JP2005536985A - 先天性免疫のエフェクター - Google Patents
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Abstract
1以上の敗血症または炎症誘導因子により調節され、ペプチドにより阻害されるポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドパターンを同定する方法を記載する。炎症又は敗血症の応答の抑制についてのポリヌクレオチド発現パターンを同定する方法を記載する。この方法は、細胞と、LPS、LTA、CpG DNA及び/又は微生物全体若しくは微生物成分とを、ペプチドの存在下又は不在下で接触させるステップ;該ペプチドの存在下及び不在下における細胞のポリヌクレオチド発現パターンを検出するステップを含み、該ペプチドの存在下におけるパターンが炎症又は敗血症の応答の抑制を示すものである。また、本発明の方法により同定された化合物及び薬剤を包含する。別の態様において、本発明は、被験体における先天性免疫を増強するための方法及び化合物を提供する。
Description
本発明は、一般にペプチドに関し、詳しくは、微生物感染に起因する病理に関連する治療および医薬品の発見に有効であり、また先天性免疫または抗炎症活性の調節に有効なペプチドに関する。
本願は、米国特許法第119条(e)項に基づき、米国特許出願第60/336,632号(2001年12月3日出願)に基づく優先権を主張する。なお、前記出願の全文は参照により本明細書に組み入れるものとする。
感染性疾患は世界的に主要な死因である。1999年の世界保健機構の研究によれば、1300万人以上が毎年感染性疾患で死亡している。感染性疾患は北アメリカでは死因の3番目であり、毎年死者の20%を占め、1980年以来50%増加している。また、多くの内科的および外科的治療の成功は、感染性疾患の制御にかかっている。抗生物質の発見とその使用は近代医療の偉大なる業績の1つであった。抗生物質がなければ、医師は、複雑な手術、化学療法、または大部分の医療介入(カテーテル法など)を実施することは不可能であろう。
抗生物質の経常販売高は世界的に見て260億USドルである。しかし、抗生物質の過剰使用と時折ある不適当な使用により、細菌の新規な抗生物質耐性株が進化してきた。抗生物質耐性は医療上の特徴の1つとなっている。バンコマイシン耐性腸球菌(VRE)、およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)などの細菌株は、抗生物質では治療することが困難であり、かかる細菌に感染している患者は死亡することも多い。抗生物質の発見は新しい医薬品開発において最も困難な分野の1つであることが分かり、多くの大規模な製薬会社は、自社の抗生物質開発計画を縮小するか、あるいは完全に中止した。しかし、治療不可能な感染症の出現をはじめとする抗生物質耐性の劇的な増加に伴って、新しいタイプの抗微生物治療に対して明らかに未解決な医学上のニーズがあり、先天性免疫に影響を及ぼす薬剤がかかるクラスの薬剤の一例であろう。
先天性免疫系は効力が高く、かつ進化した全身的な防御系である。先天性免疫の成分は常時低濃度で存在し、刺激があった場合に非常に急速に活性化される。刺激には、身体細胞の表面上のパターン認識受容体と細菌性シグナル伝達分子との相互作用、または他の疾患の作用機構が含まれる。毎日、ヒトが摂取する食品および水、ヒトが呼吸する空気、ならびにヒトが触れる表面、ペットおよびヒトを介して、ヒトは何万もの潜在的病原微生物にさらされている。先天性免疫系はこれらの病原体から疾病が発生するのを予防するように作用する。先天性免疫系はいわゆる適応免疫(抗体ならびに抗原特異的Bリンパ球およびTリンパ球が含まれる)とは異なる。その理由は、先天性免疫系は、常時存在し、即時に有効であり、かつ侵入したいかなる病原体に対しても相対的に非特異的であるからである。一方、適応免疫系は特異的な認識成分の増幅を必要とするので、したがって、応答までに数日から数週間かかる。ワクチン接種により適応免疫が予め刺激されている場合でさえ、病原体に応答するのに3日以上を要するが、先天性免疫は即時にまたは急速に(数時間)利用可能である。先天性免疫には、食細胞、捕体などをはじめとする種々のエフェクター機能が含まれているが、一般には未だに明らかではない。概して言えば、多くの先天性免疫反応は、宿主細胞の表面上にあるToll様受容体と呼ばれるパターン認識受容体に微生物のシグナル伝達分子が結合することによって「誘発される」。これらのエフェクター機能の多くは炎症反応として一まとめにされている。しかし、あまりにも重篤な炎症反応は身体に有害な反応をもたらし、極端な場合には、敗血症が生じ、死に至る可能性がある。
感染時に感染因子から構造成分が放出されると炎症反応が生じ、チェックされない場合、潜在的致死症状の敗血症に至る可能性がある。毎年北アメリカでは約780,000人の敗血症患者が発生している。敗血症は、肺炎などの群集(community)の中で感染した結果発症し得る。あるいは、外傷、癌または大手術の治療における併発症であり得る。身体が炎症反応に耐えられなくなり、身体器官が衰え始めると、重篤な敗血症が発症する。米国では、毎年敗血症により最高120,000人が死亡している。また、敗血症では、血液中に病原微生物または毒素が含まれる可能性があり(例えば毒血症(septicemia))、それはヒトにおける主要な死因となっている。グラム陰性菌はかかる疾患に最も一般に関連している生物である。しかし、グラム陽性菌も感染の増加している原因である。グラム陰性菌およびグラム陽性菌、ならびにこれらの成分はすべて敗血症を引き起こす可能性がある。
微生物成分が存在すると、前炎症性サイトカインの放出が誘導されるが、そのうち、腫瘍壊死因子−α(TNF−α)が極めて重要である。TNF−αおよび他の前炎症性サイトカインは、次いで他の前炎症性媒介因子の放出を引き起こし、炎症カスケードをもたらす。グラム陰性菌敗血症は、通常、細菌外膜成分のリポ多糖類(LPS;内毒素とも称する)の放出によって発症する。内毒素血と呼ばれる血液中の内毒素は、主として細菌感染が原因であり、抗生物質による治療の間、放出され得る。グラム陽性菌敗血症は、細菌細胞壁成分、例えば、ストレプトコッカス属菌によって産生されるリポタイコ酸(LTA)、ペプチドグリカン(PG)、ラムノース−グルコースポリマー、またはスタフィロコッカス属菌によって産生される莢膜ポリサッカライドの放出によって発症し得る。また、哺乳動物DNAと異なり、メチル化されていないシトシン・グアノシン二量体(CpG DNA)を高頻度で含有する細菌DNAまたは他の哺乳動物以外のDNAは、敗血症の症状(TNF−αの産生を含む)を誘導することがわかっている。哺乳動物DNAは、非常に低い頻度でCpGジヌクレオチドを含有するが、多くの場合メチル化形態である。細菌感染時におけるこれらの自然的な放出の他に、抗生物質による治療もまた細菌細胞壁成分のLPSおよびLTA、ならびに恐らくは細菌DNAの放出を引き起こす。その結果、抗生物質治療は、感染からの回復を妨げるか、あるいは敗血症を発症させる可能性がある。
カチオン性ペプチドは、科学文献および特許文献で認識されている主な作用は抗菌作用であるが(Hancock, R. E. W.およびR. Lehrer、1998、Cationic peptides:a new source of antibiotics、Trends in Biotechnology 16:82〜88頁)、感染に対する防御形態が次第に認められてきている。抗菌活性を有しているカチオン性ペプチドは多種多様な生物から単離されている。自然界において、かかるペプチドは、微生物(例えば、細菌および酵母)に対する防御機構を付与している。一般に、これらのカチオン性ペプチドは、細胞膜と相互に作用することにより、またほとんどの場合、チャンネルまたは損傷を形成することにより、細菌に対してペプチドの持つ抗菌活性を発現すると考えられている。グラム陰性菌では、ペプチドはLPSと相互作用して外膜の透過性を上昇させ、外膜を通過する自己促進型の取り込みを引き起こし、かつ細胞膜に接近する。カチオン性抗菌性ペプチドの例としては、インドリシジン、ディフェンシン、セクロピンおよびマガイニンが挙げられる。
抗生物質機能とエフェクター機能が無関係であるかどうかは知られていなかったが、最近、かかるペプチドが先天性免疫の他の局面におけるエフェクターであることが次第に認識されてきている(Hancock, R. E. W.およびG. Diamond、2000、The role of cationic peptides in innate host defenses、Trends in Microbiology 8:402〜410頁;Hancock, R. E. W.、2001、Cationic peptides:effectors in innate immunity and novel antimicrobials、Lancet Infectious Diseases 1:156〜164頁)。
あるカチオン性ペプチドは、細菌産生物、例えばLPSおよびLTAに結合する親和性を有している。かかるカチオン性ペプチドはLPSに応答したサイトカイン産生を抑制することができ、程度を変化させることで致死ショックを防ぐことができる。しかし、かかる影響が、ペプチドがLPSおよびLTAに結合することに基づくかどうか、あるいはペプチドと宿主細胞との直接的な相互作用によるかどうかに関しては未だ証明されていない。カチオン性ペプチドは、微生物または微生物シグナル伝達分子、例えばLPSによる攻撃に応答して、哺乳動物免疫系(Toll様受容体および転写因子であるNFκBを含む)によって使用されている調節経路に似た調節経路により誘導される。したがって、カチオン性ペプチドは、先天性免疫における重要な機能を有すると思われる。抗菌性ペプチドの誘導に影響を及ぼす突然変異は、細菌性攻撃に応答して生存率を低減させる可能性がある。同様に、抗真菌ペプチド発現の低下をもたらすショウジョウバエのToll経路の突然変異は、死に至る真菌感染の罹患性を高める。ヒトでは、α−ディフェンシンを完全に欠失している特定顆粒欠乏症候群に罹患している患者は、重篤な細菌感染にかかることが多い。他の証拠としては、感染因子によるいくつかのペプチドの誘導性と、炎症部位で記録された極めて高い濃度が挙げられる。また、カチオン性ペプチドは、細菌感染と戦う白血球の能力を促進するために、細胞遊走を調節することができる。例えば、2種類のヒトα−ディフェンシンペプチド(HNP−1およびHNP−2)は、マウスおよびヒトのT細胞並びに単球の直接的な走化性活性を有し、ヒトβ−ディフェンシンは、CCR6との相互作用を介して未熟な樹状細胞および記憶T細胞に対して化学走性誘因物質として作用すると考えられることが開示されている。同様に、ブタのカチオン性ペプチドであるPR−39は、好中球に対して走化性であることが分かっている。しかし、異なる構造および組成物のペプチドがこれらの特性を共有しているかどうかについては未だ明らかではない。
ヒト由来の1つの既知のカテリシジンLL−37は、骨髄系前駆細胞、精巣、炎症性疾患時のヒトケラチン細胞、および気道上皮により産生される。カテリシジンペプチドの特長は、カテリンドメインと称されるN末端プレプロ領域での高レベルの配列相同性である。カテリシジンペプチドは不活性プロペプチド前駆体として蓄積され、刺激されると活性ペプチドへとプロセシングされる。
米国特許出願第60/336,632号
Hancock, R. E. W.およびR. Lehrer、1998、Cationic peptides:a new source of antibiotics、Trends in Biotechnology 16:82〜88頁
Hancock, R. E. W.およびG. Diamond、2000、The role of cationic peptides in innate host defenses、Trends in Microbiology 8:402〜410頁
Hancock, R. E. W.、2001、Cationic peptides:effectors in innate immunity and novel antimicrobials、Lancet Infectious Diseases 1:156〜164頁
本発明は、内毒素性リポ多糖、リポタイコ酸、CpG DNAまたは他の細胞成分(例えば、微生物またはそれらの細胞成分)によって調節され、かつカチオン性ペプチドにより影響を受けるポリヌクレオチド発現パターンに基づいた独創性に富んだ発見に基づくものであり、被験体の敗血症および/または炎症を阻止または縮小する新規な化合物をスクリーニングすることができる。さらに、本発明はツールとしてのカチオン性ペプチドの使用に基づくものであり、敗血症反応を引き起こすことなく、炎症および/または敗血症の応答を遮断/抑制することができる先天性免疫の選択的エンハンサーを同定することができる。
したがって、一実施形態では、1以上の敗血症誘導因子または炎症誘導因子により調節され、かつカチオン性ペプチドにより阻害されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドパターンを同定する方法を提供する。本発明の方法は、1または複数の上記ポリヌクレオチドを1種以上の敗血症誘導因子または炎症誘導因子と接触させるステップ、それと同時にまたはその直後に、1または複数の上記ポリヌクレオチドをカチオン性ペプチドと接触させるステップを含む。発現の差はカチオン性ペプチドの存在下および不在下で検出され、発現の変化、すなわち、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションは、敗血症誘導因子または炎症誘導因子により調節され、かつカチオン性ペプチドにより阻害されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドパターンを示す。別の態様では、本発明は、上記の方法によって同定される1個のポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを提供する。敗血症または炎症調節因子の例としては、LPS、LTAもしくはCpG DNA、または微生物成分(またはこれらの任意の組合せ)、あるいは関連の因子が挙げられる。
別の実施形態では、本発明は、敗血症または炎症を阻止する薬剤を同定する方法であって、上述した方法により同定されたポリヌクレオチドと薬剤とを組み合わせるステップを含み、薬剤の存在下におけるポリヌクレオチドの発現が、薬剤の不在下における発現と比較してモジュレートされ、かつ発現のモジュレーションが炎症または敗血症の応答に影響を及ぼすものである、上記方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、1)細胞と、LPS、LTAおよび/またはCpG DNAとを、カチオン性ペプチドの存在下または不在下で接触させるステップ、2)前記ペプチドの存在下または不在下における細胞のポリヌクレオチド発現パターンを検出するステップにより、炎症または敗血症の応答の抑制についてのポリヌクレオチド発現パターンを同定する方法を提供する。ペプチドの存在下で得られるパターンは、炎症または敗血症の応答の抑制を示すものである。別の態様では、ペプチドの存在下で得られるパターンを試験化合物のパターンと比較して同様のパターンを提供する化合物を同定する。別の態様では、本発明は、前述の方法によって同定される化合物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、先天性免疫に関与するポリペプチドをコードする1または複数のポリヌクレオチドを対象の薬剤と接触させることによって、先天性免疫を増強する薬剤を同定する方法であって、薬剤の存在下におけるポリヌクレオチドの発現が、薬剤の不在下におけるポリヌクレオチドの発現と比較してモジュレートされ、かつ発現がモジュレートされると先天性免疫の増強が起こるものである、上記方法を提供する。好ましくは、薬剤は被験体の敗血症反応を刺激はしない。一態様では、薬剤は抗炎症性ポリヌクレオチドの発現を高める。具体的には、これらに限定されるものではないが、抗炎症性ポリヌクレオチドは、例えば、IL−1 Rアンタゴニストホモログ1(AI167887)、IL−10 Rβ(AA486393)、IL−10 Rα(U00672)、TNF受容体メンバー1B(AA150416)、TNF受容体メンバー5(H98636)、TNF受容体メンバー11b(AA194983)、HLA IIのIKサイトカインダウンレギュレーター(R39227)、TGF−B誘導性初期増殖応答2(AI473938)、CD2(AA927710)、IL−19(NM_013371)またはIL−10(M57627)などのタンパク質をコードする。一態様においては、薬剤は、NF−κB活性化に関与するプロテアソームサブユニット(例えば、プロテアソームサブユニット26S(NM_013371))をコードするポリヌクレオチドの発現を低下させる。一態様では、薬剤は、プロテインキナーゼのアンタゴニストとして作用し得る。一態様では、薬剤は配列番号4〜54から選択されるペプチドである。
別の実施形態では、本発明は、先天性免疫を選択的に増強する化合物を同定するためのポリヌクレオチド発現パターンを同定する方法を提供する。本発明は、カチオン性ペプチドの存在下および不在下で接触された細胞のポリヌクレオチド発現パターンを検出するステップであって、ペプチドの存在下におけるパターンが先天性免疫の刺激を表わすものであるステップ、試験化合物の存在下で接触された細胞のポリヌクレオチド発現パターンを検出するステップであって、カチオン性ペプチドの存在下において確認されるパターンに類似している試験化合物を用いたパターンが先天性免疫を増強する化合物を示すものであるステップとを含む。この化合物は被験体における敗血症の反応を刺激しないことが好ましい。
別の実施形態では、本発明は、核酸サンプル中で、非感染の被験体と比較した場合の、表50、51および/または52の少なくとも2個のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド発現の上昇により例示されるポリヌクレオチド発現パターンを同定することによって、哺乳動物被験体の感染の状態を被験体の核酸サンプルから推測する方法を提供する。さらに、上述のすべての方法によって得られるポリヌクレオチド発現パターンも含まれる。
別の態様では、CXCR−4のアンタゴニストであるカチオン性ペプチドを提供する。さらに、別の態様では、試験ペプチドの存在下または不在下においてT細胞をSDF−1と接触させるステップ、走化性を測定するステップによって、CXCR−4のアンタゴニストであるカチオン性ペプチドを同定する方法を提供する。試験ペプチドの存在下における走化性の低下は、CXCR−4のアンタゴニストであるペプチドを示している。また、カチオン性ペプチドはSDF−1受容体ポリヌクレオチド(NM_013371)の発現を低下させるように作用する。
上述のすべての方法では、本発明の化合物または薬剤としては、これらに限定されるものではないが、ペプチド、カチオン性ペプチド、ペプチド擬似体、化学化合物、ポリペプチド、核酸分子等が挙げられる。
さらに別の態様では、本発明は単離されたカチオン性ペプチドを提供する。本発明の単離されたカチオン性ペプチドは、以下の一般式の1つと一文字アミノ酸コードによって表わされる:
一般式:X1X2X3IX4PX4IPX5X2X1(配列番号4)(式中、X1は1個または2個のR、LまたはKであり、X2は1個のC、SまたはAであり、X3は1個のRまたはPであり、X4は1個のAまたはVであり、X5は1個のVまたはWである);
X1LX2X3KX4X2X5X3PX3X1(配列番号11)(式中、X1は1個または2個のD、E、S、TまたはNであり、X2は1個または2個のP、GまたはDであり、X3は1個のG、A、V、L、IまたはYであり、X4は1個のR、KまたはHであり、X5は1個のS、T、C、MまたはRである);
X1X2X3X4WX4WX4X5K(配列番号18)(式中、X1はA、PまたはRから選択される1〜4個であり、X2は1個または2個の芳香族アミノ酸(F、YおよびW)であり、X3は1個のPまたはKであり、X4はA、P、YまたはWから選択される1個もしくは2個、または0個であり、X5はRまたはPから選択される1〜3個である);
X1X2X3X4X1VX3X4RGX4X3X4X1X3X1(配列番号25)(式中、X1は1個または2個のRまたはKであり、X2は極性アミノ酸または荷電アミノ酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、RおよびH)であり、X3はC、S、M、DまたはAであり、X4はF、I、V、MまたはRである);
X1X2X3X4X1VX5X4RGX4X5X4X1X3X1(配列番号32)(式中、X1が1個または2個のRまたはKであり、X2は極性アミノ酸または荷電アミノ酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、RおよびH)であり、X3は1個のC、S、M、DまたはAであり、X4は1個のF、I、V、MまたはRであり、X5は1個のA、I、S、M、DまたはRである);
KX1KX2FX2KMLMX2ALKKX3(配列番号39)(式中、X1は極性アミノ酸(C、S、T、M、NおよびQ)であり、X2は1個のA、L、SまたはKであり、X3はG、A、V、L、I、P、F、S、T、KおよびHから選択される1〜17個のアミノ酸である);
KWKX2X1X1X2X2X1X2X2X1X1X2X2IFHTALKPISS(配列番号46)(式中、X1は疎水性アミノ酸であり、X2は親水性アミノ酸である)。
一般式:X1X2X3IX4PX4IPX5X2X1(配列番号4)(式中、X1は1個または2個のR、LまたはKであり、X2は1個のC、SまたはAであり、X3は1個のRまたはPであり、X4は1個のAまたはVであり、X5は1個のVまたはWである);
X1LX2X3KX4X2X5X3PX3X1(配列番号11)(式中、X1は1個または2個のD、E、S、TまたはNであり、X2は1個または2個のP、GまたはDであり、X3は1個のG、A、V、L、IまたはYであり、X4は1個のR、KまたはHであり、X5は1個のS、T、C、MまたはRである);
X1X2X3X4WX4WX4X5K(配列番号18)(式中、X1はA、PまたはRから選択される1〜4個であり、X2は1個または2個の芳香族アミノ酸(F、YおよびW)であり、X3は1個のPまたはKであり、X4はA、P、YまたはWから選択される1個もしくは2個、または0個であり、X5はRまたはPから選択される1〜3個である);
X1X2X3X4X1VX3X4RGX4X3X4X1X3X1(配列番号25)(式中、X1は1個または2個のRまたはKであり、X2は極性アミノ酸または荷電アミノ酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、RおよびH)であり、X3はC、S、M、DまたはAであり、X4はF、I、V、MまたはRである);
X1X2X3X4X1VX5X4RGX4X5X4X1X3X1(配列番号32)(式中、X1が1個または2個のRまたはKであり、X2は極性アミノ酸または荷電アミノ酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、RおよびH)であり、X3は1個のC、S、M、DまたはAであり、X4は1個のF、I、V、MまたはRであり、X5は1個のA、I、S、M、DまたはRである);
KX1KX2FX2KMLMX2ALKKX3(配列番号39)(式中、X1は極性アミノ酸(C、S、T、M、NおよびQ)であり、X2は1個のA、L、SまたはKであり、X3はG、A、V、L、I、P、F、S、T、KおよびHから選択される1〜17個のアミノ酸である);
KWKX2X1X1X2X2X1X2X2X1X1X2X2IFHTALKPISS(配列番号46)(式中、X1は疎水性アミノ酸であり、X2は親水性アミノ酸である)。
さらに別の態様では、本発明は、単離されたカチオン性ペプチド、KWKSFLRTFKSPVRTVFHTALKPISS(配列番号53)およびKWKSYAHTIMSPVRLVFHTALKPISS(配列番号54)を提供する。
さらに、本発明のカチオン性ペプチドをコードする核酸配列、かかるポリヌクレオチドを含むベクター、およびベクターを含有する宿主細胞をも提供する。
本発明は、ポリヌクレオチド発現をモジュレート(例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレート)する能力を有し、それによって敗血症および炎症の応答、ならびに/または先天性免疫を調節する、一連の一般式を特徴とする新規なカチオン性ペプチドを提供する。
本明細書で使用する「先天性免疫」は、生物が病原体による侵入から自己防衛する自然能力を意味する。本明細書で使用する病原体または微生物としては、これらに限定されるものではないが、細菌、真菌、寄生生物およびウィルスが挙げられる。先天性免疫は、生物が、特異性、増幅能力および自己対非自己の識別を特徴とする抗体および/または免疫リンパ球に実質的に基づいた防御機構を発現させる後天性免疫/適応免疫と対比される。先天性免疫では、広範な非特異的免疫が提供され、事前曝露による免疫記憶はない。先天性免疫の特徴は、多種多様の潜在的病原体に対する有効性、病原体への事前曝露の非依存性、および即時有効性(誘導されるまでに数日から数週間必要な特異的免疫反応とは対照的)である。さらに、先天性免疫には、他の疾患、例えば、癌、炎症性疾患、多発性硬化症、種々のウィルス感染等に影響を及ぼす免疫反応が含まれる。
本明細書では、「カチオン性ペプチド」という用語は、アミノ酸長が約5個から約50個のアミノ酸配列を意味する。一態様では、本発明のカチオン性ペプチドは、約10個から約35個のアミノ酸長である。また、pKa値が9.0を越える十分に正に荷電したアミノ酸を含んでいる場合には、ペプチドは「カチオン性」である。典型的には、カチオン性ペプチドの少なくとも2個のアミノ酸残基は正電荷を帯びており、その例としてはリジンまたはアルギニンが挙げられる。「正に荷電した」とは、pH7.0の正味の正電荷を有しているアミノ酸残基の側鎖を意味する。本発明により組換え産生させうる天然のカチオン性抗菌性ペプチドの例としては、ディフェンシン、カテリシジン、マガイニン、メリチンおよびセクロピン、バクテネシン、インドリシジン、ポリフェムシン、タキプレシン、ならびにこれらの類似体が挙げられる。種々の生物はカチオン性ペプチド(微生物に対する非特異性の防御機構の一部として用いられる分子)を作る。単離された場合、これらのペプチドは、細菌、真菌およびある種の外膜ウィルスをはじめとする種々の微生物にとって有毒である。カチオン性ペプチドは多くの病原体に対して作用するが、注意すべき例外と毒性の様々な程度がある。しかし、本特許では、微生物に対する毒性はないが、先天性免疫の刺激を介して感染を防御する能力を有するさらに別のカチオン性ペプチドを明らかにする。また、本発明は、抗菌活性を有するカチオン性ペプチドに限定されるものではない。実際、本発明で有用な多数のペプチドは抗菌活性を有していない。
当技術分野で既知のカチオン性ペプチドは、例えば、ヒトカテリシジンLL−37、およびウシ好中球ペプチドインドリシジン、並びにバクテネシンのウシ変異体Bac2Aを含む
LL−37 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(配列番号1)、
インドリシジン ILPWKWPWWPWRR−NH2(配列番号2)、
Bac2A RLARIVVIRVAR−NH2(配列番号3)。
LL−37 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(配列番号1)、
インドリシジン ILPWKWPWWPWRR−NH2(配列番号2)、
Bac2A RLARIVVIRVAR−NH2(配列番号3)。
先天性免疫では、免疫反応は抗原に依存しない。先天性免疫過程には、上述の分泌分子および細胞成分の産生が含まれ得る。先天性免疫では、病原体は、生殖細胞系でコードされている受容体によって認識される。これらのToll様受容体は広い特異性を有しており、多数の病原体を認識することができる。カチオン性ペプチドが免疫反応において存在する場合、それらは病原体に対する宿主反応を促進する。免疫反応におけるこの変化によってケモカインの放出が誘導され、それにより感染部位に対する免疫細胞のリクルートを促進する。
ケモカイン、すなわち化学走性誘因物質サイトカインは、走化性現象および他の前炎症現象を媒介する免疫因子のサブグループである(Schall、1991年、Cytokine 3:165〜183頁を参照されたい)。ケモカインは約70〜80残基長の小分子であり、一般に2つのサブグループに分けることができる。αは、単一のアミノ酸によって分離される2つのN末端システインを有するものであり(C×C)、βはN末端に隣接した2つのシステインを有するものである(CC)。RANTES、MIP−1αおよびMIP−1βはβサブグループのメンバーである(Horuk, R.、1994年、Trends Pharmacol. Sci.、15:159〜165頁;Murphy, P. M.、1994年、Annu. Rev. Immunol.、12:593〜633頁を参照されたい)。βケモカインRANTES、MCP−1およびMCP−3のアミノ末端は、これらのケモカインによって誘導される細胞遊走と炎症の仲介に関与している。この関与は、MCP−1のアミノ末端8残基、MCP−3のアミノ末端9残基およびRANTESのアミノ末端8残基の欠失と、RANTESのアミノ末端へのメチオニンの付加が、それらの本来の対応物によって刺激された走化性、カルシウム動員および/または酵素放出に拮抗するという所見によって示唆されている(Gongら、1996年、J. Biol. Chem.、271:10521〜10527頁;Proudfootら、1996年、J. Biol. Chem.、271:2599〜2603頁)。さらに、αケモカイン様走化性活性が、Tyr28とArg30の各々ロイシンとバリンへの二重突然変異を介してMCP−1へ導入されたが、このことは、このタンパク質の内部領域もまた走化性活性を調節する機能を果たしていることを示唆している(Beallら、1992年、J.Biol. Chem.、267:3455〜3459頁)。
これまで特性決定されてきたすべてのケモカインのモノマー形態は、α群およびβ群の四次構造は異なるが、重要な構造上の相同性が共通している。βケモカインとαケモカインのモノマー構造は非常に類似しているが、2つの群の二量体構造は完全に異なる。唯一1個のN末端システインを有している、さらなるケモカイン(リンホタクチン)が同定されており、ケモカインのさらに別のサブグループ(γ)を表わすことができる(Yoshidaら、1995年、FEBS Lett.、360:155〜159頁;およびKelnerら、1994年、Science、266:1395〜1399頁)。
ケモカインの受容体は、Gタンパク質共役型7回膜貫通ドメイン受容体(GCR)の大きなファミリーに属している(Horuk, R.、1994年、Trends Pharmacol. Sci.、15:159〜165頁;およびMurphy、P. M.、1994年、Annu. Rev. Immunol.、12:593〜633頁の概説を参照されたい)。競合結合および交差脱感作の研究では、ケモカイン受容体がリガンド結合においてかなりの無差別結合(promiscuity)を示すことが開示されている。βケモカイン受容体の中で無差別結合を示す例としては、CC CKR−1(RANTESおよびMIP−1αと結合する)(Neoteら、1993年、Cell、72:415〜425頁)、CC CKR-4(RANTES、MIP-1αおよびMCP-1と結合する)(Powerら、1995年、J. Biol. Chem.、270:19495〜19500頁)、およびCC CKR−5(RANTES、MIP−1αおよびMIP−1βと結合する)(Alkhatibら、1996年、Science、近刊、およびDragicら、1996年、Nature、381:667〜674頁)が挙げられる。赤血球は、αケモカインおよびβケモカインの両方と結合する受容体(ダッフィ抗原として既知である)を有する(Horukら、1994年、J. Biol. Chem.、269:17730〜17733頁;Neoteら、1994年、Blood、84:44〜52頁;およびNeoteら、1993年、J. Biol. Chem.、268:12247〜12249頁)。したがって、ケモカインとそれらの受容体の中の明らかな配列と構造上の相同性により、受容体−リガンド相互作用に重複のある場合が多い。
一態様では、本発明は、宿主細胞に直接作用させて敗血症および炎症の応答を縮小することを目的として、本発明のカチオン性ペプチドを含有する化合物の使用を提供する。この態様では、1以上の敗血症または炎症誘導因子によって調節される1または複数のポリヌクレオチドの同定方法であって、前記調節がカチオン性ペプチドにより改変される方法を提供する。かかる敗血症または炎症誘導因子としては、これらに限定されるものではないが、内毒素性リポ多糖(LPS)、リポタイコ酸(LTA)、および/またはCpG DNA、あるいは細菌全体もしくは他の細菌性成分が挙げられる。この同定は、1または複数のポリヌクレオチドを敗血症または炎症誘導因子と接触させること、およびそれと同時にまたはその直後に、さらにカチオン性ペプチドと接触させることによって行われる。カチオン性ペプチドの存在下または不在下におけるポリヌクレオチドの発現が確認されると、発現の変化は、敗血症誘導因子または炎症誘導因子により調節され、かつカチオン性ペプチドにより阻害されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドパターンを示す。別の態様では、本発明は、本方法により同定されるポリヌクレオチドを提供する。
同定されたら、かかるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼすことにより敗血症または炎症を遮断し得る化合物をスクリーニングする方法において有用である。発現に対する影響は、発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかであってよい。敗血症反応を引き起こすことなく、炎症または敗血症の応答を遮断または抑制することができる化合物を同定することによって、本発明は、さらに先天性免疫の増強因子を同定する方法をも提供する。さらに、本発明は、上述の方法で使用または同定される化合物を提供する。
候補化合物は、合成または天然の化合物のライブラリーを含む、種々の起源から得られる。例えば、無作為抽出されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、種々の有機化合物および生体分子の無作為および指定した合成のために多数の手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーも利用可能であり、あるいは容易に作製することができる。さらに、天然ライブラリーまたは合成により作製されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に改変され、コンビナトリアルライブラリーを得るために用いることができる。既知の薬理学的薬剤もまた指定したまたは無作為の化学的改変、例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等を行い、構造上の類似体を得ることができる。また、候補薬剤は、生体分子(これらに限定されるものではないが、ペプチド、ペプチド模倣体、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、化学化合物、誘導体、構造上の類似体、またはこれらの組合せを含む)に見出される。
スクリーニングアッセイの成分のインキュベートには、試験化合物と対象のポリヌクレオチドの間で接触させる条件が含まれる。接触には、溶液、固相、または細胞中での接触が含まれる。試験化合物は、場合によっては、複数の化合物をスクリーニングするためのコンビナトリアルライブラリーであってもよい。本発明の方法で同定される化合物は、溶液中で、または固相担体に結合された後で、化合物の検出に通常適用される任意の方法によって、さらに評価、検出、クローニング、配列決定等を行うことができる。
一般に、本発明の方法では、敗血症または炎症の過程で不可欠のポリヌクレオチドを検出および発見するためにカチオン性ペプチドを利用する。一度同定されると、ポリヌクレオチド発現のパターンは、カチオン性ペプチドの存在下および不在下における発現を調べることにより得ることができる。カチオン性ペプチドの存在下で得られたパターンは、したがって、そのポリヌクレオチドの発現を抑制し、その結果、敗血症または炎症を阻止することができる新たな化合物を同定するのに有用である。非ペプチドの化学物質とペプチド擬似体は、受容体および酵素結合部位に結合するペプチドの能力を模倣することができるので、したがってそれらを用いて生体反応を遮断または刺激することができることは、当業者には周知である。対象のさらなる化合物がカチオン性ペプチドの存在下におけるポリヌクレオチド発現パターンと類似のパターンを提供する場合、その化合物もまた敗血症または先天性免疫反応のモジュレーションに有用である。このように、敗血症および炎症の既知の阻害因子ならびに先天性免疫の増強因子である本発明のカチオン性ペプチドは、敗血症および炎症を抑制し、先天性免疫を増強するさらなる化合物の同定におけるツールとして有用である。
下記の実施例で確認できるように、本発明のペプチドは、LPSによって調節されるポリヌクレオチドの発現を低下させる広範な能力を有している。血液中の高濃度の菌体内毒素は、重篤な感染または炎症時に見られる多数の徴候(例えば、熱および白血球数の増加)の原因である。菌体内毒素はグラム陰性菌の細胞壁の一成分であり、敗血症の病態生理の有望な誘導物質である。炎症および敗血症の基本的機序に関連している。実施例1では、ポリヌクレオチドアレイを利用して、上皮細胞の転写応答におけるカチオン性ペプチドの影響を検出した。具体的には、LPSによって誘導された14,000個以上の異なる特異的ポリヌクレオチドプローブに対する影響を調べた。対照細胞と比較したペプチドを用いて処理した細胞で確認された変化を表に示す。得られたデータは、複数のペプチドがLPSによって誘導されたポリヌクレオチドの発現を低減する能力を有していることを示した。
同様に、実施例2では、グラム陽性およびグラム陰性菌の産物による免疫細胞の刺激を本発明のペプチドが中和しうることを示す。さらに、ある種の前炎症ポリヌクレオチドは、表24に記載のカチオン性ペプチド、例えば、TLR1(AI339155)、TLR2(T57791)、TLR5(N41021)、TNF受容体関連因子2(T55353)、TNF受容体関連因子3(AA504259)、TNF受容体スーパーファミリー、メンバー12(W71984)、TNF受容体スーパーファミリー、メンバー17(AA987627)、小さな誘導性サイトカインサブファミリーB、メンバー6(AI889554)、IL−12Rβ2(AA977194)、IL−18受容体1(AA482489)によってダウンレギュレートされ、一方、抗炎症ポリヌクレオチドは、表25に記載のカチオン性ペプチド、例えば、IL−1Rアンタゴニストホモログ1(AI167887)、IL−10Rβ(AA486393)、TNF受容体メンバー1B(AA150416)、TNF受容体メンバー5(H98636)、TNF受容体メンバー11b(AA194983)、HLA IIのIKサイトカインダウンレギュレーター(R39227)、TGF−B誘導性初期増殖応答2(AI473938)、またはCD2(AA927710)によってアップレギュレートされている。これらの結果の妥当性および用途は、マウスに対するin vivo適用によって確認されている。実施例3は、かかるペプチドが、それらが接触する宿主細胞に対する毒性を一般に示さないことを示している。
実施例4では、本発明のカチオン性ペプチドがマクロファージおよび上皮細胞におけるポリヌクレオチド発現を改変することを理解することができる。この実施例の結果から、前炎症性ポリヌクレオチドはカチオン性ペプチドによりダウンレギュレートされるが(表24)、抗炎症性ポリヌクレオチドはカチオン性ペプチドによりアップレギュレートされる(表25)ことが示される。
別の態様では、本発明は、先天性免疫を増強する薬剤の同定方法を提供する。本方法では、先天性免疫に関与するポリペプチドをコードする宿主細胞の1または複数のポリヌクレオチドを対象の薬剤と接触させる。薬剤の存在下および不在下の両方でポリヌクレオチドの発現を測定する。その発現を比較したところ、特定の発現のモジュレーションが先天性免疫の増強を示した。別の態様では、薬剤は、前炎症性サイトカインTNF−αのアップレギュレーションの欠如から明らかであるように、敗血症の反応を刺激しない。さらに別の態様では、薬剤は、炎症または敗血症の応答を低減または遮断する。また、別の態様では、薬剤は、TNF−αおよび/またはインターロイキン(これらに限定されるものではないが、IL−1β、IL−6、IL−12 p40、IL−12 p70およびIL−8を含む)の発現を低減する。
別の態様では、本発明は、カチオン性ペプチドによる直接的なポリヌクレオチド調節の方法と、先天性免疫の成分を刺激するためのカチオン性ペプチドを含む化合物の使用を提供する。この態様では、本発明は、先天性免疫を増強する化合物を同定するためのポリヌクレオチド発現パターンの同定方法を提供する。本発明の方法では、カチオン性ペプチドの存在下および不在下で接触された細胞のポリヌクレオチド発現パターンが最初に検出される。ペプチドの存在下におけるポリヌクレオチド発現により得られるパターンは、先天性免疫の刺激を表わす。次いで、ポリヌクレオチド発現パターンを試験化合物の存在下において検出するが、この場合、カチオン性ペプチドの存在下で確認されたパターンに類似している試験化合物により得られたパターンは、先天性免疫を増強する化合物を示す。別の態様では、本発明は、上記方法で同定される化合物を提供する。別の態様では、本発明の化合物は、ケモカインまたはケモカイン受容体発現を刺激する。ケモカインまたはケモカイン受容体としては、これらに限定されるものではないが、CXCR4、CXCR1、CXCR2、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、MIP−1α、MDC、MIP−3α、MCP−1、MCP−2、MCP−3、MCP−4、MCP−5およびRANTESが挙げられる。さらに、別の態様では、化合物は、ペプチド、ペプチド擬似体、化学化合物または核酸分子である。
また、別の態様では、ポリヌクレオチド発現パターンは、前炎症性ポリヌクレオチドの発現を含む。かかる前炎症性ポリヌクレオチドとしては、これらに限定されるものではないが、リングフィンガータンパク質10(D87451)、セリン/スレオニンプロテインキナーゼMASK(AB040057)、KIAA0912タンパク質(AB020719)、KIAA0239タンパク質(D87076)、RAP1、GTPase活性化タンパク質1(M64788)、FEM−1様デスレセプター結合タンパク質(AB007856)、カテプシンS(M90696)、推定タンパク質FLJ20308(AK000315)、pim−1癌遺伝子(M54915)、プロテアソームサブユニットβタイプ5(D29011)、KIAA0239タンパク質(D87076)、気道ムチン5サブタイプB(AJ001403)、cAMP応答エレメント結合タンパク質CREBPa、インテグリンαM(J03925)、Rho関連キナーゼ2(NM_004850)、PTD017タンパク質(AL050361)、未知遺伝子(AK001143、AK034348、AL049250、AL16199、AL031983)およびこれらの任意の組合せが挙げられる。さらに別の態様では、ポリヌクレオチド発現パターンは、細胞表面受容体の発現が含まれ、例えば、これらに限定されるものではないが、レチノイン酸受容体(X06614)、Gタンパク質共役型受容体(Z94155、X81892、U52219、U22491、AF015257、U66579)、ケモカイン(C−Cモチーフ)受容体7(L31584)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー17(Z29575)、インターフェロンγ受容体2(U05875)、サイトカイン受容体様因子1(AF059293)、クラスIサイトカイン受容体(AF053004)、凝固因子II(トロンビン)受容体様2(U92971)、白血病抑制因子受容体(NM_002310)、インターフェロンγ受容体1(AL050337)が挙げられる。
例えば、表1〜15では、カチオン性ペプチドは、主として前炎症性の応答をダウンレギュレートし、かつ/または抗炎症の応答をアップレギュレートすることにより、感染因子のシグナル伝達分子に対する宿主応答を中和し、さらに宿主細胞の転写応答を変化させることができることを示している。実施例5では、カチオン性ペプチドが、ケモカインの放出を誘導することにより、病原体に対する宿主応答を促進し、それによって、感染部位への免疫細胞のリクルートが促進されることが明らかである。これらの結果は、マウスへのin vivo適用によって確認されている。
下記の実施例からは、カチオン性ペプチドは、例えば、感染部位への免疫細胞のリクルートを促進する選択的前炎症応答を誘導し、一方で潜在的に有害な前炎症サイトカインは誘導しないことにより、宿主免疫応答の調節を補助するという点で、病原体に対する宿主応答に本質的に影響を及ぼすということが明らかである。敗血症は、部分的には感染因子に対する過度の前炎症性応答によって起こると考えられる。カチオン性ペプチドは、抗炎症反応を誘導し、ある種の潜在的に有害な前炎症性応答を抑制することにより、病原体に対する「バランスのとれた」応答で宿主を助ける。
実施例7では、カチオン性ペプチドと細胞との相互作用効果にある作用機構を調べるために、選択したMAPキナーゼの活性化を検討した。マクロファージは細菌感染に応じてMEK/ERKキナーゼを活性化する。MEKは、MAPキナーゼキナーゼの一種であり、前記キナーゼは、活性化された場合、下流のキナーゼERK(細胞外調節性キナーゼ)をリン酸化し、次いで、それは二量化し、核に転位し、そこでElk−1などの転写因子を活性化してポリヌクレオチド発現を改変する。MEK/ERKキナーゼは、マクロファージ内でサルモネラ菌の複製を低下させることが明らかにされている。MEKキナーゼおよびNADPHオキシダーゼによるシグナル伝達は、細胞内病原体に対する先天性宿主防御に重要な機能を果たすことができる。下記に示すように、MAPキナーゼに作用することにより、カチオン性ペプチドは細菌感染に影響を及ぼす。カチオン性ペプチドは直接キナーゼに影響し得る。表21は、これらに限定されるものではないが、MAPキナーゼポリヌクレオチド発現がペプチドに応答して変化することを実証している。これらのキナーゼには、MAPキナーゼキナーゼ6(H070920)、MAPキナーゼキナーゼ5(W69649)、MAPキナーゼ7(H39192)、MAPキナーゼ12(AI936909)、およびMAPキナーゼ活性化プロテインキナーゼ3(W68281)が挙げられる。
別法では、複数の特性を有する薬剤、すなわち、抗炎症/抗敗血症の活性と、ケモカインを部分的にin vivoで誘導することにより先天性免疫を増強する能力とを有するペプチドを同定するために、本発明の方法を組み合わせて用いることができる。
別の態様では、本発明は、核酸サンプル中で、非感染の被験体と比較して、表55に示す少なくとも2個のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド発現の上昇によって例示されたポリヌクレオチド発現パターンを同定することにより、被験体の核酸サンプルから哺乳動物被験体の感染状態を推測する方法を提供する。別の態様では、本発明は、核酸サンプル中で、非感染の被験体と比較して、表56または表57に示す少なくとも2個のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド発現の上昇によって例示されたポリヌクレオチド発現パターンを同定することにより、被験体の核酸サンプルから哺乳動物被験体の感染状態を推測する方法を提供する。本発明の一態様では、感染状態は、感染因子またはその因子に由来するシグナル伝達分子、例えば、これらに限定されるものではないが、グラム陰性菌およびグラム陽性菌、ウィルス、真菌または寄生生物の因子に起因する。さらに別の態様では、本発明は、上述の方法によって同定される感染状態を有する被験体のポリヌクレオチド発現パターンを提供する。一度同定されると、かかるポリヌクレオチドは、かかる感染因子またはシグナル伝達分子の活性または存在に関連する症状の診断方法において有用である。
下記の実施例10は、本発明のこの態様を説明するものである。詳しくは、表61は、MEKおよびNADPHオキシダーゼ阻害因子(インヒビター)が細菌の複製を制限することができる(ネズミチフス菌によりIFN−γ−初回刺激を受けたマクロファージの感染はMEKキナーゼを誘発する)ことを説明している。これは、宿主細胞シグナル伝達分子を変化させることによって、どれだけ細菌の生存率に大きな影響を及ぼすことができるかを示す実施例である。
本発明の別の態様では、T細胞の走化性が誘導されるストロマ細胞由来因子1(SDF−1)を阻害する化合物を提供する。また、SDF−1受容体の発現を低減する化合物も提供する。さらに、かかる化合物は、CXCR−4のアンタゴニストまたはインヒビターとして作用し得る。一態様では、本発明は、CXCR−4のアンタゴニストであるカチオン性ペプチドを提供する。別の態様では、本発明は、CXCR−4のアンタゴニストであるカチオン性ペプチドを同定する方法を提供する。本方法は、試験ペプチドの存在下または不在下において、T細胞をSDF−1と接触させるステップ、走化性を測定するステップを含む。試験ペプチドの存在下における走化性の低減は、したがって、CXCR−4のアンタゴニストであるペプチドを示す。かかる化合物と方法は、HIV患者の治療用途において有用である。化合物のこれらのタイプとこれらの有用性については、例えば実施例11で説明している(また表62、63も参照されたい)。その実施例では、カチオン性ペプチドが、細胞遊走と、それによる抗ウィルス活性を阻害することが示されている。
一実施形態では、本発明は、一般式(式A):X1X2X3IX4PX4IPX5X2X1(配列番号4)(式中、X1は1個または2個のR、LまたはKであり、X2は1個のC、SまたはAであり、X3は1個のRまたはPであり、X4は1個のAまたはVであり、X5は1個のVまたはWである)のアミノ酸配列を有する単離されたカチオン性ペプチドを提供する。本発明のペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、LLCRIVPVIPWCK(配列番号5)、LRCPIAPVIPVCKK(配列番号6)、KSRIVPAIPVSLL(配列番号7)、KKSPIAPAIPWSR(配列番号8)、RRARIVPAIPVARR(配列番号9)およびLSRIAPAIPWAKL(配列番号10)が挙げられる。
別の実施形態では、本発明は、一般式(式B):X1LX2X3KX4X2X5X3PX3X1(配列番号11)(式中、X1は1個または2個のD、E、S、TまたはNであり、X2は1個または2個のP、GまたはDであり、X3は1個のG、A、V、L、IまたはYであり、X4は1個のR、KまたはHであり、X5は1個のS、T、C、MまたはRである)のアミノ酸配列を有する単離された直鎖状カチオン性ペプチドを提供する。本発明のペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、DLPAKRGSAPGST(配列番号12)、SELPGLKHPCVPGS(配列番号13)、TTLGPVKRDSIPGE(配列番号14)、SLPIKHDRLPATS(配列番号15)、ELPLKRGRVPVE(配列番号16)およびNLPDLKKPRVPATS(配列番号17)が挙げられる。
別の実施形態では、本発明は、一般式(式C):X1X2X3X4WX4WX4X5K(配列番号18)(式中、X1はA、PまたはRから選択される1〜4個であり、X2は1個または2個の芳香族アミノ酸(F、YおよびW)であり、X3は1個のPまたはKであり、X4はA、P、YまたはWから選択される1個もしくは2個、または0個であり、X5はRまたはPから選択される1〜3個である)(この式にはCP12aとCP12dが含まれる)のアミノ酸配列を有する単離された直鎖状カチオン性ペプチドを提供する。本発明のペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、RPRYPWWPWWPYRPRK(配列番号19)、RRAWWKAWWARRK(配列番号20)、RAPYWPWAWARPRK(配列番号21)、RPAWKYWWPWPWPRRK(配列番号22)、RAAFKWAWAWWRRK(配列番号23)およびRRRWKWAWPRRK(配列番号24)が挙げられる。
別の実施形態では、本発明は、一般式(式D):X1X2X3X4X1VX3X4RGX4X3X4X1X3X1(配列番号25)(式中、X1は1個または2個のRまたはKであり、X2は極性アミノ酸または荷電アミノ酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、RおよびH)であり、X3はC、S、M、DまたはAであり、X4はF、I、V、MまたはRである)のアミノ酸配列を有する単離されたヘキサデカマーのカチオン性ペプチドを提供する。本発明のペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、RRMCIKVCVRGVCRRKCRK(配列番号26)、KRSCFKVSMRGVSRRRCK(配列番号27)、KKDAIKKVDIRGMDMRRAR(配列番号28)、RKMVKVDVRGIMIRKDRR(配列番号29)、KQCVKVAMRGMALRRCK(配列番号30)およびRREAIRRVAMRGRDMKRMRR(配列番号31)が挙げられる。
別の実施形態では、本発明は、一般式(式E):X1X2X3X4X1VX5X4RGX4X5X4X1X3X1(配列番号32)(式中、X1が1個または2個のRまたはKであり、X2は極性アミノ酸または荷電アミノ酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、RおよびH)であり、X3は1個のC、S、M、DまたはAであり、X4は1個のF、I、V、MまたはRであり、X5は1個のA、I、S、M、DまたはRである)のアミノ酸配列を有する単離されたヘキサデカマーのカチオン性ペプチドを提供する。本発明のペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、RTCVKRVAMRGIIRKRCR(配列番号33)、KKQMMKRVDVRGISVKRKR(配列番号34)、KESIKVIIRGMMVRMKK(配列番号35)、RRDCRRVMVRGIDIKAK(配列番号36)、KRTAIKKVSRRGMSVKARR(配列番号37)およびRHCIRRVSMRGIIMRRCK(配列番号38)が挙げられる。
別の実施形態では、本発明は、一般式(式F):KX1KX2FX2KMLMX2ALKKX3(配列番号39)(式中、X1は極性アミノ酸(C、S、T、M、NおよびQ)であり、X2は1個のA、L、SまたはKであり、X3はG、A、V、L、I、P、F、S、T、KおよびHから選択される1〜17個のアミノ酸である)のアミノ酸配列を有する単離された長鎖カチオン性ペプチドを提供する。本発明のペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、KCKLFKKMLMLALKKVLTTGLPALKLTK(配列番号40)、KSKSFLKMLMKALKKVLTTGLPALIS(配列番号41)、KTKKFAKMLMMALKKVVSTAKPLAILS(配列番号42)、KMKSFAKMLMLALKKVLKVLTTALTLKAGLPS(配列番号43)、KNKAFAKMLMKALKKVTTAAKPLTG(配列番号44)およびKQKLFAKMLMSALKKKTLVTTPLAGK(配列番号45)が挙げられる。
さらに別の実施形態では、本発明は、一般式(式G):KWKX2X1X1X2X2X1X2X2X1X1X2X2IFHTALKPISS(配列番号46)(式中、X1は疎水性アミノ酸であり、X2は親水性アミノ酸である)のアミノ酸配列を有する単離された長鎖カチオン性ペプチドを提供する。本発明のペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、KWKSFLRTFKSPVRTIFHTALKPISS(配列番号47)、KWKSYAHTIMSPVRLIFHTALKPISS(配列番号48)、KWKRGAHRFMKFLSTIFHTALKPISS(配列番号49)、KWKKWAHSPRKVLTRIFHTALKPISS(配列番号50)、KWKSLVMMFKKPARRIFHTALKPISS(配列番号51)およびKWKHALMKAHMLWHMIFHTALKPISS(配列番号52)が挙げられる。
さらに別の実施形態では、本発明は、次式:KWKSFLRTFKSPVRTVFHTALKPISS(配列番号53)またはKWKSYAHTIMSPVRLVFHTALKPISS(配列番号54)のアミノ酸配列を有する単離されたカチオン性ペプチドを提供する。
本明細書で使用される「単離された」という用語は、他のタンパク質、脂質および核酸(例えば、in vivoで生成されるペプチドが天然に結合している細胞成分)を実質的に含んでいないペプチドを意味する。好ましくは、ペプチドは、少なくとも70重量%、80重量%、最も好ましくは90重量%の純度である。
また、本発明は、もし、類似体、誘導体、保存的変化、または変異体が、先天性免疫を増強するか、あるいは抗炎症活性を有する検出可能な活性を有している場合、その列挙したポリペプチドの類似体、誘導体、保存的変化、およびカチオン性ペプチド変異体を含んでいる。類似体、誘導体、変化または変異体が、類似体、誘導体、保存的変異、または変異体が誘導されるペプチドの活性と同じ活性を有していることは必要ではない。
カチオン性ペプチド「変異体」は、基準とするカチオン性ペプチドの改変形態であるペプチドである。例えば、「変異体」という用語には、基準ペプチドの少なくとも1個のアミノ酸を発現ライブラリーにおいて置換したカチオン性ペプチドが含まれる。「基準」ペプチドという用語は、変異体、誘導体、類似体または保存的変異が誘導される、本発明のカチオン性ペプチド(例えば上記の式で定義したもの)のすべてを意味する。「誘導体」という用語の中には、2個の各カチオン性ペプチドの少なくとも1つの部分(例えば、2個のカチオン性ペプチドそれぞれの30〜80%)を含むハイブリッドペプチドが含まれている。さらに、誘導体が、先天性免疫を増強するか、あるいは抗炎症活性を有する活性を有している限り、本明細書で列挙したペプチド配列から1個以上のアミノ酸が欠失したペプチドも含まれる。これにより、さらに有用性のある小型の活性分子が形成され得る。例えば、ペプチドの先天性免疫または抗炎症活性の増強に必要でないアミノ酸またはカルボキシ末端アミノ酸を除去することができる。同様に、ペプチドの活性を全く阻害することなく、カチオン性ペプチドに1個または数個の(例えば5個未満の)アミノ酸を付加することにより、新たな誘導体を得ることができる。さらに、C末端誘導体(例えばC末端メチルエステル)およびN末端誘導体を得ることもでき、これらも本発明に包含される。本発明のペプチドは、本明細書に記載されている生物学的活性が維持される限り、本発明で記載されているペプチドのすべての類似体、ホモログ、突然変異体、異性体または誘導体が含まれる。さらに、上述の一般式によって包含されるペプチドの逆配列も含まれる。また、「D」配置のアミノ酸を「L」配置のアミノ酸と置き換えることもできる。逆もまた同様である。あるいは、ペプチドは、化学的に、または配列内に2個以上のシステイン残基を付加し酸化してジスルフィド結合を形成することにより環化することができる。
また、本発明は、本明細書に例示されているペプチドの保存的変異体であるペプチドも含まれる。本明細書に使用されている「保存的変異体」という用語は、少なくとも1個のアミノ酸が別の生物学的に類似した残基と置換されているポリペプチドを意味する。保存的変異体の例としては、別の残基に対する1個の疎水性残基(例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシンまたはメチオニン)の置換、あるいは別の残基に対する1個の極性残基の置換、例えば、アルギニンからリジン、グルタミン酸からアスパラギン酸、またはグルタミンからアスパラギンへ置換すること等が含まれる。互いに置換することができる中性の親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびスレオニンが含まれる。また、「保存的変異体」という用語は、非置換の親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を有するペプチドを包含する。かかる置換アミノ酸は、メチル化されたアミノ酸、またはアミド化されたアミノ酸を含み得る。他の置換については、当業者には公知である。一態様では、置換ポリペプチドに対して産生させた抗体は非置換ポリペプチドにも特異的に結合する。
本発明のペプチドは、慣用の方法、例えば、α−アミノ基のt−BOCまたはFMOC保護をはじめとする方法によって合成することができる。両方法はいずれも、ペプチドのC末端から出発して単一のアミノ酸を各ステップで付加する段階的な合成を含む(Coliganら、Current Protocols in Immunology、Wiley Interscience、1991年、第9部を参照されたい)。また、本発明のペプチドは、周知の固相ペプチド合成法、例えば、ポリマー1g当たり0.1〜1.0mMolのアミン類を含有するコポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)を用いて、Merrifieldによって記載されている方法(Merrifield J. Am. Chem. Soc.、85:2149頁、1962年)、ならびにStewartおよびYoungによって記載されている方法(StewarおよびYoung、Solid Phase Peptides Synthesis、Freeman、San Francisco、1969年、27〜62頁)により合成することができる。化学合成が終了したら、0℃で約1/4〜1時間、液体HF−10%アニソールにより処理することによって、ペプチドの脱保護後、ポリマーからペプチドを切断することができる。試薬を留去した後、1%酢酸溶液を用いてポリマーからペプチドを抽出し、次いで、凍結乾燥して粗生成物を得る。ペプチドは、溶媒として5%酢酸を用いるセファデックスG−15でのゲル濾過などの技術により精製することができる。カラム溶離液の適当な画分を凍結乾燥することにより均質なペプチドが得られ、次いで、標準技法、例えば、アミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外線吸収分光法、モル旋光度、または溶解度測定によって特徴決定することができる。所望により、ペプチドは固相エドマン分解により定量することができる。
また、本発明は、本発明のペプチドをコードする単離された核酸(例えばDNA、cDNAまたはRNA)を含む。本明細書に記載されているペプチドの類似体、突然変異体、保存的変異体および変異体をコードする核酸も含まれる。本明細書で使用されている「単離された」という用語は、in vivoで産生させる核酸が天然で結合しているタンパク質、脂質、および他の核酸を実質的に含んでいない核酸を意味する。好ましくは、核酸は、少なくとも70重量%、80重量%、または好ましくは90重量%の純度であり、in vitroで核酸を合成するための慣用の方法をin vivo法の代替として用いることができる。本明細書では、「核酸」は、分離した断片の形態で、あるいは(例えば、本発明のペプチドをコードする核酸にプロモーターを機能可能に結合することによる)大きな遺伝子構築物の成分として、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを意味する。多数の遺伝子構築物(例えば、プラスミドおよび他の発現ベクター)は当技術分野で公知であり、それらを用いて、無細胞系または原核生物もしくは真核生物(例えば、酵母、昆虫または哺乳動物)細胞において本発明のペプチドを得ることができる。当業者は、遺伝コードの縮重を考慮することによって、本発明のポリペプチドをコードする核酸を容易に合成することができる。本発明の核酸は、慣用の分子生物学的方法を用いて、本発明のペプチドを容易に得ることができる。
本発明のカチオン性ペプチドをコードしているDNAは、「発現ベクター」に挿入することができる。「発現ベクター」という用語は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含有するように組換え可能な当技術分野で公知のプラスミド、ウィルスまたは他の運搬体などの遺伝子構築物を意味する。かかる発現ベクターは、宿主細胞中での挿入遺伝子配列の転写を促進するプロモーター配列を含有するプラスミドであるのが好ましい。発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーター、ならびに形質転換細胞の表現型選択を可能とするポリヌクレオチド(例えば、抗生物質耐性ポリヌクレオチド)を含有する。本発明では、誘導プロモーターおよび構成プロモーターをはじめとする種々のプロモーターを利用することができる。典型的には、発現ベクターは、宿主細胞と適合する種に由来する複数の制御配列と1つのレプリコン部位を含有する。
本発明の核酸による受容体の形質転換またはトランスフェクションは、当業者に周知の慣用技術を用いて実施することができる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合、当技術分野で公知のCaCl2、MgCl2またはRbCl法を用いて、DNAの取込可能なコンピテント細胞を調製することができる。あるいは、物理的手段(例えば、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクション)を用いることができる。エレクトロポレーションは、高電圧電気インパルスによって核酸を細胞へ導入することができる。さらに、当技術分野で周知の方法を用いるプロトプラスト融合により宿主細胞中へ核酸を導入することもできる。真核細胞の形質転換に好適な方法、例えば、エレクトロポレーションおよびリポフェクションもまた周知である。
本発明に包含される「宿主細胞」または「受容細胞」とは、本発明の核酸を用いて本発明のポリペプチドを発現させることができるすべての細胞である。また、この用語には、受容細胞または宿主細胞のすべての後代も含まれる。本発明の好ましい受容細胞または宿主細胞としては、大腸菌、黄色ブドウ球菌(S.aureus)および緑膿菌(P.aeruginosa)、あるいは他のグラム陰性菌およびグラム陽性菌、真菌細胞および哺乳動物細胞、ならびに発現ベクターが宿主での発現を可能とする複製起点を含有している限り用いることができる当技術分野で公知の生物、を挙げることができる。
本発明の方法により使用されるカチオン性ペプチドポリヌクレオチド配列は、生物から単離するか、または研究所で合成することができる。対象のカチオン性ペプチドをコードする特定のDNA配列は、1)ゲノムDNAからの二本鎖DNA配列の単離;2)対象のカチオン性ペプチドに必要なコドンを供給するDNA配列の化学的製造;および3)ドナー細胞から単離されたmRNAの逆転写による二本鎖DNA配列のin vitro合成、によって得ることができる。後のケースでは、一般にcDNAと称される、mRNAの二本鎖DNA相補配列が最終的に形成される。
DNA配列の合成は、所望のペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が既知である場合の最良の方法であることが多い。本発明では、DNA配列の合成は、細菌宿主によって認識される可能性が高いコドンの組込みが可能であり、これにより翻訳に問題を伴わず、高レベルの発現が可能となるという利点を有する。さらに、天然のカチオン性ペプチド、その変異体、または合成ペプチドをはじめとする、すべてのペプチドも実際には合成することができる。
所望のペプチドの全配列が未知である場合、DNA配列の直接合成は不可能であり、選択法としてはcDNA配列の形成がある。対象のcDNA配列を単離させる標準的な手順は、高レベルの遺伝子発現を有するドナー細胞で豊富なmRNAの逆転写に由来したcDNAライブラリーを含有するプラスミドまたはファージの作製がある。ポリメラーゼ連鎖反応技術と組み合わせて用いる場合、非常に稀な発現産物でさえもクローニングすることができる。カチオン性ペプチドのアミノ酸配列の重要な部分が既知である場合、標的cDNA中に推定上存在する配列を複製する標識一本鎖もしくは二本鎖のDNAまたはRNAの調製は、DNA/DNAハイブリダイゼーション法で行うことができる。前記方法は一本鎖形状に変性させたcDNAのクローニングコピーで実施される(Jayら、Nuc. Acid Res.、11:2325頁、1983年)。
本発明のペプチドは、注射によるか、または持続注入によって非経口的に投与することができる。ペプチドは、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮的に投与することができる。ペプチドの好ましい送達方法は、ミクロスフェアまたはプロテイノイド中の封入による、肺へのエアロゾル送達による経口的送達、あるいはイオン導入法または経皮的エレクトロポレーションによる経皮的送達を含む。他の投与法は当業者には公知である。
本発明のペプチドの非経口投与用製剤には、無菌の水性または非水性の溶剤、懸濁剤および乳剤が含まれる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油(例えば、オリーブ油)、注射用有機エステル(例えば、オレイン酸エチル)などが挙げられる。水性担体としては、水、アルコール性/水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液(食塩水および緩衝化媒体を含む)が挙げられる。非経口用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム 、乳酸化リンガー、または不揮発性油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとしては、流体性の栄養添加物、電解質添加物(例えば、リンガーデキストロースをベースとするもの)等が挙げられる。また、保存剤や他の添加物、例えば他の抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等を含んでいてもよい。
本発明は、以下の実施例(これらに限定されるものではない)を参照しながらより詳細に記載する。本発明はこれらのある特定の好ましい実施形態に関して詳載されているが、変更および改変は、記載され、特許請求の範囲に記載した精神および範囲内にあるものと理解されたい。
抗敗血症/抗炎症作用
上皮細胞の転写応答に対するカチオン性ペプチドの影響を検出するためにポリヌクレオチドアレイを用いた。10%ウシ胎仔血清(FBS、Medicorp)を添加したDMEM(Gibco)中でA549ヒト上皮細胞系を維持した。A549細胞は、2.5×106細胞/皿にて100mmの組織培養皿中にプレーティングし、一晩培養し、次いで、4時間、100ng/mlの大腸菌O111:B4 LPS(Sigma)、無添加(対照)、もしくは50μg/mlのペプチド、または培地のみのいずれかとインキュベートした。刺激後、ピロ炭酸ジエチルで処理したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)にて細胞を1回洗浄し、細胞スクレーパを用いて、皿から細胞を分離した。全RNAは、RNAqueous(Ambion、Austin、テキサス州)を用いて単離した。RNAペレットをSuperase−In(RNase阻害剤;Ambion)を含むRNase不含の水に再懸濁した。DNA混入は、DNAフリーキット(Ambion)で除去した。1%アガロースゲルでのゲル電気泳動法によりRNAの特性を判定した。
上皮細胞の転写応答に対するカチオン性ペプチドの影響を検出するためにポリヌクレオチドアレイを用いた。10%ウシ胎仔血清(FBS、Medicorp)を添加したDMEM(Gibco)中でA549ヒト上皮細胞系を維持した。A549細胞は、2.5×106細胞/皿にて100mmの組織培養皿中にプレーティングし、一晩培養し、次いで、4時間、100ng/mlの大腸菌O111:B4 LPS(Sigma)、無添加(対照)、もしくは50μg/mlのペプチド、または培地のみのいずれかとインキュベートした。刺激後、ピロ炭酸ジエチルで処理したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)にて細胞を1回洗浄し、細胞スクレーパを用いて、皿から細胞を分離した。全RNAは、RNAqueous(Ambion、Austin、テキサス州)を用いて単離した。RNAペレットをSuperase−In(RNase阻害剤;Ambion)を含むRNase不含の水に再懸濁した。DNA混入は、DNAフリーキット(Ambion)で除去した。1%アガロースゲルでのゲル電気泳動法によりRNAの特性を判定した。
用いたポリヌクレオチドアレイは、重複してスポットされている約14,000個のヒトオリゴからなる、ヒトオペロンアレイ(Human Operon array)(ゲノム用識別番号はPRHU04−S1)とした。プローブは全RNA10μgから調製し、Cy3またはCy5標識dUTPで標識した。そのプローブを精製し、42℃にて一晩、転写したガラススライドにハイブリダイズさせ、洗浄した。洗浄後、Perkin Elmerアレイスキャナーを用いて画像を記録した。画像処理ソフトウェア(Imapolynucleotide 5.0、Marina Del Rey、カリフォルニア州)により、スポットの平均強度(mean intensity)、中央強度、およびバックグラウンド強度を検出する。また、「手製」プログラムを用いて、バックグラウンドを除いた。プログラムは、各サブグリッドについて最低値(bottom)10%強度を計算し、各グリッドについてこれを差し引いた。分析はGenespringソフトウェア(Redwood City、カリフォルニア州)を用いて行った。各スポットの強度は、スライド内のスポット値の群から中央スポット強度値を得て、この値を実験のすべてのスライドの値と比較することにより標準化した。対照細胞と比較した、ペプチドで処理した細胞で認められた相対変化を表1および表2で確認することができる。これらの表2は、改変された発現について試験した14,000個のポリヌクレオチドの発現で有意な変化を示したポリヌクレオチドのみを示している。このデータは、ペプチドが、LPSによって誘導されたポリヌクレオチドの発現を低減する広範な能力を有していることを示唆している。
表1では、ポリヌクレオチドマイクロアレイによって研究した結果、ペプチド(配列番号27)が、大腸菌O111:B4 LPSによってアップレギュレートされる多くのポリヌクレオチドの発現を著しく低減することが示される。ペプチド(50μg/ml)およびLPS(0.1μg/ml)、またはLPS単独をA549細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離した。5μgの全RNAを用いてCy3/Cy5標識cDNAプローブを作製し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞の強度は表1の3番目の欄に示している。「比 LPS/対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、LPSで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を表している。「比 LPS+ID 27/対照」の欄は、未刺激の細胞で割った、LPSおよびペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を表している。
表2では、ポリヌクレオチドマイクロアレイによって研究した結果、50μg/mlの濃度のカチオン性ペプチドが、100ng/mlの大腸菌O111:B4 LPSによってアップレギュレートされた多くのポリヌクレオチドの発現を著しく低減することが示された。ペプチドおよびLPS、またはLPS単独を4時間にわたってA549細胞とインキュベートし、RNAを単離した。5μgの全RNAを用いてCy3/Cy5標識cDNAプローブを作製し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞の強度は表2の3番目の欄に示している。「比 LPS/対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、LPSで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を表している。他の欄は、未刺激の細胞で割った、LPSおよびペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を表している。
免疫細胞の刺激の中和
グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌産物による免疫細胞の刺激を中和する化合物の能力を試験した。細菌産物が免疫系細胞を刺激して炎症性サイトカインを産生させており、チェックされない場合には、これにより敗血症が発生し得る。最初の実験では、マウスマクロファージ細胞系RAW264.7(American Type Culture Collection(Manassas、ヴァージニア州)から取得)、ヒト上皮細胞系A549、および、BALB/cマウスの骨髄由来の一次マクロファージ(Charles River Laboratories、Wilmington、マサチューセッツ州)を用いた。マウス骨髄由来の細胞は、20%FBS(Sigma Chemical Co、St. Louis、ミズーリ州)およびM−CSF源としての20%のL細胞調整培地を添加したダルベッコ変形イーグル培地(DMEM;Life Technologies Burlington、オンタリオ州)を入れた150mmプレートで培養した。マクロファージが60〜80%のコンフルエントになったら、14〜16時間かけてL細胞調整培地からそれらを除いて細胞を静止させ、次いで、24時間かけて100ng/mlのLPSまたは100ng/mlのLPS+20μg/mlペプチドで処理した。培養液上清中へのサイトカインの放出については、ELISA(R & D Systems、Minneapolis、ミネソタ州)によって検出した。細胞系RAW264.7およびA549については、10%ウシ胎仔血清を添加したDMEM中で保持した。RAW264.7細胞は、DMEM中、1ウェル当たり106個の細胞密度となるように24ウェルプレートに播種した。またA549細胞は、DMEM中、1ウェル当たり105個の細胞密度となるように24ウェルプレートに播種した。両方ともに5%のCO2下、37℃にて一晩インキュベートした。DMEMを一晩増殖させた細胞から吸引し、新鮮な培地と交換した。ある実験では、ボランティアのヒトドナー由来の血液を14.3USP単位ヘパリン/ml血液を含有するチューブ(Becton Dickinson、Franklin Lakes、ニュージャージー州)に静脈穿刺により採取した(UBC Clinical Research Ethics Board、認証COO-0537に従って行った)。この血液は、6時間、37℃にて、ポリプロピレンチューブ内で、ペプチド含有または非含有のLPSと混合した。サンプルを2000×gで5分間遠心分離にかけ、血漿を回収し、次いで、−20℃にて保存し、ELISA(R & D Systems)によってIL−8について分析した。細胞の実験では、LPSまたは他の細菌産物を細胞とともに5%CO2下、37℃にて6〜24時間インキュベートした。ネズミチフス菌(S.typhimurium)LPSおよび大腸菌O111:B4 LPSはSigmaから購入した。黄色ブドウ球菌(S.aureus)由来のリポタイコ酸(LTA)(Sigma)を内毒素不含の水(Sigma)に再懸濁した。リムルス変形細胞溶解アッセイ(Sigma)をLTA調製物で実施し、ロットが菌体内毒素の有意な混入を含まないことを確認した。菌体内毒素混入は1ng/ml未満の濃度であり、RAW264.7細胞において有意なサイトカイン産生をもたらさない濃度であった。ノンキャップのリポアラビノマンナン(AraLAM)は、コロラド州立大学のJohn T. Belisle博士から寄贈されたものであった。マイコバクテリウム由来のAraLAMはフィルタ殺菌し、その菌体内毒素混入は、リムルス変形細胞アッセイにより検出した場合、LAM1.0mg当たり3.75ngであることが分かった。LPS添加と同時に(あるいは厳密に記載した場合には添加より遅れて)、カチオン性ペプチドを一連の濃度で添加した。上清を取り出し、ELISA(R & D Systems)によりサイトカイン産生について試験した。すべてのアッセイは、少なくとも3回実施し、同様の結果を得た。抗敗血症活性をin vivoで確認するために、リン酸緩衝生理食塩水(PBS;pH7.2)に溶解した大腸菌O111:B4 LPSの2μgまたは3μgを腹腔内注射し、ガラクトサミン感作8〜10週齢メスCD−1またはBALB/cマウスに敗血症を誘発させた。ペプチドに関する実験では、LPS注射の10分以内に、滅菌水100μlに溶解したペプチド200μgを個々の腹腔内部位に注射した。別の実験では、CD−1マウスに400μgの大腸菌O111:B4 LPSを注射し、10分後に、ペプチド(200μg)を腹腔内注射により注入した。注射後48時間にわたり生存についてモニターした。
グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌産物による免疫細胞の刺激を中和する化合物の能力を試験した。細菌産物が免疫系細胞を刺激して炎症性サイトカインを産生させており、チェックされない場合には、これにより敗血症が発生し得る。最初の実験では、マウスマクロファージ細胞系RAW264.7(American Type Culture Collection(Manassas、ヴァージニア州)から取得)、ヒト上皮細胞系A549、および、BALB/cマウスの骨髄由来の一次マクロファージ(Charles River Laboratories、Wilmington、マサチューセッツ州)を用いた。マウス骨髄由来の細胞は、20%FBS(Sigma Chemical Co、St. Louis、ミズーリ州)およびM−CSF源としての20%のL細胞調整培地を添加したダルベッコ変形イーグル培地(DMEM;Life Technologies Burlington、オンタリオ州)を入れた150mmプレートで培養した。マクロファージが60〜80%のコンフルエントになったら、14〜16時間かけてL細胞調整培地からそれらを除いて細胞を静止させ、次いで、24時間かけて100ng/mlのLPSまたは100ng/mlのLPS+20μg/mlペプチドで処理した。培養液上清中へのサイトカインの放出については、ELISA(R & D Systems、Minneapolis、ミネソタ州)によって検出した。細胞系RAW264.7およびA549については、10%ウシ胎仔血清を添加したDMEM中で保持した。RAW264.7細胞は、DMEM中、1ウェル当たり106個の細胞密度となるように24ウェルプレートに播種した。またA549細胞は、DMEM中、1ウェル当たり105個の細胞密度となるように24ウェルプレートに播種した。両方ともに5%のCO2下、37℃にて一晩インキュベートした。DMEMを一晩増殖させた細胞から吸引し、新鮮な培地と交換した。ある実験では、ボランティアのヒトドナー由来の血液を14.3USP単位ヘパリン/ml血液を含有するチューブ(Becton Dickinson、Franklin Lakes、ニュージャージー州)に静脈穿刺により採取した(UBC Clinical Research Ethics Board、認証COO-0537に従って行った)。この血液は、6時間、37℃にて、ポリプロピレンチューブ内で、ペプチド含有または非含有のLPSと混合した。サンプルを2000×gで5分間遠心分離にかけ、血漿を回収し、次いで、−20℃にて保存し、ELISA(R & D Systems)によってIL−8について分析した。細胞の実験では、LPSまたは他の細菌産物を細胞とともに5%CO2下、37℃にて6〜24時間インキュベートした。ネズミチフス菌(S.typhimurium)LPSおよび大腸菌O111:B4 LPSはSigmaから購入した。黄色ブドウ球菌(S.aureus)由来のリポタイコ酸(LTA)(Sigma)を内毒素不含の水(Sigma)に再懸濁した。リムルス変形細胞溶解アッセイ(Sigma)をLTA調製物で実施し、ロットが菌体内毒素の有意な混入を含まないことを確認した。菌体内毒素混入は1ng/ml未満の濃度であり、RAW264.7細胞において有意なサイトカイン産生をもたらさない濃度であった。ノンキャップのリポアラビノマンナン(AraLAM)は、コロラド州立大学のJohn T. Belisle博士から寄贈されたものであった。マイコバクテリウム由来のAraLAMはフィルタ殺菌し、その菌体内毒素混入は、リムルス変形細胞アッセイにより検出した場合、LAM1.0mg当たり3.75ngであることが分かった。LPS添加と同時に(あるいは厳密に記載した場合には添加より遅れて)、カチオン性ペプチドを一連の濃度で添加した。上清を取り出し、ELISA(R & D Systems)によりサイトカイン産生について試験した。すべてのアッセイは、少なくとも3回実施し、同様の結果を得た。抗敗血症活性をin vivoで確認するために、リン酸緩衝生理食塩水(PBS;pH7.2)に溶解した大腸菌O111:B4 LPSの2μgまたは3μgを腹腔内注射し、ガラクトサミン感作8〜10週齢メスCD−1またはBALB/cマウスに敗血症を誘発させた。ペプチドに関する実験では、LPS注射の10分以内に、滅菌水100μlに溶解したペプチド200μgを個々の腹腔内部位に注射した。別の実験では、CD−1マウスに400μgの大腸菌O111:B4 LPSを注射し、10分後に、ペプチド(200μg)を腹腔内注射により注入した。注射後48時間にわたり生存についてモニターした。
TNF−αの過剰産生は、典型的には敗血症の進行に関係がある。本実施例で使用したLPS、LTAまたはAraLAMの3つのタイプは、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の両方から放出された産物を表わしている。ペプチド(配列番号1)は、ネズミチフス菌、セパシア菌および大腸菌O111:B4 LPSにより刺激されたTNF−α産生を有意に低減することができたが、前者については幾分作用の程度が低くかった(表3)。ペプチド1μg/mlの低濃度(0.25nM)では、後者2つの事例においては、TNF−α産生が本質的に低減することが認められた。異なるペプチドの配列番号3は、RAWマクロファージ細胞において、TNF−αのLPS誘導産生を低減しなかったが、これは、カチオン性ペプチドが均一でなく、かつ予測可能な特性ではないことを示唆している。また、各式の代表的なペプチドについて、大腸菌O111:B4 LPSにより刺激されるTNF−α産生に対して影響を及ぼす能力を試験した(表4)。これらのペプチドは、大部分が少なくとも60%までTNF−αを低下させたが、TNF−α産生を低減する様々な能力を有していた。
また、ある特定の濃度では、配列番号1および配列番号2のペプチドは、細菌産物が上皮細胞系によるIL−8産生を刺激する能力を低減させることができる。LPSは、上皮細胞によるIL−8産生の既知の強力な刺激である。ペプチドは、低濃度(1〜20μg/ml)で、LPSに対する上皮細胞のIL−8誘導反応を中和した(表5〜7)。また、配列番号2のペプチドは、ヒト全血におけるIL−8のLPS誘導産生を抑制した(表4)。反対に、高濃度(50〜100μg/ml)の配列番号1のペプチドは、実際に、IL−8の濃度を上昇させた(表5)。このことは、ペプチドは、異なる濃度で異なる作用を有することがあることを示唆している。
また、炎症刺激に対するペプチドの影響について、配列番号1のペプチドが、100ng/mlの大腸菌O111:B4 LPSで刺激されたBALB/cマウスの骨髄由来マクロファージによりTNF−α産生が有意に低減する(>90%)ことが一次マウス細胞で証明された(表8)。これらの実験は、LPS結合タンパク質(LBP)(LPSがCD14へ迅速に結合することを媒介可能なタンパク質)を含有している血清の存在下で行った。また、100ng/mlの大腸菌LPSによる刺激後1時間遅れて配列番号1をマクロファージの上清に添加すると、TNF−α産生の本質的な低減(70%)がやはり生じた(表9)。
また、in vitroにおけるLPS誘導性TNF−α産生を防止する配列番号1の能力と一致して、ある種のペプチドは、高濃度のLPSにより誘導される致死性ショックからマウスを保護した。ある実験では、CD−1マウスにガラクトサミンを先に注射した後、LPSを感作させた。大腸菌O111:B4 LPSを3μg注射した、ガラクトサミン感作マウスは、4〜6時間以内にすべて死滅した。LPSの15分後に200μgの配列番号1を注射すると、マウスの50%が生存した(表10)。他の実験では、高濃度のLPSをD−ガラクトサミンで感作されていないBALB/cマウスに注射した場合、生存なしの対照群と比較して、ペプチドにより100%保護された(表13)。また、選択した他のペプチドにおいても、これらのモデルで保護することが確認された(表11、12)。
さらに、カチオン性ペプチドは、グラム陽性細菌の産物(例えば、マイコバクテリウムのノンキャップのリポアラビノマンナン(AraLAM)および黄色ブドウ球菌LTA)によるマクロファージの刺激を低下させることができた。例えば、配列番号1は、グラム陽性細菌産物のLTA(表14)と、より少量のAraLAM(表15)によるRAW264.7細胞におけるTNF−αの誘導を阻害した。また、別のペプチドである配列番号2もRAW264.7細胞によるLTA誘導性TNF−α産生を低減することが確認された。1μg/mlの濃度では、配列番号1は、1μg/mlの黄色ブドウ球菌LTAによるTNF−α産生の誘導を実質的に低減することができた(>75%)。20μg/mlの配列番号1では、AraLAM誘導性TNF−αを>60%で阻害した。配列番号1によるAraLAM誘導性TNF−αの阻害において菌体内毒素の混入が有意な要因ではないことを示すために、対照としてポリミキシンB(PMB)を入れた。これらの結果は、カチオン性ペプチドが、細菌産物に対する免疫系の前炎症性サイトカイン反応を低減することができることを示唆している。
表3:RAW264.7細胞における配列番号1によるLPS誘導性TNF−α産生の低減
6時間にわたり示した濃度の配列番号1の存在下で、100ng/mlのネズミチフス菌LPS、100ng/mlのセパシア菌LPS、および100ng/mlの大腸菌O111:B4 LPSによりRAW264.7マウスマクロファージ細胞を刺激した。培養液上清へ放出されたTNF−αの濃度は、ELISAによって検出した。100%は、6時間にわたりLPS単独とインキュベートしたRAW264.7細胞から得られたTNF−αの量を表わす(ネズミチフス菌LPS=34.5±3.2ng/ml、セパシア菌LPS=11.6±2.9ng/ml、および大腸菌O111:B4 LPS=30.8±2.4ng/ml)。6時間無刺激で培養されたRAW264.7細胞によるTNF−α産生のバックグランドレベルは、0.037〜0.192ng/mlの範囲のTNF−α濃度であった。データは二連のサンプルから取得し、3回の実験の平均+標準誤差として示した。
6時間にわたり示した濃度の配列番号1の存在下で、100ng/mlのネズミチフス菌LPS、100ng/mlのセパシア菌LPS、および100ng/mlの大腸菌O111:B4 LPSによりRAW264.7マウスマクロファージ細胞を刺激した。培養液上清へ放出されたTNF−αの濃度は、ELISAによって検出した。100%は、6時間にわたりLPS単独とインキュベートしたRAW264.7細胞から得られたTNF−αの量を表わす(ネズミチフス菌LPS=34.5±3.2ng/ml、セパシア菌LPS=11.6±2.9ng/ml、および大腸菌O111:B4 LPS=30.8±2.4ng/ml)。6時間無刺激で培養されたRAW264.7細胞によるTNF−α産生のバックグランドレベルは、0.037〜0.192ng/mlの範囲のTNF−α濃度であった。データは二連のサンプルから取得し、3回の実験の平均+標準誤差として示した。
表4:RAW264.7細胞におけるカチオン性ペプチドによる大腸菌LPS誘導性TNF−α産生の低減
6時間にわたり提示した濃度のカチオン性ペプチドの存在下で、100ng/mlの大腸菌O111:B4 LPSを用いてRAW264.7マウスマクロファージ細胞を刺激した。培養液上清へ放出されたTNF−αの濃度はELISAによって検出した。6時間無刺激で培養されたRAW264.7細胞によるTNF−α産生のバックグランドレベルは、0.037〜0.192ng/mlの範囲のTNF−α濃度であった。データは二連のサンプルから取得し、3回の実験の平均+標準誤差として示した。
6時間にわたり提示した濃度のカチオン性ペプチドの存在下で、100ng/mlの大腸菌O111:B4 LPSを用いてRAW264.7マウスマクロファージ細胞を刺激した。培養液上清へ放出されたTNF−αの濃度はELISAによって検出した。6時間無刺激で培養されたRAW264.7細胞によるTNF−α産生のバックグランドレベルは、0.037〜0.192ng/mlの範囲のTNF−α濃度であった。データは二連のサンプルから取得し、3回の実験の平均+標準誤差として示した。
表5:A549細胞におけるLPS誘導性IL−8産生の配列番号1による低減
24時間にわたりLPS(100ng/mlの大腸菌O111:B4)の存在下において、濃度を次第に高めた配列番号1を用いてA549細胞を刺激した。培養液上清中のIL−8の濃度は、ELISAによって検出した。細胞単独のIL−8のバックグラウンドレベルは、0.172±0.029ng/mlであった。データは3回の実験の平均+標準誤差として示した。
24時間にわたりLPS(100ng/mlの大腸菌O111:B4)の存在下において、濃度を次第に高めた配列番号1を用いてA549細胞を刺激した。培養液上清中のIL−8の濃度は、ELISAによって検出した。細胞単独のIL−8のバックグラウンドレベルは、0.172±0.029ng/mlであった。データは3回の実験の平均+標準誤差として示した。
表6:A549細胞における大腸菌LPS誘導性IL−8産生の配列番号2による低減
24時間にわたりLPS(100ng/mlの大腸菌O111:B4)の存在下において、濃度を次第に高めた配列番号2を用いてヒトA549上皮細胞を刺激した。培養液上清中のIL−8の濃度はELISAによって検出した。データは3回の実験の平均+標準誤差として示した。
24時間にわたりLPS(100ng/mlの大腸菌O111:B4)の存在下において、濃度を次第に高めた配列番号2を用いてヒトA549上皮細胞を刺激した。培養液上清中のIL−8の濃度はELISAによって検出した。データは3回の実験の平均+標準誤差として示した。
表7:ヒト血液における大腸菌LPS誘導性IL−8の配列番号2による低減
4時間にわたり濃度を次第に高めたペプチドと大腸菌O111:B4 LPSを用いてヒト全血を刺激した。ヒト血液サンプルを遠心分離にかけ、血清を取り出し、IL−8をELISAにより試験した。データは、2名のドナーの平均として示す。
4時間にわたり濃度を次第に高めたペプチドと大腸菌O111:B4 LPSを用いてヒト全血を刺激した。ヒト血液サンプルを遠心分離にかけ、血清を取り出し、IL−8をELISAにより試験した。データは、2名のドナーの平均として示す。
表8:マウス骨髄マクロファージにおける大腸菌LPS誘導性TNF−α産生の配列番号1による低減
BALB/cマウス骨髄由来のマクロファージを、20μg/mlのペプチドの存在下または不在下で、100ng/mlの大腸菌O111:B4 LPSとともに6時間または24時間培養した。上清を回収し、TNF−αの濃度についてELISAで試験した。データは、6時間(1.1±0.09ng/ml)または24時間(1.7±0.2ng/ml)、単独のLPSとインキュベートした骨髄由来マクロファージの二連ウェルから得られたTNF−αの量を示す。TNF−αのバックグラウンドレベルは、6時間の場合0.038±0.008ng/mlであり、24時間の場合0.06±0.012ng/mlであった。
BALB/cマウス骨髄由来のマクロファージを、20μg/mlのペプチドの存在下または不在下で、100ng/mlの大腸菌O111:B4 LPSとともに6時間または24時間培養した。上清を回収し、TNF−αの濃度についてELISAで試験した。データは、6時間(1.1±0.09ng/ml)または24時間(1.7±0.2ng/ml)、単独のLPSとインキュベートした骨髄由来マクロファージの二連ウェルから得られたTNF−αの量を示す。TNF−αのバックグラウンドレベルは、6時間の場合0.038±0.008ng/mlであり、24時間の場合0.06±0.012ng/mlであった。
表9:A549細胞への配列番号1の遅延添加による大腸菌LPS誘導性TNF−α産生の阻害
A549ヒト上皮細胞と100ng/mlの大腸菌O111:B4 LPSをすでに含有しているウェルに、ペプチド(20μg/ml)を経時的に添加した。6時間後に上清を回収し、TNF−αの濃度についてELISAにより試験した。データは3回の実験の平均+標準誤差として示した。
A549ヒト上皮細胞と100ng/mlの大腸菌O111:B4 LPSをすでに含有しているウェルに、ペプチド(20μg/ml)を経時的に添加した。6時間後に上清を回収し、TNF−αの濃度についてELISAにより試験した。データは3回の実験の平均+標準誤差として示した。
表10:ガラクトサミン感作CD−1マウスの致死性内毒素血症に対する配列番号1による防御
CD−1マウス(9週齢)にガラクトサミン(0.1ml滅菌PBSに20mg溶解)を3回腹腔内注射して菌体内毒素を感作させた。次いで、大腸菌O111:B4 LPS(0.1mlPBSに3μg)の腹腔内注射により内毒素性ショックを誘導した。LPSを注射してから15分後に、それぞれの腹腔内部位に配列番号1のペプチド(200μg/マウス=8mg/kg)を注射した。48時間マウスをモニターし、結果を記録した。
CD−1マウス(9週齢)にガラクトサミン(0.1ml滅菌PBSに20mg溶解)を3回腹腔内注射して菌体内毒素を感作させた。次いで、大腸菌O111:B4 LPS(0.1mlPBSに3μg)の腹腔内注射により内毒素性ショックを誘導した。LPSを注射してから15分後に、それぞれの腹腔内部位に配列番号1のペプチド(200μg/マウス=8mg/kg)を注射した。48時間マウスをモニターし、結果を記録した。
表11:ガラクトサミン感作CD−1マウスの致死性内毒素血症に対するカチオン性ペプチドによる防御
CD−1マウス(9週齢)にガラクトサミン(0.1ml滅菌PBSに20mg溶解)を腹腔内注射して菌体内毒素を感作させた。次いで、大腸菌O111:B4 LPS(0.1mlPBSに2μg)の腹腔内注射により内毒素性ショックを誘導した。LPSを注射してから15分後に、それぞれの腹腔内部位にペプチド(200μg/マウス=8mg/kg)を注射した。48時間マウスをモニターし、結果を記録した。
CD−1マウス(9週齢)にガラクトサミン(0.1ml滅菌PBSに20mg溶解)を腹腔内注射して菌体内毒素を感作させた。次いで、大腸菌O111:B4 LPS(0.1mlPBSに2μg)の腹腔内注射により内毒素性ショックを誘導した。LPSを注射してから15分後に、それぞれの腹腔内部位にペプチド(200μg/マウス=8mg/kg)を注射した。48時間マウスをモニターし、結果を記録した。
表12:ガラクトサミン感作BALB/cマウスの致死性内毒素血症に対するカチオン性ペプチドによる防御
BALB/cマウス(8週齢)にガラクトサミン(0.1ml滅菌PBSに20mg溶解)を腹腔内注射して菌体内毒素を感作させた。次いで、大腸菌O111:B4 LPS(0.1mlPBSに2μg)の腹腔内注射により内毒素性ショックを誘導した。LPSを注射してから15分後に、それぞれの腹腔内部位にペプチド(200μg/マウス=8mg/kg)を注射した。48時間マウスをモニターし、結果を記録した。
BALB/cマウス(8週齢)にガラクトサミン(0.1ml滅菌PBSに20mg溶解)を腹腔内注射して菌体内毒素を感作させた。次いで、大腸菌O111:B4 LPS(0.1mlPBSに2μg)の腹腔内注射により内毒素性ショックを誘導した。LPSを注射してから15分後に、それぞれの腹腔内部位にペプチド(200μg/マウス=8mg/kg)を注射した。48時間マウスをモニターし、結果を記録した。
表13:BALB/cマウスの致死性内毒素血症に対する配列番号1による防御
BALB/cマウスに400μgの大腸菌O111:B4 LPSを腹腔内注射した。それぞれの腹腔内部位にペプチド(200μg/マウス=8mg/kg)を注射し、48時間マウスをモニターして結果を記録した。
BALB/cマウスに400μgの大腸菌O111:B4 LPSを腹腔内注射した。それぞれの腹腔内部位にペプチド(200μg/マウス=8mg/kg)を注射し、48時間マウスをモニターして結果を記録した。
表14:黄色ブドウ球菌LTAにより誘導されるTNF−α産生のペプチド阻害
濃度を次第に高めたペプチドの存在下および不在下において、1μg/mlの黄色ブドウ球菌LTAでRAW264.7マウスマクロファージ細胞を刺激した。上清を回収し、TNF−αの濃度をELISAで試験した。6時間無刺激で培養されたRAW264.7細胞によるTNF−α産生のバックグランド濃度は、0.037〜0.192ng/mlの範囲のTNF−α濃度であった。データは3回以上の実験の平均+標準誤差として示した。
濃度を次第に高めたペプチドの存在下および不在下において、1μg/mlの黄色ブドウ球菌LTAでRAW264.7マウスマクロファージ細胞を刺激した。上清を回収し、TNF−αの濃度をELISAで試験した。6時間無刺激で培養されたRAW264.7細胞によるTNF−α産生のバックグランド濃度は、0.037〜0.192ng/mlの範囲のTNF−α濃度であった。データは3回以上の実験の平均+標準誤差として示した。
カチオン性ペプチドの毒性の評価
本ペプチドの潜在的毒性について2種類の方法で測定した。第1に、細胞毒性検出キット(Roche)(乳酸デヒドロゲナーゼ−LDH)アッセイを用いた。このアッセイは、損傷を受けた細胞の細胞質ゾルから上清へ放出されたLDH活性を測定することに基づいた、細胞死と細胞溶解を定量する比色定量アッセイである。LDHはすべての細胞中に存在する安定した細胞質酵素であり、細胞膜の損傷時に細胞培養上清に放出される。死滅細胞または細胞膜に損傷を受けた細胞の量が上昇すると、ELISAプレートリーダー(OD490nm)で測定した場合、培養液上清中のLDH酵素活性が上昇する(アッセイで形成された色素の量は、溶解した細胞数に比例する)。このアッセイでは、ヒト気管支上皮細胞(16HBEol4、HBE)を24時間かけてペプチド100μgとインキュベートし、上清を取り出し、LDHについて分析した。カチオン性ペプチドの毒性の測定に用いた別のアッセイは、WST−1アッセイ(Roche)であった。このアッセイは、生細胞中のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによるテトラゾリウム塩WST−1の切断に基づいた、細胞増殖および細胞生存率を定量する比色定量のアッセイである([3H]−チミジン取込み反応アッセイに代わる非放射性アッセイ)。このアッセイでは、HBE細胞を24時間かけてペプチド100μgとインキュベートし、次いで、10μl/ウェルの細胞増殖試薬WST−1を添加した。細胞をこの試薬とインキュベートし、次いで、ELISAプレートリーダー(OD490nm)でプレートを測定した。
本ペプチドの潜在的毒性について2種類の方法で測定した。第1に、細胞毒性検出キット(Roche)(乳酸デヒドロゲナーゼ−LDH)アッセイを用いた。このアッセイは、損傷を受けた細胞の細胞質ゾルから上清へ放出されたLDH活性を測定することに基づいた、細胞死と細胞溶解を定量する比色定量アッセイである。LDHはすべての細胞中に存在する安定した細胞質酵素であり、細胞膜の損傷時に細胞培養上清に放出される。死滅細胞または細胞膜に損傷を受けた細胞の量が上昇すると、ELISAプレートリーダー(OD490nm)で測定した場合、培養液上清中のLDH酵素活性が上昇する(アッセイで形成された色素の量は、溶解した細胞数に比例する)。このアッセイでは、ヒト気管支上皮細胞(16HBEol4、HBE)を24時間かけてペプチド100μgとインキュベートし、上清を取り出し、LDHについて分析した。カチオン性ペプチドの毒性の測定に用いた別のアッセイは、WST−1アッセイ(Roche)であった。このアッセイは、生細胞中のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによるテトラゾリウム塩WST−1の切断に基づいた、細胞増殖および細胞生存率を定量する比色定量のアッセイである([3H]−チミジン取込み反応アッセイに代わる非放射性アッセイ)。このアッセイでは、HBE細胞を24時間かけてペプチド100μgとインキュベートし、次いで、10μl/ウェルの細胞増殖試薬WST−1を添加した。細胞をこの試薬とインキュベートし、次いで、ELISAプレートリーダー(OD490nm)でプレートを測定した。
下記の表16および表17に示した結果は、大部分のペプチドが試験した細胞に対して無毒であることを証明している。しかし、式Fのペプチド4種類(配列番号40、41、42および43)は、両アッセイにより測定した結果、膜損傷を誘発した。
表16:LDH放出アッセイによって測定した場合のカチオン性ペプチドの毒性
ヒトHBE気管支上皮細胞を24時間にわたり100μg/mlのペプチドまたはポリミキシンBとインキュベートした。LDH活性は細胞培養の上清中で分析した。100%LDH放出の対照として、TritonX−100を添加した。データは平均±標準偏差として示す。配列番号40、41、42および43のペプチドのみ、どれも有意な毒性を示した。
ヒトHBE気管支上皮細胞を24時間にわたり100μg/mlのペプチドまたはポリミキシンBとインキュベートした。LDH活性は細胞培養の上清中で分析した。100%LDH放出の対照として、TritonX−100を添加した。データは平均±標準偏差として示す。配列番号40、41、42および43のペプチドのみ、どれも有意な毒性を示した。
カチオン性ペプチドによるポリヌクレオチド調節
ポリヌクレオチドアレイを利用してマクロファージと上皮細胞の転写応答に対するカチオン性ペプチドそれ自体の影響を検出した。マウスマクロファージRAW264.7、ヒト気管支細胞(HBE)、またはA549ヒト上皮細胞を5.6×106細胞/皿にて150mm組織培養皿に播種し、一晩培養し、次いで、4時間にわたり50g/mlのペプチドと一緒にまたは培地のみでインキュベートした。刺激後、ピロ炭酸ジエチル処理PBSで細胞を一回洗浄し、細胞スクレーパを用いて皿から取り出した。全RNAはTrizol(Gibco Life Technologies)を用いて単離した。このRNAペレットをRNase阻害剤(Ambion、Austin、テキサス州)を含有するRNase不含の水に再懸濁した。37℃で1時間、DNaseI(Clontech、Palo Alto、カリフォルニア州)によりRNAを処理した。終結混合物(0.1MのEDTA[pH8.0]、1mg/mlのグリコーゲン)を添加した後、サンプルをフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)で1回、クロロホルムで1回抽出した。次いで、RNAに2.5容量の100%エタノールと1/10容量の酢酸ナトリウム(pH5.2)を添加して沈殿させた。RNAをRNase阻害剤(Ambion)を含むRNase不含の水に再懸濁し、−70℃で保存した。RNAの特性については、1%アガロースゲルでのゲル電気泳動法によって評価した。ゲノムDNA混入がないことについては、β−アクチン−特異的プライマー(5’−GTCCCTGTATGCCTCTGGTC−3’(配列番号55)および5’−GATGTCACGCACGATTTCC−3’(配列番号56))を用いたPCR増幅に鋳型として単離したRNAを用いて評価した。35サイクル後に、アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムブロミド染色によりアンプリコンが存在しないことを確認した。
ポリヌクレオチドアレイを利用してマクロファージと上皮細胞の転写応答に対するカチオン性ペプチドそれ自体の影響を検出した。マウスマクロファージRAW264.7、ヒト気管支細胞(HBE)、またはA549ヒト上皮細胞を5.6×106細胞/皿にて150mm組織培養皿に播種し、一晩培養し、次いで、4時間にわたり50g/mlのペプチドと一緒にまたは培地のみでインキュベートした。刺激後、ピロ炭酸ジエチル処理PBSで細胞を一回洗浄し、細胞スクレーパを用いて皿から取り出した。全RNAはTrizol(Gibco Life Technologies)を用いて単離した。このRNAペレットをRNase阻害剤(Ambion、Austin、テキサス州)を含有するRNase不含の水に再懸濁した。37℃で1時間、DNaseI(Clontech、Palo Alto、カリフォルニア州)によりRNAを処理した。終結混合物(0.1MのEDTA[pH8.0]、1mg/mlのグリコーゲン)を添加した後、サンプルをフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)で1回、クロロホルムで1回抽出した。次いで、RNAに2.5容量の100%エタノールと1/10容量の酢酸ナトリウム(pH5.2)を添加して沈殿させた。RNAをRNase阻害剤(Ambion)を含むRNase不含の水に再懸濁し、−70℃で保存した。RNAの特性については、1%アガロースゲルでのゲル電気泳動法によって評価した。ゲノムDNA混入がないことについては、β−アクチン−特異的プライマー(5’−GTCCCTGTATGCCTCTGGTC−3’(配列番号55)および5’−GATGTCACGCACGATTTCC−3’(配列番号56))を用いたPCR増幅に鋳型として単離したRNAを用いて評価した。35サイクル後に、アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムブロミド染色によりアンプリコンが存在しないことを確認した。
初期ポリヌクレオチドアレイ試験(表18、19)のため、正荷電膜上に重複してスポットした588個の選択マウスcDNAからなるAtlas cDNA発現アレイ(Clontech, Palo Alto、カリフォルニア州)を用いた。5μgの全RNAから調製された32P放射標識cDNAプローブを71℃にて一晩アレイとともにインキュベートした。フィルタを十分に洗浄し、次いで、4℃にて3日間、phosphoimagerスクリーン(Molecular Dynamics、Sunnyvale、カリフォルニア州)に暴露した。画像はMolecular Dynamics PSI phosphoimagerを用いて記録した。ハイブリダイゼーションシグナルは、AtlasImage 1.0 Image Analysisソフトウエア(Clontech)およびExcel(Microsoft、Redmond、WA)を用いて分析した。各スポットの強度はバックグラウンドレベルに対して調整し、刺激条件:β−アクチン、ユビキチン、リボソームタンパク質S29、グリセリンアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH))と、Ca2+結合タンパク質との間でほとんど変化がないことが確認された5個のポリヌクレオチドに対する平均値を用いてプローブ標識の差異を標準化した。所与のcDNAに対して標準化されたハイブリダイゼーション強度が20未満であった場合、値として20を代入して比および相対発現を算出した。
使用したポリヌクレオチドアレイ(表21〜26)は、重複してスポットされている7,458個のヒトcDNAからなる、ResgenヒトcDNAアレイ(ゲノムの識別番号はPRHU03−S3である)であった。プローブは15〜20μgの全RNAから調製し、Cy3標識化dUTPで標識した。プローブは精製し、42℃で転写したガラススライドに一晩ハイブリダイズさせ、洗浄した。洗浄後、Virtekスライドリーダーを用いて画像を記録した。画像処理ソフトウェア(Imagene 4.1、Marina Del Rey、カリフォルニア州)により、スポット平均強度、中央強度およびバックグラウンド強度を検出する。標準化と分析は、Genespringソフトウエア(Redwood City、カリフォルニア州)により行った。強度値は、Imageneによって検出された平均強度値から平均バックグラウンド強度を引いて算出した。各スポットの強度は、スライド内のスポット値の群から中央スポット強度値を取得し、この値を実験のすべてのスライドの値と比較することによって標準化した。対照細胞と比較したペプチド処理細胞で観察された相対変化は、下記の表で確認することができる。
使用した他のポリヌクレオチドアレイ(表27〜35)は、重複してスポットされた約14,000個のヒトオリゴからなる、ヒトオペロンアレイ(ゲノムに対する識別番号はPRHU04−S1)であった。プローブは全RNA10μgから調製し、Cy3またはCy5標識dUTPで標識した。これらの実験では、A549上皮細胞を2.5×106細胞/皿で100mmの組織培養皿に播種した。全RNAはRNAqueous(Ambion)を用いて単離した。DNA混入は、DNAフリーキット(Ambion)で除去した。全RNAから調製したプローブは精製し、42℃にて転写されたガラススライドに一晩ハイブリダイズさせ、洗浄した。洗浄後、Perkin Elmerアレイスキャナーを用いて画像を記録した。画像処理ソフトウェア(Imagene5.0、Marina Del Rey、カリフォルニア州)により、スポット平均強度、中央強度およびバックグラウンド強度を検出する。「自家製」プログラムを用いて、バックグラウンドを除いた。プログラムにより各サブグリッドの最低値10%の強度を計算し、各グリッドについてこれを差し引く。分析は、Genespringソフトウエア(Redwood City、カリフォルニア州)で行った。各スポットの強度は、スライド内のスポット値の群から中央スポット強度値を取得し、この値を実験のすべてのスライドの値と比較することによって標準化した。対照細胞と比較したペプチド処理細胞で観察された相対変化は、下記の表で確認することができる。
半定量的RT−PCRは、ポリヌクレオチドアレイ結果を確認するために実施した。1μgのRNAサンプルを、1μlのオリゴdT(500μg/ml)と1μlの1mM混合dNTPストックと共に、DEPC処理水中で12μl容量とサーモサイクラーにおいて65℃にて5分間インキュベートした。4μlの5×First Strandバッファー、2μlの0.1M DTT、および1μlのRNaseOUT組換えリボヌクレアーゼ阻害剤(40単位/μl)を添加し、42℃で2分間インキュベートし、次いで、Superscript II(Invitrogen, Burlington、オンタリオ州)1μl(200単位)を添加した。各RNA供与源の陰性対照は、Superscript IIの不在下における並行反応を用いて生成した。5’プライマーおよび3’プライマー(1.0μM)、0.2mMのdNTP混合物、1.5mMのMgCl、1UのTaq DNAポリメラーゼ(New England Biolabs、Missisauga、オンタリオ州)、および1×PCRバッファーの存在下でcDNAを増幅させた。各PCRは、94℃における30秒の変性、52℃または55℃における30秒のアニーリング、72℃における40秒の伸長からなるサイクルを30〜40回用いてサーマルサイクラーにより実施した。PCRのサイクル数は、各プライマーとRNAサンプルのセットの反応の直線位相に位置するように最適化した。抽出方法を評価し、かつRNAの量を推定するために、ハウスキーピングポリヌクレオチドβ−アクチンを各実験で増幅した。反応産物を電気泳動により視覚化し、濃度計測によって分析した。相対出発RNA濃度はβ−アクチン増幅を参照して算出した。
表18は、RAW264.7細胞を配列番号1で処置すると、選択した既知のポリヌクレオチドによる小型Atlasマイクロアレイにおいて、30を越える異なるポリヌクレオチドの発現をアップレギュレートしたことを示している。ペプチド(配列番号1)によってアップレギュレートされたポリヌクレオチドは、主として2つのカテゴリー、すなわち、受容体(増殖、ケモカイン、インターロイキン、インターフェロン、ホルモン、神経伝達物質)、細胞表面抗原、および細胞接着を含むものと、細胞間コミュニケーション(増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、インターフェロン、ホルモン)、細胞骨格、運動性、およびタンパク質ターンオーバーを含むものであった。アップレギュレートされた特定のポリヌクレオチドには、ケモカインMCP−3、抗炎症性サイトカインIL−10、マクロファージコロニー刺激因子、および受容体、例えば、IL−1R−2(IL−1R1に結合する生産性IL−1の推定上アンタゴニスト)、PDGF受容体B、NOTCH4、LIF受容体、LFA−1、TGFβ受容体1、G−CSF受容体、およびIFNγ受容体をコードするものが含まれていた。また、ペプチドは、いくつかのメタロプロテイナーゼ、およびこれらのインヒビター、例えば、骨形成タンパク質BMP−1、BMP−2、BMP−8a、TIMP2およびTIMP3をコードするポリヌクレオチドをアップレギュレートした。さらに、ペプチドは、特定の転写因子、例えば、JunD、ならびにYYおよびLIM−1転写因子と、キナーゼ、例えば、その広範な効果を示すEtk1およびCskをアップレギュレートした。さらに、ポリヌクレオチドアレイ研究からは、配列番号1が、RAW264.7マクロファージ細胞の少なくとも20個のポリヌクレオチドをダウンレギュレートしたことが明らかになった(表19)。ペプチドによってダウンレギュレートされたポリヌクレオチドは、DNA修復タンパク質といくつかの炎症媒介因子、例えば、MIP−1α、オンコスタチンM、およびIL−12を含んでいた。ポリヌクレオチド発現に対するペプチドの数多くの影響はRT−PCRによって確認した(表20)。また、ペプチド(配列番号2、配列番号3、配列番号19および配列番号1)、ならびに各式の代表的なペプチドは主に、中型マイクロアレイ(7835個のポリヌクレオチド)を用いて、ヒト上皮細胞系の転写応答を改変した。ポリヌクレオチド発現に対する配列番号1の影響は、2種類のヒト上皮細胞系、A549およびHBEで比較した。未刺激細胞に比べて2倍以上の比で2個以上のペプチドによりアップレギュレートされた宿主免疫反応に関係しているポリヌクレオチドは、表21に記載されている。未刺激細胞に比べて2倍以上の比で2個以上のペプチドによりダウンレギュレートされたポリヌクレオチドは、表22に記載されている。表23および表24には、それぞれアップレギュレートおよびダウンレギュレートされたヒト上皮前炎症性ポリヌクレオチドを示している。表25および表26には、カチオン性ペプチドによって影響を受けた抗炎症性ポリヌクレオチドを示している。カチオン性ペプチドは、抗炎症の応答をアップレギュレートし、前炎症の応答をダウンレギュレートするという傾向が明らかになった。ポリヌクレオチドが、ダウンレギュレートされた抗炎症の応答に関連していることを確認するのは非常に困難であった(表26)。カチオン性ペプチドによりアップレギュレートされた前炎症性ポリヌクレオチドは、主として遊走と接着に関係するポリヌクレオチドであった。ダウンレギュレートされた前炎症性ポリヌクレオチドのうち、カチオン性ペプチドのすべてがいくつかのトール様受容体(TLR)ポリヌクレオチド(感染因子に対する宿主反応のシグナル伝達において非常に重要である)に影響を及ぼしたことに注目すべきである。これらのペプチドのすべてによってアップレギュレートされた重要な抗炎症性ポリヌクレオチドは、IL−10受容体である。IL−10は、前炎症性サイトカインの調節に関与する重要なサイトカインである。また、表27および表28の配列番号6のペプチドについて確認した結果、これらのポリヌクレオチド発現作用は、一次ヒトマクロファージを用いて確認された。選択したポリヌクレオチド(試験した14,000のうち)のヒト上皮細胞発現における各式の代表的なペプチドの影響は下記の表31〜37に示している。各式の少なくとも6個のペプチドは、ヒト上皮のポリヌクレオチド発現を改変する能力に関して試験し、実際にこれらのペプチドは広範囲の刺激性の影響があった。各式においては、その群内の各ペプチドにより一般にアップレギュレートされる少なくとも50個のポリヌクレオチドが存在した。
表18:RAWマクロファージ細胞のペプチド(配列番号1)処理によりアップレギュレートされたポリヌクレオチドa
50μg/ml濃度のカチオン性ペプチドは、数個のポリヌクレオチドの発現を顕著に誘導することがわかった。ペプチドをRAW細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、Atlasアレイにハイブリダイズさせた。未刺激の細胞の強度は第3番目の欄に示している。「比 ペプチド:未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
50μg/ml濃度のカチオン性ペプチドは、数個のポリヌクレオチドの発現を顕著に誘導することがわかった。ペプチドをRAW細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、Atlasアレイにハイブリダイズさせた。未刺激の細胞の強度は第3番目の欄に示している。「比 ペプチド:未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
ハウスキーピングポリヌクレオチドの標準化した強度の変化は0.8〜1.2倍であり、標準化にこれらのポリヌクレオチドを使用することが有効であった。所与のcDNAに対して標準化されたハイブリダイゼーション強度が20未満であった場合、値として20を代入して比および相対発現を算出した。アレイの試験は異なるRNA調製物で3回繰り返し、その平均の倍率変化は上に示している。相対発現レベルの2倍以上の変化を有するポリヌクレオチドを示す。
表19:RAWマクロファージ細胞の配列番号1処理によりダウンレギュレートされたポリヌクレオチドa
50μg/ml濃度のカチオン性ペプチドは、いくらかのポリヌクレオチドの発現を低減することが示された。ペプチドをRAW細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、Atlasアレイにハイブリダイズさせた。未刺激の細胞の強度は第3番目の欄に示している。「比 ペプチド:未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。アレイの試験は異なる細胞で3回繰り返し、その平均の倍率変化は下に示している。相対発現レベルの2倍以上の変化を有するポリヌクレオチドを示す。
50μg/ml濃度のカチオン性ペプチドは、いくらかのポリヌクレオチドの発現を低減することが示された。ペプチドをRAW細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、Atlasアレイにハイブリダイズさせた。未刺激の細胞の強度は第3番目の欄に示している。「比 ペプチド:未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。アレイの試験は異なる細胞で3回繰り返し、その平均の倍率変化は下に示している。相対発現レベルの2倍以上の変化を有するポリヌクレオチドを示す。
表20:ペプチド(配列番号1)に反応したポリヌクレオチド発現変化はRT−PCRにより確認することができる
RAW264.7マクロファージ細胞は、ペプチド50μ/mlと共にまたは培地のみで、4時間インキュベートし、全RNAを単離し、半定量的RT−PCRに供した。各ポリヌクレオチドに対する特異的プライマーペアをRNAの増幅に用いた。陽性対照として、および標準化のために、β−アクチンの増幅を用いた。RT−PCR産物について濃度測定分析を用いた。これらの結果は、培地のみでインキュベートした細胞に比べて、ペプチドで処理した細胞のポリヌクレオチド発現の相対的な倍率変化を意味する。データは3回の実験の平均±標準誤差として示す。
RAW264.7マクロファージ細胞は、ペプチド50μ/mlと共にまたは培地のみで、4時間インキュベートし、全RNAを単離し、半定量的RT−PCRに供した。各ポリヌクレオチドに対する特異的プライマーペアをRNAの増幅に用いた。陽性対照として、および標準化のために、β−アクチンの増幅を用いた。RT−PCR産物について濃度測定分析を用いた。これらの結果は、培地のみでインキュベートした細胞に比べて、ペプチドで処理した細胞のポリヌクレオチド発現の相対的な倍率変化を意味する。データは3回の実験の平均±標準誤差として示す。
表21:A549上皮細胞のペプチド処理によりアップレギュレートされたポリヌクレオチドa
50μg/ml濃度のカチオン性ペプチドは、いくつかのポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトcDNAアレイID#PRHU03−S3にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2の欄に示している。「比 ペプチド:未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
50μg/ml濃度のカチオン性ペプチドは、いくつかのポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトcDNAアレイID#PRHU03−S3にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2の欄に示している。「比 ペプチド:未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表22:A549上皮細胞のペプチド処理によりダウンレギュレートされたポリヌクレオチドa
50μg/ml濃度のカチオン性ペプチドは、いくつかのポリヌクレオチドの発現を低下させることを示した。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトcDNAアレイID#PRHU03−S3にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2の欄に示している。「比 ペプチド:未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
50μg/ml濃度のカチオン性ペプチドは、いくつかのポリヌクレオチドの発現を低下させることを示した。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトcDNAアレイID#PRHU03−S3にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2の欄に示している。「比 ペプチド:未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表23:A549細胞のペプチド処理によりアップレギュレートされた前炎症性ポリヌクレオチド
50μg/ml濃度のカチオン性ペプチドは、ある種の前炎症性ポリヌクレオチドの発現を高めることが示された(データは表21の一部である)。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトcDNAアレイID#PRHU03−S3にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2の欄に示している。「比 ペプチド:未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
50μg/ml濃度のカチオン性ペプチドは、ある種の前炎症性ポリヌクレオチドの発現を高めることが示された(データは表21の一部である)。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトcDNAアレイID#PRHU03−S3にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2の欄に示している。「比 ペプチド:未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表24:A549細胞のペプチド処理によりダウンレギュレートされた前炎症性ポリヌクレオチド
50μg/ml濃度のカチオン性ペプチドは、ある種の前炎症性ポリヌクレオチドの発現を低下させることが示された(データは表22の一部である)。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトcDNAアレイID#PRHU03−S3にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2の欄に示している。「比 ペプチド:未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
50μg/ml濃度のカチオン性ペプチドは、ある種の前炎症性ポリヌクレオチドの発現を低下させることが示された(データは表22の一部である)。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトcDNAアレイID#PRHU03−S3にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2の欄に示している。「比 ペプチド:未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表25:A549細胞のペプチド処理によりアップレギュレートされた抗炎症性ポリヌクレオチド
50μg/ml濃度のカチオン性ペプチドは、ある種の前炎症性ポリヌクレオチドの発現を高めることが示された(データは表21の一部である)。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトcDNAアレイID#PRHU03−S3にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2の欄に示している。「比 ペプチド:未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
50μg/ml濃度のカチオン性ペプチドは、ある種の前炎症性ポリヌクレオチドの発現を高めることが示された(データは表21の一部である)。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトcDNAアレイID#PRHU03−S3にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2の欄に示している。「比 ペプチド:未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表26:A549細胞のペプチド処理によりダウンレギュレートされた抗炎症性ポリヌクレオチド
50μg/ml濃度のカチオン性ペプチドは、ある種の前炎症性ポリヌクレオチドの発現を高めることが示された(データは表21の一部である)。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトcDNAアレイID#PRHU03−S3にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2の欄に示している。「比 ペプチド:未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
50μg/ml濃度のカチオン性ペプチドは、ある種の前炎症性ポリヌクレオチドの発現を高めることが示された(データは表21の一部である)。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトcDNAアレイID#PRHU03−S3にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2の欄に示している。「比 ペプチド:未刺激」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表27:一次ヒトマクロファージにおいて配列番号6によりアップレギュレートされたポリヌクレオチド
50μg/ml濃度の配列番号6のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトマクロファージと4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2の欄に示している。「比 ペプチド処理:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
50μg/ml濃度の配列番号6のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトマクロファージと4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2の欄に示している。「比 ペプチド処理:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表28:一次ヒトマクロファージにおいて配列番号6によりダウンレギュレートされたポリヌクレオチド
50μg/ml濃度の配列番号6のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトマクロファージと4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2の欄に示している。「比 ペプチド処理:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
50μg/ml濃度の配列番号6のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトマクロファージと4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2の欄に示している。「比 ペプチド処理:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表29:HBE細胞において配列番号1によりアップレギュレートされたポリヌクレオチド
50μg/ml濃度の配列番号1のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトHBE上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2の欄に示している。「比 ペプチド:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
50μg/ml濃度の配列番号1のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトHBE上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2の欄に示している。「比 ペプチド:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表30:HBE細胞においてペプチド(50μg/ml:配列番号1)によりダウンレギュレートされたポリヌクレオチド
50μg/ml濃度の配列番号1のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を低下させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第3の欄に示している。「比 ペプチド:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
50μg/ml濃度の配列番号1のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を低下させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。未刺激の細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第3の欄に示している。「比 ペプチド:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表31:式Aのペプチドにより誘導されるA549細胞のポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
50μg/ml濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2欄および第3欄に、色素Cy3およびCy5で各々標識したcDNAについて示している。「ID#:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
50μg/ml濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2欄および第3欄に、色素Cy3およびCy5で各々標識したcDNAについて示している。「ID#:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表32:式Bのペプチドにより誘導されるA549細胞のポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
50μg/ml濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2欄および第3欄に、色素Cy3およびCy5で各々標識したcDNAについて示している。「ID#:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
50μg/ml濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2欄および第3欄に、色素Cy3およびCy5で各々標識したcDNAについて示している。「ID#:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表33:式Cのペプチドにより誘導されるA549細胞のポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
50μg/ml濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2欄および第3欄に、色素Cy3およびCy5で各々標識したcDNAについて示している。「ID#:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
50μg/ml濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2欄および第3欄に、色素Cy3およびCy5で各々標識したcDNAについて示している。「ID#:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表34:式Dのペプチドにより誘導されるA549細胞のポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
50μg/ml濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2欄および第3欄に、色素Cy3およびCy5で各々標識したcDNAについてそれぞれ示している。「ID#:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
50μg/ml濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2欄および第3欄に、色素Cy3およびCy5で各々標識したcDNAについてそれぞれ示している。「ID#:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表35:式Eのペプチドにより誘導されるA549細胞のポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
50μg/ml濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2欄および第3欄に、色素Cy3およびCy5で各々標識したcDNAについてそれぞれ示している。「ID#:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
50μg/ml濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2欄および第3欄に、色素Cy3およびCy5で各々標識したcDNAについてそれぞれ示している。「ID#:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表36:式Fのペプチドにより誘導されるA549細胞のポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
50μg/ml濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2欄および第3欄に、色素Cy3およびCy5で各々標識したcDNAについてそれぞれ示している。「ID#:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
50μg/ml濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2欄および第3欄に、色素Cy3およびCy5で各々標識したcDNAについてそれぞれ示している。「ID#:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表37:式Gおよび別のペプチドにより誘導されるA549細胞のポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
50μg/ml濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2欄および第3欄に、色素Cy3およびCy5で標識したcDNAについてそれぞれ示している。「ID#:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。登録番号および遺伝子記号表示は、U00115(ジンクフィンガータンパク質);M91036(ヘモグロビンガンマG);K000070(推定タンパク質);AF055889(溶質キャリアーファミリー27);AK001490(推定タンパク質);X97674(核受容体コアクチベーター2);AB022847(未知);AJ275986(転写因子);D10495(プロテインキナーゼC、δ);L36642(EphA7);M31166(ペンタキシン関連遺伝子);AF176012(未知);AF072756(キナーゼアンカータンパク質4);NM014439(IL−1スーパーファミリーz);AJ271351(推定上の転写制御因子);AK000576(推定タンパク質);AJ272265(分泌型リンタンパク質2);AL122038(推定タンパク質);AK000307(推定タンパク質);AB029001(K1AA1078タンパク質);U62437(コリン作動性受容体);AF064854(未知);AL031588(推定タンパク質);X89399(RASp21タンパク質アクチベーター);D45399(ホスホジエステラーゼ);AB037716(推定タンパク質);X79981(カドヘリン5);AF034208(RIG様7−1);AL133355(21番染色体オープンリーディングフレーム53);NM_016281(STE様キナーゼ);AF023614(膜貫通アクチベーターおよびCAMLインターアクター);AF056717(ash2様);AB029039(KIAA1116タンパク質);J03634(インヒビン、βA);U80764(未知);AB032963(未知);X82835(ナトリウムチャンネル、電位作動型、IX型)である。
50μg/ml濃度のペプチドは、多数のポリヌクレオチドの発現を高めることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度は第2欄および第3欄に、色素Cy3およびCy5で標識したcDNAについてそれぞれ示している。「ID#:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。登録番号および遺伝子記号表示は、U00115(ジンクフィンガータンパク質);M91036(ヘモグロビンガンマG);K000070(推定タンパク質);AF055889(溶質キャリアーファミリー27);AK001490(推定タンパク質);X97674(核受容体コアクチベーター2);AB022847(未知);AJ275986(転写因子);D10495(プロテインキナーゼC、δ);L36642(EphA7);M31166(ペンタキシン関連遺伝子);AF176012(未知);AF072756(キナーゼアンカータンパク質4);NM014439(IL−1スーパーファミリーz);AJ271351(推定上の転写制御因子);AK000576(推定タンパク質);AJ272265(分泌型リンタンパク質2);AL122038(推定タンパク質);AK000307(推定タンパク質);AB029001(K1AA1078タンパク質);U62437(コリン作動性受容体);AF064854(未知);AL031588(推定タンパク質);X89399(RASp21タンパク質アクチベーター);D45399(ホスホジエステラーゼ);AB037716(推定タンパク質);X79981(カドヘリン5);AF034208(RIG様7−1);AL133355(21番染色体オープンリーディングフレーム53);NM_016281(STE様キナーゼ);AF023614(膜貫通アクチベーターおよびCAMLインターアクター);AF056717(ash2様);AB029039(KIAA1116タンパク質);J03634(インヒビン、βA);U80764(未知);AB032963(未知);X82835(ナトリウムチャンネル、電位作動型、IX型)である。
各種ペプチドによる、細胞系、ヒト全血における、およびマウスにおけるケモカインの誘導
マウスマクロファージ細胞系RAW264.7、THP−1細胞(ヒト単球)、ヒト上皮細胞系(A549)、ヒト気管支上皮細胞(16HBEo14)、およびヒト全血を用いた。HBE細胞はEarleを添加したMEMで増殖させた。THP−1細胞は、RPMI1640培地で増殖、維持した。RAWおよびA549細胞系は、10%ウシ胎仔血清を添加したDMEM中で維持した。DMEM(上記参照)の1ウェル当たり106個の細胞密度にて、これらの細胞を24ウェルプレートに播種した。また、A549細胞は、DMEM(上記参照)の1ウェル当たり105個の細胞密度にて、24ウェルプレートに播種した。両細胞は一晩5%CO2下で37℃にてインキュベートした。DMEMを一晩増殖させた細胞から吸引し、新しい培地と交換した。これらの細胞をペプチドとインキュベーションした後、培養液上清中へのケモカインの放出についてELISA(R & D Systems、Minneapolis、ミネソタ州)によって検出した。
マウスマクロファージ細胞系RAW264.7、THP−1細胞(ヒト単球)、ヒト上皮細胞系(A549)、ヒト気管支上皮細胞(16HBEo14)、およびヒト全血を用いた。HBE細胞はEarleを添加したMEMで増殖させた。THP−1細胞は、RPMI1640培地で増殖、維持した。RAWおよびA549細胞系は、10%ウシ胎仔血清を添加したDMEM中で維持した。DMEM(上記参照)の1ウェル当たり106個の細胞密度にて、これらの細胞を24ウェルプレートに播種した。また、A549細胞は、DMEM(上記参照)の1ウェル当たり105個の細胞密度にて、24ウェルプレートに播種した。両細胞は一晩5%CO2下で37℃にてインキュベートした。DMEMを一晩増殖させた細胞から吸引し、新しい培地と交換した。これらの細胞をペプチドとインキュベーションした後、培養液上清中へのケモカインの放出についてELISA(R & D Systems、Minneapolis、ミネソタ州)によって検出した。
動物試験は、UBC Animal Care Committee(UBC ACC#A01-0008)により承認されている。BALB/cマウスはCharles River Laboratoriesから購入し、標準の動物施設内で飼育した。年齢、性別および重量一致の成体マウスにアベルチンの腹腔内注射(蒸留水中、4.4mM 2−2−2−トリブロモエタノール、2.5%2−メチル−2−ブタノール、体重10g当たり200μlを使用)により麻酔をかけた。点滴注入は、HoおよびFurstの方法(1973)を改良した非外科的な気管内点滴注入方法を用いて行った。簡単に説明すると、麻酔をかけられたマウスは、支持フレームの上端に、上部の歯をワイヤーにひっかけながら、あごを開けたまま、咽頭、喉頭および気管を垂直に直線に並ぶような位置を決めるために、胸部を前にそらせて押して置いた。気道を外部から照らし、挿管カテーテルを気管内腔内に挿入した。ペプチド懸濁液20μlまたは滅菌水をカテーテルの近位端のウェル内に入れ、200μlの空気とともに気管内にゆるやかに注入した。点滴注入後2分間、動物を直立位置で保持し、液体が呼吸樹へ流れるようにした。4時間後、ペントバルビタール300mg/kgを腹腔内注射してマウスを安楽死させた。気管を露出させ、静脈内カテーテルを近位の気管に入れ、縫合糸でそのまま結んだ。洗浄は、気管カニューレを通して肺へ0.75mlの滅菌PBSを導入し、数秒後にその液体を取り出すことによって行った。PBSの同一サンプルでこれを3回繰り返した。氷上のチューブに洗浄液体を入れ、マウス1匹当たりの全回収容量は約0.5mlであった。この気管支肺胞洗浄(BAL)液体を10分間、1200rpmで遠心分離し、透明な上清を取り出し、TNF−αおよびMCP−1についてELISAにより分析した。
カチオン性ペプチドによるケモカインのアップレギュレーションはいくつかの異なる系で確認された。マウスMCP−1(ヒトMCP−1の相同体)は、β(C−C)ケモカインファミリーのメンバーである。MCP−1は、単球、ナチュラルキラー細胞およびいくつかのTリンパ球をリクルートすることが実証されている。3名のドナー由来のヒト全血とRAW264.7マクロファージ細胞を濃度を次第に高めたペプチド(配列番号1)で刺激すると、ELISAで判定した場合、それらは上清中に有意なレベルのMCP−1を産生した(表36)。24時間、20〜50μg/mlの範囲のペプチド濃度で刺激したRAW264.7細胞は、有意なレベルのMCP−1を産生した(バックグラウンドより200〜400pg/ml高い)。細胞(24時間)および全血(4時間)を100μg/mlのLL−37で刺激した場合、高濃度のMCP−1が産生された。
また、ケモカイン誘導に対するカチオン性ペプチドの影響については、完全に異なる細胞系(A549ヒト上皮細胞)でも試験した。興味深いことに、これらの細胞はLPSに応じてMCP−1を産生し、この応答はペプチドにより拮抗され得るが、ペプチド(配列番号1)に対する直接応答ではA549細胞によるMCP−1の産生はなかった。しかし、高濃度のペプチド(配列番号1)は、IL−8(好中球特異的ケモカイン)の産生を誘導した(表37)。したがって、配列番号1は、異なる細胞型からの、また異なる濃度の、異なる範囲の応答を誘導し得る。式群の各々からの多数のペプチドについて、A549細胞におけるIL−8の誘導能力を試験した(表38)。これらのペプチドの多くは、低濃度(10μg/ml)において、バックグラウンドレベル以上のIL−8を誘導した。また、高濃度(100μg/ml)の配列番号13は、ヒト全血においてIL−8を誘導することが確認された(表39)。さらに、ペプチド(配列番号2)は、有意にHBE細胞(表40)および未分化THP−1細胞(表41)においてIL−8を誘導した。
BALB/cマウスには、気管内点滴注入により配列番号1または菌体内毒素非含有水が与えられ、3〜4時間後、MCP−1およびTNF−αの濃度を気管支肺胞洗浄液体で試験した。50μg/mlのペプチド(配列番号1)で処理したマウスは、水または麻酔薬のみを与えられたマウスよりも有意に上昇した濃度のMCP−1を産生することを確認した(表42)。ペプチドが、水または麻酔薬のみを与えられたマウスよりもTNF−αを有意に誘導しなかったので、これはペプチド(配列番号1)に対する前炎症性反応ではなかった。また、ペプチド(配列番号1)では、ペプチド(配列番号1)(最高100μg/ml)で処理したRAW264.7細胞および骨髄由来マクロファージによってTNF−αの産生が有意に誘導されなかったことを確認した(表43)。したがって、ペプチド(配列番号1)は、TNF−αなどの炎症伝達物質の産生は誘導せず、ケモカインの産生を選択的に誘導する。これは、感染を排除可能な食細胞をリクルートするのを促進しながら、細菌産物で誘導された炎症を遮断することができる要素としてのペプチド(配列番号1)の2重の機能を示すものである。
表38:RAW264.7細胞およびヒト全血におけるMCP−1の誘導
RAW264.7マウスマクロファージ細胞またはヒト全血は、4時間にわたり濃度を次第に高めたLL−37で刺激した。ヒト血液サンプルを遠心分離にかけ、血清を取り出し、RAW264.7細胞由来の上清とともにELISAによりMCP−1について分析した。RAW細胞データは3回以上の実験の平均±標準誤差を示し、ヒト血液データは3名の個別のドナーから得られた平均±標準誤差を表わす。
RAW264.7マウスマクロファージ細胞またはヒト全血は、4時間にわたり濃度を次第に高めたLL−37で刺激した。ヒト血液サンプルを遠心分離にかけ、血清を取り出し、RAW264.7細胞由来の上清とともにELISAによりMCP−1について分析した。RAW細胞データは3回以上の実験の平均±標準誤差を示し、ヒト血液データは3名の個別のドナーから得られた平均±標準誤差を表わす。
表39:A549細胞およびヒト全血におけるIL−8の誘導
A549細胞またはヒト全血は、24時間および4時間、それぞれ濃度を次第に高めたペプチドで刺激した。ヒト血液サンプルを遠心分離にかけ、血清を取り出し、A549細胞由来の上清とともにELISAによりIL−8について分析した。A549細胞データは3回以上の実験の平均±標準誤差を示し、ヒト血液データは平均±3名の個別のドナーの標準誤差を表わす。
A549細胞またはヒト全血は、24時間および4時間、それぞれ濃度を次第に高めたペプチドで刺激した。ヒト血液サンプルを遠心分離にかけ、血清を取り出し、A549細胞由来の上清とともにELISAによりIL−8について分析した。A549細胞データは3回以上の実験の平均±標準誤差を示し、ヒト血液データは平均±3名の個別のドナーの標準誤差を表わす。
表41:ヒト血液におけるIL−8のペプチドによる誘導
ヒト全血は、4時間にわたり濃度を次第に高めたペプチドで刺激した。ヒト血液サンプルを遠心分離にかけ、血清を取り出し、ELISAによりIL−8について分析した。示したデータは、2名のドナーの平均である。
ヒト全血は、4時間にわたり濃度を次第に高めたペプチドで刺激した。ヒト血液サンプルを遠心分離にかけ、血清を取り出し、ELISAによりIL−8について分析した。示したデータは、2名のドナーの平均である。
表42:HBE細胞におけるIL−8の誘導
濃度を次第に高めたペプチドを8時間かけてHBE細胞とインキュベートし、上清を取り出し、IL−8について試験した。データは、3回以上の実験平均±標準誤差として示す。
濃度を次第に高めたペプチドを8時間かけてHBE細胞とインキュベートし、上清を取り出し、IL−8について試験した。データは、3回以上の実験平均±標準誤差として示す。
表44:マウス気道におけるペプチド(配列番号1)によるMCP−1の誘導
BALB/cマウスは、アベルチンで麻酔をかけ、ペプチドまたは水を気管内点滴注入するか、点滴注入は行わなかった(未処置)。マウスを4時間モニターし、麻酔をかけ、BAL液体を単離し、MCP−1およびTNF−α濃度についてELISAにより分析した。示したデータは、各条件におけるマウス4匹または5匹の平均±標準誤差である。
BALB/cマウスは、アベルチンで麻酔をかけ、ペプチドまたは水を気管内点滴注入するか、点滴注入は行わなかった(未処置)。マウスを4時間モニターし、麻酔をかけ、BAL液体を単離し、MCP−1およびTNF−α濃度についてELISAにより分析した。示したデータは、各条件におけるマウス4匹または5匹の平均±標準誤差である。
カチオン性ペプチドはケモカイン受容体の表面発現を増加させる
IL−8RB、CXCR−4、CCR2およびLFA−1の細胞表面発現の分析をするために、10μg/mlの適当な一次抗体(Santa Cruz Biotechnology)、次いでFITC結合ヤギ抗ウサギIgG[IL−8RBおよびCXCR−4(Jackson ImmunoResearch Laboratories、West Grove、ペンシルベニア州)]またはFITC結合ロバ抗ヤギIgG(Santa Cruz)によりRAWマクロファージ細胞を染色した。これらの細胞は、FACscanを用いて、10,000の事象についてカウントし、細胞残屑を除去するために、前方および側方の散乱をゲート制御することによって分析した。
IL−8RB、CXCR−4、CCR2およびLFA−1の細胞表面発現の分析をするために、10μg/mlの適当な一次抗体(Santa Cruz Biotechnology)、次いでFITC結合ヤギ抗ウサギIgG[IL−8RBおよびCXCR−4(Jackson ImmunoResearch Laboratories、West Grove、ペンシルベニア州)]またはFITC結合ロバ抗ヤギIgG(Santa Cruz)によりRAWマクロファージ細胞を染色した。これらの細胞は、FACscanを用いて、10,000の事象についてカウントし、細胞残屑を除去するために、前方および側方の散乱をゲート制御することによって分析した。
ポリヌクレオチドアレイのデータは、それぞれ何種類かのペプチドが、ケモカイン受容体IL−8RB、CXCR−4およびCCR2の発現をそれぞれ未刺激細胞よりも10倍、4倍および1.4倍までアップレギュレートすることを示唆した。このポリヌクレオチドアレイのデータを確認するために、表面発現について、ペプチドで4時間刺激したRAW細胞上のこれらの受容体のフローサイトメトリーにより分析した。50μg/mlのペプチドを4時間RAW細胞と共にインキュベートした場合、IL−8RBは未刺激細胞よりも平均して2.4倍高くアップレギュレートされ、CXCR−4は未刺激細胞よりも平均して1.6倍アップレギュレートされ、CCR2は未刺激細胞よりも1.8倍アップレギュレートされた(表46)。対照では、CEMAに同様のアップレギュレーションが生じることが確認された。Bac2AはLFA−1の有意なアップレギュレーションを示すただ1つのペプチドであった(対照細胞の3.8倍超)。
カチオン性ペプチドによるMAPキナーゼのリン酸化
細胞を2.5×105〜5×105個/mlにて播種し、一晩放置した。これらの細胞を朝に血清飢餓培地で一度洗浄した(血清非含有培地−4時間)。培地を除去し、PBSと交換し、次いで、37℃で15分間置き、その後15分間で室温にした。ペプチドあるいはH2Oを添加し(濃度:0.1μg/ml〜50μg/ml)、10分間インキュベートした。PBSを迅速に除去し、阻害剤(NaF、B−グリセロリン酸塩、MOL、バナジン酸塩、PMSF、ロイペプチンアプロチニン)を含有する氷冷の放射性免疫沈降法(RIPA)バッファーと交換した。10〜15分間、あるいは細胞が溶解するまでプレートを氷上で振盪し、溶解物を回収した。THP−1細胞のための方法はわずかに異なっており、より多数の細胞(2×106個)を用いた。これらの細胞を一晩血清飢餓状態とし、反応を停止させるために1mlの氷冷PBSを添加し、次いで、それを氷上に5〜10分間置き、遠沈させ、次いで、RIPA中に再懸濁させた。タンパク質濃度はタンパク質アッセイ(Pierce, Rockford、イリノイ州)を用いて検出した。細胞溶解物(タンパク質20μg)はSDS−PAGEにより分離し、ニトロセルロースフィルターに移した。10mM Tris−HCl、pH7.5、150mM NaCl(TBS)/5%脱脂粉乳で1時間このフィルタをブロックし、次いで、TBS/0.05%Tween20に溶解した一次抗体を用いて一晩冷却しながらインキュベートした。TBS/0.05%Tween20で30分間洗浄した後、TBSに溶解した1μg/mlの二次抗体を用いて室温で1時間このフィルタをインキュベートした。TBS/0.05%Tween20で30分間フィルタを洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウスIgG(1:10,000、TBS/0.05%Tweenン20に溶解)を用いて室温にて1時間インキュベートした。TBS/0.1%Tween20で30分間フィルタを洗浄した後、高感度化学発光(ECL)検出により免疫反応バンドを可視化した。末梢血液単核細胞の実験では、末梢血(50〜100ml)をすべての被験体から採取した。単核細胞は、フィコール・ハイパックを用いた密度勾配遠心法により末梢血から単離した。静止期細胞(単核細胞)を回収し、洗浄し、次いで、10%ウシ胎仔血清(FCS)と1%のL−グルタミンを含む細胞培地(RPMI−1640)の推奨一次培地中に再懸濁した。細胞を4×106個/ウェルにて6枚のウェル培養プレートに細胞を添加し、1時間5%CO2雰囲気中で37℃にて固着させた。上清培地および非接着細胞を洗い流し、ペプチドを含む適当な培地を添加した。回収された新鮮な細胞は、細胞のトリパンブルー排除能力によって判断した結果、一貫して>99%の生存であった。ペプチドで刺激した後、種々のホスファターゼ阻害剤およびキナーゼ阻害剤の存在下でRIPAバッファー中の細胞を溶解することにより、溶解物を回収した。タンパク質含有量を分析し、約30μgの各サンプルを12%SDS−PAGEゲルに流した。ゲルをニトロセルロース膜上にブロッティングし、1%TritonX100含有Tris緩衝生理食塩水(TBS)に溶解した5%脱脂粉乳で1時間ブロッキングした。リン酸化は、リン酸化特異的抗体を用いて検出した。
細胞を2.5×105〜5×105個/mlにて播種し、一晩放置した。これらの細胞を朝に血清飢餓培地で一度洗浄した(血清非含有培地−4時間)。培地を除去し、PBSと交換し、次いで、37℃で15分間置き、その後15分間で室温にした。ペプチドあるいはH2Oを添加し(濃度:0.1μg/ml〜50μg/ml)、10分間インキュベートした。PBSを迅速に除去し、阻害剤(NaF、B−グリセロリン酸塩、MOL、バナジン酸塩、PMSF、ロイペプチンアプロチニン)を含有する氷冷の放射性免疫沈降法(RIPA)バッファーと交換した。10〜15分間、あるいは細胞が溶解するまでプレートを氷上で振盪し、溶解物を回収した。THP−1細胞のための方法はわずかに異なっており、より多数の細胞(2×106個)を用いた。これらの細胞を一晩血清飢餓状態とし、反応を停止させるために1mlの氷冷PBSを添加し、次いで、それを氷上に5〜10分間置き、遠沈させ、次いで、RIPA中に再懸濁させた。タンパク質濃度はタンパク質アッセイ(Pierce, Rockford、イリノイ州)を用いて検出した。細胞溶解物(タンパク質20μg)はSDS−PAGEにより分離し、ニトロセルロースフィルターに移した。10mM Tris−HCl、pH7.5、150mM NaCl(TBS)/5%脱脂粉乳で1時間このフィルタをブロックし、次いで、TBS/0.05%Tween20に溶解した一次抗体を用いて一晩冷却しながらインキュベートした。TBS/0.05%Tween20で30分間洗浄した後、TBSに溶解した1μg/mlの二次抗体を用いて室温で1時間このフィルタをインキュベートした。TBS/0.05%Tween20で30分間フィルタを洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウスIgG(1:10,000、TBS/0.05%Tweenン20に溶解)を用いて室温にて1時間インキュベートした。TBS/0.1%Tween20で30分間フィルタを洗浄した後、高感度化学発光(ECL)検出により免疫反応バンドを可視化した。末梢血液単核細胞の実験では、末梢血(50〜100ml)をすべての被験体から採取した。単核細胞は、フィコール・ハイパックを用いた密度勾配遠心法により末梢血から単離した。静止期細胞(単核細胞)を回収し、洗浄し、次いで、10%ウシ胎仔血清(FCS)と1%のL−グルタミンを含む細胞培地(RPMI−1640)の推奨一次培地中に再懸濁した。細胞を4×106個/ウェルにて6枚のウェル培養プレートに細胞を添加し、1時間5%CO2雰囲気中で37℃にて固着させた。上清培地および非接着細胞を洗い流し、ペプチドを含む適当な培地を添加した。回収された新鮮な細胞は、細胞のトリパンブルー排除能力によって判断した結果、一貫して>99%の生存であった。ペプチドで刺激した後、種々のホスファターゼ阻害剤およびキナーゼ阻害剤の存在下でRIPAバッファー中の細胞を溶解することにより、溶解物を回収した。タンパク質含有量を分析し、約30μgの各サンプルを12%SDS−PAGEゲルに流した。ゲルをニトロセルロース膜上にブロッティングし、1%TritonX100含有Tris緩衝生理食塩水(TBS)に溶解した5%脱脂粉乳で1時間ブロッキングした。リン酸化は、リン酸化特異的抗体を用いて検出した。
ペプチド誘導によるリン酸化の結果を表46にまとめてある。配列番号2は、マウスマクロファージRAW細胞系およびHBE細胞中のp38およびERK1/2に投与量依存的にリン酸化をもたらすことが分かった。配列番号3は、THP−1のヒト単球細胞系中のMAPキナーゼのリン酸化と、マウスRAW細胞系中のERK1/2のリン酸化をもたらした。
カチオン性ペプチドは免疫反応を増強することにより細菌感染に対して防御する
BALB/cマウスに、腹腔内注射により1×105個のサルモネラ菌とカチオン性ペプチド(200μg)を注入した。マウスを24時間モニターし、その時点でマウスを安楽死させ、脾臓を取り出し、ホモジナイズし、PBS中へ再懸濁し、カナマイシン(50μg/ml)含有のルリアブロス寒天プレート上に播種した。これらのプレートを37℃にて一晩インキュベートし、生存細菌をカウントした(表49および表50)。また、CD−1マウスに、腹腔内注射により5%ブタムチンに溶解した1×108個の黄色ブドウ球菌とカチオン性ペプチド(200μg)を注入した(表51)。3日間マウスをモニターし、その時点でマウスを安楽死させ、血液を採取し、生存数をカウントするためにプレートに播種した。また、CD−1オスマウスに、腹腔内注射(IP)により5.8×106CFUのEHEC細菌とカチオン性ペプチド(200μg)を注入し、3日間モニターした(表52)。これらの各動物モデルでは、ペプチドのサブセットが感染を防御することが示された。表50および表51の防御アッセイの結果を表31〜表37の遺伝子発現の結果と比較した場合、サルモネラ菌モデルで最も防御力のあるペプチドは上皮細胞の遺伝子の共通サブセットを誘導する能力を示した(表53)。これは、明らかに、ペプチドの防御能力と一致する遺伝子発現のパターンが存在することを示している。カチオン性ペプチドの多くは、最小発育阻止濃度(MIC)アッセイにより試験した場合、直接的に抗菌性ではないことが明らかであった(表54)。これは、ペプチドの感染からの防御能力が、直接的な抗菌活性によるものではなく、ペプチドが宿主先天性免疫を刺激する能力に依存していることを示している。
BALB/cマウスに、腹腔内注射により1×105個のサルモネラ菌とカチオン性ペプチド(200μg)を注入した。マウスを24時間モニターし、その時点でマウスを安楽死させ、脾臓を取り出し、ホモジナイズし、PBS中へ再懸濁し、カナマイシン(50μg/ml)含有のルリアブロス寒天プレート上に播種した。これらのプレートを37℃にて一晩インキュベートし、生存細菌をカウントした(表49および表50)。また、CD−1マウスに、腹腔内注射により5%ブタムチンに溶解した1×108個の黄色ブドウ球菌とカチオン性ペプチド(200μg)を注入した(表51)。3日間マウスをモニターし、その時点でマウスを安楽死させ、血液を採取し、生存数をカウントするためにプレートに播種した。また、CD−1オスマウスに、腹腔内注射(IP)により5.8×106CFUのEHEC細菌とカチオン性ペプチド(200μg)を注入し、3日間モニターした(表52)。これらの各動物モデルでは、ペプチドのサブセットが感染を防御することが示された。表50および表51の防御アッセイの結果を表31〜表37の遺伝子発現の結果と比較した場合、サルモネラ菌モデルで最も防御力のあるペプチドは上皮細胞の遺伝子の共通サブセットを誘導する能力を示した(表53)。これは、明らかに、ペプチドの防御能力と一致する遺伝子発現のパターンが存在することを示している。カチオン性ペプチドの多くは、最小発育阻止濃度(MIC)アッセイにより試験した場合、直接的に抗菌性ではないことが明らかであった(表54)。これは、ペプチドの感染からの防御能力が、直接的な抗菌活性によるものではなく、ペプチドが宿主先天性免疫を刺激する能力に依存していることを示している。
表49:BALB/cマウスのサルモネラ菌感染に対するカチオン性ペプチドの効果
サルモネラ菌とペプチドとをBALB/cマウスに腹腔内注射し、24時間後に動物を安楽死させ、脾臓を取り出し、ホモジナイズし、PBSで希釈し、細菌生存率を測定するためにプレートによるカウントを行った。
サルモネラ菌とペプチドとをBALB/cマウスに腹腔内注射し、24時間後に動物を安楽死させ、脾臓を取り出し、ホモジナイズし、PBSで希釈し、細菌生存率を測定するためにプレートによるカウントを行った。
表50:BALB/cマウスのサルモネラ菌感染に対するカチオン性ペプチドの効果
サルモネラ菌とペプチドとをBALB/cマウスに腹腔内注射し、24時間後に動物を安楽死させ、脾臓を取り出し、ホモジナイズし、PBSで希釈し、細菌生存率を測定するためにプレートによるカウントを行った。
サルモネラ菌とペプチドとをBALB/cマウスに腹腔内注射し、24時間後に動物を安楽死させ、脾臓を取り出し、ホモジナイズし、PBSで希釈し、細菌生存率を測定するためにプレートによるカウントを行った。
表51:マウス黄色ブドウ球菌感染モデルにおけるカチオン性ペプチドの効果
CD−1マウスに、腹腔内(IP)注射により5%ブタムチンに溶解した1×108個の細菌を注入した。また別の腹腔内注射によりカチオン性ペプチド(200μg)を注入した。3日間マウスをモニターし、その時点でマウスを安楽死させ、血液を採取し、生存数カウントのためにプレートに播種した。以下のペプチド、すなわち、配列番号48、配列番号26は、黄色ブドウ球菌感染の制御に有効ではなかった。
CD−1マウスに、腹腔内(IP)注射により5%ブタムチンに溶解した1×108個の細菌を注入した。また別の腹腔内注射によりカチオン性ペプチド(200μg)を注入した。3日間マウスをモニターし、その時点でマウスを安楽死させ、血液を採取し、生存数カウントのためにプレートに播種した。以下のペプチド、すなわち、配列番号48、配列番号26は、黄色ブドウ球菌感染の制御に有効ではなかった。
表52:マウスEHEC感染モデルにおけるペプチドの効果
CD−1オスマウス(5週齢)に、腹腔内(IP)注射により5.8×106CFUのEHEC細菌を注入した。また別の腹腔内注射によりカチオン性ペプチド(200μg)を注入した。3日間マウスをモニターした。
CD−1オスマウス(5週齢)に、腹腔内(IP)注射により5.8×106CFUのEHEC細菌を注入した。また別の腹腔内注射によりカチオン性ペプチド(200μg)を注入した。3日間マウスをモニターした。
表53:in vivoで活性であるペプチドにより誘導されたA549上皮細胞の遺伝子発現パターンのアップレギュレーション
50μg/ml濃度の配列番号30、配列番号7および配列番号13のペプチドは、それぞれ4時間処理した後、遺伝子のパターン発現を高めることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識したcDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞のポリヌクレオチドの強度を、cDNAの標識(Cy3とCy5の平均)について第2欄に示す。アップレギュレーション倍率の欄は、未刺激細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を表している。マウス感染モデルで活性のなかった陰性対照として、配列番号37のペプチドが含まれていた。
50μg/ml濃度の配列番号30、配列番号7および配列番号13のペプチドは、それぞれ4時間処理した後、遺伝子のパターン発現を高めることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識したcDNAプローブに変換し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の未刺激細胞のポリヌクレオチドの強度を、cDNAの標識(Cy3とCy5の平均)について第2欄に示す。アップレギュレーション倍率の欄は、未刺激細胞の強度で割った、ペプチドで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を表している。マウス感染モデルで活性のなかった陰性対照として、配列番号37のペプチドが含まれていた。
表54:ここで研究した大部分のカチオン性ペプチドと特に感染モデルで有効なカチオン性ペプチドは有意に抗菌性ではない。ペプチドの希釈系列を96ウェルプレートにおいて表示している細菌と一晩インキュベートした。細菌を死滅させたペプチドの最低濃度をMICとして用いた。>の記号は、MICが測定するには大きすぎることを示す。8μ/ml以下のMICは、臨床的に有効な活性であると考えられた。略語:大腸菌、Escherichia coli;黄色ブドウ球菌、Staphylococcus aureus;緑膿菌、Pseudomonas aeruginosa;ネズミチフス菌、Salmonella enteritidis ssp. typhimurium;C.ローデンシス、Citobacter rhodensis;EHEC、Enterohaemorrhagic E. coli。
細菌性シグナル伝達分子により誘導されたポリヌクレオチドの診断薬/スクリーニングにおける使用
ネズミチフス菌LPSおよび大腸菌O111:B4 LPSをSigma Chemical Co.(St. Louis、ミズーリ州)から購入した。黄色ブドウ球菌由来のLTA(Sigma)を内毒素不含の水(Sigma)に再懸濁した。ロットが内毒素で顕著に汚染されていないこと(すなわち<1ng/ml、RAW細胞アッセイにおいて有意なサイトカイン産生が起こらなかった濃度)を確認するために、LTA製剤についてリムルス試薬(カブトガニ血球抽出物)アッセイ(Sigma)を行った。CpGオリゴデオキシヌクレオチドは、Applied Biosystems Inc.のDNA/RNAシンセサイザー392モデル(Mississauga、オンタリオ州)で合成し、精製後、内毒素不含の水(Sigma)に再懸濁した。以下の配列、CpG:5’−TCATGACGTTCCTGACGTT−3’(配列番号57)と非CpG:5’−TTCAGGACTTTCCTCAGGTT−3’(配列番号58)を用いた。非CpGオリゴは、サイトカインの産生を刺激する能力について試験しTNF−αまたはIL−6の有意な産生をもたらすことがないことを確認した。したがって、非CpGオリゴは陰性対照とみなした。RNAは、培地のみ、100ng/mlのネズミチフス菌LPS、1μg/mlの黄色ブドウ球菌LTA、または1μMのCpG(RAW細胞の腫瘍壊死因子(TNF−α)を最適に誘導した濃度)と4時間インキュベートされたRAW264.7細胞から単離した。RNAは、cDNAプローブをポリヌクレオチド形成するために用い、これは上述のようにClontech Atlasポリヌクレオチドアレイフィルタにハイブリダイズさせた。各固定化DNAへのcDNAプローブのハイブリダイゼーションは、オートラジオグラフィーによって可視化し、ホスフォイメージャーにより定量した。少なくとも2〜3の独立した実験から得られた結果を表55〜表59にまとめている。RAW264.7細胞をLPS処理すると、炎症性タンパク質(例えば、IL−1β、誘導性一酸化窒素合成酵素(iNOS)、MIP−1α、MIP−1β、MIP−2α、CD40、および種々の転写因子)をコードするポリヌクレオチドを含む60種類を超えるポリヌクレオチドの発現が高まることが分かった。LPS、LTAおよびCpG DNAにより誘導されたポリヌクレオチド発現の変化を比較した場合、これら3種類すべての細菌産物は、前炎症性ポリヌクレオチド(例えば、iNOS、MIP−1α、MIP−2α、IL−1β、IL−15、TNFR1およびNF−κBなど)の発現を同程度まで高めることが分かった(表57)。表57は、それらの刺激比が3種類の細菌産物の間で1.5倍未満で異なる、細菌産生物により同程度までアップレギュレートされた19種類のポリヌクレオチドを記載している。また、同程度までLPS、LTAおよびCpGによりダウンレギュレートされた数種類のポリヌクレオチドもあった。3つの細菌産物に応じて異なって調節された多数のポリヌクレオチドがあり(表58)、それには、1以上の細菌産物間で1.5倍を超える発現レベルで異なった多くのポリヌクレオチドが含まれることが確認された。LTA処理は、LPSまたはCpGと比較して、Jun−D、Jun−B、Elk−1、ならびにサイクリンG2およびA1の発現の超刺激をはじめとして、ポリヌクレオチドの最大のサブセットの発現に示差的に影響を及ぼした。LPSまたはCpG処理によりその発現がさらに改変されたポリヌクレオチドもわずかにあった。LTAまたはCpG処理と比較して、LPS処理に基づいて発現が選択的に高まったポリヌクレオチドには、cAMP応答エレメントDNA結合タンパク質1(CRE−BP1)、インターフェロン誘導性タンパク質1、およびCACCCボックス結合タンパク質BKLFが含まれていた。LPSまたはLTA処理と比較して、CpG処理後に発現を選択的に高めたポリヌクレオチドには、白血病抑制因子(LIF)およびプロテアーゼネキシン1(PN−1)が含まれていた。これらの結果は、LPS、LTAおよびCpG DNAは大きく重複してポリヌクレオチド発現応答を刺激するが、それらはまたポリヌクレオチドのある種のサブセットを調節する異なる能力を示すことを示唆している。
ネズミチフス菌LPSおよび大腸菌O111:B4 LPSをSigma Chemical Co.(St. Louis、ミズーリ州)から購入した。黄色ブドウ球菌由来のLTA(Sigma)を内毒素不含の水(Sigma)に再懸濁した。ロットが内毒素で顕著に汚染されていないこと(すなわち<1ng/ml、RAW細胞アッセイにおいて有意なサイトカイン産生が起こらなかった濃度)を確認するために、LTA製剤についてリムルス試薬(カブトガニ血球抽出物)アッセイ(Sigma)を行った。CpGオリゴデオキシヌクレオチドは、Applied Biosystems Inc.のDNA/RNAシンセサイザー392モデル(Mississauga、オンタリオ州)で合成し、精製後、内毒素不含の水(Sigma)に再懸濁した。以下の配列、CpG:5’−TCATGACGTTCCTGACGTT−3’(配列番号57)と非CpG:5’−TTCAGGACTTTCCTCAGGTT−3’(配列番号58)を用いた。非CpGオリゴは、サイトカインの産生を刺激する能力について試験しTNF−αまたはIL−6の有意な産生をもたらすことがないことを確認した。したがって、非CpGオリゴは陰性対照とみなした。RNAは、培地のみ、100ng/mlのネズミチフス菌LPS、1μg/mlの黄色ブドウ球菌LTA、または1μMのCpG(RAW細胞の腫瘍壊死因子(TNF−α)を最適に誘導した濃度)と4時間インキュベートされたRAW264.7細胞から単離した。RNAは、cDNAプローブをポリヌクレオチド形成するために用い、これは上述のようにClontech Atlasポリヌクレオチドアレイフィルタにハイブリダイズさせた。各固定化DNAへのcDNAプローブのハイブリダイゼーションは、オートラジオグラフィーによって可視化し、ホスフォイメージャーにより定量した。少なくとも2〜3の独立した実験から得られた結果を表55〜表59にまとめている。RAW264.7細胞をLPS処理すると、炎症性タンパク質(例えば、IL−1β、誘導性一酸化窒素合成酵素(iNOS)、MIP−1α、MIP−1β、MIP−2α、CD40、および種々の転写因子)をコードするポリヌクレオチドを含む60種類を超えるポリヌクレオチドの発現が高まることが分かった。LPS、LTAおよびCpG DNAにより誘導されたポリヌクレオチド発現の変化を比較した場合、これら3種類すべての細菌産物は、前炎症性ポリヌクレオチド(例えば、iNOS、MIP−1α、MIP−2α、IL−1β、IL−15、TNFR1およびNF−κBなど)の発現を同程度まで高めることが分かった(表57)。表57は、それらの刺激比が3種類の細菌産物の間で1.5倍未満で異なる、細菌産生物により同程度までアップレギュレートされた19種類のポリヌクレオチドを記載している。また、同程度までLPS、LTAおよびCpGによりダウンレギュレートされた数種類のポリヌクレオチドもあった。3つの細菌産物に応じて異なって調節された多数のポリヌクレオチドがあり(表58)、それには、1以上の細菌産物間で1.5倍を超える発現レベルで異なった多くのポリヌクレオチドが含まれることが確認された。LTA処理は、LPSまたはCpGと比較して、Jun−D、Jun−B、Elk−1、ならびにサイクリンG2およびA1の発現の超刺激をはじめとして、ポリヌクレオチドの最大のサブセットの発現に示差的に影響を及ぼした。LPSまたはCpG処理によりその発現がさらに改変されたポリヌクレオチドもわずかにあった。LTAまたはCpG処理と比較して、LPS処理に基づいて発現が選択的に高まったポリヌクレオチドには、cAMP応答エレメントDNA結合タンパク質1(CRE−BP1)、インターフェロン誘導性タンパク質1、およびCACCCボックス結合タンパク質BKLFが含まれていた。LPSまたはLTA処理と比較して、CpG処理後に発現を選択的に高めたポリヌクレオチドには、白血病抑制因子(LIF)およびプロテアーゼネキシン1(PN−1)が含まれていた。これらの結果は、LPS、LTAおよびCpG DNAは大きく重複してポリヌクレオチド発現応答を刺激するが、それらはまたポリヌクレオチドのある種のサブセットを調節する異なる能力を示すことを示唆している。
使用した他のポリヌクレオチドアレイは、重複してスポットされた約14,000個のヒトオリゴからなる、ヒトオペロンアレイ(ゲノムに対する識別番号はPRHU04−S1)である。プローブは全RNA5μから調製し、Cy3またはCy5標識dUTPで標識した。これらの実験では、A549上皮細胞を2.5×106個/皿にて100mmの組織培養皿に播種し、一晩インキュベートし、次いで、100ng/mlの大腸菌O111:B4 LPSで4時間刺激した。全RNAはRNAqueous(Ambion)を使用して単離した。DNA混入はDNA不含キット(Ambion)を用いて除去した。全RNAから調製したプローブを精製し、42℃にて転写されたガラススライドに一晩ハイブリダイズさせ、洗浄した。洗浄後、Perkin Elmerアレイスキャナーを用いて画像を記録した。画像処理ソフトウェア(Imapolynucleotide 5.0、Marina Del Rey、カリフォルニア州)は、スポット平均強度、中央強度、およびバックグラウンド強度を検出する。「自家」プログラムは、バックグラウンドを取り除くために使用した。プログラムは、各サブグリッドについて最低値10%の強度を計算し、各グリッドに対してこれを差し引く。分析は、Polynucleotidespringソフトウェア(Redwood City、カリフォルニア州)により行った。各スポットの強度は、スライド内のスポット値の群から中央スポット強度値を取得し、この値を実験のすべての値と比較することによって標準化した。対照細胞と比較してLPSで処理した細胞で見られた相対変化は、下の表で確認することができる。表60には、感染の診断に有用なこれまでに報告されていない多数の変化が記載されている。
これらの変化の機能的重要性を確認し評価するために、選択したmRNAおよびタンパク質の濃度を濃度計測によって評価し定量した。CD14、ビメンチンおよびトリステトラプロリン特異的プローブを使用するノーザンブロットでは、3つのすべての細菌産物で刺激した後に同様の発現が確認された(表60)。同様に、炎症媒介因子NOの濃度を算定するためにグリース試薬を用いる一酸化窒素合成酵素(iNOS)の酵素活性を測定したところ、24時間後に産生された匹敵する濃度のNOが示され、これはiNOS発現の同様のアップレギュレーションと一致していていた(表59)。ウェスタンブロット解析では、CpGによる白血病抑制因子(LIF、サイトカインのIL−6ファミリーのメンバー)の選択的な刺激が確認された(表59)。他の確認試験では、LPSは、ELISAにより評価した場合、TNF−αおよびIL−6の発現をアップレギュレートし、ノーザンブロット解析によって評価した場合に、MIP−2αおよびIL−1β mRNAの発現をアップレギュレートし、かつDP−1およびサイクリンD mRNAをダウンレギュレートすることが示された。この分析は、ヒト全血中の前炎症性サイトカイン産生を細菌成分が刺激する能力を試験することにより、より臨床的に関連するex vivo系に広げた。大腸菌LPS、ネズミチフス菌LPSおよび黄色ブドウ球菌LTAはすべて、同量の血清TNF−αおよびIL−1βを刺激することがわかった。また、CpGは、一部の細胞系データを確認すると、はるかに低い濃度にもかかわらず、これらのサイトカインの産生を刺激した。
表55:A549上皮細胞において大腸菌O111:B4 LPSによりアップレギュレートされたポリヌクレオチド
大腸菌O111:B4 LPS(100ng/ml)は、ポリヌクレオチドマイクロアレイにより研究した場合、A549細胞の多くのポリヌクレオチド発現を高めた。LPSをA549細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離した。5μgの全RNAを用いてCy3/Cy5標識cDNAプローブを作製し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。未刺激細胞の強度を表55の第2欄に示す。「比 LPS/対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、LPSで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
大腸菌O111:B4 LPS(100ng/ml)は、ポリヌクレオチドマイクロアレイにより研究した場合、A549細胞の多くのポリヌクレオチド発現を高めた。LPSをA549細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離した。5μgの全RNAを用いてCy3/Cy5標識cDNAプローブを作製し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。未刺激細胞の強度を表55の第2欄に示す。「比 LPS/対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、LPSで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表56:A549上皮細胞において大腸菌O111:B4 LPSによりダウンレギュレートされたポリヌクレオチド
大腸菌O111:B4 LPS(100ng/ml)は、ポリヌクレオチドマイクロアレイにより研究した場合、A549細胞の多くのポリヌクレオチド発現を低下させた。LPSをA549細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離した。5μgの全RNAを用いてCy3/Cy5標識cDNAプローブを作製し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。未刺激細胞の強度は表の第2欄に示す。「比:LPS/対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、LPSで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
大腸菌O111:B4 LPS(100ng/ml)は、ポリヌクレオチドマイクロアレイにより研究した場合、A549細胞の多くのポリヌクレオチド発現を低下させた。LPSをA549細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離した。5μgの全RNAを用いてCy3/Cy5標識cDNAプローブを作製し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。未刺激細胞の強度は表の第2欄に示す。「比:LPS/対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、LPSで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表57:細菌産生物LPS、LTAおよびCpG DNAによる刺激後に同程度まで発現されたポリヌクレオチド
細菌産物(100ng/mlのネズミチフス菌LPS、1μg/mlの黄色ブドウ球菌LTA、または1μMのCpG)は、数種類のポリヌクレオチドの発現を強く誘導することが示された。ペプチドをRAW細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識したcDNAプローブに変換し、Atlasアレイにハイブリダイズさせた。対照である未刺激細胞の強度は第2欄に示す。「比 LPS/LTA/CpG:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、細菌産物で刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
細菌産物(100ng/mlのネズミチフス菌LPS、1μg/mlの黄色ブドウ球菌LTA、または1μMのCpG)は、数種類のポリヌクレオチドの発現を強く誘導することが示された。ペプチドをRAW細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識したcDNAプローブに変換し、Atlasアレイにハイブリダイズさせた。対照である未刺激細胞の強度は第2欄に示す。「比 LPS/LTA/CpG:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、細菌産物で刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表58:細菌産物LPS、LTAおよびCpG DNAにより示差的に調節されたポリヌクレオチド
細菌産物(100ng/mlのネズミチフス菌LPS、1μg/mlの黄色ブドウ球菌LTA、または1μMのCpG)は、数種類のポリヌクレオチドの発現を強く誘導することが示された。ペプチドをRAW細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識したcDNAプローブに変換し、Atlasアレイにハイブリダイズさせた。対照である未刺激細胞の強度は第2欄に示す。「比 LPS/LTA/CpG:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、細菌産物で刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
細菌産物(100ng/mlのネズミチフス菌LPS、1μg/mlの黄色ブドウ球菌LTA、または1μMのCpG)は、数種類のポリヌクレオチドの発現を強く誘導することが示された。ペプチドをRAW細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離し、標識したcDNAプローブに変換し、Atlasアレイにハイブリダイズさせた。対照である未刺激細胞の強度は第2欄に示す。「比 LPS/LTA/CpG:対照」の欄は、未刺激の細胞の強度で割った、細菌産物で刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の強度を意味する。
表59:表57および表58のアレイデータの確認
a)全RNAを未刺激のRAWマクロファージ細胞から単離し、100ng/mlのネズミチフス菌LPS、1μg/mlの黄色ブドウ球菌LTA、1μM CpG DNAまたは培地のみで4時間細胞を処理し、ノーザンブロットを実施し、前述[Scottら]のようにして、GAPDH、CD14、ビメンチンおよびトリステトラプロリンについてその膜を調べた。添加時の不整合性を調べるためにノーザンブロットのハイブリダイゼーション強度をGAPDHと比較した。これらの実験は少なくとも3回繰り返し、示したデータは、培地と比較した各条件の平均相対濃度(濃度計測により測定した場合)±標準誤差である。
a)全RNAを未刺激のRAWマクロファージ細胞から単離し、100ng/mlのネズミチフス菌LPS、1μg/mlの黄色ブドウ球菌LTA、1μM CpG DNAまたは培地のみで4時間細胞を処理し、ノーザンブロットを実施し、前述[Scottら]のようにして、GAPDH、CD14、ビメンチンおよびトリステトラプロリンについてその膜を調べた。添加時の不整合性を調べるためにノーザンブロットのハイブリダイゼーション強度をGAPDHと比較した。これらの実験は少なくとも3回繰り返し、示したデータは、培地と比較した各条件の平均相対濃度(濃度計測により測定した場合)±標準誤差である。
b)RAW264.7細胞を100ng/mlのネズミチフス菌LPS、1μg/mlの黄色ブドウ球菌LTA、1μMのCpG DNAまたは培地のみで24時間刺激した。タンパク質溶解物を調製し、SDS PAGEゲルで泳動し、ウェスタンブロットを実施してLIFを検出した(R & D Systems)。これらの実験は少なくとも3回繰り返し、示したデータは、培地と比較したLIFの相対濃度(濃度計測により測定した場合)±標準誤差である。
c)100ng/mlのネズミチフス菌LPS、1μg/mlの黄色ブドウ球菌LTA、1μMのCpG DNAまたは培地のみで24時間処理したRAWマクロファージ細胞から上清を回収し、前述[Scottら]のようにして、グリース試薬により安定したNO代謝産物亜硝酸塩の蓄積から推定される上清中に形成されたNOの量について調べた。これらのデータは3回行った実験の平均±標準誤差である。
表60:細菌シグナル伝達分子(LPS)によりアップレギュレートされたA549ヒト上皮細胞における遺伝子発現のパターン
大腸菌O111:B4 LPS(100ng/ml)は、ポリヌクレオチドマイクロアレイにより調べた場合、A549細胞で多数のポリヌクレオチド発現が増大した。LPSをA549細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離した。5μgの全RNAを用いてCy3/Cy5標識cDNAプローブを作製し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。LPSで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の変化の例は、LPSで処理した細胞の強度レベル変化は未処理の細胞の2倍を超えていることを示している。
大腸菌O111:B4 LPS(100ng/ml)は、ポリヌクレオチドマイクロアレイにより調べた場合、A549細胞で多数のポリヌクレオチド発現が増大した。LPSをA549細胞と4時間インキュベートし、RNAを単離した。5μgの全RNAを用いてCy3/Cy5標識cDNAプローブを作製し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。LPSで刺激した細胞のポリヌクレオチド発現の変化の例は、LPSで処理した細胞の強度レベル変化は未処理の細胞の2倍を超えていることを示している。
細菌感染に対して防御するためのシグナル伝達の改変
ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)SL1344株をAmerican Type Culture Collection(ATCC;Manassas、ヴァージニア州)から入手し、ルリア・ベルターニ(LB)ブロス中で増殖させた。マクロファージ感染については、125mL容フラスコに入れた10mlのLBに凍結グリセロールストックを接種し、定常期まで37℃にて一晩振盪培養した。RAW264.7細胞(1×105個/ウェル)を24ウェルのプレートに播種した。細菌を培地で希釈し、約100の感染多重度(MOI)を得た。10分間1000rpmにて単層上に細菌を遠心して感染を同調させ、20分間、37℃、5%CO2のインキュベーター内で感染を進行させた。PBSで細胞を3回洗浄して細胞外の細菌を除去し、次いで、100μg/mlのゲンタマイシン(Sigma、St. Louis、ミズーリ州)含有DMEM+10%FBS中でインキュベートして残存するすべての細胞外細菌を死滅させるとともに再感染を予防した。2時間後、ゲンタマイシン濃度を10μg/mlまで低下させ、アッセイ中保持した。感染前30分間、細胞は以下の濃度の阻害剤で処理した:50μMのPD 98059(Calbiochem)、50μMのU0126(Promega)、2mMのジフェニルヨードニウム(DPI)、250μMのアセトバニロン(アポシニン、Aldrich)、1mMのアスコルビン酸(Sigma)、30mMのN−アセチルシステイン(Sigma)、および2mMのNG−L−モノメチルアルギニン(L−NMMA、Molecular Probes)または2mMのNG−D−モノメチルアルギニン(D−NMMA、Molecular Probes)。効力を確実にするために、感染直後、感染後2時間、および6〜8時間に新しい阻害剤を添加した。培地の1mLに対して等量のジメチルスルホキシド(DMSO)で対照細胞を処理した。ネズミチフス菌SL1344株の細胞内生存/複製については、前に記載したようにして、ゲンタマイシン耐性アッセイを用いて検出した。簡単に説明すると、PBSで2回細胞を洗浄し、ゲンタマイシンを除去し、感染後2時間および24時間に、PBSに溶解した1%TritonX−100/0.1%SDSに溶解させ、LB寒天平板上のコロニー数から細胞内細菌の数を算出した。これらの感染条件下では、感染後24時間のマクロファージを分析が可能である標準の平板カウントにより判断した場合、マクロファージは細胞当たり平均1株の細菌を含んでいた。細菌の繊維化(filiamentation)は細菌のストレスと関係がある。NADPHオキシダーゼとiNOSは、MEK/ERKシグナル伝達により活性化され得る。結果(表61)によれば、細胞シグナル伝達の改変は、細胞内のサルモネラ菌感染を解消することができる方法であることが明らかである。したがって、ヒト細胞の多数の遺伝子をアップレギュレートすることにより、シグナル伝達を遮断するこの方法は、感染に対する治療の一般的な方法を意味する。
ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)SL1344株をAmerican Type Culture Collection(ATCC;Manassas、ヴァージニア州)から入手し、ルリア・ベルターニ(LB)ブロス中で増殖させた。マクロファージ感染については、125mL容フラスコに入れた10mlのLBに凍結グリセロールストックを接種し、定常期まで37℃にて一晩振盪培養した。RAW264.7細胞(1×105個/ウェル)を24ウェルのプレートに播種した。細菌を培地で希釈し、約100の感染多重度(MOI)を得た。10分間1000rpmにて単層上に細菌を遠心して感染を同調させ、20分間、37℃、5%CO2のインキュベーター内で感染を進行させた。PBSで細胞を3回洗浄して細胞外の細菌を除去し、次いで、100μg/mlのゲンタマイシン(Sigma、St. Louis、ミズーリ州)含有DMEM+10%FBS中でインキュベートして残存するすべての細胞外細菌を死滅させるとともに再感染を予防した。2時間後、ゲンタマイシン濃度を10μg/mlまで低下させ、アッセイ中保持した。感染前30分間、細胞は以下の濃度の阻害剤で処理した:50μMのPD 98059(Calbiochem)、50μMのU0126(Promega)、2mMのジフェニルヨードニウム(DPI)、250μMのアセトバニロン(アポシニン、Aldrich)、1mMのアスコルビン酸(Sigma)、30mMのN−アセチルシステイン(Sigma)、および2mMのNG−L−モノメチルアルギニン(L−NMMA、Molecular Probes)または2mMのNG−D−モノメチルアルギニン(D−NMMA、Molecular Probes)。効力を確実にするために、感染直後、感染後2時間、および6〜8時間に新しい阻害剤を添加した。培地の1mLに対して等量のジメチルスルホキシド(DMSO)で対照細胞を処理した。ネズミチフス菌SL1344株の細胞内生存/複製については、前に記載したようにして、ゲンタマイシン耐性アッセイを用いて検出した。簡単に説明すると、PBSで2回細胞を洗浄し、ゲンタマイシンを除去し、感染後2時間および24時間に、PBSに溶解した1%TritonX−100/0.1%SDSに溶解させ、LB寒天平板上のコロニー数から細胞内細菌の数を算出した。これらの感染条件下では、感染後24時間のマクロファージを分析が可能である標準の平板カウントにより判断した場合、マクロファージは細胞当たり平均1株の細菌を含んでいた。細菌の繊維化(filiamentation)は細菌のストレスと関係がある。NADPHオキシダーゼとiNOSは、MEK/ERKシグナル伝達により活性化され得る。結果(表61)によれば、細胞シグナル伝達の改変は、細胞内のサルモネラ菌感染を解消することができる方法であることが明らかである。したがって、ヒト細胞の多数の遺伝子をアップレギュレートすることにより、シグナル伝達を遮断するこの方法は、感染に対する治療の一般的な方法を意味する。
抗ウィルス活性
C−X−Cケモカインの1種であるSDF−1は、HIV−1コレセプター−CXCR4の天然リガンドである。ケモカイン受容体CXCR4およびCCR5は、HIV−1複製の阻害に関する可能性ある標的と考えられる。SDF−1の結晶構造は、逆行性のβシートと正荷電表面を示し、CXCR4の負荷電細胞外ループに結合していることが大きな特徴である。これらの知見は、ケモカイン誘導体、小型CXCR4アンタゴニスト、またはケモカインの構造またはイオン特性を模倣するアゴニストが、X4 HIV−1感染の治療に有用な薬剤となり得ることを示唆している。SDF−1を阻害したカチオン性ペプチドは、ペプチドがCXCR4アンタゴニストとして作用し得ることを示すT細胞遊走を誘導することが確認された。遊走アッセイは以下のようにして行った。ヒトJurkatT細胞を走化性培地(RPMI 1640/10mM Hepes/0.5%BSA)中に5×106/mlまで懸濁した。遊走アッセイは、5μmポリカーボネートTranswell inserts(Costar)を用いて24ウェルプレートで実施した。簡単に説明すると、ペプチドまたは対照を走化性培地で希釈し、下方チャンバーに入れ、一方、0.1mlの細胞(5×106/ml)を上部チャンバーに添加した。37℃で3時間後、フローサイトメトリーを用いて、下方チャンバーに移動した細胞の数を検出した。下方チャンバーからの培地は、細胞残屑を除去するために前方および側方の散乱光をゲート調節しながら、30秒間でFACscanを通って通過させた。生存細胞の数は、5×105/ml細胞が下方チャンバーへ直接ピペットで移し、次いで30秒間FACscanでカウントした「100%遊走対照」と比較した。結果は、ペプチドの添加はCXCR4発現に影響を及ぼし(表63および表64)、ヒトJurkatT細胞の遊走を阻害する(表62)ことを示している。
C−X−Cケモカインの1種であるSDF−1は、HIV−1コレセプター−CXCR4の天然リガンドである。ケモカイン受容体CXCR4およびCCR5は、HIV−1複製の阻害に関する可能性ある標的と考えられる。SDF−1の結晶構造は、逆行性のβシートと正荷電表面を示し、CXCR4の負荷電細胞外ループに結合していることが大きな特徴である。これらの知見は、ケモカイン誘導体、小型CXCR4アンタゴニスト、またはケモカインの構造またはイオン特性を模倣するアゴニストが、X4 HIV−1感染の治療に有用な薬剤となり得ることを示唆している。SDF−1を阻害したカチオン性ペプチドは、ペプチドがCXCR4アンタゴニストとして作用し得ることを示すT細胞遊走を誘導することが確認された。遊走アッセイは以下のようにして行った。ヒトJurkatT細胞を走化性培地(RPMI 1640/10mM Hepes/0.5%BSA)中に5×106/mlまで懸濁した。遊走アッセイは、5μmポリカーボネートTranswell inserts(Costar)を用いて24ウェルプレートで実施した。簡単に説明すると、ペプチドまたは対照を走化性培地で希釈し、下方チャンバーに入れ、一方、0.1mlの細胞(5×106/ml)を上部チャンバーに添加した。37℃で3時間後、フローサイトメトリーを用いて、下方チャンバーに移動した細胞の数を検出した。下方チャンバーからの培地は、細胞残屑を除去するために前方および側方の散乱光をゲート調節しながら、30秒間でFACscanを通って通過させた。生存細胞の数は、5×105/ml細胞が下方チャンバーへ直接ピペットで移し、次いで30秒間FACscanでカウントした「100%遊走対照」と比較した。結果は、ペプチドの添加はCXCR4発現に影響を及ぼし(表63および表64)、ヒトJurkatT細胞の遊走を阻害する(表62)ことを示している。
現時点の好ましい実施形態に関して本発明を説明したが、本発明の精神から逸脱することなく種々の変更をなすことができることが理解されるだろう。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
Claims (88)
- 1以上の敗血症誘導因子または炎症誘導因子により調節され、かつカチオン性ペプチドにより阻害されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドパターンを同定する方法であって、
1または複数の前記ポリヌクレオチドを1以上の敗血症誘導因子または炎症誘導因子と接触させるステップ、
それと同時にまたはその直後に、1または複数の前記ポリヌクレオチドをカチオン性ペプチドと接触させるステップ、
発現の変化を測定するステップ
を含み、該変化が、敗血症誘導因子または炎症誘導因子によって調節され、かつカチオン性ペプチドによって低減されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドパターンを示すものである、上記方法。 - 前記敗血症誘導因子または炎症誘導因子が、LPS、LTAもしくはCpG DNA、細菌の成分もしくは全細胞、または関連する因子である、請求項1に記載の方法。
- 前記敗血症誘導因子または炎症誘導因子との接触の前後に、ポリヌクレオチドの発現レベルを測定するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法によって同定されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドパターン。
- 炎症または敗血症の応答に関与しているポリペプチドをコードする、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- 敗血症または炎症を阻止する薬剤を同定する方法であって、請求項5に記載のポリヌクレオチドと薬剤とを組み合わせるステップを含み、薬剤の存在下におけるポリヌクレオチドの発現が、薬剤の不在下における発現と比較してモジュレートされ、かつ発現のモジュレーションが炎症または敗血症の応答に影響を及ぼすものである、上記方法。
- 前記影響が炎症または敗血症の応答の抑制である、請求項6に記載の方法。
- 請求項6に記載の方法によって同定される薬剤。
- ペプチド、ペプチド擬似体、化学化合物、核酸分子またはポリペプチドである、請求項8に記載の薬剤。
- 前記ペプチドが配列番号4〜54から選択されるものである、請求項8に記載の薬剤。
- 炎症または敗血症の応答の抑制についてのポリヌクレオチド発現パターンを同定する方法であって、
細胞と、LPS、LTA、CpG DNAおよび/または細菌全体もしくは細菌成分とをカチオン性ペプチドの存在下または不在下で接触させるステップ、
前記ペプチドの存在下および不在下における細胞のポリヌクレオチド発現パターンを検出するステップ
を含み、前記ペプチドの存在下におけるパターンが炎症または敗血症の応答の抑制を示すものである、上記方法。 - 細胞と、炎症または敗血症の応答を抑制すると考えられる1種または複数の化合物とを接触させるステップ、
炎症または敗血症の応答を抑制するカチオン性ペプチドを用いて得られたパターンと類似するポリヌクレオチド発現パターンを提供する化合物を同定するステップ
をさらに含む、請求項11に記載の方法。 - 請求項11に記載の方法により同定される化合物。
- 先天性免疫を増強する薬剤を同定する方法であって、先天性免疫に関与するポリペプチドをコードする1または複数のポリヌクレオチドと対象の薬剤とを接触させるステップを含み、前記薬剤の存在下におけるポリヌクレオチドの発現が、薬剤の不在下におけるポリヌクレオチドの発現と比較してモジュレートされ、かつ発現がモジュレートされると先天性免疫の増強が起こるものである、上記方法。
- 前記薬剤が敗血症の反応を刺激するものではない、請求項14に記載の方法。
- 前記薬剤が炎症または敗血症の応答を抑制するものである、請求項14に記載の方法。
- 前記薬剤が炎症または敗血症の応答を遮断するものである、請求項14に記載の方法。
- 前記薬剤が抗炎症因子をコードするポリヌクレオチドの発現を増大させるものである、請求項16または17に記載の方法。
- 抗炎症遺伝子が、IL−1 Rアンタゴニストホモログ1(AI167887)、IL−10 Rβ(AA486393)、IL−10 Rα(U00672)、TNF受容体メンバー1B(AA150416)、TNF受容体メンバー5(H98636)、TNF受容体メンバー11b(AA194983)、HLA IIのIKサイトカインダウンレギュレーター(R39227)、TGFB誘導性初期増殖応答2(AI473938)、CD2(AA927710)、グルココルチコイド関連ポリヌクレオチド(AK000892)、またはIL−10(M5762720)を含むサブセットから選択される、請求項18に記載の方法。
- 前記薬剤がTNF−αの発現を抑制するものである、請求項19に記載の方法。
- 前記薬剤がインターロイキンの発現を抑制するものである、請求項19に記載の方法。
- 前記インターロイキンがIL−8である、請求項23に記載の方法。
- 前記薬剤がペプチドである、請求項16に記載の方法。
- 前記ペプチドが配列番号4〜54から選択されるものである、請求項23に記載の方法。
- 請求項14に記載の方法により同定される薬剤。
- ペプチド、ペプチド擬似体、化学化合物または核酸分子である、請求項25に記載の薬剤。
- 先天性免疫を選択的に増強する化合物を同定するためのポリヌクレオチド発現パターンを同定する方法であって、
カチオン性ペプチドの存在下および不在下において接触させた細胞のポリヌクレオチド発現パターンを検出するステップであって、ペプチドの存在下におけるパターンが先天性免疫の刺激を表わすものである上記ステップ、
試験化合物の存在下において接触させた細胞のポリヌクレオチド発現パターンを検出するステップであって、カチオン性ペプチドの存在下において確認されるパターンに類似している試験化合物を用いたパターンが先天性免疫を増強する化合物を示すものである上記ステップ
を含む、上記方法。 - 請求項27に記載の方法により同定される化合物。
- 前記化合物が敗血症の反応を刺激するものではない、請求項27に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチド発現パターンが前炎症性ポリヌクレオチドの発現を含む、請求項27に記載の方法。
- 前炎症性ポリヌクレオチドが、リングフィンガータンパク質10(D87451)、セリン/スレオニンプロテインキナーゼMASK(AB040057)、KIAA0912タンパク質(AB020719)、KIAA0239タンパク質(D87076)、RAP1、GTPase活性化タンパク質1(M64788)、FEM−1様デスレセプター結合タンパク質(AB007856)、カテプシンS(M90696)、推定タンパク質FLJ20308(AK000315)、pim−1発癌遺伝子(M54915)、プロテアソームサブユニットβタイプ5(D29011)、KIAA0239タンパク質(D87076)、気道ムチン5サブタイプB(AJ001403)、cAMP応答エレメント結合タンパク質CREBPa、インテグリンαM(J03925)、Rho関連キナーゼ2(NM_004850)、PTD017タンパク質(AL050361)、未知遺伝子(AK001143、AK034348、AL049250、AL16199、AL031983)、レチノイン酸受容体(X06614)、Gタンパク質共役型受容体(Z94155、X81892、U52219、U22491、AF015257、U66579)、ケモカイン(C−Cモチーフ)受容体7(L31584)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー17(Z29575)、インターフェロンγ受容体2(U05875)、サイトカイン受容体様因子1(AF059293)、クラスIサイトカイン受容体(AF053004)、凝固因子II(トロンビン)受容体様2(U92971)、白血病抑制因子受容体(NM_002310)、インターフェロンγ受容体1(AL050337)、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項30に記載の方法。
- 前記発現パターンがケモカインをコードするポリヌクレオチドの発現を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記発現パターンが細胞分化因子の発現を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチド発現パターンが細胞表面受容体の発現を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記細胞表面受容体がケモカイン受容体またはインテグリン受容体を含む、請求項34に記載の方法。
- 先天性免疫を選択的に増強することが可能な薬剤を同定する方法であって、先天性免疫に関与するポリペプチドをコードする1または複数のポリヌクレオチドを含有する細胞を対象の薬剤と接触させるステップを含み、薬剤の存在下における1または複数のポリヌクレオチドの発現が、薬剤の不在下における発現と比較してモジュレートされ、かつ発現がモジュレートされると先天性免疫の増強が起こる、上記方法。
- 前記発現パターンが先天性免疫を増強する化合物のスクリーニングに利用される、請求項26に記載の方法。
- ケモカインまたはケモカイン受容体の発現を刺激する、請求項28に記載の化合物。
- ケモカインまたはケモカイン受容体が、CXCR4、CCR5、CCR2、CCR6、MIP−1α、IL−8、MCP−1、MCP−2、MCP−3、MCP−4またはMCP−5である、請求項38に記載の化合物。
- 前記化合物が、ペプチド、ペプチド擬似体、化学化合物または核酸分子である、請求項28に記載の化合物。
- 敗血症または炎症の応答を抑制または遮断し、かつ先天性免疫を増強することが可能な薬剤を同定する方法であって、
i)炎症または敗血症の応答を抑制することが可能なポリペプチドをコードする1または複数のポリヌクレオチド、およびii)先天性免疫に関与するポリペプチドをコードする1または複数のポリヌクレオチドを含有する細胞と、対象の薬剤とを接触させるステップ
を含み、前記薬剤の存在下における発現が、薬剤の不在下における1または複数のポリヌクレオチドの発現と比較してモジュレートされ、かつ発現がモジュレートされると、炎症または敗血症の応答の抑制、および先天性免疫の増強が起こる、上記方法。 - 哺乳動物被験体の感染の状態を被験体の核酸サンプルから推測する方法であって、前記核酸サンプル中で、非感染の被験体と比較した場合の、表55に示す少なくとも2個のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド発現の上昇により例示されるポリヌクレオチド発現パターンを同定するステップを含む、上記方法。
- 哺乳動物被験体の感染の状態を被験体の核酸サンプルから推測する方法であって、前記核酸サンプル中で、非感染の被験体と比較した場合の、表56に示す少なくとも2個のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド発現の低下により例示されるポリヌクレオチド発現パターンを同定するステップを含む、上記方法。
- 哺乳動物被験体の感染の状態を被験体の核酸サンプルから推測する方法であって、前記核酸サンプル中で、非感染の被験体と比較した場合の、表57に示す少なくとも2個のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド発現により例示されるポリヌクレオチド発現パターンを同定するステップを含む、上記方法。
- 感染状態が、細菌、ウィルス、真菌、または寄生生物の因子によるものである、請求項30、31または32のいずれかに記載の方法。
- 感染状態がグラム陽性菌またはグラム陰性菌によるものである、請求項30、31または32のいずれかに記載の方法。
- 請求項31に記載の方法により同定された感染状態を有する被験体のポリヌクレオチド発現パターン。
- CXCR−4のアンタゴニストであるカチオン性ペプチド。
- CXCR−4のアンタゴニストであるカチオン性ペプチドを同定する方法であって、
試験ペプチドの存在下または不在下においてT細胞とSDF−1とを接触させるステップ、
走化性を測定するステップ
を含み、試験ペプチドの存在下における走化性の低下が、CXCR−4のアンタゴニストであるペプチドを示すものである、上記方法。 - 一般式:X1X2X3IX4PX4IPX5X2X1(配列番号4)(式中、X1は1個または2個のR、LまたはKであり、X2は1個のC、SまたはAであり、X3は1個のRまたはPであり、X4は1個のAまたはVであり、X5は1個のVまたはWである)を含む、単離されたカチオン性ペプチド。
- LLCRIVPVIPWCK(配列番号5)、LRCPIAPVIPVCKK(配列番号6)、KSRIVPAIPVSLL(配列番号7)、KKSPIAPAIPWSR(配列番号8)、RRARIVPAIPVARR(配列番号9)およびLSRIAPAIPWAKL(配列番号10)からなる群から選択される、請求項38に記載のカチオン性ペプチド。
- 抗炎症活性を有するものである、請求項38に記載のペプチド。
- 抗敗血症活性を有するものである、請求項38に記載のペプチド。
- 一般式:X1LX2X3KX4X2X5X3PX3X1(配列番号11)(式中、X1は1個または2個のD、E、S、TまたはNであり、X2は1個または2個のP、GまたはDであり、X3は1個のG、A、V、L、IまたはYであり、X4は1個のR、KまたはHであり、X5は1個のS、T、C、MまたはRである)を含む、単離されたカチオン性ペプチド。
- DLPAKRGSAPGST(配列番号12)、SELPGLKHPCVPGS(配列番号13)、TTLGPVKRDSIPGE(配列番号14)、SLPIKHDRLPATS(配列番号15)、ELPLKRGRVPVE(配列番号16)およびNLPDLKKPRVPATS(配列番号17)からなる群から選択される、請求項42に記載のカチオン性ペプチド。
- 抗炎症活性を有するものである、請求項42に記載のペプチド。
- 抗敗血症活性を有するものである、請求項42に記載のペプチド。
- 一般式:X1X2X3X4WX4WX4X5K(配列番号18)(式中、X1はA、PまたはRから選択される1〜4個であり、X2は1個または2個の芳香族アミノ酸(F、YおよびW)であり、X3は1個のPまたはKであり、X4はA、P、YまたはWから選択される1個もしくは2個、または0個であり、X5はRまたはPから選択される1〜3個である)を含む、単離されたカチオン性ペプチド。
- RPRYPWWPWWPYRPRK(配列番号19)、RRAWWKAWWARRK(配列番号20)、RAPYWPWAWARPRK(配列番号21)、RPAWKYWWPWPWPRRK(配列番号22)、RAAFKWAWAWWRRK(配列番号23)およびRRRWKWAWPRRK(配列番号24)からなる群から選択される、請求項46に記載のカチオン性ペプチド。
- 抗炎症活性を有するものである、請求項46に記載のペプチド。
- 抗敗血症活性を有するものである、請求項46に記載のペプチド。
- 一般式:X1X2X3X4X1VX3X4RGX4X3X4X1X3X1(配列番号25)(式中、X1は1個または2個のRまたはKであり、X2は極性アミノ酸または荷電アミノ酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、RおよびH)であり、X3はC、S、M、DまたはAであり、X4はF、I、V、MまたはRである)を含む、単離されたカチオン性ペプチド。
- RRMCIKVCVRGVCRRKCRK(配列番号26)、KRSCFKVSMRGVSRRRCK(配列番号27)、KKDAIKKVDIRGMDMRRAR(配列番号28)、RKMVKVDVRGIMIRKDRR(配列番号29)、KQCVKVAMRGMALRRCK(配列番号30)およびRREAIRRVAMRGRDMKRMRR(配列番号31)からなる群から選択される、請求項50に記載のカチオン性ペプチド。
- 抗炎症活性を有するものである、請求項50に記載のペプチド。
- 抗敗血症活性を有するものである、請求項50に記載のペプチド。
- 一般式:X1X2X3X4X1VX5X4RGX4X5X4X1X3X1(配列番号32)(式中、X1が1個または2個のRまたはKであり、X2は極性アミノ酸または荷電アミノ酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、RおよびH)であり、X3は1個のC、S、M、DまたはAであり、X4は1個のF、I、V、MまたはRであり、X5は1個のA、I、S、M、DまたはRである)を含む、単離されたカチオン性ペプチド。
- RTCVKRVAMRGIIRKRCR(配列番号33)、KKQMMKRVDVRGISVKRKR(配列番号34)、KESIKVIIRGMMVRMKK(配列番号35)、RRDCRRVMVRGIDIKAK(配列番号36)、KRTAIKKVSRRGMSVKARR(配列番号37)およびRHCIRRVSMRGIIMRRCK(配列番号38)からなる群から選択される、請求項54に記載のカチオン性ペプチド。
- 抗炎症活性を有するものである、請求項54に記載のペプチド。
- 抗敗血症活性を有するものである、請求項54に記載のペプチド。
- 一般式:KX1KX2FX2KMLMX2ALKKX3(配列番号39)(式中、X1は極性アミノ酸(C、S、T、M、NおよびQ)であり、X2は1個のA、L、SまたはKであり、X3はG、A、V、L、I、P、F、S、T、KおよびHから選択される1〜17個のアミノ酸である)を含む、単離されたカチオン性ペプチド。
- KCKLFKKMLMLALKKVLTTGLPALKLTK(配列番号40)、KSKSFLKMLMKALKKVLTTGLPALIS(配列番号41)、KTKKFAKMLMMALKKVVSTAKPLAILS(配列番号42)、KMKSFAKMLMLALKKVLKVLTTALTLKAGLPS(配列番号43)、KNKAFAKMLMKALKKVTTAAKPLTG(配列番号44)およびKQKLFAKMLMSALKKKTLVTTPLAGK(配列番号45)からなる群から選択される、請求項58に記載のカチオン性ペプチド。
- 抗炎症活性を有するものである、請求項58に記載のペプチド。
- 抗敗血症活性を有するものである、請求項58に記載のペプチド。
- 一般式:KWKX2X1X1X2X2X1X2X2X1X1X2X2IFHTALKPISS(配列番号46)(式中、X1は疎水性アミノ酸であり、X2は親水性アミノ酸である)を含む、単離されたカチオン性ペプチド。
- KWKSFLRTFKSPVRTIFHTALKPISS(配列番号47)、KWKSYAHTIMSPVRLIFHTALKPISS(配列番号48)、KWKRGAHRFMKFLSTIFHTALKPISS(配列番号49)、KWKKWAHSPRKVLTRIFHTALKPISS(配列番号50)、KWKSLVMMFKKPARRIFHTALKPISS(配列番号51)およびKWKHALMKAHMLWHMIFHTALKPISS(配列番号52)からなる群から選択される、請求項62に記載のカチオン性ペプチド。
- 抗炎症活性を有するものである、請求項62に記載のペプチド。
- 抗敗血症活性を有するものである、請求項62に記載のペプチド。
- KWKSFLRTFKSPVRTVFHTALKPISS(配列番号53)の配列を含む、単離されたカチオン性ペプチド。
- KWKSYAHTIMSPVRLVFHTALKPISS(配列番号54)の配列を含む、単離されたカチオン性ペプチド。
- 前記薬剤が、ジンクフィンガータンパク質(AF061261);細胞周期遺伝子(S70622);IL−10受容体(U00672);トランスフェラーゼ(AF038664);ホメオボックスタンパク質(AC004774);フォークヘッドタンパク質(AF042832);未知(AL096803);KIAA0284タンパク質(AB006622);推定タンパク質(AL022393);受容体(AF112461);推定タンパク質(AK002104);タンパク質(AL050261);ポリペプチド(AF105424);SPR1タンパク質(AB031480);デヒドロゲナーゼ(D17793);トランスフェラーゼ(M63509);およびペルオキシソーム因子(AB013818)である、請求項28に記載の方法。
- アップレギュレートされた遺伝子が、登録番号D87451(リングフィンガータンパク質10);登録番号AL049975(未知);登録番号U39067(真核生物の翻訳開始因子3サブユニット2);登録番号AK000942(未知);登録番号AB040057(セリン/スレオニンプロテインキナーゼMASK);登録番号AB020719(KIAA0912タンパク質);登録番号AB007856(FEM−1様デスレセプター結合タンパク質);登録番号AL137376(未知);登録番号AL137730(未知);登録番号M90696(カテプシンS);登録番号AK001143(未知);登録番号AF038406(NADHデヒドロゲナーゼ);登録番号AK000315(推定タンパク質FLJ20308);登録番号M54915(pim−1癌遺伝子);登録番号D29011(プロテアソームサブユニットβ型5);登録番号AL034348(未知);登録番号D87076(KIAA0239タンパク質);登録番号AJ001403(気道ムチン5サブタイプB);登録番号J03925(インテグリンαM);Rho関連キナーゼ2(NM_004850);PTD017タンパク質(AL050361);未知遺伝子(AK001143、AK034348、AL049250、AL16199、AL031983);レチノイン酸受容体(X06614);Gタンパク質共役型受容体(Z94155、X81892、U52219、U22491、AF015257、U66579);ケモカイン(C−Cモチーフ)受容体7(L31584);腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー17(Z29575);インターフェロンγ受容体2(U05875);サイトカイン受容体様因子1(AF059293);クラスIサイトカイン受容体(AF053004);凝固因子II(トロンビン)受容体様2(U92971);白血病抑制因子受容体(NM_002310);インターフェロンγ受容体1(AL050337);またはこれらの任意の組合せである、請求項56により同定された感染状態を有する被験体のポリヌクレオチド発現パターン。
- 前記ケモカインが、CXCR4、CXCR1、CXCR2、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、MIP−1α、MDC、MIP−3α、MCP−1、MCP−2、MCP−3、MCP−4、MCP−5およびRANTESを含む、請求項32に記載の方法。
- 前記細胞分化因子が、TGFβ誘導性初期増殖応答2(AI473938)、ジンクフィンガータンパク質(AF061261、U00115、X78924)、および転写因子(U31556、AL137681、X68560)を含む、請求項33に記載の方法。
- キナーゼ活性を変化させる、請求項38に記載の化合物。
- 前記キナーゼが、MAPキナーゼキナーゼ3(D87116)、MAPキナーゼキナーゼ6(H07920)、MAPキナーゼキナーゼ5(W69649)、MAPキナーゼ7(H39192)、MAPキナーゼ12(AI936909)、MAPキナーゼ活性化プロテインキナーゼ3(W68281)、またはMAPキナーゼキナーゼ1(L11284)から選択されるものである、請求項84に記載の化合物。
- プロテアソームサブユニット発現を低下させる、請求項21に記載の化合物。
- 前記プロテアソームサブユニットが、登録番号D11094、L02426、D00763、AB009398、AF054185、M34079、M34079またはAL031177のポリヌクレオチドを含む、請求項86に記載の化合物。
- SDF−1受容体のポリヌクレオチド発現を低下させる、単離されたカチオン性ペプチド。
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