KR20040077669A - 선천 면역의 작동체 - Google Patents

선천 면역의 작동체 Download PDF

Info

Publication number
KR20040077669A
KR20040077669A KR10-2004-7008519A KR20047008519A KR20040077669A KR 20040077669 A KR20040077669 A KR 20040077669A KR 20047008519 A KR20047008519 A KR 20047008519A KR 20040077669 A KR20040077669 A KR 20040077669A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
seq
polynucleotide
expression
cells
Prior art date
Application number
KR10-2004-7008519A
Other languages
English (en)
Inventor
행콕로버트이더블유
핀레이비브렛
스콧모니샤고프
바우디쉬던
로젠버거캐리멜리사
파워스존-폴스티븐
Original Assignee
유니버시티 오브 브리티시 콜롬비아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니버시티 오브 브리티시 콜롬비아 filed Critical 유니버시티 오브 브리티시 콜롬비아
Publication of KR20040077669A publication Critical patent/KR20040077669A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4723—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7158—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

하나 이상의 패혈증 또는 염증 유도제에 의해 조절되고 펩티드에 의해 억제되는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 패턴의 확인 방법이 제공된다. 또한, 염증성 또는 패혈성 반응의 억제를 위한 폴리뉴클레오티드 발현 패턴을 확인하는 방법도 제공된다. 이 방법은 펩티드의 존재 또는 부재 하에 세포를 LPS, LTA, CpG DNA 및/또는 온전한 미생물 또는 미생물 성분과 접촉시키는 단계; 펩티드의 존재 및 부재 하에 세포에 대한 폴리뉴클레오티드 발현 패턴을 검출하는 단계를 포함하며, 펩티드의 존재 하의 패턴이 염증성 또는 패혈성 반응의 억제를 나타낸다. 본 발명의 방법에 의해 확인된 화합물 및 제제도 포함된다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 피험체의 선천 면역을 증가시키는 방법 및 화합물을 제공한다.

Description

선천 면역의 작동체{EFFECTORS OF INNATE IMMUNITY}
감염성 질환은 전세계적으로 주요한 사망 원인이다. 1999년 세계 보건 기구의 조사에 따르면, 매년 1300만명이 감염성 질환으로 사망한다. 북아메리카에서는 감염성 질환이 사망의 제3 원인으로서, 매년 사망자의 20%를 차지하고 1980년 이래로 50% 증가하고 있다. 많은 의료 및 수술 치료의 성공 여부는 감염성 질환을 조절할 수 있는냐에 달려있다. 항생제 개발 및 사용은 근대 의약의 최대 성과 중 하나이다. 항생제가 없다면, 의사는 수술, 화학요법 또는 카테터삽입과 같은 대부분의 의료 시술을 실시할 수 없을 것이다.
현재 항생제 매출액은 전세계적으로 260억 US 달러이다. 그러나, 항생제의남용과 때때로 부당한 사용으로 인해 신규 항생제 내성 균주가 출현하였다. 항생제 내성은 의료 분야의 일부가 되었다. 반코마이신 내성 엔테로코코스(Enterococcus), VRE 및 메티실린 내성 스타필로코코스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 MRSA와 같은 박테리아 균주는 항생제로 치료할 수 없으며, 그러한 박테리아에 감염된 환자는 흔히 사망한다. 항생제 발견은 가장 어려운 신규 약물 개발 분야 중 하나인 것으로 밝혀졌으며, 많은 대형 제약 회사들은 항생제 개발 프로그램을 축소하거나 또는 완전히 중단하였다. 그러나, 치료 불가능한 감염의 출현을 비롯하여 항생제 내성의 급격한 증가로, 의료 분야에서 신규한 종류의 항미생물 요법을 필요로 하는 것은 명백하며, 선천 면역에 영향을 주는 제제는 그러한 부류의 제제가 될 것이다.
선천 면역계는 매우 효과적이며, 일반적인 방어계를 이끌어낸다. 선천 면역의 성분은 항상 저 농도로 존재하지만, 자극시 매우 신속하게 활성화된다. 자극은 신체 세포의 표면 상의 패턴 인식 수용체와 박테리아 시그널링 분자의 상호작용 또는 다른 질병 기전을 포함할 수 있다. 매일 사람들은, 섭취하는 음식물, 호흡하는 공기 그리고 접촉하는 표면, 애완동물 및 사람들을 통해 수만의 유효 병원성 미생물에 노출된다. 선천 면역계는 병원체가 질병을 일으키지 못하도록 한다. 선천 면역계는, 항상 존재하고, 즉시 효과를 나타내며, 어떤 주어진 병원체에 대해서도 비교적 비특이적이기 때문에 획득 면역계(항체 및 항원 특이적 B 및 T 림프구)과는 다르다. 획득 면역계에서는 특이적 인식 성분을 증폭시켜야 하며, 따라서 반응에 수일 내지 수주가 걸린다. 예방접종으로 획득 면역을 사전 자극한 경우에도 병원체에 반응하는 데 3일 이상이 걸리지만, 선천 면역은 바로 또는 신속하게(수 시간)이용할 수 있다. 선천 면역은 포식세포, 보체 등을 비롯한 각종 작동체(effector) 기능을 포함하지만, 일반적으로 완전하게 알려져 있지 않다. 일반적으로 다수의 선천 면역 반응은, 숙주 세포의 표면에 톨(Toll)-유사 수용체라고 불리우는 패턴 인식 수용체와 미생물 시그널링 분자가 결합하여 "촉발"된다. 이들 작동체 기능 중 다수의 기능이 염증성 반응으로 함께 분류된다. 그러나, 염증 반응이 너무 지나치면 인체에 유해한 반응이 되고, 극단적 사례로서 패혈증과 잠재적으로 사망을 일으킬 수 있다.
감염 과정에서 감염제로부터 구조 성분이 방출되면 염증 반응이 일어나는데, 이를 억제하지 않으면 잠재적으로 치명적인 증상인 패혈증이 유발될 수 있다. 매년 북아메리카에서 약 780,000 환자가 패혈증을 앓는다. 패혈증은 폐렴과 같이 일부 지역에서 얻은 감염의 결과로서 생길 수 있다. 또는 패혈증은 외상, 암 또는 대수술 치료 후의 합병증일 수 있다. 중증 패혈증은 신체가 염증성 반응에 제압되면 발생하여 신체 장기가 작동하지 않게 된다. 매년 미국에서 패혈증으로 최대 120,000명이 사망한다. 패혈증은 인간 사망의 주요 원인인 혈중 병원성 미생물 또는 독소(예, 패혈증(septicemia))를 포함할 수 있다. 그람 음성 박테리아는 그러한 질병과 관련된 가장 일반적인 유기체이다. 그러나, 그람 양성 박테리아가 감염원으로 작용하는 경우도 증가하는 추세이다. 그람 음성 및 그람 양성 박테리아와 그 성분은 모두 패혈증을 유발할 수 있다.
미생물 성분이 존재하면 종양 괴사 인자-α(TNF-α)가 매우 중요한 전염증성(pro-inflammatory) 사이토킨의 방출이 유도된다. TNF-α 및 기타 전염증성 사이토킨은 다른 전염증성 매개인자의 방출을 유발하고 염증성 캐스케이드를 유도할 수 있다. 그람 음성 패혈증은 일반적으로 박테리아의 외막 성분인 리포다당류(LPS; 내독소라고도 부름)의 방출에 의해 유발된다. 내독소혈증이라고 하는 혈중 내독소는 주로 박테리아 감염으로부터 생기며, 항생제 처리 과정에서 방출될 수 있다. 그람 양성 패혈증은 리포테이콘산(LTA), 펩티도글리칸(PG), 스트렙토코코스(Streptococcus)에 의해 생성된 람노스-글루코스 중합체 또는 스타필로코코스(Staphylococcus)에 의해 생성된 캡슐 다당류와 같은 박테리아 세포벽 성분의 방출에 의해 유발될 수 있다. 포유류 DNA와는 달리, 흔히 메틸화되지 않은 시토신-구아노신 이량체(CpG DNA)를 함유하는 박테리아 또는 기타 비포유류 DNA는 TNF-α의 생성을 비롯한 패혈성 증상을 유도하는 것으로 확인된 바 있다. 포유류 DNA는, 흔히 메틸화된 형태의 CpG 디뉴클레오티드를 휠씬 낮은 빈도로 포함한다. 박테리아 감염 과정에서의 자연 방출 외에, 항생제 치료도 박테리아의 세포벽 성분인 LPS 및 LTA와 가능하게는 박테리아 DNA의 방출을 유발할 수 있다. 이 때문에 감염으로부터 회복하기 어렵거나, 심지어 패혈증이 유발될 수 있다.
양이온성 펩티드가 점차로 감염에 대한 방어 형태로 인식되고 있지만, 과학 특허 문헌에서 인정된 주요 효과는 항미생물 효과이다(Hancock, R. E. W., and R. Lehrer. 1998. Cationic peptides: a new source of antibiotics. Trends in Biotechnology 16:82-88). 항미생물 활성을 갖는 양이온성 펩티드가 각종 유기체로부터 분리되었다. 자연 상태에서, 그러한 펩티드는 박테리아 및 효모와 같은 미생물에 대한 방어 기전을 제공한다. 일반적으로, 이들 양이온성 펩티드는 세포질막과상호작용하고, 대부분의 경우에 채널 또는 병변을 형성하여 박테리아에 대한 항미생물 활성을 나타내는 것으로 생각된다. 그람 음성 박테리아에서, 이들 양이온성 펩티드는 LPS와 상호작용하여 외막을 투과함으로써, 그 자체로 외막을 통한 흡수를 촉진하고 세포질막에 접근가능하게 된다. 양이온성 항미생물 펩티드의 예로는 인돌리시딘, 디펜신, 세크로핀 및 마게이닌 등이 있다.
최근에, 그러한 펩티드가 다른 측면의 선천 면역에서 작동체라는 인식이 증가하고 있지만(Hancock, R.E.W. and G. Diamond. 2000. The role of cationic peptides in innate host defenses. Trends in Microbiology 8: 402-410; Hancock, R.E.W. 2001. Cationic peptides: effectors in innate immunity and novel antimicrobials. Lancet Infectious Diseases 1:156-164), 항미생물 기능과 작동체 기능이 무관한지는 알려지지 않았다.
일부 양이온성 펩티드는 LPS 및 LTA와 같은 박테리아의 생성물에 대한 결합 친화도를 갖는다. 그러한 양이온성 펩티드는 LPS에 반응하는 사이토킨 생성을 저해할 수 있으며, 다양한 정도로 치명적인 쇼크를 예방할 수 있다. 그러나, 그러한 효과가 LPS 및 LTA에 대한 펩티드의 결합에 기인하는 것인지 또는 숙주 세포와 펩티드의 직접적인 상호작용에 기인하는 것인지에 대해서는 밝혀지지 않았다. 미생물 또는 LPS와 같은 미생물 시그널링 분자에 의한 자극에 반응하여, 포유류 면역계(톨 유사 수용체 및 전사 인자 NFκB 포함)에 의해 이용되는 것과 유사한 조절 경로에 의해 양이온성 펩티드가 유도된다. 따라서, 양이온성 펩티드는 선천 면역에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 항바이러스 펩티드의 유도에 영향을 주는 돌연변이는 박테리아 자극에 반응하여 생존력을 저하시킬 수 있다. 또한, 항진균성 펩티드 발현 감소를 유도하는 드로소필라의 톨 경로의 돌연변이는 치명적인 진균류 감염에 대한 감수성을 증가시킨다. 사람의 경우, α-디펜신이 완전히 결핍되는 특이 과립 결핍 증후군 환자는 종종 심각한 박테리아 감염을 앓는다. 다른 증거로는 감염제에 의한 일부 펩티드의 유도성과, 염증 부위에 기록되는 매우 높은 농도 등이 있다. 또한, 양이온성 펩티드는 세포 이동을 조절하여 박테리아 감염에 대항하는 백혈구의 능력을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 2개의 인간 α-디펜신 펩티드인 HNP-1 및 HNP-2는 쥐 및 인간 T 세포 및 단핵구에 대한 직접적인 주화성 활성을 갖는 것으로 알려져 있고, 인간 β-디펜신은 CCR6과의 상호작용을 통해 미성숙 수지상 세포 및 메모리 T 세포에 대한 화학유인물질로서 작용하는 것으로 보인다. 마찬가지로, 돼지 양이온성 펩티드인 PR-39는 호중구에 대한 주화성인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 상이한 구조 및 조성의 펩티드가 이들 성질을 공유하는 지에 대해서는 분명하지 않다.
인간으로부터 유래한 것으로서 공지된 단 하나의 카텔리시딘은 골수양 전구체, 고환, 염증성 질환 중의 인간 각질세포 및 기도 상피세포에 의해 생성된다. 카텔리시딘 펩티드의 전형적인 특징은 카텔린 도메인이라고 하는 N-말단 프리프로(prepro) 영역에서의 서열 동일성 수준이 높다는 것이다. 카텔리시딘 펩티드는 자극시 활성 펩티드로 프로세싱되는 불활성 프로펩티드 전구체로서 저장된다.
관련 출원 데이타
본 출원은 참고로 인용한 2001년 12월 3일에 출원된 미국 특허 출원 제60/336,632호를 35 USC 119 (e) 하에 우선권으로 주장한다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 펩티드, 구체적으로 치료제로서 유효하고 미생물 감염에 기인한 병리에 관련된 약물 개발과 선천 면역 또는 항염증성 활성을 조절하기 위한 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 내독소 리포다당류, 리포테이콘산, CpG DNA 또는 다른 세포 성분(예, 미생물 또는 기타 세포 성분)에 의해 조절되고 양이온성 펩티드에 의해 영향을 받는 폴리뉴클레오티드 발현 패턴을 기초로 피험체의 패혈증 및/또는 염증을 차단 또는 감소시키는 신규 화합물을 스크리닝할 수 있는 독창적인 발견에 토대를 두고 있다. 또, 도구로서 양이온성 펩티드의 사용을 기초로 하여, 패혈증 반응을 촉발하지 않고 염증성 및/또는 패혈성 반응을 차단/완화시킬 수 있는 선천 면역의 선택적 증강제를 확인할 수 있다.
따라서, 일 구체예에서 1종 이상의 패혈증 또는 염증 유도제에 의해 조절되고 양이온성 펩티드에 의해 억제되는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 패턴을 확인하는 방법이 제공된다. 본 발명의 방법은 1종 이상의 패혈증 또는 염증 유도제와 폴리뉴클레오티드(들)를 접촉시키는 단계 및 동시에 또는 직후에 폴리뉴클레오티드(들)를 양이온성 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 양이온성 펩티드의 존재 및 부재 하에 발현차가 검출되며, 상향 조절 또는 하향 조절의 발현 변화는 패혈증 또는 염증 유도제에 의해 조절되고 양이온성 펩티드에 의해 억제되는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 패턴을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 상기 개시된 방법으로 확인된 폴리뉴클레오티드(들)를 제공한다. 패혈증 또는 염증성 조절제의 예로는 LPS, LTA 또는 CpG DNA 또는 미생물 성분(또는 이의 임의의 조합) 또는 관련 제제 등이 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 상기 개시된 방법으로 확인된 폴리뉴클레오티드를 제제와 조합하는 것을 포함하는 패혈증 또는 염증을 차단하는 제제를 확인하는 방법을 제공하며, 여기서 제제의 존재 하의 폴리뉴클레오티드의 발현은 제제의 부재 하의 발현과 비교하고 조절되며, 발현 조절은 염증성 또는 패혈성 반응에 영향을 준다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 1) 양이온성 펩티드의 존재 또는 부재 하에 LPS, LTA 및/또는 CpG DNA와 세포를 접촉시키고 2) 펩티드의 존재 및 부재 하에 세포에 대한 폴리뉴클레오티드 발현 패턴을 검출하여 염증성 또는 패혈성 반응의 억제를 위한 폴리뉴클레오티드 발현 패턴을 확인하는 방법을 제공한다. 펩티드의 존재 하에 얻은 패턴은 염증성 또는 패혈성 반응의 억제를 나타낸다. 또 다른 측면에서 펩티드의 존재 하에 얻은 패턴을 테스트 화합물의 패턴과 비교하여 유사한 패턴을 제공하는 화합물을 확인한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 전술한 방법으로 확인된 화합물을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 선천 면역에 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들)를 해당 제제와 접촉시켜 선천 면역을 높이는 제제를 확인하는 방법을 제공하며, 여기서 제제의 존재 하의 폴리뉴클레오티드 발현은 제제의 부재 하의 폴리뉴클레오티드의 발현과 비교하여 조절되며, 발현 조절로 선천 면역이 증강된다. 바람직하게는, 제제는 피험체의 패혈증 반응을 자극하지 않는다. 일 측면에서, 제제는 항염증성 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시킨다. 비제한적인 일례의 항염증성 폴리뉴클레오티드는 IL-1R 길항제 상동체 1 (AI167887), IL-10R 베타 (AA486393), IL-10R 알파 (U00672) TNF 수용체 구성원 1B (AA150416), TNF 수용체 구성원 5 (H98636), TNF 수용체 구성원 11b (AA 194983), HLA II의 IK 사이토킨 하향 조절인자(R39227), TGF-B 유도성 초기 성장 반응 2(AI473938), CD2(AA927710), IL-19(NM_013371) 또는 IL-10 (M57627) 등의 단백질을 암호화한다. 일 측면에서, 제제는 프로테아솜 서브유닛 26S(NM_013371)과 같이 NF-κB 활성화에 관련된 프로테아솜을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 감소시킨다. 일 측면에서, 제제는 단백질 키나제의 길항제로서 작용할 수 있다. 일 측면에서, 제제는 서열 번호 4-54로부터 선택된 펩티드이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 선천 면역을 선택적으로 증가시키는 화합물을 확인하기 위해 폴리뉴클레오티드 발현 패턴을 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명은 양이온성 펩티드의 존재 및 부재 하에 접촉한 세포에 대한 폴리뉴클레오티드 발현 패턴을 검출하는 단계[펩티드의 존재 하의 패턴은 선천 면역의 자극을 나타냄]; 테스트 화합물의 존재 하에 접촉한 세포에 대한 폴리뉴클레오티드 발현 패턴을 검출하는 단계[양이온성 펩티드의 존재 하에 관찰된 패턴과 유사한 테스트 화합물의 존재 하의 패턴은 선천 면역을 높이는 화합물을 나타냄]를 포함한다. 화합물은 피험체의 패혈성 반응을 자극하지 않는 것이 바람직하다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 감염되지 않은 피험체와 비교하여 표 50, 51 및/또는 52 중 2 이상의 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 발현 증가에 의해 예시되는 폴리뉴클레오티드 발현 패턴을 핵산 샘플 중에서 확인함으로써 피험체의 핵산 샘플로부터 포유류 피험체의 감염 상태를 추정하는 방법을 제공한다. 또한, 상기한 임의의 방법으로 얻은 폴리뉴클레오티드 발현 패턴도 포함된다.
또 다른 측면에서, CXCR-4의 길항제인 양이온성 펩티드가 제공된다. 또 다른 측면에 따르면, 테스트 펩티드의 존재 또는 부재 하에 T 세포를 SDF-1과 접촉시켜CXCR-4의 길항제인 양이온성 펩티드를 확인하고 주화성을 결정하는 방법이 제공된다. 테스트 펩티드의 존재 하의 주화성 감소는 그 펩티드가 CXCR-4의 길항제임을 나타낸다. 또한 양이온성 펩티드는 SDF-1 수용체 폴리뉴클레오티드(NM_013371)의 발현을 감소시키는 작용을 한다.
상기 개시된 모든 방법에 있어서, 본 발명의 화합물 또는 제제는 펩티드, 양이온성 펩티드, 펩티드 유사체, 화학적 화합물, 폴리펩티드, 핵산 분자 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 분리된 양이온성 펩티드를 제공한다. 본 발명의 분리된 양이온성 펩티드는 1문자 아미노산 코드를 사용한 하기 일반식 중 하나로 표시된다:
X1X2X3IX4PX4IPX5X2X1(서열 번호 4), 여기서 X1은 R, L 또는 K 중 1 또는 2개 이고, X2는 C, S 또는 A 중 1개이며, X3은 R 또는 P 중 1개이고, X4는 A 또는 V 중 1개이며, X5는 V 또는 W 중 1개이고;
X1LX2X3KX4X2X5X3PX3X1(서열 번호 11), 여기서 X1은 D, E, S, T 또는 N 중 1 또는 2개이고, X2는 P, G 또는 D 중 1 또는 2개이며, X3은 G, A, V, L, I 또는 Y 중 1개이고, X4는 R, K 또는 H 중 1개이며, X5는 S, T, C, M 또는 R 중 1개이고;
X1X2X3X4WX4WX4X5K (서열 번호 18), 여기서 X1은 A, P 또는 R로부터 선택된 1∼4개이고, X2는 1 또는 2개의 방향족 아미노산(F, Y 및 W)이며, X3은 P 또는 K 중1개이고, X4는 A, P, Y 또는 W로부터 선택된 0, 1 또는 2개이며, X5는 R 또는 P로부터 선택된 1∼3개이고;
X1X2X3X4X1VX3X4RGX4X3X4X1X3X1(서열 번호 25), 여기서 X1은 R 또는 K 중 1 또는 2개이고, X2는 극성 또는 하전된 아미노산(S, T, M, N, Q, D, E, K, R 및 H)이며, X3은 C, S, M, D 또는 A이고 X4는 F, I, V, M 또는 R이며;
X1X2X3X4X1VX5X4RGX4X5X4X1X3X1(서열 번호 32), 여기서 X1은 R 또는 K 중 1 또는2개이고, X2는 극성 또는 하전된 아미노산(S, T, M, N, Q, D, E, K, R 및 H)이며, X3은 C, S, M, D 또는 A 중 1개이고, X4는 F, I, V, M 또는 R 중 1개이며, X5는 A, I, S, M, D 또는 R 중 1개이고;
KX1KX2FX2KMLMX2ALKKX3(서열 번호 39), 여기서 X1은 극성 아미노산(C, S, T, M, N 및 Q)이고, X2는 A, L, S 또는 K 중 1개이며 X3는 G, A, V, L, I, P, F, S, T, K 및 H로부터 선택된 1∼17개의 아미노산이며;
KWKX2X1X1X2X2X1X2X2X1X1X2X2IFHTALKPISS (서열 번호 46), 여기서 X1은 소수성 아미노산이고 X2는 친수성 아미노산이다.
또한, 추가의 측면에 따라서 본 발명은 분리된 양이온성 펩티드 KWKSFLRTFKSPVRTVFHTALKPISS (서열 번호 53) 및 KWKSYAHTIMSPVRLVFHTALKPISS (서열 번호 54)를 제공한다.
또한, 본 발명의 양이온성 펩티드를 암호화하는 핵산 서열, 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터와 그 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 폴리뉴클레오티드 발현을 조절(예컨대, 상향 및/또는 하향 조절)하는 능력을 보유하여 패혈증 및 염증성 반응 및/또는 선천 면역을 조절하는, 일군의 일반식을 특징으로 하는 신규한 양이온성 펩티드를 제공한다.
본 명세서에 사용된 "선천 면역"은 병원체에 의한 침입에 대해 유기체가 자체 방어하는 자연력을 의미한다. 본 명세서에 사용된 병원체 또는 미생물로는 박테리아, 진균류, 기생체 및 바이러스 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 선천 면역은, 실질적으로 특이성, 증폭성 및 자가 대 비자가의 구별을 특징으로 하는 항체 및/또는 면역 림프구를 기초로 한 방어 기전을 유기체가 형성하는 후천/획득 면역과는 대조적이다. 선천 면역은 광범위하고 비특이적인 면역을 제공하며, 이전 노출시의 면역 기억을 갖지 않는다. 선천 면역의 특징은 각종 유효 병원체에 대한 효과, 이전의 병원체에의 노출과의 무관성 및 즉각적인 효과(유발되는 데 수일 내지 수주가 걸리는 특이적 면역 반응과는 대조적임)이다. 또한, 선천 면역은 암, 염증성 질환, 다발성 경화증, 각종 바이러스 감염 등과 같은 기타 질병에 영향을 주는 면역 반응을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "양이온성 펩티드"는 길이가 약 5∼약 50개인 아미노산으로부터 유래한 아미노산 서열을 의미한다. 일 측면에서, 본 발명의 양이온성 펩티드는 길이가 약 10∼약 35 아미노산이다. 펩티드가 9.0 이상의 pKa를 갖는 충분히 양으로 하전된 아미노산을 포함하는 경우, 그 펩티드를 "양이온" 펩티드라고 한다. 통상적으로 양이온성 펩티드의 아미노산 잔기 중 2개 이상, 예컨대 리신 및 아르기닌이 양으로 하전될 것이다. "양으로 하전된"은 pH 7.0에서 순 양전하를 갖는 아미노산 잔기의 측쇄를 의미한다. 본 발명에 따라 재조합으로 생성될 수 있는 자연 양이온성 항미생물 펩티드의 예로는 디펜신, 카텔리시딘, 마게이닌, 멜리틴 및 세크로핀, 박테네신, 인돌리시딘, 폴리페뮤신, 타키플레신 및 이의 유사체 등이 있다. 각종 유기체는 양이온성 펩티드를 미생물에 대한 비특이적 방어 기전의 일부로서 사용되는 분자로 만들 수 있다. 이들 펩티드는 분리시, 박테리아, 진균류 및 일부 엔벨로프형 바이러스를 비롯한 각종 미생물에 대해 독성을 나타낸다. 양이온성 펩티드가 여러 병원체에 대해 작용하지만, 명백한 예외와 다양한 정도의 독성이 존재한다. 그러나, 본 출원에서는 미생물에 대한 독성은 없지만 선천 면역의 자극을 통해 감염에 대해 보호하는 능력을 갖는 추가의 양이온성 펩티드를 밝혀내었으며, 본 발명은 항미생물 활성을 갖는 양이온성 펩티드에 한정되지 않는다. 실제로, 본 발명에 유용한 여러 펩티드는 항미생물 활성을 갖지 않는다.
당업계에 공지된 양이온성 펩티드로는 예를 들어 인간 카텔리시딘 LL-37, 소 호중구 펩티드인 인돌리시딘과 박테네신의 소 변형체인 Bac2A 등이 있다.
LL-37 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES (서열 번호 1)
인돌리시딘 ILPWKWPWWPWRR-NH2(서열 번호 2)
Bac2A RLARIVVIRVAR-NH2(서열 번호 3)
선천 면역에서 면역 반응은 항원에 의존하지 않는다. 선천 면역 과정은 전술한 바와 같은 분비 분자 및 세포 성분의 생성을 포함할 수 있다. 선천 면역에서 병원체는 배선에서 암호화된 수용체에 의해 인식된다. 톨 유사 수용체는 특이성이 광범위하고 여러 병원체를 인식할 수 잇다. 양이온성 펩티드가 면역 반응에 존재하는 경우, 이들 펩티드는 병원체에 대한 숙주 반응에 도움이 된다. 면역 반응의 변화는, 감염 부위로의 면역 세포의 소집을 촉진하는 케모카인의 방출을 유도한다.
케모카인 또는 화학유인물질 사이토킨은 주화성 및 기타 전염증성 현상을 매개하는 면역 인자의 서브그룹이다(Schall, 1991, Cytokine 3: 165-183 참조). 케모카인은 약 70∼80개 길이의 잔기로 된 작은 분자로서, 일반적으로 2개의 서브그룹 α 및 β로 분류할 수 있다. α는 단일 아미노산에 의해 분리되는 2개의 N-말단 시스테인(CxC)을 갖고 β는 N 말단에서 2개의 인접 시스테인(CC)을 갖는다. RANTES, MIP-1α 및 MIP-1 β는 β 서브그룹의 구성원이다(Horuk, R., 1994, Trends Pharmacol Sci, 15: 159-165; Murphy, P. M., 1994, Annu. Rev. Immunol., 12: 593-633에 검토되어 있음). β케모카인인 RANTES, MCP-1, 및 MCP-3의 아미노 말단은 이들 케모카인이 유도하는 세포 이동 및 염증 매개에 연루되어 있다. MCP-1의 아미노 말단 8개 잔기, MCP-3의 아미노 말단 9개 잔기 및 RANTES의 아미노 말단 8개 잔기의 결실과 RANTES의 아미노 말단으로의 메티오닌의 첨가는 그 천연 대응부에 의해 자극되는 효소 방출, 주화성 및/또는 칼슘 이동에 대해 길항작용을 한다는 관찰 결과로부터 그러한 연관성이 시사된다(Gong et al., 1996 J. Biol. Chem. 271: 10521-10527; Proudfoot et al., 1996J. Biol. Chem. 271: 2599-2603). 또한,α 케모카인 유사 주화성 활성은 각각 Tyr28 및 Arg30의 류신 및 발린으로의 이중 돌연변이를 통해 MCP-1로 도입되는 데, 이는 단백질의 내부 영역이 주화성 활성을 조절하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 제시하는 것이다(Beall et al. , 1992, J. Biol. Chem. 267:3455-3459).
모든 케모카인의 단량체 형태는 유의적인 구조적 상동성을 상당히 공유하는 것을 특징으로 하지만, α 및 β 그룹의 4차 구조는 다르다. β 및 α 케모카인의 단량체 구조는 매우 유사하지만, 2개의 그룹의 이량체 구조는 완전히 다르다. 오직 하나의 N 말단 시스테인을 보유하는 추가의 케모카인인 림포탁틴이 확인되었으며, 케모카인의 추가의 서브그룹(γ)을 나타낼 수 있다(Yoshida et al., 1995, FEBS Lett. 360: 155-159; and Kelner et al., 1994, Science 266: 1395-1399).
케모카인에 대한 수용체는 G-단백질 커플링된 7 경막 도메인 수용체(GCR)의 거대 패밀리에 속한다(Horuk, R., 1994, Trends Pharmacol. Sci. 15: 159-165; and Murphy, P. M., 1994, Annu. Rev. Immunol. 12: 593-633의 검토 문헌 참조). 경쟁 결합 및 교차 탈감착화 연구 결과, 케모카인 수용체는 리간드 결합에 있어서 상당한 무차별성을 나타내는 것으로 확인되었다. β 케모카인 수용체 사이의 무차별성을 입증하는 예로는 RANTES 및 MIP-1α에 결합하는 CC CKR-1 (Neote et al., 1993, Cell 72: 415-425), RANTES, MIP-1α, 및 MCP-1에 결합하는 CC CKR-4(Power et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:19495-19500), 및 RANTES, MIP-1α, 및 MIP-1β에 결합하는 CC CKR-5 (Alkhatib et al., 1996, Science, in press and Dragic et al., 1996, Nature 381: 667-674) 등이 있다. 적혈구는 α 및 β 케모카인에 결합하는 (Duffy 항원으로 알려진) 수용체를 보유한다(Horuk et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:17730-17733; Neote et al., 1994, Blood 84: 44-52; and Neote et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 12247-12249). 따라서, 케모카인 및 그 수용체 사이의 서열 및 구조적 상동성 사건은 수용체-리간드 상호작용에 있어서 일부 중복을 가능하게 한다.
일 측면에서, 본 발명은 숙주 세포 상에서 직접 작용함으로써 패혈증 및 염증 반응을 감소시키기 위해 사용되는 본 발명의 양이온성 펩티드를 비롯한 화합물의 용도를 제공한다. 이 측면에 따르면, 1종 이상의 패혈증 또는 염증 유도제에 의해 조절되는 폴리뉴클레오티드(들)의 확인 방법이 제공되며, 상기 조절은 양이온성 펩티드에 의해 변경된다. 그러한 패혈증 또는 염증 유도제의 비제한적인 예로는 내독소 리포다당류(LPS), 리포테이콘산(LTA) 및/또는 CpG DNA 또는 온전한 박테리아 또는 기타 박테리아 성분 등이 있다. 폴리뉴클레오티드(들)를 패혈증 또는 염증 유도제와 접촉시키고 동시에 또는 직후에 양이온성 펩티드와 추가로 접촉시켜 확인을 실시한다. 양이온성 펩티드의 존재 및 부재 하의 폴리뉴클레오티드 발현이 관찰되며, 발현 변화는 패혈증 또는 염증 유도제에 의해 조절되고 양이온성 펩티드에 의해 억제되는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 패턴을 나타낸다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 그 방법에 의해 확인된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일단 확인되면, 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 주어 패혈증 또는 염증을 차단할 수 있는 화합물을 스크리닝하는 방법에 그러한 폴리뉴클레오티들 사용할 수 있다. 발현에 미치는 영향은 발현의 상향 조절 또는 하향 조절일 수 있다. 또한 본발명은, 패혈증 반응을 촉발하지 않고 염증성 또는 패혈성 반응을 차단 또는 완화시킬 수 있는 화합물을 확인함으로써 선천 면역의 증강제를 확인하는 방법을 제공한다. 또, 본 발명은 상기 방법에 사용되거나 확인된 화합물을 제공한다.
후보 화합물은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 비롯한 각종 공급원으로부터 얻는다. 예를 들어, 무작위화된 올리고뉴클레오티드 및 올리고펩티드의 발현을 비롯한 각종 유기 화합물 및 생체분자의 무작위 및 지정 합성을 위한 다수의 수단이 이용가능하다. 대안적으로, 박테리아, 진균류, 식물 및 동물 추출물의 형태로 천연 화합물의 라이브러리를 이용하거나 또는 용이하게 생성한다. 또한, 천연 또는 합성에 의해 생성된 라이브러리 및 화합물을, 통상적인 화학적, 물리적 및 생화학적 방법을 이용하여 쉽게 변형시킬 수 있으며, 조합 라이브러리를 생성하는 데 사용할 수 있다. 기지의 약리제에 대해 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화 등과 같은 지정 또는 무작위 화학 변형을 가하여 구조적 유사체를 얻을 수 있다. 후보 제제는, 비제한적인 예로서 펩티드, 펩티드 유사체, 당류, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 화학적 화합물, 유도체, 구조적 유사체 또는 이의 조합을 비롯한 생체분자 중에서 발견된다.
스크리닝 분석 성분들의 항온처리는, 테스트 화합물과 해당 폴리뉴클레오티드의 접촉을 가능하게 하는 조건을 포함한다. 접촉은 용액, 고상 또는 세포에서의 접촉을 포함한다. 테스트 화합물은 경우에 따라 다수의 화합물을 스크리닝하기 위한 조합 라이브러리일 수 있다. 본 발명의 방법에서 확인된 화합물에 대해, 화합물의 검출에 일반적으로 적용되는 임의의 방법으로 용액 중에서 또는 고상 지지체에결합시킨 후에 추가로 평가, 검출, 클로닝, 서열결정 등을 실시할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 방법에서는 패혈증 또는 염증 과정에서 필수적인 폴리뉴클레오티드를 검출 및 정위하는 데 양이온성 펩티드를 이용한다. 일단 확인되면, 양이온성 펩티드의 존재 및 부재 하에 발현을 관찰하여 폴리뉴클레오티드 발현 패턴을 얻는다. 양이온성 펩티드의 존재 하에 얻은 패턴은, 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하여 패혈증 또는 염증을 차단할 수 있는 추가의 화합물을 확인하는 데 유용하다. 비펩티드성 화학물질 및 펩티드 유사체는 수용체 및 효소 결합 부위에 결합하는 펩티드의 능력을 모방할 수 있으므로, 생물학적 반응을 차단하거나 자극하는 데 사용될 수 있다. 해당하는 추가의 화합물이 양이온성 펩티드의 존재 하의 발현 패턴과 유사한 폴리뉴클레오티드 발현 패턴을 제공하는 경우, 그 화합물은 또한 패혈증 또는 선천 면역 반응의 조절에 유용하다. 이러한 방식으로, 패혈증 및 염증의 기지 억제제이고 선천 면역의 증강제인 본 발명의 양이온성 펩티드는, 패혈증 및 염증을 억제하고 선천 면역을 증가시키는 추가의 화합물을 확인하는 도구로서 유용하다.
하기 실시예에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 LPS에 의해 조절되는 폴리뉴클레오티드의 발현을 감소시키는 광범위한 능력을 갖는다. 높은 혈중 농도의 내독소는 발열 및 백혈구의 수 증가와 같이 심각한 감염 또는 염증 과정에서 확인되는 다수의 증상의 원인이 된다. 내독소는 그람 음성 박테리아의 세포벽 성분이며, 패혈증의 병태생리의 유효 촉발인자이다. 염증과 패혈증의 기본 기전은 관련이 있다. 실시예 1에서는 폴리뉴클레오티드 어레이를 이용하여 상피 세포의 전사 반응에 대한 양이온성 펩티드의 영향을 결정하였다. 구체적으로, LPS에 의해 유도되는 14,000 이상의 다른 특이적 폴리뉴클레오티드 프로브에 대한 효과가 관찰되었다. 표는 대조군 세포와 비교하여 펩티드로 처리한 세포에서 관찰되는 변화를 보여준다. 결과의 데이타로부터, 펩티드가 LPS에 의해 유도되는 폴리뉴클레오티드 발현을 감소시키는 능력을 갖는다는 것이 확인되었다.
유사하게 실시예 2에서는 본 발명의 펩티드가 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 산물에 의한 면역 세포의 자극을 중화시킬 수 있다는 것을 보여준다. 또한, 표 24에 제시된 바와 같이, TLR1 (AI339155), TLR2 (T57791), TLR5 (N41021), TNF 수용체-관련 인자 2 (T55353), TNF 수용체-관련 인자 3 (AA504259), TNF 수용체 상과 구성원 12 (W71984), TNF 수용체 상과 구성원 17 (AA987627), 작은 유도성 사이토킨 서브패밀리 B 구성원 6 (AI889554), IL-12R 베타 2 (AA977194), IL-18 수용체 1 (AA482489)와 같은 일부 전염증성 폴리뉴클레오티드가 양이온성 펩티드에 의해 하향조절되며, 표 25에 제시된 바와 같이 IL-1R 길항제 상동체 1 (AI167887), IL-10R 베타 (AA486393), TNF 수용체 구성원 1B (AA150416), TNF 수용체 구성원 5 (H98636), TNF 수용체 구성원 11b (AA194983), HLA II의 IK 사이토킨 하향 조절인자 (R39227), TGF-B 유도성 초기 성장 반응 2(AI473938), 또는 CD2 (AA927710)와 같은 항염증성 폴리뉴클레오티드는 양이온성 펩티드에 의해 상향 조절된다. 이들 결과의 관련성 및 응용성은 마우스에의 생체내 적용으로 확인된다. 실시예 3은 그러한 펩티드가 일반적으로 접촉하는 숙주 세포에 대한 독성을 나타내지 않는다는 것을 입증한다.
실시예 4에서는 본 발명의 양이온성 펩티드가 대식세포 및 상피 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현을 변경한다는 것을 확인할 수 있다. 본 실시예의 결과는 전염증성 폴리뉴클레오티드가 양이온성 펩티드에 의해 하향 조절되는 반면에(표 24), 항염증성 폴리뉴클레오티드는 양이온성 펩티드에 의해 상향 조절된다는 것을 보여준다(표 25).
또 다른 측면에서, 본 발명은 선천 면역을 증가시키는 제제를 확인하는 방법을 제공한다. 이 방법에서, 선천 면역과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 숙주 폴리뉴클레오티드(들)를 해당 제제와 접촉시킨다. 제제의 존재 및 부재 하에 폴리뉴클레오티드의 발현을 결정한다. 발현을 비교하고, 특이적 발현 조절은 선천 면역 증가를 나타낸다. 또 다른 측면에서, 전염증성 사이토킨 TNF-α의 상향 조절의 결여로 확인되는 바와 같이 제제는 패혈성 반응을 자극하지 않는다. 또 다른 측면에서, 제제는 염증성 또는 패혈성 반응을 감소 또는 차단한다. 또 다른 측면에서, 제제는 IL-1β, IL-6, IL-12 p40, IL-12 p70, 및 IL-8(이에 국한되지 않음)을 비롯한 인터류킨 및/또는 TNF-α의 발현을 감소시킨다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 양이온성 펩티드에 의한 직접적인 폴리뉴클레오티드 조절 방법과, 선천 면역의 요소를 자극하기 위한 양이온성 펩티드를 비롯한 화합물의 용도를 제공한다. 이 측면에서, 본 발명은 선천 면역을 증가시키는 화합물을 확인하기 위한 폴리뉴클레오티드 발현 패턴의 확인 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 있어서, 양이온성 펩티드의 존재 및 부재 하에 접촉한 세포에 대한 폴리뉴클레오티드 발현 패턴을 초기에 검출할 수 있다. 펩티드의 존재 하에 폴리뉴클레오티드 발현으로부터 생성되는 패턴은 선천 면역의 자극을 나타낸다. 폴리뉴클레오티드 발현 패턴은 테스트 화합물의 존재 하에 검출되며, 양이온성 펩티드의 존재 하에 관찰되는 패턴과 유사한 테스트 화합물의 존재 하의 패턴은 그 화합물이 선천 면역을 증가시키는 화합물임을 나타낸다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 방법에서 확인된 화합물을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 화합물은 케모카인 또는 케모카인 수용체 발현을 자극한다. 케모카인 또는 케모카인 수용체로는 CXCR4, CXCR1, CXCR2, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, MIP-1 알파, MDC, MIP-3 알파, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, 및 RANTES 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또 다른 구체예에서, 화합물은 펩티드, 펩티드 유사체, 화학적 화합물 또는 핵산 분자이다.
또 다른 측면에서, 폴리뉴클레오티드 발현 패턴은 전염증성 폴리뉴클레오티드의 발현을 포함한다. 그러한 전염증성 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예로는 링 핑거 단백질 10 (D87451), 세린/트레오닌 단백질 키나제 MASK (AB040057), KIAA0912 단백질 (AB020719), KIAA0239 단백질 (D87076), RAP1, GTPase 활성화 단백질 1 (M64788), FEM-1-유사 세포사 수용체 결합 단백질 (AB007856), 카텝신 S (M90696), 가상 단백질 FLJ20308 (AK000315), pim-1 종양유전자 (M54915), 프로테아솜 서브유닛 베타 타입 5 (D29011), KIAA0239 단백질 (D87076), 뮤신 5 서브타입 B 기관기관지 (AJ001403), cAMP 반응 요소-결합 단백질 CREBPa, 인테그린 알파 M (J03925), Rho-관련 키나제 2 (NM_004850), PTD017 단백질 (AL050361), 불명 유전자(AK001143, AK034348, AL049250, AL16199, AL031983) 및 이의 임의의 조합 등이있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또 다른 측면에서 폴리뉴클레오티드 발현 패턴은 세포 표면 수용체의 발현을 포함하며, 그러한 세포 표면 수용체의 비제한적인 예로는 레틴산 수용체 (X06614), G 단백질-커플링된 수용체 (Z94155, X81892, U52219, U22491, AF015257, U66579) 케모카인 (C-C 모티프) 수용체 7 (L31584), 종양 괴사 인자 수용체 상과 구성원 17 (Z29575), 인터페론 감마 수용체 2 (U05875), 사이토킨 수용체-유사 인자 1 (AF059293), 클래스 I 사이토킨 수용체 (AF053004), 응고 인자 II (트롬빈) 수용체-유사 2 (U92971), 백혈병 억제 인자 수용체 (NM_002310), 인터페론 감마 수용체 1 (AL050337) 등이 있다.
예를 들어, 양이온성 펩티드는, 주로 전염증 반응을 하향 조절하고 및/또는 항염증 반응을 상향조절하여 감염제의 시그널링 분자에 대한 숙주 반응을 중화시킬 뿐 아니라 숙주 세포의 전사 반응을 변형시킬 수 있다는 것이 표 1 내지 15에서 확인된다. 실시예 5는, 양이온성 펩티드가 감염 부위로의 면역 세포의 소집을 촉진하는 케모카인의 방출을 유도하여 병원체에 대한 숙주 반응을 보조할 수 있다는 것을 보여준다. 이 결과는 마우스에서의 생체내 적용으로 확인된다.
양이온성 펩티드는, 예컨대 감염 부위로의 면역 세포의 소집을 촉진하는 선택적 전염증성 반응을 유도하지만 잠재적으로 유해한 전염증성 사이토킨을 유도하지 않음으로써 숙주 면역 반응의 조절을 보조한다는 점에서 병원체에 대한 숙주 반응에 실질적인 영향을 준다는 것이 하기 실시예로부터 확인된다. 패혈증은 부분적으로는 감염제에 대한 압도적인 전염증성 반응에 의해 유발되는 것으로 보인다. 양이온성 펩티드는 항염증성 반응을 유도하고 잠재적으로 유해한 전염증성 반응을 저해하여 숙주가 병원체에 대해 "균형" 반응하도록 보조한다.
실시예 7에서는 선택된 MAP 키나제의 활성화를 조사하여 세포와 양이온성 펩티드의 상호작용 효과 이면의 기본 기전을 연구하였다. 대식세포는 박테리아 감염에 반응하여 MEK/ERK 키나제를 활성화시킨다. MEK는, 활성화시 하류 키나제 ERK(세포외 조절된 키나제)를 인산화시킨 다음, 이량체화하고 핵으로 전좌하여, 여기서 Elk-1과 같은 전사 인자를 활성화시켜 폴리뉴클레오티드 발현을 변형시키는 MAP 키나제 키나제이다. MEK/ERK 키나제는 대식세포 내에서 살모넬라(Salmonella)의 복제를 손상시키는 것으로 밝혀졌다. MEK 키나제 및 NADPH 옥시다제에 의한 시그널 변환은 세포내 병원체에 대한 선천 숙주 방어에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 양이온성 펩티드는, 하기 개시된 바와 같이 MAP 키나제에 영향을 미침으로써 박테리아 감염에 대한 효과를 나타낸다. 양이온성 펩티드는 키나제에 직접 영향을 줄 수 있다. 표 21은 펩티드에 반응하는 MAP 키나제 폴리뉴클레오티드 발현 변화를 입증하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 키나제는 MAP 키나제 키나제 6 (H070920), MAP 키나제 키나제 5 (W69649), MAP 키나제 7 (H39192), MAP 키나제 12 (AI936909) 및 MAP 키나제-활성화된 단백질 키나제 3 (W68281)을 포함한다.
또 다른 방법에서, 본 발명의 방법들을 함께 사용하여 복수의 특징을 갖는 제제, 즉 항염증/항패혈증 활성과 생체내에서 케모카인을 유도하여 부분적으로 선천 면역을 증가시키는 능력을 갖는 펩티드를 확인할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 비감염 피험체와 비교하여 표 55에서 2개 이상의 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 발현 증가로 예증되는 폴리뉴클레오티드발현 패턴을 핵산 샘플 중에서 확인하여 피험체의 핵산 샘플로부터 포유류 피험체의 감염 상태를 추정하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 비감염 피험체와 비교하여 표 56 또는 표 57에서 2개 이상의 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 발현 증가로 예증되는 폴리뉴클레오티드 발현 패턴을 핵산 샘플 중에서 확인하여 피험체의 핵산 샘플로부터 포유류 피험체의 감염 상태를 추정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 감염 상태는 감염제 또는 이로부터 유도된 시그널링 분자에 기인하는 것이며, 감염제의 비제한적인 예로는 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아, 바이러스, 진균류 또는 기생체 제제 등이 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 방법으로 확인된 감염 상태의 피험체의 폴리뉴클레오티드 발현 패턴을 제공한다. 일단 확인되면, 그러한 폴리뉴클레오티드는 감염제 또는 시그널링 분자의 존재 또는 활성과 관련된 증상의 진단 방법에 유용하다.
하기 실시예 10은 본 발명의 이러한 측면을 입증한다. 구체적으로, 표 61은 MEK 및 NADPH 옥시다제 억제제가 박테리아 복제를 제한할 수 있다는 것을 입증한다(에스.티피뮤리움(S.typhimurium)에 의한 IFN-γ감작된 대식세포의 감염은 MEK 키나제를 촉발한다). 이것은 숙주 세포 시그널링 분자를 변화시켜 박테리아 생존에 영향을 주는 방법의 일례이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 간질 유도된 인자-1(SDF-1)이 유도하는 T 세포의 주화성을 억제하는 화합물이 제시된다. SDF-1 수용체의 발현을 감소시키는 화합물도 또한 제시된다. 또 그러한 화합물은 CXCR-4의 길항제 또는 억제제로서 작용할 수 있다. 본 발명의 일 측면에 따라 CXCR-4의 길항제인 양이온성 펩티드가 제공된다. 본 발명의 또 다른 측면에 따라 CXCR-4의 길항제인 양이온성 펩티드를 확인하는 방법이 제공된다. 이 방법은 테스트 펩티드의 존재 또는 부재 하에 SDF-1과 T 세포를 접촉시키는 단계 및 주화성을 측정하는 단계를 포함한다. 테스트 펩티드의 존재 하에 주화성의 감소는 그 펩티드가 CXCR-4의 길항제임을 나타낸다. 그러한 화합물 및 방법은 HIV 환자에서 치료용으로 유용하다. 이들 유형의 화합물과 이의 유용성은, 예를 들어 실시예 11에서 입증된다(또한 표 62, 63 참조). 본 실시예에서, 양이온성 펩티드는 세포 이동을 억제하여 항바이러스 활성을 나타내는 것으로 확인된다.
일 구체예에서, 본 발명은 하기 식(식 A)의 아미노산 서열을 갖는 분리된 양이온성 펩티드를 제공한다:
X1X2X3IX4PX4IPX5X2X1(서열 번호 4), 여기서 X1은 R, L 또는 K 중 1 또는 2개이고, X2는 C, S 또는 A 중 1개이며, X3은 R 또는 P 중 1개이고, X4는 A 또는 V 중 1개이며 X5는 V 또는 W 중 1개이다. 본 발명의 펩티드의 비제한적인 예로는 LLCRIVPVIPWCK (서열 번호 5), LRCPIAPVIPVCKK (서열 번호 6), KSRIVPAIPVSLL (서열 번호 7), KKSPIAPAIPWSR (서열 번호 8), RRARIVPAIPVARR (서열 번호 9) 및 LSRIAPAIPWAKL (서열 번호 10) 등이 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기 식(식 B)의 아미노산 서열을 갖는 분리된 선형 양이온성 펩티드를 제공한다:
X1LX2X3KX4X2X5X3PX3X1(서열 번호 11), 여기서 X1은 D, E, S, T 또는 N 중 1또는 2개이고, X2는 P, G 또는 D 중 1 또는 2개이며, X3은 G, A, V, L, I 또는 Y 중 1개이며, X4는 R, K 또는 H 중 1개이고, X5는 S, T, C, M 또는 R 중 하나이다. 본 발명의 펩티드의 비제한적인 예로는 DLPAKRGSAPGST (서열 번호 12), SELPGLKHPCVPGS (서열 번호 13), TTLGPVKRDSIPGE (서열 번호 14), SLPIKHDRLPATS (서열 번호 15), ELPLKRGRVPVE (서열 번호 16) 및 NLPDLKKPRVPATS (서열 번호 17) 등이 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기 식(식 C)의 아미노산 서열을 갖는 분리된 선형 양이온성 펩티드를 제공한다:
X1X2X3X4WX4WX4X5K (서열 번호 18)[이 식은 CP12a 및 CP12d를 포함함], 여기서 X1은 A, P 또는 R로부터 선택된 1∼4개이고, X2는 1 또는 2개의 방향족 아미노산(F, Y 및 W)이며, X3은 P 또는 K 중 1개이고, X4는 A, P, Y 또는 W로부터 선택된 0, 1 또는 2개이며, X5는 R 또는 P로부터 선택된 1∼3개이다. 본 발명의 펩티드의 비제한적인 예로는 RPRYPWWPWWPYRPRK (서열 번호 19), RRAWWKAWWARRK (서열 번호 20), RAPYWPWAWARPRK (서열 번호 21), RPAWKYWWPWPWPRRK (서열 번호 22), RAAFKWAWAWWRRK (서열 번호 23) 및 RRRWKWAWPRRK (서열 번호 24) 등이 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기 식(식 D)의 아미노산 서열을 갖는 분리된 16량체 양이온성 펩티드를 제공한다:
X1X2X3X4X1VX3X4RGX4X3X4X1X3X1(서열 번호 25), 여기서 X1은 R 또는 K 중 1 또는2개이고, X2는 극성 또는 하전된 아미노산(S, T, M, N, Q, D, E, K, R 및 H)이며, X3은 C, S, M, D 또는 A이고 X4는 F, I, V, M 또는 R이다. 본 발명의 펩티드의 비제한적인 예로는 RRMCIKVCVRGVCRRKCRK (서열 번호 26), KRSCFKVSMRGVSRRRCK (서열 번호 27), KKDAIKKVDIRGMDMRRAR (서열 번호 28), RKMVKVDVRGIMIRKDRR (서열 번호 29), KQCVKVAMRGMALRRCK (서열 번호 30) 및 RREAIRRVAMRGRDMKRMRR (서열 번호 31) 등이 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기 식(식 E)의 아미노산 서열을 갖는 분리된 16량체 양이온성 펩티드를 제공한다:
X1X2X3X4X1VX5X4RGX4X5X4X1X3X1(서열 번호 32), 여기서 X1은 R 또는 K 중 1 또는2개이고, X2는 극성 또는 하전된 아미노산(S, T, M, N, Q, D, E, K, R 및 H)이며, X3은 C, S, M, D 또는 A 중 1개이고, X4는 F, I, V, M 또는 R 중 1개이며, X5는 A, I, S, M, D 또는 R 중 하나이다. 본 발명의 펩티드의 비제한적인 예로는 RTCVKRVAMRGIIRKRCR (서열 번호 33), KKQMMKRVDVRGISVKRKR (서열 번호 34), KESIKVIIRGMMVRMKK (서열 번호 35), RRDCRRVMVRGIDIKAK (서열 번호 36), KRTAIKKVSRRGMSVKARR (서열 번호 37) 및 RHCIRRVSMRGIIMRRCK (서열 번호 38) 등이 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기 식(식 F)의 아미노산 서열을 갖는 분리된 장쇄 양이온성 펩티드를 제공한다:
KX1KX2FX2KMLMX2ALKKX3(서열 번호 39), 여기서 X1은 극성 아미노산(C, S, T, M, N 및 Q)이고; X2는 A, L, S 또는 K 중 1개이며 X3는 G, A, V, L, I, P, F, S, T, K 및 H로부터 선택된 1∼17개의 아미노산이다. 본 발명의 펩티드의 비제한적인 예로는 KCKLFKKMLMLALKKVLTTGLPALKLTK (서열 번호 40), KSKSFLKMLMKALKKVLTTGLPALIS (서열 번호 41), KTKKFAKMLMMALKKVVSTAKPLAILS (서열 번호 42), KMKSFAKMLMLALKKVLKVLTTALTLKAGLPS (서열 번호 43), KNKAFAKMLMKALKKVTTAAKPLTG (서열 번호 44) 및 KQKLFAKMLMSALKKKTLVTTPLAGK (서열 번호 45) 등이 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기 식(식 G)의 아미노산 서열을 갖는 분리된 장쇄 양이온성 펩티드를 제공한다:
KWKX2X1X1X2X2X1X2X2X1X1X2X2IFHTALKPISS (서열 번호 46), 여기서 X1은 소수성 아미노산이고 X2는 친수성 아미노산이다. 본 발명의 펩티드의 비제한적인 예로는 KWKSFLRTFKSPVRTIFHTALKPISS (서열 번호 47), KWKSYAHTIMSPVRLIFHTALKPISS (서열 번호 48), KWKRGAHRFMKFLSTIFHTALKPISS (서열 번호 49), KWKKWAHSPRKVLTRIFHTALKPISS (서열 번호 50), KWKSLVMMFKKPARRIFHTALKPISS (서열 번호 51) 및 KWKHALMKAHMLWHMIFHTALKPISS (서열 번호 52) 등이 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기 식의 아미노산 서열을 갖는 분리된 양이온성 펩티드를 제공한다:
KWKSFLRTFKSPVRTVFHTALKPISS (서열 번호 53) 또는
KWKSYAHTIMSPVRLVFHTALKPISS (서열 번호 54)
본 명세서 중에 사용된 용어 "분리된"은 다른 단백질, 지질 및 핵산(예컨대, 생체내에서 생성된 펩티드가 자연적으로 회합되어 있는 세포 성분)이 실질적으로 없는 펩티드를 의미한다. 바람직하게는, 펩티드는 적어도 70 중량%, 80 중량% 순수하고, 가장 바람직하게는 90 중량% 순수하다.
또한, 본 발명은 나열된 폴리펩티드의 유사체, 유도체, 보존성 변이체 및 양이온성 펩티드 변형체를 포함하지만, 단 유사체, 유도체, 보존성 변이체 또는 변형체는 선천 면역을 증가시키는 검출가능한 활성을 갖거나 또는 항염증 활성을 보유해야 한다. 유사체, 유도체, 변이체 또는 변형체는, 이들이 유도된 펩티드의 활성과 동일한 활성을 보유해야 하는 것은 아니다.
양이온성 펩티드 "변형체"는 기준 양이온성 펩티드의 변형형 펩티드를 의미한다. 예를 들어, 용어 "변형체"는, 발현 라이브러리에서 기준 펩티드의 하나 이상의 아미노산이 치환된 양이온성 펩티드를 포함한다. 용어 "기준" 펩티드는 변형체, 유도체, 유사체 또는 보존성 변이체가 유도된 본 발명의 임의의 양이온성 펩티드(예, 상기 식에서 정의한 바와 같은 펩티드)를 의미한다. 용어 "유도체"에는 2개의 양이온성 펩티드 각각의 일부(예, 2개의 양이온성 펩티드 각각의 30∼80%)를 적어도 포함하는 하이브리드 펩티드가 포함된다. 하나 이상의 아미노산이 본 명세서에 열거한 펩티드 서열로부터 결실된 펩티드도 포함되지만, 단 그 유도체는 선천 면역을 증가시키는 활성을 보유하거나 또는 항염증 활성을 보유해야 한다. 따라서, 여전히 유용성을 갖는 더 작은 활성 분자를 생성할 수 있다. 예를 들어, 펩티드의 항염증 활성 또는 선천 면역을 증가시키는 데 필요하지 않은 아미노 또는 카르복시말단 아미노산을 제거할 수 있다. 마찬가지로, 펩티드의 활성을 완전히 억제하지 않는 양이온성 펩티드에 하나 또는 몇개(예, 5개 미만)의 아미노산을 부가하여 추가의 유도체를 생성할 수 있다. 또, C-말단 유도체, 예컨대 C-말단 메틸 에스테르, 및 N-말단 유도체를 생성할 수 있으며, 이들은 본 발명에 포함된다. 본 발명의 펩티드는 본 명세서에 개시된 바와 같은 생활성을 보유하는 한 본 발명에 개시된 펩티드의 임의의 유사체, 상동체, 돌연변이체, 이성체 또는 유도체를 포함한다. 상기 제시된 일반식에 포함되는 펩티드의 역 서열도 포함된다. 또한, "D"형 아미노산을 "L"형 아미노산으로 치환할 수 있으며, 그 역도 가능하다. 대안적으로, 화학적으로 또는 2 이상의 시스테인 잔기를 서열에 첨가하고 산화하여 이황화 결합을 형성함으로써 펩티드를 고리화할 수 있다.
또한 본 발명은 본 명세서에 예시된 펩티드의 보존성 변이체인 펩티드를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "보존성 변이체"는 하나 이상의 아미노산이 생물학적으로 유사한 또 다른 잔기로 치환된 폴리펩티드를 의미한다. 보존성 변이체의 예로는, 이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 시스테인, 글리신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신, 노르류신 또는 메티오닌 등의 하나의 소수성 잔기의 또 다른 잔기로의 치환, 또는 극성 잔기의 또 다른 잔기로의 치환, 예컨대 리신의 아르기닌으로의 치환, 아스파르트산의 글루탐산으로의 치환, 또는 아스파라긴의 글라타민으로의 치환 등이 있다. 서로 치환될 수 있는 중성 친수성 아미노산으로는 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌 등이 있다. 용어 "보존성 변이체"는 또한 비치환된 모 아미노산 대신에 치환된 아미노산을 갖는 펩티드도 포함한다. 그러한 치환된 아미노산은 메틸화되거나 아미드화된 아미노산을 포함할 수 있다. 기타의 치환은 당업자들에게 공지되어 있다. 일 측면에서, 치환된 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는 비치환된 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 펩티드는, 통상 사용되는 방법, 예컨대 알파 아미노기의 t-BOC 또는 FMOC 보호를 포함하는 방법으로 합성할 수 있다. 양 방법은 펩티드의 C-말단으로부터 출발하여 각 단계에서 단일 아미노산을 부가하는 단계식 합성을 포함한다(Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, Unit 9 참조). 본 발명의 펩티드는 중합체 1 g당 0.1∼1.0 mMol 아민을 함유하는 (스티렌-디비닐벤젠)의 공중합체를 사용하여 Stewart 및 Young의 문헌[Solid Phase Peptides Synthesis, Freeman, San Francisco, 1969, pp. 27-62] 및 Merrifield의 문헌[J. Am. Chem. Soc., 85: 2149, 1962]에 개시된 바와 같은 공지된 고상 펩티드 합성법으로 합성할 수 있다. 화학적 합성이 완료되면, 펩티드를 탈보호시키고 0℃에서 약 1/4∼1 시간 동안 액체 HF-10% 아니솔로 처리하여 중합체로부터 분해할 수 있다. 시약의 증발 후에, 1% 아세트산 용액으로 펩티드를 중합체로부터 추출한 다음, 동결건조시켜 미정제 물질을 얻는다. 용매로서 5% 아세트산을 사용하여 Sephadex G-15 상에서의 겔 여과와 같은 방법으로 펩티드를 정제할 수 있다. 적절한 컬럼 용출물 분획의 동결건조로 균질한 펩티드를 산출한 다음, 아미노산 분석, 박막 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 자외선 흡수 분광분석, 몰 광회전 또는 용해도 측정과 같은 표준 방법으로 특성화할 수 있다. 필요에 따라, 고상 에드만 분해로 펩티드를 정량할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 펩티드를 암호화하는 분리된 핵산(예, DNA, cDNA, 또는 RNA)을 포함한다. 본 명세서에 개시된 펩티드의 유사체, 돌연변이체, 보존성 변이체 및 변형체를 암호화하는 핵산도 포함된다. 본 명세서에 개시된 용어 "분리된"은 생체내에서 생성된 핵산이 자연적으로 회합되어 있는 단백질, 지질 및 기타 핵산이 실질적으로 없는 핵산을 의미한다. 바람직하게는, 핵산은 적어도 70 중량%, 80 중량% 순수하고, 바람직하게는 90 중량% 순수하며, 시험관 내에서 핵산을 합성하는 통상적인 방법을 생체내 방법 대신에 사용할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "핵산"은 별도의 단편 형태 또는 (예, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 핵산에 프로모터를 작동가능하게 연결하여) 더 큰 유전자 작제물의 성분으로서의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. 다수의 유전자 작제물(예, 플라스미드 및 기타 발현 벡터)은 당업계에 공지되어 있으며, 무세포 시스템 또는 원핵 또는 진핵(예, 효모, 곤충 또는 포유류) 세포에서 본 발명의 펩티드를 생성하는 데 사용될 수 있다. 당업자는 유전자 코드의 축퇴를 고려하여 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 쉽게 합성할 수 있다. 통상적인 분자 생물학 방법에서 본 발명의 핵산을 용이하게 이용하여 본 발명의 펩티드를 생성할 수 있다.
본 발명의 양이온성 펩티드를 암호화하는 DNA를 "발현 벡터"로 삽입할 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하도록 조작될 수 있는 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 비히클과 같은 유전자 작제물을 의미한다. 그러한 발현 벡터는 숙주 세포 중 삽입된 유전자 서열의 전사를 용이하게 하는 프로모터 서열을 포함하는 플라스미드인 것이 바람직하다.발현 벡터는 통상적으로 복제 기점, 프로모터 그리고 형질전환된 세포의 표현형 선별을 가능하게 하는 폴리뉴클레오티드(예, 항생제 내성 폴리뉴클레오티드)를 포함한다. 유도성 및 구성성 프로모터를 비롯한 각종 프로모터를 본 발명에 이용할 수 있다. 통상적으로, 발현 벡터는 숙주 세포에 적합한 종으로부터 유도된 레플리콘 부위 및 조절 서열을 포함한다.
본 발명의 핵산을 이용한 수용체의 형질전환 또는 형질감염은, 당업자들에게 공지된 종래 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포가 이.콜리인 경우, 당업계에 공지된 CaCl2, MgCl2또는 RbCl 방법을 이용하여 DNA를 흡수할 수 있는 컴피턴트 세포를 제조할 수 있다. 대안적으로, 일렉트로포레이션 또는 마이크로인젝션과 같은 물리적 수단을 사용할 수 있다. 일렉트로포레이션은 고전압 전기 충격으로 핵산을 세포로 전달할 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 원형질 융합체로 핵산을 숙주 세포로 도입할 수 있다. 일렉트로포레이션 및 리포펙션과 같은 적절한 진핵 세포의 형질전환법도 공지되어 있다.
본 발명에 포함된 "숙주 세포" 또는 "수용체 세포"는 본 발명의 핵산을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 임의의 세포이다. 이 용어는 수용체 또는 숙주 세포의 임의의 자손을 포함한다. 본 발명의 바람직한 수용체 또는 숙주 세포로는 이.콜리(E. coli), 에스.아우레우스(S. aureus) 및 피.애루지노사(P. aeruginosa) 등이 있지만, 발현 벡터가 숙주의 발현을 가능하게 하는 복제 기점을 포함하는 한 당업계에 공지된 다른 그람 음성 및 그람 양성 박테리아, 진균류 및 포유류 세포와 유기체를 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 사용된 양이온성 펩티드 폴리뉴클레오티드 서열을 유기체로부터 분리하거나 또는 실험실에서 합성할 수 있다. 해당 양이온성 펩티드를 암호화하는 특이적 DNA 서열을 1) 게놈 DNA로부터 2본쇄 DNA 서열의 분리; 2) 해당 양이온성 펩티드에 대한 필수적인 코돈을 제공하는 DNA 서열의 화학적 제조; 및 3) 공여자 세포로부터 분리된 mRNA의 역전사에 의한 2본쇄 DNA 서열의 시험관내 합성으로 얻을 수 있다. 후자의 경우에, 일반적으로 cDNA라고 하는 mRNA의 2본쇄 DNA 상보체가 마침내 형성된다.
목적하는 펩티드 생성물의 아미노산 잔기의 전체 서열이 알려진 경우에는 DNA 서열의 합성은 흔히 선택 방법이 된다. 본 발명에 있어서, DNA 서열 합성은 박테리아 숙주가 인식할 것 같은 코돈을 도입하여, 번역에 어려움 없이 고 농도로 발현시킬 수 있다는 잇점이 있다. 또한, 결국 천연 양이온성 펩티드, 이의 변형체 또는 합성 펩티드를 암호화하는 것들을 비롯한 임의의 펩티드를 합성할 수 있다.
목적하는 펩티드의 전체 서열이 알려지지 않은 경우, DNA 서열의 직접 합성은 불가능하며, 선택 방법은 cDNA 서열을 형성하는 것이다. 해당 cDNA 서열을 분리하는 표준 절차 중 하나는 고 농도로 유전자를 발현하는 공여 세포에 풍부한 mRNA의 역전사로부터 유도된 cDNA 라이브러리를 함유하는 플라스미드 또는 파지를 형성하는 것이다. 폴리머라제 연쇄 반응 방법과 함께 사용되는 경우, 매우 희귀한 발현 생성물을 클로닝할 수 있다. 양이온성 펩티드의 아미노산 서열 중 상당 부분이 알려진 경우에는, 표적 cDNA에 존재할 것으로 추정되는 서열을 복제하는 표지된 1본쇄 또는 2본쇄 DNA 또는 RNA 프로브 서열을 생성하여, 1본쇄 형태로 변성된 cDNA의클로닝된 카피 상에서 실시되는 DNA/DNA 하이브리드화 절차에 사용할 수 있다(Jay, et al., Nuc. Acid Res., 11:2325, 1983).
본 발명의 펩티드를 경시적으로 주사하거나 또는 점진 주입하여 비경구 투여할 수 있다. 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 강내 또는 경피로 펩티드를 투여할 수 있다. 펩티드를 전달하기 위한 바람직한 방법으로는, 경구, 미소구 또는 프로테이노이드에서의 캡슐화, 폐로의 에어로졸 전달 또는 이온영동 또는 경피 일렉트로포레이션에 의한 경피 투여 등이 있다. 다른 투여 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 펩티드를 투여하기 위한 비경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성유(예, 올리브유), 및 주사가능한 유기 에스테르(예, 에틸 올레이트) 등이 있다. 수성 담체는 물을 포함하고, 염수 및 완충 매체 비경구 비히클을 비롯한 알코올/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 아세트산나트륨, 구연산나트륨, 젖산화된 링거 또는 불휘발성유를 포함한다. 정맥내 비히클은 체액 및 영양분 공급원, 전해질 공급원(예, 링거 덱스트로스 기준) 등을 포함한다. 항미생물제, 산화방지제, 킬레이트화제 및 불활성 기체 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제도 존재할 수 있다.
이하 본 발명은 하기 비제한적인 실시예를 참조하여 상세히 설명될 것이다. 일부 바람직한 구체예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명하지만, 청구범위에 개시된 바와 같은 발명의 취지 및 범위 내에서 변형 및 변화가 가능함을 알 것이다.
실시예 1
항패혈증/항염증 활성
폴리뉴클레오티드를 이용하여 상피 세포의 전사 반응에 대한 양이온성 펩티드의 효과를 결정하였다. A549 인간 상피 세포주를 10% 태아 소 혈청(FBS, 메디코프)으로 보충시킨 DMEM(기브코)에 유지시켰다. A549 세포를 2.5 x 106세포/접시로 100 mm 조직 배양 접시에 넣고, 밤새도록 배양한 다음, 4 시간 동안 50 ㎍/㎖ 펩티드 또는 배지 단독 존재 또는 부재(대조군) 하에 100 ng/㎖ 이.콜리 O111:B4 LPS(시그마)로 항온처리하였다. 자극 후, 세포를 디에틸 피로탄산염 처리된 인산염 완충염수(PBS)로 1 회 세척하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 접시에서 분리시켰다. RNA 펠렛을, Superase-In(RNase 억제제; 암비온)을 함유하는 RNase 무함유 물에 재현탁시켰다. RNA의 질은 1% 아가로스 겔 상의 겔 전기 영동에 의해 평가하였다.
사용된 폴리뉴클레오티드 어레이는 인간 오페론 어레이(게놈에 대한 확인 번호는 PRHU04-S1임)였는데, 이는 두 벌로 스포팅된 약 14,000 인간 올리고로 구성된 것이다. 프로브는 총 RNA 10 ㎍으로부터 제조하고, Cy3 또는 Cy5 표지된 dUTP로 표지하였다. 세척 후, 퍼킨 엘머 어레이 스캐너를 사용하여 이미지를 포착하였다. 이미지 프로세싱 소프트웨어(Imapolynucleotide 5.0, 미국 캘리포니아주 마리나 델 레이 소재)로 스폿 평균 강도, 중간 강도 및 백그라운드 강도를 측정하였다. "자체 제작" 프로그램을 사용하여 백그라운드를 제거하였다. 이 프로그램으로 각각의 부격자에 대한 저부 10% 강도를 계산하고, 각각의 격자에 대하여 이것을 공제하였다. 분석은 Genespring 소프트웨어(미국 캘리포니아주 레드우드 시티 소재)로 수행하였다. 각각의 스폿에 대한 강도는 슬라이드 내 스폿 값의 모집단으로부터 중간 스폿 강도 값을 취하고, 이 값을 실험에서의 모든 슬라이드의 값과 비교함으로써 정규화하였다. 대조 세포와 비교하여 펩티드로 처리된 세포에서 보여지는 상대 변화는 표 1 및 2에서 찾아볼 수 있다. 이러한 표 2는 변경된 발현에 대해 테스트된 14,000 폴리뉴클레오티드의 유의적인 발현 변화를 나타내는 폴리뉴클레오티드만을 반영한다. 이 데이타는 펩티드가 LPS에 의해 유도된 폴리뉴클레오티드의 발현을 감소시키는 일반적인 능력을 가진다는 것을 보여준다.
표 1에서, 펩티드, 서열 번호 27은 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이에 의해 연구된 바와 같이 이.콜리 O111:B4 LPS에 의해 상향 조절된 많은 폴리뉴클레오티드의 발현을 강력하게 감소시키는 것으로 나타났다. 펩티드(50 ㎍/㎖) 및 LPS(0.1 ㎍/㎖) 또는 LPS 단독을 4 시간 동안 A549로 항온처리하고, RNA를 분리하였다. 5 ㎍ 총 RNA를 사용하여 Cy3/Cy5 표지된 cDNA 프로브를 제조하고, 인간 오페론 어레이(PRHU04)로 하이브리드화하였다. 비자극 세포의 강도는 표 1의 제3 칼럼에 나타낸다. "비율: LPS/대조군" 칼럼은 비자극 세포의 강도로 나눈 LPS 자극 세포 내 폴리뉴클레오티드 발현의 강도에 관한 것이다. "비율: LPS + ID 27/대조군" 칼럼은 비자극 세포로 나눈 LPS 및 펩티드로 자극된 세포 내 폴리뉴클레오티드 발현의 강도에 관한 것이다.
[표 1] 이.콜리 O111:B4 LPS에 의해 상향 조절된 A549 인간 상피 세포 폴리뉴클레오티드 발현의, 펩티드 서열 번호 27에 의한 감소
*표 1 내지 표 64의 모든 기탁 번호는 GenBank 기탁 번호에 관한 것이다.
표 2에서, 50 ㎍/㎖ 농도의 양이온성 펩티드는 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이에 의해 연구한 바와 같이 100 ng/㎖ 이.콜리 O111:B4 LP5에 의해 상향 조절된 많은 폴리뉴클레오티드의 발현을 강력하게 감소시키는 것으로 나타났다. 펩티드와 LPS 또는 LPS 단독을 A549 세포로 4 시간 동안 항온 처리하고, RNA를 분리하였다. 5 ㎍ 총 RNA를 사용하여 Cy3/Cy5 표지된 cDNA 프로브를 제조하고, 인간 오페론 어레이(PRHU04)로 하이브리드화하였다. 비자극된 세포의 강도는 표 2의 제3 칼럼에 나타낸다. "비율: LPS/대조군" 칼럼은 비자극된 세포의 강도로 나눈 LPS 자극된 세포 내 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 의미한다. 다른 칼럼은 비자극된 세포로 나눈 LPS와 펩티드로 자극된 세포 내 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 의미한다.
[표 2] 이.콜리 O111:B4 LPS에 의해 상향 조절되고 양이온성 펩티드에 의해 감소된 인간 A549 상피 세포 폴리뉴클레오티드 발현
실시예 2
면역 세포의 자극의 중화
그램 음성 및 그램 양성 박테리아 산물에 의한 면역 세포의 자극을 중화시키는 화합물의 능력을 테스트하였다. 박테리아 산물은 면역 시스템의 세포를 자극하여 염증성 사이토킨을 생성하며, 체킹되지 않은 경우, 이는 패혈증을 초래할 수 있다. 초기 실험은 어메리칸 타입 컬춰 콜렉션(미국 매사추세츠주 마나사스 소재)으로부터 입수한 쥐과 대식 세포주 RAW 264.7, 인간 상피 세포 A549, 및 BALB/c 마우스(찰스 리버 래보러토리즈, 미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재)의 골수로부터 유도된 1차 대식 세포를 이용하였다. 마우스 골수로부터의 세포는 20% FBS(시그마 케미컬 컴패니, 미국 미주리주 세인트루이스 소재) 및 M-CSF의 공급원으로서 20% L 세포 상태 조절된 배지로 보충된 둘베코 변성 이글 배지(DMEM; 라이프 테크놀로지스, 캐나다 온타리오주 벌링턴 소재) 중의 150 mm 플레이트에 배양하였다. 대식 세포가 60 내지 80% 콘플루언트되면, 이들을 14 내지 16 시간 동안 L 세포 상태 조절된 배지에서 제외시켜서 세포가 무활동이 되게 한 다음, 100 ng/㎖ LPS 또는 100 ng/㎖ LPS + 20 ㎍/㎖ 펩티드로 24 시간 동안 처리하였다. 배양 상청액으로의 사이토킨의방출은 ELISA(R&D 시스템즈, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)에 의해 결정하였다. 세포주 RAW 264.7 및 A549를 10% 태아 소 혈청으로 보충한 DMEM 중에 유지시켰다. RAW 264.7 세포를 DMEM 중의 웰 당 105세포의 밀도로 24 웰 플레이트에 시딩하고, 둘 다 37℃, 5% CO2에서 밤새도록 항온 처리하였다. DMEM을 밤새도록 성장시킨 세포로부터 흡입하고, 새로운 배지로 대체하였다. 일부 실험에서, 지원자 인간 기부자로부터의 혈액을 정맥 천자에 의해 14.3 USP 유닛 헤파린/㎖ 혈액을 함유하는 튜브(벡톤 디킨슨, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)로 채혈하였다(UBC 임상 연구 윤리 위원회 증명서 C00-0537에 의해 허용되는 절차를 따름). 혈액은 37℃에서 6 시간 동안 폴리프로필렌 튜브 내에서 펩티드 유무 하의 LPS와 혼합하였다. 샘플을 5 분 동안 2000 x g으로 원심분리하고, 혈장을 수집한 다음, ELISA(R&D 시스템즈)에 의해 IL-8에 대하여 분석할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 세포를 이용한 실험에서, LPS 또는 다른 박테리아 산물을 그 세포로 6 내지 24 시간 동안 37℃에서 5% CO2하에 항온 처리하였다. 에스.티피무리움 LPS 및 이.콜리 0111:B4 LPS는 시그마에서 구입하였다. 에스.아우레우스(시그마)로부터의 리포테이코산을 내독소가 없는 물(시그마)에 재현탁시켰다. 리물러스 아메보사이트(limulus amoebocyte) 용해물 어세이(시그마)를 LTA 제제에 대하여 수행하여 로트가 내독소에 의해 유의적으로 오염되지 않았음을 확인하였다. 내독소 오염은 RAW 264.7 세포 내 유의적인 사이토킨 생성을 유발하지 않는 농도인 1 ng/㎖ 미만이었다. 비캐핑된 리포아라비노만난(AraLAM)은 콜로라도 주립대학의 존 T. 벨리슬 박사로부터의 기증물이었다.미코박테리움(Mycobacterium)으로부터의 AraLAM을 여과 살균하였으며, 리물러스 아메보사이트 어세이에 의해 측정한 바, LAM 1.0 mg 당 3.75 ng인 것으로 밝혀졌다. LPS 첨가와 동시에(또는 구체적으로 기술한 경우, 나중에), 양이온성 펩티드를 농도 범위에서 첨가하였다. 상청액을 제거하고, ELISA(R&D 시스템즈)에 의해 사이토킨 생성에 대하여 테스트하였다. 모든 어세이를 3 회 이상 수행하여 유사한 결과를 얻었다. 생체내 항패혈증 활성을 확인하기 위하여, 인산염 완충 염수(PBS; pH 7.2) 내 이.콜리 O111:B4 LPS 2 내지 3 ㎍을 갈락토스아민 감작된 8 내지 10 주령 암컷 CD-1 또는 BALB/c 마우스에게 복강내 주사하여 패혈증을 유도하였다. 펩티드를 수반하는 실험에서, 멸균수 100 ㎕ 중의 200 ㎕를 LPS 주사 10 분 이내에 별도의 복강내 부위에 주사하였다. 다른 실험에서, CD-1 마우스에 400 ㎍ 이.콜리 O111:B4 LPS를 주사하고, 10 분 후 펩티드(200 ㎍)를 복강내 주사에 의해 도입하였다. 생존은 주사 후 48 시간 동안 모니터하였다.
TNF-α의 과생산은 패혈증의 개발에 관행적으로 연관되어 왔다. 이 실시예에 사용되는 LPS, LTA 또는 AraLAM의 세 가지 유형은 그램 음성 및 그램 양성 박테리아에 의해 방출되는 산물을 나타낸다. 펩티드, 서열 번호 1은 에스.티피무리움, 비.세파시아 및 이.콜리 O111:B4 LPS에 의해 자극된 TNF-α생성을 유의적으로 감소시킬 수 있었으며, 전자는 다소 영향을 받았다(표 3). 펩티드 1 ㎍/㎖ 정도로 낮은 농도에서 TNF-α생성의 실질적인 감소는 후자의 두 경우에서 관찰되었다. 상이한 펩티드, 서열 번호 3은 RAW 대식 세포 내 TNF-α의 LPS 유도된 생성을 감소시키지 않았는데, 이는 이것이 양이온성 펩티드의 균일하고 예측 가능한 특성이 아님을 나타내는 것이다. 각각의 방식으로부터의 대표적인 펩티드도 이.콜리 O111:B4 LPS에 의해 자극된 TNF-α생성에 영향을 미치는 능력에 대해 테스트하였다(표 4). 펩티드는 TNF-α생성을 감소시키는 능력이 다양하였지만, 이들 중 대부분은 TNF-α를 60% 이상 저하시켰다.
또한, 특정 농도에서, 펩티드 서열 번호 1 및 서열 번호 2는 상피 세포주에 의하여 IL-8의 생성을 자극하는 박테리아 산물의 능력을 감소시킬 수 있었다. LPS는 상피 세포에 의한 IL-8의 공지된 강력한 자극물이다. 저 농도(1 내지 20 ㎍/㎖)에서, 펩티드는 상피 세포의 LPS에 대한 IL-8 도입 반응을 중화시킨다(표 5 내지 7). 또한, 펩티드 서열 번호 2는 인간 전혈 내 IL-8의 LPS-유도된 생성을 억제하였다. 이와는 반대로, 고 농도의 펩티드 서열 번호 1(50 내지 100 ㎍/㎖)은 실제로 IL-8의 수치를 증가시켰다(표 5). 이는 펩티드가 상이한 농도에서 상이한 효과를 가짐을 시사하는 것이다.
또한, 염증성 자극에 대한 펩티드의 효과는 1차 쥐과 세포에서 나타났는데, 여기서 펩티드 서열 번호 1은 100 ng/㎖ 이.콜리 O111:B4 LPS로 자극된 BALB/c 마우스로부터의 골수 유도된 대식 세포에 의한 TNF-α생성을 유의적으로 감소(>90%)시켰다(표 8). 이러한 실험은 LPS의 CD14로의 신속 결합을 매개할 수 있는 단백질인, LPS 결합 단백질(LBP)를 함유하는 혈청의 존재 하에 수행하였다. 100 ng/㎖ 이.콜리 LPS로 자극한 지 1 시간 후 대식 세포의 상청액에 서열 번호 1을 지연 첨가해도 여전히 TNF-α생성을 실질적으로 감소(70%)시켰다(표 9).
생체내 TNF-α의 LPS 유도된 생성을 방지하는 서열 번호 1의 능력과 일치하여, 특정 펩티드도 고 농도의 LPS에 의해 유도된 치명적인 졸중에 대하여 마우스를 보호하였다. 일부 실험에서, CD-1 마우스에 갈락토스아민의 선행 주사로 LPS에 대하여 감작시켰다. 이.콜리 O111:B4 LPS 3 ㎍으로 주사한 갈락토스아민 감작된 마우스를 4 내지 6 시간 이내에 모두 희생시켰다. 서열 번호 1 200 ㎍을 LPS 15 분 후에 주사하였을 때, 마우스 50%가 생존하였다(표 10). 다른 실험에서, 고 농도의 LPS를 D-갈락토스아민이 없는 BALB/c 마우스에 주사하였을 때, 펩티드는 생존한 것이 없는 대조군과 비교하였을 때 100% 보호하였다(표 13). 또한, 선택된 다른 펩티드는 이러한 모델들에서 보호성인 것으로 밝혀졌다(표 11, 12).
또한, 양이온성 펩티드는 미코박테리움 비캐핑된 리포아라비노만난(AraLAM) 및 에스.아우레우스 LTA와 같은 그램 양성 박테리아 산물에 의한 대식 세포의 자극을 저하시킬 수 있었다. 예를 들면, 서열 번호 1은 그램 양성 박테리아 산물, LTA(표 14) 및 다소 AraLAM(표 15)에 의한 RAW 264.7 세포 내 TNF-α의 유도를 억제하였다. 또한, 다른 펩티드, 서열 번호 2도 RAW 264.7 세포에 의한 LTA 유도된 TNF-α생성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 1 ㎍/㎖의 농도에서, 서열 번호 1은 TNF-α생성의 유도를 실질적으로 1 ㎍/㎖ 감소(>75%)시킬 수 있었다. 20 ㎍/㎖ 서열 번호 1에서, AraLAM 유도 TNF-α가 >60% 억제되었다. 폴리마익신 B(PMB)를 대조군으로서 포함시켜서 내독소 오염이 AraLAM 유도된 TNF-α의 서열 번호 1에 의한 억제에서 유의적인 인자가 아닌 것임을 설명하였다. 이러한 결과는 양이온성 펩티드가 박테리아 산물에 대한 면역계의 전구 염증성 사이토킨 응답을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
[표 3] RAW 264.7 세포 내 LPS 유도된 TNF-α생성의 서열 번호 1에 의한 감소.
RAW 264.7 마우스 대식 세포를 서열 번호 1의 소정 농도의 존재 하에 6 시간 동안 100 ng/㎖ 에스.티피무리움 LPS, 100 ng/㎖ 비.세파시아 LPS 및 100 ng/㎖ 이.콜리 O111:B4 LPS로 자극시켰다. 배양 상청액으로 방출된 TNF-α의 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 100%는 6 시간 동안 LPS 단독으로 항온 처리된 RAW 264.7 세포로부터 생성된 TNF-α의 양을 나타낸다(에스.티피무리움 LPS = 34.5 ±3.2 ng/㎖, 비.세파시아 LPS = 11.6 ±2.9 ng/㎖ 및 이.콜리 O111:B4 LPS = 30.8 ±2.4 ng/㎖). 6 시간 동안 자극없이 배양된 RAW 264.7 세포에 의한 TNF-α생성의 백그라운드 레벨은 0.037 내지 0.192 ng/㎖ 범위의 TNF-α레벨을 초래한다. 데이타는 두 벌 샘플로부터 얻었고, 3 회 실험의 평균 + 표준 오차로서 제공한다.
[표 4] RAW 264.7 세포 내 이.콜리 LPS 유도된 TNF-α생성의 양이온성 펩티드에 의한 감소.
RAW 264.7 마우스 대식 세포를 6 시간 동안 양이온성 펩티드의 소정 농도의 존재 하에 100 ng/㎖ 이.콜리 O111:B4 LPS로 자극하였다. 배양 상청액으로 방출된TNF-α의 농도는 ELISA에 의해 측정하였다. 6 시간 동안 자극없이 배양된 RAW 264.7 세포에 의한 TNF-α생성의 백그라운드 레벨은 0.037 내지 0.192 ng/㎖ 범위의 TNF-α레벨을 초래한다. 데이타는 두 벌 샘플로부터 얻었고, 3 회 실험의 평균 + 표준 오차로서 제공한다.
[표 5] A549 세포 내 LPS 유도된 IL-8 생성의 서열 번호 1에 의한 감소.
A549 세포는 24 시간 동안 LPS(100 ng/㎖ 이.콜리 O111:B4)의 존재 하에 서열 번호 1의 농도를 증가시켜 자극하였다. 배양 상청액 내 IL-8의 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 세포 단독으로부터의 IL-8의 백그라운드 레벨은 0.172 ±0.029 ng/㎖였다. 데이타는 3 회 실험의 평균 + 표준 오차로서 제공한다.
[표 6] A549 세포 내 이.콜리 LPS 유도된 IL-8 생성의 서열 번호 2에 의한 감소.
인간 A549 상피 세포는 24 시간 동안 LPS(100 ng/㎖ 이.콜리 O111:B4)의 존재 하에 서열 번호 2의 농도를 증가시켜 자극하였다. 배양 상청액 내 IL-8의 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 데이타는 3 회 실험의 평균 + 표준 오차로서 제공한다.
[표 7] 인간 혈액 중의 이.콜리 LPS 유도된 IL-8의 서열 번호 2에 의한 감소.
인간 전혈은 4 시간 동안 펩티드 및 이.콜리 O111:B4 LPS의 농도를 증가시켜 자극하였다. 인간 혈액 샘플을 원심분리하고, 혈청을 제거하였으며, ELISA에 의해 IL-8에 대하여 테스트하였다. 데이타는 2 명의 기증자의 평균으로서 제공한다.
[표 8] 쥐과 골수 대식 세포 내 이.콜리 LPS 유도된 TNF-α생성의 서열 번호 1에 의한 감소.
BALB/c 마우스 골수 유도된 대식 세포를 펩티드 20 ㎍/㎖의 존재 또는 부재 하에 100 ng/㎖ 이.콜리 O111:B4 LPS로 6 시간 또는 24 시간 동안 배양하였다. 상청액을 수집하고, ELISA에 의한 TNF-α의 레벨에 대하여 테스트하였다. 데이타는 LPS 단독으로 6 시간(1.1 ±0.09 ng/㎖) 또는 24 시간(1.7 ±0.5 ng/㎖) 동안 항온 처리한 골수 유도된 대식 세포의 두 벌 웰로부터 생성된 TNF-α의 양을 나타낸다.TNF-α의 백그라운드 레벨은 6 시간 동안 0.038 ±0.008 ng/㎖ 및 24 시간 동안 0.06 ±0.012 ng/㎖였다.
[표 9] 서열 번호 1의 A549 세포로의 지연 첨가에 의한 이.콜리 LPS 유도된 TNF-α생성의 억제.
펩티드(20 ㎍/㎖)를 증가 시점에서 미리 A549 인간 상피 세포 및 100 ng/㎖ 이.콜리 O111:B4 LPS를 함유하는 웰에 첨가하였다. 상청액을 6 시간 후에 수집하고, ELISA에 의해 TNF-α의 레벨에 대해 테스트하였다. 데이타는 3회 실험의 평균 + 표준 오차로서 제공한다.
[표 10] 서열 번호 1에 의한 갈락토스아민 감작된 CD-1 마우스의 치명적인 내독소혈증에 대한 보호.
CD-1 마우스(9 주령)를 갈락토스아민(0.1 ㎖ 멸균 PBS 중의 20 mg)의 3 회 복강내 주사에 의해 내독소에 감작시켰다. 그 다음, 내독소 쇼크는 이.콜리 O111:B4 LPS(0.1 ㎖ PBS 중의 3 ㎍)의 복강내 주사에 의해 유도하였다. 펩티드, 서열 번호 1(200 ㎍/마우스 = 8 mg/kg)를 LPS 주사 15 분 후 별도의 복강내 부위에 주사하였다. 마우스를 48 시간 동안 모니터하고, 결과를 기록하였다.
[표 11] 양이온성 펩티드에 의한 갈락토스아민 감작된 CD-1 마우스의 치명적인 내독소혈증에 대한 보호.
CD-1 마우스(9 주령)를 갈락토스아민(0.1 ㎖ 멸균 PBS 중의 20 mg)의 3 회 복강내 주사에 의해 내독소에 감작시켰다. 그 다음, 내독소 쇼크는 이.콜리 O111:B4 LPS(0.1 ㎖ PBS 중의 2 ㎍)의 복강내 주사에 의해 유도하였다. 펩티드, 서열 번호 1(200 ㎍/마우스 = 8 mg/kg)를 LPS 주사 15 분 후 별도의 복강내 부위에주사하였다. 마우스를 48 시간 동안 모니터하고, 결과를 기록하였다.
[표 12] 양이온성 펩티드에 의한 갈락토스아민 감작된 BALB/c 마우스의 치명적인 내독소혈증에 대한 보호.
BALB/c 마우스(8 주령)를 갈락토스아민(0.1 ㎖ 멸균 PBS 중의 20 mg)의 3 회 복강내 주사에 의해 내독소에 감작시켰다. 그 다음, 내독소 쇼크는 이.콜리 O111:B4 LPS(0.1 ㎖ PBS 중의 2 ㎍)의 복강내 주사에 의해 유도하였다. 펩티드, 서열 번호 1(200 ㎍/마우스 = 8 mg/kg)를 LPS 주사 15 분 후 별도의 복강내 부위에주사하였다. 마우스를 48 시간 동안 모니터하고, 결과를 기록하였다.
[표 13] 서열 번호 1에 의한 BALB/c 마우스의 치명적 내독소혈증에 대한 보호.
BALB/c 마우스에 400 ㎍ 이.콜리 O111:B4 LPS로 복강내 주사하였다. 펩티드(200 ㎍/마우스 = 8 mg/kg)를 별도의 복강내 부위에 주사하고, 마우스를 48시간 동안 모니터하였으며, 결과를 기록하였다.
[표 14] 에스.아우레우스 LTA에 의해 유도된 TNF-α생성의 펩티드 첨가.
RAW 264.7 마우스 대식 세포는 펩티드의 증가시킨 농도의 부재 및 존재 하에 1 ㎍/㎖ 에스.아우레우스 LTA로 자극하였다. 상청액을 수집하고, ELISA에 의한 TNF-α의 레벨에 대하여 테스트하였다. 6 시간 동안 자극없이 배양한 RAW 264.7 세포에 의한 TNF-α생성의 백그라운드 레벨은 0.037 내지 0.192 ng/㎖ 범위의 TNF-α레벨을 초래하였다. 데이타는 3 회 이상의 실험의 평균 + 표준 오차로서 제공한다.
[표 15] 미코박테리움 비캐핑된 리포아라비노만난에 의해 유도된 TNF-α의 펩티드 억제.
RAW 264.7 마우스 대식 세포는 20 ㎍/㎖ 펩티드 또는 폴리마익신 B의 부재 및 존재 하에 1 ㎍/㎖ AraLAM으로 자극하였다. 상청액을 수집하고, ELISA에 의한 TNF-α의 레벨에 대하여 테스트하였다. 6 시간 동안 자극없이 배양한 RAW 264.7 세포에 의한 TNF-α생성의 백그라운드 레벨은 0.037 내지 0.192 ng/㎖ 범위의 TNF-α레벨을 초래하였다. 데이타는 3 회 이상의 실험의 평균 + 표준 오차로서 제공한다.
실시예 3
양이온성 펩티드의 독성의 평가
펩티드의 잠재적 독성은 두 가지 방식으로 측정하였다. 첫째, 세포 독성 검출 키트(로헤)(락테이트 데히드로게나제-LDH) 분석법을 사용하였다. 이는 손상된 세포의 사이토솔이 상청액으로 방출되는 LDH 활성의 측정을 기준으로 세포 사멸 및 세포 용해의 정량에 대한 열량계 분석법이다. LDH는 모든 세포 내에 존재하는 안정한 세포질 효소이고, 이는 세포질 멤브레인 손상시 세포 배양 상청액으로 방출된다. 사멸 또는 세포질 멤브레인 손상된 세포의 양 증가는 ELISA 플레이트 판독기, OD490nm로 측정하였을 때 배양 상청액 내 LDH 효소 활성의 증가를 초래한다(분석법에서 형성된 색의 양은 용해된 세포의 수에 비례한다). 이 분석법에서, 인간 기관지 상피 세포(16HBEo14, HBE) 세포를 24 시간 동안 펩티드 100 ㎍으로 항온 처리하고, 상청액을 제거하였으며, LDH에 대해 테스트하였다. 양이온성 펩티드의 독성을 측정하는 데 사용된 다른 분석법은 WST-1 분석법(로헤)이었다. 이 분석법은 생존 가능한 세포 내 미토콘드리아 데히드로게나제에 의한 테트라졸륨 염 WST-1의 개열을 토대로 하는, 세포 증식 및 세포 생존 가능성의 정량에 대한 열량계분석이다([3H]-티미딘 도입 분석법을 대신하는 비방사능법). 이 분석법에서, HBE 세포를 24 시간 동안 펩티드 100 ㎍으로 항온 처리한 다음, 10 ㎕/웰 세포 증식 시약 WST-1을 가하였다. 세포를 이 시약으로 항온 처리한 다음, 플레이트를 ELISA 플레이트 판독기, OD490nm로 측정하였다.
하기 표 16 및 17에 나타낸 결과는 대부분의 펩티드가 테스트된 세포에 독성이 아님을 나타낸다. 그러나, 식 F로부터의 펩티드 중 네 개(서열 번호 40, 41, 42 및 43)는 두 분석법에 의해 측정하였을 때 멤브레인 손상을 유도하지 않았다.
[표 16] LDH 방출 분석에 의해 측정된 바와 같은 양이온성 펩티드의 독성.
인간 HBE 기관지 상피 세포를 24 시간 동안 100 ㎍/㎖ 펩티드 또는 폴리마익신 B로 항온 처리하였다. LDH 활성은 세포 배양물의 상청액에서 분석하였다. 100% LDH 방출에 대한 대조군으로서, Triton X-100을 첨가하였다. 데이타는 평균 ±표준 편차로 제공된다. 펩티드 서열 번호 40, 41, 42 및 43만이 유의적인 독성을 나타내었다.
[표 17] WST-1 분석법에 의해 측정한 바와 같은 양이온성 펩티드의 독성.
HBE 세포를 24 시간 동안 100 ㎍/㎖ 펩티드 또는 폴리마익신 B로 항온 처리하고, 세포 생존 가능성을 테스트하였다. 데이타는 평균 ±표준 편차로 제공된다. 100% LDH 방출에 대한 대조군으로서, Triton X-100을 첨가하였다. 펩티드 서열 번호 40, 41, 42 및 43만이 유의적인 독성을 나타내었다.
실시예 4
양이온성 펩티드에 의한 폴리뉴클레오티드 조절
폴리뉴클레오티드 분석법을 이용하여 대식 세포 및 상피 세포의 전사 응답에 대한 양이온성 펩티드의 그 자체 효과를 결정하였다. 마우스 대식 세포 RAW 264.7, 인간 기관지 세포(HBE) 또는 A549 인간 상피 세포를 5.6 x 106세포/접시로 150 nn 조직 배양 접시에 넣고, 밤새도록 배양한 다음, 50 ㎍/㎖ 펩티드로, 또는 배지 단독으로 4 시간 동안 항온 처리하였다. 자극 후, 세포를 디에틸 피로카르보네이트 처리된 PBS로 1 회 세척하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 접시로부터 떼어내었다. 총 RNA는 Trizol(기브코 라이프 테크놀로지스)를 사용하여 분리하였다. RNA 펠렛을 RNase 억제제를 함유하는 무함유 물(암비온, 미국 텍사스주 오스틴 소재)에 재현탁시켰다. RNA를 DNaseI(클론테크, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로 1 시간 동안 37℃에서 처리하였다. 종결 믹스(0.1 M EDTA [pH 8.0], 1 mg/㎖ 글리코겐)를 첨가한 후, 샘플을 페놀: 클로로포름: 이소아밀 알콜(25:24:1)로 1 회 추출하고, 클로로포름으로 1 회 추출하였다. 그 다음, RNA는 100% 에탄올 2.5 부피 및 아세트산나트륨 1/10 부피(pH 5.2)를 첨가함으로써 침전시켰다. RNA는 RNase 억제제를 보유한 RNase 무함유 물(암비온)에 재현탁시키고, -70℃에서 저장하였다. RNA의 질은 1% 아가로스 겔 상에서 겔 전기 영동에 의해 평가하였다. β-악틴 특이적인 프라이머(5'-GTCCCTGTATGCCTCTGGTC-3'(서열 번호 55) 및 5'-GATGTCACGCACGATTTCC-3'(서열 번호 56))을 이용한 PCR 증폭을 위한 주형으로서 분리된 RNA를 사용함으로써 게놈 DNA 오염이 없는 것으로 평가되었다. 아가로스 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드 스테이닝으로 35 주기 후 앰플리콘의 부재를 확인하였다.
양전하를 띠는 멤브레인 상에 두 벌로 스포팅된 588 개의 선택된 마우스 cDNA로 구성된 아틀라스 cDNA 발현 분석법(클론테크, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)을 초기 폴리뉴클레오티드 어레이 연구에 사용하였다(표 18, 19). 5 ㎍ 총 RNA로부터 제조된32P-방사 표지된 cDNA 프로브를 어레이와 함게 밤새도록 71℃에서 항온 처리하였다. 필터를 대충 세척한 다음, 포스포이미저 스크린(몰레큘라 다이나믹스, 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)에 3 일 동안 4℃에서 노출시켰다. 이미지는 몰레큘라 다이나믹스 PSI 포토이미저를 사용하여 포착하였다. 하이브리드화 시그널은 AtlasImage 1.0 이미지 분석 소프트웨어(클론테크) 및 엑셀(마이크로소프트, 미국 워싱턴주 레드몬드 소재)을 사용하여 분석하였다. 각각의 스폿에 대한 강도를 백그라운드 레벨에 대해 보정하고, 자극 조건: β-악틴, 유비퀴틴, 리보솜 단백질 S29, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제(GAPDH) 및 Ca2+결합 단백질 간에 약간 변한 것으로 관찰된 5 개의 폴리뉴클레오티드에 대한 평균치를 사용하여 프로브 표지화 차이에 대해 정규화하였다. 소정의 cDNA에 대한 정규화된 하이브리드화 강도가 20 미만인 경우, 20의 값을 할당하여 비율 및 상대 발현을 계산하였다.
사용된 다음 폴리뉴클레오티드 어레이(표 21 내지 26)는 두 벌로 스포팅된 7,458 개의 인간 cDNA로 구성된 레스겐 인간 cDNA 어레이(게놈에 대한 확인 번소는 PRHU03-S3임)였다. 프로브를 총 RNA 15 내지 20 ㎍으로부터 제조하고, Cy3 표지된 dUTP로 표지하였다. 프로브를 정제하고, 밤새도록 42℃에서 인쇄된 유리 슬라이드에 하이브리드화하였으며, 세척하였다. 세척 후, 이미지는 Virtek 슬라이드 판독기를 사용하여 포착하였다. 이미지 프로세싱 소프트웨어(Imagene 4.1, 미국 캘리포니아주 마리나 델 레이 소재)로 스폿 평균 강도, 중간 강도 및 백그라운드 강도를 측정하였다. 정규화 및 분석은 Genespring 소프트웨어(미국 캘리포니아주 레드우드 시티 소재)로 수행하였다. 강도 값은 Imagene에 의해 측정된 평균 강도 값으로부터 평균 백그라운드 강도를 공제함으로써 계산하였다. 각각의 스폿에 대한 강도는 슬라이드 내 스폿 값의 모집단으로부터 중간 스폿 강도 값을 취하고, 이 값을 실험 내 모든 슬라이드의 값에 비교함으로써 정규화하였다. 대조군 세포와 비교하여 펩티드로 처리된 세포로 보여지는 상대 변화는 하기 표에서 찾아볼 수 있다.
사용된 다른 폴리뉴클레오티드 어레이는 두 벌로 스포팅된 약 14,000 개의 인간 올리고로 구성된 인간 오페론 어레이(게놈에 대한 확인 번호는 PRHU04-S1임)였다. 프로브를 총 RNA 10 ㎍으로부터 제조하고, Cy3 또는 Cy5 표지된 dUTP로 표지하였다. 이들 실험에서, A549 상피 세포를 2.5 x 106세포/접시로 100 mm 조직 배양 접시에 넣었다. 총 RNA는 RNAqueous(암비온)를 사용하여 분리하였다. DNA 오염은 DNA 무함유 키트(암비온)로 제거하였다. 총 RNA로부터 제조된 프로브를 정제하고, 밤새도록 42℃에서 인쇄된 유리 슬라이드에 하이브리드화하였으며, 세척하였다. 세척 후, 이미지는 퍼킨 엘머 어레이 스캐너를 사용하여 포착하였다. 이미지 프로세싱 소프트웨어(Imagene 5.0, 미국 캘리포니아주 마리나 델 레이 소재)로 스폿 평균 강도, 중간 강도 및 백그라운드 강도를 측정하였다. "자체 제작" 프로그램을 사용하여 백그라운드를 제거하였다. 이 프로그램으로 각각의 부격자에 대한 저부 10% 강도를 계산하고, 각각의 격자에 대하여 이것을 공제하였다. 분석은 Genespring 소프트웨어(미국 캘리포니아주 레드우드 시티 소재)로 수행하였다. 각각의 스폿에 대한 강도는 슬라이드 내 스폿 값의 모집단으로부터 중간 스폿 강도 값을 취하고, 이 값을 실험에서의 모든 슬라이드의 값과 비교함으로써 정규화하였다. 대조 세포와 비교하여 펩티드로 처리된 세포에서 보여지는 상대 변화는 하기 표에서 찾아볼 수 있다.
반정량 RT-PCR를 수행하여 폴리뉴클레오티드 어레이 결과를 확인하였다. 1 ㎍ RNA 샘플은 서모사이클러 내에서 5 분 동안 65℃의 DEPC 처리수로 12 ㎕ 부피 중의 1 mM로, 1 ㎕ oligodT(500 ㎍/㎖) 및 1 ㎕ 혼합 dNTP 스톡으로 항온 처리하였다. 4 ㎕ 5X 제1 가닥 완충제, 2 ㎕ 0.1 M DTT 및 1 ㎕ RNaseOUT 재조합 리보뉴쿨레아제 억제제(40 유닛/㎕)를 가하고, 42℃에서 2 분 동안 항온 처리한 후, Superscript II(인비트로겐, 캐나다 온타리오주 벌링턴 소재) 1 ㎕(200 유닛)를 첨가하였다. 각각의 RNA 공급원에 대한 음성 대조군은 Superscript II의 부재 하에 병행 반응을 사용하여 발생시켰다. cDNA를 5' 및 3' 프라이머(1.0 μM), 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.5 mM MgCl, Taq DNA 폴리머라제(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 캐나다 온타리오주 미시사우가 소재) 1 U 및 1X PCR 완충제의 존재 하에 증폭시켰다. 각각의 PCR은 94℃ 변성 30 초, 52℃ 또는 55℃ 어닐링 30 초 및 72℃ 연장 40℃로 구성된 30 내지 40 사이클을 사용함으로써 열 사이클러로 수행하였다. PCR의 사이클 수는 각각의 프라이머와 RNA 샘플의 세트에 대한 반응의 선형 단계에 있도록 최적화하였다. 하우스키핑 폴리뉴클레오티드 β-악틴을 각각의 실험에서 증폭시켜서 추출 절차를 평가하고, RNA의 양을 평가하였다. 반응 산물은 전기 영동에 의해 가시화하고, 농도계에 의해 분석하였으며, 상대 출발 RNA 농도를 β-악틴 증폭에 대한 기준으로서 계산하였다.
표 18은 RAW 264.7 세포의 서열 번호 1 처리가 선택된 공지의 폴리뉴클레오티드를 이용한 소형 아틀라스 마이크로어레이에서 30 이상의 상이한 폴리뉴클레오티드의 발현을 상향 조절하였음을 보여준다. 펩티드, 서열 번호 1에 의해 상향 조절된 폴리뉴클레오티드는 주로 2 가지 카테고리: 수용체(성장, 케모카인, 인터루킨, 인터페론, 호르몬, 신경전달물질), 세포 표면 항원 및 세포 유착을 포함하는 것과 세포-세포 교류(성장 인자, 사이토킨, 케모카인, 인터루킨, 인터페론, 호르몬), 세포 골격, 운동성 및 단백질 전환을 포함하는 것으로부터였다. 상향 조절된 특이적인 폴리뉴클레오티드는 케모카인 MCP-3, 항염증성 사이토킨 IL-10, 대식 세포 콜리니 자극 인자 및 수용체, 예컨대 IL-1R-2(IL-1R1에 결합하는 생산성 IL-1의추정 길항제), PDGF 수용체 B, NOTCH4, LIF 수용체, LFA-1, TGFβ수용체 1, G-SCF 수용체 및 IFNγ수용체를 암호화하는 것들을 포함하였다. 또한, 펩티드는 골 형태 발생 단백질 BMP-1, BMP-2, BMP-8a, TIMP2 및 TIMP3을 비롯한, 몇 가지 메탈로프로테이나제 및 그 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 상향 조절하였다. 뿐만 아니라, 펩티드는 JunD, 및 YY 및 LIM-1 전사 인자, 그리고 그 넓은 효과를 나타내는 EtK1 및 Csk와 같은 키나제를 비롯한, 특이적인 전사 인자를 상향 조절하였다. 또한, 폴리뉴클레오티드 어레이 연구로부터 서열 번호 1이 RAW 264.7 대식 세포 중의 20 이상의 폴리뉴클레오티드를 하향 조절시킨다는 것이 발견되었다(표 19). 펩티드에 의해 하향 조절된 폴리뉴클레오티드는 DNA 손상 단백질 및 몇 가지 염증성 매개인자, 예컨대 MIP-1α, 온코스타틴 M 및 IL-12를 포함하였다. 폴리뉴클레오티드 발현에 대한 펩티드의 다수의 효과는 RT-PCR에 의해 확인되었다(표 20). 또한, 펩티드, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 19 및 서열 번호 1, 그리고 각각의 식으로부터의 대표적인 펩티드는 중간 크기의 마이크로어레이(7835 폴리뉴클레오티드)를 사용하는 인간 상피 세포주의 전사 응답을 변경시켰다. 폴리뉴클레오티드 발현에 대한 서열 번호 1의 효과는 2 인간 상피 세포, A549 및 HBE에서 비교되었다. 비자극된 세포보다 2 배 이상의 비율로 2 펩티드 이상에 의해 상향 조절된 숙주 면역 응답에 관련된 폴리뉴클레오티드는 표 21에 기재하였다. 비자극된 세포보다 2 배 이상의 비율로 2 펩티드 이상에 의해 하향 조절된 폴리펩티드는 표 22에 기재하였다. 표 23 및 표 24에 각각 상향 및 하향 조절된 인간 상피 전구 염증성 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 표 25 및 26에, 양이온성 펩티드에 의해 영향받은 항염증성 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 양이온성 펩티드가 항염증성 응답을 상향 조절하고, 전구 염증성 응답을 하향 조절하는 경향은 분명해진다. 하향 조절된 항염증성 응답에 관련된 폴리뉴클레오티드를 찾는 것은 매우 어렵다(표 26). 양이온성 펩티드에 의해 상향 조절된 전구 염증성 폴리뉴클레오티드는 주로 이동 및 유착에 관련된 폴리뉴클레오티드였다. 하향 조절된 전구 염증성 폴리뉴클레오티드 중에서, 모든 양이온성 펩티드는 몇 가지 toll 유사 수용체(TLR) 폴리뉴클레오티드에 영향을 미쳤음에 유념해야 하는데, 이는 감염 제제에 대한 숙주 응답을 시그널링하는 데 매우 중요한 것이다. 모든 펩티드에 의해 상향 조절된 중요한 항염증성 폴리뉴클레오티드는 IL-10 수용체이다. IL-10은 전구 염증성 사이토킨을 조절하는 데 수반되는 중요한 사이토킨이다. 또한, 이들 폴리뉴클레오티드 발현 효과는 표 27 및 28에서 펩티드 서열 번호 6에 대해 관찰된 바와 같이 1차 인간 대식 세포를 사용하여 관찰되었다. 선택된 폴리뉴클레오티드(조사된 14,000 중에서)의 인간 상피 세포 발현에 대한 각각의 식으로부터의 대표적인 펩티드의 효과는 하기 표 31 내지 37에 나타낸다. 각각의 식으로부터의 6 이상의 펩티드를, 인간 상피 폴리뉴클레오티드 발현을 변경하는 능력에 대해 테스트하였으며, 이들은 광범위한 자극 효과를 가졌다. 각각의 식에서, 군 내 각각의 펩티드에 의해 통상적으로 상향 조절된 50 이상의 폴리뉴클레오티드가 있었다.
[표 18] RAW 대식 세포의 펩티드 서열 번호 1 처리에 의해 상향 조절된 폴리뉴클레오티드a.
50 ㎍/㎖의 농도에서 양이온성 펩티드는 몇 가지 폴리뉴클레오티드의 발현을강력하게 유도하는 것으로 나타났다. 펩티드를 4 시간 동안 RAW 세포로 항온 처리하고, RNA를 본리하였으며, 표지된 cDNA 프로브로 전환시키고, 아틀라스 어레이로 하이브리드화하였다. 비자극된 세포의 강도는 제3 칼럼에 나타낸다. "비율: 펩티드 자극: 비자극" 칼럼은 비자극된 세포의 강도로 나눈 펩티드 자극된 세포 내 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 의미한다.
하우스키핑 폴리뉴클레오티드의 정규화된 강도 변화는 0.8 내지 1.2 배 범위였으며, 정규화를 위한 이러한 폴리뉴클레오티드의 사용이 유효하였다. 소정의 cDNA에 대한 정규화된 하이브리드화 강도가 20 미만인 경우, 20의 값을 할당하여 비율 및 상대 발현을 계산하였다. 어레이 실험은 상이한 RNA 제제로 3 회 반복하고, 평균 배율 변화는 위에 나타낸다. 상대 발현 레벨이 2 배 이상 변화된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
[표 19] RAW 대식 세포의 서열 번호 1 처리에 의해 하향 조절된 폴리뉴클레오티드a.
50 ㎍/㎖의 농도에서 양이온성 펩티드는 몇 가지 폴리뉴클레오티드의 발현을 감소시키는 것으로 나타났다. 펩티드를 4 시간 동안 RAW 세포로 항온 처리하고, RNA를 본리하였으며, 표지된 cDNA 프로브로 전환시키고, 아틀라스 어레이로 하이브리드화하였다. 비자극된 세포의 강도는 제3 칼럼에 나타낸다. "비율: 펩티드 자극: 비자극" 칼럼은 비자극된 세포의 강도로 나눈 펩티드 자극된 세포 내 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 의미한다. 어레이 실험은 상이한 RNA 제제로 3 회 반복하고, 평균 배율 변화는 위에 나타낸다. 상대 발현 레벨이 2 배 이상 변화된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
[표 20] 펩티드, 서열 번호 1에 다른 폴리뉴클레오티드 발현 변화는 RT-PCR에 의해 확인할 수 있다.
RAW 264.7 대식 세포를 4 시간 동안 펩티드 50 ㎍/㎖ 또는 배지 단독으로 항온 처리하고, 총 RNA를 분리하였으며, 반정량 RT-PCR을 행하였다. 각각의 폴리뉴클레오티드에 특이적인 프라이머 쌍을 RNA의 증폭에 사용하였다. β-악틴의 증폭을 양성 대조군으로서 표준화를 위해 사용하였다. RT-PCR 산물의 농도계 분석을 사용하였다. 결과는 배지 단독으로 항온 처리된 세포와 비교한 펩티드 처리된 세포의 폴리뉴클레오티드 발현의 상대 배율 변화에 관한 것이다. 데이타는 3 회 실험의 평균 ±표준 오차로 제공한다.
[표 21] A549 상피 세포의 펩티드 처리에 의해 상향 조절된 폴리뉴클레오티드a.
50 ㎍/㎖의 농도에서 양이온성 펩티드는 몇 가지 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 펩티드를 4 시간 동안 인간 A549 상피 세포로 항온 처리하고, RNA를 분리하였으며, 표지된 cDNA 프로브로 전환시키고, 인간 cDNA 어레이 ID#PRHU03-S3으로 하이브리드화하였다. 비자극된 세포 내 폴리뉴클레오티드의 강도는 제2 칼럼에 나타낸다. "비율 펩티드 자극:비자극"은 비자극된 세포의 강도로 나눈 펩티드 자극된 세포 내 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 의미한다.
[표 22] A549 상피 세포의 펩티드 처리에 의해 하향 조절된 폴리뉴클레오티드a.
50 ㎍/㎖의 농도에서 양이온성 펩티드는 몇 가지 폴리뉴클레오티드의 발현을 감소시키는 것으로 나타났다. 펩티드를 4 시간 동안 인간 A549 상피 세포로 항온 처리하고, RNA를 분리하였으며, 표지된 cDNA 프로브로 전환시키고, 인간 cDNA 어레이 ID#PRHU03-S3으로 하이브리드화하였다. 비자극된 세포 내 폴리뉴클레오티드의 강도는 제2 칼럼에 나타낸다. "비율 펩티드 자극:비자극"은 비자극된 세포의 강도로 나눈 펩티드 자극된 세포 내 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 의미한다.
[표 23] A549 세포의 펩티드 처리에 의해 상향 조절된 전구 염증성 폴리뉴클레오티드.
50 ㎍/㎖의 농도에서 양이온성 펩티드는 특정한 전구 염증성 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(데이타는 표 21의 소칼럼에 나타냄). 펩티드를 4 시간 동안 인간 A549 상피 세포로 항온 처리하고, RNA를 분리하였으며, 표지된 cDNA 프로브로 전환시키고, 인간 cDNA 어레이 ID#PRHU03-S3으로 하이브리드화하였다. 비자극된 세포 내 폴리뉴클레오티드의 강도는 제2 칼럼에 나타낸다. "비율 펩티드 자극:비자극"은 비자극된 세포의 강도로 나눈 펩티드 자극된 세포 내 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 의미한다.
[표 24] A549 세포의 펩티드 처리에 의해 하향 조절된 전구 염증성 폴리뉴클레오티드.
50 ㎍/㎖의 농도에서 양이온성 펩티드는 특정한 전구 염증성 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(데이타는 표 22의 소칼럼에 나타냄). 펩티드를 4 시간 동안 인간 A549 상피 세포로 항온 처리하고, RNA를 분리하였으며, 표지된 cDNA 프로브로 전환시키고, 인간 cDNA 어레이 ID#PRHU03-S3으로 하이브리드화하였다. 비자극된 세포 내 폴리뉴클레오티드의 강도는 제2 칼럼에 나타낸다. "비율 펩티드 자극:비자극"은 비자극된 세포의 강도로 나눈 펩티드 자극된 세포 내 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 의미한다.
[표 25] A549 세포의 펩티드 처리에 의한 상향 조절된 항염증성 폴리뉴클레오티드
50 ㎍/㎖ 농도의 양이온성 펩티드는 특정의 항염증성 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. (표 21의 서브세트의 데이타 참조). 사람 A549 상피 세포를 사용하여 펩티드를 4 시간 동안 배양하고, RNA를 분리하고, 이를 표지된 cDNA 탐침으로 전환시키고, 사람 cDNA 어레이 ID#PRHU03-S3으로 하이브리드화하였다. 비자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 강도는 두번째 컬럼에 기재하였다. "펩티드 자극형:비자극형의 비" 컬럼은 펩티드 자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 비자극형 세포의 강도로 나눈 값을 의미한다.
[표 26] A549 세포의 펩티드 처리에 의하여 하향 조절된 항염증성 폴리뉴클레오틸드
50 ㎍/㎖ 농도의 양이온성 펩티드는 특정의 항염증성 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. (표 21의 서브세트의 데이타 참조). 사람 A549 상피 세포를 사용하여 펩티드를 4 시간 동안 배양하고, RNA를 분리하고, 이를 표지된 cDNA 탐침으로 전환시키고, 사람 cDNA 어레이 ID#PRHU03-S3으로 하이브리드화하였다. 비자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 강도는 두번째 컬럼에 기재하였다. "펩티드 자극형:비자극형의 비" 컬럼은 펩티드 자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 비자극형 세포의 강도로 나눈 값을 의미한다.
[표 27] 1차 사람 대식세포에서의 서열 번호 6에 의하여 상향 조절된 폴리뉴클레오티드
50 ㎍/㎖ 농도의 펩티드 서열 번호 6은 다수의 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 사람 대식세포를 사용하여 펩티드를 4 시간 동안 배양하고, RNA를 분리하고, 이를 표지된 cDNA 탐침으로 전환시키고, 사람 오페론 어레이 (PRHU04)로 하이브리드화하였다. 비자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 강도는 두번째 컬럼에 기재하였다. "펩티드 자극형:비자극형의 비" 컬럼은 펩티드 자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 비자극형 세포의 강도로 나눈 값을 의미한다.
[표 28] 1차 사람 대식세포에서의 서열 번호 6에 의하여 하향 조절된 폴리뉴클레오티드
50 ㎍/㎖ 농도의 펩티드 서열 번호 6은 다수의 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 사람 대식세포를 사용하여 펩티드를 4 시간 동안 배양하고, RNA를 분리하고, 이를 표지된 cDNA 탐침으로 전환시키고, 사람 오페론 어레이 (PRHU04)로 하이브리드화하였다. 비자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 강도는 두번째 컬럼에 기재하였다. "펩티드 자극형:비자극형의 비" 컬럼은 펩티드 자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 비자극형 세포의 강도로 나눈 값을 의미한다.
[표 29] HBE 세포에서의 서열 번호 1에 의하여 상향 조절된 폴리뉴클레오티드
50 ㎍/㎖ 농도의 펩티드 서열 번호 1은 다수의 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 사람 HBE 상피 세포를 사용하여 펩티드를 4 시간 동안 배양하고, RNA를 분리하고, 이를 표지된 cDNA 탐침으로 전환시키고, 사람 오페론 어레이 (PRHU04)로 하이브리드화하였다. 비자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 강도는 두번째 컬럼에 기재하였다. "펩티드 자극형:비자극형의 비" 컬럼은 펩티드 자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 비자극형 세포의 강도로 나눈 값을 의미한다.
[표 30] HBE 세포에서의 펩티드 (50 ㎍/㎖), 서열 번호 1에 의하여 하향 조절된 폴리뉴클레오티드
50 ㎍/㎖ 농도의 펩티드 서열 번호 1은 다수의 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 사람 A549 상피 세포를 사용하여 펩티드를 4 시간 동안 배양하고, RNA를 분리하고, 이를 표지된 cDNA 탐침으로 전환시키고, 사람 오페론 어레이 (PRHU04)로 하이브리드화하였다. 비자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 강도는 세번째 컬럼에 기재하였다. "펩티드 자극형:비자극형의 비" 컬럼은 펩티드 자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 비자극형 세포의 강도로 나눈 값을 의미한다.
[표 31] 화학식 A 펩티드에 의하여 유도된 A549 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현의 상향 조절
50 ㎍/㎖ 농도의 펩티드는 다수의 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 사람 A549 상피 세포를 사용하여 펩티드를 4 시간 동안 배양하고, RNA를 분리하고, 이를 표지된 cDNA 탐침으로 전환시키고, 사람 오페론 어레이 (PRHU04)로 하이브리드화하였다. 대조군 비자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 강도는 두번째 컬럼에 기재하고, 염료 Cy3 및 Cy5 각각으로 cDNA의 표지화는 세번째 컬럼에 기재하였다. "ID#: 대조군" 컬럼은 펩티드 자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 비자극형 세포의 강도로 나눈 값을 의미한다.
[표 32] 화학식 B 펩티드에 의하여 유도된 A549 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현의 상향 조절
50 ㎍/㎖ 농도의 펩티드는 다수의 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 사람 A549 상피 세포를 사용하여 펩티드를 4 시간 동안 배양하고, RNA를 분리하고, 이를 표지된 cDNA 탐침으로 전환시키고, 사람 오페론 어레이(PRHU04)로 하이브리드화하였다. 대조군 비자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 강도는 두번째 컬럼에 기재하고, 염료 Cy3 및 Cy5 각각으로 cDNA의 표지화는 세번째 컬럼에 기재하였다. "ID#: 대조군" 컬럼은 펩티드 자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 비자극형 세포의 강도로 나눈 값을 의미한다.
[표 33] 화학식 C 펩티드에 의하여 유도된 A549 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현의 상향 조절
50 ㎍/㎖ 농도의 펩티드는 다수의 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 사람 A549 상피 세포를 사용하여 펩티드를 4 시간 동안 배양하고, RNA를 분리하고, 이를 표지된 cDNA 탐침으로 전환시키고, 사람 오페론 어레이(PRHU04)로 하이브리드화하였다. 대조군 비자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 강도는 두번째 컬럼에 기재하고, 염료 Cy3 및 Cy5 각각으로 cDNA의 표지화는 세번째 컬럼에 기재하였다. "ID#: 대조군" 컬럼은 펩티드 자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 비자극형 세포의 강도로 나눈 값을 의미한다.
[표 34] 식 D의 펩티드에 의해 유도되는 A549 세포내 폴리뉴클레오티드 발현의 상향 조절
농도 50 ㎍/ml의 펩티드는 다수의 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 펩티드를 4시간 동안 A549 상피 세포로 항온처리하고 RNA를 분리하여 표지된 cDNA 프로브로 전환시키고 인간 오페론 어레이(Human operon array)(PRHU04)에 하이브리드화하였다. 대조군인 비자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 강도는 각각 염료 Cy3 및 Cy5를 사용하는 cDNA 표지용 제2 컬럼 및 제3 컬럼에 나타난다. "서열번호: 대조군" 컬럼은 펩티드-자극형 세포내에서의 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 비자극형 세포의 강도로 나눈 것이다.
[표 35] 식 E의 펩티드에 의해 유도되는 A549 세포내 폴리뉴클레오티드 발현의 상향 조절
농도 50 ㎍/ml의 펩티드는 다수의 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 펩티드를 4시간 동안 A549 상피 세포로 항온처리하고 RNA를 분리하여 표지된 cDNA 프로브로 전환시키고 인간 오페론 어레이(Human operon array)(PRHU04)에 하이브리드화하였다. 대조군인 비자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 강도는 각각 염료 Cy3 및 Cy5를 사용하는 cDNA 표지용 제2 컬럼 및 제3 컬럼에 나타난다. "서열번호: 대조군" 컬럼은 펩티드-자극형 세포내에서의 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 비자극형 세포의 강도로 나눈 것이다.
[표 36] 식 F의 펩티드에 의해 유도되는 A549 세포내 폴리뉴클레오티드 발현의 상향 조절
농도 50 ㎍/ml의 펩티드는 다수의 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 펩티드를 4시간 동안 A549 상피 세포로 항온처리하고 RNA를 분리하여 표지된 cDNA 프로브로 전환시키고 인간 오페론 어레이(Human operonarray)(PRHU04)에 하이브리드화하였다. 대조군인 비자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 강도는 각각 염료 Cy3 및 Cy5를 사용하는 cDNA 표지용 제2 컬럼 및 제3 컬럼에 나타난다. "서열번호:대조군의 비율" 컬럼은 펩티드-자극형 세포내에서의 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 비자극형 세포의 강도로 나눈 것이다.
[표 37] 식 G의 펩티드에 의해 유도되는 A549 세포내 폴리뉴클레오티드 발현의 상향 조절
농도 50 ㎍/ml의 펩티드는 다수의 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 펩티드를 4시간 동안 A549 상피 세포로 항온처리하고 RNA를 분리하여 표지된 cDNA 프로브로 전환시키고 인간 오페론 어레이(Human operonarray)(PRHU04)에 하이브리드화하였다. 대조군인 비자극형 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 강도는 각각 염료 Cy3 및 Cy5를 사용하는 cDNA 표지용 제2 컬럼 및 제3 컬럼에 나타난다. "서열번호:대조군의 비율" 컬럼은 펩티드-자극형 세포내에서의 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 비자극형 세포의 강도로 나눈 것이다. 기탁 번호 및 유전자 명칭은 U00115, 징크 핑거 단백질; M91036, 헤모글로빈 감마 G; K000070, 가상 단백질; AF055899, 용질 운반체 패밀리 27; AK001490, 가상 단백질; X97674, 핵 수용체 공동 활성화 인자 2; AB022847, 불명; AJ275986, 전사 인자; D10495, 단백질 키나제 C, 델타; L36642, EphA7; M31166, 펜탁신-관련 유전자; AF176012, 불명; AF072756, 키나제 앵커 단백질 4; NM_014439, IL-1 상과 z; AJ271351, 추정 전사 조절인자; AK000576, 가상 단백질; AJ272265, 분비되는 인단백질 2; AL122038, 가상 단백질; AK000307, 가상 단백질; AB029001, KIAA1078 단백질; U62437 콜린효능성 수용체; AF064854, 불명; AL031588, 가상 단백질; X89399, RAS p21 단백질 활성화 인자; D45399, 포스포디에스테라제; AB037716, 가상 단백질; X79981, 카드헤린 5; AF034208, RIG-유사 7-1; AL133355, 엽록소 21 오픈 리딩 프레임 53; NM_016281, STE20-유사 키나제; AF023614, 경막 활성화 인자 및 상호작용인자; AF056717, 애쉬2-유사; AB029039, KIAA1116 단백질; J03634, 인히빈, 베타 A; U80764, 불명; AB032963, 불명; X82835, 나트륨 채널, 전압-게이트, IX 타입이다.
실시예 5
세포주, 인간 전혈 및 마우스에서 펩티드에 의한 케모카인의 유도
쥐 대식 세포주 raw 264.7, THP-1 세포(인간 단핵구), 인간 상피 세포주(A549), 인간 기관지 상피 세포(16HBEo14) 및 인간 전혈을 사용하였다. HBS 세포를 Earle's를 함유하는 MEM에서 성장시켰다. THP-1 세포를 RPMI 1640 배지에서생장 및 유지시켰다. RAW 및 A549 세포주를 10%의 태아 소 혈청을 보충한 DMEM에서 유지하였다. 이 세포를 DMEM(상기 참조)내에서 웰당 106의 세포의 밀도에서 24 웰 평판에 접종하고 A549 세포는 DMEM(상기 참조)내에서 웰당 105의 세포의 밀도에서 24 웰 평판에 접종하였으며 둘다 5% CO2에서 밤새 37℃에서 항온처리하였다. DMEM을 밤새 성장시킨 세포에서 흡인하고 새로운 배지로 교체하였다. 펩티드로 세포를 항온처리한 후 ELISA(미국 미네소타주 미네아폴리스에 소재하는 R & D Systems사)로 케모카인이 배양 상청액내로 방출되는 것을 측정하였다.
동물 연구는 UBC 동물 보호 협회(UBC ACC # A01-0008)의 승인을 받았다. BALB/c 마우스를 Charles River Laboratories에서 구입하여 표준 동물 시설에서 키웠다. 나이, 성별 및 중량이 맞는 성숙한 마우스를 아베르틴(증류수내 4.4 mM 2-2-2-트리브로모에탄올, 2.5% 2-메틸-2-부탄올)을 체중 10 g당 200㎕로 사용하여 복막내 주사로 마취시켰다. 1973년 Ho 및 Furst가 채택한 비외과적 기관내 주입 방법을 사용하여 주입하였다. 간단하게는, 마취시킨 쥐를 놓고 지지 프레임의 상부에서 와이어 상에 마취시킨 마우스의 윗니를 걸고 턱을 벌려 놓고 스프링을 목구멍에 밀어 넣어 수직선으로 인두, 후두 및 기관으로 향하게 한다. 공기 경로는 외부에서 조사하고, 뚜렷하게 조사된 기관 관강에 삽관 카테터를 삽입하였다. 20 ㎕의 펩티드 현탁액 또는 무균수를 카테터의 근위 말단에 있는 웰에 두고 200 ㎕의 공기를 기관에 서서히 주입시켰다. 주입후 동물을 2분동안 위로 향한 자세로 유지하여 유체가 호흡기내로 드레인되게 하였다. 300 mg/kg의 펜토바르비탈을 복막내 주사하여 안락사시켰다. 기관을 노출시키고 정맥내 카테터를 근위 기관에 통과시키고 봉합실로 고정하였다. 기관 캐뉼러를 통하여 0.75 ml의 무균 PBS를 폐에 도입함으로써 세척을 실시한 다음 수초후 유체를 빼내었다. 이것을 동일한 PBS 샘플로 3회 반복하였다. 세척액을 얼음 위의 튜브에 넣었고 마우스당 총 회복 부피는 약 0.5 ml였다. 폐포 세척(BAL)액을 10분 동안 1200 rpm에서 원심분리한 다음 맑은 상청액을 분리하여 ELISA에 의하여 TNF-α및 MCP-1에 대하여 테스트하였다.
양이온성 펩티드에 의한 케모카인의 상향 조절은 몇가지 상이한 시스템에서 확인되었다. 쥐 MCP-1, 인간 MCP-1의 상동체는 β(C-C) 케모카인 패밀리의 구성원이다. MCP-1은 단핵구, NK 세포 및 일부 T 림프구를 보충하는 것이 검증되었다. RAW 264.7 대식 세포 및 인간 전혈(3인의 공여자로부터 얻음)을 서열 번호 1의 펩티드의 농도를 증가시켜 자극할 경우, ELISA로 판단할 때 유의적 수준의 MCP-1을 상청액에 생성시켰다(표 36). 24시간 동안 20∼50 ㎍/ml 농도 범위의 펩티드로 자극한 RAW 264.7 세포는 유의적 수준의 MCP-1(200∼400 pg/ml above background)을 생성시켰다. 세포(24 시간) 및 인간 전혈(4 시간)을 100 ㎍/ml의 LL-37로 자극할 경우, 높은 수준의 MCP-1이 생성되었다.
또한, 케모카인 유도에 미치는 양이온성 펩티드의 효과도 완전히 상이한 세포계, A549 인간 상피 세포에서 조사하였다. 흥미롭게도, 이들 세포는 LPS에 대한 반응으로 MCP-1을 생성시키고 이러한 반응은 펩티드에 의하여 중화되나, 서열 번호 1의 펩티드에 대한 직접적인 반응에서 A549 세포에 의한 MCP-1의 생성은 없었다. 그러나, 고농도의 서열 번호 1의 펩티드는 IL-8, 호중구 특이 케모카인의 생성을유도하였다(표 37). 이들 펩티드의 다수는 저농도, 10 ㎍/ml에서 IL-8 상기 배경 수준을 유도하였다. 고농도(100 ㎍/ml)에서 서열 번호 13은 인간 전혈에서 IL-8을 유도하는 것으로 판명되었다. 서열 번호 2의 펩티드는 또 HBE 세포(표 40) 및 미분화 THP-1 세포(표 41)에서 IL-8을 유의적으로 유도하였다.
BALB/c 마우스에 서열 번호 1 또는 엔도톡신-없는 물을 기관내 주입에 의하여 가하고 3∼4 시간후 폐포 세척액내 MCP-1 및 TNF-α의 수준을 조사하였다. 50 ㎕/ml의 서열 번호 1의 펩티드로 처리한 마우스는 물 또는 마취제만을 받은 마우스에 비하여 유의적으로 증가된 수준의 MCP-1을 생성시켰다(표 42). 펩티드는 물 또는 마취제만을 받은 마우스보다 현저히 더 많은 TNF-α를 유도하지 않았으므로 이것은 서열 번호 1의 펩티드에 대한 친염증 반응이었다. 서열 번호 1의 펩티드는 또한 서열 번호 1의 펩티드로 처리된 골수-유도 대식 세포 및 RAW 264.7 세포에 의한 TNF-α생성을 유의적으로 유도하지 않은 것이 판명되었다(100 ㎍/ml 이하)(표 43). 따라서, 서열 번호 1의 펩티드는 TNF-α와 같은 염증 매개 인자의 생성을 유도하지 않고 케모카인의 생성을 선택적으로 유도한다. 이것은 염증을 치유할 수 있는 식세포의 보충을 도우면서 세균 생성물로 유도된 염증을 차단할 수 있는 인자로서의 서열 번호 1의 펩티드의 이중 역할을 나타낸다.
[표 38] RAW 264.7 세포 및 인간 전혈의 유도
RAW 264.7 마우스 대식 세포 또는 인간 전혈을 4 시간 동안 농도를 증가시킨 LL-37로 자극하였다. 인간 혈액 샘플을 원심분리하고 혈청을 분리하여 RAW 264.7 세포로부터 얻은 상청액과 함께 ELISA에 의하여 MCP-1에 대해 테스트하였다. 존재하는 RAW 세포 데이타는 3 이상의 실험 ±표준 오차의 평균이고 인간 혈액 데이타는 3의 개별 공여자로부터 얻은 평균 ±표준 오차이다.
[표 39] A549 세포 및 인간 전혈내 IL-8의 유도
A549 세포 또는 인간 전혈을 각각 24 및 4 시간 동안 증가된 농도의 펩티드로 자극하였다. 인간 혈액 샘플을 원심분리하고 혈청을 분리하여 A549 세포로부터 얻은 상청액과 함께 ELISA에 의하여 IL-8에 대해 테스트하였다. 존재하는 A549 세포 데이타는 3 이상의 실험 ±표준 오차의 평균이고 인간 혈액 데이타는 3의 개별공여자로부터 얻은 평균 ±표준 오차이다.
[표 40] 양이온성 펩티드에 의한 A549 세포에서 IL-8의 유도
A549 인간 상피 세포를 24 시간 동안 10 ㎍의 펩티드로 자극하였다. 상청액을 분리하여 ELISA에 의하여 IL-8에 대해 테스트하였다.
[표 41] 인간 혈액내에서 펩티드에 의한 IL-8의 유도
인간 전혈을 증가하는 농도의 펩티드로 4 시간 동안 자극하였다. 인간 혈액 샘플을 원심분리하여 상청액을 분리하고 ELISA에 의하여 IL-8에 대한 테스트를 하였다. 데이타는 평균 2 공여자에 나타났다.
[표 42] HBE 세포에서 IL-8의 유도
증가하는 농도의 펩티드를 8 시간 동안 HBE 세포로 항온처리하고, 상청액을 분리하여 IL-8에 대해 테스트하였다. 제시된 데이타는 3 이상의 실험 ±표준 오차의 평균이다.
[표 43] 미분화된 THP-1에서 IL-8의 유도
인간 단핵구 THP-1 세포를 지시된 농도의 펩티드로 8 시간 동안 항온처리하였다. 상청액을 분리하여 ELISA에 의하여 IL-8에 대한 테스트를 하였다.
[표 44] 마우스 공기 통로에서 서열 번호 1의 펩티드에 의한 MCP-1의 유도
BALB/c 마우스를 펩티드를 아베르틴으로 마취시키고 펩티드 또는 물을 기관내 주입시키거나 주입시키지 않았다(처리 안함). 마우스를 4 시간 동안 모니터링하고 마취시키고 BAL액을 분리시켜 ELISA에 의하여 MCP-1 및 TNF-α농도 분석을 하였다. 기술된 데이타는 각 조건 ±표준 오차에 대한 4 또는 5 마리의 마우스의 평균이다.
[표 45] 양이온성 펩티드에 의한 유의적인 TNF-α유도 결핍
6 시간 동안 지시된 펩티드(40 ㎍/ml)로 RAW 264.7 대식 세포를 항온처리하였다. 상청액을 수거하여 ELISA에 의하여 TNF-α의 수준에 대한 테스트를 하였다. 데이타는 3 이상의 실험 ±표준 오차의 평균으로서 나타낸다.
실시예 6
양이온성 펩티드는 케모카인 수용체의 표면 발현을 증가시킨다
IL-8RB, CXCR-4, CCR2 및 LFA-1의 세포 표면 발현을 분석하기 위하여, RAW 대식 세포를 10 ㎍/ml의 적절한 1차 항체(Santa Cruz Biotechnology)로 염색한 다음 FITC-접합된 염소 항-래빗 IgG [IL-8RB 및 CXCR-4 (미국 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재 Jackson ImmunoResearch Laboratories)] 또는 FITC-접합된 당나귀 항-염소 IgG (Santa Cruz)로 염색하였다. FACscan을 사용하여 세포들을 분석하여 10,000의 결과를 헤아렸고 세포 조각을 제거하기 위하여 전방 및 측방 스캐터 상에 배출시켰다.
폴리뉴클레오티드 어레이 데이타는 일부 펩티드가 케모카인 수용체 IL-8RB,CXCR-4 및 CCR2의 발현을 상기 비자극형 세포에 대하여 각각 10, 4 및 1.4배 상향 조절함을 시사하였다. 폴리뉴클레오티드 어레이 데이타를 확인하기 위하여 4 시간 동안 펩티드로 자극한 RAW 세포 상에서 이들 수용체의 흘림세포계측법에 의하여 표면 발현을 조사하였다. 50 ㎍/ml의 펩티드를 4 시간 동안 RAW 세포로 항온처리할 경우, IL-8RB는 상기 비자극형 세포의 평균 2.4배 상향 조절되고, CXCR-4는 상기 비자극형 세포의 평균 1.6배 상향 조절되며, CCR2는 상기 비자극형 세포의 평균 1.8배 상향 조절되었다(표 46). 대조군 CEMA는 비슷한 상향 조절을 야기하는 것이 증명되었다. Bac2A는 LFA-1 (대조군 세포 보다 3.8배 높음)의 유의적 상향 조절을 보이는 유일한 펩티드였다.
[표 46] 펩티드에 대한 반응으로 CXCR-4, IL-8RB 및 CCR2의 표면 발현 증가
RAW 대식 세포를 4 시간 동안 펩티드로 자극하였다. 세포를 세척하고 적절한 1차 및 FITC-표지된 2차 항체로 염색하였다. 기재된 데이타는 평균(배지로부터의 펩티드로 자극한 RAW 세포의 폴드 변화) ±표준 오차를 나타낸다.
실시예 7
양이온성 펩티드에 의한 맵 키나제의 포스포릴화
세포를 2.5 x 105∼ 5 x 105세포/ml로 접종하고 밤새 정치시켰다. 이들을 일단 배지에서 세척하고 아침에 혈청을 절식시켰다(혈청 없는 배지 - 4 시간). 배지를 분리하여 PBS로 교체한 다음 15 분간 37℃에서 두고 15 분간 실온으로 회복시켰다. 펩티드를 가하거나(농도 O.l ㎍/ml ∼ 50 ㎍/ml) 또는 H20를 가하고 10 분간 항온처리하였다. PBS를 매우 신속히 제거하고 억제 인자(NaF, B-글리세로포스페이트, MOL, 바나데이트, PMSF, 류펩틴 아프로티닌)가 함유된 빙냉 방사면역침전물(RIPA)로 교체하였다. 10∼15분 동안 또는 세포가 용균될 때까지 평판을 흔들어주고 용균액을 수거하였다. THP-1 세포에 대한 절차는 다소 상이하였고 더 많은 세포(2 x 106)를 사용하였다. 이들은 밤새 혈청을 절식시키고 반응을 중단시키기 위하여 1 ml의 빙냉 PBS를 가한 다음 5∼10 분간 정치시키고 스핀 다운한 다음 RIPA에 재현탁하였다. 단백질 분석( Protein concentrations were determined using a protein assay (미국 일리노이주 로크포드 소재의 Pierce사)을 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 세포 용균액(단백질 20 ㎍)을 SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로즈 필터에 옮겼다. 필터를 1 시간 동안 10 mM의 Tris-HCI, pH 7.5, 150 mM의 NaCl(TBS)/5%의 스킴 밀크 분말로 1 시간 동안 블록킹한 다음 TBS/0.05% Tween 20에서 1차 항체로 전온으로 밤새 항온처리하였다. TBS/0.05% Tween 20으로 30분간 세척한 후, 필터를 1 시간 동안 실온에서 TBS내 1 ㎍/ml의 2차 항체로 항온처리하였다. 필터를 30분간 TBS/0.05% Tween 20으로 세척한 다음 실온에서 1 시간 동안 고추냉이 퍼옥시다제-접합된 양의 항-마우스 IgG(1:10,000 TBS내/0.05% Tween 20)로 항온처리하였다. 30분간 TBS/0.1% Tween 20으로 필터를 세척한 후, 면역반응성 밴드를 증대된 화학발광(ECL) 검출에 의하여 시각화하였다. 말초 혈액 단핵구를 이용한 실험에서 말초 혈액(50∼lOO ml)을 모든 대상으로부터 수거하였다. 단핵구를 Ficoll-Hypaque 상에서 밀도 경사 원심분리에 의하여 말초 혈액으로부터 분리하였다. 간기 세포(단핵구)를 수거하여 세척한 다음 10% 태아 소 혈청(FCS) 및 1% L-글루타민으로 추천된 세포 배양용 1차 배지(RPMI-1640)에 재현탁하였다. 세포를 6웰 배양 평판에 4 x 106세포/웰로 첨가하고 1 시간 동안 5% CO2대기에서 37℃에서 부착되게 하였다. 상청액 배지 및 비-부착 세포를 세척해 버리고 펩티드를 함유하는 적절한 배지를 첨가하였다. 새로 수확한 세포는 트리판 블루를 소모하는 능력으로 추정컨대 생존율이 항상 99%를 넘었다. 펩티드로 자극한 후, 생존가능한 포스파타제- 및 키나제-억제 인자의 존재하에 RIPA 완충액을 용균시켜 용균액을 수거하였다. 단백질 함량을 분석하고 약 30 ㎍의 각 샘플을 12% SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 겔을 니트로셀룰로즈 상에 블롯팅하고 1%의 Triton X 100을 함유하는 트리스 완충 염수(TBS)내 5% 스킴 밀크 분말로 1 시간 동안 블록킹하였다. 포스포릴화-특이 항체로 포스포릴화를 검출하였다.
펩티드-유도 포스포릴화의 결과는 표 46에 요약되어 있다. 서열 번호 2는 마우스 대식 RAW 세포주 및 HBE 세포에서 p38 및 ERK1/2의 용량 의존 포스포릴화를 야기하는 것으로 판명되었다. 서열 번호 3은 THP-1 인간 단핵구 세포주에서 MAP 키나제의 포스포릴화 및 마우스 RAW 세포주에서 ERK1/2의 포스포릴화를 초래하였다.
[표 47] 펩티드에 대한 반응에서 MAP의 포스포릴화
[표 48] 인간 혈액 단핵구에서 MAP 키나제의 펩티드 포스포릴화.
50 ㎍/ml의 서열 번호 1을 사용하여 포스포릴화를 촉진하였다.
실시예 8
양이온성 펩티드는 면역 반응을 증대시킴으로써 세균 감염을 방지한다
BALB/c 마우스에 1 x 105의 살로넬라 및 양이온성 펩티드(200 ㎍)을 복막내 주사로 투입하였다. 마우스를 이들의 안락사 시점에서 24 시간 동안 모니터링하고 비장을 분리하여 균질화하고 PBS에 재현탁하고 캐나마이신(50 ㎍/ml)을 함유하는 Luria 영양 배지 한천 평판에서 평판 배양하였다. 평판을 밤새 37℃에서 항온처리하고 생존가능한 세균을 세었다(표 49 및 50). CD-1 마우스에 복막내 주사로 5% 돼지 점액내 1 x 108에스, 아우레우스(S. aureus) 및 양이온성 펩티드(200 ㎍)를 투입하였다(표 51). 마우스를 이들이 안락사하는 시점에서 24 시간 동안 3 일간 모니터링하고 혈액을 분리하여 생존가능한 숫자에 대하여 평판 배양하였다. CD-1 수컷 마우스에 5.8 x 106CFU EHEC 세균 및 양이온성 펩티드(200 ㎍)를 복막내(IP) 주사로 투입하고 3 일간 모니터링하였다(표 52). 이들 각 동물 모델에서, 서브세트의 펩티드들은 감염을 방지하는 것으로 증명되었다. 살모넬라 모델에서 대부분의 보호 펩티드는 표 31∼37의 유전자 발현 결과에 표 50 및 51의 보호 분석 결과를 비교할때 상피 세포에서 통상의 서브세트의 유전자를 유도하는 능력이 증명되었다(표 53). 이것은 명백히 보호를 나타내는 펩티드의 능력에 있어 일정한 유전자 발현의 패턴이 있음을 나타내는 것이다. 다수의 양이온성 펩티드는 최소 억제 농도(MIC) 분석에 의하여 테스트할 때 직접적인 항미생물성이 아닌 것으로 나타났다(표 54). 이것은 감염을 방지하는 펩티드의 능력이 직접적인 항미생물 활성보다는 숙주의 선천적 면역을 자극하는 펩티드의 능력에 의존함을 증명한다.
[표 49] BALB/c 마우스에서 살모넬라 감염에 미치는 양이온성 펩티드의 영향
BALB/c 마우스에 살모넬라 및 펩티드를 IP 주입하고 24 시간후 동물을 안락사시키고 비장을 분리하여 균질화하고 PBS에서 희석하고 평판에서 수를 세어 세균 생존율을 측정하였다.
[표 50] BALB/c 마우스에서 살모넬라 감염에 미치는 양이온성 펩티드의 영향
BALB/c 마우스에 살모넬라 및 펩티드를 IP 주입하고 24 시간후 동물을 안락사시키고 비장을 분리하여 균질화하고 PBS에서 희석하고 평판에서 수를 세어 세균생존율을 측정하였다.
[표 51] 쥐의 에스.아우레우스 감염 모델에서 양이온성 펩티드의 영향
CD-1 마우스에 복막내(IP) 주사를 통하여 5% 돼지 점액내의 1 x 108의 ㅔㅅ균을 주입하였다. 별도의 IP 주사를 통하여 양이온성 펩티드(200 ㎍)를 공급하였다. 마우스를 이들이 안락사하는 시점에서 3일간 모니터링하고 혈액을 분리하여 생존가능한 숫자로 평판 배양하였다. 서열 번호 48, 서열 번호 26의 펩티드는 에스. 아우레우스를 조절하는데 효과적이 아니었다.
[표 52] 쥐의 EHEC 감염 모델에서 펩티드의 영향
CD-1 수컷 마우스(5주)에 복막내(IP) 주사를 통하여 5.8 x 106CFU EHEC를 주입하였다. 별도의 IP 주사를 통하여 양이온성 펩티드(200 ㎍)를 공급하였다. 마우스를 3일간 모니터링하였다.
[표 53] 생체내 활성인 펩티드에 의하여 유도되는 A549 상피 세포에서 유전자 발현 패턴의 상향 조절
서열 번호 30, 서열 번호 7 및 서열 번호 13의 펩티드는 50 ㎍/ml의 농도에서 각각 4 시간 처리후 유전자 패턴의 발현이 증가된 것으로 나타났다. 펩티드를 4시간 동안 인간 A549 상피 세포로 항온처리하고 RNA를 분리하여 표지된 cDNA 프로브로 전환하고 인간 오페론 어레이(PRHU04)에 하이브리드화하였다. 대조군인 비자극형 세포내 폴리뉴클레오티드의 강도는 cDNA의 표지에 대한 제2 컬럼(Cy3 및 Cy5의 평균)에 나타낸다. 폴드 상향 조절 컬럼은 비자극형 세포의 강도로 나눈 펩티드-자극형 세포내 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 나타낸다. 서열 번호 37의 펩티드는 쥐 감염 모델에서 활성이 아닌 음성 대조군으로서 포함되었다.
[표 54] 여기서 연구되는 대부분의 양이온성 펩티드, 특히 감염 모델에서 효과적인 양이온성 펩티드는 현저히 항미생물성인 것은 아니다. 일련의 희석 펩티드를 96-웰 평판에서 밤새 지시된 세균으로 항온처리하였다. 세균을 죽인 펩티드의 최저 농도를 MIC로서 사용하였다. 기호 >는 MIC가 너무 커서 측정할 수 없음을 나타낸다. 8 ㎍/ml 이하의 MIC는 임상적으로 의미있는 활성인 것으로 고려된다. 약어는 다음과 같다: 이.콜리(E. coli), 에스케리치아 콜리(Escherichia coli); 에스. 아우레우스(S. aureus), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus); 피.아에룩(P. aerug), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa); 에스. 티핌(S. Typhim), 살모넬라 엔트리티디스 에스에스피. 티피무리움(Salmonella enteritidis ssp. typhimurium); 씨. 로드(C. rhod), 키토박테르 로덴시스(Citobacter rhodensis); EHEC, 엔테로하이모르하직(Enterohaemorrhagic) E. coli.
실시예 9
진단/스크리닝에서 박테리아 시그널링 분자에 의하여 유도된 폴리뉴클레오티드의 사용
Sigma Chemical Co.(미주리주 세인트루이스 소재)로부터 에스.타이피뮤리움(S.typhimurium) LPS 및 이.콜라이(E.Coli) 0111:B4 LPS를 구입하였다. 에스.아우레우스(S.aureus)로부터 유래된 LTA(Sigma)를 내독소를 함유하지않는 물(Sigma)에 재현탁시켰다. LTA 제제로 리물루스 아메바성 세포(Limulus amoebocyte) 용해 분석(Sigma)을 수행하여, 분액들이 내독소에 의하여 유의적으로 오염되지는 않았음[즉, RAW 세포 분석법에서 사이토킨을 유의적으로 생성하지 않는 농도, <1 ng/㎖]을 확인하였다. Applied Biosystems Inc.의 Model 392 DNA/RNA Synthesizer(오타리오주 미시사가 소재)를 사용하여 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드를 합성한 다음, 정제하여 이를 내독소를 함유하지 않는 물(Sigma)에 재현탁시켰다. 다음의 서열들을 사용하였다:CpG:5'-TCATGACGTTCCTGACGTT-3'(서열 번호 57) 및 비CpG:5'-TTCAGGACTTTCCTCAGGTT-3'(서열 번호 58). 상기 비CpG 올리고를 그의 사이토카인 생성 자극 능력에 대하여 테스트한 결과, TNF-α 또는 IL-6를 거의 생성하지 않음을 발견하였으며, 이로써 이를 음성 대조군으로 간주하였다. 4 시간 동안 배지 단독으로, 그리고 100 ng/㎖의 에스.타이피뮤리움 LPS, 1 ㎍/㎖이 에스.아우레우스 LTA 또는 1μM의 CpG[이들 농도는 RAW 세포내에서 종양 괴사 인자(TNF-α)를 최적으로 유도시키는 농도임]와 함께 항온처리한 RAW 264.7 세포로부터 RNA를 분리하였다. 상기 RNA를 사용하여 전술한 바와 같이, Clontech Atlas 폴리뉴클레오티드 어레이 필터에 하이브리드화된 cDNA 프로브를 폴리뉴클레오티드로 만들었다. 각각의 고정화된 DNA에의 cDNA 프로브의 하이브리드화를 방사선 자동 사진으로 가시화하였으며, 포스포이미저를 사용하여 정량화하였다. 2∼3회의 독립적인 실험으로부터 얻어진 결과들을 표 55∼59에 요약하였다. RAW 264.7 세포를 LPS로 처리한 결과, 염증 단백질 예컨대, IL-β, 유도성 산화질소 신타제(iNOS), MIP-α, MIP-1β, MIP-2α, CD40 및 다양한 전사 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 비롯한폴리뉴클레오티드의 발현을 60 배 이상 증가시켰다. LPS, LTA 및 CpG DNA에 의하여 유발되는 폴리뉴클레오티드 발현율의 변화를 비교하였을 때, 이러한 3가지의 박테리아 생성물 모두는 후-염증성(pro-inflammatory) 폴리뉴클레오티드 예컨대, iNOS, MIP-1α, MIP-2α, IL-1β, IL-15, TNFR1 및 NF-κB의 발현율을 유사한 정도로 상승시켰음을 알 수 있었다(표 57 참조). 표 57은 박테리아 생성물에 의하여 유사한 정도로 상승-조절된 19개의 폴리뉴클레오티드는 자극율에 있어서 상기 3가지의 박테리아 생성물간에 1.5배 미만까지 차이가 난다고 기술하고 있다. 또한, LPS, LTA 및 CpG에 의하여 유사한 정도로 하향 조절된 몇몇 폴리뉴클레오티드도 존재하였다. 뿐만 아니라, 하나 이상의 박테리아 생성물간 발현 수준이 1.5배 이상 차이가 나는 다수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 3 가지 박테리아 생성물에 반응하여 순차적으로 조절되는 다수의 폴리뉴클레오티드가 존재한다는 사실도 발견하였다. LTA 처리는 LPS 또는 CpG에 비하여 순차적으로, Jun-D, Jun-B, Elk-1 및 사이클린 G2 및 A1 발현의 초자극을 비롯한, 폴리뉴클레오티드의 가장 큰 서브세트의 발현율에 영향을 준다. LPS 또는 CpG 처리에 의하여 발현이 더욱 변경되는 폴리뉴클레오티드도 소수 존재한다. LTA 또는 CpG 처리보다는 LPS 처리로 인하여 발현이 더욱 증가되는 폴리뉴클레오티드로서는, cAMP 반응 요소 DNA-결합 단백질 1(CRE-BP1), 인터페론 유도성 단백질 1 및 CACCC 박스-결합 단백질 BKLF를 포함한다. LPS 또는 LTA 처리시 보다는 CpG 처리후에 발현이 더욱 증가되는 폴리뉴클레오티드로서는 백혈병 억제 인자(LIF) 및 프로테아제 넥신 1(PN-1)을 포함한다. 이러한 결과들은, 비록 LPS, LTA 및 CpG DNA가 상당 부분 중첩되는 폴리뉴클레오티드 발현 반응을 자극함에도 불구하고, 이들은 또한 폴리뉴클레오티드의 특정 서브세트를 순차적으로 조절하는 능력을 나타낸다는 사실을 제시한다.
사용된 기타 폴리뉴클레오티드 어레이로서는 인간 오페론 어레이[게놈에 대한 식별 번호 = PRHU04-S1]가 있으며, 이는 이중으로 산포되어 있는 약 14,000개의 인간 올리고로 이루어져 있다. 전체 RNA 5 ㎍으로부터 프로브를 제조하였으며, 이를 Cy3 또는 Cy5 표지화된 dUTP로 표지화하였다. 이 실험에서, A549 상피 세포를 100 ㎜의 조직 배양 접시에 2.5 ×106세포/접시의 농도로 도말하고, 이를 밤세도록 항온처리한 후, 4 시간 동안 100 ng/㎖의 이.콜라이 O111:B4 LPS로 자극하였다. RNAqueous(Ambicon)을 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. 무-DNA 키트(앰비콘)로 DNA 오염을 제거하였다. 전체 RNA로부터 제조된 프로브를 정제하여, 이를 42℃에서 밤새도록 프린팅된 유리 슬라이드상에 하이브리드화시킨후 세척하였다. 세척한후, Perkin Elmer 어레이 스캐너를 사용하여 이미지를 포착하였다. 이미지 프로세싱 소프트웨어(Imapolynucleotide 5.0, Marina Del Rey, CA)는 스팟의 평균 강도, 중간 강도 및 백그라운드 강도를 측정하는 것이다. "인 하우스(in house)" 프로그램을 사용하여 백그라운드를 없앴다. 이 프로그램은 각각의 서브그리드(subgrid)에 대한 기준 10% 강도를 계산하고, 각각의 그리드(grid)에 대한 기준 10% 강도는 공제한다. Polynucleotidespring 소프트웨어(캘리포니아 레드우드 시티 소재)를 사용하여 분석을 수행하였다. 슬라이드내 스팟 군집의 값으로부터 중앙 스팟 강도값을 취하여, 이 값을 실험에 의한 모든 슬라이드 값과 비교함으로써, 각 스팟에 대한 강도를 표준화하였다. LPS 처리된 세포에서 나타나는, 대조군 세포에 대한 상대적 변화를 이하 표에 제시하였다. 감염을 진단하는데 유용한, 미리 보고되지 않은 다수의 변화에 관하여는 표 60에 제시하였다.
이러한 변화의 기능상 유의성을 확인 및 평가하기 위하여, 선택된 mRNA 및 단백질 수준을 밀도계측계로 평가 및 정량화하였다. CD14, 비멘틴 및 트리스테트라프롤린-특이적 프로브를 사용하는 노던 블럿으로 3가지 박테리아 생성물 모두로 자극된 이후의 발현율은 유사함을 확인하였다(표 60). 이와 유사하게, 염증 매개제인 NO의 수준을 측정하기 위하여 Griess 시약으로 산화질소 신타제, iNOS의 효소 활성을 측정한 결과 24 시간 경과후 제조된 NO 수준은 iNOS 발현의 유사한 상향 조절과 거의 일치함을 알 수 있었다(표 59). 웨스턴 블럿 분석법을 통하여, CpG에 의하여 백혈병 억제 인자(LIF, 사이토카인의 IL-6과의 구성원)가 더욱 많이 자극됨을 확인하였다. 다른 확인용 실험을 통하여, LPS는 TNF-α 및 IL-6의 발현을 상향 조절하고[이에 관하여는 ELISA에 의해 평가됨], MIP-2α 및 IL-1βmRNA의 발현은 상향 조절하며, DP-1 및 사이클린 D mRNA는 하향 조절한다는 것[이에 관하여는 노던 블럿 분석법에 의하여 평가됨]을 확인하였다. 이러한 분석법은, 박테리아 요소가 인간 전혈중 후염증성 사이토카인 생성을 자극하는 능력을 관찰함으로써 임상적으로 보다 관련된 세포외 시스템으로 까지 확장되었다. 이로써 이.콜라이 LPS, 에스.타이피뮤리움 LPS 및 에스.아우레우스 LTA 모두가 유사량의 혈청 TNF-α 및 IL-1β를 자극하였음을 알 수 있었다. CpG 또한 이러한 사이토카인들의 생성을 비록 낮은 수준이기는 하였으나 자극하였으며, 이는 부분적으로 세포주 데이터를 확인시켜 주는 것이다.
[표 55] A549 상피 세포내에서 이.콜라이 O111:B4 LPS에 의하여 상향 조절된 폴리뉴클레오티드
이.콜라이 O111:B4 LPS(100 ng/㎖)는 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이에 의하여 연구된 바와 같이 A549 세포에서 다수의 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시켰다. LPS를 4 시간 동안 A549 세포와 함께 항온처리하여 RNA를 분리하였다. 전체 RNA 5㎍을 사용하여 Cy3/Cy5 표지화된 cDNA 프로브를 제조하였으며, 이는 또한 인간 오페론 어레이(PRHU04)상에 하이브리드화되었다. 비자극 세포의 강도는 표 55의 두번째 컬럼에 나타내었다. "LPS/대조군의 비" 컬럼은 비자극 세포의 강도로 LPS 자극 세포의 발현 강도를 나눈 값을 의미한다.
기탁 번호 유전자 대조군:배지만을 함유하는경우의 강도 LPS/대조군의 비
D87451 링 핑거 단백질 10 715.8 183.7
AF061261 C3H-타입 징크 핑거 단백질 565.9 36.7
D17793 알도-케토 리덕타제 패밀리1, 구성원 C3 220.1 35.9
M14630 프로티모신, 알파 168.2 31.3
AL049975 불명 145.6 62.3
L04510 ADP-리보실화 인자 도메인단백질 1, 64 kD 139.9 213.6
U10991 G2 단백질 101.7 170.3
U39067 진핵생물 번역 개시 인자 3,서브유닛 2 61.0 15.9
X03342 리보좀 단백질 L32 52.6 10.5
NM_004850 단백질 키나제 2 함유Rho-관련, 코일링된 코일 48.1 11.8
AK000942 불명 46.9 8.4
AB040057 세린/트레오닌 단백질키나제 MASK 42.1 44.3
AB020719 KIAA0912 단백질 41.8 9.4
AB007856 FEM-1-유사 세포사 수용체결합 단백질 41.2 15.7
J02783 프로콜라겐-프롤린,2-옥소글루타레이트4-디옥시게나제 36.1 14.1
AL137376 불명 32.5 17.3
AL137730 불명 29.4 11.9
기탁 번호 유전자 대조군:배지만을 함유하는경우의 강도 LPS/대조군의 비
D25328 포스포프럭토키나제, 혈소판 27.3 8.5
AF047470 말레이트 디하이드로게나제2,NAD 25.2 8.2
M86752 스트레스-유발성-포스포단백질 1 22.9 5.9
M90696 카텝신 S 19.6 6.8
AK001143 불명 19.1 6.4
AF038406 NADH 디하이드로게나제 17.7 71.5
AK000315 가상 단백질 FLJ20308 17.3 17.4
M54915 pim-1 암 유전자 16.0 11.4
D29011 프로테아좀 서브유닛,베타 타입, 5 15.3 41.1
AK000237 콜린성 시냅스 소포의막 단백질 15.1 9.4
AL034348 불명 15.1 15.8
AL161991 불명 14.2 8.1
AL049250 불명 12.7 5.6
AL050361 PTD017 단백질 12.6 13.0
U74324 RAB 상호작용 인자 12.3 5.2
M22538 NADH 디하이드로게나제 12.3 7.6
D87076 KIAA0239 단백질 11.6 6.5
NM_006327 내부 미토콘드리아 막 23(효모) 상동체의트랜스로카제 11.5 10.0
AK001083 불명 11.1 8.6
AJ001403 뮤신5, 서브타입 B,기관지 10.8 53.4
기탁 번호 유전자 대조군:배지만을 함유하는경우의 강도 LPS/대조군의 비
M64788 RAP1, GTPase 활성화단백질 1 10.7 7.6
X06614 레티논산 수용체, 알파 10.7 5.5
U85611 칼슘 및 통합 결합 단백질 10.3 8.1
U23942 시토크롬 P450,51 10.1 10.2
AL031983 불명 9.7 302.8
NM_007171 단백질-O-만노실트랜스퍼라제 1 9.5 6.5
AK000403 가상 단백질 FLJ20396 9.5 66.6
NM_002950 리보포린 1 9.3 35.7
L05515 cAMP 반응 요소-결합 단백질CRE-BPa 8.9 6.2
X83368 포스포이노시티드-3-키나제,촉매성, 감마 폴리펩티드 8.7 27.1
M30269 니도겐(인액틴) 8.7 5.5
M91083 11번 염색체 개방 해독틀 13 8.2 6.6
D29833 타액 프롤린-풍부 단백질 7.7 5.8
AB024536 류신-풍부 반복부 함유면역글로불린 상과 7.6 8.0
U39400 11번 염색체 개방 해독틀 4 7.4 7.3
AF028789 unc119(씨.엘레강스) 상동체 7.4 27.0
NM_003144 시그널 서열 수용체,알파(트랜스로콘-관련단백질 알파) 7.3 5.9
기탁 번호 유전자 대조군:배지만을 함유하는경우의 강도 LPS/대조군의 비
X52195 아라키도네이트 5-리폭시게나제-활성화 단백질 7.3 13.1
U43895 인간 생장 인자-조절성 티로신키나제 기질 6.9 6.9
L25876 사이클린-의존성 키나제억제제 3 6.7 10.3
L04490 NADH 디하이드로게나제 6.6 11.1
Z18948 S100 칼슘-결합 단백질 6.3 11.0
D10522 미리스틸화된 알라닌-풍부단백질 키나제 C 기질 6.1 5.8
NM_014442 시알산 결합 Ig-유사 렉틴 8 6.1 7.6
U81375 용질 운반체 패밀리 29 6.0 6.4
AF041410 악성종양-관련 단백질 5.9 5.3
U24077 킬러 세포 면역글로불린-유사단백질 5.8 14.4
AL137614 가상 단백질 4.8 6.8
NM_002406 만노실(알파-1,3)-당단백질베타-1,2-N-아세틸글루코사밀트랜스퍼라제 4.7 5.3
AB002348 KIAA0350 단백질 4.7 7.6
AF165217 트로포모듈린 4(근육) 4.6 12.3
Z14093 분지쇄 케토산 디하이드로게나제E1,알파 폴리펩티드 4.6 5.4
U82671 칼트랙틴 3.8 44.5
기탁 번호 유전자 대조군:배지만을 함유하는경우의 강도 LPS/대조군의 비
AL050136 불명 3.6 5.0
NM_005135 용질 운반체 패밀리 12 3.6 5.0
AK001961 가상 단백질FLJ11099 3.6 5.9
AL034410 불명 3.2 21.3
S74728 안티퀴틴 1 3.1 9.2
AL049714 리보좀 단백질 L34위유전자 2 3.0 19.5
NM_014075 PRO0593 단백질 2.9 11.5
AF189279 포스포리파제 A2, ⅡE 군 2.8 37.8
J03925 인테그린, 알파 M 2.7 9.9
NM_012177 F-박스 단백질 Fbx5 2.6 26.2
NM_004519 칼륨 전압-게이팅된 채널,KQT-유사 서브패밀리,구성원 3 2.6 21.1
M28825 CD1A 항원, 폴리펩티드 2.6 16.8
X16940 액틴, 감마 2, 장내 평활근 2.4 11.8
X03066 주 조직적합 복합체,클래스 Ⅱ, DO 베타 2.2 36.5
AK001237 가상 단백질FLJ10375 2.1 18.4
AB028971 KIAA1048 단백질 2.0 9.4
AL137665 불명 2.0 7.3
[표 56] A549 상피 세포내에서 이.콜라이 O111:B4 LPS에 의하여 하향 조절된 폴리뉴클레오티드
폴리뉴클레오티드 마이크로어레이에 의하여 연구된 바와 같이, 이.콜라이 O111:B4 LPS(100 ng/㎖)는 A549 세포에서 다수의 폴리뉴클레오티드의 발현을 감소시켰다. LPS를 A549 세포와 함께 4 시간 동안 항온처리한후, RNA를 분리하였다. 전체 RNA 5 ㎍을 사용하여 Cy3/Cy5 표지화된 cDNA 프로브를 제조하였으며, 이는 또한 인간 오페론 어레이(PRHU04)상에 하이브리드화되었다. 비자극 세포의 강도는 이하 표의 두번째 컬럼에 나타내었다. "LPS/대조군의 비" 컬럼은 비자극 세포의 강도로 LPS 자극 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현 강도를 나눈 값을 의미한다.
기탁 번호 유전자 대조군:배지만을 함유하는경우의 강도 LPS/대조군의 비
NM_017433 미오신 ⅢA 167.8 0.03
X60484 H4 히스톤 패밀리 구성원 E 36.2 0.04
X60483 H4 히스톤 패밀리 구성원 D 36.9 0.05
AF151079 가상 단백질 602.8 0.05
M96843 DNA 결합 2, 우성의 음성 헬릭스-루프-헬릭스 단백질의억제제 30.7 0.05
S79854 디요오디나제, 요오도티로닌,타입 Ⅲ 39.4 0.06
AB018266 마트린 3 15.7 0.08
M33374 NADH 디하이드로게나제 107.8 0.09
AF005220 NUP98-HOXD13 융합 단백질,부분 cds에 대한호모 사피엔스 mRNA 105.2 0.09
Z80783 H2B 히스톤 패밀리, 구성원 L 20.5 0.10
Z46261 H3 히스톤 패밀리, 구성원 A 9.7 0.12
Z80780 H2B 히스톤 패밀리, 구성원 H 35.3 0.12
U33931 적혈구 막 단백질 밴드 7.2(스토마틴) 18.9 0.13
M60750 H2B 히스톤 패밀리, 구성원 A 35.8 0.14
Z83738 H2B 히스톤 패밀리, 구성원 E 19.3 0.15
Y14690 콜라겐, 타입 Ⅴ, 알파 2 7.5 0.15
M30938 차이니즈 햄스터 세포 5에서의X-선 수복 상보성 결함 수복 11.3 0.16
L36055 진핵 생물 번역 개시 인자 4E 182.5 0.16
기탁 번호 유전자 대조군:배지만을 함유하는경우의 강도 LPS/대조군의 비
결합 단백질 1
Z80779 H2B 히스톤 패밀리, 구성원 G 54.3 0.16
AF226869 5(3)-데옥시리보뉴클레오티다제;RB-관련 KRAB 억제제 7.1 0.18
D50924 KIAA0134 유전자 생성물 91.0 0.18
AL133415 비멘틴 78.1 0.19
AL050179 트로포미오신 1(알파) 41.6 0.19
AJ005579 RD 요소 5.4 0.19
M80899 AHNAK 핵단백질 11.6 0.19
NM_004873 BCL2-관련 아타노겐 5 6.2 0.19
X57138 H2A 히스톤 패밀리, 구성원 N 58.3 0.20
AF081281 리소포스포리파제 Ⅰ 7.2 0.22
U96759 본 Hippel-Lindau 결합 단백질 1 6.6 0.22
U85977 인간 리보좀 단백질 L12위유전자, 부분 cds 342.6 0.22
D13315 글리옥살라제 Ⅰ 7.5 0.22
AC003007 불명 218.2 0.22
AB032980 RU2S 246.6 0.22
U40282 인테그린-결합 키나제 10.1 0.22
U81984 상피 PAS 도메인 단백질 1 4.7 0.23
X91788 염소이온 채널,뉴클레오티드-감수성,1A 9.6 0.23
AF018081 콜라겐, 타입 ⅩⅧ, 알파 1 6.9 0.24
L31881 핵상 인자 Ⅰ/Ⅹ(CCAAT-결합 전사 인자) 13.6 0.24
X61123 B-세포 전위 유전자 1,항-증식성 5.3 0.24
L32976 미토겐-활성화된 단백질 키나제 6.3 0.24
기탁 번호 유전자 대조군:배지만을 함유하는경우의 강도 LPS/대조군의 비
키나제 11
M27749 면역글로불린 람다-유사폴리펩티드 3 5.5 0.24
X57128 H3 히스톤 패밀리, 구성원 C 9.0 0.25
X80907 포스포이노시티드-3-키나제,조절 서브유닛, 폴리펩티드 2 5.8 0.25
Z34282 뮤신(일부)에 대한에이치.사피엔스(MAR11)MUC5AC mRNA 100.6 0.26
X00089 H2A 히스톤 패밀리, 구성원 M 4.7 0.26
AL035252 CD39-유사 2 4.6 0.26
X95289 MHC 클래스 Ⅰ 영역내PERB11 패밀리 구성원 27.5 0.26
AJ001340 U3 snoRNP-관련 55 kDa 단백질 4.0 0.26
NM_014161 HSPC071 단백질 10.6 0.27
U60873 불명 6.4 0.27
X91247 티오리독신 리덕타제 1 84.4 0.27
AK001284 가상 단백질 FLJ 10422 4.2 0.27
U90840 활막 육종, X 파열점 3 6.6 0.27
X53777 리보좀 단백질 L17 39.9 0.27
AL035067 불명 10.0 0.28
AL117665 DKFZP586M1824 단백질 3.9 0.28
L14561 ATPase, Ca2+ 운반, 원형질막 1 5.3 0.28
L19779 H2A 히스톤 패밀리, 구성원 O 30.6 0.28
AL049782 불명 285.3 0.28
X00734 튜블린, 베타 5 39.7 0.29
AK001761 레티논산 유도 3 23.7 0.29
U72661 닌쥬린 1 4.4 0.29
기탁 번호 유전자 대조군:배지만을 함유하는경우의 강도 LPS/대조군의 비
S48220 디요오디나제, 요오도티로닌,타입 Ⅰ 1.296.1 0.29
AF025304 EphB2 4.5 0.30
S82198 키모트립신 C 4.1 0.30
Z80782 H2B 히스톤 패밀리, 구성원 K 31.9 0.30
X68194 시냅토피신-유사 단백질 7.9 0.30
AB028869 불명 4.2 0.30
AK000761 불명 4.3 0.30
[표 57] 박테리아 생성물 LPS, LTA 및 CpG DNA에 의한 자극 이후에 유사한 정도로 발현된 폴리뉴클레오티드
박테리아 생성물(100 ng/㎖의 에스.타이피뮤리움 LPS, 1 ㎍/㎖의 에스.아우레우스 LTA 또는 1 μM CpG)은 몇몇 폴리뉴클레오티드의 발현을 유력하게 유도시키는 것으로 나타났다. 펩티드를 RAW 세포와 함께 4 시간 동안 항온 처리하고, RNA를 분리한 다음, 이를 표지된 cDNA 프로브로 전환시켜 Atlas 어레이에 하이브리드화시켰다. 대조군인 비자극 세포의 강도를 두번째 컬럼에 나타내었다. "LPS/LTA/CpG:대조군의 비" 컬럼은 비자극된 세포의 강도로 나눈 박테리아 생성물-자극된 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 의미한다.
[표 58] 박테리아 생성물인 LPS, LTA 및 CpG DNA에 의하여 순차적으로 조절된 폴리뉴클레오티드
박테리아 생성물(100 ng/㎖의 에스.타이피뮤리움 LPS, 1 ㎍/㎖의 에스.아우레우스 LTA 또는 1 μM CpG)은 몇몇 폴리뉴클레오티드의 발현을 유력하게 유도시키는 것으로 나타났다. 펩티드를 RAW 세포와 함께 4 시간 동안 항온 처리하고, RNA를 분리한 다음, 이를 표지된 cDNA 프로브로 전환시켜 Atlas 어레이에 하이브리드화시켰다. 대조군인 비자극 세포의 강도를 두번째 컬럼에 나타내었다. "LPS/LTA/CpG:대조군의 비" 컬럼은 비자극된 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현의 강도로 나눈 박테리아 생성물-자극된 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현의 강도를 의미한다.
[표 59] 표 57 및 58 아레이 데이터의 확인
a) 비자극 RAW 대식세포로부터 전체 RNA를 분리하여, 이 세포를 4 시간 동안 100 ng/㎖의 에스.타이피뮤리움 LPS, 1 ㎍/㎖의 에스.아우레우스 LTA, 1 μM CpG DNA와 함께, 또는 배지 단독으로 항온처리한 다음, 노던 블럿을 수행하였다[전술한바와 같이, 막은 GAPDH, CD14, 비멘틴 및 트리스테트라프롤린에 대하여 프로빙함; Scott외 다수]. 노던 블럿의 하이브리드화 강도를 GAPDH와 비교한 결과, 로딩이 불일치함을 발견하였다. 이러한 실험을 3회 이상 반복 수행하였으며, 이하에 나타낸 데이터는 배지와 비교한 각 조건의 평균적인 상대 수준(밀도계에 의하여 측정됨) ±표준 오차이다.
b) 100 ng/㎖의 에스.타이피뮤리움 LPS, 1 ㎍/㎖의 에스.아우레우스 LTA, 1 μM CpG DNA와 함께, 또는 배지 단독으로 24 시간 동안 항온처리하여 RAW 264.7 세포를 자극하였다. 단백질 용해물을 준비한 다음, 이를 SDS PAGE 겔 상에서 전개시키고, 웨스턴 블럿을 수행하여 LIF(R&D Systems)를 검출하였다. 이러한 실험을 3회 이상 반복 수행하였으며, 이하에 나타낸 데이터는 배지와 비교한 LIF의 상대 수준(밀도계에 의하여 측정됨) ±표준 오차이다.
c) 100 ng/㎖의 에스.타이피뮤리움 LPS, 1 ㎍/㎖의 에스.아우레우스 LTA, 1 μM CpG DNA와 함께, 또는 배지 단독으로 24 시간 동안 처리한 RAW 대식 세포로부터 상청액을 수집하여, 이를 전술한 바와 같이 안정한 NO 대사물질 아질산염의 축적량으로부터 측정된, 상청액중 생성된 NO의 양에 대하여 Griess 시약으로 테스트하였다[Scott외 다수]. 여기에 나타낸 데이터는 3회 실험값의 평균 ±표준 오차이다.
[표 60] 박테리아 시그널링 분자(LPS)에 의하여 상향-조절된 A549 인간 상피 세포에서의 유전자 발현 패턴
폴리뉴클레오티드 마이크로어레이에 의하여 연구된 바에 의하면, 이.콜라이 O111:B4 LPS(100 ng/㎖)는 A549 세포내에서 다수의 폴리뉴클레오티드 발현을 증가시켰다. LPS를 A549 세포와 함께 4 시간 동안 항온처리한 다음, RNA를 분리하였다. 전체 RNA 5 ㎍을 사용하여 Cy3/Cy5 표지화된 cDNA 프로브를 제조하였으며, 이를 또한 인간 오페론 어레이(PRHU04)상에 하이브리드화하였다. LPS 자극된 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현 변화 예를 들어, 미처리 세포로부터 유래된 LPS 처리 세포의 강도 수준 변화는 2 배 이상이다.
실시예 10
박테리아 감염에 대한 보호를 위한 시그널링의 변경
미국 모식균 배양 수집소(ATCC: 버지니아 매너사 소재)로부터 살모넬라 타이피뮤리움 균주 SL1344를 입수하여, 이를 루리아-버타니(LB) 브로쓰에서 생장시켰다. 대식 세포 감염을 위해서, 125 ㎖들이 플라스크중에 냉동 글리세롤 스톡으로부터 얻은 LB 10 ㎖를 접종시키고, 이를 진탕시키면서 37℃에서 밤새도록 고정상에서 배양하였다. RAW 264.7 세포(1 ×105세포/웰)를 24 웰 평판에 종균시켰다. 박테리아를 배양 배지중에 희석시켜 명목상의 감염 다중도(MOI)가 약 100이 되도록 만들고, 박테리아를 10분 동안 1000 rpm에서 원심분리시켜 단일층상에 감염을 동조화시켰으며, 또한 37℃, 5% CO2항온처리기에서 20분 동안 감염을 진행시켰다. 세포를 PBS로 3회 세척하여 세포외 박테리아를 제거하였으며, 그 다음 이를 DMEM + 100 ㎍/㎖의 젠타마이신을 함유하는 10% FBS(미주리주 세인트루이스 소재, Sigma)중에서 항온처리하여 임의의 남아있는 세포외 박테리아를 사멸시켜 재감염을 막았다. 2 시간후, 상기 젠타마이신 농도를 10 ㎍/㎖로 낮추고 분석 내내 이 농도로 유지시켰다. 세포를 30분 동안 억제제로 예비 처리한후, 다음과 같은 농도로 감염시켰다: 50 μM PD 98059(Calbiochem), 50 μM U 0126(Promega), 2 mM 디페닐요도늄(DPI), 250 μM 아세토바닐론(아포시닌, Aldrich), 1 mM 아스코르브산(Sigma), 30 mM N-아세틸 시스테인(Sigma), 및 2 mM NG-L-모노메틸 아르기닌(L-NMMA, Molecular Probes) 또는 2 mM NG-D-모노메틸 아르기닌(D-NMMA, Molecular Probes). 감염 직후 2 시간 및 6∼8 시간 경과시 신선한 억제제를 첨가하여 효능을 확인하였다. 대조군 세포를 배지 1 ㎖당 동부피의 디메틸설폭시드(DMSO)로 처리하였다. 전술한 바와 같이, 젠타마이신-내성 분석법을 사용하여 에스.타이피뮤리움 SL1344의 세포내 생존/복제율을 측정하였다. 요약하면, 세포를 PBS로 2회 세척하여 젠타마이신을 제거하고, 감염후 2 시간 및 24 시간 경과시 PBS내에서 1% Triton X-100/0.1% SDS로 용균시킨 다음, LB 아가 평판상 콜로니로부터 세포내 박테리아 수를 계수하였다. 표준 평판 계수법에 의하여 평가한 바에 의하면 이와 같은 감염 조건하에서, 대식 세포는 세포당 평균 1 마리의 박테리아를 함유하였으며, 이로써 감염후 24 시간 경과시 대식 세포를 분석할 수 있었다. 박테리아의 사상화(filamentation)는 박테리아 스트레스와 관련있다. NADPH 옥시다제 및 iNOS는 MEK/ERK 시그널링에 의하여 활성화될 수 있다. 그 결과(표 61)는, 세포 시그널링의 변화는 세포내 살모넬라 감염에 관한 문제를 해결할 수 있는 방법이라는 사실을 명백히 입증하였다. 따라서, 박테리아는 인간 세포내 다수의 유전자들을 상향 조절하므로, 시그널링을 막는 기술은 감염에 대한 일반적인 치료 방법을 대표한다.
[표 61] IFN- γ-프라이밍된 RAW 세포에 있어서 세포내 박테리아에 대한 시그널링 분자 MEK의 효과
실시예 11
항바이러스 활성
SDF-1 즉, C-X-C 케모카인은 HIV-1 보조수용체-CXCR4에 대한 천연 리간드이다. 케모카인 수용체 CXCR4 및 CCR5는 HIV-1 복제의 억제에 대한 잠재적 표적으로 간주된다. SDF-1의 결정 구조는 역평행 β-시트 및 양으로 하전된 표면, CXCR4의 음으로 하전된 세포외 루프에 결합하는데 중요한 역할을 하는 형태를 나타낸다. 이러한 발견은 케모카인의 구조 또는 이온성을 모의하는 케모카인 유도체 즉, 작은 크기의 CXCR4 길항제 또는 작용제가 X4 HIV-1 감염 처리용 제제로서 유용할 수 있음을 제시하는 것이다. 양이온성 펩티드 억제된 SDF-1 유도성 T-세포 이동은 이 펩티드가 CXCR4 길항제로서 작용할 수 있음을 제시한다는 것을 발견하였다. 이동 분석법은 다음과 같이 수행되었다. 인간 Jurkat T-세포를 주화성 배지[RPMI 1640/10 mM Hepes/0.5% BSA]중에 5 ×106/㎖의 농도로 재현탁시켰다. 5 ㎛의 폴리카르보네이트 Transwell 삽입물(Costar)를 사용하여 24 웰 평판내에서 이동 분석법을 수행하였다. 요약하면, 펩티드 또는 대조군을 주화성 배지중에 희석시키고, 이를 하층의 챔버에 넣은 다음, 0.1 ㎖의 세포(5 ×106/㎖)는 상층의 챔버에 첨가하였다. 37℃에서 3 시간 경과후, 유동 세포계측법에 의해 하층 챔버로 이동한 세포의 수를 측정하였다. 상기 하층 챔버로부터 얻은 배지를 30초 동안 FACscan에 통과시키고, 전방향 및 측방향 산란으로 게이팅(gating)하여 세포 파편을 제외시켰다. 생존 세포의 수를 "100% 이동 대조군"과 비교하였으며, 여기서 상기 생존 세포는 5 ×105/㎖ 세포를 하층 챔버로 직접 피펫팅한 후, 30초 동안 FACscan 상에서 계수하였다. 그 결과는 CXCR4 발현에 영향을 미침으로 인한 인간 Jurkat T-세포(표 62)의 이동을 억제시켰다(표 63 및 64).
[표 62] 펩티드는 인간 Jurkat-T 세포의 이동을 억제함:
이동율(%)
실험 양의 대조군 SDF-1(100 ng/㎖) SDF-1 +서열 번호 1(50 ㎍/㎖) 음의 대조군
1 100 32 0 < 0.01
2 100 40 0 0
[표 63] 표 56에 대응하는 폴리뉴클레오티드 어레이 데이터
폴리뉴클레오티드/단백질 폴리뉴클레오티드기능 비자극 세포의강도 펩티드:비자극 세포의비 기탁 번호
CXCR-4 케모카인 수용체 36 4 D87747
[표 64] 표 62 및 63에 대응하는 FACs 데이터
펩티드 농도(㎍/㎖) 단백질 발현에 있어서 폴딩의 증가 정도 CXCR-4
서열 번호 1 10 변화 없음
서열 번호 1 50 1.3 ±0.03
서열 번호 1 100 1.6 ±0.23
서열 번호 3 100 1.5 ±0.2
지금까지 본 발명은 바람직한 구체예를 참고로 하여 기술되었지만, 본 발명의 사상에서 벗어남이 없이 다양한 변형이 가능함을 이해해야 할 것이다. 따라서,본 발명은 오로지 다음의 청구항들에 의하여 한정된다.
SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA HANCOCK, Robert E. W. FINLAY, B. Brett SCOTT, Monisha Gough BOWDISH, Dawn ROSENBERGER, Carrie Melissa POWERS, Jon-Paul Steven <120> EFFECTORS OF INNATE IMMUNITY <130> UBC1180WO <140> PCT/CA 02/01830 <141> 2002-12-02 <150> US 60/336,632 <151> 2001-12-03 <160> 58 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu 1 5 10 15 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val 20 25 30 Pro Arg Thr Glu Ser 35 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Bovine <400> 2 Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Bovine <400> 3 Arg Leu Ala Arg Ile Val Val Ile Arg Val Ala Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Xaa is independently R, L or K and one or both may be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is one of C, S or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is one of R or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is one of A or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is one of A or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is one of V or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is one of C, S or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(14) <223> Xaa is independently R, L or K and one or both may be present <400> 4 Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Pro Xaa Ile Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 5 Leu Leu Cys Arg Ile Val Pro Val Ile Pro Trp Cys Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 6 Leu Arg Cys Pro Ile Ala Pro Val Ile Pro Val Cys Lys Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 7 Lys Ser Arg Ile Val Pro Ala Ile Pro Val Ser Leu Leu 1 5 10 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 8 Lys Lys Ser Pro Ile Ala Pro Ala Ile Pro Trp Ser Arg 1 5 10 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 9 Arg Arg Ala Arg Ile Val Pro Ala Ile Pro Val Ala Arg Arg 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 10 Leu Ser Arg Ile Ala Pro Ala Ile Pro Trp Ala Lys Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Xaa is independently D, E, S, T or N and one or both may be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(5) <223> Xaa is P, G or D and one or both may be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is one of G, A, V, L, I or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is one of R, K or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(10) <223> Xaa is P, G or D and one or both may be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is one of S, T, C, M or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is one of G, A, V, L, I or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is one of G, A, V, L, I or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(16) <223> Xaa is D, E, S, T or N and one or both may be present <400> 11 Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 12 Asp Leu Pro Ala Lys Arg Gly Ser Ala Pro Gly Ser Thr 1 5 10 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 13 Ser Glu Leu Pro Gly Leu Lys His Pro Cys Val Pro Gly Ser 1 5 10 <210> 14 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 14 Thr Thr Leu Gly Pro Val Lys Arg Asp Ser Ile Pro Gly Glu 1 5 10 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 15 Ser Leu Pro Ile Lys His Asp Arg Leu Pro Ala Thr Ser 1 5 10 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 16 Glu Leu Pro Leu Lys Arg Gly Arg Val Pro Val Glu 1 5 10 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 17 Asn Leu Pro Asp Leu Lys Lys Pro Arg Val Pro Ala Thr Ser 1 5 10 <210> 18 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(4) <223> Xaa is chosen from A, P or R and one, two, three or all four may be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(6) <223> Xaa is an aromatic amino acid (F, Y and W) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is one of P or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(9) <223> Xaa is chosen from A, P, Y or W and one, both or none may be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(12) <223> Xaa is chosen from A, P, Y or W and one, both or none may be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(15) <223> Xaa is chosen from A, P, Y or W and one, both or none may be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(18) <223> Xaa is chosen from R or P and one, two or three may be present <400> 18 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Lys <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 19 Arg Pro Arg Tyr Pro Trp Trp Pro Trp Trp Pro Tyr Arg Pro Arg Lys 1 5 10 15 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 20 Arg Arg Ala Trp Trp Lys Ala Trp Trp Ala Arg Arg Lys 1 5 10 <210> 21 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 21 Arg Ala Pro Tyr Trp Pro Trp Ala Trp Ala Arg Pro Arg Lys 1 5 10 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 22 Arg Pro Ala Trp Lys Tyr Trp Trp Pro Trp Pro Trp Pro Arg Arg Lys 1 5 10 15 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 23 Arg Ala Ala Phe Lys Trp Ala Trp Ala Trp Trp Arg Arg Lys 1 5 10 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 24 Arg Arg Arg Trp Lys Trp Ala Trp Pro Arg Arg Lys 1 5 10 <210> 25 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Xaa is R or K and one or both may be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is a polar or charged amino acid (S, T, M, N, Q, D, E, K, R and H) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is C, S, M, D or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is F, I, V, M or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(7) <223> Xaa is R or K and one or both may be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is C, S, M, D or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is F, I, V, M or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is F, I, V, M or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is C, S, M, D or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa is F, I, V, M or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(17) <223> Xaa is R or K and one or both may be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa is C, S, M, D or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(20) <223> Xaa is R or K and one or both may be present <400> 25 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Arg Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 26 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 26 Arg Arg Met Cys Ile Lys Val Cys Val Arg Gly Val Cys Arg Arg Lys 1 5 10 15 Cys Arg Lys <210> 27 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 27 Lys Arg Ser Cys Phe Lys Val Ser Met Arg Gly Val Ser Arg Arg Arg 1 5 10 15 Cys Lys <210> 28 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 28 Lys Lys Asp Ala Ile Lys Lys Val Asp Ile Arg Gly Met Asp Met Arg 1 5 10 15 Arg Ala Arg <210> 29 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 29 Arg Lys Met Val Lys Val Asp Val Arg Gly Ile Met Ile Arg Lys Asp 1 5 10 15 Arg Arg <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 30 Lys Gln Cys Val Lys Val Ala Met Arg Gly Met Ala Leu Arg Arg Cys 1 5 10 15 Lys <210> 31 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 31 Arg Arg Glu Ala Ile Arg Arg Val Ala Met Arg Gly Arg Asp Met Lys 1 5 10 15 Arg Met Arg Arg 20 <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is a polar or charged amino acid (S, T, M, N, Q, D, E, K, R and H) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is one of C, S, M, D or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is one of F, I, V, M or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(6) <223> Xaa is R or K and one or both may be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is one of A, I, S, M, D or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is one of F, I, V, M or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is one of F, I, V, M or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is one of A, I, S, M, D or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is one of F, I, V, M or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa is R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is one of C, S, M, D or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa is R or K <400> 32 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Arg Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 33 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 33 Arg Thr Cys Val Lys Arg Val Ala Met Arg Gly Ile Ile Arg Lys Arg 1 5 10 15 Cys Arg <210> 34 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 34 Lys Lys Gln Met Met Lys Arg Val Asp Val Arg Gly Ile Ser Val Lys 1 5 10 15 Arg Lys Arg <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 35 Lys Glu Ser Ile Lys Val Ile Ile Arg Gly Met Met Val Arg Met Lys 1 5 10 15 Lys <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 36 Arg Arg Asp Cys Arg Arg Val Met Val Arg Gly Ile Asp Ile Lys Ala 1 5 10 15 Lys <210> 37 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 37 Lys Arg Thr Ala Ile Lys Lys Val Ser Arg Arg Gly Met Ser Val Lys 1 5 10 15 Ala Arg Arg <210> 38 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 38 Arg His Cys Ile Arg Arg Val Ser Met Arg Gly Ile Ile Met Arg Arg 1 5 10 15 Cys Lys <210> 39 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is a polar amino acid (C, S, T, M, N and Q) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is one of A, L, S or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is one of A, L, S or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is one of A, L, S or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is one of A, L, S or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(31) <223> Xaa is amino acids chosen from G, A, V, L, I, P, F, S, T, K and H and one to seventeen may be present <400> 39 Lys Xaa Lys Xaa Phe Xaa Lys Met Leu Met Xaa Ala Leu Lys Lys Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 <210> 40 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 40 Lys Cys Lys Leu Phe Lys Lys Met Leu Met Leu Ala Leu Lys Lys Val 1 5 10 15 Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Lys Leu Thr Lys 20 25 <210> 41 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 41 Lys Ser Lys Ser Phe Leu Lys Met Leu Met Lys Ala Leu Lys Lys Val 1 5 10 15 Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser 20 25 <210> 42 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 42 Lys Thr Lys Lys Phe Ala Lys Met Leu Met Met Ala Leu Lys Lys Val 1 5 10 15 Val Ser Thr Ala Lys Pro Leu Ala Ile Leu Ser 20 25 <210> 43 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 43 Lys Met Lys Ser Phe Ala Lys Met Leu Met Leu Ala Leu Lys Lys Val 1 5 10 15 Leu Lys Val Leu Thr Thr Ala Leu Thr Leu Lys Ala Gly Leu Pro Ser 20 25 30 <210> 44 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 44 Lys Asn Lys Ala Phe Ala Lys Met Leu Met Lys Ala Leu Lys Lys Val 1 5 10 15 Thr Thr Ala Ala Lys Pro Leu Thr Gly 20 25 <210> 45 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 45 Lys Gln Lys Leu Phe Ala Lys Met Leu Met Ser Ala Leu Lys Lys Lys 1 5 10 15 Thr Leu Val Thr Thr Pro Leu Ala Gly Lys 20 25 <210> 46 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(26) <223> Xaa at residues 4, 7, 8, 10, 11,14, 15 is a hydrophobic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(26) <223> Xaa at residues 5, 6, 9, 12, 13 is a hydrophilic amino acid <400> 46 Lys Trp Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile 1 5 10 15 Phe His Thr Ala Leu Lys Pro Ile Ser Ser 20 25 <210> 47 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 47 Lys Trp Lys Ser Phe Leu Arg Thr Phe Lys Ser Pro Val Arg Thr Ile 1 5 10 15 Phe His Thr Ala Leu Lys Pro Ile Ser Ser 20 25 <210> 48 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 48 Lys Trp Lys Ser Tyr Ala His Thr Ile Met Ser Pro Val Arg Leu Ile 1 5 10 15 Phe His Thr Ala Leu Lys Pro Ile Ser Ser 20 25 <210> 49 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 49 Lys Trp Lys Arg Gly Ala His Arg Phe Met Lys Phe Leu Ser Thr Ile 1 5 10 15 Phe His Thr Ala Leu Lys Pro Ile Ser Ser 20 25 <210> 50 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 50 Lys Trp Lys Lys Trp Ala His Ser Pro Arg Lys Val Leu Thr Arg Ile 1 5 10 15 Phe His Thr Ala Leu Lys Pro Ile Ser Ser 20 25 <210> 51 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 51 Lys Trp Lys Ser Leu Val Met Met Phe Lys Lys Pro Ala Arg Arg Ile 1 5 10 15 Phe His Thr Ala Leu Lys Pro Ile Ser Ser 20 25 <210> 52 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 52 Lys Trp Lys His Ala Leu Met Lys Ala His Met Leu Trp His Met Ile 1 5 10 15 Phe His Thr Ala Leu Lys Pro Ile Ser Ser 20 25 <210> 53 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 53 Lys Trp Lys Ser Phe Leu Arg Thr Phe Lys Ser Pro Val Arg Thr Val 1 5 10 15 Phe His Thr Ala Leu Lys Pro Ile Ser Ser 20 25 <210> 54 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cationic peptide <400> 54 Lys Trp Lys Ser Tyr Ala His Thr Ile Met Ser Pro Val Arg Leu Val 1 5 10 15 Phe His Thr Ala Leu Lys Pro Ile Ser Ser 20 25 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR amplification primer <400> 55 gtccctgtat gcctctggtc 20 <210> 56 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR amplification primer <400> 56 gatgtcacgc acgatttcc 19 <210> 57 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> CpG oligonucleotide <400> 57 tcatgacgtt cctgacgtt 19 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nonCpG oligonucleotide <400> 58 ttcaggactt tcctcaggtt 20

Claims (88)

1종 이상의 패혈증 또는 염증 유도제에 의해 조절되고 양이온성 펩티드에 의해 억제되는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 패턴을 확인하는 방법으로서, 폴리뉴클레오티드(들)를 1종 이상의 패혈증 또는 염증 유도제와 접촉시키는 단계, 동시에 또는 직후에 상기 폴리뉴클레오티드(들)를 양이온성 펩티드와 접촉시키는 단계, 및 발현 변화를 결정하는 단계를 포함하며, 발현 변화가 패혈증 또는 염증 유도제에 의해 조절되고 양이온성 펩티드에 의해 감소되는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 패턴을 나타내는 것인 방법.
제1항에 있어서, 패혈증 또는 염증 유도제가 LPS, LTA 또는 CpG DNA, 박테리아 성분이나 전체 세포, 또는 관련 제제인 것인 방법.
제1항에 있어서, 패혈증 또는 염증 유도제와 접촉시키기 전후에 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항의 방법으로 확인된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 패턴.
제3항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 염증성 또는 패혈성 반응과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 것인 폴리뉴클레오티드.
제5항의 폴리뉴클레오티드를 제제와 조합하는 단계를 포함하는 패혈증 또는 염증을 차단하는 제제의 확인 방법으로서, 제제의 존재 하의 폴리뉴클레오티드 발현은 제제의 부재 하의 발현과 비교하여 조절되며, 상기 발현 조절은 염증성 또는 패혈성 반응에 영향을 주는 방법.
제6항에 있어서, 상기 영향은 염증성 또는 패혈성 반응의 억제인 것인 방법.
제6항의 방법으로 확인된 제제.
제8항에 있어서, 제제는 펩티드, 펩티드 유사체(peptidomimetic), 화학적 화합물, 핵산 분자 또는 폴리펩티드인 것인 제제.
제8항에 있어서, 펩티드는 서열 번호 4 내지 54로부터 선택되는 것인 제제.
염증성 또는 패혈성 반응의 억제를 위한 폴리뉴클레오티드 발현 패턴을 확인하는 방법으로서,
양이온성 펩티드의 존재 또는 부재 하에 세포를 LPS, LTA, CpG DNA 및/또는 온전한 박테리아 또는 박테리아 성분과 접촉시키는 단계;
펩티드의 존재 및 부재 하에 세포에 대한 폴리뉴클레오티드 발현 패턴을 검출하는 단계를 포함하고, 펩티드의 존재 하의 패턴이 염증성 또는 패혈성 반응의 억제를 나타내는 것인 방법.
제11항에 있어서, 염증성 반응 또는 패혈성 반응을 억제할 것으로 추정되는 1종 이상의 화합물과 세포를 접촉시키는 단계 및 염증성 또는 패혈성 반응을 억제하는 양이온성 펩티드로 얻은 패턴과 유사한 폴리뉴클레오티드 발현 패턴을 제공하는 화합물을 확인하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제11항의 방법으로 확인된 화합물.
선천 면역과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들)를 해당 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 선천 면역을 증가시키는 제제의 확인 방법으로서, 제제의 존재 하의 폴리뉴클레오티드 발현은 제제의 부재 하의 폴리뉴클레오티드 발현과 비교하여 조절되고, 발현 조절로 선천 면역이 증가되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 제제는 패혈성 반응을 자극하지 않는 것인 방법.
제14항에 있어서, 제제는 염증성 또는 패혈성 반응을 억제하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 제제는 염증성 또는 패혈성 반응을 차단하는 것인 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 제제는 항염증성을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 것인 방법.
제18항에 있어서, 항염증성 유전자는 IL-1R 길항제 상동체 1 (AI167887), IL-10R 베타 (AA486393), IL-10R 알파 (U00672) TNF 수용체 구성원 1B (AA150416), TNF 수용체 구성원 5 (H98636), TNF 수용체 구성원 11b (AA 194983), HLA II의 IK 사이토킨 하향 조절인자 (R39227), TGF-B 유도성 초기 성장 반응 2 (AI473938), CD2 (AA927710), 글루코코르티코이드 관련 폴리뉴클레오티드 (AK000892) 또는 IL-10 (M5762720)을 포함하는 서브세트로부터 선택되는 것인 방법.
제19항에 있어서, 제제가 TNF-알파의 발현을 억제하는 것인 방법.
제19항에 있어서, 제제가 인터류킨의 발현을 억제하는 것인 방법.
제23항에 있어서, 인터류킨이 IL-8인 것인 방법.
제16항에 있어서, 제제가 펩티드인 것인 방법.
제23항에 있어서, 펩티드가 서열 번호 4 내지 54로부터 선택되는 것인 방법.
제14항의 방법으로 확인된 제제.
제25항에 있어서, 제제는 펩티드, 펩티드 유사체, 화학적 화합물 또는 핵산 분자인 것인 제제.
선천 면역을 선택적으로 증가시키는 화합물을 확인하기 위한 폴리뉴클레오티드 발현 패턴의 확인 방법으로서,
양이온성 펩티드의 존재 및 부재 하에 접촉한 세포에 대한 폴리뉴클레오티드 발현 패턴을 검출하는 단계[펩티드의 존재 하의 패턴은 선천 면역의 자극을 나타냄];
테스트 화합물의 존재 하에 접촉한 세포에 대한 폴리뉴클레오티드 발현 패턴을 검출하는 단계[양이온성 펩티드의 존재 하에 관찰된 패턴과 유사한 테스트 화합물의 존재 하의 패턴은 테스트 화합물이 선천 면역을 높이는 화합물임을 나타냄]를 포함하는 방법.
제27항의 방법에 의해 확인된 화합물.
제27항에 있어서, 화합물은 패혈성 반응을 자극하지 않는 것인 방법.
제27항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 발현 패턴은 전염증성 폴리뉴클레오티드의 발현을 포함하는 것인 방법.
제30항에 있어서, 전염증성 폴리뉴클레오티드는 링 핑거 단백질 10 (D87451), 세린/트레오닌 단백질 키나제 MASK (AB040057), KIAA0912 단백질 (AB020719), KIAA0239 단백질 (D87076), RAP1, GTPase 활성화 단백질 1 (M64788), FEM-1-유사 세포사 수용체 결합 단백질 (AB007856), 카텝신 S (M90696), 가상 단백질 FLJ20308 (AK000315), pim-1 종양유전자 (M54915), 프로테아솜 서브유닛 베타 타입 5 (D29011), KIAA0239 단백질 (D87076), 뮤신 5 서브타입 B 기관기관지 (AJ001403), cAMP 반응 요소-결합 단백질 CREBPa, 인테그린 알파 M (J03925), Rho-관련 키나제 2 (NM_004850), PTD017 단백질 (AL050361), 불명 유전자(AK001143, AK034348, AL049250, AL16199, AL031983), 레틴산 수용체 (X06614), G 단백질-커플링된 수용체 (Z94155, X81892, U52219, U22491, AF015257, U66579) 케모카인 (C-C 모티프) 수용체 7 (L31584), 종양 괴사 인자 수용체 상과 구성원 17 (Z29575), 인터페론 감마 수용체 2 (U05875), 사이토킨 수용체-유사 인자 1 (AF059293), 클래스 I 사이토킨 수용체 (AF053004), 응고 인자 II (트롬빈) 수용체-유사 2 (U92971), 백혈병 억제 인자 수용체 (NM_002310), 인터페론 감마 수용체 1 (AL050337) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
제27항에 있어서, 발현 패턴은 케모카인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의발현을 포함하는 것인 방법.
제27항에 있어서, 발현 패턴은 세포 분화 인자의 발현을 포함하는 것인 방법.
제27항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 발현 패턴은 세포 표면 수용체의 발현을 포함하는 것인 방법.
제34항에 있어서, 세포 표면 수용체는 케모카인 수용체 또는 인테그린 수용체를 포함하는 것인 방법.
선천 면역과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 세포를 해당 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 선천 면역을 선택적으로 증가시킬 수 있는 제제의 확인 방법으로서, 제제의 존재 하의 폴리뉴클레오티드(들)의 발현은 제제의 부재 하의 발현과 비교하여 조절되며, 발현 조절로 선천 면역이 증가되는 것인 방법.
제26항에 있어서, 발현 패턴이 선천 면역을 증가시키는 화합물의 스크리닝에 이용되는 것인 방법.
제28항에 있어서, 화합물이 케모카인 또느 케모카인 수용체 발현을 자극하는 것인 화합물.
제38항에 있어서, 케모카인 또는 케모카인 수용체가 CXCR4, CCR5, CCR2, CCR6, MIP-1 알파, IL-8, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 또는 MCP-5인 것인 화합물.
제28항에 있어서, 화합물이 펩티드, 펩티드 유사체, 화학적 화합물 또는 핵산 분자인 것인 화합물.
i) 염증성 또는 패혈성 반응을 저해할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들) 및 ii) 선천 면역과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 세포를 해당 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 패혈성 또는 염증성 반응을 저해 또는 차단하고 선천 면역을 증가시킬 수 있는 제제의 확인 방법으로서, 제제의 존재 하의 폴리뉴클레오티드(들)의 발현은 제제의 부재 하의 폴리뉴클레오티드(들)의 발현과 비교하여 조절되며, 발현 조절로 염증성 또는 패혈성 반응이 저해되고 선천 면역이 증가되는 것인 방법.
비감염 피험체와 비교하여 표 55 중 2 이상의 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 발현 증가로 예증되는 폴리뉴클레오티드의 발현 패턴을 핵산 샘플 중에서 확인하는 단계를 포함하는, 피험체의 핵산 샘플로부터 포유류 피험체의 감염 상태를 추정하는 방법.
비감염 피험체와 비교하여 표 56 중 2 이상의 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 발현 증가로 예증되는 폴리뉴클레오티드의 발현 패턴을 핵산 샘플 중에서 확인하는 단계를 포함하는, 피험체의 핵산 샘플로부터 포유류 피험체의 감염 상태를 추정하는 방법.
비감염 피험체와 비교하여 표 57 중 2 이상의 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 발현 증가로 예증되는 폴리뉴클레오티드의 발현 패턴을 핵산 샘플 중에서 확인하는 단계를 포함하는, 피험체의 핵산 샘플로부터 포유류 피험체의 감염 상태를 추정하는 방법.
제30항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 감염 상태가 박테리아, 바이러스, 진균류 또는 기생체 제제에 기인하는 것인 방법.
제30항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 감염 상태가 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아에 기인하는 것인 방법.
제31항의 방법으로 확인된 감염 상태를 갖는 피험체의 폴리뉴클레오티드 발현 패턴.
CXCR-4의 길항제인 양이온성 펩티드.
테스트 펩티드의 존재 또는 부재 하에 T 세포를 SDF-1과 접촉시키는 단계 및 주화성을 측정하는 단계를 포함하는 CXCR-4의 길항제인 양이온성 펩티드의 확인 방법으로서, 테스트 펩티드의 존재 하의 주화성 감소는 테스트 펩티드가 CXCR-4의 길항제임을 나타내는 것인 방법.
일반식 X1X2X3IX4PX4IPX5X2X1(서열 번호 4)를 포함하는 분리된 양이온성 펩티드로서, 여기서 X1은 R, L 또는 K 중 1개 또는 2개이고, X2는 C, S 또는 A 중 1개이며, X3은 R 또는 P 중 1개이고, X4는 A 또는 V 중 1개이며, X5는 V 또는 W 중 1개인 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제38항에 있어서, 펩티드가 LLCRIVPVIPWCK (서열 번호 5), LRCPIAPVIPVCKK (서열 번호 6), KSRIVPAIPVSLL (서열 번호 7), KKSPIAPAIPWSR (서열 번호 8), RRARIVPAIPVARR (서열 번호 9) 및 LSRIAPAIPWAKL (서열 번호 10)로부터 선택되는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제38항에 있어서, 펩티드가 항염증 활성을 갖는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제38항에 있어서, 펩티드가 항패혈증 활성을 갖는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
일반식 X1LX2X3KX4X2X5X3PX3X1(서열 번호 11)를 포함하는 분리된 양이온성 펩티드로서, 여기서 X1은 D, E, S, T 또는 N 중 1개 또는 2개이고, X2는 P, G 또는 D 중 1개 또는 2개이며, X3은 G, A, V, L, I 또는 Y 중 1개이며, X4는 R, K 또는 H 중 1개이고, X5는 S, T, C, M 또는 R 중 1개인 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제42항에 있어서, 펩티드가 DLPAKRGSAPGST (서열 번호 12), SELPGLKHPCVPGS (서열 번호 13), TTLGPVKRDSIPGE (서열 번호 14), SLPIKHDRLPATS (서열 번호 15), ELPLKRGRVPVE (서열 번호 16) 및 NLPDLKKPRVPATS (서열 번호 17)로 구성된 군에서 선택되는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제42항에 있어서, 펩티드가 항염증 활성을 갖는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제42항에 있어서, 펩티드가 항패혈증 활성을 갖는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
일반식 X1X2X3X4WX4WX4X5K (서열 번호 18)를 포함하는 분리된 양이온성 펩티드로서, 여기서 X1은 A, P 또는 R로부터 선택된 1∼4개이고, X2는 1개 또는 2개의 방향족 아미노산(F, Y 및 W)이며, X3은 P 또는 K 중 1개이고, X4는 A, P, Y 또는 W로부터 선택된 0, 1 또는 2개이며, X5는 R 또는 P로부터 선택된 1∼3개인 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제46항에 있어서, 펩티드가 RPRYPWWPWWPYRPRK (서열 번호 19), RRAWWKAWWARRK (서열 번호 20), RAPYWPWAWARPRK (서열 번호 21), RPAWKYWWPWPWPRRK (서열 번호 22), RAAFKWAWAWWRRK (서열 번호 23) 및 RRRWKWAWPRRK (서열 번호 24)로 구성된 군에서 선택되는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제46항에 있어서, 펩티드가 항염증 활성을 갖는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제46항에 있어서, 펩티드가 항패혈증 활성을 갖는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
일반식 X1X2X3X4X1VX3X4RGX4X3X4X1X3X1(서열 번호 25)를 포함하는 분리된 양이온성 펩티드로서, 여기서 X1은 R 또는 K 중 1개 또는 2개이고, X2는 극성 또는 하전된 아미노산(S, T, M, N, Q, D, E, K, R 및 H)이며, X3은 C, S, M, D 또는 A이고, X4는 F, I, V, M 또는 R인 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제50항에 있어서, 펩티드가 RRMCIKVCVRGVCRRKCRK (서열 번호 26), KRSCFKVSMRGVSRRRCK (서열 번호 27), KKDAIKKVDIRGMDMRRAR (서열 번호 28), RKMVKVDVRGIMIRKDRR (서열 번호 29), KQCVKVAMRGMALRRCK (서열 번호 30) 및 RREAIRRVAMRGRDMKRMRR (서열 번호 31)로 구성된 군에서 선택되는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제50항에 있어서, 펩티드가 항염증 활성을 갖는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제50항에 있어서, 펩티드가 항패혈증 활성을 갖는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
일반식 X1X2X3X4X1VX5X4RGX4X5X4X1X3X1(서열 번호 32)를 포함하는 분리된 양이온성 펩티드로서, 여기서 X1은 R 또는 K 중 1개 또는 2개이고, X2는 극성 또는 하전된아미노산(S, T, M, N, Q, D, E, K, R 및 H)이며, X3은 C, S, M, D 또는 A 중 1개이고, X4는 F, I, V, M 또는 R 중 1개이며, X5는 A, I, S, M, D 또는 R 중 1개인 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제54항에 있어서, 펩티드가 RTCVKRVAMRGIIRKRCR (서열 번호 33), KKQMMKRVDVRGISVKRKR (서열 번호 34), KESIKVIIRGMMVRMKK (서열 번호 35), RRDCRRVMVRGIDIKAK (서열 번호 36), KRTAIKKVSRRGMSVKARR (서열 번호 37) 및 RHCIRRVSMRGIIMRRCK (서열 번호 38)로 구성된 군에서 선택되는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제54항에 있어서, 펩티드가 항염증 활성을 갖는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제54항에 있어서, 펩티드가 항패혈증 활성을 갖는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
일반식 KX1KX2FX2KMLMX2ALKKX3(서열 번호 39)를 포함하는 분리된 양이온성 펩티드로서, 여기서 X1은 극성 아미노산(C, S, T, M, N 및 Q)이고, X2는 A, L, S 또는 K 중 1개이며, X3는 G, A, V, L, I, P, F, S, T, K 및 H로부터 선택된 1∼17개의 아미노산인 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제58항에 있어서, 펩티드가 KCKLFKKMLMLALKKVLTTGLPALKLTK (서열 번호 40), KSKSFLKMLMKALKKVLTTGLPALIS (서열 번호 41), KTKKFAKMLMMALKKVVSTAKPLAILS (서열 번호 42), KMKSFAKMLMLALKKVLKVLTTALTLKAGLPS (서열 번호 43), KNKAFAKMLMKALKKVTTAAKPLTG (서열 번호 44) 및 KQKLFAKMLMSALKKKTLVTTPLAGK (서열 번호 45)로 구성된 군에서 선택되는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제58항에 있어서, 펩티드가 항염증 활성을 갖는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제58항에 있어서, 펩티드가 항패혈증 활성을 갖는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
일반식 KWKX2X1X1X2X2X1X2X2X1X1X2X2IFHTALKPISS (서열 번호 46)를 포함하는 분리된 양이온성 펩티드로서, 여기서 X1은 소수성 아미노산이고, X2는 친수성 아미노산인 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제62항에 있어서, 펩티드가 KWKSFLRTFKSPVRTIFHTALKPISS (서열 번호 47),KWKSYAHTIMSPVRLIFHTALKPISS (서열 번호 48), KWKRGAHRFMKFLSTIFHTALKPISS (서열 번호 49), KWKKWAHSPRKVLTRIFHTALKPISS (서열 번호 50), KWKSLVMMFKKPARRIFHTALKPISS (서열 번호 51) 및 KWKHALMKAHMLWHMIFHTALKPISS (서열 번호 52)로 구성된 군에서 선택되는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제62항에 있어서, 펩티드가 항염증 활성을 갖는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
제62항에 있어서, 펩티드가 항패혈증 활성을 갖는 것인 분리된 양이온성 펩티드.
서열 KWKSFLRTFKSPVRTVFHTALKPISS (서열 번호 53)를 포함하는 분리된 양이온성 펩티드.
서열 KWKSYAHTIMSPVRLVFHTALKPISS (서열 번호 54)를 포함하는 분리된 양이온성 펩티드.
제28항에 있어서, 제제가 징크 핑거 단백질 (AF061261); 세포 주기 유전자 (S70622); IL-10 수용체 (U00672); 트랜스퍼라제 (AF038664); 호메오박스 단백질 (AC004774); 포크헤드 단백질 (AF042832); 불명 (AL096803); KIAA0284 단백질(AB006622); 가상 단백질 (AL022393); 수용체 (AF112461); 가상 단백질 (AK002104); 단백질 (AL050261); 폴리펩티드 (AF105424); SPR1 단백질 (AB031480); 데히드로게나제(D17793); 트랜스퍼라제 (M63509); 및 퍼옥시좀 인자(AB013818)인 것인 방법.
제56항의 방법으로 확인된 감염 상태의 피험체의 폴리뉴클레오티드 발현 패턴으로서, 상향 조절된 유전자는 기탁 번호 D87451 링 핑거 단백질 10; 기탁 번호 AL049975, 불명; 기탁 번호 U39067, 진핵세포 번역 개시 인자 3 서브유닛 2; 기탁 번호 AK000942, 불명; 기탁 번호 AB040057, 세린/트레오닌 단백질 키나제 MASK; 기탁 번호 AB020719, KIAA0912 단백질; 기탁 번호 AB007856, FEM-1-유사 세포사 수용체 결합 단백질; 기탁 번호 AL137376, 불명; 기탁 번호 AL137730, 불명; 기탁 번호 M90696, 카텝신 S; 기탁 번호 AK001143, 불명; 기탁 번호 AF038406, NADH 데히드로게나제; 기탁 번호 AK000315, 가상 단백질 FLJ20308; 기탁 번호 M54915, pim-1 종양유전자; 기탁 번호 D29011, 프로테아솜 서브유닛 베타 타입 5; 기탁 번호 AL034348, 불명; 기탁 번호 D87076, KIAA0239 단백질; 기탁 번호 AJ001403, 기관기관지 뮤신 5 서브유닛 B; 기탁 번호 J03925, 인테그린 알파 M, Rho-관련 키나제 2(NM_004850), PTD017 단백질 (AL050361) 불명 유전자 (AK001143, AK034348, AL049250, AL16199, AL031983), 레틴산 수용체 (X06614), G 단백질-커플링된 수용체 (Z94155, X81892, U52219, U22491, AF015257, U66579) 케모카인 (C-C 모티프) 수용체 7 (L31584), 종양 괴사 인자 수용체 상과 구성원 17 (Z29575), 인터페론 감마 수용체 2 (U05875), 사이토킨 수용체 유사 인자 1 (AF059293), 클래스 I 사이토킨 수용체 (AF053004), 응고 인자 II (트롬빈) 수용체-유사 2 (U92971), 백혈병 억제 인자 수용체 (NM_002310), 인터페론 감마 수용체 1 (AL050337), 또는 이들의 임의의 조합인 것인 폴리뉴클레오티드 발현 패턴.
제32항에 있어서, 케모카인은 CXCR4, CXCR1, CXCR2, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, MIP-1 알파, MDC, MIP-3 알파, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5 및 RANTES를 포함하는 것인 방법.
제33항에 있어서, 세포 분화 인자가 TGFβ유도성 초기 성장 반응 2 (AI473938), 징크 핑거 단백질 (AF061261, U00115, X78924) 및 전사 인자 (U31556, AL137681, X68560)를 포함하는 것인 방법.
제38항에 있어서, 화합물이 키나제 활성을 변형시키는 것인 화합물.
제84항에 있어서, 키나제가 MAP 키나제 키나제 3 (D87116), MAP 키나제 키나제 6 (H07920), MAP 키나제 키나제 5 (W69649), MAP 키나제 7 (H39192), MAP 키나제 12 (AI936909), MAP 키나제-활성화된 단백질 키나제 3 (W68281) 또는 MAP 키나제 키나제 1 (L11284)로부터 선택되는 것인 화합물.
제21항에 있어서, 화합물이 프로테아솜 서브유닛 발현을 감소시키는 것인 화합물.
제86항에 있어서, 프로테아솜 서브유닛이 기탁 번호 D11094, L02426, D00763, AB009398, AF054185, M34079, M34079 또는 AL03117의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 화합물.
SDF-1 수용체의 폴리뉴클레오티드 발현을 감소시키는 분리된 양이온성 펩티드.
KR10-2004-7008519A 2001-12-03 2002-12-02 선천 면역의 작동체 KR20040077669A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33663201P 2001-12-03 2001-12-03
US60/336,632 2001-12-03
PCT/CA2002/001830 WO2003048383A2 (en) 2001-12-03 2002-12-02 Effectors of innate immunity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20040077669A true KR20040077669A (ko) 2004-09-06

Family

ID=23316965

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2004-7008519A KR20040077669A (ko) 2001-12-03 2002-12-02 선천 면역의 작동체

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP1470249A2 (ko)
JP (1) JP2005536985A (ko)
KR (1) KR20040077669A (ko)
CN (2) CN100357324C (ko)
AU (1) AU2002365675B2 (ko)
CA (1) CA2468907A1 (ko)
HK (1) HK1075677A1 (ko)
IL (1) IL162300A0 (ko)
NZ (2) NZ533721A (ko)
SG (1) SG159382A1 (ko)
WO (1) WO2003048383A2 (ko)
ZA (1) ZA200404919B (ko)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7687454B2 (en) 2001-12-03 2010-03-30 The University Of British Columbia Effectors of innate immunity determination
US7507787B2 (en) 2001-12-03 2009-03-24 The University Of British Columbia Effectors of innate immunity
MXPA06002828A (es) * 2003-09-12 2006-06-23 Univ British Columbia Efectores de determinacion de inmunidad innata.
WO2006005190A1 (en) * 2004-07-14 2006-01-19 Inimex Pharmaceuticals Inc. Method of screening for protection from microbial infection
US7638340B2 (en) 2005-06-22 2009-12-29 Seikagu Corporation Method of eliminating reactivity of lipoarabinomannan and application of the same
GB0517090D0 (en) 2005-08-19 2005-09-28 Tcp Innovations Ltd ApoE mimetic agents
JP2009509552A (ja) * 2005-10-04 2009-03-12 イニメックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 先天免疫を調節することによる感染の処置および予防を含む、免疫関連疾患障害の処置および予防のための新規ペプチド
ES2497441T3 (es) 2006-08-21 2014-09-22 The University Of British Columbia Péptidos inmunomoduladores catiónicos pequeños
SG175573A1 (en) * 2006-10-04 2011-11-28 Inimex Pharmaceuticals Inc Novel peptides for treating and preventing immune-related disorders, including treating and preventing infection by modulating innate immunity
WO2009057695A1 (ja) * 2007-10-30 2009-05-07 Olympus Corporation 遺伝子解析による腺腫又はがんの検出方法
WO2010026489A1 (en) * 2008-09-05 2010-03-11 The University Of British Columbia Innate immunity modulators
EP2346521A4 (en) * 2008-10-06 2012-06-20 Univ Colorado Regents PEPTIDES AND METHODS OF USE
JO3623B1 (ar) 2012-05-18 2020-08-27 Amgen Inc البروتينات المرتبطة بمولد المستضاد st2
KR20230119130A (ko) 2020-12-14 2023-08-16 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인히빈 서브유닛 베타 e(inhbe) 억제제로 대사 장애 및 심혈관 질환을 치료하는 방법
WO2023063994A1 (en) * 2021-10-13 2023-04-20 Phenomune, LLC Testing methods for determination of t2r phenotype and applications thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5877274A (en) * 1995-06-02 1999-03-02 University Of British Columbia Antimicrobial cationic peptides
DE19734161A1 (de) * 1997-08-07 1999-04-01 Jerini Biotools Gmbh SDF-1 - Antagonisten
US6288212B1 (en) * 1998-08-28 2001-09-11 The University Of British Columbia Anti-endotoxic, antimicrobial cationic peptides and methods of use therefor

Also Published As

Publication number Publication date
CN101215601A (zh) 2008-07-09
CA2468907A1 (en) 2003-06-12
EP1470249A2 (en) 2004-10-27
CN1615368A (zh) 2005-05-11
JP2005536985A (ja) 2005-12-08
HK1075677A1 (en) 2005-12-23
CN100357324C (zh) 2007-12-26
WO2003048383A2 (en) 2003-06-12
AU2002365675A1 (en) 2003-06-17
AU2002365675B2 (en) 2007-04-05
NZ533721A (en) 2007-12-21
SG159382A1 (en) 2010-03-30
WO2003048383A3 (en) 2004-08-05
ZA200404919B (en) 2006-05-31
IL162300A0 (en) 2005-11-20
NZ563261A (en) 2008-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
García et al. Identification of a novel, multifunctional β-defensin (human β-defensin 3) with specific antimicrobial activity: its interaction with plasma membranes of Xenopus oocytes and the induction of macrophage chemoattraction
Boismenu et al. Chemokine expression by intraepithelial gamma delta T cells. Implications for the recruitment of inflammatory cells to damaged epithelia.
Zhu et al. Advances in research of fish immune-relevant genes: a comparative overview of innate and adaptive immunity in teleosts
JP4951213B2 (ja) 治療用ペプチド及びその使用方法
US7507787B2 (en) Effectors of innate immunity
KR20040077669A (ko) 선천 면역의 작동체
US20070134261A1 (en) Effectors of innate immunity
EP1492812A2 (en) Modulator of the notch signalling pathway and use thereof in medical treatment
US7687454B2 (en) Effectors of innate immunity determination
HUE031681T2 (en) CMAP27 based antimicrobial peptides
KR20070033314A (ko) 양이온성 펩티드를 사용한 선천 면역의 자극 방법
US20070190533A1 (en) Effectors of innate immunity
KR101604169B1 (ko) Ｔｈ17세포 관련 면역질환 치료를 위한 ＲＯＲα의 용도
AU2007201885A1 (en) Effectors of innate immunity
EP1278535B1 (en) Uses of tgap7 for the modulation of leucocyte activation
JP2009500314A (ja) 遺伝子調節
Scott The contribution of cationic antimicrobial peptides to the host immune response to bacterial infection
Kunkel et al. The function of chemokines in health and disease
Bowdish et al. The Human Antimicrobial Peptide
BARTZ et al. Workshop C Innate Immunity
Natarajan Characterization of chemokine CCL19 in the duck (Anas platyrhynchos)
BARTZ et al. Workshop K Innate Immunity
from Host Structure-Function Relationships among

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application