JP2007505048A - 先天性免疫のエフェクターの決定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は一般的に、ペプチド、詳しくは治療物質として有効な、ならびに微生物感染症に起因する病態に関連する新薬を発見するためおよび先天性免疫または抗炎症活性を調節するために有効なペプチドに関する。
本出願は、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、35 USC 120によって2002年12月2日に提出された米国特許出願第10/308,905号に対する優先権を、そして35 USC 119(e)によって2001年12月3日に提出された米国特許出願第60/336,632号に対する優先権を主張する。
感染疾患は、全世界での死因の第一位である。1999年の世界保健機構の調査によれば、毎年1300万人を超える人が感染疾患のために死亡する。感染疾患は北米では死因の第三位であり、年間死亡数の20%を占め、1980年代以降50%増加している。多くの内科的および外科的治療の成否も、感染疾患の制御次第で決まる。抗生物質の発見および使用は、近代医学の偉大な業績の一つであった。抗生物質がなければ、医師は、複雑な手術、化学療法、またはカテーテル挿入のようなほとんどの医学的介入を行うことができないであろう。
本発明は、エンドトキシンリポ多糖類、リポテイコ酸、CpG DNA、または他の細胞成分(例えば、微生物もしくはその細胞成分)によって調節され、陽イオンペプチドによって影響を受けるポリヌクレオチド発現パターンに基づいて、被験者における敗血症および/または炎症を遮断または減少する新規化合物をスクリーニングすることができるという独創性に富んだ発見に基づいている。さらに、ツールとして陽イオンペプチドを用いることに基づいて、敗血症反応を誘発せずに、ならびに炎症および/または敗血症反応を遮断/低下させることができる先天性免疫の選択的増強物質を同定することができる。
X1がR、L、またはKの一つまたは二つであって、X2がC、S、またはAの一つであって、X3がRまたはPの一つであって、X4がAまたはVの一つであって、およびX5がVまたはWの一つである、
;
X1がD、E、S、TまたはNの一つまたは二つであって、X2がP、G、またはDの一つまたは二つであって、X3がG、A、V、L、I、またはYの一つであって、X4がR、K、またはHの一つであって、およびX5がS、T、C、M、またはRの一つである、
;
X1がA、P、またはRから選択される一つから四つであって、X2が一つまたは二つの芳香族アミノ酸(F、Y、およびW)であって、X3がPまたはKの一つであって、X4がA、P、Y、またはWから選択される一つ、二つ、またはなしであて、およびX5がRまたはPから選択される一つから三つである、
;
X1がRまたはKの一つまたは二つであって、X2が極性または荷電アミノ酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R、およびH)であって、X3がC、S、M、D、またはAであって、およびX4がF、I、V、M、またはRである、
;
X1がRまたはKの一つまたは二つであって、X2が極性または荷電アミノ酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R、およびH)であって、X3がC、S、M、D、またはAの一つであって、X4がF、I、V、M、またはRの一つであって、およびX5がA、I、S、M、D、またはRの一つである、
;
X1が極性アミノ酸(C、S、T、M、N、およびQ)であって、X2がA、L、S、またはKの一つであって、およびX3がG、A、V、L、I、P、F、S、T、K、およびHから選択される1〜17個のアミノ酸である、
;
X1が疎水性アミノ酸であって、およびX2が親水性アミノ酸である、
。
本発明は、ポリヌクレオチド発現の調節能(例えば、アップおよび/またはダウンレギュレート能)を有し、それによって敗血症および炎症反応および/または先天性免疫を調節する一群の一般式を特徴とする新規陽イオンペプチドを提供する。
X1がR、L、またはKの一つまたは二つであって、X2がC、S、またはAの一つであって、X3がRまたはPの一つであって、X4がAまたはVの一つであって、およびX5がVまたはWの一つである、
。本発明のペプチドの例には、
が含まれるがこれらに限定されない。
X1がD、E、S、TまたはNの一つまたは二つであって、X2がP、G、またはDの一つまたは二つであって、X3がG、A、V、L、I、またはYの一つであって、X4がR、K、またはHの一つであって、およびX5がS、T、C、M、またはRの一つである、
。本発明のペプチドの例には、
が含まれるがこれらに限定されない。
X1がA、P、またはRから選択される一つから四つであって、X2が一つまたは二つの芳香族アミノ酸(F、Y、およびW)であって、X3がPまたはKの一つであって、X4がA、P、Y、またはWから選択される一つ、二つ、またはなしであて、およびX5がRまたはPから選択される一つから三つである、
。本発明のペプチドの例には、
が含まれるがこれらに限定されない。
X1がRまたはKの一つまたは二つであって、X2が極性または荷電アミノ酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R、およびH)であって、X3がC、S、M、D、またはAであって、およびX4がF、I、V、M、またはRである、
。本発明のペプチドの例には、
が含まれるがこれらに限定されない。
X1がRまたはKの一つまたは二つであって、X2が極性または荷電アミノ酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R、およびH)であって、X3がC、S、M、D、またはAの一つであって、X4がF、I、V、M、またはRの一つであって、およびX5がA、I、S、M、D、またはRの一つである、
。本発明のペプチドの例には、
が含まれるがこれらに限定されない。
X1が極性アミノ酸(C、S、T、M、N、およびQ)であって、X2がA、L、S、またはKの一つであって、およびX3がG、A、V、L、I、P、F、S、T、K、およびHから選択される1〜17個のアミノ酸である、
。本発明のペプチドの例には、
が含まれるがこれらに限定されない。
X1が疎水性アミノ酸であって、X2が親水性アミノ酸である、
。本発明のペプチドの例には、
が含まれるがこれらに限定されない。
抗敗血症/抗炎症活性
ポリヌクレオチドアレイを利用して、上皮細胞の転写反応に及ぼす陽イオンペプチドの影響を決定した。A549ヒト上皮細胞株を、10%ウシ胎児血清(FBS、Medicorp)を添加したDMEM(Gibco)において維持した。A549細胞を100 mm組織培養皿に2.5×106個/皿で播種して、一晩培養した後、50 μg/mlペプチドの存在下または非存在下で100 ng/ml大腸菌O111:B4 LPS(Sigma)と共に、または培地単独で4時間インキュベートした。刺激後、細胞をジエチルピロカーボネート処置リン酸緩衝生理食塩液(PBS)によって1回洗浄して、セルスクレイパーを用いて皿から剥離させた。RNAqueous(Ambion, Austin, TX)を用いて総RNAを単離した。RNA沈降物を、Superase-In(RNアーゼ阻害剤;Ambion)を含むRNアーゼを含まない水に浮遊させた。DNAの混入は、DNA-freeキット(Ambion)によって除去した。RNAの質を1%アガロースゲルにおけるゲル電気泳動によって評価した。
a表1〜表64までのアクセッション番号は、全てGenBankアクセッション番号を指す。
免疫細胞の刺激の中和
化合物が、グラム陰性およびグラム陽性菌双方の産物による免疫細胞の刺激を中和できるか否かを調べた。細菌産物は、免疫系の細胞を刺激して、炎症性サイトカインを産生し、これが抑制されなければ敗血症が起こりうる。最初の実験は、American Type Culture Collection(Manassas, VA)から得たマウスマクロファージ細胞株RAW 264.7、ヒト上皮細胞株A549、およびBALB/cマウス(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)の骨髄に由来する骨髄初代培養マクロファージを利用した。マウス骨髄からの細胞を、20%FBS(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)およびM-CSF源として20%L-細胞条件培地を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM;Life Technologies, Burlington, ON)において150 mmプレートにおいて培養した。マクロファージが60〜80%コンフルエントとなった後、それらをL細胞条件培地を14〜16時間枯渇して、細胞を静止期に入らせて、100 ng/ml LPSまたは100 ng/ml LPS+20 μg/mlペプチドによって24時間処置した。培養上清へのサイトカインの放出を、ELISA(R&D Systems, Minneapolis, MN)によって決定した。細胞株RAW 264.7およびA549は、10%仔ウシ胎児血清を添加したDMEMにおいて維持した。RAW264.7細胞を24ウェルプレートにDMEMにおいて106個/ウェルの密度で播種して、A549細胞を24ウェルプレートにおいてDMEMにおいて105個/ウェルの密度で播種して、いずれも5%CO2において37℃で一晩インキュベートした。一晩増殖させた細胞からDMEMを吸引して、新鮮な培地を加えた。いくつかの実験において、ボランティアヒトドナーからの血液を静脈穿刺によって14.3 USP単位ヘパリン/ml血液を含むチューブ(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)に採取した(UBC 臨床研究倫理委員会、証明書C00-0537によって承認された手順に従って)。血液を、ポリプロピレンチューブにおいてペプチドの存在下または非存在下でLPSと37℃で6時間混合した。試料を2000×gで5分間遠心して、血漿を採取した後、ELISA(R&D Systems)によってIL-8に関して分析するまで-20℃で保存した。細胞を用いる実験では、LPSまたは他の細菌産物を37℃、5%CO2において細胞と共に6〜24時間インキュベートした。ネズミチフス菌LPSおよび大腸菌O111:B4 LPSをSigmaから購入した。黄色ブドウ球菌からのリポテイコ酸(LTA)(Sigma)を無エンドトキシン水(Sigma)に浮遊させた。LTA調製物に関してリムラス・アメーバ溶解物アッセイ(Sigma)を行って、ロットがエンドトキシンによって有意に汚染されていないことを確認した。エンドトキシンの混入は1 ng/ml未満であり、この濃度はRAW 264.7細胞において有意なサイトカイン産生を引き起こさなかった。非キャップリポアラビノマンナン(AraLAM)はJohn T博士、Belisle of Colorado State Universityからの寄贈であった。マイコバクテリウムからのAraLAMを濾過滅菌して、エンドトキシンの混入は、リムラス・アメーバアッセイによって決定したところ、LAM 1.0 mgあたり3.75 ngであることが判明した。LPSの添加と同時に(または特に記述されている場合には後に)陽イオンペプチドを濃度範囲で加えた。上清を回収してELISA(R&D Systems)によってサイトカイン産生に関して試験した。アッセイは全て、少なくとも3回行い、類似の結果を得た。抗敗血症活性をインビボで確認するために、ガラクトサミンによって感作した8〜10週齢の雌性CD-1またはBALB/cマウスに、リン酸緩衝生理食塩液(PBS;pH 7.2)において大腸菌O111:B4 LPS 2または3μgを腹腔内注射することによって敗血症を誘導した。ペプチドを含む実験において、滅菌水100 μl中に200μgを、LPS注射の10分以内に異なる腹腔部位に注射した。他の実験において、CD-1マウスに大腸菌O111:B4 LPS 400 μgを注射して、10分後にペプチド(200 μg)を腹腔内注射によって導入した。生存を注射後48時間モニターした。
RAW 264.7マウスマクロファージ細胞を、SEQ ID NO:1の表記の濃度の存在下で100 ng/mlネズミチフス菌LPS、100 ng/ml B.セパシアLPS、および100 ng/ml大腸菌O111:B4 LPSによって6時間刺激した。培養上清に放出されたTNF-αの濃度を、ELISAによって決定した。100%はLPS単独と共に6時間インキュベートしたRAW 264.7細胞に起因するTNF-αの量を表す(ネズミチフス菌LPS=34.5±3.2 ng/ml、B.セパシアLPS=11.6±2.9 ng/mlおよび大腸菌O111:B4 LPS=30.8±2.4 ng/ml)。刺激を与えないで6時間培養したRAW 264.7細胞によるTNF-αの産生のバックグラウンドレベルは、TNF-αレベルが0.037〜0.192 ng/mlの範囲であった。データは1試料あたり2個ずつから得て、3回の実験の平均値+標準誤差として表す。
RAW264.7マウスマクロファージ細胞を、表記の濃度の陽イオンペプチドの存在下で100 ng/ml大腸菌O111:B4 LPSによって6時間刺激した。培養上清に放出されたTNF-αの濃度をELISAによって決定した。刺激を与えないで6時間培養したRAW 264.7細胞によるTNF-αの産生のバックグラウンドレベルは、TNF-αのレベルが0.037〜0.192 ng/mlであった。データは1試料あたり2個ずつの試料から得て、3回の実験の平均値+標準偏差として表す。
A549細胞を、LPS(100 ng/ml大腸菌O111:B4)の存在下で増加濃度のSEQ ID NO:1によって24時間刺激した。培養上清におけるIL-8の濃度を、ELISAによって決定した。細胞単独からのIL-8のバックグラウンドレベルは0.172±0.029 ng/mlであった。データは3回の実験の平均値+標準誤差として表す。
ヒトA549上皮細胞をLPS(100 ng/ml大腸菌O111:B4)の存在下で増加濃度のSEQ ID NO:2によって24時間刺激した。培養上清におけるIL-8の濃度は、ELISAによって決定した。データは3回の実験の平均値+標準誤差として表す。
ヒト全血を増加濃度のペプチドおよび大腸菌O111:B4 LPSによって4時間刺激した。ヒト血液試料を遠心して血清を採取し、ELISAによってIL-8に関して試験した。データはドナー2人の平均値として表す。
BALB/cマウス骨髄由来マクロファージを、20 μg/mlペプチドの存在下または非存在下で、100 ng/ml大腸菌O111:B4 LPSと共に6時間または24時間のいずれか培養した。上清を回収してELISAによってTNF-αレベルに関して試験した。データは、LPS単独と共に6時間(1.1±0.09 ng/ml)または24時間(1.7±0.2 ng/ml)インキュベートした骨髄由来マクロファージの1試料あたりウェル2個から得られたTNF-αの量を表す。TNF-αのバックグラウンドレベルは、6時間の場合0.038±0.008 ng/mlおよび24時間の場合0.06±0.012 ng/mlであった。
ペプチド(20 μg/ml)を、A549ヒト上皮細胞および100 ng/ml大腸菌O111:B4 LPSを含むウェルに時間をずらして加えた。上清を6時間後に回収して、ELISAによってTNF-αレベルを調べた。データは3回の実験の平均値+標準誤差として表す。
CD-1マウス(9週齢)を、ガラクトサミンの腹腔内注射(0.1 ml滅菌PBSにおいて20 mg)を3回行うことによってエンドトキシンに対して感作した。次に、大腸菌O111:B4 LPS(0.1 ml PBSにおいて3μg)の腹腔内注射によってエンドトキシンショックを誘導した。ペプチドSEQ ID NO:1(200 μg/マウス=8 mg/kg)をLPSの注射後15分に異なる腹腔内部位に注射した。マウスを48時間モニターして、結果を記録した。
CD-1マウス(9週齢)を、ガラクトサミンの腹腔内注射(0.1 ml滅菌PBSにおいて20 mg)によってエンドトキシンに対して感作した。次に、大腸菌O111:B4 LPS(0.1 ml PBSにおいて2μg)の腹腔内注射によってエンドトキシンショックを誘導した。ペプチド(200 μg/マウス=8 mg/kg)をLPSの注射後15分に異なる腹腔内部位に注射した。マウスを48時間モニターして、結果を記録した。
BALB/cマウス(8週齢)を、ガラクトサミンの腹腔内注射(0.1 ml滅菌PBSにおいて20 mg)によってエンドトキシンに対して感作した。次に、大腸菌O111:B4 LPS(0.1 ml PBSにおいて2μg)の腹腔内注射によってエンドトキシンショックを誘導した。ペプチド(200 μg/マウス=8 mg/kg)をLPSの注射後15分に異なる腹腔内部位に注射した。マウスを48時間モニターして、結果を記録した。
BALB/cマウスに大腸菌O111:B4 LPS 400 μgを腹腔内注射した。ペプチド(200 μg/マウス=8 mg/kg)を異なる腹腔内部位に注射して、マウスを48時間モニターして、結果を記録した。
RAW 264.7マウスマクロファージ細胞をペプチドの増加濃度の非存在下および存在下で1μg/ml黄色ブドウ球菌LTAによって刺激した。上清を回収してELISAによってTNF-αレベルに関して調べた。刺激を行わずに6時間培養したRAW 264.7細胞によるTNF-α産生のバックグラウンドレベルは、TNF-αレベルが0.037〜0.192 ng/mlの範囲であった。データは3回またはそれ以上の実験の平均値+標準誤差として表す。
RAW 264.7マウスマクロファージ細胞を、20 μg/mlペプチドまたはポリミキシンBの非存在下および存在下で1μg/ml AraLAMによって刺激した。上清を回収して、ELISAによってTNF-αレベルに関して試験した。刺激しないで6時間培養したRAW264.7細胞によるTNF-α産生のバックグラウンドレベルは、TNF-αレベルが0.037〜0.192 ng/mlの範囲であった。データは、3回またはそれ以上の実験の阻害の平均値+標準誤差として表す。
陽イオンペプチドの毒性の評価
ペプチドに関して可能性がある毒性を二つの方法で測定した。第一に、細胞障害性検出キット(Roche)(乳酸デヒドロゲナーゼ-LDH)アッセイを用いた。これは、損傷された細胞のサイトソルから上清に放出されたLDH活性の測定に基づく、細胞死および細胞溶解を定量するための比色アッセイである。LDHは全ての細胞に存在する安定な細胞質酵素であり、細胞質膜の損傷に基づいて細胞培養上清に放出される。死細胞または細胞膜損傷細胞の量が増加すれば、ELISAプレートリーダーによってOD490 nmで測定した場合に培養上清におけるLDH酵素活性の増加が起こる(アッセイにおいて形成された色素量は、溶解された細胞数に比例する)。このアッセイにおいて、ヒト気管支上皮細胞(16HBEo14、HBE)をペプチド100 μgと共に24時間インキュベートして、上清を採取してLDHに関して試験した。陽イオンペプチドの毒性を測定するために用いた他のアッセイはWST-1アッセイ(Roche)であった。このアッセイは生存細胞におけるミトコンドリアデヒドロゲナーゼによるテトラゾリウム塩WST-1の切断に基づく、細胞増殖および細胞生存率の定量のための比色アッセイである([3H]-チミジン取り込みアッセイに対する非放射活性代用法)。このアッセイにおいて、HBE細胞をペプチド100 μgと共にインキュベートした後、10μl/ウェル細胞増殖試薬WST-1を加えた。細胞を試薬と共にインキュベートして、プレートをELISAプレートリーダーによってOD490 nmで測定する。
ヒトHBE気管支上皮細胞を100 μg/mlペプチドまたはポリミキシンBと共に24時間インキュベートした。LDH活性は細胞培養上清においてアッセイした。100%LDH放出の対照として、トライトンX-100を加えた。データは平均値±標準偏差として示す。ペプチドSEQ ID NO:40、41、42、および43のみが有意な毒性を示した。
HBE細胞を100 μg/mlペプチドまたはポリミキシンBと共に24時間インキュベートして、細胞生存率を調べた。データは平均値±標準偏差として表す。100%LDH放出の対照として、トライトンX-100を加えた。ペプチドSEQ ID NO:40、41、42、および43のみが有意な毒性を示した。
陽イオンペプチドによるポリヌクレオチド調節
ポリヌクレオチドアレイを利用して、マクロファージおよび上皮細胞の転写反応に及ぼす陽イオンペプチド自身の影響を決定した。マウスマクロファージRAW 264.7、ヒト気管支細胞(HBE)、またはA549ヒト上皮細胞を150 mm組織培養皿において5.6×106個/皿で播種して、一晩培養した後、50 μg/mlペプチドまたは培地単独と共に4時間インキュベートした。刺激後、細胞をジエチルピロカーボネート処置PBSによって1回洗浄して、セルスクレイパーを用いて皿から剥離させた。総RNAトリゾル(Gibco Life Technologies)を用いて単離した。RNA沈降物を、RNアーゼ阻害剤(Ambion, Austin, TX)を含むRNアーゼを含まない水に浮遊させた。RNAをDNアーゼI(Clontech, Palo Alto, CA)によって37℃で1時間処置した。終止ミクス(0.1 M EDTA[pH 8.0]、1 mg/mlグリコーゲン)を加えた後、試料をフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)によって1回抽出し、クロロホルムによって1回洗浄した。次に、100%エタノールの2.5倍量および酢酸ナトリウム、pH 5.2の1/10倍量を加えることによって、RNAを沈殿させた。RNAを、RNアーゼ阻害剤(Ambion)を含むRNアーゼを含まない水に浮遊させて、-70℃で保存した。RNAの質は、1%アガロースゲルにおけるゲル電気泳動によって評価した。ゲノムDNA混入がないことは、β-アクチン特異的プライマー
によるPCR増幅の鋳型として単離RNAを用いることによって評価した。アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色は、35サイクル後にアンプリコンが存在しないことを確認した。
濃度50μg/mlの陽イオンペプチドは、いくつかのポリヌクレオチドの発現を強力に誘導することが示された。ペプチドをRAW細胞と共に4時間インキュベートした後、RNAを単離して、標識したcDNAプローブに変換してAtlasアッセイにハイブリダイズした。非刺激細胞の強度を第三の列に示す。「ペプチド:非刺激の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現の強度を指す。
濃度50 μg/mlの陽イオンペプチドは、いくつかのポリヌクレオチドの発現を減少させることが示された。ペプチドをRAW細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識されたcDNAプローブに変換して、Atlasアッセイにハイブリダイズさせた。非刺激細胞の強度を第三の列に示す。「ペプチド:非刺激の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現の強度を指す。アレイの実験を異なる細胞について3回繰り返して変化倍率の平均値を下記に示す。相対的発現レベルにおいて約2倍またはそれより大きい変化を示すポリヌクレオチドを示す。
RAW264.7マクロファージ細胞を、50 μg/mlペプチドまたは培地単独と共に4時間インキュベートして、総RNAを抽出し、半定量的PCRを行った。各ポリヌクレオチドに関する特異的プライマー組をRNAの増幅のために用いた。β-アクチンの増幅を陽性対照としておよび標準化のために用いた。RT-PCR産物の密度測定分析を用いた。結果は、培地単独と共にインキュベートした細胞と比較したペプチド処置細胞のポリヌクレオチド発現の相対的変化倍率を示す。データは実験3回の平均値±標準誤差として示す。
濃度50μg/mlの陽イオンペプチドは、いくつかのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトcDNAアレイID#PRHU03-S3にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第二の列に示す。「ペプチド:非刺激の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
濃度50μg/mlの陽イオンペプチドは、いくつかのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識したcDNAプローブに変換してヒトcDNAアレイID#PRHU03-S3にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第二の列に示す。「ペプチド:非刺激の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
濃度50μg/mlの陽イオンペプチドは、いくつかの前炎症性ポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された(データは表21のサブセットである)。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識したcDNAプローブに変換してヒトcDNAアレイID#PRHU03-S3にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第二の列に示す。「ペプチド:非刺激の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
濃度50μg/mlの陽イオンペプチドは、いくつかの前炎症性ポリヌクレオチドの発現を減少させることが示された(データは表22のサブセットである)。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識したcDNAプローブに変換してヒトcDNAアレイID#PRHU03-S3にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第二の列に示す。「ペプチド:非刺激の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
濃度50μg/mlの陽イオンペプチドは、特定の抗炎症性のポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された(データは表21のサブセットである)。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトcDNAアレイID#PRHU03-S3にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第二の列に示す。「ペプチド:非刺激の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
濃度50μg/mlの陽イオンペプチドは、特定の抗炎症性ポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された(データは表21のサブセットである)。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトcDNAアレイID#PRHU03-S3にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第二の列に示す。「ペプチド:非刺激の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
濃度50μg/mlのペプチドSEQ ID NO:6は、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトマクロファージと共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第二の列に示す。「ペプチド処置:対照の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
濃度50μg/mlのペプチドSEQ ID NO:6は、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトマクロファージと共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第二の列に示す。「ペプチド:対照の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
濃度50μg/mlのペプチドSEQ ID NO:1は、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトHBE細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識したcDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第二の列に示す。「ペプチド:対照の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
濃度50μg/mlのペプチドSEQ ID NO:1は、多くのポリヌクレオチドの発現を減少させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第三の列に示す。「ペプチド:対照の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
濃度50μg/mlのペプチドは、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトA549細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識したcDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を色素Cy3およびCy5によるcDNAの標識に関してそれぞれ、第二の列および第三の列に示す。「ID番号:対照」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
濃度50μg/mlのペプチドは、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を色素Cy3およびCy5によるcDNAの標識に関してそれぞれ、第二の列および第三の列に示す。「ID番号:対照」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
濃度50μg/mlのペプチドは、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を色素Cy3およびCy5によるcDNAの標識に関してそれぞれ、第二の列および第三の列に示す。「ID番号:対照」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
濃度50μg/mlのペプチドは、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を色素Cy3およびCy5によるcDNAの標識に関してそれぞれ、第二の列および第三の列に示す。「ID番号:対照」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
濃度50μg/mlのペプチドは、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を色素Cy3およびCy5によるcDNAの標識に関してそれぞれ、第二の列および第三の列に示す。「ID番号:対照」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
濃度50μg/mlのペプチドは、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識したcDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を色素Cy3およびCy5によるcDNAの標識に関して第二の列および第三の列に示す。「ID番号:対照」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
濃度50μg/mlのペプチドは、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を色素Cy3およびCy5によるcDNAの標識に関してそれぞれ、第二の列および第三の列に示す。「ID番号:対照」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。アクセッション番号および遺伝子の名称はU00115、ジンクフィンガータンパク質;M91036、ヘモグロビンγG;K000070、仮説上のタンパク質;AF055899、溶質担体ファミリー27;AK001490、仮説上のタンパク質;X97674、核受容体共活性化因子2;AB022847、未知;AJ275986、転写因子;D10495、タンパク質キナーゼC、δ;L36642、EphA7;M31166、ペンタキシン関連遺伝子;AF176012、未知;AF072756、キナーゼアンカータンパク質4;NM_014439、IL-1スーパーファミリーz;AJ271351、推定の転写調節因子;AK000576、仮説上のタンパク質;AJ272265、分泌型燐蛋白質2;AL122038、仮説上のタンパク質;AK000307、仮説上のタンパク質;AB029001、KIAA1078タンパク質;U62437、コリン作動性受容体;AF064854、未知;AL031588、仮説上のタンパク質;X89399、RAS p21タンパク質活性化因子;D45399、ホスホジエステラーゼ;AB037716、仮説上のタンパク質;X79981、カドヘリン5;AF034208、RIG-様7-1;AL133355、第21染色体オープンリーディングフレーム53;NM_016281、SEE20様キナーゼ;AF023614、膜貫通活性化因子およびCAML相互作用因子;AF056717、ash2-様;AB029039、KIAA1116タンパク質;J03634、インヒビン、βA;U80764、未知;AB032963、未知;X82835、ナトリウムチャンネル、電位により開く、IX型。
細胞株、ヒト全血、およびマウスにおけるペプチドによるケモカインの誘導
マウスマクロファージ細胞株RAW264.7、THP-1細胞(ヒト単球)、ヒト上皮細胞株(A549)、ヒト気管支上皮細胞(16HBEo14)、およびヒト全血を用いた。HBE細胞をアール塩を含むMEMにおいて増殖させた。THP-1細胞を増殖させて、RPMI1640培地において維持した。RAWおよびA549細胞株を、10%仔ウシ胎児血清を添加したDMEMにおいて維持した。細胞を24ウェルプレートにおいてDMEM(上記参照)において106個/ウェルの密度で播種し、A549細胞を24ウェルプレートにおいてDMEM(上記)において105個/ウェルの密度で播種し、双方を5%CO2において37℃で一晩インキュベートした。一晩増殖させた細胞からDMEMを吸引して、新鮮な培地に交換した。細胞をペプチドと共にインキュベートした後、培養上清へのケモカインの放出をELISA(R&D Systems, Minneapolis, MN)によって決定した。
RAW264.7マウスマクロファージ細胞またはヒト全血をLL-37の増加濃度によって4時間刺激した。ヒト血液試料を遠心して、血清を採取し、RAW264.7細胞からの上清と共にELISAによってMCP-1に関して試験した。示したRAW細胞データは、3回またはそれ以上の実験の平均値±標準誤差であり、ヒト血液データは異なるドナーからの平均値±標準誤差を表す。
A549細胞またはヒト全血をペプチドの増加濃度によってそれぞれ、24時間および4時間刺激した。ヒト血液試料を遠心して、血清を採取し、A549細胞からの上清と共にELISAによってIL-8に関して試験した。示したA549細胞データは、3回またはそれ以上の実験の平均値±標準誤差であり、ヒト血液データは異なるドナーからの平均値±標準誤差を表す。
ヒト全血をペプチドの増加濃度によって4時間刺激した。ヒト血液試料を遠心して、血清を採取してELISAによってIL-8に関して試験した。示したデータはドナー2人の平均である。
ペプチドの増加濃度をHBE細胞と共に8時間インキュベートして、上清を採取して、IL-8に関して試験した。データは、3回またはそれ以上の実験の平均値±標準誤差として表す。
BALB/cマウスをアベルチンによって麻酔して、ペプチドもしくは水の気管内注入を行うか、または注入を行わなかった(無処置)。マウスを4時間モニターして麻酔し、BAL液を単離してELISAによってMCP-1およびTNF-α濃度に関して分析した。示したデータは各条件に関してマウス4または5匹の平均値±標準誤差である。
RAW264.7マクロファージ細胞を、表記のペプチド(40 μg/ml)と共に6時間インキュベートした。上清を採取して、ELISAによってTNF-αレベルに関して試験した。データは3回またはそれ以上の実験の平均値+標準誤差として表す。
陽イオンペプチドはケモカイン受容体の表面発現を増加させる
IL-8RB、CXCR-4、CCR2、およびLFA-1の細胞表面発現を分析するために、RAWマクロファージ細胞を10 μg/mlの適当な一次抗体(Santa Cruz Biotechnology)によって染色した後、FITC結合ヤギ抗ウサギIgG[IL-8RBおよびCXCR-4(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)]またはFITC結合ロバ抗ヤギIgG(Santa Cruz)によって染色した。FACscanを用いて細胞を分析し、事象10,000個を計数して、前方および側方散乱にゲートを設定して細胞の破片を除去した。
RAWマクロファージ細胞をペプチドによって4時間刺激した。細胞を洗浄して、適当な一次抗体およびFITC標識二次抗体によって染色した。示したデータは、平均値(ペプチドによって刺激したRAW細胞の培地に対する変化倍率)±標準誤差を表す。
陽イオンペプチドによるMAPキナーゼのリン酸化
細胞を2.5×105個〜5×105個/mlで播種して一晩放置した。それらを培地において1回洗浄し、朝のあいだ血清を枯渇した(無血清培地−4時間)。培地を除去してPBSに交換して37℃で15分間放置した後、室温で15分間放置した。ペプチド(濃度0.1μg/ml〜50 μg/ml)またはH2Oを加えて、10分間インキュベートした。PBSを非常に速やかに除去して、阻害剤(NaF、B-グリセロホスフェート、MOL、バナジン酸塩、PMSF、ロイペプチン、アプロチニン)を含む氷冷ラジオイムノ沈殿(RIPA)緩衝液に交換した。プレートを氷中で10〜15分間または細胞が溶解するまで振とうさせて、溶解物を採取した。THP-1細胞の場合の技法はわずかに異なり、より多くの細胞(2×106個)を用いた。それらを一晩血清を枯渇させて、氷冷PBS 1 mlを加えた後、氷中に5〜10分間放置して遠心した後、RIPAに浮遊させた。タンパク質濃度は、タンパク質アッセイ(Pierce, Rockford, IL)を用いて決定した。細胞溶解物(タンパク質20 μg)をSDS-PAGEによって分離して、ニトロセルロースフィルターに転写した。フィルターを10 mMトリス-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl(TBS)/5%スキムミルク粉末によって1時間ブロックした後、TBS/0.05%ツイーン20において一次抗体と共に低温で一晩インキュベートした。TBS/0.05%ツイーン20によって30分間洗浄した後、フィルターを1μg/ml二次抗体のTBS溶液と共に室温で1時間インキュベートした。フィルターをTBS/0.05%ツイーン20によって30分間洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウスIgG(TBS/0.05%ツイーン20において1:10,000希釈)と共に室温で1時間インキュベートした。フィルターをTBS/0.1%ツイーン20によって30分間洗浄した後、免疫反応性バンドを増強化学発光(ECL)検出によって可視化した。末梢血単核球による実験に関して、末梢血(50〜100 ml)を全ての被験者から単離した。単核球をFicoll-Hypaque上での密度勾配遠心によって末梢血から単離した。分裂間期細胞(単核球)を採取して、洗浄し、10%仔ウシ胎児血清(FCS)および1%グルタミンを含む推奨される初代培養細胞培養培地に浮遊させた。細胞を6ウェル培養プレートに4×106個/ウェルで播種して、5%CO2大気中で37℃で1時間接着させた。上清の培地および非接着細胞を洗浄して除去し、ペプチドを含む適当な培地を添加した。新たに採取した細胞は、そのトリパンブルー排除能によって評価したところ、一貫して生存細胞>99%であった。ペプチドによる刺激後、様々なホスファターゼおよびキナーゼ阻害剤の存在下でRIPA緩衝液において細胞を溶解することによって、溶解物を採取した。タンパク質含有量を分析して、各試料約30 μgを12%SDS-PAGEゲルにローディングした。ゲルをニトロセルロースにブロットして、1%トライトンX 100を含むトリス緩衝生理食塩液(TBS)において5%スキムミルク粉末によって1時間ブロックした。リン酸化は、リン酸化特異的抗体によって検出した。
陽イオンペプチドは免疫応答を増強することによって細菌感染症に対して保護する
BALB/cマウスにサルモネラ1×105個および陽イオンペプチド(200 μg)を腹腔内注射によって投与した。マウスを24時間モニターして、その時点でマウスを安楽死させて、脾臓を摘出し、ホモジナイズしてPBSに浮遊させて、カナマイシン(50 μg/ml)を含むLuriaブロス寒天プレートに播種した。プレートを37℃で一晩インキュベートして、生存細菌に関して計数した(表49および50)。CD-1マウスに、5%ブタムチンにおいて黄色ブドウ球菌1×108個および陽イオンペプチド(200 μg)を腹腔内注射によって投与した(表51)。マウスを3日間モニターしてその時点で屠殺して血液を採取し、生存細胞数を調べるために播種した。CD-1雄性マウスにEHEC細菌5.8×106 CFUおよび陽イオンペプチド(200 μg)を腹腔内注射(IP)によって投与して、3日間モニターした(表52)。これらの動物モデルのそれぞれにおいて、ペプチドのサブセットは感染症に対する保護を示した。サルモネラモデルにおいて最も保護的なペプチドは、表50および51における保護アッセイの結果を表31〜37における遺伝子発現の結果と比較した場合に、上皮細胞において遺伝子の共通のサブセットの誘導能を示した(表53)。これは明らかに、ペプチドの保護を示す能力と一貫した遺伝子発現パターンが存在することを示している。陽イオンペプチドの多くは、最小生育阻止濃度(MIC)アッセイによって調べた場合に、直接の抗菌剤ではないことが示された(表54)。このことは、ペプチドの感染症保護能は、直接の抗菌活性よりむしろ、ペプチドの宿主先天性免疫の刺激能に依存することを証明している。
BALB/cマウスにサルモネラおよびペプチドを腹腔内注射して、24時間後に動物を安楽死させて、脾臓を摘出してホモジナイズし、PBSにおいて希釈して、細菌の生存率を決定するために、プレートの計数を行った。
BALB/cマウスにサルモネラおよびペプチドを腹腔内注射して、24時間後に動物を安楽死させて、脾臓を摘出してホモジナイズし、PBSにおいて希釈して、細菌の生存率を決定するために、プレートの計数を行った。
CD-1マウスに、5%ブタムチンにおいて細菌1×108個を腹腔内注射(IP)によって接種した。陽イオンペプチド(200 μg)を異なるIP注射によって投与した。マウスを3日間モニターして、その時点で安楽死させて、採血して生存細胞数を調べるために播種した。以下のペプチドは、黄色ブドウ球菌感染症の制御において有効ではなかった:SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:26。
CD-1雄性マウス(5週齢)にEHEC細菌5.8×106 CFUを腹腔内注射(IP)によって接種した。陽イオンペプチド(200 μg)を異なるIP注射によって投与した。マウスを3日間モニターした。
ペプチドSEQ ID NO:30、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:13は、濃度50 μg/mlでそれぞれ4時間処置後に遺伝子発現パターンを増加させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離して、標識cDNAプローブに変換して、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)とハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を、cDNAの標識に関して第二の列に示す(Cy3およびCy5の平均値)。アップレギュレーション倍率は、非刺激細胞の強度で除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。SEQ ID NO:37のペプチドは、マウス感染症モデルにおいて活性ではない陰性対照として含めた。
本明細書において調べたほとんどの陽イオンペプチド、および特に感染症モデルにおいて有効である陽イオンペプチドは、有意に抗菌的ではない。ペプチドの連続希釈液を表記の細菌と共に96ウェルにおいて一晩インキュベートした。細菌を殺すペプチドの最低濃度をMICとして用いた。記号>は、MICが大きすぎて測定できないことを示す。MIC 8μg/mlまたはそれ未満は、臨床的に意味のある活性であると見なされた。省略語:E.coli、大腸菌;S.aureus、黄色ブドウ球菌;P.aerug、緑膿菌;S. typhim、腸炎菌亜種ネズミチフス菌;C. rhod、シトロバクター・ロデンシス;EHEC、腸管出血性大腸菌。
診断/スクリーニングにおける細菌シグナル伝達分子によって誘導されたポリヌクレオチドの使用
ネズミチフス菌LPSおよび大腸菌O111:B4 LPSは、Sigma Chemical Co.(St. Louis、MO)から購入した。黄色ブドウ球菌のLTA(Sigma)を無エンドトキシン水(Sigma)に浮遊させた。LTA調製物に関してリムラス・アメーバ溶解物試験(Sigma)を行って、ロットがエンドトキシンによって有意に汚染されていないこと(すなわち、<1 ng/ml、RAW細胞アッセイにおいて有意なサイトカイン産生を引き起こさない濃度)を確認した。CpGオリゴデオキシヌクレオチドを、Applied Biosystems Inc.モデル392 DNA/RNAシンセサイザー、Missisauga, ONによって合成した後、精製して無エンドトキシン水(Sigma)に浮遊させた。以下の配列を用いた:
。非CpGオリゴは、そのサイトカイン産生刺激能に関して調べたところ、TNF-αまたはIL-6の有意な産生を引き起こさないことが判明し、したがって陰性対照として見なされた。培地単独、100 ng/mlネズミチフス菌LPS、1μg/ml黄色ブドウ球菌LTA、または1μM CpG(RAW細胞において腫瘍壊死因子(TNF-α)の最適な誘導を引き起こす濃度)によって4時間インキュベートしたRAW 264.7細胞から、RNAを単離した。RNAを用いて上記のようにClontech AtlasポリヌクレオチドアレイフィルターにハイブリダイズさせたcDNAプローブをポリヌクレオチド化させた。cDNAプローブのそれぞれの固定DNAに対するハイブリダイゼーションは、オートラジオグラフィーによって可視化して、ホスホイメージャーを用いて定量した。少なくとも2または3回の独立した実験からの結果を表55〜59に要約する。RAW 264.7細胞のLPS処置によってIL-1β、誘導型酸化窒素シンターゼ(iNOS)、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2α、CD40および多様な転写因子のような炎症性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む60個より多いポリヌクレオチドの発現の増加が起こることが判明した。LPS、LTA、およびCpG DNAによって誘導されたポリヌクレオチド発現の変化を比較したところ、これらの細菌産物は、三つ全てがiNOS、MIP-1α、MNP-2α、IL-1β、IL-15、TNFR1およびNF-κBのような前炎症性ポリヌクレオチドの発現を同程度に増加させることが判明した(表57)。表57は、その刺激比の差が三つの細菌産物のあいだで1.5倍未満であるという点において、同程度に細菌産物によってアップレギュレートされたポリヌクレオチド19個について記述している。同様に、LPS、LTA、およびCpGによって同程度にダウンレギュレートされたいくつかのポリペプチドが存在した。同様に、三つの細菌産物に反応して異なるように調節される多くのポリヌクレオチドが存在することが判明し(表58)、これには、一つまたは複数の細菌産物のあいだでの発現レベルの差が1.5倍より大きいこれらのポリヌクレオチドの多くが含まれた。LTA処置は、Jun-D、Jun-B、Elk-1ならびにサイクリンG2およびA1の発現の過剰刺激を含む、LPSまたはCpGと比較してポリヌクレオチドの最大のサブセットの発現に異なるように影響を及ぼした。その発現がLPSまたはCpG処置によってより大きく変化したポリヌクレオチドはごく少数であった。LTAまたはCpG処置と比較してLPS処置によって発現を選択的に増加させたポリヌクレオチドには、cAMP反応エレメントDNA結合タンパク質(CRE-BPI)、インターフェロン誘導型蛋白質1、およびCACCCボックス結合タンパク質BKLFが含まれた。LPSまたはLTA処置と比較してCpG処置後に発現が選択的に増加したポリヌクレオチドには、白血病阻害因子(LIF)およびプロテアーゼネキシン1(PN-1)が含まれた。これらの結果は、LPS、LTA、およびCpG DNAが大きく重なり合うポリヌクレオチド発現反応を刺激するが、同様に特定のサブセットのポリヌクレオチドの異なる調節能を示すことを示している。
大腸菌O111:B4 LPS(100 ng/ml)は、ポリヌクレオチドマイクロアレイによって調べた場合、A549細胞における多くのポリヌクレオチドの発現を増加させた。LPSを、A549細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離した。総RNA 5μgを用いて、Cy3/Cy5標識cDNAプローブを作製し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。非刺激細胞の強度を表55の第二の列に示す。「比:LPS/対照」の列は、非刺激細胞の強度によって除したLPS刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
大腸菌O111:B4 LPS(100 ng/ml)は、ポリヌクレオチドマイクロアレイによって調べた場合に、A549細胞における多くのポリヌクレオチドの発現を減少させた。LPSをA549細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離した。総RNA 5μgを用いてCy3/Cy5標識cDNAプローブを作製し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。非刺激細胞の強度を、表の第二の列に示す。「比:LPS/対照」の列は、非刺激細胞の強度で除したLPS刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
細菌産物(100 ng/mlネズミチフス菌LPS、1μg/ml黄色ブドウ球菌LTA、または1μM CpG)は、いくつかのポリヌクレオチドの発現を強力に誘導することが示された。ペプチドをRAW細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離して、標識cDNAプローブに変換して、Atlasアレイにハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞の強度を第二の列に示す。「LPS/LTA/CpG:対照の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除した細菌産物刺激細胞のポリヌクレオチド発現の強度を指す。
細菌産物(100 ng/mlネズミチフス菌LPS、1μg/ml黄色ブドウ球菌LTA、または1μM CpG)は、いくつかのポリヌクレオチドの発現を強力に誘導することが示された。ペプチドをRAW細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離して、標識cDNAプローブに変換して、Atlasアレイにハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞の強度を第二の列に示す。「LPS/LTA/CpG:対照の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除した細菌産物刺激細胞のポリヌクレオチド発現の強度を指す。
a)非刺激RAWマクロファージ細胞および100 ng/mlネズミチフス菌LPS、1μg/ml黄色ブドウ球菌LTA、1μM CpG DNA、または培地単独によって4時間処置した細胞から総RNAを単離して、ノザンブロットを行い、メンブレンをGAPDH、CD14、ビメンチン、およびトリステトラプロリンに関して既に記述されたようにプロービングした[Scottら]。ノザンブロットのハイブリダイゼーション強度を、ローディングの際の不一致を調べるためにGAPDHと比較した。これらの実験を少なくとも3回繰り返して、示したデータは培地と比較した各条件の相対的レベルの平均値(密度測定によって測定)±標準誤差である。
b)RAW 264.7細胞を100 ng/mlネズミチフス菌LPS、1μg/ml黄色ブドウ球菌LTA、1μM CpG DNA、または培地単独によって24時間刺激した。タンパク質溶解物を調製して、SDS PAGEゲルにおいて泳動させ、ウェスタンブロットを行ってLIF(R&D Systems)を検出した。これらの実験を少なくとも3回繰り返して、示したデータは培地と比較したLIFの相対レベル(密度測定によって測定)±標準誤差である。
c)100 ng/mlネズミチフス菌LPS、1μg/ml黄色ブドウ球菌LTA、1μM CpG DNAまたは培地単独によって24時間処置したRAWマクロファージ細胞から上清を回収して、既に記述されたように[Scottら]、グリース試薬によって安定なNO代謝物である窒素化物の蓄積から推定して、上清において形成されたNOの量を調べた。示したデータは、3回の実験の平均値±標準誤差である。
大腸菌O111:B4 LPS(100 ng/ml)は、ポリヌクレオチドマイクロアレイによって調べたところ、A549細胞において多くのポリヌクレオチドの発現を増加させた。LPSをA549細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離した。総RNA 5μgを用いてCy3/Cy5標識cDNAプローブを作製し、ヒトオペロンアレイ(PRHU04)にハイブリダイズさせた。LPS刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現の変化の例は、無処置細胞に対するLPS処置細胞の2倍より大きい強度レベルの変化を表す。
細菌感染症に対して保護するためのシグナル伝達の変化
ネズミチフス菌SL1344をAmerican Type Culture Collection(ATCC;Manassas, VA)から得て、ルリア-ベルタニ(LB)ブロスにおいて増殖させた。マクロファージ感染に関して、125 mlフラスコにおいてLB 10 mlを凍結したグリセロール保存液から接種して、37℃で振とうさせながら静止相まで一晩培養した。RAW 264.7細胞(1×105個/ウェル)を24ウェルプレートに播種した。細菌を培養培地において、名目上の感染多重度が100となるように希釈して、細菌を単層上で1000 rpmで10分間遠心して、感染を同期させて、感染を37℃、5%CO2インキュベータにおいて20分間進行させた。細胞をPBSによって3回洗浄して、細胞外細菌を除去した後、残存している如何なる細胞外細菌も殺し、再感染を防止するために、100 μg/mlゲンタマイシン(Sigma, St. Louis, MO)を含むDMEM+10%FBSにおいてインキュベートした。2時間後、ゲンタマイシン濃度を10 μg/mlに低下させて、アッセイを通して維持した。細胞を、以下の濃度の阻害剤によって感染前に30分間前処置した:50 μM PD 98059(Calbiochem)、50 μM U0126(Promega)、2 mMジフェニルヨードニウム(DPI)、250 μMアセトバニロン(アポシニン、Aldrich)、1 mMアスコルビン酸(Sigma)、30 mM N-アセチルシステイン(Sigma)、および2 mM NG-L-モノメチルアルギニン(L-NMMA、Molecular Probes)、または2 mM NG-D-モノメチルアルギニン(D-NMMA、Molecular Probes)。確実に有効性が得られるように、調製したばかりの阻害剤を感染直後、感染後2時間、および6〜8時間に加えた。対照細胞を、培地1 mlあたり同等の容量のジメチルスルホキシド(DMSO)によって処置した。ネズミチフス菌SL1344の細胞内生存/複製は、既に記述されているように、ゲンタマイシン耐性アッセイを用いて決定した。簡単に説明すると、細胞をPBSによって2回洗浄して、ゲンタマイシンを除去し、1%トライトンX-100/0.1%SDSのPBS溶液によって感染後2時間および24時間目に溶解して、細胞内細菌数をLB寒天プレート上でのコロニー数から計算した。これらの感染条件において、マクロファージを標準的なプレート計数によって評価したところ、平均で細菌1個/細胞を含み、これによって感染後24時間でのマクロファージの分析を行うことができた。細菌の糸状化は細菌のストレスに関連する。NADPHオキシダーゼおよびiNOSは、MEK/ERKシグナル伝達によって活性化することができる。結果(表61)は、細胞のシグナル伝達の変化が、それによって細胞内サルモネラ感染症を寛解できる方法であることを明らかに証明している。このように、細菌は、ヒト細胞において多数の遺伝子をアップレギュレートすることから、シグナル伝達を遮断するこの戦略は、感染症に対する一般的治療法である。
抗ウイルス活性
SDF-1、C-X-Cケモカインは、HIV-1共受容体-CXCR4の天然のリガンドである。ケモカイン受容体CXCR4およびCCR5は、HIV-1複製阻害の標的となる可能性がある。SDF-1の結晶構造は、逆平行β-シート、およびCXCR4の陰性荷電細胞外ループに結合する際に肝要である陽性荷電表面を示す。これらの知見は、ケモカイン誘導体、低分子CXCR4アンタゴニスト、またはケモカインの構造もしくはイオン特性を模倣するアゴニストが、X4 HIV-1感染症を治療するために有用な物質となる可能性があることを示唆している。陽イオンペプチドはSDF-1誘導T-細胞遊走を阻害することが判明し、ペプチドがCXCR4アンタゴニストとして作用する可能性があることを示唆している。遊走アッセイは以下のように実施した。ヒトJurkat T細胞を化学走化性培地(RPMI 1640/10 mM Hepes/0.5%BSA)において5×106個/mlで浮遊させた。遊走アッセイを5μmポリカーボネートトランスウェルインサート(Costar)を用いて24ウェルプレートにおいて行った。簡単に説明すると、ペプチドまたは対照を化学走化性培地において希釈し、下室に入れて、細胞(5×106個/ml)0.1 mlを上室に加えた。37℃で3時間後、下室に遊走した細胞数をフローサイトメトリーを用いて決定した。下室からの培地をFACscanの中に30秒間通過させて、前方および側方散乱にゲートを設定して細胞の破片を除外した。細胞5×105個/mlを下室に直接ピペッティングした「100%遊走対照」と比較して、生存細胞数をFACscanにおいて30秒間計数した。結果は、ペプチドの添加によっておそらくCXCR4発現に影響を及ぼすことによって(表63および64)、ヒトJurkat T細胞(表62)の遊走阻害が起こることを証明している。
相乗的併用
材料および方法
黄色ブドウ球菌をリン酸緩衝生理食塩液(PBS)および5%ブタムチン(Sigma)において、最終期待濃度が1〜4×107 CFU/mlとなるように調製した。黄色ブドウ球菌(5%ブタムチンと混合)100 μlを各CD-1マウス(体重20〜25 gの6〜8週齢雌性マウス(Charles River))に腹腔内注射した。感染開始6時間後、ペプチド100 μlを0.1 mg/kgセフェピムと共にIP注射した(50〜200 μg)。24時間後、動物を屠殺して、心穿刺を行って血液100 μlを得た。血液をヘパリンを含むPBS 1 mlにおいて希釈した。これをさらに希釈して、ミュラー-ヒントン寒天プレート(10-1、10-2、10-3、および10-4)において生存コロニー数を調べるためにに播種した。生存コロニー、コロニー形成単位(CFU)を24時間後に計数した。各実験は、少なくとも3回行った。データはCFUの平均値±標準誤差/治療群(マウス8〜10匹/群)として表す。
SEQ ID NO:1(配列
)は、UBCの核酸タンパク質合成(NAPS)部門においてFmoc[(N-(9-フルオレニル)メトキシカルボニル)]化学によって合成した。ヒト組換え型顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン-4(IL-4)、およびマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)は、Research Diagnostics Inc.(Flanders, NJ. USA)から購入した。百日咳毒素はList Biological Laboratories Inc.(Campbell, CA, USA)によって提供された。
刺激後、細胞を1 mMバナジン酸塩(Sigma)を含む氷冷PBSによって洗浄した。次に、RIPA緩衝液(50 mMトリス-HCl、pH 7.4、1%NP-40、0.25%デオキシコール酸ナトリウム、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM PMSF、各1μg/mlのアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチン、1 mMオルトバナジン酸ナトリウム、1 mM NaF)125 μlを加えて、肉眼的に評価して細胞が完全に溶解するまで、細胞を氷中でインキュベートした。溶解物をBCAアッセイ(Pierce)を用いて定量した。溶解物30 μlを厚さ1.5 mmのゲルにローディングして、これを100ボルトで約2時間泳動した。タンパク質をニトロセルロースフィルターに70 Vで75分間転写した。フィルターを5%スキムミルクのTBST(10 mMトリス-HCl、pH 8、150 mM NaCl、0.1%ツイーン-20)溶液によって室温で2時間ブロックした。次に、フィルターを抗ERK1/2-Pまたは抗-p38-P(Cell Signaling, Technology, Ma)モノクローナル抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。免疫反応性バンドを西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウスIgG抗体(Amersham Pharmacia, New Jersey)および化学発光検出(Sigma, MO)を用いて検出した。バンドを定量するために、フィルムをスキャンして、ソフトウェアプログラムImageJを用いて密度測定によって定量した。ブロットをβ-アクチン抗体(ICN Biomedical Incorporated, Ohio)によって再プロービングして、密度測定を行ってタンパク質のローディングを補正した。
ERK1/2活性アッセイは非放射活性キット(Cell Signaling, Technology)を用いて行った。簡単に説明すると、細胞を15分間処置して、溶解緩衝液において溶解した。等量のタンパク質を、ERK1/2のリン酸化(すなわち活性化)型に限って反応する固定ホスホERK1/2抗体によって免疫沈殿した。固定された沈殿した酵素を、Elk-1を用いるキナーゼアッセイに用いた後、リン酸化基質を検出および定量することができる抗体によるウェスタンブロット分析を行った。
16HBE40細胞の上清からのヒトIL-8は、製造元の説明書に従って市販の酵素結合イムノソルベントアッセイキット(Biosource)を用いて測定した。
二つの独立した実験からの総RNAを、製造元によって記述されたRNAqueous(Ambion)16HBE40細胞から単離した。試料をDNアーゼによって処置した後、第一鎖cDNA合成キット(Gibco)を用いてcDNA合成を行った。得られたcDNAを様々なサイトカイン遺伝子
のPCRにおける鋳型として用いた。各RT-PCR反応を少なくとも1試料あたり2個ずつ行った。結果を増幅の直線相において分析し、ハウスキーピング対照であるグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼに対して標準化した。逆転写酵素を用いない対象を含めることによって、反応をRNA増幅に関して確認した。
A.ペプチドは末梢血由来単球においてERK1/2およびp38のリン酸化を誘導する
ペプチドがMAPキナーゼ、ERK1/2、および/またはp38の活性化を誘導するか否かを決定するために、末梢血由来単球を50 μg/ml SEQ ID NO:1または水(溶媒対照として)によって15分間処置した。キナーゼの活性化(リン酸化)型を可視化するために、キナーゼの二重リン酸化型(ERK1/2およびp38に関してそれぞれ、Thr202+Tyr204およびThr180+Tyr182でのリン酸化)に対して特異的な抗体によるウェスタンブロットを行った。ゲルをβ-アクチンに対する抗体によって再プロービングして、ローディングの差を標準化した。全てにおいて、ERK1/2(n=8)およびp38(n=4)のリン酸化の増加がSEQ ID NO:1の処置に反応して認められた(図2)。
本発明者らは、LL-37によるERK1/2のリン酸化が血清の非存在下では起こらないこと、およびリン酸化の程度が、ERK1/2の活性化がウシ胎児血清(FBS)よりヒト血清(HS)においてかなり優れているように、存在する血清のタイプに依存することをを証明することができた。
GM-CSF、IL-4、またはM-CSF(それぞれ、100 ng/ml)をSEQ ID NO:1と同時に加えて、新たに単離したヒト血液単球においてERK1/2のリン酸化を測定した。細胞を50 μg/ml SEQ ID NO:1によって処置した場合、ERK1/2リン酸化は明白であった(無処置に対して8.3倍増加、n=9)が、より低い濃度(n=2)では明白ではなかった。100 ng/ml GM-CSFの存在下では、SEQ ID NO:1によるERK1/2リン酸化は、顕著に増加した(無処置より58倍増加、n=5)。さらに、GM-CSFの存在下では、ERK1/2の活性化は、調べたドナー2人においてそれぞれ、5および10 μg/ml SEQ ID NO:1の濃度に反応して起こった(図4)。このことは、SEQ ID NO:1が、炎症部位で局所的に認められるサイトカインであるGM-CSFの存在下では、より低い閾値でERK1/2の活性化を誘導したことを証明する。
IL-8は少なくとも部分的にERK1/2およびp38キナーゼの活性化によって支配される。ペプチドがIL-8分泌を誘導できるか否かを調べるために、ヒト気管支細胞株16HBE4o-をTranswellフィルターにおいてコンフルエンシーまで増殖させ、これによって細胞の分極が起こり、明瞭な先端および基底表面が作製される。細胞を先端表面において50 μg/ml SEQ ID NO:1によって4時間刺激した場合、先端上清に放出されたIL-8の統計学的に有意な増加が検出された(図5)。ペプチドによるMAPキナーゼ活性化の下流の転写効果を決定するために、ERK1/2またはp38によって調節されることが公知である遺伝子の発現を、RT-PCRによって評価した。RT-PCRは、2回の独立した実験から、16HBE4o-細胞から単離され、血清の存在下で50 μg/ml SEQ ID NO:1を4時間処置されたRNAについて行った。MCP-1およびIL-8はERK1/2およびp38の双方の転写制御下にあることが証明されており、これと一致してそれらはそれぞれ、2.4および4.3倍アップレギュレートされる。MCP-3の転写はこれまで、マイトゲン活性化タンパク質キナーゼの活性化によって影響を受けないことが証明されており、これと一致して発現はペプチド処置によって影響を受けない(図5)。これらのデータは、ERK1/2およびp38シグナル伝達経路の活性化が、免疫調節機能を有するサイトカイン遺伝子の転写に対して機能的影響を及ぼすという仮説と一致する。図3Bの挿入図はまた、ペプチドが血清依存的に転写因子Elk-1のリン酸化を誘導したことを証明している。
Claims (22)
- SEQ ID NO:1〜4、11、18、25、32、39、46、53、または54に記載のペプチドの治療的有効量を被験者に投与して、それによって免疫応答を刺激することを含む、被験者における先天性免疫を刺激する方法。
- 先天性免疫が、宿主免疫細胞の活性化、増殖、分化、またはMAPキナーゼ経路活性化によって証明される、請求項1記載の方法。
- MAPキナーゼがMEKおよび/またはERKである、請求項2記載の方法。
- 被験者にGM-CSFを投与することをさらに含む、請求項1記載の方法。
- SEQ ID NO:1〜4、7、11、18、25、32、39、46、53、または54に記載のペプチドと併用して抗生物質を被験者に投与する段階を含む、感染症を有するかまたは感染症を有する危険性のある被験者における先天性免疫を刺激する方法。
- ペプチドがD-エナンチオマーである少なくとも一つのアミノ酸を含む、請求項1記載の方法。
- ペプチドが環状である、請求項1記載の方法。
- ペプチドの配列が逆転している、請求項1記載の方法。
- 抗生物質を被験者に投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 抗生物質が、アミノグリコシド、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、クロラムフェニコール、グリシルサイクリン(glycylcycline)、リコサミド(licosamide)、アミノシクリトール、陽イオン抗菌ペプチド、リポペプチド、ポリミキシン、ストレプトグラミン、オキサゾラジノン、リンコサミド(lincosamide)、フルオロキノロン、カルバペネム、テトラサイクリン、マクロライド、βラクタム、カルバペネム、モノバクタム、キノロン、テトラサイクリン、またはグリコペプチドから選択される、請求項9記載の方法。
- ペプチドが抗炎症活性を有する、請求項5記載の方法。
- ペプチドが抗敗血症活性を有する、請求項5記載の方法。
- ペプチドがD-エナンチオマーである少なくとも一つのアミノ酸を含む、請求項5記載の方法。
- ペプチドが環状である、請求項5記載の方法。
- ペプチドの配列が逆転している、請求項5記載の方法。
- 抗生物質が、アミノグリコシド、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、クロラムフェニコール、グリシルサイクリン、リコサミド、アミノシクリトール、陽イオン抗菌ペプチド、リポペプチド、ポリミキシン、ストレプトグラミン、オキサゾラジノン、リンコサミド、フルオロキノロン、カルバペネム、テトラサイクリン、マクロライド、βラクタム、カルバペネム、モノバクタム、キノロン、テトラサイクリン、またはグリコペプチドから選択される、請求項5記載の方法。
- SEQ ID NO:1〜4、7、11、18、25、32、39、46、53、または54に記載のペプチドと併用してGM-CSFを被験者に投与する段階を含む、感染症を有するかまたは感染症を有する危険性のある被験者における先天性免疫を刺激する方法。
- ペプチドが抗炎症活性を有する、請求項17記載の方法。
- ペプチドが抗敗血症活性を有する、請求項17記載の方法。
- ペプチドがD-エナンチオマーである少なくとも一つのアミノ酸を含む、請求項17記載の方法。
- ペプチドが環状である、請求項17記載の方法。
- ペプチドの配列が逆転している、請求項17記載の方法。
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