 재조합 단백질(2 μM)을 처리하였다. 2시간 후 세포를 수거하여 사이토카인과 케모카인 생성을 RT-PCR 방법으로 mRNA 수준을 확인하였다.
도 2를 참고하면, AP-NTD-PIN이 처리된 세포군에서는 LPS 유도 IL-6, IL-12 및 RANTES 생성이 통계학적으로 유의하게 감소한 것으로 확인된 반면, AP-PIN 또는 AP-PIN-ZF 처리된 세포군에서는 LPS 유도 IL-6, IL-12 및 RANTES의 생성이 유의하게 억제되지 않았다.
상기 결과로부터 Regnase-1의 NTD-PIN 도메인을 세포내로 주입할 경우, IL-6, IL-12 및 RANTES와 같은 염증사이토카인과 케모카인의 생성이 억제되는 것이 확인됨에 따라, Regnase-1의 NTD-PIN 도메인이 Regnase-1의 항염증 작용을 담당하는데 있어서 필수적인 도메인임이 확인되었다.
한편, TNF-a는 IL-6, IL-12 및 RANTES와 다르게, Regnase-1의 NTD-PIN 재조합단백질에 의한 생성 감소가 나타나지 않았다. (Mino et al., 2015)의 논문에 따르면, TNF-a는 Regnase-1의 타겟사이토카인이 아니라고 보고되어 짐에 따라, 상기 Regnase-1의 NTD-PIN 재조합 단백질에 의한 영향이 나타나지 않은 것과 부합한다.
상기 결과로부터 Regnase-1의 NTD-PIN 재조합 단백질에 의한 IL-6, IL-12 및 RANTES 생성 감소는 무작위적 억제가 아니라, Regnase-1의 항염증 작용에 기인한 것임이 확인되었다.
상기 결과들로부터 본 발명의 regnase-1 재조합 단백질은 세포내 도입이 가능하며 항염증작용을 나타내는 것이 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION
<120> Cell permeable Regnase-1 recombinant protein and
anti-inflammatory composition comprising the same
<130> ADP-2020-0566
<160> 7
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> astrotactin 1 derived peptide
<400> 1
Arg Arg Arg Trp Cys Lys Arg Arg Arg
1 5
<210> 2
<211> 162
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Regulatory RNase 1 PIN domain
<400> 2
Asp Leu Arg Pro Val Val Ile Asp Gly Ser Asn Val Ala Met Ser His
1 5 10 15
Gly Asn Lys Glu Val Phe Ser Cys Arg Gly Ile Leu Leu Ala Val Asn
20 25 30
Trp Phe Leu Glu Arg Gly His Thr Asp Ile Thr Val Phe Val Pro Ser
35 40 45
Trp Arg Lys Glu Gln Pro Arg Pro Asp Val Pro Ile Thr Asp Gln His
50 55 60
Ile Leu Arg Glu Leu Glu Lys Lys Lys Ile Leu Val Phe Thr Pro Ser
65 70 75 80
Arg Arg Val Gly Gly Lys Arg Val Val Cys Tyr Asp Asp Arg Phe Ile
85 90 95
Val Lys Leu Ala Phe Glu Ser Asp Gly Val Val Val Ser Asn Asp Thr
100 105 110
Tyr Arg Asp Leu Gln Gly Glu Arg Gln Glu Trp Lys Arg Phe Ile Glu
115 120 125
Glu Arg Leu Leu Met Tyr Ser Phe Val Asn Asp Lys Phe Met Pro Pro
130 135 140
Asp Asp Pro Leu Gly Arg His Gly Pro Ser Leu Asp Asn Phe Leu Arg
145 150 155 160
Lys Lys
<210> 3
<211> 251
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> NTD-PIN
<400> 3
Thr Ser Glu Leu Gln Met Lys Val Asp Phe Phe Arg Lys Leu Gly Tyr
1 5 10 15
Ser Ser Ser Glu Ile His Ser Val Leu Gln Lys Leu Gly Val Gln Ala
20 25 30
Asp Thr Asn Thr Val Leu Gly Glu Leu Val Lys His Gly Ser Ala Thr
35 40 45
Glu Arg Glu Cys Gln Ala Leu Thr Ala Pro Ser Pro Gln Pro Pro Leu
50 55 60
Val Pro Arg Gly Gly Ser Thr Pro Lys Pro Ser Thr Leu Glu Pro Ser
65 70 75 80
Leu Pro Glu Glu Asp Arg Glu Gly Ser Asp Leu Arg Pro Val Val Ile
85 90 95
Asp Gly Ser Asn Val Ala Met Ser His Gly Asn Lys Glu Val Phe Ser
100 105 110
Cys Arg Gly Ile Leu Leu Ala Val Asn Trp Phe Leu Glu Arg Gly His
115 120 125
Thr Asp Ile Thr Val Phe Val Pro Ser Trp Arg Lys Glu Gln Pro Arg
130 135 140
Pro Asp Val Pro Ile Thr Asp Gln His Ile Leu Arg Glu Leu Glu Lys
145 150 155 160
Lys Lys Ile Leu Val Phe Thr Pro Ser Arg Arg Val Gly Gly Lys Arg
165 170 175
Val Val Cys Tyr Asp Asp Arg Phe Ile Val Lys Leu Ala Phe Glu Ser
180 185 190
Asp Gly Val Val Val Ser Asn Asp Thr Tyr Arg Asp Leu Gln Gly Glu
195 200 205
Arg Gln Glu Trp Lys Arg Phe Ile Glu Glu Arg Leu Leu Met Tyr Ser
210 215 220
Phe Val Asn Asp Lys Phe Met Pro Pro Asp Asp Pro Leu Gly Arg His
225 230 235 240
Gly Pro Ser Leu Asp Asn Phe Leu Arg Lys Lys
245 250
<210> 4
<211> 193
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> PIN-ZF
<400> 4
Asp Leu Arg Pro Val Val Ile Asp Gly Ser Asn Val Ala Met Ser His
1 5 10 15
Gly Asn Lys Glu Val Phe Ser Cys Arg Gly Ile Leu Leu Ala Val Asn
20 25 30
Trp Phe Leu Glu Arg Gly His Thr Asp Ile Thr Val Phe Val Pro Ser
35 40 45
Trp Arg Lys Glu Gln Pro Arg Pro Asp Val Pro Ile Thr Asp Gln His
50 55 60
Ile Leu Arg Glu Leu Glu Lys Lys Lys Ile Leu Val Phe Thr Pro Ser
65 70 75 80
Arg Arg Val Gly Gly Lys Arg Val Val Cys Tyr Asp Asp Arg Phe Ile
85 90 95
Val Lys Leu Ala Phe Glu Ser Asp Gly Val Val Val Ser Asn Asp Thr
100 105 110
Tyr Arg Asp Leu Gln Gly Glu Arg Gln Glu Trp Lys Arg Phe Ile Glu
115 120 125
Glu Arg Leu Leu Met Tyr Ser Phe Val Asn Asp Lys Phe Met Pro Pro
130 135 140
Asp Asp Pro Leu Gly Arg His Gly Pro Ser Leu Asp Asn Phe Leu Arg
145 150 155 160
Lys Lys Pro Leu Pro Ser Glu His Arg Lys Gln Pro Cys Pro Tyr Gly
165 170 175
Lys Lys Cys Thr Tyr Gly Ile Lys Cys Arg Phe Phe His Pro Glu Arg
180 185 190
Pro
<210> 5
<211> 171
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> AP-PIN
<400> 5
Arg Arg Arg Trp Cys Lys Arg Arg Arg Asp Leu Arg Pro Val Val Ile
1 5 10 15
Asp Gly Ser Asn Val Ala Met Ser His Gly Asn Lys Glu Val Phe Ser
20 25 30
Cys Arg Gly Ile Leu Leu Ala Val Asn Trp Phe Leu Glu Arg Gly His
35 40 45
Thr Asp Ile Thr Val Phe Val Pro Ser Trp Arg Lys Glu Gln Pro Arg
50 55 60
Pro Asp Val Pro Ile Thr Asp Gln His Ile Leu Arg Glu Leu Glu Lys
65 70 75 80
Lys Lys Ile Leu Val Phe Thr Pro Ser Arg Arg Val Gly Gly Lys Arg
85 90 95
Val Val Cys Tyr Asp Asp Arg Phe Ile Val Lys Leu Ala Phe Glu Ser
100 105 110
Asp Gly Val Val Val Ser Asn Asp Thr Tyr Arg Asp Leu Gln Gly Glu
115 120 125
Arg Gln Glu Trp Lys Arg Phe Ile Glu Glu Arg Leu Leu Met Tyr Ser
130 135 140
Phe Val Asn Asp Lys Phe Met Pro Pro Asp Asp Pro Leu Gly Arg His
145 150 155 160
Gly Pro Ser Leu Asp Asn Phe Leu Arg Lys Lys
165 170
<210> 6
<211> 260
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> AP-NTD-PIN
<400> 6
Arg Arg Arg Trp Cys Lys Arg Arg Arg Thr Ser Glu Leu Gln Met Lys
1 5 10 15
Val Asp Phe Phe Arg Lys Leu Gly Tyr Ser Ser Ser Glu Ile His Ser
20 25 30
Val Leu Gln Lys Leu Gly Val Gln Ala Asp Thr Asn Thr Val Leu Gly
35 40 45
Glu Leu Val Lys His Gly Ser Ala Thr Glu Arg Glu Cys Gln Ala Leu
50 55 60
Thr Ala Pro Ser Pro Gln Pro Pro Leu Val Pro Arg Gly Gly Ser Thr
65 70 75 80
Pro Lys Pro Ser Thr Leu Glu Pro Ser Leu Pro Glu Glu Asp Arg Glu
85 90 95
Gly Ser Asp Leu Arg Pro Val Val Ile Asp Gly Ser Asn Val Ala Met
100 105 110
Ser His Gly Asn Lys Glu Val Phe Ser Cys Arg Gly Ile Leu Leu Ala
115 120 125
Val Asn Trp Phe Leu Glu Arg Gly His Thr Asp Ile Thr Val Phe Val
130 135 140
Pro Ser Trp Arg Lys Glu Gln Pro Arg Pro Asp Val Pro Ile Thr Asp
145 150 155 160
Gln His Ile Leu Arg Glu Leu Glu Lys Lys Lys Ile Leu Val Phe Thr
165 170 175
Pro Ser Arg Arg Val Gly Gly Lys Arg Val Val Cys Tyr Asp Asp Arg
180 185 190
Phe Ile Val Lys Leu Ala Phe Glu Ser Asp Gly Val Val Val Ser Asn
195 200 205
Asp Thr Tyr Arg Asp Leu Gln Gly Glu Arg Gln Glu Trp Lys Arg Phe
210 215 220
Ile Glu Glu Arg Leu Leu Met Tyr Ser Phe Val Asn Asp Lys Phe Met
225 230 235 240
Pro Pro Asp Asp Pro Leu Gly Arg His Gly Pro Ser Leu Asp Asn Phe
245 250 255
Leu Arg Lys Lys
260
<210> 7
<211> 202
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> AP-PIN-ZF
<400> 7
Arg Arg Arg Trp Cys Lys Arg Arg Arg Asp Leu Arg Pro Val Val Ile
1 5 10 15
Asp Gly Ser Asn Val Ala Met Ser His Gly Asn Lys Glu Val Phe Ser
20 25 30
Cys Arg Gly Ile Leu Leu Ala Val Asn Trp Phe Leu Glu Arg Gly His
35 40 45
Thr Asp Ile Thr Val Phe Val Pro Ser Trp Arg Lys Glu Gln Pro Arg
50 55 60
Pro Asp Val Pro Ile Thr Asp Gln His Ile Leu Arg Glu Leu Glu Lys
65 70 75 80
Lys Lys Ile Leu Val Phe Thr Pro Ser Arg Arg Val Gly Gly Lys Arg
85 90 95
Val Val Cys Tyr Asp Asp Arg Phe Ile Val Lys Leu Ala Phe Glu Ser
100 105 110
Asp Gly Val Val Val Ser Asn Asp Thr Tyr Arg Asp Leu Gln Gly Glu
115 120 125
Arg Gln Glu Trp Lys Arg Phe Ile Glu Glu Arg Leu Leu Met Tyr Ser
130 135 140
Phe Val Asn Asp Lys Phe Met Pro Pro Asp Asp Pro Leu Gly Arg His
145 150 155 160
Gly Pro Ser Leu Asp Asn Phe Leu Arg Lys Lys Pro Leu Pro Ser Glu
165 170 175
His Arg Lys Gln Pro Cys Pro Tyr Gly Lys Lys Cys Thr Tyr Gly Ile
180 185 190
Lys Cys Arg Phe Phe His Pro Glu Arg Pro
195 200
Claims (9)
- 서열번호 1로 표시되는 AP (astrotactin 1-derived peptide) 아미노산 서열을 인코딩하는 유전자 및 서열번호 3으로 표시되는 Regnase-1 (Regulatory RNase 1)의 N-말단 도메인 (NTD)과 PilT N-말단 유사 (PIN) 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로,
상기 재조합 발현벡터는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 세포투과성 Regnase-1 재조합 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터. - 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 발현벡터는 도 5에 도시된 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 청구항 1에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포주.
- 청구항 4에 따른 재조합 세포주로부터 발현되는 세포투과성 Regnase-1 재조합 단백질.
- 삭제
- 청구항 5에 따른 세포투과성 Regnase-1 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 청구항 7에 있어서, 상기 세포투과성 Regnase-1 재조합 단백질은 LPS에 의해 유도되는 IL-6, IL-12 및 RANTES 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 청구항 7에 있어서, 상기 염증 질환은 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 건선 및 전신 경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 염증 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
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| WO2020139031A1 (ko) * | 2018-12-27 | 2020-07-02 | 한양대학교 산학협력단 | Crispr-cas를 기반으로 하는 유전자 교정용 조성물 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
2021
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2019018652A1 (en) | 2017-07-21 | 2019-01-24 | The Cleveland Clinic Foundation | SBE APTAMERS FOR THE TREATMENT OF DISEASES AND CONDITIONS ASSOCIATED WITH IL-17A |
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| Title |
|---|
| Ewelina Dobosz etc, "MCPIP-1, Alias Regnase-1, Controls Epithelial Inflammation by Posttranscriptional Regulation of IL-8 Production", J Innate Immun. 2016* |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20220136640A (ko) | 2022-10-11 |
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