CN100357324C - 先天免疫的效应物 - Google Patents

Abstract

描述了一种鉴定受一种或多种脓毒症或炎症诱导物调节和受阳离子肽抑制的多聚核苷酸或多聚核苷酸谱型的方法。一种鉴定代表炎症或脓毒症应答受抑制的多聚核苷酸表达谱型的方法。该方法包括在存在或缺少肽的情况下，将细胞与LPS、LTA、CpG DNA和/或完整微生物或微生物成分接触；检测在存在或缺少该肽的情况下细胞的多聚核苷酸表达谱型，其中在该肽存在时的谱型代表炎症或脓毒症应答受到抑制。还包括由本发明的方法鉴定的化合物和试剂。在另一方面，本发明提供用于强化个体的先天免疫的方法和化合物。

Description

先天免疫的效应物

相关申请资料

本申请依据35 USC 119(e)要求基于于2001年12月3日提出申请的美国专利申请序列号60/336,632的优先权，在此完整引用作为参考。

技术领域

[0001]本发明总体上涉及肽，更具体地，涉及作为治疗有效的肽，和有效地用于与微生物感染引起的病理相关的药物开发和有效地调节先天免疫或抗炎活性的肽。

发明背景

[0002]感染性疾病是世界范围内导致死亡的主要原因。根据1999年世界卫生组织的研究，每年有超过1.3千万人死于感染性疾病。在北美，感染性疾病是导致死亡的第三大祸首，每年有20％的死亡归咎于感染性疾病，而且自1980年以来它就以50％的速度递增。许多药物治疗和手术治疗成功的关键也都在于对感染性疾病的控制。抗生素的发现和使用已经成为现代医学的重大成就之一。没有抗生素，医生就无法开展复杂的手术、化疗和大多数医学干预，例如导管插入术(catheterization)。

[0003]目前，抗生素在世界范围内的销售量为260亿美元。然而，抗生素的滥用和某些不正当应用已经导致进化出对抗生素具有抗性的新菌株。抗生素抗性已经成为医学领域的一个组成部分。不能用抗生素对付一些细菌，如具有万古霉素抗性的肠球菌，VRE和具有甲氧苯青霉素(methicillin)抗性的葡萄球菌，MRSA菌株，于是，被这些细菌感染的病人常常就会死去。对于新药开发来说，抗生素的发现已经成为最困难的领域之一，许多大的制药公司已经削减或者完全停止了它们的抗生素开发项目。然而，随着抗生素抗性问题的急剧增涨，包括不能被治疗的感染性疾病的出现，对新型抗微生物疗法的医学需求显然未能得到满足，对先天免疫能够产生影响的制剂将成为这样的一类制剂之一。

[0004]先天免疫系统是极为有效的、高度进化的普遍的防御系统。先天免疫的要素(elements)总是低水平地存在，当受到刺激时，它们能非常快速地被激活。刺激包括细菌信号传导分子和身体细胞表面的谱型识别受体间的相互作用，或其它致病机理。每天，人类都要通过各位所消化的食物和水分、各位所呼吸的空气、各位所触摸到的物体表面、宠物和人，接触到成千上万的潜在的病原微生物。先天免疫便发挥作用以防止这些病原体引起疾病的发生。先天免疫系统不同于所谓的适应性免疫(它包括抗体和抗原特异性B淋巴细胞及T淋巴细胞)，因为前者总是存在的，能立刻产生效应，并且对于任何特定的病原体都是相对非特异性的。适应性免疫要求放大特定的识别要素(recoginationelements)，因此需要数天至数周才能发生响应。即便用疫苗接种预先刺激了适应性免疫，它也可能需要三天或者更长时间对一种病原体作出反应，然而，先天免疫可以立刻或很快地(数小时)地进行反应。先天免疫涉及各种效应物功能，包括吞噬细胞、补体等等，但是尚未被完全理解。一般说来，许多先天免疫响应都是由微生物信号传导分子结合到宿主细胞表面上的谱型识别受体而“触发”的，该谱型识别受体称之为Toll样受体。在炎症反应中，有许多这样的效应物功能(effector function)聚集到一起。然而，一个太剧烈的炎症反应会导致对身体有害的反应，在极端的情况中可能出现脓毒症，以及很可能死亡。

[0005]在感染过程中，结构性组分从感染原(infectious agents)上释放出来，导致炎症应答，当它未受到抑制时，则有可能导致潜在的致死状况，脓毒症。在北美每年有大约780,000例脓毒症患者。脓毒症的发生可能是在社区获得的传染病如肺炎导致的结果，也可能是治疗外伤、癌症或大外科时的并发症。当身体完全无法控制炎症应答时，便会发生严重的脓毒症，身体器官开始失去机能。在北美每年有多达120,000人死于脓毒症。脓毒症也可能涉及病原微生物或血液中的毒素(例如，败血症)，它是人类死亡的一个主要原因。革兰氏阴性细菌是与这类疾病联系最为普遍的生物。然而，革兰氏阳性细菌也在越来越多地引起感染病。革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌以及它们的组分都能导致脓毒症。

[0006]微生物组分的存在引起促炎细胞因子的释放，在这些促炎细胞因子中，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是极其重要的。TNF-α和其它促炎细胞因子又能够导致其它促炎介质(pro-inflammatory mediator)的释放并导致炎症级联反应(pro-inflammatory cascade)。革兰氏阴性脓毒症通常是由细菌外膜组分，脂多糖(LPS，也被称为内毒素)的释放引起的。血液中的内毒素，被称为内毒素血症(endotoxemia)，它主要来自于细菌感染，可以在抗生素治疗过程中被释放。革兰氏阳性脓毒症可由细菌的细胞壁组分的释放引起，这些细胞壁组分例如脂磷壁酸(LTA)、肽聚糖(PG)、由链球菌产生的鼠李糖-葡萄糖聚合物，或由葡萄球菌产生的荚膜多糖。不同于哺乳动物DNA，细菌或其他非哺乳动物的DNA含有高频率的未甲基化的胞嘧啶-鸟苷二聚体(CpGDNA)，已经表明细菌或其他非哺乳动物的DNA也能引发脓毒症状况，包括TNF-α的产生。哺乳动物DNA含有CpG二核苷酸的频率要低得多，它们常常是甲基化的形式。除了在细菌感染过程中它们的自然释放，抗生素治疗也能导致细菌细胞壁组分LPS和LTA的释放，而且也可能导致细菌DNA的释放。这可能阻碍从感染痊愈，或者甚至导致脓毒症。

[0007]人们不断认识到阳离子肽(cationic peptides)可以作为防御感染的一种形式，尽管在科学和专利文献中，它的主要效果被认为是抗微生物的效果(Hancock，R.E.W.，和R.Lehrer.1998 Cationic peptides：anew source of antibiotics.Trends in Biotechnology 16：82-88)。具有抗微生物活性的阳离子肽已经从多种生物中分离出来。事实上，这些肽提供了一种防御微生物例如细菌和酵母的机制。一般地，认为这些阳离子肽与细胞质膜相互作用，而且在大多数情况下，会形成通道和损伤，由此对细菌产生抗微生物活性。在革兰氏阴性细菌中，它们和LPS作用，使外膜具有可通透性，由此导致自促式的穿透外膜的吸收，并到达细胞质膜。阳离子抗微生物肽的例子包括indolicidin(来自牛嗜中性细胞的抗微生物多肽)、防御素(defensins)、杀菌肽(cecropins)和爪蟾抗菌肽(magainins)。

[0008]最近，已经逐渐认识到，在先天免疫的其它方面，这些肽可以作为效应物(Hancock，R.E.W.和G.Diamond.2000.The role of cationicpeptides in innate host defenses.Trends in Microbiology  8：402-410.；Hancock，R.E.W.2001.Cationic peptides：effectors in innate immunity andnovel antimicrobials.Lancet Infectious Diseases  1：156-164)，尽管还不知道该抗微生物功能和效应物功能是否有关。

[0009]一些阳离子肽具有能够结合细菌产物如LPS和LTA的吸附作用。在对LPS的应答中，这些阳离子肽能够抑制细胞因子的产生，因此能够在一定程度上防止致死性休克。然而，还没有证明，这些效果是由于该肽结合到LPS和LTA上，还是由于该肽和宿主细胞的直接作用。在对微生物或微生物信号分子如LPS的攻击产生应答时，阳离子肽通过与由哺乳动物免疫系统使用的调控路径相类似的调控路径被诱导(涉及Toll样受体和转录因子；NFκB)。由此看来，阳离子肽在先天免疫中具有关键的作用。影响抗细菌肽的诱导的突变能够降低对细菌攻击进行应答时的生存者。同样，当果蝇的Toll路径发生可导致抗真菌肽表达降低的突变时，也就增加了对致死性真菌感染的敏感性。对于人类，患有颗粒体缺乏综合症的病人完全缺乏α-防御素，会患上频繁的和严重的细菌感染疾病。其它证据包括一些肽可由传染原(infectious agents)诱导，以及已经发现在炎症发生处这些肽的浓度相当高。阳离子肽也可以调控细胞迁移，以促进白细胞抵抗细菌感染的能力。例如，已经发现，两种人α-防御素多肽，HNP-1和HNP-2，对鼠和人的T细胞和单核细胞具有趋化活性，而且，人β-防御素似乎能够通过和CCR6作用，而对未成熟树突细胞和记忆T细胞起到化学引诱物(chemoattractants)的作用。类似地，发现猪的阳离子肽PR-39对嗜中性粒细胞具有趋化作用。然而，具有不同结构和组成的肽是否共有这些性质仍不清楚。

[00010]LL-37是唯一已知的来自人的cathelicidin(一种具强有力膜活性的抗微生物肽类的前体)，它是由骨髓前体、睾丸、炎症疾病期间的人角化细胞和气道上皮细胞产生。Cathelicidin肽的特征是在称之为cathelin结构域的N端前体区域(prepro region)具有相当高比例的序列同一性。Cathelicidin肽作为未活化的前肽前体被贮存起来，一旦受到刺激，它便被加工成为活性肽(active peptides)。

发明概述

[00011]本发明是基于如下开创性发现：可以基于受内毒性的脂多糖、脂磷壁酸、CpG DNA或其它细胞成分(例如微生物或它们的细胞成分)调节，而又被阳离子肽影响的多聚核苷酸表达谱型，筛选出可阻断或降低个体的脓毒症和/或炎症的新颖化合物。而且，在使用阳离子肽作为工具的基础上，能够鉴定出先天免疫的选择性强化剂，它们不会引起脓毒症反应，却能够阻断/抑止炎症和/或脓毒症应答。

[00012]因此，在一个实施方案中，提供了鉴定多聚核苷酸或多聚核苷酸谱型的方法，这些多聚核苷酸受一种或多种脓毒症或炎症诱导物调节，同时受阳离子肽抑制。本发明的方法包括将一种或多种多聚核苷酸与一种或多种脓毒症或炎症诱导物接触，并同时或随后立即将该种或该多种多聚核苷酸与阳离子肽接触。检测在阳离子肽存在时和阳离子肽不存在时的表达差异，在表达上的变化，或者是增量调节(up-regulation)或者是减量调节(down-regulation)，可以作为受脓毒症或炎症诱导物调节同时又受阳离子肽抑制的多聚核苷酸或多聚核苷酸谱型的标志。在另一个方面，本发明提供了由上述方法鉴定的一种或多种多聚核苷酸。脓毒症或炎症调节物包括LPS、LTA或CpG DNA或微生物成分(或它们的任意组合)，或相关试剂。

[0010]在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定可阻止脓毒症或炎症的试剂的方法，包括将由前述方法鉴定出的多聚核苷酸与一种试剂进行组合，其中，与不存在该试剂时相比较，在存在该试剂时该多聚核苷酸的表达受到了调节，并且在表达上的这种调节影响炎症或脓毒症应答。

[0011]在另一个实施方案中，本发明通过1)在存在或缺乏阳离子肽的情况下，将细胞与LPS、LTA和/或CpG DNA接触，和2)检测在存在或缺乏该肽的情况下的多聚核苷酸表达谱型，提供了一种鉴定在炎症或脓毒症应答受抑制时的多聚核苷酸表达谱型的方法。在该肽存在时获得的谱型代表炎症或脓毒症应答受到抑制。在另一个方面，将该肽存在时获得的谱型与一种受测化合物存在时获得的谱型相比较，从而鉴定出提供类似谱型的化合物。在另一个方面，本发明提供了由前述方法鉴定的化合物。

[0012]在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定可强化先天免疫的试剂的方法，包括将编码涉及先天免疫的多肽的一种或多种多聚核苷酸与感兴趣的试剂接触，其中，与不存在该试剂时相比较，在存在该试剂时该多聚核苷酸的表达被调节，并且该被调节的表达导致先天免疫的强化。优选地，该试剂并不刺激个体内的脓毒症反应。在一个方面，该试剂增加抗炎症的多聚核苷酸的表达。示例性但非限制性的抗炎多聚核苷酸编码的蛋白例如：IL-1R拮抗剂同源物1(AI167887)、IL-10Rβ(AA486393)、IL-10Rα(U00672)、TNF受体成员1B(AA150416)、TNF受体成员5(H98636)、TNF受体成员11b(AA194983)、HLA II的IK细胞因子减量调节物(R39227)、TGF-B诱导性早期生长应答蛋白2(AI473938)、CD2(AA927710)、IL-19(NM_013371)或IL-10(M57627)。在一个方面，该试剂降低编码涉及NK-κB激活的蛋白酶体亚基例如蛋白酶体亚基26S(NM_013371)的多聚核苷酸的表达。在一个方面，该试剂可以作为蛋白激酶的拮抗剂。在一个方面，该试剂是选自SEQ ID NO：4-54的肽。

[0013]在另一个实施方案中，本发明提供了一种鉴定多聚核苷酸表达谱型以鉴定可选择性地强化先天免疫的化合物的方法。本发明包括检测在有阳离子肽接触时和无阳离子肽接触时细胞的多聚核苷酸表达谱型，其中，在该肽存在时的谱型代表刺激先天免疫；检测在有一种受测化合物接触时细胞的多聚核苷酸表达谱型，其中，如果使用该受测化合物时的谱型与在该阳离子肽存在时观察到的谱型相类似，则表示该受测化合物可强化先天免疫。优选的是，该化合物并不刺激个体内的脓毒症反应。

[0014]在另一个实施方案中，本发明提供了由一哺乳动物个体的核酸样品推断该个体的感染状态的方法，该方法是依靠于确定该核酸样品中的多聚核苷酸表达谱型，例如与未感染的个体相比，表50、51和/或52中的至少两种多聚核苷酸的表达量增加。还包括由上述任一方法获得的多聚核苷酸表达谱型。

[00013]在另一个方面，提供了作为CXCR-4的拮抗剂的阳离子肽。仍然在另一个方面，提供了鉴定作为CXCR-4的拮抗剂的阳离子肽的方法，包括在受测肽存在或不存在的情况下将T细胞和SDF-1接触，并测量趋化性。如果在受测肽存在时趋化性降低，则表明该肽是CXCR-4的拮抗剂。阳离子肽也可以起到降低SDF-1受体多聚核苷酸(NM_013371)的表达的作用。

[0015]在上述所有方法中，本发明的化合物或试剂包括但不限于肽(peptides)、阳离子肽(cationic peptides)、肽模拟物(peptidomimetics)、化学化合物(chemical compounds)、多肽(polypeptides)、核酸分子(nucleicacid molecules)和类似物。

[0016]仍然在另一方面，本发明提供了被分离的阳离子肽。本发明的被分离的阳离子肽可用下列任一通式和单字母氨基酸记号表示：

X₁X₂X₃IX₄PX₄IPX₅X₂X₁(SEQ ID NO：4)，其中X₁是一个或两个R、L或K，X₂是一个C、S或A，X₃是一个R或P，X₄是一个A或V，X₅是一个V或W；

X₁LX₂X₃KX₄X₂X₅X₃PX₃X₁(SEQ ID NO：11)，其中X₁是一个或两个D、E、S、T或N，X₂是一个或两个P、G或D，X₃是一个G、A、V、L、I或Y，X₄是一个R、K或H，X₅是一个S、T、C、M或R；

X₁X₂X₃X₄WX₄WX₄X₅K(SEQ ID NO：18)，其中X₁是一至四个选自A、P或R的氨基酸，X₂是一个或两个芳香氨基酸(F、Y和W)，X₃是一个P或K，X₄是零至两个选自A、P、Y或W的氨基酸，X₅是一至三个选自R或P的氨基酸；

X₁X₂X₃X₄X₁VX₃X₄RGX₄X₃X₄X₁X₃X₁(SEQ ID NO：25)，其中X₁是一个或两个R或K，X₂是一个极性的或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H)，X₃是C、S、M、D或A，X₄是F、I、V、M或R；

X₁X₂X₃X₄X₁VX₅X₄RGX₄X₅X₄X₁X₃X₁(SEQ ID NO：32)，其中X₁是一个或两个R或K，X₂是一个极的性或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H)，X₃是一个C、S、M、D或A，X₄是一个F、I、V、M或R，X₅是一个A、I、S、M、D或R；和

KX₁KX₂FX₂KMLMX₂ALKKX₃(SEQ ID NO：39)，其中，X₁是一个极性氨基酸(C、S、T、M、N和Q)；X₂是一个A、L、S或K，X₃是1至17个选自G、A、V、L、I、P、F、S、T、K和H的氨基酸；

KWKX₂X₁X₁X₂X₂X₁X₂X₂X₁X₁X₂X₂IFHTALKPISS(SEQ ID NO：46)，其中X₁是一个疏水氨基酸，X₂是一个亲水氨基酸。

[0017]此外，在另一方面本发明提供了被分离的阳离子肽KWKSFLRTFKSPVRTVFHTALKPISS(SEQ ID NO：53)和KWKSYAHTIMSPVRLVFHTALKPISS(SEQ ID NO：54)。

[0018]还提供了编码本发明的阳离子肽的核酸序列，包含这些多聚核苷酸的载体和含有这些载体的宿主细胞。

发明详述

[0019]本发明提供了可由一组通式表征的新颖的阳离子多肽，它们能够调节(例如，增量调控和/或减量调控)多聚核苷酸的表达，由此调控和炎症应答和/或先天免疫。

[0020]在此使用的“先天免疫”是指一种生物防御病原体入侵、保护自己的先天具有的能力。在此使用的病原体或微生物可以包括，但不限于细菌、真菌、寄生虫和病毒。先天免疫与获得性/适应性免疫不同，对于后者，生物主要是基于抗体和/或免疫淋巴细胞来发展自己的防御机制，其特征是特异性、可放大性和辨认自身与非自身。先天免疫提供了广泛的非特异性免疫，并且对于以前的暴露没有免疫记忆。先天免疫的特点是能够有效地抵抗广范围的各种潜在病原体，而不依赖于对一种病原体的先前接触，先天免疫的另一个特点是能够快速的生效(与特异性免疫应答相比较而言，特异性免疫应答的激发需要数天到数周的时间)。而且，先天免疫包括影响到其它疾病的免疫应答，这些疾病例如癌症、炎症疾病、多发性硬化症、各种病毒感染，等等。

[0021]正如在此所使用的，术语“阳离子肽”是指约5到约50个氨基酸长的氨基酸序列。在一个方面，本发明的阳离子肽的长度为约10到约35个氨基酸。如果一个肽具有足够的正电荷氨基酸，以致于pI大于9.0，则认为该肽是“阳离子肽”，其中pI(等电点)＝当该肽的净电荷是中性时的pH值。通常，该阳离子肽的氨基酸残基中至少有两个是带正电荷的，例如赖氨酸和精氨酸。“具正电荷”是指在pH 7.0时具有净的正电荷的氨基酸残基侧链。自然出现的阳离子抗微生物肽的例子包括防御素、cathelicidins、爪蟾抗菌肽、峰毒肽(melittin)、杀菌肽、bactenecins(来自牛嗜中性粒细胞的抗微生物多肽)、indolicidins、polyphemusins、tachyplesins(来自马蹄蟹血细胞的抗微生物多肽)，以及它们的类似物，这些自然出现的阳离子抗微生物多肽可以依据本发明重组产生。许多生物都制造阳离子肽，把这些分子作为抵抗微生物的非特异性防御机制的一部分来使用。分离出来的这些肽对广范围的各种微生物具有毒性，包括细菌、真菌和某些带被膜的病毒。当阳离子肽对许多病原体发挥抵抗作用时，显著的异常和不同程度的毒性是存在的。然而，本专利揭露了对微生物不具毒性却能够通过刺激先天免疫防御感染的其它阳离子肽，并且本发明并不限于具有抗微生物活性的阳离子肽。事实上，在本发明中使用的许多肽并没有抗微生物活性。

[0022]在本技术领域已知的阳离子肽包括，例如人cathelicindinIL-37、牛嗜中性细胞多肽indolicidin、以及牛bactenecin的变体，Bac2A。

IL-37 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(SEQ ID：1)

Indolicidin    ILPWKWPWWPWRR-NH₂(SEQ ID NO：2)

Bac2A          RLARIVVIRVAR-NH₂(SEQ ID NO：3)

[0023]在先天免疫中，免疫应答并不依赖于抗原。先天免疫过程可以包括分泌性分子和前面提出的细胞组分的产生。先天免疫中，病原体由在生殖种系中编码的受体识别。这些Toll样受体具有广泛的特异性，能够识别许多病原体。当阳离子肽出现在免疫应答中时，它们辅助宿主对病原体的应答。在免疫应答中的这种变化诱导趋化因子的释放，趋化因子促使免疫细胞集中到感染发生的部位。

[0024]趋化因子或化学诱导细胞因子属于一类免疫因子，它们介导趋化和其它促炎症现象(参见，Schall，1991，Cytokine 3：165-183)。趋化因子是长度大约70-80残基的小分子，通常被分为两小类，具有由单个氨基酸隔开的N端半胱氨酸(C×C)的α亚类，和在N端具有两个相邻半胱氨酸(CC)的β亚类。RANTES、MIP-1α和MIP-1β属于β亚类(参见综述：Horuk，R.，1994，Trends Pharmacol.Sci，15：159-165；Murphy，P.M.，1994，Annu.Rev.Immunol.，12：593-633)。β型趋化因子RANTES、MCP-1和MCP-3的氨基末端关联到介导细胞迁移和由这些趋化因子诱导的炎症反应的调节。这种关联由实验观察看出，剔除MCP-1氨基末端的8个残基、MCP-3氨基末端的9个残基和RANTES氨基末端的8个残基，以及将一个甲硫氨酸增加到RANTES的氨基末端，会对其趋化性、钙转移和/或由它们的天然相似物刺激的酶释放产生拮抗作用(Gong等，1996 J.Biol.Chem.271：10521-10527；Proudfoot等，1996 J.Biol.Chem.271：2599-2603)。另外，可以通过将Tyr 28和Arg 30通过双突变变为亮氨酸和缬氨酸，将与α型趋化因子类似的趋化活性引入到MCP-1中，这表明该蛋白的内部区域在调控趋化活性时也发挥着作用(Beall等，1992，J.Biol.Chem.267：3455-3459)。

[0025]迄今已获表征的所有趋化因子的单体形式都具有明显的结构同源性，尽管α型和β型的四级结构有所不同。β型和α型趋化因子的单体结构非常类似，但是这两种类型的二聚体结构则完全不同。还鉴别出了另外一种趋化因子，淋巴细胞趋化因子(lymphotactin)，它只有一个N端半胱氨酸，它代表了趋化因子的第三个亚家族(γ)(Yoshida等，1995，FEBS Lett.360：155-159；和Kelner等，1994.Science266：1395-1399)。

[0026]趋化因子的受体属于与G蛋白偶联的具有7个跨膜结构域的受体(GCR’s)大家族(参见综述：Horuk，R.，1994，Trends Pharmacol.Sci.15：159-165；和Murphy，P. M.，1994，Annu.Rev.Immunol.12：593-633)。竞争结合和交互失敏(cross-desensitization)研究已表明趋化因子受体在结合配体时具有明显的混杂性。证明β趋化因子间的混杂性的例子包括：CC CKR-1结合RANTES和MIP-1α(Neote等，1993，Cell 72：415-425)，CC CKR-4结合RNATES、MIP-1α和MCP-1(Power等，1995，J.Biol.Chem.270：19495-19500)，以及CC CKR-5结合RNATES、MIP-1α和MIP-1β(Alkhatib等，1996，Science，in press和Dragic等，1996，Nature 381：667-674)。红细胞具有一种能够结合α和β趋化因子的受体(被称为Duffy antigen(达菲抗原))(Horuk等，1994，J.Biol.Chem.269：17730-17733；Neote等，1994，Blood 84：44-52；和Neote等，1993，J.Biol.Chem.268：12247-12249)。因此，趋化因子以及它们的受体间的明显的序列和结构同源性使得在受体-配体的相互作用中存在着重叠。

[0027]一方面，本发明提供了包括本发明的阳离子肽在内的化合物通过直接作用于宿主细胞而减少脓毒症和炎症应答的应用。在这一方面，一种鉴别被一种或多种脓毒症或炎症诱导物调控的多聚核苷酸的方法被提供，其中该调控被阳离子肽改变。所述的脓毒症或炎症诱导物包括，但不限于内毒性脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)和/或CpG DNA或完整的细菌或其它细菌组分。该鉴别方法是依靠将多聚核苷酸与脓毒症或炎症诱导物接触，并同时或随后立即与阳离子肽接触。在存在阳离子肽和缺少阳离子肽时，对多聚核苷酸的表达进行观察，表达上的变化说明该核苷酸或该类型的核苷酸受脓毒症或炎症诱导物的调控，并受阳离子肽的抑制。在另一个方面，本发明提供了由该方法鉴定的多聚核苷酸。

[0028]这样的多聚核苷酸一旦被鉴定出来，就可用于筛选能够通过影响该多聚核苷酸的表达而阻止脓毒症或炎症的化合物。对表达的这种影响可以是表达的增量调控(up regulation)或减量调控(downregulation)。通过鉴定不激发脓毒症反应的化合物和能够阻止或抑止炎症或脓毒症反应的化合物，本发明还提出了一种鉴别先天免疫强化剂的方法。此外，本发明提供了在上述方法中使用和鉴别出的化合物。

[0029]候选化合物从广泛的来源获得，包括各种合成化合物和天然化合物。例如，可以利用许多方法来随机和定向合成出各种有机化合物和生物分子，包括随机寡聚核苷酸和寡聚多肽的表达。作为选择，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式存在的天然化合物的文库(libraries)可被利用或方便地生产。此外，可以通过传统的化学、物理和生化手段方便地修饰天然的或合成产生的文库和化合物，也可利用这些文库和化合物得到组合文库(combinatorial libraries)。已知的药理学的药剂可以作定向或随机的化学修饰，例如酰基化、烷基化、酯化、酰胺化等等，从而得到结构类似物(structural analogs)。候选试剂也可以从生物分子中找到，包括但不限于：肽、肽模拟物(peptidiomimetics)、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、多肽、多聚核苷酸、化合物(chemicalcompounds)、衍生物(derivatives)、结构类似物(structural analogs)或它们的组合(combinations)。

[0030]筛选实验的温育要素(components)包括允许受测化合物与感兴趣的多聚核苷酸相互接触的条件。接触可以是在液相中、固相中，或者在细胞中。为了筛选出多个化合物，受测化合物可以选择为组合文库。依本发明的方法鉴定出的化合物可以通过在检测化合物时通常使用的任何方法，在溶液中或者在结合到固体支持物之后，被进一步评估、检测、克隆、测序等等。

[0031]一般而言，在本发明的方法中，利用阳离子肽来检测和定位在脓毒症和炎症过程中必需的多聚核苷酸。一旦被鉴定出来，就可以通过观察其在阳离子肽存在和缺乏时的表达来获得多聚核苷酸的表达谱型(pattern)。在阳离子肽存在的情况下获得的谱型对于鉴定能够抑制该多聚核苷酸的表达并由此阻止脓毒症或炎症的其它化合物又是很有用的。对于本领域技术人员而言，已熟知的是，非肽类化合物和肽模拟物能够模拟肽结合受体的能力和酶结合位点，并由此可被用来阻断或激发生物反应。当一种感兴趣的另外的化合物提供了与在阳离子肽存在时相类似的多聚核苷酸表达谱型时，也可该应用化合物来调节脓毒症或先天免疫应答。如此讲来，本发明的阳离子肽在作为脓毒症和炎症的已知抑制剂和先天免疫的已知强化剂的同时，也可用作鉴定抑制脓毒症和炎症和强化先天免疫的其它化合物的工具。

[0032]正如在后面的实施例中看到的，本发明的肽具有广泛的减少由LPS调控的多聚核苷酸表达的能力。在严重的感染或炎症期间所看到的许多症状例如发烧和白血细胞数目升高都归咎于血液中的高水平内毒素。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的一种组分，它是脓毒症在病理生理学上强有效的引发剂(trigger)。炎症和脓毒症的基本机制是相关联的。在实施例1中，利用多聚核苷酸阵列来确定阳离子肽对上皮细胞的转录应答的影响。特别地，观察了对由LPS诱导的超过14,000个不同的特定多聚核苷酸的影响。表格显示了用肽处理过的细胞与对照细胞相比所见到的变化。得到的数据表明该肽具有降低由LPS诱导的多聚核苷酸表达的能力。

[0033]类似地，实施例2说明了本发明的肽能够中和革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌产物对免疫细胞的刺激。另外，注意到，某些促炎症的多聚核苷酸受阳离子肽的减量调节，这些阳离子肽在表24中写出，例如TLR1(AI339155)、TLR2(T57791)、TLR5(N41021)、TNF受体相关因子2(T55353)、TNF受体相关因子3(AA504259)、TNF受体超家族成员12(W71984)、TNF受体超家族成员17(AA987627)、小分子诱导性细胞因子亚家族B成员6(AI889554)、IL-12Rβ2(AA977194)、IL-18受体1(AA482489)，而抗炎症的多聚核苷酸受阳离子多肽的增量调节，这些阳离子多肽在表25中写出，例如IL-1R拮抗剂同源物1(AI167887)、IL-10Rβ(AA486393)、TNF受体成员1B(AA150416)、TNF受体成员5(H98636)、TNF受体成员11b(AA194983)、HLA II的IK细胞因子减量调节物(R39227)、可由TGF-B诱导的早期生长应答2(AI473938)或CD2(AA927710)。这些结果的适用性和应用通过对鼠的体内应用证实。实施例3证明了这些肽对与之接触的宿主细胞基本上不会产生毒性。

[0034]在实施例4中可以看到，本发明的阳离子肽可改变巨噬细胞和上皮细胞中的多聚核苷酸表达。此实施例的结果说明，促炎症的多聚核苷酸受阳离子肽的减量调节(down-regulated)(表24)，而抗炎症的多聚核苷酸受阳离子肽的增量调节(up-regulated)(表25)。

[0035]在另一个方面，本发明提供了鉴定可强化先天免疫的试剂的方法。在此方法中，将宿主细胞中编码涉及先天免疫的多肽的多聚核苷酸与感兴趣的试剂接触。在存在该试剂和缺少该试剂的情况下，测定该多聚核苷酸的表达。比较表达情况，表达的特异性调节说明先天免疫被强化。在另一方面，该试剂并不激发脓毒症反应，如同缺乏促炎症细胞因子TNF-α的增量调节(upregulation)时所揭示的。仍然在另一个方面，该试剂降低或阻断炎症或脓毒症应答。还是在另一个方面，该试剂降低TNF-α和/或白介素的表达，白介素包括但不限于IL-1β、IL-6、IL-12 p40、IL-12 p70和IL-8。

[0036]在另一方面，本发明提供了利用阳离子肽进行直接的多聚核苷酸调节的方法和包括阳离子肽在内的化合物在激化先天免疫的元素(elements)中的应用。在这一方面，本发明提供了为了鉴定可强化先天免疫的化合物而确定多聚核苷酸表达谱型的方法。在本发明的该方法中，对与阳离子肽接触的和未与阳离子肽接触的细胞作了多聚核苷酸表达谱型的初步检测。在该肽存在的情况下得出的多聚核苷酸表达谱型表明先天免疫受到刺激。然后检测了在受测化合物存在的情况下多聚核苷酸的表达谱型，其中使用受测化合物得到与在阳离子肽存在时相类似的表达谱型，说明这是一个可强化先天免疫的化合物。在另一个方面，本发明提供了在上述方法中确认的化合物。在另一个方面，本发明的化合物刺激趋化因子或趋化因子受体的表达。趋化因子或趋化因子受体可以包括，但不限于CXCR4、CXCR1、CXCR2、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、MIP-1α、MDC、MIP-3α、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5和RANTES。仍然是在另一方面，该化合物是肽、肽模拟物(peptidomimetic)、化合物(chemical compounds)或核酸分子。

[0037]仍然是在另一方面，该多聚核苷酸表达谱型包括促炎症的多聚核苷酸的表达。这些促炎症多聚核苷酸包括，但不限于环指蛋白10(D87451)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MASK(AB040057)、KIAA0912蛋白(AB020719)、KIAA0239蛋白(D87076)、RAP1、GTP酶激活蛋白1(M64788)、FEM-1样死亡受体结合蛋白(AB007856)、组织蛋白酶S(M90696)、假想蛋白FLJ20308(AK000315)、pim-1癌基因(M54915)、蛋白酶体亚基β型5(D29011)、KIAA0239蛋白(D87076)、气管支气管黏蛋白5亚型B(AJ001403)、cAMP应答元件结合蛋白CREBPa、整连蛋白αM(J03925)、与Rho相关的激酶2(NM_004850)、PTD017蛋白(AL050361)、未知基因(AK001143、AK034348、AL049250、AL161991、AL031983)和它们的任意组合。仍然在另一个方面，该多聚核苷酸表达谱型包括细胞表面受体的表达，细胞表面受体包括但不限于视黄酸受体(X06614)、G蛋白偶联受体(Z94155、X81892、U52219、U22491、AF015257、U66579)、趋化因子(C-C基序)受体7(L31584)、肿瘤坏死因子受体超家族成员17(Z29575)、干扰素γ受体2(U05875)、细胞因子受体样因子1(AF059293)、I类细胞因子受体(AF053004)、凝集因子II(凝血酶)受体样2(U92971)、白血病抑制因子受体(NM_002310)、干扰素γ受体1(AL050337)。

[0038]在后面例如表1-15中将说明，阳离子肽能够中和宿主对感染原的信号分子的应答，还能改变宿主细胞的转录应答，这些主要是通过减量调节促炎应答和/或增量调节抗炎应答来完成。实施例5说明，该阳离子肽能够通过诱导趋化因子的释放来辅助宿主对病原体的应答，趋化因子促使免疫细胞聚集到感染位点。这些结果通过鼠的体内应用被证实。

[0039]从后面的实施例可以看到，阳离子肽明显影响宿主对病原体的应答，原因在于阳离子肽诱导选择性的促炎应答，例如促使免疫细胞聚集到感染位点的应答，但不诱导明显有害的促炎细胞因子，由此辅助宿主免疫应答的调控。脓毒症似乎部分地是由对感染原的过度促炎应答引起的。阳离子肽诱导抗炎应答和抑制某些具有潜在危害的促炎应答，由此帮助宿主对病原体产生一种“平衡”的应答。

[0040]在实施例7中，为了研究阳离子肽与细胞相互作用时产生这些效果的基本机制，对所选择的MAP激酶的活化作了分析。巨噬细胞在应答细菌感染时激活MEK/ERK激酶。MEK是MAP激酶激酶，当它被激活时，便会磷酸化下游的激酶ERK(细胞外调节性激酶)，然后ERK形成二聚体并转移到细胞核，它在那里激活转录因子如ElK-1，由此改变多聚核苷酸的表达。已经表明MEK/ERK激酶可削弱巨噬细胞内沙门氏菌(salmonella)的复制。由MEK激酶和NADPH氧化酶介导的信号传导(signal transduction)在对细胞内病原体的先天性防御中发挥着重要的作用。如下面所示，阳离子肽通过影响MAP激酶，对细菌感染产生影响。这些阳离子肽可以直接影响激酶。表21显示了在肽的应答中MAP激酶多聚核苷酸表达的变化，但是不限于这些。这些激酶包括MAP激酶激酶6(H070920)、MAP激酶激酶5(W69649)、MAP激酶7(H39192)、MAP激酶12(AI936909)和被MAP激酶激活的蛋白激酶3(W68281)。

[0041]在另一方法中，本发明的方法可以被组合使用，以鉴定具有多种特征的试剂，即具有抗炎症/抗脓毒症活性和能够部分地通过体内诱导趋化因子而强化先天免疫的肽。

[0042]在另一个方面，本发明提供了由哺乳动物个体的核酸样品推断该个体的感染状态的方法，该方法是依靠于确定核酸样品中的多聚核苷酸表达谱型，其例证是表55中的至少两个多聚核苷酸与未感染的个体相比，多聚核苷酸表达增加。在另一方面，本发明提供了由哺乳动物个体的核酸样品推断该个体的感染状态的方法，该方法是依靠于确定核酸样品中的多聚核苷酸表达谱型，其例证是表56或表57中的至少两个多聚核苷酸与未感染的个体相比较的多聚核苷酸表达。在本发明的一个方面，感染状态的原因在于感染原或从它们那里得到的信号分子，例如，但不限于革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、病毒、真菌或寄生虫。在另一个方面，本发明提供了依据上述方法确定的受感染个体的多聚核苷酸表达谱型。一旦经确定，这样的多聚核苷酸将可用于诊断与这些感染原或信号分子的存在或活性相关的症状。

[0043]实施例10显示了本发明的这个方面。特别地，表61证明了MEK和NADPH氧化酶抑制剂都能限制细菌的复制(鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)对由IFN-γ引发的巨噬细胞的感染激化了MEK激酶)。这是通过改变宿主细胞信号分子而如何影响细菌存活的一个例子。

[0044]仍然在本发明的另一个方面，提出了可抑制由基质细胞源性因子1(SDF-1)诱导的T细胞趋化性的化合物。还提出了可降低SDF-1受体表达的化合物。这些化合物也可以用作CXCR-4的拮抗剂或抑制剂。在一个方面，本发明提供了作为CXCR-4拮抗剂的阳离子肽。在另一个方面，本发明提供了鉴定作为CXCR-4拮抗剂的阳离子肽的方法。该方法包括，在存在受测肽和缺少受测肽时，将T细胞与SDF-1接触，并测量趋化性。在受测肽存在的情况下，趋化性的降低表明该肽是CXCR-4的拮抗剂。这些化合物和方法在HIV病人的治疗应用中是有用的。这些类型的化合物及其实用性已经被证明，例如实施例11(也参见表格62，63)。在该实施例中，已经表明阳离子肽可抑制细胞迁移(cell migration)以及抗病毒活性。

[0045]在一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式A)的氨基酸序列的被分离的阳离子肽：

X₁X₂X₃IX₄PX₄IPX₅X₂X₁(SEQ ID NO：4)，其中X₁是一个或两个R、L或K，X₂是一个C、S或A，X₃是一个R或P，X₄是一个A或V，X₅是一个V或W。

本发明的肽的例子包括，但不限于：

LLCRIVPVIPWCK(SEQ ID NO：5)，LRCPIAPVIPVCKK(SEQ ID NO：6)，KSRIVPAIPVSLL(SEQ ID NO：7)，KKSPIAPAIPWSR(SEQ ID NO：8)，RRARIVPAIPVARR(SEQ ID NO：9)和LSRIAPAIPWAKL(SEQID NO：10)。

[0046]在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式B)的氨基酸序列的被分离的线性阳离子肽：

X₁LX₂X₃KX₄X₂X₅X₃PX₃X₁(SEQ ID NO：11)，其中X₁是一个或两个D、E、S、T或N，X₂是一个或两个P、G或D，X₃是一个G、A、V、L、I或Y，X₄是一个R、K或H，X₅是一个S、T、C、M或R。本发明的肽的例子包括，但不限于：DLPAKRGSAPGST(SEQ ID NO：12)，SELPGLKHPCVPGS(SEQ ID NO：13)，TTLGPVKRDSIPGE(SEQ IDNO：14)，SLPIKHDRLPATS(SEQ ID NO：15)，ELPLKRGRVPVE(SEQID NO：16)和NLPDLKKPRVPATS(SEQ ID NO：17)。

[0047]在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式C)的氨基酸序列的被分离的线性阳离子肽：

X₁X₂X₃X₄WX₄WX₄X₅K(SEQ ID NO：18)(此式包括CP12a和CP12d)，其中X₁是一至四个选自A、P或R的氨基酸，X₂是一个或两个芳香性氨基酸(F、Y和W)，X₃是一个P或K，X₄是零至两个选自A、P、Y或W的氨基酸，X₅是一至三个选自R或P的氨基酸。本发明的肽的例子包括，但不限于：RPRYPWWPWWPYRPRK(SEQ ID NO：19)，RRAWWKAWWARRK(SEQ ID NO：20)，RAPYWPWAWARPRK(SEQ ID NO：21)，RPAWKYWWPWPWPRRK(SEQ ID NO：22)，RAAFKWAWAWWRRK(SEQ ID NO：23)和RRRWKWAWPRRK(SEQID NO：24)。

[0048]在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式D)的氨基酸序列的被分离的十六聚体阳离子肽：

X₁X₂X₃X₄X₁VX₃X₄RGX₄X₃X₄X₁X₃X₁(SEQ ID NO：25)，其中X₁是一个或两个R或K，X₂是一个极性或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H)，X₃是C、S、M、D或A，X₄是F、I、V、M或R。本发明的肽的例子包括，但不限于：RRMCIKVCVRGVCRRKCRK(SEQ ID NO：26)，KRSCFKVSMRGVSRRRCK(SEQ ID NO：27)，KKDAIKKVDIRGMDMRRAR(SEQ ID NO：28)，RKMVKVDVRGIMIRKDRR(SEQ ID NO：29)，KQCVKVAMRGMALRRCK(SEQ ID NO：30)和RREAIRRVAMRGRDMKRMRR(SEQ ID NO：31)。

[0049]在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式E)的氨基酸序列的被分离的十六聚体阳离子肽：

X₁X₂X₃X₄X₁VX₅X₄RGX₄X₅X₄X₁X₃X₁(SEQ ID NO：32)，其中X₁是一个或两个R或K，X₂是一个极性或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H)，X₃是一个C、S、M、D或A，X₄是一个F、I、V、M或R，X₅是一个A、I、S、M、D或R。本发明的肽的例子包括，但不限于：RTCVKRVAMRGIIRKRCR(SEQ ID NO：33)，KKQMMKRVDVRGISVKRKR(SEQ ID NO：34)，KESIKVIIRGMMVRMKK(SEQ ID NO：35)，RRDCRRVMVRGIDIKAK(SEQ ID NO：36)，KRTAIKKVSRRGMSVKARR(SEQ ID NO：37)和RHCIRRVSMRGIIMRRCK(SEQ ID NO：38)。

[0050]在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式F)的氨基酸序列的被分离的更长的阳离子肽：

KX₁KX₂FX₂KMLMX₂ALKKX₃(SEQ ID NO：39)，其中X₁是一个极性氨基酸(C、S、T、M、N和Q)；X₂是一个A、L、S或K，X₃是1-17个选自G、A、V、L、I、P、F、S、T、K和H的氨基酸。本发明的肽的例子包括，但不限于：KCKLFKKMLMLALKKVLTTGLPALKLTK(SEQ ID NO：40)，KSKSFLKMLMKALKKVLTTGLPALIS(SEQ IDNO：41)，KTKKFAKMLMMALKKVVSTAKPLAILS(SEQ ID NO：42)，KMKSFAKMLMLALKKVLKVLTTALTLKAGLPS(SEQ ID NO：43)，KNKAFAKMLMKALKKVTTAAKPLTG(SEQ ID NO：44)和KQKLFAKMLMSALKKKTLVTTPLAGK(SEQ ID NO：45)。

[0051]在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述通式(通式G)的氨基酸序列的被分离的更长的阳离子肽：

KWKX₂X₁X₁X₂X₂X₁X₂X₂X₁X₁X₂X₂IFHTALKPISS(SEQ ID NO：46)，其中，X₁是疏水性氨基酸，X₂是亲水性氨基酸。本发明的肽的例子包括，但不限于：KWKSFLRTFKSPVRTIFHTALKPISS(SEQ ID NO：47)，KWKSYAHTIMSPVRLIFHTALKPISS(SEQ ID NO：48)，KWKRGAHRFMKFLSTIFHTALKPISS(SEQ ID NO：49)，KWKKWAHSPRKVLTRIFHTALKPISS(SEQ ID NO：50)，KWKSLVMMFKKPARRIFHTALKPISS(SEQ ID NO：51)，和KWKHALMKAHMLWHMIFHTALKPISS(SEQ ID NO：52)。

[0052]在另一个实施方案中，本发明提供了具有下述式子的氨基酸序列的被分离的阳离子肽：

KWKSFLRTFKSPVRTVFHTALKPISS(SEQ ID NO：53)或

KWKSYAHTIMSPVRLVFHTALKPISS(SEQ ID NO：54)。

[0053]在此使用的术语“分离的”是指基本上没有其它蛋白质、脂类和核酸(例如，与体内产生的肽天然联系在一起的细胞组分)的肽。优选地，该肽的纯度依重量来算至少为70％、80％，或者最优选90％。

[0054]本发明还包括被列举的多肽的类似物(analogs)、衍生物(derivatives)、保守变异体(conservative variations)和阳离子肽变体(cationic peptide variants)，只要这些类似物、衍生物、保守变异体或变体具有可检测到的强化先天免疫或抗炎症的活性。肽的类似物、衍生物、保守变异体或变体的活性不一必与该肽的活性完全相同。

[0055]阳离子肽“变体”是指具有所参照的阳离子肽的变化形式的肽。例如，术语“变体”包括参照肽的至少一个氨基酸在表达文库中被替换而得到的阳离子肽。术语“参照”肽是指本发明的任何阳离子肽(例如，在上面式子中所定义的)，由它们得到变体、衍生物、类似物或保守变异。术语“衍生物”包括杂合肽，它包括两种阳离子肽中的每一种的至少一部分(例如，两种阳离子肽中的每一种的30-80％)。还包括将一个或多个氨基酸从在此列举的肽的序列中删去所得到的肽，只要该衍生物具有强化先天免疫或抗炎症的活性。由此可以开发得到同样具有效用的更小的活性分子。例如，可以移去那些对于强化先天免疫和肽的抗炎活性并不是必要的氨基端氨基酸或羧基端氨基酸。同样，可以将一个或一些(例如，少于5个)氨基酸添加到阳离子肽上而且不会完全抑制该肽的活性，这样便得到另外的衍生物。此外，C端衍生物，例如C端甲基酯，和N端衍生物可以被获得，而且它们被包括在本发明内。本发明的肽包括本发明所公开的肽的任何类似物、同源物(homolog)、突变体(mutant)、异构体(isomer)或衍生物，只要在此所述的生物活性仍然保留着。还包括前面提出的通式所包含的肽的反向序列。此外，可以用“L”构型的氨基酸替代“D”构型的氨基酸，反之亦然。作为选择，可以通过化学方法或者在其序列中增加两个或多个半胱氨酸残基并氧化形成二硫键，将该肽环化。

[0056]本发明还包括作为在此列举的那些肽的保守变异体的肽。在此使用的术语“保守变异体”是指至少一个氨基酸被别的生物活性类似的残基替换所得到的多肽。保守变异体的例子包括用一个疏水性残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸替代另一个疏水性残基，或者用一个极性残基替代另一个极性残基，例如，精氨酸替代赖氨酸，谷氨酸替代天冬氨酸，谷氨酰胺替代天冬酰胺，等等。可以彼此替换的中性亲水性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。“保守变异体”还包括用取代的氨基酸替换未取代的原氨基酸(parent amino acids)所得到的肽。这些取代的氨基酸可以包括甲基化的或酰胺化的氨基酸。其它替代对于本领域技术人员是熟知的。在一个方面，由取代的多肽制出的抗体也能够特异地结合未取代的多肽。

[0057]本发明的肽可以用普遍使用的方法合成，例如，该方法包括α氨基的t-BOC或FMOC保护。两种方法都涉及逐步合成步骤，其中从该肽的C末端开始，每一步增加一个氨基酸(参见，Coligan等，CurrentProtocols in Immunology，Wiley Interscience，1991，第9单元)。本发明的肽也可以用已熟知的固相肽合成方法合成，例如由Merrifield(J.Am.Chem.Soc.，85：2149，1962)以及Stewart和Young(Solid PhasePeptides Synthesis，Freeman，San Francisco，1969，第27-62页)描述的方法，其中使用了苯乙烯-二乙烯基苯共聚聚合物，每克聚合物中有0.1-1.0毫摩尔胺。化学合成完成后，用HF-10％苯甲醚在0℃处理1/4-1小时，将该肽脱保护并从聚合物上切割下来。待试剂蒸发后，用1％乙酸溶液将肽从聚合物中提取出来，然后冻干得到粗产物。使用例如凝胶过滤的技术将该肽纯化，例如在Sephadex G-15上使用5％乙酸作为溶剂。将柱洗脱物的合适级分冻干，便可产生匀质的肽，然后用标准的技术例如氨基酸分析、薄层色谱、高效液相色谱、紫外吸收光谱、摩尔旋光或者溶解性测量对它进行表征。如果需要的话，该肽可以使用固相Edman降解定量。

[0058]本发明也包括编码本发明的肽的被分离的核酸(例如，DNA、cDNA或RNA)。编码在此描述的肽的类似物、突变体、保守变异体和变体的核酸也包括在内。在此使用的术语“分离的”是指基本上除去了与体内产生的核酸天然联系着的蛋白、脂和其它核酸所得到的核酸。优选地，该核酸的纯度在重量上为至少70％、80％或优选90％。可以使用体外合成核酸的传统方法替代体内方法。正如在此使用的，“核酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，它们可以是一个独立的片断，也可以是一个大的遗传构建物(construct)的一部分(例如，将一个启动子连接到编码本发明的肽的核酸上)。大量的遗传构建物(例如，质粒和其它表达载体)在本领域是已知的，它们可被用于在无细胞系统或原核细胞或真核(例如酵母、昆虫或哺乳动物)细胞中制造本发明的肽。考虑到遗传密码的简并性，本领域普通技术人员能够容易地合成编码本发明的多肽的核酸。可以方便地使用传统的分子生物学方法利用本发明的核酸获得本发明的肽。

[0059]可以将编码本发明的阳离子肽的DNA插入到“表达载体”中。术语“表达载体”是指一种遗传构建物例如质粒、病毒或其他本领域已知的载体，它们可以经过设计而含有编码本发明的多肽的核酸。这些表达载体优选为含有启动子序列的质粒，启动子有助于插入的基因序列在宿主细胞中的转录。表达载体通常含有复制起点、启动子和能实现被转化的细胞的表型选择的多聚核苷酸(例如，抗生素抗性多聚核苷酸)。在本发明中可以使用各种启动子，包括诱导型启动子和组成型启动子。通常，该表达载体含有复制子位点和由与宿主细胞相容的物种所获得的控制序列。

[0060]可以使用本领域技术人员已熟知的传统技术，将本发明的核酸转化或转染到受体(recipient)中。例如，当宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)时，可以使用本领域已知的CaCl₂、MgCl₂或RbCl方法制备能够吸收DNA的感受态细胞。作为选择，可以使用物理方法，例如电穿孔或微注射。电击转化是通过高电压脉冲将核酸转移到细胞中。此外，可以使用本领域已熟知的方法，通过原生质体融合将核酸引入宿主细胞中。用于转化真核细胞的合适方法例如电穿孔和脂转染也是已知的。

[0061]本发明所包含的“宿主细胞”或“受体细胞”是指可以在其中用本发明的核酸来表达本发明的多肽的任何细胞。该术语也包括受体细胞或宿主细胞的任何子代。本发明优选的受体细胞或宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)、金黄葡萄球菌(S.aureus)和绿脓杆菌(P.aeruginosa)，尽管其它的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、真菌和哺乳动物细胞和本领域已知的其它生物也可以被利用，只要该表达载体含有复制起点以允许其在该宿主中表达。

[0062]根据本发明的方法所使用的阳离子肽多聚核苷酸序列可以从生物体中分离得到，或者在实验室合成。编码感兴趣的阳离子肽的特定DNA序列可以通过如下方法获得：1)从基因组DNA从分离出双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以提供感兴趣的阳离子肽所需的密码子；和3)利用从供体细胞分离出的mRNA的反转录在体外合成双链DNA序列。在后一种情况中，可以得到mRNA的双链DNA互补序列，它通常被称之为cDNA。

[0063]当所需要的肽产物的氨基酸残基的整个序列都是已知时，合成其DNA序列通常是被选择的方法。在本发明中，合成DNA序列具有一个优点，即允许整合进最可能被细菌宿主识别的密码子，由此便没有翻译上的困难，可以获得高水平的表达。此外，事实上任何肽都可以被合成，包括那些编码天然阳离子肽的肽、它们的变体或合成的肽。

[0064]当所需要的肽的整个序列是未知的时候，DNA序列的直接合成便不可能，此时可以选择的方法是获得cDNA序列。分离出感兴趣的cDNA序列的标准程序包括构建含有cDNA文库的质粒或噬菌体，cDNA文库是由存在于供体细胞中具有高水平遗传表达的大量mRNA的反转录获得。当同聚合酶链式反应一起被使用时，即使稀有表达产物也能被克隆。当阳离子肽的氨基酸序列的重要部分是已知时，可以制作标记的单链或双链DNA或RNA探针，其序列被认为是存在于目标cDNA中，于是在已变性成为单链形式的cDNA克隆拷贝上进行DNA/DNA杂交实验时就可以应用这些探针(Jay等，Nuc.Acid.Res.，11：2325，1983)。

[0065]可以通过注射或一段时间内的逐渐输注方式不经肠道地施用本发明的肽。该肽可以静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内或透皮施用。传送该肽的优选方法包括通过微球体或类蛋白形式的胶囊进行口服，以气雾剂形式传送至肺，或者利用离子电渗透或电穿孔经皮传送。其它的施用方法对本领域技术人员是已知的。

[0066]本发明的肽的不经肠道施用形式的制备包括无菌的含水或无水溶液、悬浮液和乳液。无水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油，以及可注射用的有机酯例如油酸乙酯。含水载剂包括水、乙醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和含缓冲介质的不经肠道载体，包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖液、葡萄糖和氯化钠、乙酸钠、柠檬酸钠、乳酸化林格氏溶液或非挥发性油。静脉内施用的载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如它们可基于林格氏葡萄糖液)，等等。也可以含有防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物试剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体和类似物。

[0067]现在通过引用下面的非限制性实施例，更详细地描述本发明。通过引用本发明的一些优选实施方案，本发明被更详细地描述，同时，应该理解，修改和变化亦在被描述和要求保护的内容的精神和范围之内。

                        实施例1

                    抗脓毒症/抗炎症活性

[0068]利用多聚核苷酸阵列来确定阳离子肽对上皮细胞转录应答的影响。将A549人上皮细胞系保持在DMEM(Gibco)中，并补充以10％胎牛血清(FBS，Medicorp)。将A549细胞铺在100mm组织培养皿中，每个培养皿含2.5×10⁶个细胞，过夜培养，然后和100ng/ml的E.coliO111：B4 LPS(Sigma)共同温育4小时，其中含有50μg/ml的肽及培养基，或者不含有肽而只有培养基，作为对照。经刺激后，用焦碳酸二乙酯处理的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞一次，再用细胞刷刮下细胞。用RNAquesous(Ambion，Austin，TX)分离总RNA。用含有Superase-In(RNA酶抑制剂；Ambion)的无RNA酶的水重悬RNA沉淀物。用DNA-free试剂盒(Ambion)除掉DNA污染。通过1％琼脂糖凝胶电泳估计RNA的质量。

[0069]所使用的多聚核苷酸阵列是Human Operon阵列(该基因组的识别号(identification number)是PRHU04-S1)，它由双份的14,000个的人寡聚体点组成。用10μg总RNA制备探针，探针用Cy 3或Cy 5标记的dUTP进行标记。该探针经纯化后杂交到印刷玻璃片上，42℃过夜，然后洗涤。洗涤之后，用Perkin Elmer阵列扫描仪获取图象。用图象处理软件(Imapolynucleotide 5.0，Marina Del Rey，CA)确定点的平均强度，中间强度和背景强度。使用“自制的”程序除去背景。该程序计算将每个子小格(subgrid)的底部强度计为10％，并对每个小格(grid)减去此值。使用Genespring软件(Redwood City，CA)进行分析。从一个玻片内的点数值的集合中，获得中间点强度值，并将该值与此实验中所有玻片的数值比较，从而使每个点的强度标准化。肽处理的细胞和对照细胞之间的相对变化可以在表1和表2中看到。表2只显示了那些在受测的14,000个多聚核苷酸中表达发生明显变化的多聚核苷酸。该数据表明，该肽具有广泛地降低由LPS诱导的多聚核苷酸表达的能力。

[0070]在表1中，多聚核苷酸微阵列的研究表明了SEQ ID NO：27的肽有效地降低了由E.coli O111：B4 LPS增量调节的多种多聚核苷酸的表达。肽(50μg/ml)和LPS(0.1μg/ml)与A549细胞一起温育4小时，或者LPS单独与A549细胞温育4小时，然后分离出RNA。利用5μg总RNA制作出Cy 3/Cy 5标记的cDNA探针，并杂交到HumanOperon阵列(PRHU04)上。表1的第三列显示未受刺激的细胞的强度。“比值：LPS/对照”一列是指用LPS刺激的细胞中的多聚核苷酸表达的强度除以未受刺激的细胞的强度所得到的结果。“比值：LPS+ID27/对照”一列是指用LPS和肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达的强度除以未受刺激的细胞的强度所得到的结果。

表1：肽SEQ ID 27降低

由E.coli O111：B4 LPS增量调控的A549人上皮细胞多聚核苷酸表达

序列登记号a	多聚核苷酸基因功能	对照：仅有培养基强度	比值：LPS/对照	比值：LPS+ID 27/对照
					AL031983	未知	0.032	302.8	5.1
L04510	ADP-核糖基化因子	0.655	213.6	1.4
					D87451	环指蛋白10	3.896	183.7	2.1
AK000869	假想蛋白	0.138	120.1	2.3

U78166	在神经元中表达的Ric样	0.051	91.7	0.2
					AJ001403	气管支气管黏蛋白5亚型B	0.203	53.4	15.9
AB040057	丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MASK	0.95	44.3	15.8
					Z99756	未知	0.141	35.9	14.0
L42243	干扰素受体2	0.163	27.6	5.2
					MN_016216	RNA套索脱分支酶	6.151	22.3	10.9
AK001589	假想蛋白	0.646	19.2	1.3
					AL137376	未知	1.881	17.3	0.6
AB007856	FEM-1样死亡受体结合蛋白	2.627	15.7	0.6
					AB007854	生长阻滞特异蛋白7	0.845	14.8	2.2
AK000353	细胞溶质卵巢肿瘤抗原1	0.453	13.5	1.0
					D14539	髓样/淋巴样或混合谱系白血病；发生易位的；1(MLLT1)	2.033	11.6	3.1
X76785	爱泼斯坦-巴尔病毒的整合位点	0.728	11.6	1.9
					M54915	pim-1癌基因	1.404	11.4	0.6
NM_006092	天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)征募结构域4	0.369	11.0	0.5
					J03925	整连蛋白αM	0.272	9.9	4.2
NM_001663	ADP-核糖基化因子6	0.439	9.7	1.7
					M23379	RAS p21蛋白激活剂	0.567	9.3	2.8
K02581	可溶性胸苷激酶1	3.099	8.6	3.5
					U94831	跨膜9超家族成员1	3.265	7.1	1.5
X70394	锌指蛋白146	1.463	6.9	1.7
					AL137614	假想蛋白	0.705	6.8	1.0
U43083	鸟嘌呤核苷酸结合蛋白	0.841	6.6	1.6
					AL137648	DKFZp434J1813蛋白	1.276	6.5	0.8
AF085692	ATP-结合盒亚家族C(CFTR-MRP)成员3	3.175	6.5	2.4
					AK001239	假想蛋白FLJ10377	2.204	6.4	1.3
NM_001679	ATP酶Na+/K+转运β3多肽	2.402	6.3	0.9
					L24804	无活性孕酮受体	3.403	6.1	1.1

U15932	双重特异性磷酸酶5	0.854	6.1	2.1
					M36067	ATP依赖性DNA连接酶I	1.354	6.1	2.2
AL161951	未知	0.728	5.8	1.9
					M59820	集落刺激因子3受体	0.38	5.7	2.0
AL050290	亚精胺/精胺N1-酰基转移酶	2.724	5.6	1.4
					NM_002291	层黏连蛋白β-1	1.278	5.6	1.8
X06614	视黄酸受体α	1.924	5.5	0.8
					AB007896	推定的L型中性氨基酸转运蛋白	0.94	5.3	1.8
AL050333	DKFZP564B116蛋白	1.272	5.3	0.6
					AK001093	假想蛋白	1.729	5.3	2.0
NM_016406	假想蛋白	1.314	5.2	1.2
					M86546	前B细胞白血病转录因子1	1.113	5.2	2.2
X56777	透明带糖蛋白3A	1.414	5.0	1.4
					NM_013400	复制起始区域蛋白	1.241	4.9	2.0
NM_002309	白血病抑制因子	1.286	4.8	1.9
					NM_001940	齿状红核苍白球萎缩症	2.034	4.7	1.2
U91316	细胞溶质酰基辅酶A硫酯水解酶	2.043	4.7	1.4
					X76104	死亡相关蛋白激酶1	1.118	4.6	1.8
AF131838	未知	1.879	4.6	1.4
					AL050348	未知	8.502	4.4	1.7
D42085	KIAA0095基因产物	1.323	4.4	1.2
					X92896	未知	1.675	4.3	1.5
U26648	突触融合蛋白5A	1.59	4.3	1.4
					X85750	与单核细胞到巨噬细胞的分化有关	1.01	4.3	1.1
D14043	CD164抗原_唾液酸粘蛋白	1.683	4.2	1.0
					J04513	成纤维生长因子2	1.281	4.0	0.9
U19796	黑素瘤相关抗原	1.618	4.0	0.6
					AK000087	假想蛋白	1.459	3.9	1.0
AK001569	假想蛋白	1.508	3.9	1.2
					AF189009	泛蛋白2	1.448	3.8	1.3
U60205	固醇-C4-甲基氧化酶样	1.569	3.7	0.8

AK000562	假想蛋白	1.166	3.7	0.6
					AL096739	未知	3.66	3.7	0.5
AK000366	假想蛋白	15.192	3.5	1.0
					NM_006325	RAN成员RAS癌基因超家族	1.242	3.5	1.4
X51688	细胞周期蛋白A2	1.772	3.3	1.0
					U34252	醛脱氢酶	1.264	3.3	1.2
NM_013241	含有FH1/FH2结构域的蛋白	1.264	3.3	0.6
					AF112219	酯酶/甲酰谷胱甘肽水解酶	1.839	3.3	1.1
NM_016237	间期促进性复合物亚基5	2.71	3.2	0.9
					AB014569	KIAA0669基因产物	2.762	3.2	0.2
AF151047	假想蛋白	3.062	3.1	1.0
					X92972	蛋白磷酸酶6催化性亚基	2.615	3.1	1.1
AF035309	蛋白酶体26S亚基ATP酶5	5.628	3.1	1.3
					U52960	SRB7同源物	1.391	3.1	0.8
J04058	电子转移黄素蛋白α多肽	3.265	3.1	1.2
					M57230	白介素6信号转导物	0.793	3.1	1.0
U78027	α半乳糖苷酶	3.519	3.1	1.1
					AK000264	未知	2.533	3.0	0.6
X80692	有丝分裂原活化蛋白激酶6	2.463	2.9	1.3
					L25931	核纤层蛋白B受体	2.186	2.7	0.7
X13334	CD14抗原	0.393	2.5	1.1
					M32315	肿瘤坏死因子受体超家族成员1B	0.639	2.4	0.4
NM_004862	由LPS诱导的TNF-α因子	6.077	2.3	1.1
					AL050337	干扰素γ受体1	2.064	2.1	1.0

^a表1到表64中的所有登记号均指GenBank登记号(AccessionNumbers)。

[0071]在表2中，多聚核苷酸微阵列的研究表明了浓度为50μg/ml的阳离子肽有效地降低了由100ng/ml的E.coli O111：B4 LPS增量调节的许多多聚核苷酸的表达。肽和LPS与A549细胞一起温育4小时，或者LPS单独与A549细胞温育4小时，然后分离出RNA。利用5μg总RNA制作出Cy 3/Cy 5标记的cDNA探针，并杂交到Human Operon阵列(PRHU04)上。表2的第三列显示未受刺激的细胞的强度。“比值：LPS/对照”一列是指用LPS刺激的细胞中的多聚核苷酸表达的强度除以未受刺激的细胞的强度所得到的结果。其它列是指用LPS和肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达的强度除以未受刺激的细胞的强度所得到的结果。

[0072]表2：由E.coli O111：B4 LPS增量调控的和由阳离子肽降低的人A549上皮细胞多聚核苷酸表达

登记号	基因	对照：仅有培养基强度	比值：LPS/对照	比值：LPS+ID27/对照	比值：LPS+ID16/对照	比值：LPS+ID22/对照
							AL031983	未知	0.03	302.8	5.06	6.91	0.31
L04510	ADP-核糖基化因子	0.66	213.6	1.4	2.44	3.79
							D87451	环指蛋白	3.90	183.7	2.1	3.68	4.28
AK000869	假想蛋白	0.14	120.1	2.34	2.57	2.58
							U78166	Ric样	0.05	91.7	0.20	16.88	21.37
X03066	II类MHCDOβ	0.06	36.5	4.90	12.13	0.98
							AK001904	假想蛋白	0.03	32.8	5.93	0.37	0.37
AB037722	未知	0.03	21.4	0.30	0.30	2.36
							AK001589	假想蛋白	0.65	19.2	1.26	0.02	0.43
AL137376	未知	1.88	17.3	0.64	1.30	1.35
							L19185	硫氧还蛋白依赖型过氧化物还原酶1	0.06	16.3	0.18	2.15	0.18
J05068	转钴胺素蛋白I	0.04	15.9	1.78	4.34	0.83
							AB007856	FEM-1样死亡受体结合	2.63	15.7	0.62	3.38	0.96

	蛋白
							Ak000353	细胞溶质卵巢肿瘤抗原1	0.45	13.5	1.02	1.73	2.33
X16940	平滑肌肠肌动蛋白γ2	0.21	11.8	3.24	0.05	2.26
							M54915	pim-1癌基因	1.40	11.4	0.63	1.25	1.83
AL122111	假想蛋白	0.37	10.9	0.21	1.35	0.03
							M95678	磷脂酶Cβ2	0.22	7.2	2.38	0.05	1.33
AK001239	假想蛋白	2.20	6.4	1.27	1.89	2.25
							AC004849	未知	0.14	6.3	0.07	2.70	0.07
X06614	视黄酸受体α	1.92	5.5	0.77	1.43	1.03
							AB007896	推定的L型中性氨基酸转运蛋白	0.94	5.3	1.82	2.15	2.41
AB010894	BAI1相关性蛋白	0.69	5.0	1.38	1.03	1.80
							U52522	RAC1伴侣	1.98	2.9	1.35	0.48	1.38
AK001440	假想蛋白	1.02	2.7	0.43	1.20	0.01
							NM_001148	神经元的锚蛋白2	0.26	2.5	0.82	0.04	0.66
X07173	α间抑制剂H2	0.33	2.2	0.44	0.03	0.51
							AF095687	脑和鼻咽癌敏感性蛋白	0.39	2.1	0.48	0.03	0.98
NM_016382	NK细胞激活诱导配体NAIL	0.27	2.1	0.81	0.59	0.04
							AB023198	KIAA0981蛋白	0.39	2.0	0.43	0.81	0.92

                                实施例2

                            中和对免疫细胞的刺激

[0073]测试了化合物压制革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌产物对免疫细胞的刺激的能力。细菌产物刺激免疫系统的细胞，由此产生炎症细胞因子，当它们不受压制时，就可能导致脓毒症。开始的实验是利用由美国典型培养物收藏中心(Manassas，VA)获得的鼠巨噬细胞系RAW 264.7，人上皮细胞系A549和来自BALB/c鼠骨髓的原代巨噬细胞(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)。用150mm培养板培养来自鼠骨髓的细胞，培养基为达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM；Life Technologies，Burlington，ON)，并补充以20％FBS(Sigma ChemicalCo，St.Louis，MO)和20％L细胞条件培养液作为M-CSF来源。当巨噬细胞铺满60-80％时，移去培养基中的L细胞条件培养液，培养14-16小时，直到它们进入静态，然后用10ng/ml LPS或100ng/ml LPS+20μg/ml肽处理24小时。用ELISA(R&D Systems，Minneapolis，MN)测定释放到培养物上清中的细胞因子。细胞系RAW 264.7和A549被保持在补充有10％胎小牛血清的DMEM中。将RAW 264.7细胞以每孔10⁶个细胞的密度接种到含有DMEM的24孔板中，将A549细胞以每孔10⁵个细胞的密度接种到含有DMEM的24孔板中，两者均于37℃在5％CO₂中过夜培养。从过夜生长的细胞中吸去DMEM，换以新鲜培养基。在一些实验中，通过静脉穿刺将志愿者的血液收集(按照UBC临床研究道德委员会承认的程序，证明号C00-0537)到含有14.3USP单位肝素/ml血液的试管(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中。将血液与带有肽或者没有肽的LPS，于37℃在聚丙烯管中混合6小时。样品于2000×g离心5分钟，收集血浆，然后贮存于-20℃，直到用ELISA(R&D Systems)对其作IL-8分析时才取出。在这些细胞实验中，将细胞与LPS或其它细菌产物于37℃在5％CO₂中温育6-24小时。鼠伤寒沙门氏菌LPS和E.coli 0111：B4 LPS购自Sigma。将来自金黄葡萄球菌(Sigma)的脂磷壁酸(LTA)重悬于无内毒素的水(Sigma)中。对LTA制备物进行鲎变形细胞溶解物试验(Sigma)以确定其没有受到明显的内毒素污染。内毒素污染小于1ng/ml，该浓度不会导致RAW 264.7细胞产生明显的细胞因子产物。无帽的脂阿拉伯甘露聚糖(AraLAM)由Colorado State University的John T.Belisle博士馈赠。将分支杆菌(Mycobacterium)的AraLAM过滤灭菌，用鲎变形细胞试验测定内毒素污染，发现为3.75ng/1.0mg LAM。在加入LPS的同时(或者在一些特别指出的地方，是在随后加入)，加入一定浓度范围的阳离子肽。移走上清，用ELISA(R&D Systems)对产生的细胞因子进行检测。所有实验都至少进行三次，得到的是类似的结果。为了证实体内的抗脓毒症活性，将2或3μg E.coli 0111：B4 LPS的磷酸缓冲盐溶液(PBS；pH 7.2)经腹膜注射到半乳糖胺敏化的8-10周雌性CD-1或BALB/c鼠体内，由此诱导脓毒症。在其他实验中，将400μgE.coli 0111：B4 LPS注射进入CD-1鼠，10分钟后，再通过腹膜内注射导入肽(200μg)。注射后对存活情况进行48小时监测。

[0074]传统上认为产生过量的TNF-α是与脓毒症的发生联系在一起的。在此实施例中使用的三种类型LPS、LTA或AraLAM代表了由革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌释放的产物。SEQ ID NO：1的肽能够明显降低由鼠伤寒沙门氏菌、洋葱伯克霍尔德菌(B.cepacia)和E.coli0111：B4 LPS刺激的TNF-α生成，前者所受的影响要稍小些(表3)。在后两种情况中可以看到，浓度低至1μg/ml的肽(0.25nM)也能导致TNF-α生成的显著降低。一种不同的肽，SEQ ID NO：3并不降低RAW巨噬细胞中LPS诱导的TNF-α生成，说明这是阳离子肽的一个并不统一和不可预测的性质。还测试了每个式子的代表性肽影响由E.coli0111：B4 LPS刺激的TNF-α生成的能力(表4)。尽管这些肽中有许多都降低了TNF-α生成的至少60％，但是它们降低TNF-α生成的能力是有差别的。

[0075]一定浓度的肽SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2还能够削弱细菌产物刺激上皮细胞系生成IL-8的能力。已经知道LPS能够有效地刺激上皮细胞生成IL-8。肽在低浓度(1-20μg/ml)时能压制上皮细胞对LPS的IL-8生成应答(表5-7)。肽SEQ ID 2也抑制由LPS诱导的人全血中的IL-8生成(表4)。相反，高浓度的肽SEQ ID NO：1(50-100μg/ml)实际上会导致IL-8的水平升高(表5)。这表明肽在不同的浓度具有不同的效果。

[0076]肽对炎症刺激的影响也在原代鼠细胞中得到了证实，肽SEQ IDNO：1明显降低了BALB/c鼠的源自骨髓的巨噬细胞中的TNF-α生成(＞90％)，该细胞已经用100ng/ml E.coli 0111：B4 LPS刺激过(表8)。这些实验都是在存在血清的情况下进行的，其中含有LPS结合蛋白(LBP)，这是一种能够介导LPS快速结合到CD14上的蛋白。在用100ng/ml E.coli LPS进行刺激后一小时再将SEQ ID NO：1延迟加入到巨噬细胞上清中，仍然导致TNF-α生成的明显降低(70％，表9)。

[0077]SEQ ID NO：1能够阻止LPS在体外诱导生成TNF-α，与此相一致，某些肽也能使鼠避免由高浓度LPS诱发的致死性休克。在一些实验中，通过预先注射半乳糖胺使CD-1鼠对LPS产生过敏性。由半乳糖胺敏化的小鼠在注射以3μg的E.coli 0111：B4 LPS之后4-6小时内被处死。在注射LPS后15分钟，再注射200μg的SEQ ID NO：1，有50％的小鼠存活(表10)。在其它实验中，将更高浓度的LPS注射到没有预先注射D型半乳糖胺的BALB/c鼠中，肽提供的保护是100％，与之相比，在对照组中无一存活(表13)。发现被选择的其它肽在这些模型中也是具有保护性的(表11，12)。

[0078]阳离子肽还能够减缓革兰氏阳性细菌的产物对巨噬细胞的刺激，这些细菌产物例如分支杆菌的无帽脂阿拉伯甘露聚糖(AraLAM)和金黄葡萄球菌(S.aureus)的LTA。例如，SEQ ID NO：1抑制革兰氏阳性细菌产物LTA(表14)和AraLAM(表15)对RAW 264.7细胞中的TNF-α的诱导，后者的程度稍轻些。还发现另一个肽SEQ ID NO：2降低了LTA对RAW 264.7细胞中的TNF-α的诱导。浓度为1μg/ml的SEQ ID NO：1能够明显降低(＞75％)1μg/ml的金黄葡萄球菌LTA对TNF-α生成的诱导。在SEQ ID NO：1浓度为20μg/ml时，AraLAM诱导TNF-α的抑制率＞60％。可以引入多黏菌素B(PMB)作为对照，以证明在SEQ ID NO：1对AraLAM诱导TNF-α的抑制中，内毒素污染不是一个显著因素。这些结果证明阳离子肽能够减弱免疫系统对细菌产物的促炎细胞因子应答。

[0079]表3：在RAW 264.7细胞中SEQ ID NO：1减少由LPS诱导的TNF-α生成。在存在指定浓度的SEQ ID 1的情况下，用100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、100ng/ml洋葱伯克霍尔德菌LPS和100ng/ml E.coli0111：B4 LPS，刺激RAW 264.7鼠巨噬细胞6小时。用ELISA测定释放到培养物上清中的TNF-α的浓度。100％是表示单独用LPS温育RAW 264.7细胞6小时所获得的TNF-α的量(鼠伤寒沙门氏菌LPS＝34.5±3.2ng/ml，洋葱伯克霍尔德菌LPS＝11.6±2.9ng/ml，E.coli 0111：B4 LPS＝30.8±2.4ng/ml)。不加以刺激地培养了6小时的RAW 264.7细胞的TNF-α生成的背景水平为0.037-0.192ng/ml。实验数据来自于两份相同的样品，并且表示成三个实验的平均值+标准偏差的形式。

SEQ ID 1的量(μg/ml)	对TNF-α的抑制(％)*
				洋葱伯克霍尔德菌LPS	大肠杆菌LPS	鼠伤寒沙门氏菌LPS
	0.1	8.5±2.9	0.0±0.6				0.0±0
1				23.0±11.4	36.6±7.5	9.8±6.6
	5	55.4±8	65.0±3.6				31.1±7.0
10				63.1±8	75.0±3.4	37.4±7.5
	20	71.7±5.8	81.0±3.5				58.5±10.5
50				86.7±4.3	92.6±2.5	73.1±9.1

[0080]表4：在RAW 264.7细胞中阳离子肽减少由E.coli LPS诱导的TNF-α生成。在存在指定浓度的阳离子肽的情况下，用100ng/ml E.coli0111：B4 LPS刺激RAW 264.7鼠巨噬细胞6小时。用ELISA测定释放到培养物上清中的TNF-α的浓度。不加以刺激地培养了6小时的RAW264.7细胞的TNF-α生成的背景水平为0.037-0.192ng/ml。实验数据来自于两份相同的样品，并且表示成三个实验的平均值+标准偏差的形式。

肽(20μg/ml)	对TNF-α的抑制(％)
		SEQ ID 5	65.6±1.6
SEQ ID 6	59.8±1.2
		SEQ ID 7	50.6±0.6
SEQ ID 8	39.3±1.9
		SEQ ID 9	58.7±0.8
SEQ ID 10	55.5±0.52
		SEQ ID 12	52.1±0.38
SEQ ID 13	62.4±0.85
		SEQ ID 14	50.8±1.67
SEQ ID 15	69.4±0.84
		SEQ ID 16	37.5±0.66
SEQ ID 17	28.3±3.71
		SEQ ID 19	69.9±0.09
SEQ ID 20	66.1±0.78
		SEQ ID 21	67.8±0.6
SEQ ID 22	73.3±0.36
		SEQ ID 23	83.6±0.32
SEQ ID 24	60.5±0.17

SEQ ID 26	54.9±1.6
		SEQ ID 27	51.1±2.8
SEQ ID 28	56±1.1
		SEQ ID 29	58.9±0.005
SEQ ID 31	60.3±0.6
		SEQ ID 33	62.1±0.08
SEQ ID 34	53.3±0.9
		SEQ ID 35	60.7±0.76
SEQ ID 36	63±0.24
		SEQ ID 37	58.9±0.67
SEQ ID 38	54±1
		SEQ ID 40	75±0.45
SEQ ID 41	86±0.37
		SEQ ID 42	80.5±0.76
SEQ ID 43	88.2±0.65
		SEQ ID 44	44.9±1.5
SEQ ID 45	44.7±0.39
		SEQ ID 47	36.9±2.2
SEQ ID 48	64±0.67
		SEQ ID 49	86.9±0.69
SEQ ID 53	46.5±1.3
		SEQ ID 54	64±0.73

[0081]表5：在A549细胞中SEQ ID 1减少由LPS诱导的IL-8生成。在存在LPS(100ng/ml E.coli 0111：B4)的情况下，用浓度逐渐增高的SEQ ID 1刺激A549细胞24小时。用ELISA测定培养物中的IL-8浓度。单独的细胞的IL-8背景水平为0.172±0.029ng/ml。数据表示成三个实验的平均值+标准偏差的形式。

SEQ ID 1(μg/ml)	对IL-8的抑制(％)
		0.1	1±0.3
1	32±10
		10	60±9
20	47±12
		50	40±13
100	0

[0082]表6：在A549细胞中SEQ ID 2减少由E.coli LPS诱导的IL-8生成。在存在LPS(100ng/ml E.coli O111：B4)的情况下，用浓度逐渐增高的SEQ ID 2刺激人A549上皮细胞24小时。用ELISA测定培养物上清中的IL-8浓度。数据表示成三个实验的平均值+标准偏差的形式。

SEQ ID 2的浓度(μg/ml)	对IL-8的抑制(％)
		0.1	6.8±9.6
1	12.8±24.5
		10	29.0±26.0
50	39.8±1.6
		100	45.0±3.5

[0083]表7：在人血液中SEQ ID 2减少由E.coli LPS诱导的IL-8生成。用E.coli O111：B4 LPS和浓度逐渐增高的肽刺激人全血4小时。将人全血样品离心，移走血清并用ELISA测定IL-8浓度。数据表示成两个供血者的平均值。

SEQ ID 2(μg/ml)	IL-8(pg/ml)
		0	3205
10	1912
		50	1458

[0084]表8：在鼠骨髓巨噬细胞中SEQ ID 1减少由E.coli LPS诱导的TNF-α生成。在存在20μg/ml的肽或者没有肽的情况下，将源自BALB/c鼠骨髓的巨噬细胞与100ng/ml E.coli O111：B4 LPS共同培养6小时或24小时。收集上清并用ELISA测定TNF-α的水平。数据表示TNF-α的量，它来自两份相同的实验，源自骨髓的巨噬细胞与LPS单独温育6小时(1.1±0.09ng/ml)或24小时(1.7±0.2ng/ml)。TNF-α的背景水平为：6小时是0.038±0.008ng/ml，24小时是0.06±0.012ng/ml。

SEQ ID 1(μg/ml)	TNF-α的生成量(ng/ml)
				6小时	24小时
只有LPS	1.1	1.7
1	0.02	0.048
			10	0.036	0.08
100	0.033	0.044
			没有LPS 对照	0.038	0.06

[0085]表9：推迟加入到A549细胞中的SEQ ID 1抑制由E.coli LPS诱导的TNF-α生成。在逐渐后延的时间点，将肽(20μg/ml)加入到已含有A549人上皮细胞和100ng/ml E.coli O111：B4 LPS的培养孔中。6小时之后收集上清并用ELISA测定TNF-α水平。数据表示成三个实验的平均值+标准偏差的形式。

在加入LPS之后加入SEQ ID 1的时间(分钟)	对TNF-α的抑制(％)
		0	98.3±0.3
15	89.3±3.8
		30	83±4.6
60	68±8
		90	53±8

[0086]表10：通过SEQ ID 1对半乳糖胺敏化的CD-1鼠中的致命性内毒素血症进行防御。通过三次腹膜内注射半乳糖胺(20mg，溶于0.1ml无菌PBS中)，使CD-1鼠(9周大)对内毒素产生过敏性。然后通过腹膜内注射E.coli O111：B4 LPS(3μg，在0.1ml PBS中)诱导内毒素休克。注射LPS后15分钟，再在一个不同的位点注射肽SEQ ID 1(200μg/只鼠＝8mg/kg)。对鼠进行48小时监测并记录下结果。

D-半乳糖胺处理	E.coli O111：B4 LPS	肽或缓冲液	鼠的总数	内毒素休克后的存活量
					0	3μg	PBS	5	5(100％)
20mg	3μg	PBS	12	0(0％)
					20mg	3μg	SEQ ID 1	12	5(50％)

[0087]表11：通过阳离子肽对半乳糖胺敏化的CD-1鼠中的致命性内毒素血症进行防御。通过腹膜内注射半乳糖胺(20mg，溶于0.1ml无菌PBS中)，使CD-1鼠(9周大)对内毒素产生过敏性。然后通过腹膜内注射E.coli O111：B4 LPS(2μg，在0.1ml PBS中)诱导内毒素休克。注射LPS后15分钟，再在一个不同的位点注射肽(200μg/只鼠＝8mg/kg)。对鼠进行48小时监测并记录下结果。

肽处理	加入的E.coliO111：B4 LPS	鼠的数目	存活(％)
				对照(没有肽)	2μg	5	0

SEQ ID 6	2μg	5	40
				SEQ ID 13	2μg	5	20
SEQ ID 17	2μg	5	40
				SEQ ID 24	2μg	5	0
SEQ ID 27	2μg	5	20

[0088]表12：通过阳离子肽对半乳糖胺敏化的BALB/c鼠中的致命性内毒素血症进行防御。通过腹膜内注射半乳糖胺(20mg，溶于0.1ml无菌PBS中)，使BALB/c鼠(8周大)对内毒素产生过敏性。然后通过腹膜内注射E.coli O111：B4 LPS(2μg，在0.1ml PBS中)诱导内毒素休克。注射LPS后15分钟，再在一个不同的位点注射肽(200μg/只鼠＝8mg/kg)。对鼠进行48小时监测并记录下结果。

肽处理	加入的E.coliO111：B4 LPS	鼠的数目	存活(％)
				没有肽	2μg	10	10
SEQ ID 1	2μg	6	17
				SEQ ID 3	2μg	6	0
SEQ ID 5	2μg	6	17
				SEQ ID 6	2μg	6	17
SEQ ID 12	2μg	6	17
				SEQ ID 13	2μg	6	33
SEQ ID 15	2μg	6	0
				SEQ ID 16	2μg	6	0
SEQ ID 17	2μg	6	17
				SEQ ID 23	2μg	6	0
SEQ ID 24	2μg	6	17
				SEQ ID 26	2μg	6	0
SEQ ID 27	2μg	6	50
				SEQ ID 29	2μg	6	0
SEQ ID 37	2μg	6	0
				SEQ ID 38	2μg	6	0
SEQ ID 41	2μg	6	0
				SEQ ID 44	2μg	6	0
SEQ ID 45	2μg	6	0

[0089]表13：通过SEQ ID 1对BALB/c鼠的致命性内毒素血症进行防御。将400μg E.coli O111：B4 LPS腹膜内注射到BALB/c鼠体内。在一个不同的腹膜位点注射肽(200μg/只鼠＝8mg/kg)。对鼠进行48小时监测并记录下结果。

肽处理	加入的E.coliO111：B4 LPS	鼠的数目	存活(％)
				没有肽	400μg	5	0
SEQ ID 1	400μg	5	100

[0090]表14：肽抑制由金黄葡萄球菌LTA诱导的TNF-α生成。在存在浓度逐渐升高的肽和没有肽的情况下，用1μg/ml金黄葡萄球菌LPS刺激RAW 264.7鼠巨噬细胞。收集上清并用ELISA测定TNF-α的水平。不加以刺激地培养了6小时的RAW 264.7细胞的TNF-α生成的背景水平为0.037-0.192ng/ml。数据表示成三个或更多个实验的平均值+标准偏差的形式。

加入的SEQ ID 1(μg/ml)	对TNF-α的抑制(％)
		0.1	44.5±12.5
1	76.7±6.4
		5	91±1
10	94.5±1.5
		20	96±1

[0091]表15：肽抑制由分支杆菌的无帽脂阿拉伯甘露聚糖诱导的TNF-α生成。在存在20μg/ml肽或多黏菌素B(Polymyxin B)或者没有肽的情况下，用1μg/ml AraLAM刺激RAW 264.7鼠巨噬细胞。收集上清并用ELISA测定TNF-α的水平。不加以刺激地培养了6小时的RAW264.7细胞的TNF-α生成的背景水平为0.037-0.192ng/ml。数据表示成三个或更多个实验的平均值+标准偏差的形式。

肽(20μg/ml)	对TNF-α的抑制(％)
		没有肽	0
SEQ ID 1	64±5.9
		多黏菌素B	15±2

            实施例3

        阳离子肽的毒性评价

[0092]使用两种方法测量肽的潜在毒性。第一种，使用细胞毒性检测试剂盒(Cytotoxicity Detection Kit，Roche)(乳酸脱氢酶-LDH)分析。这是一种对细胞死亡和细胞裂解进行定量的比色分析，它的基础是从损伤细胞的细胞溶质释放到上清的LDH的活性测量。LDH是存在于所有细胞中的稳定的细胞质酶，当质膜受损时，它便释放到细胞培养物的上清中。死亡细胞或质膜受损细胞的数量增加导致培养物上清中的LDH酶活增加，可以采用ELISA平板记录仪测量OD_490nm(在此分析中形成的颜色的量与裂解细胞的数目成正比)。在此分析中，将人支气管上皮细胞(16HBEo14，HBE)与100μg的肽共同温育24小时，移走上清并测定LDH。用来测量阳离子肽的毒性的另一种分析是WST-1分析(Roche)。该分析是对细胞繁殖和细胞成活进行定量的比色分析，它的基础是活细胞中的线粒体脱氢酶能裂解四唑盐WST-1(作为对[³H]-胸苷吸收分析的替代，它没有放射性)。在此分析中，将HBE细胞与100μg的肽共同温育24小时，然后每孔加入10μl细胞繁殖试剂(Cell Proliferation Reagent)WST-1。将细胞与试剂一起温育，然后用ELISA平板记录仪测量OD_490nm。

[0093]下面在表16和17中显示的结果表明大多数肽对受测细胞都是没有毒性的。然而，两种分析的测量结果表明式F的肽中有四个(SEQID NOS：40，41，42和43)确实导致膜损害。

[0094]表16：通过LDH释放分析测量阳离子肽的毒性。将人HBE支气管上皮细胞与100μg/ml肽或多黏菌素B共同温育24小时。测量细胞培养物上清中的LDH活性。作为对照，加入Triton X-100以释放出100％的LDH。数据表示成平均值±标准偏差。只有肽SEQ ID 40、41、42和43显示出一些明显的毒性。

处理	LDH释放(OD490nm)
		无细胞的对照	0.6±0.1
Triton X-100的对照	4.6±0.1
		没有肽的对照	1.0±0.05
SEQ ID 1	1.18±0.05
		SEQ ID 3	1.05±0.04
SEQ ID 6	0.97±0.02
		SEQ ID 7	1.01±0.04
SEQ ID 9	1.6±0.03

SEQ ID 10	1.04±0.04
		SEQ ID 13	0.93±0.06
SEQ ID 14	0.99±0.05
		SEQ ID 16	0.91±0.04
SEQ ID 17	0.94±0.04
		SEQ ID 19	1.08±0.02
SEQ ID 20	1.05±0.03
		SEQ ID 21	1.06±0.04
SEQ ID 22	1.29±0.12
		SEQ ID 23	1.26±0.46
SEQ ID 24	1.05±0.01
		SEQ ID 26	0.93±0.04
SEQ ID 27	0.91±0.04
		SEQ ID 28	0.96±0.06
SEQ ID 29	0.99±0.02
		SEQ ID 31	0.98±0.03
SEQ ID 33	1.03±0.05
		SEQ ID 34	1.02±0.03
SEQ ID 35	0.88±0.03
		SEQ ID 36	0.85±0.04
SEQ ID 37	0.96±0.04
		SEQ ID 38	0.95±0.02
SEQ ID 40	2.8±0.5
		SEQ ID 41	3.3±0.2
SEQ ID 42	3.4±0.2
		SEQ ID 43	4.3±0.2
SEQ ID 44	0.97±0.03
		SEQ ID 45	0.98±0.04
SEQ ID 47	1.05±0.05
		SEQ ID 48	0.95±0.05
SEQ ID 53	1.03±0.06
		多黏菌素B	1.21±0.03

[0095]表17：通过WST-1分析测量阳离子肽的毒性。将HBE细胞与100μg/ml肽或多黏菌素B共同温育24小时，然后测量细胞存活。数据表示成平均值±标准偏差。作为对照，加入Triton X-100以释放出100％的LDH。只有肽SEQ ID 40、41、42和43显示出一些明显的毒性。

处理	OD490nm
		无细胞的对照	0.24±0.01

Triton X-100的对照	0.26±0.01
		没有肽的对照	1.63±0.16
SEQ ID 1	1.62±0.34
		SEQ ID 3	1.35±0.12
SEQ ID 10	1.22±0.05
		SEQ ID 6	1.81±0.05
SEQ ID 7	1.78±0.10
		SEQ ID 9	1.69±0.29
SEQ ID 13	1.23±0.11
		SEQ ID 14	1.25±0.02
SEQ ID 16	1.39±0.26
		SEQ ID 17	1.60±0.46
SEQ ID 19	1.42±0.15
		SEQ ID 20	1.61±0.21
SEQ ID 21	1.28±0.07
		SEQ ID 22	1.33±0.07
SEQ ID 23	1.14±0.24
		SEQ ID 24	1.27±0.16
SEQ ID 26	1.42±0.11
		SEQ ID 27	1.63±0.03
SEQ ID 28	1.69±0.03
		SEQ ID 29	1.75±0.09
SEQ ID 31	1.84±0.06
		SEQ ID 33	1.75±0.21
SEQ ID 34	0.96±0.05
		SEQ ID 35	1.00±0.08
SEQ ID 36	1.58±0.05
		SEQ ID 37	1.67±0.02
SEQ ID 38	1.83±0.03
		SEQ ID 40	0.46±0.06
SEQ ID 41	0.40±0.01
		SEQ ID 42	0.39±0.08
SEQ ID 43	0.46±0.10
		SEQ ID 44	1.49±0.39
SEQ ID 45	1.54±0.35
		SEQ ID 47	1.14±0.23
SEQ ID 48	0.93±0.08
		SEQ ID 53	1.51±0.37
多黏菌素B	1.30±0.13

实施例4

通过阳离子肽进行多聚核苷酸调控

[0096]利用多聚核苷酸阵列来测量阳离子肽本身对巨噬细胞和上皮细胞的转录应答的影响。将鼠巨噬细胞RAW 264.7、人支气管细胞(HBE)或A549人上皮细胞涂到150mm组织培养皿中，密度为每个培养皿5.6×10⁶个细胞，过夜培养，然后与50μg/ml的肽共同温育4小时，或者只与培养基温育而不含有肽。经刺激后，用焦碳酸二乙酯处理过的PBS洗涤细胞一次，再用细胞刷从培养皿上刮下细胞。用Trizol(Gibco LifeTechnologies)分离总RNA。用含有RNA酶抑制剂(Ambion，Austin，TX)的无RNA酶的水重悬RNA沉淀物。在37℃用DNaseI(Clontech，PaloAlto，CA)处理该RNA一小时。加入终止混合物(0.1M EDTA[pH 8.0]，1mg/ml糖原)之后，样品用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)洗一次，再用氯仿洗一次。然后加入2.5体积100％乙醇和1/10体积乙酸钠，pH5.2将RNA沉淀。该RNA重悬于含有RNA酶抑制剂(Ambion)的无RNA酶的水中，并贮存于-70℃。通过1％琼脂糖凝胶电泳估计RNA的质量。用分离出来的RNA作为模板，使用β肌动蛋白特异性引物(5′-GTCCCTGTATGCCTCTGGTC-3′(SEQ ID NO：55)和5′-GATGTCACGCACGATTTCC-3′(SEQ ID NO：56))进行PCR扩增，以判断是否有基因组DNA污染。琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色证实经过35次循环并没有扩增产物出现。

[0097]Atlas cDNA表达阵列(Clontech，Palo Alto，CA)由双份(duplcate)点在正电荷膜上的588个经由选择的鼠cDNA组成，它们在较早的多聚核苷酸阵列研究中被使用(表18，19) 。用5μg总RNA制备得到³²p放射性标记的cDNA探针，将其与阵列于71℃温育过夜。进行泛洗，然后于4℃暴露于磷屏成像系统(phosphoimager screen，MolecularDynamics，Sunnyvale，CA)3天。使用Molecular Dynamics PSI磷屏成像(phosphoimager)获取图像。使用AtlasImage 1.0图象分析软件(Clontech)和Excel(Microsoft，Redmond，WA)分析杂交信号。针对背景水平对每个点的强度进行校正，并针对探针标记间的差异对强度进行标准化处理，方法是利用被发现在刺激条件间几乎没有变化的5个多聚核苷酸的平均值：β肌动蛋白、泛蛋白、核糖体蛋白S29、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和Ca²⁺结合蛋白。当一个给定的cDNA的标准化杂交信号小于20时，则将其值定为20，由此计算比值和相对表达。

[0098]下步使用的多聚核苷酸阵列(表21-26)是Resgen Human cDNA阵列(该基因组的识别号(identification number)是PRHU03-S3)，它由双份的7,458个人cDNA点组成。用15-20μg总RNA制备探针，探针用Cy 3标记的dUTP进行标记。该探针经纯化后杂交到印刷玻璃片上，42℃过夜，然后洗涤。洗涤之后，用Virtek玻片记录仪获取图象。用图象处理软件(Imagene 4.1，Marina Del Rey，CA)确定点的平均强度，中间强度和背景强度。使用Genespring软件(Redwood City，CA)进行标准化处理和分析。将平均背景强度从Imagene测定的平均强度中减去，计算出强度值。从一个玻片内的点的数值集合中获得中间点强度，并将该值与此实验中所有玻片的数值比较，从而使每个点的强度标准化。肽处理的细胞和对照细胞之间的相对变化可以在下面的表格中看到。

[0099]所使用的其它多聚核苷酸阵列(表27-35)是Human Operon阵列(该基因组的识别号(identification number)是PRHU04-S1)，它由双份的14,000个人寡聚体点组成。用10μg总RNA制备探针，探针用Cy 3或Cy 5标记的dUTP进行标记。在这些实验中，将A549上皮细胞涂到100mm组织培养皿中，密度为每个培养皿2.5×10⁶个细胞。用RNAqueous(Ambion)分离总RNA。用除DNA试剂盒(Ambion)除去DNA污染。由总RNA制备的探针经纯化后杂交到印刷玻璃片上，42℃过夜，然后洗涤。洗涤之后，用Perkin Elmer阵列扫描仪获取图象。用图象处理软件(Imagene 5.0，Marina Del Rey，CA)确定点的平均强度，中间强度和背景强度。使用“自制的”程序除去背景。该程序将每个子小格的底部强度计算为10％，并对每个小格减去此值。使用Genespring软件(Redwood City，CA)进行分析。从一个玻片内的点的数值集合中获得中间点强度，并将该值与此实验中所有玻片的数值比较，从而使每个点的强度标准化。肽处理的细胞和对照细胞之间的相对变化可以在下面的表格中看到。

[00100]实施半定量RT-PCR以证实多聚核苷酸阵列的结果。在热循环仪中将1μg RNA样品和1μl寡聚dT(500μg/ml)以及浓度为1mM的1μl混合dNTP储液，于65℃温育5分钟，反应体积为12μl，使用的水为焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水。加入4μ15×第一链缓冲液，2μl0.1M DTT和1μl RNaseOUT重组的核糖核酸酶抑制剂(40units/μl)，于42℃温育2分钟，然后加入1μl(200units)的Superscript II(Invitrogen，Burlington，ON)。对于每个cDNA来源，在没有Superscript II的情况下进行平行实验，以提供阴性对照。利用5’和3’引物(1.0μM)、0.2mMdNTP混合物、1.5mM MgCl₂、1U Taq DNA聚合酶(New England Biolabs，Missiauga，ON)和1×PCR缓冲液扩增cDNA。每个PCR均在热循环仪上进行，包括30-40个循环，每个循环包括94℃变性30秒，52℃或55℃退火30秒，72℃延伸40秒。针对每种引物和每份RNA样品，优化PCR的循环次数，使其位于反应的线性范围内。为了评估抽提步骤和估计RNA的量，在每个实验中对管家(housekeeping)多聚核苷酸β肌动蛋白基因进行了扩增。用电泳观察反应产物，并用光密度分析法(densitometry)进行分析，这样就可参考β肌动蛋白多聚核苷酸的扩增计算出起始的RNA相对浓度。

[00101]表18显示，在小块Atlas微阵列上，所选择的已知多聚核苷酸中，SEQ ID NO：1对RAW 264.7细胞的处理增量调节了其中30多个不同的多聚核苷酸的表达。由肽SEQ ID NO：1增量调节的多聚核苷酸主要来自两类：一类包括受体(生长因子、趋化因子、白介素、干扰素、激素、神经递质)、细胞表面抗原和细胞粘连，另一类包括细胞-细胞通讯(生长因子、细胞因子、趋化因子、白介素、干扰素、激素)、细胞骨架、细胞游动和蛋白质更新。受增量调节的特定多聚核苷酸包括编码下列蛋白的多聚核苷酸：趋化因子MCP-3、抗炎细胞因子IL-10、巨噬细胞集落刺激因子和受体例如IL-1R-2(结合到IL-1R1上的多产性IL-1的公认拮抗物)、PDGF受体B、NOTCH4、LIF受体、LFA-1、TGFβ受体1、G-CSF受体和IFNγ受体。该肽还增量调控编码几种金属蛋白酶及其抑制物的多聚核苷酸，包括骨形态发生蛋白BMP-1、BMP-2、BMP-8a、TIMP 2和TIMP 3。而且，该肽增量调节一些特异性转录因子，包括JunD，以及YY和LIM-1转录因子，和激酶例如Etk1和Csk，表明它具有广泛的影响。多聚核苷酸阵列的研究还发现，SEQID NO：1减量调节了RAW 264.7巨噬细胞中的至少20个多聚核苷酸(表19)。由肽减量调节的多聚核苷酸包括DNA修复蛋白和几种炎症介质例如MIP-1α、制癌蛋白M(oncostatin M)和IL-12。肽对多聚核苷酸表达的许多影响都被RT-PCR证实(表20)。利用中等大小的微阵列(7835个多聚核苷酸)还发现，肽SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：19和SEQ ID NO：1，以及每个式子的代表性肽改变了人上皮细胞系中的转录应答。SEQ ID NO：1对多聚核苷酸表达的影响在两种人上皮细胞系A549和HBE中加以比较。表21描述的是被2种或更多种肽增量调控的与宿主免疫应答相关的多聚核苷酸，与未受刺激的细胞相比，它们的增量比率为2倍多。表22描述的是被2种或更多种肽减量调控的与宿主免疫应答相关的多聚核苷酸，与未受刺激的细胞相比，它们的减量比率为2倍多。表23和表24分别显示了受增量调节和减量调节的人上皮促炎多聚核苷酸。表25和表26显示了受阳离子肽影响的促炎多聚核苷酸。一个明显的趋向是阳离子肽增量调节抗炎症应答，减量调节促炎症应答。要找到一个与抗炎症应答相关却又受减量调节的多聚核苷酸，是非常困难的(表26)。被阳离子肽增量调控的促炎多聚核苷酸主要是与迁移和粘连相关的多聚核苷酸。应该注意到，在受减量调控的促炎多聚核苷酸中，有几种toll样受体(TLR)多聚核苷酸受到所有阳离子肽的影响，TLR多聚核苷酸对于宿主对感染原的应答的信号传导是非常重要的。被所有的肽增量调控的一种重要的抗炎多聚核苷酸是IL-10受体多聚核苷酸。IL-10是涉及调控促炎细胞因子的重要细胞因子。对于肽SEQ ID NO：6，当使用的是原代人巨噬细胞时，也可以观察到对多聚核苷酸表达的这些影响，如表27和28所示。下面的表31-37显示了每个式子的代表性肽对人上皮细胞表达所选多聚核苷酸(受测的14,000个)的影响。为了测试肽改变人上皮多聚核苷酸表达的能力，每个式子至少选用了6种肽，它们确实具有广泛的刺激效果。对每个式子而言，通常至少有50个多聚核苷酸被该组中的每一个肽增量调节。

[00102]表18：RAW巨噬细胞中被肽SEQ ID NO：1处理增量调节的多聚核苷酸^a。发现浓度为50μg/ml的阳离子肽有效地诱导了数种多聚核苷酸的表达。将肽与RAW细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Atlas阵列杂交。未被刺激的细胞的强度显示在第三列。“比值  肽：未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

[00103]管家多聚核苷酸的标准化后的强度的变化范围为0.8-1.2倍，因此这些多聚核苷酸可以有效地用于标准化过程。当一个给定的cDNA的标准杂交强度低于20时，将其值定为20，由此计算比值和相对表达。该分析实验用不同的RNA制备物重复三次，平均的倍数变化如下所示。显示了相对表达水平发生两倍或更大变化的多聚核苷酸。

多聚核苷酸/蛋白	多聚核苷酸功能	未被刺激的强度	比值肽：未刺激	序列登记号
					Etk 1	酪氨酸蛋白激酶受体	20	43	M68513
PDGFRB	生长因子受体	24	25	X04367
						促肾上腺皮质素释放因子受体	20	23	X72305
NOTCH4	原癌多聚核苷酸	48	18	M80456
					IL-1R2	白介素受体	20	16	X59769
MCP-3	趋化因子	56	14	S71251
					BMP-1	骨形态发生蛋白	20	14	L24755
内皮素b受体	受体	20	14	U32329
					c-ret	癌多聚核苷酸前体	20	13	X67812
LIFR	细胞因子受体	20	12	D26177
					BMP-8a	骨形态发生蛋白	20	12	M97017
Zfp92	锌指蛋白92	87	11	U47104
					MCSF	巨噬细胞集落刺激因子1	85	11	X05010
GCSFR	粒细胞集落刺激因子受体	20	11	M58288
					IL-8RB	趋化因子受体	112	10	D17630
IL-9R	白介素受体	112	6	M84746
					Cas	Crk相关性底物	31	6	U48853
p58/GTA	激酶	254	5	M58633
					CASP2	天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)前体	129	5	D28492

IL-1β前体	白介素前体	91	5	M15131
					SPI2-2	丝氨酸蛋白酶抑制物	62	5	M64086
C5AR	趋化因子受体	300	4	S46665
					L-myc	癌多聚核苷酸	208	4	X13945
IL-10	白介素	168	4	M37897
					p19ink4	cdk4和cdk6抑制物	147	4	U19597
ATOH2	无调性基因同源物2	113	4	U29086
					DNAsel	DNA酶	87	4	U00478
CXCR-4	趋化因子受体	36	4	D87747
					细胞周期蛋白D3	细胞周期蛋白	327	3	U43844
IL-7Rα	白介素受体	317	3	M29697
					POLA	DNA聚合酶α	241	3	D17384
Tie-2	癌多聚核苷酸	193	3	S67051
					DNL1	DNA连接酶I	140	3	U04674
BAD	细胞调亡蛋白	122	3	L37296
					GADD45	可诱导DNA损伤的蛋白	88	3	L28177
Sik	Scr相关性激酶	82	3	U16805
					整连蛋白4	整连蛋白	2324	2	X53176
TGFβR1	生长因子受体	1038	2	D25540
					LAMR1	受体	1001	2	J02870
Crk	Crk衔接蛋白	853	2	S72408
					ZFX	染色体蛋白	679	2	M32309
细胞周期蛋白E1	细胞周期蛋白	671	2	X75888
					POLD1	DNA聚合酶亚基	649	2	Z21848
Vav	原癌多聚核苷酸	613	2	X64361
					YY(NF-E1)	转录因子	593	2	L13968
JunD	转录因子	534	2	J050205
					Csk	c-src激酶	489	2	U05247
Cdk7	细胞周期蛋白依赖性激酶	475	2	U11822
					MLC1A	肌球蛋白轻亚基同等型	453	2	M19436

ERBB-3	受体	435	2	L47240
					UBF	转录因子	405	2	X60831
TRAIL	细胞调亡配体	364	2	U37522
					LFA-1	细胞粘连受体	340	2	X14951
SLAP	Src样衔接蛋白	315	2	U29056
					IFNGR	干扰素γ受体	308	2	M28233
LIM-1	转录因子	295	2	Z27410
					ATF-2	转录因子	287	2	S76657
FST	滤泡素抑制素前体	275	2	Z29532
					TIMP3	蛋白酶抑制物	259	2	L19622
RU49	转录因子	253	2	U41671
					IGF-1Rα	胰岛素样生长因子受体	218	2	U00182
细胞周期蛋白G2	细胞周期蛋白	214	2	U95826
					fyn	酪氨酸蛋白激酶	191	2	U70324
BMP-2	骨形态发生蛋白	186	2	L25602
					Brn-3.2 POU	转录因子	174	2	S68377
KIF1A	驱动蛋白家族蛋白	169	2	D29951
					MRC1	甘露糖受体	167	2	Z11974
PAI2	蛋白酶抑制物	154	2	X19622
					BKLF	CACCC序列框结合蛋白	138	2	U36340
TIMP2	蛋白酶抑制物	136	2	X62622
					Mas	原癌基因	131	2	X67735
NURR-1	转录因子	129	2	S53744

[00104]表19：RAW巨噬细胞中被SEQ ID NO：1处理减量调节的多聚核苷酸^a。发现浓度为50μg/ml的阳离子肽减少了数种多聚核苷酸的表达。将肽与RAW细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Atlas阵列杂交。未被刺激的细胞的强度显示在第三列。“比值肽：未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。该分析实验用不同的细胞重复三次，平均的倍数变化如下所示。显示了相对表达水平发生大约两倍或更大变化的多聚核苷酸。

多聚核苷酸/蛋白	多聚核苷酸功能	未被刺激的强度	比值肽：未刺激	序列登记号
					钠通道	电压门控离子通道	257	0.08	L36179
XRCC1	DNA修复蛋白	227	0.09	U02887
					est-2	癌多聚核苷酸	189	0.11	J04103
XPAC	DNA修复蛋白	485	0.12	X74351
					EPOR	受体前体	160	0.13	J04843
PEA 3	Ets相关性蛋白	158	0.13	X63190
					孤儿受体	细胞核受体	224	0.2	U11688
N-钙依粘连蛋白	细胞粘连受体	238	0.23	M31131
					OCT3	转录因子	583	0.24	M34381
PLCβ	磷脂酶	194	0.26	U43144
					KRT18	中间纤丝蛋白	318	0.28	M11686
THAM	酶	342	0.32	X58384
					CD40L	CD40配体	66	0.32	X65453
CD86	T淋巴细胞抗原	195	0.36	L25606
					制癌蛋白M	细胞因子	1127	0.39	D31942
PMS2 DNA	DNA修复蛋白	200	0.4	U28724
					IGFBP6	生长因子	1291	0.41	X81584
MIP-1β	细胞因子	327	0.42	M23503
					ATBF1	AT基序结合因子	83	0.43	D26046
Nucleobindin(核结合蛋白)	高尔基体驻留蛋白	367	0.43	M96823
					bcl-x	细胞凋亡蛋白	142	0.43	L35049
尿调理素(uromodulin)	糖蛋白	363	0.47	L33406
					IL-12 p40	白介素	601	0.48	M86671
MmRad52	DNA修复蛋白	371	0.54	Z32767
					Tob1	抗增生因子	956	0.5	D78382
Ung1	DNA修复蛋白	535	0.51	X99018
					KRT19	中间纤丝蛋白	622	0.52	M28698
PLCγ	磷脂酶	251	0.52	X95346
					整连蛋白α6	细胞粘连受体	287	0.54	X69902
GLUT1	葡萄糖转运蛋白	524	0.56	M23384

CTLA4	免疫球蛋白超家族	468	0.57	X05719
					FRA2	Fos相关性抗原	446	0.57	X83971
MTRP	溶酶体缔合性蛋白	498	0.58	U34259

[00105]表20：在对肽SEQ ID NO：1的应答中多聚核苷酸表达的变化能够通过RT-PCR证实。将RAW 264.7巨噬细胞与50μg/ml的肽共同温育4小时，或者单独与培养基温育4小时。分离总RNA，进行半定量RT-PCR。每种多聚核苷酸的特异性引物对被用于扩增RNA。β肌动蛋白的扩增被用作阳性对照并被用于进行标准化。对RT-PCR产物进行密度测量分析。结果表示为被肽处理的细胞与单独同培养基温育的细胞相比，其多聚核苷酸表达中的相对倍数变化。数据表示为三次实验的平均值±标准偏差。

多聚核苷酸	阵列比值-*	RT-PCR-*
			CXCR-4	4.0±1.7	4.1±0.9
IL-8RB	9.5±7.6	7.1±1.4
			MCP-3	13.5±4.4	4.8±0.88
IL-10	4.2±2.1	16.6±6.1
			CD14	0.9±0.1	0.8±0.3
MIP-1B	0.42±0.09	0.11±0.04
			XRCC1	0.12±0.01	0.25±0.093
MCP-1	没有阵列	3.5±1.4

[00106]表21：A549上皮细胞中被肽处理增量调节的多聚核苷酸^a。发现浓度为50μg/ml的阳离子肽增加数种多聚核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与人cDNA阵列ID#PRHU03-S3杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第二列。“比值肽：未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

多聚核苷酸/蛋白	未被刺激强度	比值  肽：未刺激				登记号
							ID 2	ID 3	ID 19	ID 1
		IL-1 R拮抗剂同源物1	0.00	3086	1856						870		AI167887

IL-10Rβ	0.53	2.5	1.6	1.9	3.1	AA486393
							IL-11Rα	0.55	2.4	1.0	4.9	1.8	AA454657
IL-17R	0.54	2.1	2.0	1.5	1.9	AW029299
							TNF R超家族，成员1B	0.28	18	3.0	15	3.6	AA150416
TNF R超家族，成员5(CD40LR)	33.71	3.0	0.02			H98636
							TNF R超家族，成员11b	1.00	5.3	4.50	0.8		AA194983
IL-8	0.55	3.6	17	1.8	1.1	AA102526
							白介素增强子结合因子2	0.75	1.3	2.3	0.8	4.6	AA894687
白介素增强子结合因子1	0.41	2.7		5.3	2.5	R56553
							可由细胞因子诱导的含SH2的蛋白	0.03	33	44	39	46	AA427521
IK细胞因子，HLA II的减量调节物	0.50	3.1	2.0	1.7	3.3	R39227
							可由细胞因子诱导的含SH2的蛋白	0.03	33	44	39	46	AA427521
小分子诱导性细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员21	1.00	3.9			2.4	AI922341
							TGFB诱导的早期生长应答2	0.90	2.4	2.1	0.9	1.1	AI473938
NK细胞R	1.02	2.5	0.7	0.3	1.0	AA463248
							CCR6	0.14	4.5	7.8	6.9	7.8	N57964
细胞粘连分子	0.25	4.0	3.9	3.9	5.1	R40400
							黑素瘤粘连分子	0.05	7.9	20	43	29.1	AA497002
CD31	0.59	2.7	3.1	1.0	1.7	R22412
							整连蛋白，α2(CD49B，VLA-2受体的α2亚基)	1.00	0.9	2.4	3.6	0.9	AA463257
整连蛋白，α3(CD49C，VLA-3	0.94	0.8	2.5	1.9	1.1	AA424695

受体的α3亚基)
							整连蛋白，αE	0.01	180	120	28	81	AA425451
整连蛋白，β1	0.47	2.1	2.1	7.0	2.6	W67174
							整连蛋白，β3	0.55	2.7	2.8	1.8	1.0	AA037229
整连蛋白，β3	0.57	2.6	1.4	1.8	2.0	AA666269
							整连蛋白，β4	0.65	0.8	2.2	4.9	1.5	AA485668
整连蛋白β4结合蛋白	0.20	1.7	5.0	6.6	5.3	AI017019
							钙和整连蛋白结合蛋白	0.21	2.8	4.7	9.7	6.7	AA487575
解整连蛋白和金属蛋白酶结构域8	0.46	3.1		2.2	3.8	AA279188
							解整连蛋白和金属蛋白酶结构域9	0.94	1.1	2.3	3.6	0.5	H59231
解整连蛋白和金属蛋白酶结构域10	0.49	1.5	2.1	3.3	2.2	AA043347
							解整连蛋白和金属蛋白酶结构域23	0.44	1.9	2.3	2.5	4.6	H11006
钙依粘连蛋白1，1型，E-钙依粘连蛋白(上皮)	0.42	8.1	2.2	2.4	7.3	H97778
							钙依粘连蛋白12，2型(N-钙依粘连蛋白2)	0.11	13	26	9.5		AI740827
原钙依粘连蛋白12	0.09	14.8	11.5	2.6	12.4	AI652584
							原钙依粘连蛋白γ亚家族C，3	0.34	3.0	2.5	4.5	9.9	R89615
连环蛋白(钙依粘连蛋白相关的蛋白)，δ1	0.86	1.2	2.2	2.4		AA025276
							层粘连蛋白R1(67kD，核糖体蛋白SA)	0.50	0.4	2.0	4.4	3.0	AA629897

杀伤细胞凝集素样受体亚家族C，成员2	0.11	9.7	9.0	4.1	13.4	AA190627
							杀伤细胞凝集素样受体亚家族C，成员3	1.00	3.2	1.0	0.9	1.3	W93370
杀伤细胞凝集素样受体亚家族G，成员1	0.95	2.3	1.7	0.7	1.1	AI433079
							C型凝集素样受体2	0.45	2.1	8.0	2.2	5.3	H70491
CSF 3 R	0.40	1.9	2.5	3.5	4.0	AA458507
							巨噬细胞刺激1R	1.00	1.7	2.3	0.4	0.7	AA173454
BMP R型IA	0.72	1.9	2.8	0.3	1.4	W15390
							甲酰肽受体1	1.00	3.1	1.4	0.4		AA425767
CD2	1.00	2.6	0.9	1.2	0.9	AA927710
							CD36	0.18	8.2	5.5	6.2	2.5	N39161
维生素D R	0.78	2.5	1.3	1.1	1.4	AA485226
							人蛋白酶激活R-2	0.54	6.1	1.9	2.2		AA454652
前列腺素E受体3(EP3亚型)	0.25	4.1	4.9	3.8	4.9	AA406362
							PDGF Rβ多肽	1.03	2.5	1.0	0.5	0.8	R56211
VIP R2	1.00	3.1			2.0	AI057229
							生长因子受体粘合蛋白2	0.51	2.2	2.0	2.4	0.3	AA449831
鼠乳腺肿瘤病毒受体同源物	1.00	6.9		16		W93891
							腺苷A2a R	0.41	3.1	1.8	4.0	2.5	N57553
腺苷A3 R	0.83	2.0	2.3	1.0	1.2	AA863086
							T细胞Rδ基因座	0.77	2.7	1.3		1.8	AA670107
前列腺素E受体1(EP1亚型)	0.65	7.2		6.0	1.5	AA972293
							生长因子受体粘合蛋白14	0.34		3.0	6.3	2.9	R24266
爱泼斯坦-巴尔病毒诱导的多聚	0.61	1.6	2.4		8.3	AA037376

核苷酸2
							补体组分受体2	0.22	26	4.5	2.6	18.1	AA521362
内毒素受体A型	0.07	12	14	14	16	AA450009
							v-SNARE R	0.56	11	12	1.8		AA704511
酪氨酸激酶，非受体，1	0.12	7.8	8.5	10	8.7	AI936324
							受体酪氨酸激酶样孤儿受体2	0.40	7.3	5.0	1.6	2.5	N94921
蛋白酪氨酸磷酸酶，非受体型3	1.02	1.0	13.2	0.5	0.8	AA682684
							蛋白酪氨酸磷酸酶，非受体型9	0.28	2.5	4.0	0.9	5.3	AA434420
蛋白酪氨酸磷酸酶，非受体型11	0.42	2.9	2.4	2.2	3.0	AA995560
							蛋白酪氨酸磷酸酶，非受体型12	1.00	2.3	2.2	0.8	0.5	AA446259
蛋白酪氨酸磷酸酶，非受体型13	0.58	1.7	2.4	3.6	1.7	AA679180
							蛋白酪氨酸磷酸酶，非受体型18	0.52	3.2	0.9	1.9	6.5	AI668897
蛋白酪氨酸磷酸酶，受体型，A	0.25	4.0	2.4	16.8	12.8	H82419
							蛋白酪氨酸磷酸酶，受体型，J	0.60	3.6	3.2	1.6	1.0	AA045326
蛋白酪氨酸磷酸酶，受体型，T	0.73	1.2	2.8	3.0	1.4	R52794
							蛋白酪氨酸磷酸酶，受体型，U	0.20	6.1	1.2	5.6	5.0	AA644448
蛋白酪氨酸磷酸酶，受体型，C相关蛋白	1.00	5.1			2.4	AA481547
							磷脂酶A2受体1	0.45	2.8	2.2	1.9	2.2	AA086038
被MAP激酶激活的蛋白激酶3	0.52	2.1	2.7	1.1	1.9	W68281
							MAP激酶激酶6	0.10	18	9.6		32	H07920
MAP激酶激酶5	1.00	3.0	5.2	0.8	0.2	W69649
							MAP激酶7	0.09		11.5	12	33	H39192

MAP激酶12	0.49	2.1	1.7	2.2	2.0	AI936909
							G蛋白偶联受体4	0.40	3.7	3.0	2.4	2.5	AI719098
G蛋白偶联受体49	0.05		19	19	27	AA460530
							G蛋白偶联受体55	0.08	19	15	12		N58443
G蛋白偶联受体75	0.26	5.2	3.1	7.1	3.9	H84878
							G蛋白偶联受体85	0.20	6.8	5.4	4.9	5.0	N62306
G蛋白信号传导作用的调节蛋白20	0.02	48	137	82		AI264190
							G蛋白信号传导作用的调节蛋白6	0.27		3.7	8.9	10.6	R39932
与BCL2作用的杀伤蛋白(诱导细胞凋亡)	1.00	1.9		5.2		AA291323
							细胞凋亡抑制物5	0.56	2.8	1.6	2.4	1.8	AI972925
caspase 6，细胞凋亡相关性半胱氨酸蛋白酶	0.79	0.7	2.6	1.3	2.8	W45688
							细胞凋亡相关性蛋白PNAS-1	0.46	2.2	1.4	2.3	2.9	AA521316
caspase 8，细胞凋亡相关性半胱氨酸蛋白酶	0.95	2.2	1.0	0.6	2.0	AA448468

[00107]表22：A549上皮细胞中被肽处理减量调节的多聚核苷酸a。发现浓度为50μg/ml的阳离子肽减少数种多聚核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与人cDNA阵列ID#PRHU03-S3杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第二列。“比值肽：未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

多聚核苷酸/蛋白	未被刺激强度	比值  肽:未刺激				登记号
							ID 3	ID 3	ID 19	ID 1
		TLR 1	3.22	0.35	0.31						0.14	0.19	AI339155
TLR 2	2.09					0.52	0.31	0.48	0.24	T57791
		TLR 5	8.01	0.12	0.39								N41021
TLR 7	5.03					0.13	0.11	0.20	0.40	N30597
		TNF受体相关因子2	0.82	1.22	0.45						2.50	2.64	T55353
TNF受体相关因子3	3.15					0.15		0.72	0.32	AA504259
		TNF受体超家族，成员12	4.17	0.59	0.24							0.02	W71984
TNF R超家族，成员17	2.62						0.38	0.55	0.34	AA987627
		TRAF和TNF受体相关蛋白	1.33	0.75	0.22						0.67	0.80	AA488650
IL-1受体，I型	1.39					0.34	0.72	1.19	0.34	AA464526
		IL-2受体，α	2.46	0.41	0.33						0.58		AA903183
IL-2受体，γ(严重联合免疫缺陷)	3.34					0.30	0.24		0.48	N54821
		IL-1 2受体，β2	4.58	0.67	0.22								AA977194
IL-18受体1	1.78					0.50	0.42	0.92	0.56	AA482489
		TGFβ受体III	2.42	0.91	0.24						0.41	0.41	H62473
白三烯b4受体(趋化因子受体样-1)	1.00						1.38	4.13	0.88	AI982606
		小分子诱导性细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员18	2.26	0.32							0.44	1.26	AA495985
小分子诱导性细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员20	2.22					0.19	0.38	0.45	0.90	AI285199
		小分子诱导性细胞因子亚家族A	2.64	0.38	0.31						1.53		AA916836

(Cys-Cys)，成员23
							小分子诱导性细胞因子亚家族B(Cys-X-Cys)，成员6(粒细胞趋化性蛋白2)	3.57	0.11	0.06	0.28	0.38	AI889554
小分子诱导性细胞因子亚家族B(Cys-X-Cys)，成员10	2.02	0.50	1.07	0.29	0.40	AA878880
							小分子诱导性细胞因子A3(与鼠Mip-1a同源)	2.84	1.79	0.32	0.35		AA677522
细胞因子诱导性激酶	2.70	0.41	0.37	0.37	0.34	AA489234
							补体成分Clq受体	1.94	0.46	0.58	0.51	0.13	AI761788
钙依粘连蛋白11，2型，OB-钙依粘连蛋白(成骨细胞)	2.00	0.23	0.57	0.30	0.50	AA136983
							钙依粘连蛋白3，1型，P-钙依粘连蛋白(胎盘)	2.11	0.43	0.53	0.10	0.47	AA425217
钙依粘连蛋白，EGF LAGseven-pass G型受体2，flamingo(果蝇)同源物	1.67	0.42	0.41	1.21	0.60	H39187
							钙依粘连蛋白13，H-钙依粘连蛋白(心脏)	1.78	0.37	0.40	0.56	0.68	R41787
选凝素L(淋巴细胞粘连分子1)	4.43	0.03	0.23	0.61		H00662
							血管细胞黏附分子1	1.40	0.20	0.72	0.77	0.40	H16591
分子间黏附分子	1.00	0.12	0.31	2.04	1.57	AA479188

3
							整连蛋白，α1	2.42	0.41	0.26		0.56	AA450324
整连蛋白，α7	2.53	0.57	0.39	0.22	0.31	AA055979
							整连蛋白，α9	1.16	0.86	0.05	0.01	2.55	AA865557
整连蛋白，α10	1.00	0.33	0.18	1.33	2.55	AA460959
							整连蛋白，β5	1.00	0.32	1.52	1.90	0.06	AA434397
整连蛋白，β8	3.27	0.10	1.14	0.31	0.24	W56754
							解整连蛋白和金属蛋白酶结构域18	2.50	0.40	0.29	0.57	0.17	AI205675
解整连蛋白样和金属蛋白酶具有血小板结合蛋白1基序，3	2.11	0.32	0.63	0.47	0.35	AA398492
							解整连蛋白样和金属蛋白酶具有血小板结合蛋白1基序，5	1.62	0.39	0.42	1.02	0.62	AI375048
T细胞受体作用分子	1.00	0.41	1.24	1.41	0.45	AI453185
							白喉毒素受体(肝素结合表皮生长因子样生长因子)	1.62	0.49	0.85	0.62	0.15	R45640
血管活性肠肽受体1	2.31	0.43	0.31	0.23	0.54	H73241
							IgG的Fc片段，低亲和力IIIb，受体为(CD16)	3.85	-0.20	0.26	0.76	0.02	H20822
IgG的Fc片段，低亲和力IIb，受体为(CD32)	1.63	0.27	0.06	1.21	0.62	R68106
							IgE的Fc片段，高亲和力I，受体为；α多肽	1.78	0.43	0.00	0.56	0.84	AI676097
白细胞免疫球蛋白样受体，亚家族A	2.25	0.44	0.05	0.38	0.99	N63398

白细胞免疫球蛋白样受体，亚家族B(具有TM和ITIM结构域)，成员3	14.21			1.10	0.07	AI815229
							白细胞免疫球蛋白样受体，亚家族B(具有TM和ITIM结构域)，成员4	2.31	0.75	0.43	0.19	0.40	AA076350
白细胞免疫球蛋白样受体，亚家族B	1.67	0.35	0.60	0.18	0.90	H54023
							过氧化物酶体增殖蛋白激活性受体，α	1.18	0.38	0.85	0.87	0.26	AI739498
蛋白酪氨酸磷酸酶，受体型，f多肽(PTPRF)，相互作用蛋白(liprin)，α1	2.19	0.43		1.06	0.46	N49751
							蛋白酪氨酸磷酸酶，受体型，C	1.55	0.44	0.64	0.30	0.81	H74265
蛋白酪氨酸磷酸酶，受体型，E	2.08	0.23	0.37	0.56	0.48	AA464542
							蛋白酪氨酸磷酸酶，受体型，N多肽2	2.27	0.02	0.44		0.64	AA464590
蛋白酪氨酸磷酸酶，受体型，H	2.34	0.11	0.43	0.24	0.89	AI924306
							蛋白酪氨酸磷酸酶，受体型，Z多肽1	1.59	0.63	0.34	0.72	0.35	AA476461
蛋白酪氨酸磷酸酶，非受体型21	1.07	0.94	0.43	0.25	1.13	H03504
							MAP激酶8相互作用蛋白2	1.70	0.07	0.85	0.47	0.59	AA418293
MAP激酶激酶激	1.27	0.37	0.79	1.59	-5.28	AA402447

酶4
							MAP激酶激酶激酶14	1.00	0.34	0.66	2.10	1.49	W61116
MAP激酶8相互作用蛋白2	2.90	0.16	0.35	0.24	0.55	AI202738
							MAP激酶激酶激酶12	1.48	0.20	0.91	0.58	0.68	AA053674
MAP激酶激酶激酶激酶3	2.21	0.45	0.20	1.03	0.41	AA043537
							MAP激酶激酶激酶6	2.62	0.37	0.38		0.70	AW084649
MAP激酶激酶激酶激酶4	1.04	0.96	0.09	0.29	2.79	AA417711
							MAP激酶激酶激酶11	1.53	0.65	0.41	0.99	0.44	R80779
MAP激酶激酶激酶10	1.32	1.23	0.27	0.50	0.76	H01340
							MAP激酶9	2.54	0.57	0.39	0.16	0.38	AA157286
MAP激酶激酶激酶1	1.23	0.61	0.42	0.81	1.07	AI538525
							MAP激酶激酶激酶8	0.66	1.52	1.82	9.50	0.59	W56266
被MAP激酶激活的蛋白激酶3	0.52	2.13	2.68	1.13	1.93	W68281
							MAP激酶激酶2	0.84	1.20	3.35	0.02	1.31	AA425826
MAP激酶激酶激酶7	1.00	0.97		1.62	7.46	AA460969
							MAP激酶7	0.09		11.45	11.80	33.43	H39192
MAP激酶激酶6	0.10	17.83	9.61		32.30	H07920
							G蛋白信号传导作用的调节蛋白5	3.7397	0.27	0.06	0.68	0.18	AA668470
G蛋白信号传导作用的调节蛋白13	1.8564	0.54	0.45	0.07	1.09	H70047
							G蛋白偶联性受体	1.04	1.84	0.16	0.09	0.96	R91916
G蛋白偶联性受	1.78	0.32	0.56	0.39	0.77	AI953187

体17
							G蛋白偶联性受体激酶7	2.62		0.34	0.91	0.38	AA488413
孤儿七次跨膜受体，与趋化因子关联	7.16	1.06	0.10	0.11	0.14	AI131555
							细胞凋亡拮抗性转录因子	1.00	0.28	2.50	1.28	0.19	AI439571
caspase 1，细胞凋亡相关性半胱氨酸蛋白酶(白介素1，β，转换酶)	2.83	0.44		0.33	0.35	T95052
							程序性细胞死亡8(诱导细胞凋亡的因子)	1.00	1.07	0.35	1.94	0.08	AA496348

[00108]表23：A549细胞中被肽处理增量调节的促炎多聚核苷酸。发现浓度为50μg/ml的阳离子肽增加某些促炎多聚核苷酸的表达(数据是表21的一部分)。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与人cDNA阵列ID#PRHU03-S3杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第二列。“比值肽：未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

多聚核苷酸/蛋白和功能	未被刺激强度	比值  肽:未刺激				登记号
							ID 2	ID 3	ID 19	ID 1
		IL-11Rα；促炎细胞因子的受体，炎症	0.55	2.39	0.98						4.85	1.82	AA454657
IL-17R；IL-17受体，上皮细胞中产生细胞因子的诱导物	0.54					2.05	1.97	1.52	1.86	AW029299
		小分子诱导性细胞因子亚家族A，成员21；一种趋化因子	1.00	3.88								2.41	AI922341

CD31；白细胞和细胞与细胞的黏附(PECAM)	0.59	2.71	3.13	1.01	1.68	R22412
							CCR6；细胞因子MIP-3α的受体	0.14	4.51	7.75	6.92	7.79	N57964
整连蛋白，α2(CD49B，VLA-2受体的α2亚基)；与白细胞的黏附	1.00	0.89	2.44	3.62	0.88	AA463257
							整连蛋白，α3(CD49C，VLA-3受体的α3亚基)；与白细胞的黏附	0.94	0.79	2.51	1.88	1.07	AA424695
整连蛋白，αE；黏附	0.01	179.33	120.12	28.48	81.37	AA425451
							整连蛋白，β4；白细胞黏附	0.65	0.79	2.17	4.94	1.55	AA485668
C型凝集素样受体2；白细胞黏附	0.45	2.09	7.92	2.24	5.29	H70491

[00109]表24：A549细胞中被肽处理减量调节的促炎多聚核苷酸。发现浓度为50μg/ml的阳离子肽减少某些促炎多聚核苷酸的表达(数据是表22的一部分)。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与人cDNA阵列ID#PRHU03-S3杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第二列。“比值  肽:未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

多聚核苷酸/蛋白；功能	未被刺激强度	比值  肽:未刺激				登记号
							ID 2	ID 3	ID 19	ID 1
		Toll样受体(TLR)1；对革	3.22	0.35	0.31						0.14	0.19	AI339155

兰氏阳性细菌进行应答
							TLR 2；对革兰氏阳性细菌和酵母进行应答	2.09	0.52	0.31	0.48	0.24	T57791
TLR 5；可以增强其他TLR应答，对鞭毛蛋白的应答性	8.01	0.12	0.39			N41021
							TLR 7；推导的宿主防御机制	5.03	0.13	0.11	0.20	0.40	N30597
TNF受体相关因子2；炎症	0.82	1.22	0.45	2.50	2.64	T55353
							TNF受体相关因子3；炎症	3.15	0.15		0.72	0.32	AA504259
TNF受体超家族，成员12；炎症	4.17	0.59	0.24		0.02	W71984
							TNF受体超家族，成员17；炎症	2.62		0.38	0.55	0.34	AA987627
TRAF和TNF受体相关蛋白；TNF信号传导	1.33	0.75	0.22	0.67	0.80	AA488650
							小分子诱导性细胞因子亚家族A，成员18；趋化因子	2.26	0.32		0.44	1.26	AA495985
小分子诱导性细胞因子亚家族A，成员20；趋化因子	2.22	0.19	0.38	0.45	0.90	AI285199
							小分子诱导性细胞因子亚家族A，成员23；趋化因子	2.64	0.38	0.31	1.53		AA916836
小分子诱导性细胞因子亚家	3.57	0.11	0.06	0.28	0.38	AI889554

族B，成员6；(粒细胞趋化性蛋白)；趋化因子
							小分子诱导性细胞因子亚家族B，成员10；趋化因子	2.02	0.50	1.07	0.29	0.40	AA878880
小分子诱导性细胞因子A3(与鼠Mip-1a同源)；趋化因子	2.84	1.79	0.32	0.35		AA677522
							IL-12受体，β2；白介素和干扰素受体	4.58	0.67	0.22			AA977194
IL-18受体1；诱导INF-γ	1.78	0.50	0.42	0.92	0.56	AA482489
							选凝素L(白细胞黏附分子1)；白细胞黏附	4.43	0.03	0.23	0.61		H00662
血管细胞黏附分子1；白细胞黏附	1.40	0.20	0.72	0.77	0.40	H16591
							细胞间黏附分子3；白细胞黏附	1.00	0.12	0.31	2.04	1.57	AA479188
整连蛋白，α1；白细胞黏附	2.42	0.41	0.26		0.56	AA450324

[00110]表25：A549细胞中被肽处理增量调节的抗炎多聚核苷酸。发现浓度为50μg/ml的阳离子肽增加某些抗炎多聚核苷酸的表达(数据是表21的一部分)。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与人cDNA阵列ID#PRHU03-S3杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第二列。“比值  肽:未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

多聚核苷酸/蛋白；功能	未被刺激强度	比值  肽：未刺激				登记号
							ID 2	ID 3	ID 19	ID 1
		IL-1R拮抗剂同源物1；脓毒症休克的抑制物	0.00	3085.96	1855.90						869.57		AI167887
IL-10Rβ；细胞因子合成抑制物的受体	0.53					2.51	1.56	1.88	3.10	AA486393
		TNF R，成员1B；细胞凋亡	0.28	17.09	3.01						14.93	3.60	AA150416
TNF R，成员5；细胞凋亡(CD40L)	33.71					2.98	0.02			H98636
		TNF R，成员11b；细胞凋亡	1.00	5.29	4.50						0.78		AA194983
IK细胞因子，HLA II的减量调节物；抑制抗原呈递	0.50					3.11	2.01	1.74	3.29	R39227
		可由TGFB诱导的早期生长应答蛋白2；抗炎细胞因子	0.90	2.38	2.08						0.87	1.11	AI473938
CD2；黏附分子，结合LFAp3	1.00					2.62	0.87	1.15	0.88	AA927710

[00111]表26：A549细胞中被肽处理减量调节的抗炎多聚核苷酸。发现浓度为50μg/ml的阳离子肽减少某些抗炎多聚核苷酸的表达(数据是表21的一部分)。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与人cDNA阵列ID#PRHU03-S3杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第二列。“比值  肽:未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

多聚核苷酸/蛋白；功能	未被刺激强度	比值  肽:未刺激				登记号
							ID 2	ID 3	ID 19	ID 1
		MAP激酶9	2.54	0.57	0.39						0.16	0.38	AA157286

[00112]表27：原代人巨噬细胞中被SEQ ID NO：6增量调节的多聚核苷酸。发现浓度为50μg/ml的肽SEQ ID NO：6增加了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人巨噬细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第二列。“比值  肽处理:对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

基因(登记号)	对照：未被刺激的细胞	比值  肽处理：对照
			蛋白聚糖2(Z26248)	0.69	9.3
未知(AK001843)	26.3	8.2
			磷酸化酶激酶α1(X73874)	0.65	7.1
辅肌动蛋白，α3(M86407)	0.93	6.9
			DKFZP586B2420蛋白(AL050143)	0.84	5.9
未知(AL109678)	0.55	5.6
			转录因子21(AF047419)	0.55	5.4
未知(A433612)	0.62	5.0
			染色体缩聚1-样(AF060219)	0.69	4.8
未知(AL137715)	0.66	4.4
			细胞凋亡抑制物4(U75285)	0.55	4.2
与TERF1(TRF1)作用的细胞核因子2(NM_012461)	0.73	4.2
			LINE反转录转座元件1(M22333)	6.21	4.0
1-酰基甘油-3-磷酸酯O-酰基转移酶1(U56417)	0.89	4.0
			空泡质子性ATP酶，亚基D；V-ATP酶，亚基D(X71490)	1.74	4.0

KIAA0592蛋白(AB011164)	0.70	4.0
			电压门控钾通道KQT样亚家族成员4(AF105202)	0.59	3.9
CDC14同源物A(AF000367)	0.87	3.8
			组蛋白折叠蛋白CHRAC17(AF070640)	0.63	3.8
隐花色素1(D83702)	0.69	3.8
			胰腺酶原粒膜缔合性蛋白(AB035541)	0.71	3.7
Sp3转录因子(X68560)	0.67	3.6
			假想蛋白FLJ20495(AK000502)	0.67	3.5
E2F转录因子5，p130结合(U31556)	0.56	3.5
			假想蛋白FLJ20070(AK000077)	1.35	3.4
糖蛋白IX(X52997)	0.68	3.4
			KIAA1013蛋白(AB023230)	0.80	3.4
真核细胞翻译起始因子4A，同工型2(AL137681)	2.02	3.4
			FYN结合蛋白(AF198052)	1.04	3.3
鸟苷酸结合蛋白，γ转导活性多肽1(U41492)	0.80	3.3
			磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(X54232)	0.74	3.2
黏膜血管地址素细胞黏附分子1(U43628)	0.65	3.2
			淋巴细胞抗原(M38056)	0.70	3.2
H1组蛋白家族，成员4(M60748)	0.81	3.0
			翻译抑制蛋白p14.5(X95384)	0.78	3.0
假想蛋白FLJ20689(AB032978)	1.03	2.9
			KIAA1278蛋白(AB03104)	0.80	2.9
未知(AL031864)	0.95	2.9
			胰凝乳蛋白酶样蛋白酶(X71877)	3.39	2.9
网腔钙结合蛋白(NM_001219)	2.08	2.9
			蛋白激酶，cAMP依赖性，调节性，I型，β(M65066)	7.16	2.9
POU结构域，第4类，转录因子2(U06233)	0.79	2.8
			POU结构域，第2类，相关因子1(Z49194)	1.09	2.8
KIAA0532蛋白(AB011104)	0.84	2.8
			未知(AF068289)	1.01	2.8
未知(AL117643)	0.86	2.7
			组织蛋白酶E(M84424)	15.33	2.7
间质金属蛋白酶23A(AF056200)	0.73	2.7

干扰素受体2(L42243)	0.70	2.5
			MAP激酶激酶1(L11284)	0.61	2.4
蛋白激酶C，α(X52479)	0.76	2.4
			c-Cb1作用蛋白(AF230904)	0.95	2.4
c-fos诱导性生长因子(Y12864)	0.67	2.3
			细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物1B(S76988)	0.89	2.2
锌指蛋白266(X78924)	1.67	2.2
			MAP激酶14(L35263)	1.21	2.2
KIAA0922蛋白(AB023139)	0.96	2.1
			骨形态发生蛋白1(NM_006129)	1.10	2.1
NADH脱氢酶1α亚复合体，10(AF087661)	1.47	2.1
			骨形态发生蛋白受体，1B型(U89326)	0.50	2.1
干扰素调节性因子2(NM002199)	1.46	2.0
			蛋白酶，丝氨酸，21(AB031331)	0.89	2.0

[00113]表28：原代人巨噬细胞中被SEQ ID NO：6减量调节的多聚核苷酸。发现浓度为50μg/ml的肽SEQ ID NO：6降低了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人巨噬细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第二列。“比值  肽处理：对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

基因(登记号)	对照：未被刺激的细胞	比值  肽处理：对照
			未知(AL049263)	17	0.06
整连蛋白关联性激酶(U40282)	2.0	0.13
			KIAA0842蛋白(AB020649)	1.1	0.13
未知(AB037838)	13	0.14
			颗粒体蛋白(AF055008)	8.6	0.14
谷胱甘肽过氧化酶3(NM_002084)	1.2	0.15
			KIAA0152基因产物(D63486)	0.9	0.17
TGFB1诱导性抗细胞凋亡因子1(D86790)	0.9	0.19
			解整连蛋白蛋白酶(Y13323)	1.5	0.21

蛋白酶体亚基β型7(D38048)	0.7	0.22
			Sp1转录激活亚基3所需的辅助因子(AB033042)	0.9	0.23
TNF受体超家族，成员14(U81232)	0.8	0.26
			蛋白酶体26S亚基非ATP酶8(D38047)	1.1	0.28
蛋白酶体亚基β型，4(D26600)	0.7	0.29
			TNF受体超家族成员1B(M32315)	1.7	0.29
细胞色素c氧化酶亚基Vic(X13238)	3.3	0.30
			S100钙结合蛋白A4(M80563)	3.8	0.31
蛋白酶体亚基α型，6(X59417)	2.9	0.31
			蛋白酶体26S亚基非ATP酶，10(AL031177)	1.0	0.32
MAP激酶激酶激酶2(NM_006609)	0.8	0.32
			核糖体蛋白L11(X79234)	5.5	0.32
间质金属蛋白酶14(Z48481)	1.0	0.32
			蛋白酶体亚基β型，5(D29011)	1.5	0.33
被MAP激酶激活的蛋白激酶2(U12779)	1.5	0.34
			caspase 3(U13737)	0.5	0.35
jun D原癌基因(X56681)	3.0	0.35
			蛋白酶体26S亚基，ATP酶，3(M34079)	1.3	0.35
IL-1受体样1(AB012701)	0.7	0.35
			干扰素α诱导性蛋白(AB019565)	13	0.35
SDF受体1(NM_012428)	1.6	0.35
			组织蛋白酶D(M63138)	46	0.36
MAP激酶激酶3(D87116)	7.4	0.37
			TGF，β诱导性(M77349)	1.8	0.37
TNF受体超家族，成员10b(AF016266)	1.1	0.37
			蛋白酶体亚基β型，6(M34079)	1.3	0.38
细胞核受体结合蛋白(NM_013392)	5.2	0.38
			未知(AL050370)	1.3	0.38
蛋白酶抑制物1α-1-抗胰蛋白酶(X01683)	0.7	0.40
			蛋白酶体亚基α型，7(AF054185)	5.6	0.40
LPS诱导性TNF-α因子(NM_004862)	5.3	0.41
			运铁蛋白受体(X01060)	14	0.42
蛋白酶体26S亚基非ATP酶13(AB009398)	1.8	0.44
			MAP激酶激酶5(U25265)	1.3	0.44

组织蛋白L(X12451)	15	0.44
			IL-1受体相关激酶1(L76191)	1.7	0.45
MAP激酶激酶激酶激酶2(U07349)	1.1	0.46
			过氧化物酶体增殖蛋白激活性受体δ(AL022721)	2.2	0.46
TNF超家族，成员15(AF039390)	16	0.46
			细胞死亡防御物1(D15057)	3.9	0.46
TNF超家族成员10(U37518)	287	0.46
			组织蛋白H(X16832)	14	0.47
蛋白酶抑制物12(Z81326)	0.6	0.48
			蛋白酶体亚基α型，4(D00763)	2.6	0.49
蛋白酶体26S亚基ATP酶，1(L02426)	1.8	0.49
			蛋白酶体26S亚基ATP酶，2(D11094)	2.1	0.49
caspase 7(U67319)	2.4	0.49
			间质金属蛋白酶7(Z11887)	2.5	0.49

[00114]表29：HBE细胞中被SEQ ID NO：1增量调节的多聚核苷酸。发现浓度为50μg/ml的肽SEQ ID NO：1增加了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人HBE上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第三列。“比值  肽处理：对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

登记号	基因	对照：未被刺激的细胞	比值肽处理：对照
				AL110161	未知	0.22	5218.3
AF131842	未知	0.01	573.1
				AJ000730	溶质载体家族	0.01	282.0
Z25884	氯离子通道1	0.01	256.2
				M93426	蛋白酪氨酸磷酸酶受体-型，ζ	0.01	248.7
X65857	嗅觉受体，家族1，亚家族D，成员2	0.01	228.7
				M55654	TATA序列框结合蛋白	0.21	81.9
AK001411	假想蛋白	0.19	56.1
				D29643	多萜二磷寡聚糖-蛋白糖基	1.56	55.4

	转移酶
				AF006822	髓磷脂转录因子2	0.07	55.3
AL117601	未知	0.05	53.8
				AL117629	DKFZP434C245蛋白	0.38	45.8
M59465	肿瘤坏死因子，α诱导性蛋白3	0.50	45.1
				AB013456	水通道蛋白8	0.06	41.3
AJ131244	SEC24相关性基因家族，成员A	0.56	25.1
				AL110179	未知	0.87	24.8
AB037844	未知	1.47	20.6
				Z47727	聚合酶II多肽K	0.11	20.5
AL035694	未知	0.81	20.4
				X68994	人类CREB基因	0.13	19.3
AJ238379	假想蛋白	1.39	18.5
				NM_003519	H2B组蛋白家族成员	0.13	18.3
U16126	谷氨酸受体，亲离子kainate2	0.13	17.9
				U29926	腺苷单磷酸脱氨酶	0.16	16.3
AK001160	假想蛋白	0.39	14.4
				U18018	ets变种基因4	0.21	12.9
D80006	KIAA0184蛋白	0.21	12.6
				AK000768	假想蛋白	0.30	12.3
X99894	胰岛素启动子因子1	0.26	12.0
				AL031177	未知	1.09	11.2
AF052091	未知	0.28	10.9
				L38928	5，10-甲叉亚甲基四氢叶酸合成酶	0.22	10.6
AL117421	未知	0.89	10.1
				AL133606	假想蛋白	0.89	9.8
NM_016227	膜蛋白CH1	0.28	9.6
				NM_006594	连接蛋白相关性蛋白复合物4	0.39	9.3
U54996	ZW10同源物，蛋白	0.59	9.3
				AJ007557	钾通道	0.28	9.0
AF043938	肌肉RAS癌基因	1.24	8.8
				AK001607	未知	2.74	8.7
AL031320	过氧化物酶体生物发生因	0.31	8.4

	子30
				D38024	未知	0.31	8.3
AF059575	LIM同源框TF	2.08	8.2
				AF043724	肝炎A病毒细胞受体1	0.39	8.1
AK002062	假想蛋白	2.03	8.0
				L13436	钠尿多肽受体	0.53	7.8
U33749	甲状腺转录因子1	0.36	7.6
				AF011792	细胞周期进程2蛋白	0.31	7.6
AK000193	假想蛋白	1.18	6.8
				AF039022	输出蛋白(expotin)，tRNA	0.35	6.8
M17017	白介素8	0.50	6.7
				AF044958	NADH脱氢酶	0.97	6.5
U35246	囊泡分选蛋白	0.48	6.5
				AK001326	四次跨膜蛋白(tetraspan)3	1.59	6.5
M55422	克鲁佩尔相关性锌指蛋白	0.34	6.4
				U44772	棕榈酰-蛋白硫酯酶	1.17	6.3
AL117485	假想蛋白	0.67	5.9
				AB037776	未知	0.75	5.7
AF131827	未知	0.69	5.6
				AL137560	未知	0.48	5.2
X05908	膜联蛋白A1	0.81	5.1
				X68264	黑素瘤黏附分子	0.64	5.0
AL161995	neurturin	0.86	4.9
				AF037372	细胞色素c氧化酶	0.48	4.8
NM_016187	桥接整合蛋白2	0.65	4.8
				AL137758	未知	0.57	4.8
U59863	TRAF家族成员相关NFKB激活物	0.46	4.7
				Z30643	氯离子通道Ka	0.70	4.7
D16294	乙酰辅酶A酰基转移酶2	1.07	4.6
				AJ132592	锌指蛋白281	0.55	4.6
X82324	POU结构域TF	1.73	4.5
				NM_016047	CGI-110蛋白	1.95	4.5
AK001371	假想蛋白	0.49	4.5
				M60746	H3组蛋白家族成员D	3.05	4.5
AB033071	假想蛋白	4.47	4.4
				AB002305	KIAA0307基因产物	1.37	4.4
X92689	UDP-N-乙酰基-α-D-半乳	0.99	4.4

	糖胺：多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶
				AL049543	谷胱甘肽过氧化酶5	1.62	4.3
U43148	PTCH(patched homolog)	0.96	4.3
				M67439	多巴胺受体D5	2.61	4.2
U09850	锌指蛋白143	0.56	4.2
				L20316	胰高血糖素受体	0.75	4.2
AB037767	解整连蛋白样和金属蛋白酶	0.69	4.2
				NM_017433	肌球蛋白IIIA	99.20	4.2
D26579	解整连蛋白和金属蛋白酶结构域8	0.59	4.1
				L10333	reticulon 1	1.81	4.1
AK000761	未知	1.87	4.1
				U91540	NK同源盒家族3，A	0.80	4.1
Z17227	白介素10受体，β	0.75	4.0

[00115]表30：HBE细胞中被肽SEQ ID NO：1(50μg/ml)减量调节的多聚核苷酸。发现浓度为50μg/ml的肽SEQ ID NO：1降低了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人HBE上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第三列。“比值肽处理：对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

登记号	基因	对照：未被刺激的细胞	比值肽处理：对照
				AC004908	未知	32.4	0.09
S70622	G1期特异性基因	43.1	0.10
				Z97056	DEAD/H框多肽	12.8	0.11
AK002056	假想蛋白	11.4	0.12
				L33930	CD24抗原	28.7	0.13
X77584	硫氧还蛋白	11.7	0.13
				NM_014106	PRO1914蛋白	25.0	0.14
M37583	H2A组蛋白家族成员	22.2	0.14
				U89387	聚合酶(RNA)II多肽D	10.2	0.14
D25274	ras相关性C3肉毒杆菌毒素	10.3	0.15

	底物1
				J04173	磷酸甘油酯变位酶1	11.4	0.15
U19765	锌指蛋白9	8.9	0.16
				X67951	增殖相关基因A	14.1	0.16
AL096719	肌动蛋白抑制蛋白2	20.0	0.16
				AF165217	原肌球调节蛋白4	14.6	0.16
NM_014341	线粒体载体蛋白同源物1	11.1	0.16
				AL022068	未知	73.6	0.17
X69150	核糖体蛋白S18	42.8	0.17
				AL031577	未知	35.0	0.17
AL031281	未知	8.9	0.17
				AF090094	人鸟氨酸脱羧酶抗酶的mRNA	10.3	0.17
AL022723	`HLA-G组织相容性抗原，I类，G	20.6	0.18
				U09813	ATP合成酶，H+转运性线粒体F0复合物	9.8	0.18
AF000560	人类TTF-1相互作用性多肽20	20.2	0.19
				NM_016094	HSPC042蛋白	67.2	0.19
AF047183	NADH脱氢酶	7.5	0.19
				D14662	抗氧化剂蛋白2(非硒谷胱甘肽过氧化酶，酸性钙依赖性磷脂酶)	8.1	0.19
X16662	膜联蛋白A8	8.5	0.19
				U14588	桩蛋白	11.3	0.19
AL117654	DKFZP586D0624蛋白	12.6	0.20
				AK001962	假想蛋白	7.7	0.20
L41559	6-丙酮酰四氢蝶呤合酶/肝细胞核因子1α的二聚作用辅助因子	9.1	0.20
				NM_016139	16.7Kd蛋白	21.0	0.21
NM_016080	CGI-150蛋白	10.7	0.21
				U86782	26S蛋白酶体相关pad1同源物	6.7	0.21
AJ400717	肿瘤蛋白，翻译控制蛋白1	9.8	0.21
				X07495	同源框C4	31.0	0.21
AL034410	未知	7.3	0.22

X14787	血小板结合蛋白1	26.2	0.22
				AF081192	富含嘌呤元件结合蛋白B	6.8	0.22
D49489	蛋白二硫键异构酶相关性蛋白	11.0	0.22
				NM_014051	PTD011蛋白	9.3	0.22
AK001536	未知	98.0	0.22
				X62534	2组高速泳动蛋白	9.5	0.22
AJ005259	内皮分化相关性因子1	6.7	0.22
				NM_000120	环氧化物水解酶1，微粒体的	10.0	0.22
M38591	S100钙结合蛋白A10	23.9	0.23
				AF071596	即时早期相应蛋白2	11.5	0.23
X16396	甲叉四氢叶酸脱氢酶	8.3	0.23
				AK000934	ATP酶抑制物前体	7.6	0.23
AL117612	未知	10.7	0.23
				AF119043	转录中间因子1γ	7.3	0.23
AF037066	溶质载体家族22成员1-样反义	7.6	0.23
				AF134406	细胞色素c氧化酶亚基	13.3	0.23
AE000661	未知	9.2	0.24
				AL157424	synaptojanin 2	7.2	0.24
X56468	酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白	7.2	0.24
				U39318	泛蛋白缀合酶E2D3	10.7	0.24
AL034348	未知	24.4	0.24
				D26600	蛋白酶体亚基β型4	11.4	0.24
AB032987	未知	16.7	0.24
				J04182	溶酶体缔合性膜蛋白1	7.4	0.24
X78925	锌指蛋白267	16.1	0.25
				NM_000805	胃泌素	38.1	0.25
U29700	抗缪氏激素受体，II型	12.0	0.25
				Z98200	未知	13.4	0.25
U07857	信号识别颗粒	10.3	0.25
				L05096	人类核糖体蛋白L39	25.3	0.25
AK001443	假想蛋白	7.5	0.25
				K03515	磷酸葡萄糖异构酶	6.2	0.25
X57352	干扰素诱导性跨膜蛋白3	7.5	0.26
				J02883	胰腺辅脂肪酶	5.7	0.26

M24069	冷休克结构域蛋白	6.3	0.26
				AJ269537	软骨素-4-磺基转移酶	60.5	0.26
AL137555	未知	8.5	0.26
				U89505	RNA结合基序蛋白	5.5	0.26
U82938	CD27结合蛋白	7.5	0.26
				X99584	SMT3同源物1	12.8	0.26
AK000847	未知	35.8	0.27
				NM_014463	Lsm3蛋白	7.8	0.27
AL133645	未知	50.8	0.27
				X78924	锌指蛋白266	13.6	0.27
NM_004304	恶性淋巴瘤激酶	15.0	0.27
				X57958	核糖体蛋白L7	27.9	0.27
U63542	未知	12.3	0.27
				AK000086	假想蛋白	8.3	0.27
X57138	H2A组氨酸家族成员N	32.0	0.27
				AB023206	KIAA0989蛋白	6.5	0.27
AB021641	促性腺素诱导性转录遏制物1	5.5	0.28
				AF050639	NADH脱氢酶	5.5	0.28
M62505	补体成分5受体1	7.5	0.28
				X64364	basigin	5.8	0.28
AJ224082	未知	22.5	0.28
				AF042165	细胞色素c氧化酶	20.4	0.28
AK001472	anillin	10.9	0.28
				X86428	蛋白磷酸酶2A亚基	12.7	0.28
AF227132	候补味觉受体T2R5	5.1	0.28
				Z98751	未知	5.3	0.28
D21260	网格蛋白重多肽	8.3	0.28
				AF041474	肌动蛋白样6	15.1	0.28
NM_005258	GTP环水解酶I蛋白	7.6	0.28
				L20859	溶质载体家族20	9.6	0.29
Z80783	H2B组蛋白家族成员	9.0	0.29
				AB011105	层黏连蛋白α5	7.1	0.29
AL008726	β-半乳糖苷酶的保护蛋白	5.2	0.29
				D29012	蛋白酶体亚基	12.6	0.29
X63629	钙依粘连蛋白3P-钙依粘连蛋白	6.8	0.29
				X02419	纤溶酶原激活物尿激酶	12.9	0.29

X13238	细胞色素c氧化酶	8.0	0.29
				X59798	细胞周期蛋白D1	12.7	0.30
D78151	蛋白酶体26S亚基	7.6	0.31
				AF054185	蛋白酶体亚基	18.8	0.31
J03890	肺相关的表面活性蛋白C	5.5	0.32
				M34079	蛋白酶体26S亚基	5.2	0.33

[00116]表31：A549细胞中被式A的肽诱导的多聚核苷酸表达的增量调节。发现浓度为50μg/m1的肽增加了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多聚核苷酸的强度显示在第三列和第四列，它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的cDNA。“ID#：对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

登记号	基因	对照-Cy3	对照-Cy5	ID5：对照	ID6：对照	ID7：对照	ID8：对照	ID9：对照	ID10：对照
										U12472	谷胱甘肽S-转移酶	0.09	0.31	13.0	3.5	4.5	7.0	4.3	16.4
X66403	胆碱能受体	0.17	0.19	7.8	9.9	6.0	6.4	5.0	15.7
										AK001932	未知	0.11	0.25	19.4	4.6	9.9	7.6	8.1	14.5
X58079	S100钙结合蛋白	0.14	0.24	12.2	7.6	8.1	4.3	4.5	13.2
										U18244	溶质载体家族1	0.19	0.20	6.1	9.7	11.9	5.0	3.7	10.6
U20648	锌指蛋白	0.16	0.13	5.3	6.2	5.6	3.1	6.8	9.5
										AB037832	未知	0.10	0.29	9.0	4.2	9.4	3.1	2.6	8.7
AC002542	未知	0.15	0.07	10.5	15.7	7.8	10.1	11.7	8.2
										M89796	跨膜4-结构域，亚家族A	0.15	0.14	2.6	6.1	7.6	3.5	13.3	8.1
AF042163	细胞色素c氧化酶	0.09	0.19	3.9	3.2	7.6	6.3	4.9	7.9
										AL032821	Vanin 2	0.41	0.23	2.5	5.2	3.2	2.1	4.0	7.9
U25341	褪黑素受体1B	0.04	0.24	33.1	5.1	23.3	6.6	4.1	7.6
										U52219	G蛋白偶联性受体	0.28	0.20	2.1	6.2	6.9	2.4	3.9	7.1
X04506	载脂蛋白B	0.29	0.32	7.9	3.4	3.3	4.8	2.6	7.0
										AB011138	IV型ATP酶	0.12	0.07	3.5	12.9	6.6	6.4	21.3	6.9
AF055018	未知	0.28	0.22	3.8	6.9	5.0	2.3	3.1	6.8
										AK002037	假想蛋白	0.08	0.08	2.9	7.9	14.1	7.9	20.1	6.5
AK001024	鸟苷酸结合蛋白	0.16	0.11	7.7	11.9	5.0	10.3	6.0	6.3
										AF240467	TLR-7	0.11	0.10	20.4	9.0	3.4	9.4	12.9	6.1
AF105367	胰高血糖素样多肽2受体	0.15	0.35	23.2	2.6	3.0	10.6	2.9	5.7
										AL009183	TNFR超家族，成员9	0.46	0.19	10.6	4.7	3.7	2.8	6.5	5.7

X54380	孕区带蛋白	0.23	0.08	4.7	11.9	7.2	12.7	3.8	5.5
										AL137736	未知	0.22	0.15	2.1	7.2	3.3	7.1	4.6	5.5
X05615	甲状腺球蛋白	0.28	0.42	6.3	2.7	7.7	2.4	3.1	5.4
										D28114	髓磷脂相关性蛋白	0.24	0.08	2.5	15.9	13.0	7.1	13.7	5.4
AK000358	微纤维缔合蛋白3	0.28	0.28	8.7	4.2	7.2	3.2	2.4	5.3
										AK001351	未知	0.12	0.22	3.9	7.6	8.7	3.9	2.3	5.2
U79289	未知	0.14	0.27	2.5	2.7	2.8	2.0	4.3	5.1
										AB014546	锌指蛋白	0.12	0.34	6.8	2.4	4.1	2.7	2.0	5.0
AL117428	DKFZP434A236蛋白	0.10	0.07	2.8	16.1	12.8	9.7	14.2	4.9
										AL050378	未知	0.41	0.14	3.5	8.7	11.7	3.5	7.0	4.9
AJ250562	跨膜4超家族成员2	0.13	0.10	5.2	5.7	14.2	3.8	10.3	4.8
										NM_001756	皮质类固醇激素结合性球蛋白	0.28	0.13	4.0	7.9	6.5	14.9	5.6	4.8
AL137471	假想蛋白	0.29	0.05	3.7	18.0	6.2	7.2	16.3	4.7
										M19684	蛋白酶抑制物1	0.41	0.14	3.5	4.6	5.4	2.8	9.4	4.7
NM_001963	表皮生长因子	0.57	0.05	3.4	6.2	1.8	32.9	14.7	4.4
										NM_000910	神经肽Y受体	0.62	0.36	3.1	2.7	2.3	2.6	3.1	4.4
AF022212	Rho GTP酶激活蛋白6	0.19	0.02	9.0	45.7	25.6	12.4	72.2	4.4
										AK001674	Sp1所需的辅助因子	0.11	0.13	8.4	6.5	7.9	4.5	7.4	4.3
U51920	信号识别颗粒	0.23	0.27	3.4	3.8	2.1	4.1	8.8	4.2
										AK000576	假想蛋白	0.27	0.06	4.4	14.7	7.4	14.1	8.6	4.2
AL080073	未知	0.17	0.20	21.6	3.9	4.3	8.8	2.6	4.1
										U59628	成对盒基因9	0.34	0.06	3.4	14.1	5.4	7.9	4.9	4.1

U90658	嗜乳汁蛋白，亚家族3，成员A3	0.41	0.31	2.3	4.7	5.5	6.8	3.4	4.1
										M19673	胱蛋白酶抑制剂SA	0.43	0.26	2.3	8.5	4.5	2.5	4.1	3.8
AL161972	ICAM 2	0.44	0.37	2.0	3.6	2.0	2.7	5.5	3.8
										X54938	肌醇1，4，5-三磷酸3-激酶A	0.32	0.22	3.9	3.3	6.2	3.1	4.4	3.7
AB014575	KIAA0675基因产物	0.04	0.13	46.2	4.5	10.2	8.0	6.2	3.4
										M83664	MHC II，DP β1	0.57	0.29	2.9	2.1	2.0	3.1	6.6	3.4
AK000043	假想蛋白	0.34	0.14	2.7	7.1	3.7	9.4	8.8	3.3
										U60666	睾丸特异性富含亮氨酸重复单位的蛋白	0.21	0.11	9.9	9.0	4.1	5.5	13.0	3.3
AK000337	假想蛋白	0.49	0.19	4.3	5.1	4.7	10.6	7.1	3.3
										AF050198	推断为线粒体空间蛋白	0.34	0.15	7.0	6.3	3.6	5.6	11.9	3.3
AJ251029	气味结合蛋白2A	0.28	0.12	4.4	9.4	7.2	8.8	7.1	3.2
										X74142	分叉头型框G1B	0.12	0.33	19.5	4.5	8.4	6.4	4.4	3.2
AB029033	KIAA1110蛋白	0.35	0.24	3.1	2.2	5.6	5.2	3.1	3.1
										D85606	缩胆囊肽A受体	0.51	0.14	4.3	3.9	4.6	3.5	7.2	3.1
X84195	酰基磷酸酶2肌肉型	0.32	0.19	4.8	3.7	5.0	11.2	9.8	3.0
										U57971	ATP酶钙离子转运细胞质膜3	0.29	0.13	2.2	7.9	1.8	6.3	4.8	3.0
J02611	载脂蛋白D	0.28	0.10	2.8	11.0	3.7	10.3	8.4	3.0
										AF071510	卵磷脂视黄醇酰基转移酶	0.07	0.05	7.9	3.8	11.7	46.0	16.3	3.0
AF131757	未知	0.10	0.08	4.8	9.0	44.3	9.3	10.7	3.0
										L10717	IL2诱导性T细胞激酶	0.45	0.21	2.5	4.9	2.8	10.9	4.5	2.9
L32961	4-氨基丁酸酯氨基转移酶	0.64	0.32	3.6	2.9	3.2	5.3	2.3	2.9
										NM_003631	多(ADP-核糖)糖水解酶	0.46	0.41	9.7	3.9	4.1	3.8	2.8	2.7

AF098484	pronaspin A	0.28	0.14	3.7	3.7	5.6	11.6	3.7	2.5
										NM_009589	酰基硫酸酯酶D	0.73	0.16	3.2	5.6	6.0	48.6	7.2	2.4
M14764	TNFR超家族，成员16	0.49	0.15	2.3	3.5	10.6	13.6	6.8	2.2
										AL035250	内毒素3	0.52	0.14	2.1	7.3	4.8	4.5	3.7	2.2
M97925	防御素，α5，帕内特细胞特异性	0.33	0.07	4.0	14.7	7.8	9.4	3.5	2.1
										D43945	转录因子EC	0.46	0.19	6.6	2.9	8.2	4.0	3.5	2.1
D16583	组氨酸脱羧酶	0.46	0.09	3.2	13.8	4.2	8.8	13.7	2.1

[00117]表32：A549细胞中被式B的肽诱导的多聚核苷酸表达的增量调节。发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与HumanOperon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多聚核苷酸的强度显示在第三列和第四列，它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的cDNA。“ID#：对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

登记号	基因	对照-Cy3	对照-Cy5	ID12：对照	ID13：对照	ID14：对照	ID15：对照	ID16：对照	ID17：对照
										AL157466	未知	0.05	0.06	18.0	21.4	16.7	5.2	6.8	8.6
AB023215	KIAA0998蛋白	0.19	0.07	14.8	10.6	7.9	14.4	6.6	16.1
										AL031121	未知	0.24	0.08	14.1	5.7	3.8	5.5	2.8	4.6
NM_016331	锌指蛋白	0.16	0.08	12.8	7.2	11.0	5.3	11.2	9.7
										M14565	细胞色素P450	0.16	0.12	10.6	12.5	5.0	3.6	10.1	6.3
U22492	G蛋白偶联性受体	0.28	0.07	10.4	8.9	4.8	10.8	6.6	3.6

U76010	溶质载体家族30	0.14	0.07	9.7	18.6	3.7	4.8	5.6	8.9
										AK000685	未知	0.51	0.10	9.0	3.1	2.8	3.9	15.3	3.0
AF013620	免疫球蛋白重链可变区4-4	0.19	0.18	8.5	2.6	6.2	5.7	8.2	3.8
										AL049296	未知	0.61	0.89	8.1	3.2	2.7	3.2	2.7	2.0
AB006622	KIAA0284蛋白	0.47	0.28	7.5	5.0	2.8	11.1	5.5	4.6
										X04391	CD5抗原	0.22	0.13	7.2	16.7	2.7	7.7	6.1	5.9
AK000067	假想蛋白	0.80	0.35	7.1	4.6	2.1	3.2	8.5	2.2
										AF053712	TNF超家族成员11	0.17	0.08	6.9	17.7	3.0	6.2	12.3	5.2
X58079	S100钙结合蛋白A1	0.14	0.24	6.7	6.7	5.9	6.5	5.3	2.5
										M91036	血红蛋白_γA	0.48	0.36	6.7	14.2	2.1	2.9	2.7	4.8
AF055018	未知	0.28	0.22	6.3	10.7	2.7	2.6	4.6	6.5
										L17325	前T/NK细胞相关蛋白	0.19	0.29	6.1	4.4	6.5	4.7	4.0	4.0
D45399	磷酸二酯酶	0.21	0.18	6.1	4.6	5.0	2.8	10.8	4.0
										AB023188	KIAA0971蛋白	0.29	0.13	5.9	10.6	3.6	3.4	10.6	7.2
NM_012177	F-框蛋白	0.26	0.31	5.9	5.5	3.8	2.8	3.0	6.8
										D38550	E2F TF3	0.43	0.39	5.8	3.4	2.1	4.5	2.5	2.4
AL050219	未知	0.26	0.04	5.7	17.0	3.1	9.2	30.3	16.1
										AL137540	未知	0.67	0.79	5.5	3.2	3.9	10.9	2.9	2.3
D50926	KIAA0136蛋白	0.57	0.21	5.4	5.6	2.0	3.3	4.4	3.2
										AL137658	未知	0.31	0.07	5.4	12.1	2.6	10.8	3.9	8.6
U21931	果糖二磷酸酶1	0.48	0.14	5.4	4.1	2.9	3.6	6.0	3.2
										AK001230	DKFZP586D211蛋白	0.43	0.26	5.0	4.6	2.1	2.2	2.5	2.7

AL137728	未知	0.67	0.47	5.0	5.9	2.2	6.8	5.9	2.1
										AB022847	未知	0.39	0.24	4.5	2.2	3.5	4.3	3.8	3.7
X75311	甲羟戊酸激酶	0.67	0.22	4.3	4.0	2.0	8.3	4.0	5.1
										AK000946	DKFZP566C243蛋白	0.36	0.29	4.1	3.8	3.9	5.4	25.8	2.7
AB023197	KIAA0980蛋白	0.25	0.30	4.0	8.3	2.1	8.8	2.2	4.9
										AB014615	成纤维细胞生长因子8	0.19	0.07	3.9	3.3	7.0	3.4	2.2	7.7
X04014	未知	0.29	0.16	3.8	2.5	2.2	3.0	5.5	3.1
										U76368	溶质载体家族7	0.46	0.17	3.8	3.8	2.8	3.2	4.2	3.0
AB032436	未知	0.14	0.21	3.8	2.7	6.1	3.2	4.5	2.6
										AB020683	KIAA0876蛋白	0.37	0.21	3.7	4.2	2.2	5.3	2.9	9.4
NM_012126	糖类磺基转移酶5	0.31	0.20	3.7	5.2	3.2	3.4	3.9	2.5
										AK002037	假想蛋白	0.08	0.08	3.7	17.1	4.6	12.3	11.0	8.7
X78712	甘油激酶假基因2	0.17	0.19	3.6	2.5	4.5	5.3	2.2	3.3
										NM_014178	HSPC156蛋白	0.23	0.12	3.5	8.4	2.9	6.9	14.4	5.5
AC004079	同源框A2	0.31	0.11	3.5	7.0	2.1	2.0	7.3	.9.1
										AL080182	未知	0.51	0.21	3.4	3.5	2.2	2.1	2.9	2.4
M91036	血红蛋白γG	0.22	0.02	3.4	26.3	5.8	6.8	30.4	21.6
										AJ000512	血清/糖皮质激素调节性激酶	0.27	0.43	3.3	2.1	4.9	2.3	3.9	2.7
AK002140	假想蛋白	0.28	0.14	3.3	9.9	2.8	2.1	16.6	7.2
										AL137284	未知	0.22	0.04	3.3	7.2	4.1	6.0	12.2	3.7
Z11898	POU结构域_类型5TF1	0.12	0.29	3.2	3.7	8.2	2.5	6.6	2.2
										AB017016	脑特异性蛋白	0.27	0.29	3.1	2.8	2.5	2.8	3.3	5.5

X54673	溶质载体家族6	0.34	0.08	2.9	12.0	2.2	10.4	7.4	5.9
										AL033377	未知	0.40	0.22	2.6	2.6	2.6	2.3	4.5	2.2
X85740	CCR4	0.34	0.05	2.6	2.3	2.6	2.5	12.5	5.2
										AB010419	核心结合蛋白	0.59	0.20	2.5	12.8	2.0	2.8	2.9	5.9
AL109726	未知	0.14	0.15	2.3	9.0	4.3	4.4	2.6	3.7
										NM_012450	硫酸盐转运蛋白1	0.15	0.10	2.2	3.1	8.2	9.9	4.7	5.9
J04599	双糖链蛋白聚糖	0.39	0.30	2.1	3.3	6.6	2.2	2.7	5.4
										AK000266	假想蛋白	0.49	0.35	2.1	3.5	3.5	6.6	4.3	4.0

[00118]表33：A549细胞中被式C的肽诱导的多聚核苷酸表达的增量调节。发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与HumanOperon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多聚核苷酸的强度显示在第三列和第四列，它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的cDNA。“ID#：对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

登记号	基因	对照-Cy3	对照-Cy5	ID19：对照	ID20：对照	ID21：对照	ID22：对照	ID23：对照	ID24：对照
										NM_014139	电压门控钠通道	0.04	0.05	31.6	25.2	18.0	9.7	22.2	11.2
X84003	TATA框结合蛋白	0.47	0.07	31.8	12.7	2.5	2.8	18.0	14.2
										AF144412	晶状体上皮细胞蛋白	0.25	0.07	23.9	8.0	6.8	3.4	16.2	3.5
AL080107	未知	0.11	0.06	17.8	34.4	12.4	6.2	5.4	7.9
										AF052116	未知	0.34	0.07	15.5	3.9	9.2	3.0	6.9	2.7

AB033063	未知	0.46	0.13	15.2	10.3	4.0	2.6	7.2	11.2
										AK000258	假想蛋白	0.27	0.07	13.9	8.0	3.5	3.4	26.5	11.5
NM_006963	锌指蛋白	0.10	0.08	12.8	6.8	6.2	5.9	17.2	1241.2
										NM_014099	PRO1768蛋白	0.30	0.06	12.3	17.4	5.4	5.4	19.5	3.4
AK000996	假想蛋白	0.17	0.07	10.0	8.0	9.7	7.4	20.7	16.3
										M81933	细胞分裂周期蛋白25A	0.13	0.21	8.8	7.8	19.6	15.6	4.8	3.8
AF181286	未知	0.05	0.22	8.8	2.7	12.0	35.6	5.9	2.3
										AJ272208	IL-1R辅助蛋白样2	0.22	0.17	8.8	2.9	5.0	3.2	9.8	7.3
AF030555	脂肪酸辅酶A连接酶	0.10	0.39	8.7	2.2	11.3	9.9	3.0	2.1
										AL050125	未知	0.23	0.07	8.6	14.3	5.2	2.8	18.7	8.3
AB011096	KIAA0524蛋白	0.21	0.08	8.5	24.4	4.7	6.8	10.4	7.5
										J03068	N-酰氨基酰基-肽水解酶	0.54	0.21	8.3	2.4	2.2	4.1	3.0	6.0
M33906	II类MHC，DQα1	0.14	0.08	7.6	4.5	15.2	6.1	7.5	7.9
										AJ272265	分泌磷蛋白	0.21	0.09	7.6	9.0	3.3	4.9	18.8	14.5
J00210	干扰素α13	0.41	0.07	7.2	15.0	2.8	3.1	11.0	4.3
										AK001952	假想蛋白	0.42	0.21	6.9	4.9	2.5	3.1	7.6	4.5
X54131	蛋白酪氨酸磷酸酶，受体型	0.09	0.20	6.4	6.5	7.7	15.0	5.6	4.1
										AF064493	LIM结合结构域2	0.46	0.14	5.9	5.6	2.2	2.9	8.5	5.8
AL117567	DKFZP566O084蛋白	0.44	0.22	5.8	3.3	2.9	2.3	5.7	14.9
										L40933	磷酸葡糖变位酶5	0.16	0.03	5.6	11.0	4.8	3.5	8.5	76.3
M27190	regenerating islet-derived 1 alpha(胰石蛋白)·	0.19	0.28	5.3	3.0	3.8	3.6	5.8	3.6
										AL031121	未知	0.24	0.09	5.3	3.8	3.2	3.9	3.0	27.9

U27655	G蛋白信号传导的调节物	0.24	0.29	5.0	9.0	4.5	8.3	4.2	4.5
										AB037786	未知	0.12	0.03	4.7	54.1	2.8	2.3	2.2	11.0
X73113	肌球蛋白结合蛋白C	0.29	0.13	4.7	6.5	6.0	2.4	6.7	6.3
										AB010962	基质金属蛋白酶	0.08	0.12	4.7	6.2	2.4	4.7	10.9	4.2
AL096729	未知	0.36	0.13	4.7	7.7	3.2	2.4	6.3	6.2
										AB018320	Arg/Ab1相互作用性蛋白	0.16	0.18	4.6	7.1	3.0	3.3	5.8	8.9
AK001024	鸟苷酸结合蛋白	0.16	0.11	4.6	2.0	9.8	2.6	7.6	14.1
										AJ21931	未知	0.15	0.08	4.6	17.3	5.4	9.2	5.1	5.5
U21931	果糖二磷酸酶1	0.48	0.14	4.6	4.3	2.6	2.1	8.4	9.6
										X66403	胆碱能受体	0.17	0.19	4.4	9.0	10.9	9.3	5.1	6.7
X67734	contactin 2	0.25	0.09	4.3	6.8	3.1	5.8	7.9	8.4
										U92981	未知	0.20	0.23	4.3	3.2	4.8	5.6	5.4	6.3
X68879	空气门同源物1	0.05	0.08	4.3	2.0	12.3	2.7	5.6	4.7
										AL137362	未知	0.22	0.22	4.2	4.1	2.7	4.1	9.3	4.2
NM_001756	皮质类固醇激素结合性球蛋白	0.28	0.13	4.4	10.6	3.9	2.7	10.3	5.5
										U80770	未知	0.31	0.14	4.1	4.1	23.3	2.7	7.0	10.1
AL109792	未知	0.16	0.19	4.0	4.5	4.3	8.8	8.7	3.9
										X65962	细胞色索P450	0.33	0.05	3.8	25.3	5.7	5.1	19.8	12.0
AK001856	未知	0.40	0.21	3.8	7.0	2.6	3.1	2.9	7.8
										AL022723	MHC，I类，F	0.55	0.18	3.7	5.7	4.4	2.3	3.3	5.2
D38449	推定的G蛋白偶联性受体	0.18	0.09	3.5	11.1	13.3	5.8	4.8	5.2
										AL137489	未知	0.74	0.26	3.3	2.9	2.6	3.3	2.5	5.4

AB000887	小分子诱导性细胞因子亚家族A	0.76	0.18	3.3	5.0	2.6	2.4	5.9	10.3
										NM_012450	硫酸盐转运蛋白1	0.15	0.10	3.3	9.0	10.0	10.9	4.6	8.7
U86529	谷胱甘肽S-转移酶ζ1	0.55	0.15	3.2	6.8	4.4	2.3	9.3	5.1
										AK001244	未知	0.79	0.31	3.2	5.5	2.3	2.3	3.9	2.8
AL133602	未知	0.16	0.21	3.1	7.8	8.7	2.6	4.1	5.6
										AB033080	细胞周期进程8蛋白	0.31	0.31	3.1	4.6	3.0	3.5	2.2	4.2
AF023466	推定的甘氨酸-N-酰基转移酶	0.27	0.18	3.1	5.0	4.2	7.4	10.1	3.8
										AL117457	肌动蛋白素(cofilin)2	0.68	0.53	3.0	4.6	3.3	2.4	7.4	3.4
AC007059	未知	0.37	0.35	3.0	5.7	3.1	2.4	2.6	2.4
										U60179	生长激素受体	0.34	0.21	2.9	3.5	2.3	3.1	8.0	4.7
M37238	磷脂酶C，γ2	0.60	0.36	2.9	2.0	3.2	2.1	2.9	4.6
										L22569	组织蛋白酶B	0.32	0.12	2.9	2.1	6.2	3.0	13.1	16.7
M80359	MAP/微管亲和调控激酶3	0.37	0.76	2.9	3.1	6.1	7.6	2.1	3.3
										S70348	整连蛋白β3	0.58	0.31	2.6	4.8	4.1	2.6	2.6	2.6
L13720	生长阻滞特异蛋白6	0.36	0.26	2.4	2.5	6.8	4.8	3.9	3.7
										AL049423	未知	0.33	0.30	2.4	3.7	3.8	2.8	2.9	3.4
AL050201	未知	0.68	0.29	2.2	3.1	3.7	3.0	3.0	2.2
										AF050078	生长阻滞特异蛋白11	0.87	0.33	2.1	8.4	2.5	2.2	2.6	4.4
AK001753	假想蛋白	0.53	0.28	2.1	5.0	2.2	2.8	3.6	4.6
										X05323	未知	0.39	0.13	2.1	7.8	2.6	2.4	21.5	3.5
AB014548	KIAA0648蛋白	0.61	0.30	2.0	2.4	4.8	3.4	4.9	3.9

[00119]表34：A549细胞中被式D的肽诱导的多聚核苷酸表达的增量调节。发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与HumanOperon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多聚核苷酸的强度显示在第三列和第四列，它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的cDNA。“ID#：对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

登记号	基因	对照-Cy3	对照-Cy5	ID26：对照	ID27：对照	ID28：对照	ID29：对照	ID30：对照	ID31：对照
										U68018	MAD同源物2	0.13	0.71	11.2	2.2	8.0	2.3	6.7	25.6
NM_016015	CGI-68蛋白	0.92	1.59	2.3	2.3	3.5	3.7	3.4	22.9
										AF071510	卵磷脂视黄醇酰基转移酶e	0.07	0.05	15.4	10.3	5.3	44.1	2.1	21.2
AC005154	未知	0.17	1.13	2.7	7.2	12.6	6.4	3.3	20.6
										M81933	细胞分裂周期25A	0.13	0.21	4.3	3.1	3.2	4.3	5.6	18.2
AF124735	LIM框基因2	0.17	0.21	2.1	4.4	5.9	5.2	7.6	17.0
										AL110125	未知	0.30	0.08	5.0	2.7	6.8	10.2	2.8	12.0
NM_004732	电压门控钾通道	0.15	0.16	7.6	4.0	3.4	2.2	2.9	11.4
										AF030555	脂肪酸辅酶A连接酶长链4	0.10	0.39	10.5	2.2	6.4	3.0	5.1	10.7
AF000237	1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶e 2	1.80	2.37	3.4	2.5	2.4	2.1	3.7	9.9
										AL031588	假想蛋白	0.40	0.26	5.8	20.2	2.8	4.7	5.6	9.1
AL080077	未知	0.15	0.21	2.4	2.0	11.9	3.8	2.3	8.7
										NM_014366	推定为核苷酸结合蛋白_雌二醇诱导性	0.90	2.52	2.4	4.3	2.4	2.6	3.0	8.6
AB002359	磷酸核糖甲酰基甘氨脒合成酶	0.81	2.12	3.2	2.7	5.5	2.5	2.8	6.9

U33547	II类MHC抗原HLA DRB6 mRNA	0.14	0.16	2.5	5.3	4.5	5.0	3.1	6.6
										AL133051	未知	0.09	0.07	7.7	6.3	5.4	23.1	5.4	6.5
AK000576	假想蛋白	0.27	0.06	7.1	9.3	5.0	6.9	2.9	6.2
										AF042378	纺锤体极体蛋白	0.36	0.39	3.3	3.0	9.5	4.5	3.4	6.2
AF093265	Homer神经元即刻早期基因3	0.67	0.53	2.7	13.3	6.5	5.0	2.9	6.2
										D80000	有丝分裂染色体的分离1	1.01	1.56	3.6	2.5	4.9	3.2	6.3	6.1
AF035309	蛋白酶体26S亚基ATP酶5	3.61	4.71	2.7	6.6	5.2	4.9	2.7	6.0
										M34175	连接蛋白相关性蛋白复合物2β1亚基	4.57	5.13	3.2	3.1	4.0	4.6	2.7	6.0
AB020659	KIAA0852蛋白	0.18	0.37	4.1	7.6	5.7	4.8	2.5	5.7
										NM_004862	LPS诱导性TNFα因子	2.61	3.36	3.8	4.8	4.1	4.9	3.2	5.6
U00115	锌指蛋白51	0.51	0.07	18.9	2.2	3.5	7.2	21.2	5.6
										AF088868	fibrousheathin II	0.45	0.20	4.7	10.0	3.2	6.4	6.0	5.6
AK001890	未知	0.42	0.55	2.4	3.5	3.6	2.3	2.2	5.6
										AL137268	KIAA0759蛋白	0.49	0.34	3.8	2.3	5.0	3.5	3.3	5.4
X63563	聚合酶II多肽B	1.25	1.68	2.5	8.1	3.4	4.8	5.2	5.4
										D12676	CD36抗原	0.35	0.39	2.9	3.4	2.6	2.2	3.5	5.3
AK000161	假想蛋白	1.06	0.55	3.4	8.7	2.1	6.7	2.9	5.1
										AF052138	未知	0.64	0.51	2.9	2.8	2.7	5.2	3.6	5.0
AL096803	未知	0.36	0.03	20.1	18.3	3.7	19.3	16.1	4.9
										S49953	DNA结合转录激活物	0.70	0.15	3.7	4.0	2.1	6.6	4.0	4.8
X89399	RAS p21蛋白激活物	0.25	0.10	8.5	14.9	4.8	18.6	4.3	4.8
										AJ005273	recA蛋白的抗原决定簇	0.70	0.10	7.6	11.1	2.8	9.9	12.0	4.6

AK001154	假想蛋白	1.70	0.96	2.4	4.4	2.9	8.9	2.4	4.5
										AL133605	未知	0.26	0.15	12.4	4.2	4.4	3.3	3.3	4.1
U71092	G蛋白偶联性受体24	0.53	0.06	19.0	9.1	2.2	12.0	3.3	4.1
										AF074723	RNA聚合物II转录调节介质	0.67	0.54	4.0	3.2	3.1	3.4	6.0	4.0
AL137577	未知	0.32	0.12	31.4	6.2	5.3	10.1	25.3	3.9
										AF151043	假想蛋白	0.48	0.35	2.6	2.2	2.0	3.3	2.2	3.8
AF131831	未知	0.67	0.81	2.1	7.0	3.5	3.2	3.9	3.7
										D50405	组氨酸脱乙酰基酶1	1.52	1.62	3.1	7.2	2.9	4.1	2.8	3.7
U78305	蛋白质磷酸酶1D	1.21	0.20	4.7	13.0	3.5	5.9	4.2	3.7
										AL035562	成对框基因1	0.24	0.01	30.2	81.9	5.6	82.3	6.2	3.7
U67156	促细胞分裂剂激活性蛋白激酶激酶激酶5	1.15	0.30	6.6	3.0	2.2	2.3	2.5	3.6
										AL031121	未知	0.24	0.09	5.2	3.7	2.3	6.5	9.1	3.6
U13666	G蛋白偶联性受体1	0.34	0.14	3.8	5.4	3.1	3.3	2.8	3.6
										AB018285	KIAA0742蛋白	0.53	0.13	14.9	13.9	5.9	18.5	15.2	3.5
D42053	位点1蛋白酶	0.63	0.40	2.6	7.1	5.6	9.2	2.6	3.5
										AK001135	Sec23相互作用性蛋白p125	0.29	0.53	5.7	4.5	3.4	2.6	11.3	3.4
AL137461	未知	0.25	0.02	23.8	9.0	2.7	59.2	12.5	3.3
										NM_006963	锌指蛋白22	0.10	0.08	3.2	7.6	3.7	7.9	11.2	3.2
AL137540	未知	0.67	0.79	3.9	2.6	5.6	4.2	3.5	3.1
										AL137718	未知	0.95	0.18	4.7	8.0	4.0	13.3	3.0	3.1
AF012086	RNA结合蛋白2样1	1.20	0.59	4.6	4.0	2.0	4.6	3.6	3.1
										S57296	HER2/neu受体	0.59	0.17	7.3	12.1	2.3	20.0	22.2	3.0

NM_013329	富含GC序列DNA结合因子候补物	0.16	0.08	6.9	14.3	9.7	3.3	7.2	3.0
										AF038664	UDP-Gal：βGlcN Acβ1_4-半乳糖基转移酶	0.15	0.03	13.4	22.2	5.4	15.8	17.6	3.0
AF080579	人类整合性膜蛋白	0.34	1.03	3.3	3.0	6.7	2.1	2.9	2.9
										AK001075	假想蛋白	0.67	0.10	2.1	2.6	2.6	8.9	2.2	2.9
AB011124	KIAA0552基因产物	0.46	0.04	9.6	72.0	6.0	33.9	13.6	2.9
										J03068	N-酰氨基酰基-肽水解酶	0.54	0.21	2.2	5.0	2.4	5.2	3.6	2.8
D87120	造骨细胞蛋白	0.87	0.87	2.2	2.0	4.7	2.3	2.0	2.8
										AB006537	IL-1R辅助蛋白	0.17	0.07	2.9	7.0	14.5	5.3	6.6	2.8
L34587	转录延伸因子B	2.49	1.23	2.2	16.3	5.0	15.8	5.5	2.7
										D31891	SET结构域_分叉_1	1.02	0.29	3.9	6.0	4.3	4.9	6.6	2.7
D00760	蛋白酶体亚基_α型_2	4.97	4.94	4.1	2.6	2.0	2.8	2.7	2.7
										AC004774	distal-less同源框5	0.25	0.12	2.3	6.3	3.8	5.2	5.2	2.6
AL024493	未知	1.46	0.54	4.8	13.5	2.1	11.6	6.8	2.6
										AB014536	copine III	1.80	1.29	3.2	9.5	3.8	6.8	2.6	2.6
X59770	IL-1R型II	0.59	0.16	9.6	4.7	3.9	3.2	4.9	2.5
										AF052183	未知	0.65	0.76	4.0	3.7	2.3	5.0	3.0	2.5
AK000541	假想蛋白	0.92	0.27	4.5	13.9	3.6	18.1	4.3	2.5
										U88528	cAMP应答元件结合蛋白	1.37	0.86	3.1	5.4	2.1	2.8	2.1	2.4
M97925	防御素α5帕内特细胞特异性	0.33	0.07	4.6	35.9	2.0	7.8	6.5	2.4
										NM_013393	细胞分裂蛋白FtsJ	1.38	0.94	3.1	5.8	2.1	4.2	2.6	2.3
X62744	II类MHC DMα	0.86	0.32	4.0	4.7	2.3	2.9	6.1	2.3
										AF251040	推定为细胞核蛋白	0.64	0.30	6.7	3.4	2.9	3.9	5.7	2.2

AK000227	假想蛋白	1.49	0.43	3.4	7.1	2.3	3.3	9.1	2.1
										U88666	SFRS蛋白激酶2	1.78	0.37	3.4	5.9	2.6	8.4	6.1	2.0

[00120]表35：A549细胞中被式E的肽诱导的多聚核苷酸表达的增量调节。发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与HumanOperon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多聚核苷酸的强度显示在第三列和第四列，它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的cDNA。“ID#：对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

登记号	基因	对照-Cy3	对照-Cy5	ID33：对照	ID34：对照	ID35：对照	ID36：对照	ID37：对照	ID38：对照
										AL049689	新的人mRNA	0.25	0.05	2.7	26.5	3.3	21.7	5.4	37.9
AK000576	假想蛋白	0.27	0.06	3.0	19.1	3.9	23.0	3.1	28.3
										X74837	甘露糖苷酶，α类1A成员1	0.10	0.07	5.6	10.0	10.8	12.3	12.0	19.9
AK000258	假想蛋白	0.27	0.07	14.0	11.1	7.9	16.1	6.2	18.9
										X89067	瞬时受体	0.20	0.14	3.7	2.2	2.4	2.6	8.0	18.1
AL137619	未知	0.16	0.08	6.3	6.7	10.8	10.5	7.9	16.5
										NM_003445	锌指蛋白	0.17	0.07	4.0	23.6	2.9	13.6	4.3	14.4
X03084	补体成分1	0.36	0.15	2.4	3.1	2.9	7.7	3.4	13.7
										U27330	岩藻糖基转移酶5	0.39	0.08	2.4	2.5	2.6	12.1	3.5	13.0
AF070549	未知	0.16	0.09	2.7	4.7	7.9	10.3	4.2	12.6
										AB020335	sel-1样	0.19	0.24	2.9	2.6	2.0	7.3	4.7	12.4

M26901	肾素	0.09	0.12	14.9	2.2	7.3	12.0	20.8	12.0
										Y07828	锌指蛋白	0.09	0.06	9.0	26.6	8.9	16.0	3.6	11.6
AK001848	假想蛋白	0.21	0.07	6.2	8.2	2.7	5.2	5.5	10.9
										NM_016331	锌指蛋白	0.16	0.08	7.6	5.1	7.0	25.5	5.5	10.9
U75330	神经细胞黏附分子2	0.42	0.08	2.5	3.6	2.0	5.8	6.2	9.9
										AB037826	未知	0.16	0.11	3.8	6.0	3.4	13.4	6.0	9.8
M34041	肾上腺素能α-2B受体	0.30	0.13	4.5	4.5	3.7	8.6	5.6	9.8
										D38449	推定为G蛋白偶联性受体	0.18	0.09	2.3	25.8	11.7	2.3	3.2	9.5
AJ250562	跨膜4超家族成员2	0.13	0.10	10.0	8.4	2.2	8.1	16.3	9.1
										AK001807	假想蛋白	0.18	0.12	4.2	5.3	4.6	3.2	4.0	8.3
AL133051	未知	0.09	0.07	5.1	13.6	6.0	9.1	2.2	8.2
										U43843	神经-d4同源物	0.61	0.10	2.0	6.4	2.3	16.6	2.2	8.1
NM_013227	软骨聚集蛋白聚糖1	0.28	0.15	7.5	3.1	2.5	6.9	8.5	7.8
										AF226728	生长激素抑制素受体相互作用性蛋白	0.23	0.17	7.0	3.6	3.1	5.5	3.5	7.7
AK001024	鸟苷酸结合蛋白	0.16	0.11	0.39	12.3	2.7	7.4	3.3	7.0
										AC002302	未知	0.13	0.14	16.1	5.8	5.8	2.6	9.6	6.2
AB007958	未知	0.17	0.27	2.0	2.3	11.3	3.3	3.0	6.1
										AF059293	细胞因子受体样因子1	0.19	0.22	3.6	2.5	10.2	3.8	2.7	5.9
V01512	v-fos	0.27	0.21	6.7	3.7	13.7	9.3	3.7	5.4
										U82762	唾液酸转移酶8	0.23	0.15	3.2	6.5	2.7	9.2	5.7	5.4
U44059	促甲状腺胚胎因子	0.05	0.13	22.9	7.1	12.5	7.4	9.7	5.4
										X05323	由单克隆抗体确认的抗原	0.39	0.13	4.3	2.5	2.2	7.4	2.8	5.1

U72671	ICAM 5	0.25	0.14	5.3	2.7	3.7	10.0	3.2	4.8
										AL133626	假想蛋白	0.26	0.25	2.2	4.2	2.9	3.0	2.6	4.7
X96401	MAX结合蛋白	0.31	0.29	6.9	2.3	4.9	3.1	2.9	4.6
										AL117533	未知	0.05	0.26	8.2	2.7	11.1	2.5	11.9	4.5
AK001550	假想蛋白	0.10	0.30	8.0	2.0	4.9	2.1	7.8	4.5
										AB032436	人类BNP1 mRNA	0.14	0.21	5.1	2.2	9.1	4.5	6.4	4.4
AL035447	假想蛋白	0.28	0.23	4.3	3.7	8.7	5.2	3.7	4.2
										U09414	锌指蛋白	0.28	0.25	4.0	2.2	4.7	3.3	7.2	4.2
AK001256	未知	0.09	0.08	5.3	6.5	31.1	12.7	6.4	4.1
										L14813	羧酸酯连接酶样	0.64	0.21	2.7	6.2	3.1	2.1	3.4	3.9
AF038181	未知	0.06	0.18	34.1	6.4	4.5	8.7	11.3	3.9
										NM_001486	葡糖激酶	0.21	0.08	3.0	2.2	6.5	12.4	5.7	3.9
AB033000	假想蛋白	0.24	0.22	3.4	3.3	7.1	5.5	4.5	3.8
										AL117567	DKFZP5660084蛋白	0.44	0.22	2.2	2.7	3.9	4.0	4.5	3.7
NM_012126	糖类磺基转移酶5	0.31	0.20	5.5	5.4	3.8	5.5	2.6	3.5
										AL031687	未知	0.16	0.27	5.9	2.6	3.4	2.3	4.9	3.5
X04506	载脂蛋白B	0.29	0.32	5.4	4.4	6.9	5.5	2.1	3.5
										NM_006641	CCR9	0.35	0.11	3.3	3.3	2.2	16.5	2.3	3.5
Y00970	顶体蛋白酶	0.12	0.14	8.2	8.8	3.1	6.2	17.5	3.4
										X67098	rTS β蛋白	0.19	0.26	2.4	3.1	7.8	3.5	4.4	3.3
U51990	前mRNA剪接因子	0.56	0.19	2.2	3.0	2.8	13.7	2.9	3.0
										AF030555	脂肪酸辅酶A	0.10	0.39	3.5	6.9	13.3	4.4	7.5	2.9

AL009183	TNFR超家族，成员9	0.46	0.19	6.0	4.1	2.8	8.6	2.6	2.8
										AF045941	sciellin	0.16	0.21	11.6	2.4	2.8	2.2	4.1	2.8
AF072756	激酶锚蛋白4	0.33	0.07	2.5	5.3	3.9	32.7	2.3	2.7
										X78678	己酮激酶	0.10	0.20	18.0	3.5	4.1	2.5	14.6	2.6
AL031734	未知	0.03	0.39	43.7	2.3	41.7	4.0	10.8	2.5
										D87717	KIAA0013基因产物	0.35	0.42	4.2	2.3	3.6	2.6	2.9	2.5
U01824	溶质载体家族1	0.42	0.29	4.8	2.3	4.2	7.1	4.2	2.4
										AF055899	溶质载体家族27	0.14	0.31	9.5	12.3	7.4	4.7	6.6	2.3
U22526	羊毛甾醇合成酶	0.09	0.45	4.1	3.4	10.4	2.2	17.9	2.3
										AB032963	未知	0.19	0.34	6.3	6.1	2.9	2.1	5.7	2.2
NM_015974	λ-晶体蛋白	0.17	0.25	11.4	2.8	5.9	2.4	5.8	2.2
										X82200	受激的反式作用因子	0.23	0.15	8.2	3.4	3.0	2.8	11.3	2.2
AL137522	未知	0.12	0.26	12.1	3.7	12.6	6.9	4.3	2.2
										Z99916	晶体蛋白，βB3	0.28	0.65	2.5	2.1	3.6	2.2	2.6	2.1
AF233442	泛蛋白特异性蛋白酶21	0.41	0.31	2.6	3.6	3.6	4.5	3.4	2.1
										AK001927	假想蛋白	0.24	0.52	7.6	5.6	5.0	2.5	4.1	2.0

[00121]表36：A549细胞中被式F的肽诱导的多聚核苷酸表达的增量调节。发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与HumanOperon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多聚核苷酸的强度显示在第三列和第四列，它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的cDNA。“比值ID#：对照”  一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

登记号	基因	对照-Cy3	对照-Cy5	比值ID40：对照	比值ID42：对照	比值ID43：对照	比值ID44：对照	比值ID45：对照
									AF025840	聚合酶ε2	0.34	0.96	3.4	2.0	2.0	2.1	4.3
AF132495	CGI-133蛋白	0.83	0.67	3.0	2.2	2.6	2.8	5.1
									AL137682	假想蛋白	0.73	0.40	2.0	5.3	4.8	2.9	8.2
U70426	G蛋白信号传导的调节物16	0.23	0.25	3.1	3.0	5.3	3.1	12.2
									AK001135	Sec23相互作用性蛋白p125	0.29	0.53	3.2	2.6	3.3	14.4	5.2
AB023155	KIAA0938蛋白	0.47	0.21	2.7	4.8	8.1	4.2	10.4
									AB033080	细胞周期进程8蛋白	0.31	0.31	4.4	2.2	5.9	4.3	6.9
AF061836	Ras关联结构域家族1	0.29	0.31	3.2	2.5	11.1	18.8	6.8
									AK000298	假想蛋白	0.48	0.27	3.3	2.2	7.1	5.6	7.7
L75847	锌指蛋白	0.35	0.52	3.2	3.0	4.0	3.0	3.9
									X97267	蛋白酪氨酸磷酸酶	0.19	0.24	4.1	9.3	2.4	4.2	8.3
Z11933	POU结构域类3 TF 2	0.09	0.23	8.7	2.5	3.6	4.3	8.2
									AB037744	未知	0.37	0.57	2.6	2.9	2.7	3.0	3.1
U90908	未知	0.12	0.16	11.8	7.7	3.4	7.8	11.2
									AL050139	未知	0.29	0.60	5.2	2.4	3.3	3.0	2.8
AB014615	成纤维细胞生长因子8	0.19	0.07	5.4	3.5	8.5	3.2	22.7
									M28825	CD1A抗原	0.51	0.36	4.1	2.6	2.0	4.6	4.4
U27330	岩藻糖基转移酶5	0.39	0.08	3.3	2.1	24.5	8.2	19.3
									NM_006963	锌指蛋白	0.10	0.08	10.4	12.6	12.3	29.2	20.5

AF093670	过氧化物酶体生物发生因子	0.44	0.53	4.0	2.6	2.6	4.3	2.9
									AK000191	假想蛋白	0.50	0.18	2.3	3.6	4.4	2.2	8.2
AB022847	未知	0.39	0.24	2.1	6.9	4.5	2.8	6.2
									AK000358	微纤维缔合蛋白3	0.28	0.28	5.7	2.0	3.5	5.2	5.2
X74837	甘露糖酶_α类1A	0.10	0.07	13.1	18.4	23.6	16.3	20.8
									AF053712	TNF超家族成员11	0.17	0.08	11.3	9.3	13.4	10.6	16.6
AL133114	DKFZP586P2421蛋白	0.11	0.32	8.5	3.4	4.9	5.3	4.3
									AF049703	E74样因子5	0.22	0.24	5.1	6.0	3.3	2.7	5.4
AL137471	假想蛋白	0.29	0.05	4.0	15.0	10.1	2.7	25.3
									AL035397	未知	0.33	0.14	2.3	2.8	10.6	4.6	9.3
AL035447	假想蛋白	0.28	0.23	3.8	6.8	2.7	3.0	5.7
									X55740	CD73	0.41	0.61	2.1	3.3	2.9	3.2	2.1
NM_004909	紫杉醇抗性相关基因3	0.20	0.22	3.9	2.9	6.5	3.2	5.6
									AF233442	泛蛋白特异性蛋白酶	0.41	0.31	2.9	4.7	2.7	3.5	3.9
U92980	未知	0.83	0.38	4.2	4.1	4.8	2.3	3.1
									AF105424	肌球蛋白重多肽样	0.30	0.22	2.8	3.3	4.4	2.3	5.3
M26665	histatin 3	0.29	0.26	7.9	3.5	4.6	3.5	4.5
									AF083898	神经肿瘤腹侧抗原2	0.20	0.34	18.7	3.8	2.2	3.6	3.5
AJ009771	ariadne_果蝇_同源物	0.33	0.06	2.3	17.6	15.9	2.5	20.3
									AL022393	假想蛋白P1	0.05	0.33	32.9	2.4	3.0	69.4	3.4
AF039400	钙激活的氯离子通道家族成员1	0.11	0.19	8.4	2.9	5.1	18.1	5.9
									AJ012008	二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶	0.42	0.43	5.1	3.3	3.2	6.2	2.6

AK00542	假想蛋白	0.61	0.24	2.1	4.5	5.0	3.7	4.4
									AL133654	未知	0.27	0.40	2.8	2.1	2.5	2.5	2.6
AL137513	未知	0.43	0.43	6.4	3.2	3.8	2.3	2.3
									U05227	GTP结合蛋白	0.38	0.36	5.0	3.1	3.1	2.2	2.8
D38449	推定为G蛋白偶联性受体	0.18	0.09	5.8	6.7	6.7	9.1	10.4
									U80770	未知	0.31	0.14	3.9	3.8	6.6	3.1	6.8
X61177	1L-5 Rα	0.40	0.27	2.6	4.4	9.8	8.1	3.6
									U35246	囊泡分选蛋白45A	0.15	0.42	5.8	2.8	2.6	4.5	2.2
AB017016	脑特异性蛋白p25α	0.27	0.29	6.0	2.6	3.4	3.1	3.1
									X82153	组织蛋白酶K	0.45	0.20	4.2	5.2	4.8	4.4	4.6
AC005162	很可能为羧肽酶前体	0.12	0.28	11.9	3.4	6.8	18.7	3.2
									AL137502	未知	0.22	0.16	3.9	4.9	7.3	3.9	5.3
U66669	3-羟基异丁酰轴酶A水解酶	0.30	0.40	10.3	3.5	5.2	2.3	2.1
									AK000102	未知	0.39	0.30	2.8	5.3	5.2	4.1	2.8
AF034970	对接蛋白2	0.28	0.05	3.3	8.5	15.7	4.0	17.3
									AK000534	假想蛋白	0.13	0.29	6.8	2.3	4.0	20.6	2.9
J04599	双糖链蛋白聚糖	0.39	0.30	4.0	3.7	4.0	4.8	2.8
									AL133612	未知	0.62	0.33	2.7	3.4	5.2	3.0	2.5
D10495	蛋白激酶Cδ	0.18	0.10	12.0	20.7	8.7	6.8	8.1
									X58467	细胞色素P450	0.07	0.24	15.4	4.7	7.9	34.4	3.4
AF131806	未知	0.31	0.25	2.6	3.4	5.7	7.0	3.2
									AK000351	假想蛋白	0.34	0.13	4.0	6.9	5.5	2.8	6.3

AF075050	假想蛋白	0.55	0.09	2.7	17.8	5.1	2.2	8.3
									AK000566	假想蛋白未知	0.15	0.35	6.7	2.2	6.8	6.4	2.1
U43328	软骨连接蛋白1	0.44	0.19	2.5	6.2	6.9	7.8	3.8
									AF045941	sciellin	0.16	0.21	6.8	7.5	4.8	6.9	3.4
U27655	G蛋白信号传导的调节物3	0.24	0.29	5.5	4.9	2.9	4.9	2.4
									AK000058	假想蛋白	0.25	0.15	5.0	9.7	16.4	2.7	4.5
AL035364	假想蛋白	0.32	0.26	4.4	4.2	7.3	2.8	2.6
									AK001864	未知	0.40	0.25	3.7	3.7	4.6	3.2	2.6
AB015349	未知	0.14	0.24	10.5	2.8	3.7	8.0	2.7
									V00522	II类MHC DR β3	0.62	0.22	4.8	3.9	4.7	2.5	3.0
U75330	神经细胞黏附分子2	0.42	0.08	2.1	9.6	13.2	3.3	7.8
									NM_007199	IL-1R相关激酶M	0.15	0.25	8.7	7.8	8.6	16.1	2.5
D30742	钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV	0.28	0.09	6.2	28.7	7.4	2.4	6.8
									X05978	胱蛋白A(cystatin A)	0.63	0.17	2.7	4.8	9.4	2.2	3.6
AF240467	TLR-7	0.11	0.10	13.8	13.3	4.7	7.7	4.9

[00122]表37：A549细胞中被式G的肽和其它的肽诱导的多聚核苷酸表达的增量调节。发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多聚核苷酸的强度显示在第二列和第三列，它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的cDNA。“比值ID#：对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。登记号和基因表示为：U00115，锌指蛋白；M91036，血红蛋白γG；AK000070，假想蛋白；AF055899，溶质载体家族27；AK001490，假想蛋白；X97674，细胞核受体辅激活物2；AB022847，未知；AJ275986，转录因子；D10495，蛋白激酶C，δ；L36642，EphA7；M31166，pentaxin相关性基因；AF176012，未知；AF072756，激酶锚蛋白4；NM 014439，IL-1超家族z；AJ271351，推定的转录调节物；AK000576，假想蛋白；AJ272265，分泌磷蛋白2；AL122038，假想蛋白；AK000307，假想蛋白；AB029001，KIAA1078蛋白；U62437，胆碱能受体；AF064854，未知；AL031588，假想蛋白；X89388，RAS p21蛋白激活物；D45399，磷酸二酯酶；AB037716，假想蛋白；X79981，钙依粘连蛋白5；AF034208，RIG样7-1；AL133355，染色体21开放阅读框架53；NM_016281，STE20样激酶；AF023614，跨膜激活物和CAML相互作用蛋白；AF056717，ash2样；AB029039，KIAA1116蛋白；J03634，抑制素，βA；U80764，未知；AB032963，未知；X82835，IX型电压门控钠离子通道。

登记号	对照-Cy3	对照-Cy5	ID53：对照	ID54：对照	ID47：对照	ID48：对照	ID49：对照	ID50：对照	ID51：对照	ID52：对照
											U00115	0.51	0.07	27.4	7.3	2.4	3.1	4.8	8.3	3.5	20.0
M91036	0.22	0.02	39.1	32.5	5.2	2.2	37.0	6.0	16.2	18.0
											AK000070	0.36	0.18	3.8	7.6	2.6	15.1	12.2	9.9	17.2	15.3
AF055899	0.14	0.31	6.7	3.7	9.7	10.0	2.2	16.7	5.4	14.8
											AK001490	0.05	0.02	14.1	35.8	3.2	28.6	25.0	20.2	56.5	14.1
X97674	0.28	0.28	3.2	3.7	4.0	10.7	3.3	3.1	4.0	13.2
											AB022847	0.39	0.24	4.1	4.4	4.5	2.7	3.7	10.4	5.0	11.3
AJ275986	0.26	0.35	5.8	2.3	5.7	2.2	2.5	9.7	4.3	11.1
											D10495	0.18	0.10	8.0	3.4	4.6	2.0	6.9	2.5	12.7	10.3
L36642	0.26	0.06	5.8	14.2	2.6	4.1	8.9	3.4	6.5	6.6
											M31166	0.31	0.12	4.8	3.8	12.0	3.6	9.8	2.4	8.8	6.4
AF176012	0.45	0.26	3.1	2.9	2.8	2.6	2.3	6.9	3.0	5.8
											AF072756	0.33	0.07	9.9	9.3	4.4	4.3	3.2	4.9	11.9	5.4

NM_014439	0.47	0.07	12.0	7.1	3.3	3.3	4.7	5.9	5.0	5.4
											AJ271351	0.46	0.12	3.4	3.5	2.3	4.7	2.3	2.7	6.9	5.2
AK000576	0.27	0.06	7.4	15.7	2.9	4.7	9.0	2.4	8.2	5.1
											AJ272265	0.21	0.09	6.2	7.9	2.3	3.7	10.3	4.5	4.6	4.7
AL122038	0.46	0.06	6.7	4.5	2.6	4.3	16.4	6.5	26.6	4.6
											AK000307	0.23	0.09	3.7	4.0	4.3	3.2	5.3	2.9	13.1	4.4
AB029001	0.52	0.21	14.4	4.3	4.6	4.4	4.8	21.9	3.2	4.2
											U62437	0.38	0.13	12.6	6.5	4.2	6.7	2.2	3.7	4.8	3.9
AF064854	0.15	0.16	2.6	2.9	6.2	8.9	14.4	5.0	9.1	3.9
											AL031588	0.40	0.26	8.3	5.2	2.8	3.3	5.3	9.0	5.6	3.4
X89388	0.25	0.10	15.8	12.8	7.4	4.2	16.7	6.9	12.7	3.3
											D45399	0.21	0.18	3.0	4.7	3.3	4.4	8.7	5.3	5.1	3.3
AB037716	0.36	0.40	5.1	7.5	2.6	2.1	3.5	3.1	2.4	2.8
											X79981	0.34	0.10	4.7	7.2	3.2	4.6	6.5	5.1	5.8	2.7
AF034208	0.45	0.24	2.7	10.9	2.1	3.7	2.3	5.9	2.2	2.5
											AL133355	0.22	0.23	2.3	3.4	7.3	2.7	3.3	4.3	2.8	2.5
NM_016281	0.40	0.19	6.6	10.6	2.1	2.8	5.0	11.2	10.6	2.5
											AF023614	0.11	0.42	2.2	2.2	6.0	7.5	5.0	2.7	2.0	2.4
AF056717	0.43	0.62	4.3	3.2	5.1	4.0	4.6	9.7	3.1	2.2
											AB029039	0.79	0.49	2.7	3.3	3.7	2.0	2.3	2.4	4.8	2.2
J03634	0.40	0.12	3.7	2.3	2.3	4.0	10.5	4.1	9.1	2.2
											U80764	0.31	0.18	2.3	7.4	4.2	2.3	5.1	3.3	8.8	2.1
AB032963	0.19	0.34	4.0	7.3	5.0	3.0	2.9	6.7	3.8	2.1
											X82835	0.25	0.38	2.0	2.7	2.9	7.7	3.3	3.1	3.5	2.0

            实施例5

细胞系、人全血和鼠中用肽诱导趋化因子

[00123]使用了鼠巨噬细胞系RAW 264.7、THP-1细胞(人单核细胞)、人上皮细胞系(A549)、人支气管上皮细胞(16HBEo14)和人全血。HBE细胞在含有厄尔溶液的MEM(最低必须培养基)中生长。THP-1细胞在RPMI 1640培养基中生长和维持。RAW和A549细胞系维持在补充以10％胎小牛血清的DMEM中。将这些细胞接种到具有DMEM的24孔板中，密度为每孔10⁶个细胞(见上)，将A549细胞接种到具有DMEM的24孔板中，密度为每孔10⁵个细胞(见上)，它们都于37℃在5％CO₂中温育过夜。将DMEM从过夜生长的细胞中吸去，代之以新鲜培养基。在这些细胞与肽温育后，用ELISA(R&D Systems，Minneapolis，MN)测定释放到培养物上清中的趋化因子。

[00124]动物研究经由UBC动物管理委员会同意(UBCACC#A01-0008)。BALB/c鼠购自Charles River Laboratories，并用标准的动物设施喂养。年龄、性别和体重匹配的成年鼠通过腹膜内注射阿佛丁(4.4mM 2-2-2-三溴乙醇，2.5％2-甲基-2-丁醇，在蒸馏水中)被麻醉，剂量为每10g体重200μl。使用改自Ho和Furst 1973的非外科的气管内滴注方法实施滴注。简单的说，将已麻醉的鼠的上颌牙钩在支撑架顶部的金属丝上，使其颚处于打开状态，用弹簧推压胸部，使其咽、喉和气管处于一条垂直线上。从外面照亮气管，将一根插管导管插入到被清楚照亮的气管内腔。将20μl肽悬液或无菌水置于插管近端的小孔中，并将其用200μl空气慢慢滴注到该气管中。滴注之后，将这些动物于竖直位置保持2分钟，以使该流体流到呼吸树内。4小时后，通过腹膜内注射300mg/kg的戊巴比妥，将这些鼠无痛致死。将该气管暴露，将一个静脉内导管插入到气管近端，并用缝合线适当地系结。进行灌洗：通过气管插管将0.75毫升无菌PBS引入肺中，在数秒后，吸出该流体。该步骤用同样的PBS样品重复三次。将灌洗液放在管子中，并置于冰上，每只鼠的总回收体积约为0.5ml。将此支气管肺泡灌洗(BAL)液1200rpm高速离心10分钟，移走上清，用ELISA检测其中的TNF-α和MCP-1。

[00125]阳离子肽对趋化因子的增量调节作用在多个不同的系统中被证实。鼠MCP-1是人MCP-1的同源物，它是β(C-C)趋化因子家族的成员。已经证明MCP-1能招集单核细胞、NK细胞和一些T淋巴细胞。当来自RAW 264.7巨噬细胞和3个供体的人全血被浓度不断增加的肽SEQ ID NO：1刺激时，ELISA表明它们在其上清中产生了明显量的MCP-1(表36)。被浓度范围为20-50μg/ml的肽刺激了24小时的RAW264.7细胞产生了明显量的MCP-1(背景之上200-400pg/ml)。当用100μg/ml的LL-37刺激这些细胞(24小时)和全血(4小时)时，产生了高水平的MCP-1。

[00126]阳离子肽诱导趋化因子的效应也在一种完全不同的细胞系统，A549人上皮细胞中被检测。有趣的是，尽管这些细胞应答LPS时会产生MCP-1，并且这种应答会被肽拮抗；但是A549细胞直接应答肽SEQID NO：1时，并没有MCP-1产生。然而，高浓度的肽SEQ ID NO：1的确诱导产生了一种嗜中性粒细胞特异性趋化因子IL-8(表37)。因此，SEQ ID NO：1在不同的浓度和在不同的细胞类型中能够诱导不同范围的应答。测试了各个式子对应的大量肽在A549细胞中诱导IL-8的能力(表38)。低浓度10μg/ml的这些肽中有许多在背景水平上诱导出IL-8。还发现高浓度(100μg/ml)的SEQ ID NO：13在全血中诱导出IL-8(表39)。在HBE细胞(表40)和未分化的THP-1细胞(表41)中肽SEQ ID NO：2也明显诱导IL-8。

[00127]通过气管内滴注给予BALB/c鼠SEQ ID NO：1或无内毒素的水，3-4小时后检测支气管肺泡灌洗液中的MCP-1和TNF-α水平。发现用50μg/ml肽SEQ ID NO：1处理的鼠与只给予水或麻醉剂的鼠相比，前者产生的MCP-1水平明显增高(表42)。对肽SEQ ID NO：1并没有促炎应答，因为与只给予水或麻醉剂的鼠相比，该肽没有明显诱导出更多的TNF-α。还发现，在用肽SEQ ID NO：1(高到100μg/ml)处理的RAW 264.7细胞和骨髓源巨噬细胞中，肽SEQ ID NO：1没有明显诱导TNF-α的生成(表43)。因此，肽SEQ ID NO：1选择性地诱导趋化因子的产生，而不诱导炎症介导物例如TNF-α的产生。这说明肽SEQ ID NO：1具有双重作用，它既作为能够阻止细菌产物诱导的炎症的因子，又有助于招集可清除感染的吞噬细胞。

[00128]表38：RAW 264.7细胞和人全血中MCP-1的诱导。用浓度不断增加的LL-37刺激RAW 264.7鼠巨噬细胞和人全血4个小时。将人全血样品高速离心，移走血清，用ELISA检测其中的MCP-1，同时用ELISA检测RAW 264.7细胞的上清中的MCP-1。RAW细胞的数据表示为三个或更多个实验的平均值±标准偏差，人全血的数据表示为来自三个不同供体的平均值±标准偏差。

肽，SEQ ID NO：1(μg/ml)	单核细胞化学诱导蛋白(MCP)-1(pg/ml)*
				RAW细胞	全血
0	135.3±16.3	112.7±43.3
			10	165.7±18.2	239.3±113.3
50	367±11.5	371±105
			100	571±17.4	596±248.1

[00129]表39：A549细胞和人全血中IL-8的诱导。用浓度不断增加的肽分别刺激A549细胞和人全血24小时和4小时。将人全血样品高速离心，移走血清，用ELISA检测其中的IL-8，同时用ELISA检测A549细胞的上清中的IL-8。A549细胞的数据表示为三个或更多个实验的平均值±标准偏差，人全血的数据表示为来自三个不同供体的平均值±标准偏差。

肽，SEQ ID NO：1(μg/ml)	IL-8(pg/ml)
				A549细胞	全血
0	172±29.1	660.7±126.6
			1	206.7±46.1
10	283.3±28.4	945.3±279.9
			20	392±31.7
50	542.3±66.2	1160.3±192.4
			100	1175.3±188.3

[00130]表40：A549细胞中阳离子肽诱导IL-8。用10μg肽刺激A549人上皮细胞24小时。移走上清，并用ELISA检测其中的IL-8。

肽(10μg/ml)	IL-8(ng/ml)
		没有肽	0.164
LPS，没有肽	0.26
		SEQ ID NO：1	0 278
SEQ ID NO：6	0.181
		SEQ ID NO：7	0.161

SEQ ID NO：9	0.21
		SEQ ID NO：10	0.297
SEQ ID NO：13	0.293
		SEQ ID NO：14	0.148
SEQ ID NO：16	0.236
		SEQ ID NO：17	0.15
SEQ ID NO：19	0.161
		SEQ ID NO：20	0.151
SEQ ID NO：21	0.275
		SEQ ID NO：22	0.314
SEQ ID NO：23	0.284
		SEQ ID NO：24	0.139
SEQ ID NO：26	0.201
		SEQ ID NO：27	0.346
SEQ ID NO：28	0.192
		SEQ ID NO：29	0.188
SEQ ID NO：30	0.284
		SEQ ID NO：31	0.168
SEQ ID NO：33	0.328
		SEQ ID NO：34	0.315
SEQ ID NO：35	0.301
		SEQ ID NO：36	0.166
SEQ ID NO：37	0.269
		SEQ ID NO：38	0.171
SEQ ID NO：40	0.478
		SEQ ID NO：41	0.371
SEQ ID NO：42	0.422
		SEQ ID NO：43	0.552
SEQ ID NO：44	0.265
		SEQ ID NO：45	0.266
SEQ ID NO：47	0.383
		SEQ ID NO：48	0.262
SEQ ID NO：49	0.301
		SEQ ID NO：50	0.141
SEQ ID NO：51	0.255
		SEQ ID NO：52	0.207
SEQ ID NO：53	0.377
		SEQ ID NO：54	0.133

[00131]表41：人血液中肽诱导IL-8。用浓度不断增加的肽刺激人全血4小时。将人血样品离心，移走血清，并用ELISA检测其中的IL-8。

数据来自两个供体的平均值。

SEQ ID NO：3(μg/ml)	IL-8(pg/ml)
		0	85
10	70
		100	323

[00132]表42：HBE细胞中IL-8的诱导。将浓度不断增加的肽与HBE细胞共同温育8小时，移走上清，并用ELISA检测其中的IL-8。数据表示为三个或更多个实验的平均值±标准偏差。

SEQ ID NO：2(μg/ml)	IL-8(pg/ml)
		0	552±90
0.1	670±155
		1	712±205
10	941±15
		50	1490±715

[00133]表43：未分化的THP-1细胞中IL-8的诱导。将指定浓度的肽与人单核细胞THP-1细胞共同温育8小时，移走上清，并用ELISA检测其中的IL-8。

SEQ ID NO：3(μg/ml)	IL-8(pg/ml)
		0	10.6
10	17.2
		50	123.7

[00134]表44：在鼠的气道中肽SEQ ID NO：1诱导MCP-1。用阿佛丁将BALB/c鼠麻醉，并对其气管内滴注肽或水，或者不进行滴注(不作处理)。对鼠进行4小时监测，并分离出BAL流体，用ELISA分析其中的MCP-1和TNF-α浓度。数据表示为各种条件的四只或五只鼠的平均值±标准偏差。

条件	MCP-1(pg/ml)	TNF-α(pg/ml)
			水	16.5±5	664±107
肽	111±30	734±210
			阿佛丁(avertin)	6.5±0.5	393±129

[00135]表45：阳离子肽没有明显诱导TNF-α。将指定的肽(40μg/ml)与RAW 246.7巨噬细胞共同温育6小时。收集上清，并用ELISA检测其中的TNF-α水平。数据表示为三个或更多个实验的平均值±标准偏差。

肽处理	TNF-α(pg/ml)
		培养基背景	56±8
LPS处理，没有肽	15207±186
		SEQ ID NO：1	274±15
SEQ ID NO：5	223±45
		SEQ ID NO：6	297±32
SEQ ID NO：7	270±42
		SEQ ID NO：8	166±23
SEQ ID NO：9	171±33
		SEQ ID NO：10	288±30
SEQ ID NO：12	299±65
		SEQ ID NO：13	216±42
SEQ ID NO：14	226±41
		SEQ ID NO：15	346±41
SEQ ID NO：16	341±68
		SEQ ID NO：17	249±49
SEQ ID NO：19	397±86
		SEQ ID NO：20	285±56
SEQ ID NO：21	263±8
		SEQ ID NO：22	195±42
SEQ ID NO：23	254±58
		SEQ ID NO：24	231±32
SEQ ID NO：26	281±34
		SEQ ID NO：27	203±42
SEQ ID NO：28	192±26
		SEQ ID NO：29	242±40
SEQ ID NO：31	307±71
		SEQ ID NO：33	196±42
SEQ ID NO：34	204±51
		SEQ ID NO：35	274±76
SEQ ID NO：37	323±41
		SEQ ID NO：38	199±38
SEQ ID NO：43	947±197
		SEQ ID NO：44	441±145
SEQ ID NO：45	398±90
		SEQ ID NO：48	253±33
SEQ ID NO：49	324±38
		SEQ ID NO：50	311±144
SEQ ID NO：53	263±40

SEQ ID NO：54

346±86

                实施例6

    阳离子肽增加趋化因子受体的表面表达

[00136]为了分析IL-8RB、CXCR-4、CCR2和LFA-1的细胞表面表达，RAW巨噬细胞用10μg/ml适当的第一抗体(Santa Cruz Biotechnology)染色，接着用FITC偶联的羊抗兔IgG[IL-8RB和CXCR-4(JacksonImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)]或FITC偶联的驴抗羊IgG(Santa Cruz)。用FACscan对细胞进行分析，计数10,000次并开启前部和侧部分散器以排除细胞碎片。

[00137]多聚核苷酸阵列数据表明，与未受刺激的细胞相比，一些肽分别增量调节了趋化因子受体IL-8RB、CXCR-4和CCR2的表达10、4和1.4倍。为了证实该多聚核苷酸阵列数据，用流式细胞仪检测用肽刺激了4小时的RAW细胞上的受体的表面表达。当50μg/ml的肽与RAW细胞共同温育4小时时，IL-8RB平均被增量调节超过未刺激的细胞2.4倍，CXCR-4平均被增量调节超过未刺激的细胞1.6倍，CCR2被增量调节超过未刺激的细胞1.8倍(表46)。作为对照，CEMA被证明可导致类似的增量调节。Bac2A是唯一可明显增量调节LFA-1(高于对照细胞3.8倍)的肽。

[00138]表46：在对肽的应答中，CXCR-4、IL-8RB和CCR2的表面表达增加。用肽刺激RAW巨噬细胞4小时。清洗该细胞，用适当的第一抗体和FITC标记的第二抗体染色。显示的数据表示平均值(用肽刺激的RAW细胞的倍数变化)±标准偏差。

肽	浓度(μg/ml)	蛋白表达的倍数增加
					IL-8RB	CXCR-4	CCR2
		SEQ IDNO：1	10	1.0				1.0	1.0
SEQ IDNO：1	50				1.3±0.05	1.3±0.03	1.3±0.03
		SEQ IDNO：1	100	2.4±0.6				1.6±0.23	1.8±0.15
SEQ IDNO：3	100				2.0±0.6	没有做	4.5
		CEMA	50	1.6±0.1				1.5±02	1.5±0.15

100

3.6±0.8

没有做

4.7±1.1

                    实施例7

        阳离子肽导致的MAP激酶的磷酸化

[00139]以2.5×10⁵-5×10⁵个细胞/ml的密度接种细胞，并让其过夜。在早晨，用无血清的培养基洗细胞一次(无血清培养基-4小时)。去掉该培养基并换之以PBS，然后于37℃放置15分钟，再于室温15分钟。加入肽(浓度为0.1μg/ml-50μg/ml)或水，温育10分钟。迅速移去PBS，代之以冰冷的放射免疫沉淀(RIPA)缓冲液和抑制剂(NaF、B-甘油磷酸、MOL、钒酸盐、PMSF、亮抑蛋白酶肽抑蛋白酶肽)。将培养板在冰上摇动10-15分钟，或者摇至细胞裂解，收集裂解物。对于THP-1细胞，步骤稍有不同；要使用更多的细胞(5×10⁶)。它们在缺乏血清的情况下过夜，加入1ml冰冷的PBS以停止反应，然后放置在冰上5-10分钟，旋转沉淀，然后用RIPA重悬。使用蛋白质分析(Pierce，Rockford，IL.)测定蛋白浓度。细胞裂解物(20μg蛋白)用SDS-PAGE分离，并转移到硝酸纤维素膜上。该膜用10mM Tris-HCl，pH7.5，150mMNaCl(TBS)/5％脱脂奶粉封闭1小时，然后在冷的含有第一抗体的TBS/0.05％Tween 20中过夜温育。用TBS/0.05％Tween 20清洗30分钟后，再于室温与辣根过氧化酶偶联的羊抗鼠IgG(1∶10,000，在TBS/0.05％ Tween 20中)温育1小时。用TBS/0.1％Tween 20清洗该膜30分钟后，利用增强化学发光(ECL)检测可以看到免疫反应性条带。对于使用外周血单核细胞的实验：外周血(50-100ml)采自所有个体。在Ficoll-Hypaque上通过密度梯度离心从外周血分离出单核细胞。间期细胞(单核细胞)被回收、洗涤，然后重悬于含有10％胎小牛血清(FCS)和1％L-谷酰胺的推荐的细胞培养的首要培养基(RPMI-1640)中。以每孔4×10⁶个细胞的密度将细胞加到6孔培养板中，于37℃在5％CO₂气体中放置1小时，让黏附发生。洗去浮在表面的培养基和未黏附的细胞，加入适当的培养基和肽。由它们排斥台盼蓝的能力估计新鲜收获的细胞中应有＞99％存活。用肽进行刺激后，在各种磷酸酶抑制剂和激酶抑制剂存在的情况下，用RIPA缓冲液裂解细胞，收集裂解物。分析蛋白含量，将各个样品的大约30μg加载到12％SDS-PAGE凝胶上。将胶中蛋白转移点到硝酸纤维素上，用含有5％脱脂奶粉和1％Triton X 100的Tris缓冲盐(TBS)封闭1小时。用磷酸化特异性抗体检测磷酸化。

[00140]由肽诱导的磷酸化的结果总结于表46。发现在鼠巨噬RAW细胞系和HBE细胞中，SEQ ID NO：2导致p3 8和ERK1/2发生剂量依赖的磷酸化。在THP-1人单核细胞系中，SEQ ID NO：3导致MAP激酶的磷酸化，在鼠RAW细胞系中，SEQ ID NO：3导致ERK1/2的磷酸化。

[00141]表47：在对肽的应答中MAP激酶的磷酸化。

细胞系	肽	MAP激酶磷酸化的
				p38	ERK1/2
		RAW 264.7	SEQ ID NO：3			-	+
SEQ ID NO：2	+			+
			HBE		SEQ ID NO：3		+
SEQ ID NO：2	+	+
				THP-1	SEQ ID NO：3	+	+
SEQ ID NO：2

[00142]表48：在人血单核细胞中MAP激酶的肽磷酸化(SEQ ID NO：1，50μg/ml)被用来促进磷酸化。

P38磷酸化		ERK1/2磷酸化
				15分钟	60分钟	15分钟	60分钟
+	-	+	+

                            实施例8

            阳离子肽通过强化免疫应答对细菌感染进行防御

[00143]通过腹膜内注射对BALB/c鼠施以1×10⁵沙门氏菌和阳离子肽(200μg)。对鼠进行24小时监测，此时它们死亡，取出脾脏，匀浆化，重悬于PBS，涂在含有卡那霉素(50μg/ml)的Luria Broth琼脂平板上。平板于37℃温育过夜，对存活细菌进行计数(表49和50)。通过腹膜内注射对CD-1鼠施以含有1×10⁸金黄葡萄球菌的5％猪粘蛋白液和阳离子肽(200μg)(表51)。对鼠进行3天的监测，此时它们死亡，取出血液，涂板，计算活细胞数。通过腹膜内(IP)注射对CD-1雄鼠施以5.8×10⁶ CFU EHEC细菌和阳离子肽(200μg)，监测3天(表52)。在这些动物模型的每一个中都有一部分肽表现出对感染的防御。当将表49和50中的防御分析结果与表31-37中的基因表达结果作比较时，发现在沙门氏菌模型中最具防御性的肽能够诱导上皮细胞中共同的一套基因(表53)。这清楚地表明基因表达的谱型与肽展示防御的能力是一致的。最小抑制浓度(MIC)测试的结果(表54)表明，这些阳离子肽中有许多并不直接抵抗微生物。这表明肽防御感染的能力依赖于该肽刺激宿主先天免疫的能力，而不是依赖于直接的抗微生物活性。

[00144]表49：在BALB/c鼠中阳离子肽对沙门氏菌感染的影响。将沙门氏菌和肽腹膜内注射到BALB/c鼠中，24小时后，这些动物无痛死亡，取出脾脏，匀浆化，用PBS稀释，平板计数，确定细菌存活数。

肽处理	脾脏中的存活细菌(CFU/ml)	统计显著性(p值)
			对照	2.70±0.84X105
SEQ ID NO：1	1.50±0.26X105	0.12
			SEQ ID NO：6	2.57±0.72X104	0.03
SEQ ID NO：13	3.80±0.97X104	0.04
			SEQ ID NO：17	4.79±1.27X104	0.04
SEQ ID NO：27	1.01±0.26X105	0.06

[00145]表50：在BALB/c鼠中阳离子肽对沙门氏菌感染的影响。将沙门氏菌和肽腹膜内注射到BALB/c鼠中，24小时后，这些动物无痛死亡，取出脾脏，匀浆化，用PBS稀释，平板计数，确定细菌存活数。

肽处理	脾脏中的存活细菌(CFU/ml)
		对照	1.88±0.16X104
SEQ ID NO：48	1.98±0.18X104
		SEQ ID NO：26	7.1±1.37X104
SEQ ID NO：30	5.79±0.43X103
		SEQ ID NO：37	1.57±0.44X104
SEQ ID NO：5	2.75±0.59X104
		SEQ ID NO：7	5.4±0.28X103
SEQ ID NO：9	1.23±0.87X104
		SEQ ID NO：14	2.11±0.23X103
SEQ ID NO：20	2.78±0.22X104
		SEQ ID NO：23	6.16±0.32X104

[00146]表51：在鼠的金黄葡萄球菌感染模型中阳离子肽的效应。将含有1×10⁸细菌的5％猪粘蛋白液腹膜内(IP)注射到CD-1鼠中。经由单独的一次腹膜内注射施以阳离子肽(200μg)。监测3天，这些鼠无痛死亡，取出血液，涂板计算存活数。下列的肽在控制金黄葡萄球菌感染方面是没有效果的：SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：26。

处理	CFU/ml(血液)	#存活的鼠(3天)/该组的鼠总数
			没有肽	7.61±1.7X103	6/8
SEQ ID NO：1	0	4/4
			SEQ ID NO：27	2.25±0.1X102	3/4
SEQ ID NO：30	1.29±0.04X102	4/4
			SEQ ID NO：37	9.65±0.41X102	4/4
SEQ ID NO：5	3.28±1.7X103	4/4
			SEQ ID NO：6	1.98±0.05X102	3/4
SEQ ID NO：7	3.8±0.24X103	4/4
			SEQ ID NO：9	2.97±0.25X102	4/4
SEQ ID NO：13	4.83±0.92X103	3/4
			SEQ ID NO：17	9.6±0.41X102	4/4
SEQ ID NO：20	3.41±1.6X103	4/4
			SEQ ID NO：23	4.39±2.0X103	4/4

[00147]表52：在鼠的EHEC感染模型中阳离子肽的效应。将5.8×10⁶CFU EHEC细菌腹膜内(IP)注射到CD-1雄鼠(5周大)中。经由单独的一次腹膜内注射施以阳离子肽(200μg)。对这些鼠进行3天的监测。

处理	肽	存活(％)
			对照	无	25
SEQ ID NO：23	200μg	100

[00148]表53：在体内有活性的肽诱导A549上皮细胞中基因表达谱型的增量调节。发现在用浓度为50μg/ml的肽SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：13处理4小时后，每一种肽都增加了一套基因的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时，分离RNA，转化为标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多聚核苷酸的强度显示在第二列(用Cy3和Cy5标记cDNA两种情况的平均值)。增量调节倍数一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。表中还包括作为阴性对照的肽SEQ ID NO：37，它在鼠的感染模型中没有活性。

目标(登记号)

未刺激的细胞强度

基因表达相对于未处理的细胞的增量调节倍数

		SEQ IDNO：30	SEQ IDNO：7	SEQ IDNO：13	SEQ IDNO：37
						锌指蛋白(AF061261)	13	2.6	9.4	9.4	1.0
细胞周期基因(S70622)	1.62	8.5	3.2	3.2	0.7
						IL-10受体(U00672)	0.2	2.6	9	4.3	0.5
转移酶(AF038664)	0.09	12.3	9.7	9.7	0.1
						同源框蛋白(AC004774)	0.38	3.2	2.5	2.5	1.7
分叉头型蛋白(AF042832)	0.17	14.1	3.5	3.5	0.9
						未知(AL096803)	0.12	4.8	4.3	4.3	0.6
KIAA0284蛋白(AB006622)	0.47	3.4	2.1	2.1	1.3
						假想蛋白(AL022393)	0.12	4.4	4.0	4.0	0.4
受体(AF112461)	0.16	2.4	10.0	10.0	1.9
						假想蛋白(AK002104)	0.51	4.7	2.6	2.6	1.0
蛋白(AL050261)	0.26	3.3	2.8	2.8	1.0
						多肽(AF105424)	0.26	2.5	5.3	5.3	1.0
SPR1蛋白(AB031480)	0.73	3.0	2.7	2.7	1.3
						脱氢酶(D17793)	4.38	2.3	2.2	2.2	0.9
转移酶(M63509)	0.55	2.7	2.1	2.1	1.0
						过氧化物酶体因子(AB013818)	0.37	3.4	2.9	2.9	1.4

[00149]表54：在此研究的多数阳离子肽，特别是在感染模型中有效的阳离子肽并不是明显抗微生物的。将系列稀释的肽与指定的细菌在96孔板中温育过夜。杀死该细菌的肽的最低浓度表示为MIC。符号＞表示MIC太大而不能测量。8μg/ml或更低的MIC被认为是临床上有意义的活性。缩写：E.coli，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)；S.aureus，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；P.aerug，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；S.typhim，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellaenteritidis ssp.typhimurium)，C.rhod(Citobacter rhodensis)；EHEC，肠出血性大肠埃希氏菌(Enterohaemorrhagic E.coli)。

肽	MIC(μg/ml)
							E.coli	S.aureus	P.aerug	S.typhim	C.rhod	EHEC
	多黏菌素	0.25	16	0.25	0.5	0.25							0.5
庆大霉素							0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.5

SEQ ID NO：1	32	＞	96	64	8	4
							SEQ ID NO：5	128	＞	＞	＞	64	64
SEQ ID NO：6	128	＞	＞	128	64	64
							SEQ ID NO：7	＞	＞	＞	＞	＞	＞
SEQ ID NO：8	＞	＞	＞	＞	＞	＞
							SEQ ID NO：9	＞	＞	＞	＞	＞	＞
SEQ ID NO：10	＞	＞	＞	＞	＞	64
							SEQ ID NO：12	＞	＞	＞	＞	＞	＞
SEQ ID NO：13	＞	＞	＞	＞	＞	＞
							SEQ ID NO：14	＞	＞	＞	＞	＞	＞
SEQ ID NO：15	128	＞	＞	＞	128	64
							SEQ ID NO：16	＞	＞	＞	＞	＞	＞
SEQ ID NO：17	＞	＞	＞	＞	＞	＞
							SEQ ID NO：19	8	16	16	64	4	4
SEQ ID NO：2	4	16	32	16	64
							SEQ ID NO：20	8	8	8	8	16	8
SEQ ID NO：21	64	64	96	64	32	32
							SEQ ID NO：22	8	12	24	8	4	4
SEQ ID NO：23	4	8	8	16	4	4
							SEQ ID NO：24	16	16	4	16	16	4
SEQ ID NO：26	0.5	32	64	2	2	0.5
							SEQ ID NO：27	8	64	64	16	2	4
SEQ ID NO：28	＞	＞	＞	64	64	128
							SEQ ID NO：29	2	＞	＞	16	32	4
SEQ ID NO：30	16	＞	128	16	16	4
							SEQ ID NO：31	＞	＞	128	＞	＞	64
SEQ ID NO：33	16	32	＞	16	64	8
							SEQ ID NO：34	8	＞	＞	32	64	8
SEQ ID NO：35	4	128	64	8	8	4
							SEQ ID NO：36	32	＞	＞	32	32	16
SEQ ID NO：37	＞	＞	＞	＞	＞	＞
							SEQ ID NO：38	0.5	32	64	4	8	4
SEQ ID NO：40	4	32	8	4	4	2
							SEQ ID NO：41	4	64	8	8	2	2
SEQ ID NO：42	1.5	64	4	2	2	1
							SEQ ID NO：43	8	128	16	16	8	4
SEQ ID NO：44	8	＞	128	128	64	64
							SEQ ID NO：45	8	＞	128	128	16	16
SEQ ID NO：47	4	＞	16	16	4	4
							SEQ ID NO：48	16	＞	128	16	1	2
SEQ ID NO：49	4	＞	16	8	4	4
							SEQ ID NO：50	8	＞	16	16	16	8

SEQ ID NO：51	4	＞	8	32	4	8
							SEQ ID NO：52	8	＞	32	8	2	2
SEQ ID NO：53	4	＞	8	8	16	8
							SEQ ID NO：54	64	＞	16	64	16	32

                                实施例9

        由细菌信号传导分子诱导的多聚核苷酸在诊断/筛选中的应用

[00150]鼠伤寒沙门氏菌LPS和E coli 0111：B4 LPS购自SigmaChemical Co.(St.Louis，MO)。将金黄葡萄球菌的LTA(Sigma)重悬于无内毒素的水(Sigma)中。对LTA制备物开展鲎变形细胞溶解物试验(Sigma)以确定其没有受到明显的内毒素污染(即，小于1ng/nl，这个浓度并不会导致RAW细胞产生明显的细胞因子产物)。使用Applied Biosystem(应用生物系统公司)(Missisauga，ON.)的Model 392DNA/RNA合成仪合成CpG寡聚脱氧核苷酸，经纯化后重悬于无内毒素的水(Sigma)中。使用如下序列CpG：5′-TCATGACGTTCCTGACGTT-3′(SEQ ID NO：57)和非CpG：5′-TTCAGGACTTTCCTCAGGTT-3′(SEQ ID NO：58)。测试了非CpG寡聚物刺激细胞因子生成的能力，发现它没有导致TNF-α或IL-6的明显产生，因此可看作一种阴性对照。将RAW 264.7细胞与单独的培养基、100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、1μg/ml金黄葡萄球菌LTA或1μM CpG共同温育4小时(这些浓度可最佳地诱导RAW细胞产生肿瘤坏死因子(TNF-α))，再从这些细胞中分离出RNA。使用该RNA制备出多聚核苷酸cDNA探针，将其与Clontech Atlas多聚核苷酸阵列滤膜杂交，如前面所述。cDNA探针与各个固定化DNA的杂交可以通过放射自显影法显现，并且可以使用磷光显像系统进行定量。表55-59总结了至少2-3个独立实验的结果。发现用LPS处理RAW 264.7细胞导致超过60种多聚核苷酸的表达量增加，这些多聚核苷酸编码的蛋白包括炎症蛋白，例如IL-1β、诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2α、CD40和多种转录因子。将LPS、LTA和CpG DNA诱导的多聚核苷酸表达的变化进行比较，发现所有这三种细菌产物都以相类似的程度增加促炎多聚核苷酸的表达，例如iNOS、MIP-1α、MIP-2α、IL-1β、IL-15、TNFR1和NF-κB(表57)。表57描述了被细菌产物以类似的程度增量调节的19种多聚核苷酸，它们的刺激比值在这三种细菌产物间的差异不超过1.5倍。也有几种多聚核苷酸是被LPS、LTA和CpG以类似的程度减量调节。还发现在对这三种细菌产物的应答中，有许多多聚核苷酸是被不同地调节的(表58)，包括其表达水平在一种或多种细菌产物间的差异大于1.5倍的许多多聚核苷酸。与LPS或CpG相比较而言，表达受LTA处理差异影响的多聚核苷酸最多，包括对Jun-D、Jun-B、Elk-1和细胞周期蛋白G2和A1的超量刺激。仅仅有一些多聚核苷酸的表达被LPS或CpG处理更多地改变。与LTA或CpG处理相比较而言，LPS处理更能够增加一些多聚核苷酸的表达，包括cAMP应答元件DNA结合蛋白(CRE-BP)、干扰素诱导性蛋白1和CACCC框结合蛋白BKLF。与LPS或LTA处理相比较而言，CpG处理更能够增加一些多聚核苷酸的表达，包括白血病抑制因子(LIF)和蛋白酶连接蛋白1(PN-1)。这些结果表明，尽管LPS、LTA和CpGDNA刺激表达应答的多聚核苷酸大部分重叠，但是它们对某些多聚核苷酸的调节也表现出不同的能力。

[00151]被使用的其它多聚核苷酸阵列是Human Operon阵列(该基因组的识别号是PRHU04-S1)，它由点成双份的约14,000个人寡聚体点组成。用5μg总RNA制备探针，探针用Cy 3或Cy 5标记的dUTP进行标记。在这些实验中，将A549上皮细胞涂到100mm组织培养皿中，密度为每个培养皿2.5×10⁶个细胞，过夜温育，然后用100ng/ml E.coliO111：B4 LPS刺激4小时。用RNAqueous(Ambion)分离总RNA。用除DNA试剂盒(Ambion)除去DNA污染。由总RNA制备的探针经纯化后杂交到印刷玻璃片上，42℃过夜，然后洗涤。洗涤之后，用Perkin Elmer阵列扫描仪获取图象。用图象处理软件(Imapolynucleotide5.0，Marina Del Rey，CA)确定点的平均强度，中间强度和背景强度。使用“自制的”程序除去背景。该程序将每个子小格的底部强度计算为10％，并对每个小格减去此值。使用Polynucleotidespring软件(Redwood City，CA)进行分析。从一个玻片内的点的数值集合中获得中间点强度，并将该值与此实验中所有玻片的数值比较，从而使每个点的强度标准化。LPS处理的细胞和对照细胞之间的相对变化可以在下面的表格中看到。表60描述了许多以前未曾报道的变化，它们在诊断感染方面将是有用的。

[00152]为了证实和评估这些变化在功能上的显著性，通过密度分析法对所选择的mRNA和蛋白的水平进行估计和定量。应用CD14、波形蛋白和三重四脯氨酸碱性蛋白特异性探针进行Northern印迹杂交，证明用所有三种细菌产物进行刺激后出现的是类似的表达(表60)。应用Griess试剂估计炎症介导物NO的水平，发现24小时后产生的NO水平是可比较的，由于NO的水平可作为一氧化氮合成酶iNOS的酶活的标志，因此可知iNOS表达的增量调节是类似的(表59)。Western印迹杂交分析证明CpG更优先地刺激白血病抑制因子(LIF，细胞因子IL-6家族的成员)(表59)。其他的验证性实验证明，LPS增量调节TNF-α和IL-6的表达，如ELISA的分析结果；还增量调节MIP-2α和IL-1βmRNA的表达和减量调节DP-1和细胞周期蛋白D mRNA的表达，如Northern印迹杂交的结果。通过检测细菌元件刺激全血中促炎细胞因子生成的能力，可以将该分析扩展到与临床更相关的体外系统。发现E.coli LPS、鼠伤寒沙门氏菌LPS和金黄葡萄球菌LTA都刺激类似生成量的血清TNF-α和IL-1β。CpG也刺激这些细胞因子的产生，尽管其水平要低得多，但还是部分地支持了细胞系的数据。

[00153]表55：A549上皮细胞中被E coli O111：B4 LPS增量调节的多聚核苷酸。多聚核苷酸微阵列的研究表明，E coli O111：B4 LPS(100ng/ml)增加许多多聚核苷酸的表达。将LPS与A549细胞共同温育4小时，分离出RNA。用5μg总RNA制备用Cy3/Cy5标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的细胞中的强度显示在表55的第三列。“比值：LPS/对照”一列是指被LPS刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

登记号	基因	对照：只有培养基强度	比值：LPS/对照
				D87451	环指蛋白10	715.8	183.7
AF061261	C3H型锌指蛋白	565.9	36.7
				D17793	醛-酮还原酶家族1，成员C3	220.1	35.9
M14630	胸腺素原α	168.2	31.3
				AL049975	未知	145.6	62.3

L04510	ADP-核糖基化因子结构域蛋白1，64kD	139.9	213.6
				U10991	G2蛋白	101.7	170.3
U39067	真核翻译起始因子3，亚基2	61.0	15.9
				X03342	核糖体蛋白L32	52.6	10.5
NM_004850	Rho相关的，含有卷曲螺旋的蛋白激酶2	48.1	11.8
				AK000942	未知	46.9	8.4
AB040057	丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MASK	42.1	44.3
				AB020719	KIAA0912蛋白	41.8	9.4
AB007856	FEM-1样死亡受体结合蛋白	41.2	16.7
				J02783	原胶原-脯氨酸，2-氧代戊二酸4-双加氧酶	36.1	14.1
AL137376	未知	32.5	17.3
				AL137730	未知	29.4	11.9
D25328	磷酸果糖激酶，血小板	27.3	8.5
				AF047470	苹果酸脱氢酶2，NAD	25.2	8.2
M86752	应激诱导性磷蛋白1	22.9	5.9
				M90696	组织蛋白酶S	19.6	6.8
AK001143	未知	19.1	6.4
				AF038406	NADH脱氢酶	17.7	71.5
AK000315	假想蛋白FLJ20308	17.3	17.4
				M54915	pim-1癌基因	16.0	11.4
D29011	蛋白酶体亚基，β型，5	15.3	41.1
				AK000237	胆碱能突触小泡的膜蛋白	15.1	9.4
AL034348	未知	15.1	15.8
				AL161991	未知	14.2	8.1
AL049250	未知	12.7	5.6
				AL050361	PTD017蛋白	12.6	13.0
U74324	RAB相互作用性因子	12.3	5.2
				M22538	NADH脱氢酶	12.3	7.6
D87076	KIAA0239蛋白	11.6	6.5
				NM_006327	(酵母)线粒体内膜异位酶23的同源物	11.5	10.0
AK001083	未知	11.1	8.6
				AJ001403	粘蛋白5，亚型B，气管支气管的	10.8	53.4

M64788	RAP1，GTP酶激活蛋白1	10.7	7.6
				X06614	视黄酸受体，α	10.7	5.5
U85611	钙和整连蛋白结合蛋白	10.3	8.1
				U23942	细胞色素P450，51	10.1	10.2
AL031983	未知	9.7	302.8
				NM_007171	蛋白-甘露糖基转移酶	9.5	6.5
AK000403	假想蛋白FLJ20396	9.5	66.6
				NM_002950	核糖体受体蛋白I	9.3	35.7
L05515	cAMP应答元件结合蛋白CRE-BPa	8.9	6.2
				X83368	磷酸肌醇3-激酶，催化的，γ多肽	8.7	27.1
M30269	巢蛋白(enactin)	8.7	5.5
				M91083	染色体11开放阅读框架13	8.2	6.6
D29833	唾液的富含脯氨酸的蛋白	7.7	5.8
				AB024536	含有富含亮氨酸的重复序列的免疫球蛋白超家族	7.6	8.0
U39400	染色体11开放阅读框架4	7.4	7.3
				AF028789	unc119(C.elegans)同源物	7.4	27.0
NM_003144	信号序列受体，α(易位子相关蛋白α)	7.3	5.9
				X52195	花生四烯酸5-脂加氧酶激活蛋白	7.3	13.1
U43895	人生长因子调节性酪氨酸激酶底物	6.9	6.9
				L25876	细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物3	6.7	10.3
L04490	NADH脱氢酶	6.6	11.1
				Z18948	S100钙结合蛋白	6.3	11.0
D10522	肉豆蔻酰基化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物	6.1	5.8
				NM_014442	唾液酸结合Ig样凝集素8	6.1	7.6
U81375	溶质载体家族29	6.0	6.4
				AF041410	恶性肿瘤相关蛋白	5.9	5.3
U24077	杀伤细胞免疫球蛋白样受体	5.8	14.4
				AL137614	假想蛋白	4.8	6.8
NM_002406	甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖氨基转移酶	4.7	5.3

AB002348	KIAA0350蛋白	4.7	7.6
				AF165217	原肌球条件蛋白4(肌肉)	4.6	12.3
Z14093	支链酮酸脱氢酶E1，α多肽	4.6	5.4
				U82671	钙牵蛋白	3.8	44.5
AL050136	未知	3.6	5.0
				NM_005135	溶质载体家族12	3.6	5.0
AK001961	假想蛋白FLJ11099	3.6	5.9
				AL034410	未知	3.2	21.3
S74728	antiquitin 1	3.1	9.2
				AL049714	核糖体蛋白L34假基因2	3.0	19.5
NM_014075	PRO0593蛋白	2.9	11.5
				AF189279	磷脂酶A2，IIE类	2.8	37.8
J03925	整连蛋白，αM	2.7	9.9
				NM_012177	F框蛋白Fbx5	2.6	26.2
NM_004519	电压门控钾通道，KQT样亚家族，成员3	2.6	21.1
				M28825	CD1A抗原，多肽	2.6	16.8
X16940	肌动蛋白，γ2，肠平滑肌	2.4	11.8
				X03066	II类主要组织相容性复合物，DOβ	2.2	36.5
AK001237	假想蛋白FLJ10375	2.1	18.4
				AB028971	KIAA1048蛋白	2.0	9.4
AL137665	未知	2.0	7.3

[00154]表56：A549上皮细胞中被E coli O111：B4 LPS减量调节的多聚核苷酸。多聚核苷酸微阵列的研究表明，E coli O111：B4 LPS(100ng/ml)降低了A549细胞中许多多聚核苷酸的表达。将LPS与A549细胞共同温育4小时，分离出RNA。用5μg总RNA制备用Cy3/Cy5标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的细胞中的强度显示在表格5的第三列。“比值：LPS/对照”一列是指被LPS刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

登记号	基因	对照：只有培养基强度	比值：LPS/对照
				NM_017433	肌球蛋白IIIA	167.8	0.03
X60484	H4组蛋白家族成员E	36.2	0.04

X60483	H4组蛋白家族成员D	36.9	0.05
				AF151079	假想蛋白	602.8	0.05
M96843	DNA结合的抑制蛋白2，负显性螺旋-环-螺旋蛋白	30.7	0.05
				S79854	脱碘酶，碘代甲腺原氨酸，III型	39.4	0.06
AB018266	matrin 3	15.7	0.08
				M33374	NADH脱氢酶	107.8	0.09
AF005220	人NUP98-HOXD13融合蛋白的mRNA，部分cds	105.2	0.09
				Z80783	H2B组蛋白家族，成员L	20.5	0.10
Z46261	H3组蛋白家族，成员A	9.7	0.12
				Z80780	H2B组蛋白家族，成员H	35.3	0.12
U33931	红血球膜蛋白带7.2(stomatin)	18.9	0.13
				M60750	H2B组蛋白家族，成员A	35.8	0.14
Z83738	H2B组蛋白家族，成员E	19.3	0.15
				Y14690	胶原蛋白，V型，α2	7.5	0.15
M30938	XRCC5，X射线修复，补充中国仓鼠细胞的缺陷修复功能	11.3	0.16
				L36055	真核翻译起始因子4E结合蛋白	182.5	0.16
Z80779	H2B组蛋白家族，成员G	54.3	0.16
				AF226869	5(3)-脱氧核糖核酸酶；RB相关性KRAB阻遏物	7.1	0.18
D50924	KIAA0134基因产物	91.0	0.18
				AL133415	波形蛋白	78.1	0.19
AL050179	原肌球蛋白1(α)	41.6	0.19
				AJ005579	RD元件	5.4	0.19
M80899	AHNAK细胞核蛋白	11.6	0.19
				NM_004873	BCL2相关性athanogene 5	6.2	0.19
X57138	H2A组蛋白家族，成员N	58.3	0.20
				AF081281	溶血磷脂酶I	7.2	0.22
U96759	von Hippel-Linau结合蛋白I	6.6	0.22
				U85977	人核糖体蛋白L12假基因，部分cds	342.6	0.22
D13315	乙二醛酶	7.5	0.22
				AC003007	未知	218.2	0.22
AB032980	RU2S	246.6	0.22

U40282	整连蛋白关联性激酶	10.1	0.22
				U81984	内皮PAS结构域蛋白1	4.7	0.23
X91788	氯通道，核苷酸敏感的，1A	9.6	0.23
				AF018081	胶原蛋白，XVIII型，α1	6.9	0.24
L31881	细胞核因子I/X(CCAAT结合性转录因子)	13.6	0.24
				X61123	B细胞易位基因1，抗增殖	5.3	0.24
L32976	促细胞分裂剂激活性蛋白激酶激酶激酶11	6.3	0.24
				M27749	免疫球蛋白λ样多肽3	5.5	0.24
X57128	H3组蛋白家族，成员C	9.0	0.25
				X80907	磷酸肌醇-3-激酶，调节性亚基，多肽2	5.8	0.25
Z34282	人类粘蛋白的(MAR11)MUC5AC mRNA(部分)	100.6	0.26
				X00089	H2A组蛋白家族，成员M	4.7	0.26
AL035252	CD39样2	4.6	0.26
				X95289	I类MHC区域的PERB11家族成员	27.5	0.26
AJ001340	U3 snoRNP相关性55kDa蛋白	4.0	0.26
				NM_014161	HSPC071蛋白	10.6	0.27
U60873	未知	6.4	0.27
				X91247	硫氧还蛋白还原酶1	84.4	0.27
AK001284	假想蛋白FLJ10422	4.2	0.27
				U90840	滑膜肉瘤，X breakpoint 3	6.6	0.27
X53777	核糖体蛋白L17	39.9	0.27
				AL035067	未知	10.0	0.28
AL117665	DKFZP586M1824蛋白	3.9	0.28
				L14561	ATP酶，钙离子转运，质膜1	5.3	0.28
L19779	H2A组蛋白家族，成员O	30.6	0.28
				AL049782	未知	285.3	0.28
X00734	微管蛋白，β，5	39.7	0.29
				AK001761	视黄酸诱导性3	23.7	0.29
U72661	ninjurin 1	4.4	0.29
				S48220	脱碘酶，碘代甲腺原氨酸，I型	1,296.1	0.29
AF025304	EphB2	4.5	0.30

S82189	胰凝乳蛋白酶C	4.1	0.30
				Z80782	H2B组蛋白家族，成员K	31.9	0.30
X68194	突触小泡蛋白样蛋白	7.9	0.30
				AB028869	未知	4.2	0.30
AK000761	未知	4.3	0.30

[00155]表57：被细菌产物LPS、LTA和CpG DNA刺激后，以类似的程度表达的多聚核苷酸。发现细菌产物(100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、1μg/ml金黄葡萄球菌LTA或1μM CpG)有效地诱导数种多聚核苷酸的表达。将细菌产物与RAW细胞共同温育4小时，分离出RNA，转变为标记的cDNA探针，并将其与Atlas阵列杂交。未被刺激的对照细胞中的强度显示在第二列。“比值：LPS/LTA/CpG：对照”一列是指被细菌产物刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

登记号	对照未刺激强度	比值LPS：对照	比值LTA：对照	比值CpG：对照	蛋白/多聚核苷酸
						M15131	20	82	80	55	IL-1β
M57422	20	77	64	90	三重四脯氨酸碱性蛋白
						X53798	20	73	77	78	MIP-2α
M35590	188	50	48	58	MIP-1β
						L28095	20	49	57	50	ICE
M87039	20	37	38	45	iNOS
						X57413	20	34	40	28	TGFβ
X15842	20	20	21	15	c-rel原癌多聚核苷酸
						X12531	489	19	20	26	MIP-1α
U14332	20	14	15	12	IL-15
						M59378	580	10	13	11	TNFR1
U37522	151	6	6	6	TRAIL
						M57999	172	3.8	3.5	3.4	NF-κB
U36277	402	3.2	3.5	2.7	I-κB(α亚基)
						X76850	194	3	3.8	2.5	MAPKAP-2
U06924	858	2.4	3	3.2	Stat1
						X14951	592	2	2	2	CD18
X60671	543	1.9	2.4	2.8	NF-2
						M34510	5970	1.6	2	1.4	CD14
X51438	2702	1.3	2.2	2.0	波形蛋白
						X68932	4455	0.5	0.7	0.5	c-Fms

Z21848	352	0.5	0.6	0.6	DNA聚合酶
						X70472	614	0.4	0.6	0.5	B-myb

[00156]表58：被细菌产物LPS、LTA和CpG DNA有差异地调节的多聚核苷酸。发现细菌产物(100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、1μg/ml金黄葡萄球菌LTA或1μM CpG)有效地诱导数种多聚核苷酸的表达。将细菌产物与RAW细胞共同温育4小时，分离出RNA，转变为标记的cDNA探针，并将其与Atlas阵列杂交。未被刺激的对照细胞中的强度显示在第二列。“比值：LPS/LTA/CpG：对照”一列是指被细菌产物刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。

登记号	对照未刺激强度	比值LPS：对照	比值LTA：对照	比值CpG：对照	蛋白/多聚核苷酸
						X72307	20	1.0	23	1.0	肝细胞生长因子
L38847	20	1.0	21	1.0	肝癌跨膜激酶配体
						L34169	393	0.3	3	0.5	血小板生成素
J04113	289	1	4	3	Nur77
						Z50013	20	7	21	5	H-ras原癌多聚核苷酸
X84311	20	4	12	2	细胞周期蛋白A1
						U95826	20	5	14	2	细胞周期蛋白G2
X87257	123	2	4	1	Elk-1
						J05205	20	18	39	20	Jun-D
J03236	20	11	19	14	Jun-B
						M83649	20	71	80	42	Fas 1受体
M83312	20	69	91	57	CD40L受体
						X52264	20	17	23	9	ICAM-1
M13945	573	2	3	2	Pim-1
						U60530	193	2	3	3	Mad相关蛋白
D10329	570	2	3	2	CD7
						X06381	20	55	59	102	白血病抑制因子(LIF)
X70296	20	6.9	13	22	蛋白酶连接蛋白1(PN-1)
						U36340	20	38	7	7	CACCC框结合蛋白BKLF
S76657	20	11	6	7	CRE-BPI
						U19119	272	10	4	4	干扰素诱导性蛋白1

[00157]表59：证实表57和表58的阵列数据。a)总RNA分离自未刺激的RAW巨噬细胞和用100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、1μg/ml金黄葡萄球菌LTA、1μM CpG DNA或单独的培养基处理了4小时的细胞，实施Northern印迹杂交，探查膜上的GAPDH、CD14、波形蛋白和三重四脯氨酸碱性蛋白，如以前所述[Scott等]。将Northern印迹的杂交强度与GAPDH作比较，以发现上样方面的不一致。这些实验至少被重复三次，表示的数据是各种条件相对于培养基的平均水平(使用密度分析法测量)±标准偏差。

b)用100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、1μg/ml金黄葡萄球菌LTA、1μMCpG DNA或单独的培养基刺激RAW 264.7细胞24小时。制备蛋白裂解物，在SDS-PAGE凝胶上分离，实施Western印迹杂交以检测LIF(R&D系统)。这些实验至少被重复三次，表示的数据是LIF相对于培养基的水平(使用密度分析法测量)±标准偏差。

c)用100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、1μg/ml金黄葡萄球菌LTA、1μMCpG DNA或单独的培养基刺激RAW巨噬细胞24小时，收集细胞上清，使用Griess试剂检测上清中的NO形成量，NO量是用稳定的NO代谢物亚硝酸盐的积累量来估计的，方法如前面所述[Scott等]。表示的数据是三个实验的平均值±标准偏差。

产物	相对水平
					未处理	LPS	LTA	CpG
	CD14a	1.0	2.2±0.4	1.8±0.2					1.5±0.3
波形蛋白a					1.0	1.2±0.07	1.5±0.05	1.3±0.07
	三重四脯氨酸碱性蛋白a	1.0	5.5±0.5	5.5±1.5					9.5±1.5
LIFb					1.0	2.8±1.2	2.7±0.6	5.1±1.6
	NOc	8±1.5	47±2.5	20±3					21±1.5

[00158]表60：A549人上皮细胞中被细菌信号传导分子(LPS)增量调节的基因表达谱型。多聚核苷酸微阵列的研究表明，E coli O111：B4LPS(100ng/ml)增加A549细胞中许多多聚核苷酸的表达。将LPS与A549细胞共同温育4小时，分离出RNA。用5μg总RNA制备Cy3/Cy5标记的cDNA探针，并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的细胞中的强度显示在表55的第三列。被LPS刺激的细胞中的多聚核苷酸表达变化的这些例子代表着它们与未处理的细胞相比，强度水平的变化在2倍以上。

登记号	基因
		AL050337	干扰素γ受体1
U05875	干扰素γ受体2
		NM_002310	白血病抑制因子受体
U92971	凝固作用因子II(凝血酶)受体样2
		Z29575	肿瘤坏死因子受体超家族成员17
L31584	趋化因子受体7
		J03925	cAMP应答元件结合蛋白
M64788	RAP1，GTP酶激活蛋白
		NM_004850	Rho相关性激酶2
D87451	环指蛋白10
		AL049975	未知
U39067	真核翻译起始因子3，亚基2
		AK000942	未知
AB040057	丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MASK
		AB020719	KIAA0912蛋白
AB007856	FEM-1样死亡受体结合蛋白
		AL137376	未知
AL137730	未知
		M90696	组织蛋白酶S
AK001143	未知
		AF038406	NADH脱氢酶
AK000315	假想蛋白FLJ20308
		M54915	pim-1癌基因
D29011	蛋白酶体亚基，β型，5
		AL034348	未知
D87076	KIAA0239蛋白
		AJ001403	气管支气管粘蛋白5，亚型B，
J03925	整连蛋白，αM

                    实施例10

            改变信号传导以防御细菌感染

[00159]鼠伤寒沙门氏菌株SL1344由美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)获得，在Luria-Bertani(LB)液体培养基中培养。为了实施巨噬细胞感染，将冷冻的甘油储物接种到盛于125ml摇瓶的10ml LB中，37℃振荡过夜培养至稳定相。将RAW 264.7细胞(1×10⁵个细胞/孔)接种到24孔板中。用培养基稀释细菌直至可获得标称复合感染(MOI)，约为100，通过1000rpm的10分钟离心使细菌离心到单层细胞上，以使感染同步发生，再让感染于37℃在5％CO₂培养箱中继续进行20分钟。用PBS洗细胞3次以除去细胞外的细菌，然后将细胞在含有100μg/ml庆大霉素(Sigma，St.Louis，MO)的DMEM+10％FBS中温育以杀死任何残留的细胞外细菌，避免再感染。两小时后，将庆大霉素浓度降至10μg/ml，并在整个分析中维持该值。细胞在感染前用具有以下浓度的抑制剂预处理30分钟：50μMPD98059(Calbiochem)，50μM U 0126(Promega)，2mM二苯碘(DPI)，250μM乙酰香兰酮(夹竹桃麻素，Aldrich)，1mM抗坏血酸(Sigma)，30mM N-乙酰半胱氨酸(Sigma)和2mM N^G-L-一甲基精氨酸(L-NMMA，Molecular Probe)或2mM N^G-D-一甲基精氨酸(D-NMMA，Molecular Probe)。在感染后的即刻、2小时和6-8小时再加入新鲜的抑制剂，以保证效力。对照细胞用每毫升培养基同等体积的二甲基亚砜(DMSO)处理。鼠伤寒沙门氏菌SL1344在细胞内的存活/复制用庆大霉素抗性分析测定，如以前所述。简单地说，在感染后2小时和24小时，细胞用PBS洗两次以除去庆大霉素，用含有1％TritonX-100/0.1％SDS的PBS裂解，细胞内的细菌数目由LB琼脂平板上的菌落数计算出。在这些感染条件下，由标准的平板计数估计，巨噬细胞平均每个细胞含有一个细菌，这样便可在感染后的24小时对巨噬细胞进行分析。细菌的纤丝化(filamentation)与细菌应力(stress)有关。NADPH氧化酶和iNOS能被MEK/ERK信号传导激活。结果(表61)清楚的说明，改变细胞信号传导是可藉以解决细胞内沙门氏菌感染的一种方法。由于细菌增量调节人细胞内的多种基因，所以阻断信号传导的这种策略代表了抗感染治疗的一种普遍方法。

[00160]表61：在IFN-γ致敏的RAW细胞中信号传导分子MEK对细胞内细菌的影响。

处理a	效果b
		0	无

MEK抑制剂U0126	降低细菌纤丝化(细菌应力)c增加细胞内鼠伤寒沙门氏菌数目
		MEK抑制剂PD98059	降低细菌纤丝化(细菌应力)c增加细胞内鼠伤寒沙门氏菌数目
NADPH氧化酶抑制剂d	降低细菌纤丝化(细菌应力)c增加细胞内鼠伤寒沙门氏菌数目

                    实施例11

                    抗病毒活性

[00161]SDF-1是一种C-X-C趋化因子，它是HIV-1共受体CXCR-4的自然配体。为了抑制HIV-1的复制，考虑趋化因子受体CXCR-4和CCR5作为可能的目标。SDF-1的晶体结构表现出反平行的β-片层和带正电荷的表面，这些特征对于其结合CXCR-4中带负电荷的细胞外环是非常重要的。这些发现说明，趋化因子衍生物、小的CXCR4拮抗剂，或模拟趋化因子的结构或离子性质的激动剂都可以成为治疗X4 HIV-1感染的有用试剂。发现阳离子肽抑制SDF-1诱导的T细胞迁移，这暗示这些肽可以用作CXCR-4拮抗剂。迁移分析如下进行。用趋化性培养基(RPMI 1640/10mM Hepes/0.5％BSA)将人Jurkat T细胞重悬至5×10⁶个细胞/ml。利用5μm聚碳酯Transwell插件(Costar)在24孔板中实施迁移分析。简单地说，肽或对照用趋化性培养基稀释，并置于下位腔中，同时将0.1ml细胞(5×10⁶个/ml)加入到上位腔中。37℃3小时后，用流式细胞仪测定迁移到下位腔中的细胞数目。下位腔的培养物用30秒的时间穿过FACscan，开启前部和侧部分散器以排出细胞碎片。将活细胞的数目与“100％迁移对照”作比较，对于后者，5×10⁵个细胞被直接移液到下位腔中，然后用FACscan计数30秒。结果说明，肽的加入导致人Jurkat T细胞的迁移受到抑制(表62)，这很可能是因为CXCR-4的表达受到影响(表63和64)。

[00162]表62：肽抑制人Jurkat T细胞的迁移：

	迁移(％)
					实验	阳性对照	SDF-1(100ng/ml)	SDF-1+SEQ ID 1(50μg/ml)	阴性对照
1	100％	32％	0％	＜0.01％

2

100％

40％

0％

0％

[00163]表63：对应于表56的多聚核苷酸阵列数据：

多聚核苷酸/蛋白	多聚核苷酸功能	未刺激强度	比值肽：未刺激	登记号
					CXCR-4	趋化因子受体	36	4	D87747

[00164]表64：对应于表62和63的FACs数据：

肽	浓度(μg/ml)	蛋白表达的倍数增加CXCR-4
			SEQ ID NO：1	10	没有变化
SEQ ID NO：1	50	1.3±0.03
			SEQ ID NO：1	100	1.6±0.23
SEQ ID NO：3	100	1.5±0.2

[00164]尽管本发明已经通过引用优选的实施方案被描述，但是应该理解，可以在不脱离本发明的精神的情况下作出各种改变。因此，本发明仅受权利要求的限制。

Claims (20)

1.包含通式X₁X₂X₃IX₄PX₄IPX₅X₂X₁(SEQ ID NO：4)的被分离的阳离子肽，其中X₁是一个或两个R、L或K，X₂是一个C、S或A，X₃是一个R或P，X₄是一个A或V，X₅是一个V或W。

2.根据权利要求1的阳离子肽，其中该肽选自：LLCRIVPVIPWCK(SEQ ID NO：5)，LRCPIAPVIPVCKK(SEQ ID NO：6)，KSRIVPAIPVSLL(SEQ ID NO：7)，KKSPIAPAIPWSR(SEQ ID NO：8)，RRARIVPAIPVARR(SEQ ID NO：9)和LSRIAPAIPWAKL(SEQ ID NO：10)。

3.根据权利要求1的阳离子肽，其中该肽具有抗炎症活性。

4.根据权利要求1的阳离子肽，其中该肽具有抗脓毒症活性。

5.根据权利要求1-4中任何一项的阳离子肽，其中所述的肽包含至少一个D-对映异构体的氨基酸。

6.根据权利要求1-4中任何一项的阳离子肽，其中所述的肽是环状的。

7.根据权利要求1-4中任何一项的阳离子肽，其中所述的肽是反向的。

8.根据权利要求5的阳离子肽，其中所述的肽是环状的。

9.根据权利要求5的阳离子肽，其中所述的肽是反向的。

10.根据权利要求6的阳离子肽，其中所述的肽是反向的。

11.根据权利要求8的阳离子肽，其中所述的肽是反向的。

12.由SEQ ID NO：4示出的阳离子肽在制造用于刺激个体的先天免疫的药物中的应用，其中治疗上有效量的所述肽被包含在所述药物中。

13.根据权利要求12的应用，其中所述的先天免疫被MAP激酶通路的激活所证明。

14.根据权利要求13的应用，其中所述的MAP激酶是MEK和/或ERK。

15.根据权利要求12的应用，其中所述的肽具有抗炎症活性。

16.根据权利要求12的应用，其中所述的肽具有抗脓毒症活性。

17.根据权利要求12的应用，其中所述的肽包含至少一个D-对映异构体的氨基酸。

18.根据权利要求12的应用，其中所述的肽是环状的。

19.根据权利要求1或2的阳离子肽，其中所述肽的氨基酸是D构型并且是按反向的序列连接。

20.根据权利要求19的阳离子肽，其中所述肽的所有氨基酸是D对映异构体。