CN101215601A - 先天免疫的效应物 - Google Patents
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Abstract
描述了一种鉴定受一种或多种脓毒症或炎症诱导物调节和受阳离子肽抑制的多聚核苷酸或多聚核苷酸谱型的方法。一种鉴定代表炎症或脓毒症应答受抑制的多聚核苷酸表达谱型的方法。该方法包括在存在或缺少肽的情况下,将细胞与LPS、LTA、CPG DNA和/或完整微生物或微生物成分接触;检测在存在或缺少该肽的情况下细胞的多聚核苷酸表达谱型,其中在该肽存在时的谱型代表炎症或脓毒症应答受到抑制。还包括由本发明的方法鉴定的化合物和试剂。在另一方面,本发明提供用于强化个体的先天免疫的方法和化合物。
Description
本申请是申请号为02827327.3、申请日为2002年12月2日、发明名称为“先天免疫的效应物”的专利申请的分案申请。
技术领域
[0001]本发明总体上涉及肽,更具体地,涉及作为治疗有效的肽,和有效地用于与微生物感染引起的病理相关的药物开发和有效地调节先天免疫或抗炎活性的肽。
背景技术
[0002]感染性疾病是世界范围内导致死亡的主要原因。根据1999年世界卫生组织的研究,每年有超过1.3千万人死于感染性疾病。在北美,感染性疾病是导致死亡的第三大祸首,每年有20%的死亡归咎于感染性疾病,而且自1980年以来它就以50%的速度递增。许多药物治疗和手术治疗成功的关键也都在于对感染性疾病的控制。抗生素的发现和使用已经成为现代医学的重大成就之一。没有抗生素,医生就无法开展复杂的手术、化疗和大多数医学干预,例如导管插入术(catheterization)。
[0003]目前,抗生素在世界范围内的销售量为260亿美元。然而,抗生素的滥用和某些不正当应用已经导致进化出对抗生素具有抗性的新菌株。抗生素抗性已经成为医学领域的一个组成部分。不能用抗生素对付一些细菌,如具有万古霉素抗性的肠球菌,VRE和具有甲氧苯青霉素(methicillin)抗性的葡萄球菌,MRSA菌株,于是,被这些细菌感染的病人常常就会死去。对于新药开发来说,抗生素的发现已经成为最困难的领域之一,许多大的制药公司已经削减或者完全停止了它们的抗生素开发项目。然而,随着抗生素抗性问题的急剧增涨,包括不能被治疗的感染性疾病的出现,对新型抗微生物疗法的医学需求显然未能得到满足,对先天免疫能够产生影响的制剂将成为这样的一类制剂之一。
[0004]先天免疫系统是极为有效的、高度进化的普遍的防御系统。先天免疫的要素(elements)总是低水平地存在,当受到刺激时,它们能非常快速地被激活。刺激包括细菌信号传导分子和身体细胞表面的谱型识别受体间的相互作用,或其它致病机理。每天,人类都要通过各位所消化的食物和水分、各位所呼吸的空气、各位所触摸到的物体表面、宠物和人,接触到成千上万的潜在的病原微生物。先天免疫便发挥作用以防止这些病原体引起疾病的发生。先天免疫系统不同于所谓的适应性免疫(它包括抗体和抗原特异性B淋巴细胞及T淋巴细胞),因为前者总是存在的,能立刻产生效应,并且对于任何特定的病原体都是相对非特异性的。适应性免疫要求放大特定的识别要素(recogination elements),因此需要数天至数周才能发生响应。即便用疫苗接种预先刺激了适应性免疫,它也可能需要三天或者更长时间对一种病原体作出反应,然而,先天免疫可以立刻或很快地(数小时)地进行反应。先天免疫涉及各种效应物功能,包括吞噬细胞、补体等等,但是尚未被完全理解。一般说来,许多先天免疫响应都是由微生物信号传导分子结合到宿主细胞表面上的谱型识别受体而“触发”的,该谱型识别受体称之为Toll样受体。在炎症反应中,有许多这样的效应物功能(effector function)聚集到一起。然而,一个太剧烈的炎症反应会导致对身体有害的反应,在极端的情况中可能出现脓毒症,以及很可能死亡。
[0005]在感染过程中,结构性组分从感染原(infectious agents)上释放出来,导致炎症应答,当它未受到抑制时,则有可能导致潜在的致死状况,脓毒症。在北美每年有大约780,000例脓毒症患者。脓毒症的发生可能是在社区获得的传染病如肺炎导致的结果,也可能是治疗外伤、癌症或大外科时的并发症。当身体完全无法控制炎症应答时,便会发生严重的脓毒症,身体器官开始失去机能。在北美每年有多达120,000人死于脓毒症。脓毒症也可能涉及病原微生物或血液中的毒素(例如,败血症),它是人类死亡的一个主要原因。革兰氏阴性细菌是与这类疾病联系最为普遍的生物。然而,革兰氏阳性细菌也在越来越多地引起感染病。革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌以及它们的组分都能导致脓毒症。
[0006]微生物组分的存在引起促炎细胞因子的释放,在这些促炎细胞因子中,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是极其重要的。TNF-α和其它促炎细胞因子又能够导致其它促炎介质(pro-inflammatory mediator)的释放并导致炎症级联反应(pro-inflammatory cascade)。革兰氏阴性脓毒症通常是由细菌外膜组分,脂多糖(LPS,也被称为内毒素)的释放引起的。血液中的内毒素,被称为内毒素血症(endotoxemia),它主要来自于细菌感染,可以在抗生素治疗过程中被释放。革兰氏阳性脓毒症可由细菌的细胞壁组分的释放引起,这些细胞壁组分例如脂磷壁酸(LTA)、肽聚糖(PG)、由链球菌产生的鼠李糖-葡萄糖聚合物,或由葡萄球菌产生的荚膜多糖。不同于哺乳动物DNA,细菌或其他非哺乳动物的DNA含有高频率的未甲基化的胞嘧啶-鸟苷二聚体(CpG DNA),已经表明细菌或其他非哺乳动物的DNA也能引发脓毒症状况,包括TNF-α的产生。哺乳动物DNA含有CpG二核苷酸的频率要低得多,它们常常是甲基化的形式。除了在细菌感染过程中它们的自然释放,抗生素治疗也能导致细菌细胞壁组分LPS和LTA的释放,而且也可能导致细菌DNA的释放。这可能阻碍从感染痊愈,或者甚至导致脓毒症。
[0007]人们不断认识到阳离子肽(cationic peptides)可以作为防御感染的一种形式,尽管在科学和专利文献中,它的主要效果被认为是抗微生物的效果(Hancock,R.E.W.和R.Lehrer.1998 Cationic peptides:a new source of antibiotics.Trends inBiotechnology 16:82-88)。具有抗微生物活性的阳离子肽已经从多种生物中分离出来。事实上,这些肽提供了一种防御微生物例如细菌和酵母的机制。一般地,认为这些阳离子肽与细胞质膜相互作用,而且在大多数情况下,会形成通道和损伤,由此对细菌产生抗微生物活性。在革兰氏阴性细菌中,它们和LPS作用,使外膜具有可通透性,由此导致自促式的穿透外膜的吸收,并到达细胞质膜。阳离子抗微生物肽的例子包括indolicidin(来自牛嗜中性细胞的抗微生物多肽)、防御素(defensins)、杀菌肽(cecropins)和爪蟾抗菌肽(magainins)。
[0008]最近,已经逐渐认识到,在先天免疫的其它方面,这些肽可以作为效应物(Hancock,R.E.W.和G.Diamond.2000.The role of cationic peptides in innate hostdefenses.Trends in Microbiology 8:402-410.Hancock,R.E.W.2001.Cationicpeptides:effectors in innate immunity and novel antimicrobials.Lancet InfectiousDiseases 1:156-164),尽管还不知道该抗微生物功能和效应物功能是否有关。
[0009]一些阳离子肽具有能够结合细菌产物如LPS和LTA的吸附作用。在对LPS的应答中,这些阳离子肽能够抑制细胞因子的产生,因此能够在一定程度上防止致死性休克。然而,还没有证明,这些效果是由于该肽结合到LPS和LTA上,还是由于该肽和宿主细胞的直接作用。在对微生物或微生物信号分子如LPS的攻击产生应答时,阳离子肽通过与由哺乳动物免疫系统使用的调控路径相类似的调控路径被诱导(涉及Toll样受体和转录因子;NFκB)。由此看来,阳离子肽在先天免疫中具有关键的作用。影响抗细菌肽的诱导的突变能够降低对细菌攻击进行应答时的生存者。同样,当果蝇的Toll路径发生可导致抗真菌肽表达降低的突变时,也就增加了对致死性真菌感染的敏感性。对于人类,患有颗粒体缺乏综合症的病人完全缺乏α-防御素,会患上频繁的和严重的细菌感染疾病。其它证据包括一些肽可由传染原(infectious agents)诱导,以及已经发现在炎症发生处这些肽的浓度相当高。阳离子肽也可以调控细胞迁移,以促进白细胞抵抗细菌感染的能力。例如,已经发现,两种人α-防御素多肽,HNP-1和HNP-2,对鼠和人的T细胞和单核细胞具有趋化活性,而且,人β-防御素似乎能够通过和CCR6作用,而对未成熟树突细胞和记忆T细胞起到化学引诱物(chemoattractants)的作用。类似地,发现猪的阳离子肽PR-39对嗜中性粒细胞具有趋化作用。然而,具有不同结构和组成的肽是否共有这些性质仍不清楚。
[00010]LL-37是唯一已知的来自人的cathelicidin(一种具强有力膜活性的抗微生物肽类的前体),它是由骨髓前体、睾丸、炎症疾病期间的人角化细胞和气道上皮细胞产生。Cathelicidin肽的特征是在称之为cathelin结构域的N端前体区域(preproregion)具有相当高比例的序列同一性。Cathelicidin肽作为未活化的前肽前体被贮存起来,一旦受到刺激,它便被加工成为活性肽(active peptides)。
发明内容
[00011]本发明是基于如下开创性发现:可以基于受内毒性的脂多糖、脂磷壁酸、CpG DNA或其它细胞成分(例如微生物或它们的细胞成分)调节,而又被阳离子肽影响的多聚核苷酸表达谱型,筛选出可阻断或降低个体的脓毒症和/或炎症的新颖化合物。而且,在使用阳离子肽作为工具的基础上,能够鉴定出先天免疫的选择性强化剂,它们不会引起脓毒症反应,却能够阻断/抑止炎症和/或脓毒症应答。
[00012]因此,在一个实施方案中,提供了鉴定多聚核苷酸或多聚核苷酸谱型的方法,这些多聚核苷酸受一种或多种脓毒症或炎症诱导物调节,同时受阳离子肽抑制。本发明的方法包括将一种或多种多聚核苷酸与一种或多种脓毒症或炎症诱导物接触,并同时或随后立即将该种或该多种多聚核苷酸与阳离子肽接触。检测在阳离子肽存在时和阳离子肽不存在时的表达差异,在表达上的变化,或者是增量调节(up-regulation)或者是减量调节(down-regulation),可以作为受脓毒症或炎症诱导物调节同时又受阳离子肽抑制的多聚核苷酸或多聚核苷酸谱型的标志。在另一个方面,本发明提供了由上述方法鉴定的一种或多种多聚核苷酸。脓毒症或炎症调节物包括LPS、LTA或CpG DNA或微生物成分(或它们的任意组合),或相关试剂。
[0010]在另一个实施方案中,本发明提供了鉴定可阻止脓毒症或炎症的试剂的方法,包括将由前述方法鉴定出的多聚核苷酸与一种试剂进行组合,其中,与不存在该试剂时相比较,在存在该试剂时该多聚核苷酸的表达受到了调节,并且在表达上的这种调节影响炎症或脓毒症应答。
[0011]在另一个实施方案中,本发明通过1)在存在或缺乏阳离子肽的情况下,将细胞与LPS、LTA和/或CpG DNA接触,和2)检测在存在或缺乏该肽的情况下的多聚核苷酸表达谱型,提供了一种鉴定在炎症或脓毒症应答受抑制时的多聚核苷酸表达谱型的方法。在该肽存在时获得的谱型代表炎症或脓毒症应答受到抑制。在另一个方面,将该肽存在时获得的谱型与一种受测化合物存在时获得的谱型相比较,从而鉴定出提供类似谱型的化合物。在另一个方面,本发明提供了由前述方法鉴定的化合物。
[0012]在另一个实施方案中,本发明提供了鉴定可强化先天免疫的试剂的方法,包括将编码涉及先天免疫的多肽的一种或多种多聚核苷酸与感兴趣的试剂接触,其中,与不存在该试剂时相比较,在存在该试剂时该多聚核苷酸的表达被调节,并且该被调节的表达导致先天免疫的强化。优选地,该试剂并不刺激个体内的脓毒症反应。在一个方面,该试剂增加抗炎症的多聚核苷酸的表达。示例性但非限制性的抗炎多聚核苷酸编码的蛋白例如:IL-1 R拮抗剂同源物1(AI167887)、IL-10Rβ(AA486393)、IL-10Rα(U00672)、TNF受体成员1B(AA150416)、TNF受体成员5(H98636)、TNF受体成员11b(AA194983)、HLA II的IK细胞因子减量调节物(R39227)、TGF-B诱导性早期生长应答蛋白2(AI473938)、CD2(AA927710)、IL-19(NM_013371)或IL-10(M57627)。在一个方面,该试剂降低编码涉及NK-κB激活的蛋白酶体亚基例如蛋白酶体亚基26S(NM_013371)的多聚核苷酸的表达。在一个方面,该试剂可以作为蛋白激酶的拮抗剂。在一个方面,该试剂是选自SEQ ID NO:4-54的肽。
[0013]在另一个实施方案中,本发明提供了一种鉴定多聚核苷酸表达谱型以鉴定可选择性地强化先天免疫的化合物的方法。本发明包括检测在有阳离子肽接触时和无阳离子肽接触时细胞的多聚核苷酸表达谱型,其中,在该肽存在时的谱型代表刺激先天免疫;检测在有一种受测化合物接触时细胞的多聚核苷酸表达谱型,其中,如果使用该受测化合物时的谱型与在该阳离子肽存在时观察到的谱型相类似,则表示该受测化合物可强化先天免疫。优选的是,该化合物并不刺激个体内的脓毒症反应。
[0014]在另一个实施方案中,本发明提供了由一哺乳动物个体的核酸样品推断该个体的感染状态的方法,该方法是依靠于确定该核酸样品中的多聚核苷酸表达谱型,例如与未感染的个体相比,表50、51和/或52中的至少两种多聚核苷酸的表达量增加。还包括由上述任一方法获得的多聚核苷酸表达谱型。
[00013]在另一个方面,提供了作为CXCR4的拮抗剂的阳离子肽。仍然在另一个方面,提供了鉴定作为CXCR-4的拮抗剂的阳离子肽的方法,包括在受测肽存在或不存在的情况下将T细胞和SDF-1接触,并测量趋化性。如果在受测肽存在时趋化性降低,则表明该肽是CXCR-4的拮抗剂。阳离子肽也可以起到降低SDF-1受体多聚核苷酸(NM_013371)的表达的作用。
[0015]在上述所有方法中,本发明的化合物或试剂包括但不限于肽(peptides)、阳离子肽(cationic peptides)、肽模拟物(peptidomimetics)、化学化合物(chemicalcompounds)、多肽(polypeptides)、核酸分子(nucleic acid molecules)和类似物。
[0016]仍然在另一方面,本发明提供了被分离的阳离子肽。本发明的被分离的阳离子肽可用下列任一通式和单字母氨基酸记号表示:
X1X2X3IX4PX4IPX5X2X1(SEQ ID NO:4),其中X1是一个或两个R、L或K,X2是一个C、S或A,X3是一个R或P,X4是一个A或V,X5是一个V或W;
X1LX2X3KX4X2X5X3PX3X1(SEQ ID NO:11),其中X1是一个或两个D、E、S、T或N,X2是一个或两个P、G或D,X3是一个G、A、V、L、I或Y,X4是一个R、K或H,X5是一个S、T、C、M或R;
X1X2X3X4WX4WX4X5K(SEQ ID NO:18),其中X1是一至四个选自A、P或R的氨基酸,X2是一个或两个芳香氨基酸(F、Y和W),X3是一个P或K,X4是零至两个选自A、P、Y或W的氨基酸,X5是一至三个选自R或P的氨基酸;
X1X2X3X4X1VX3X4RGX4X3X4X1X3X1(SEQ ID NO:25),其中X1是一个或两个R或K,X2是一个极性的或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H),X3是C、S、M、D或A,X4是F、I、V、M或R;
X1X2X3X4X1VX5X4RGX4X5X4X1X3X1(SEQ ID NO:32),其中X1是一个或两个R或K,X2是一个极的性或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H),X3是一个C、S、M、D或A,X4是一个F、I、V、M或R,X5是一个A、I、S、M、D或R;和
KX1KX2FX2KMLMX2ALKKX3(SEQ ID NO:39),其中,X1是一个极性氨基酸(C、S、T、M、N和Q);X2是一个A、L、S或K,X3是1至17个选自G、A、V、L、I、P、F、S、T、K和H的氨基酸;
KWKX2X1X1X2X2X1X2X2X1X1X2X2IFHTALKPISS(SEQ ID NO:46),其中X1是一个疏水氨基酸,X2是一个亲水氨基酸。
[0017]此外,在另一方面本发明提供了被分离的阳离子肽KWKSFLRTFKSPVRTVFHTALKPISS(SEQ ID NO:53)和KWKSYAHTIMSPVRLVFHTALKPISS(SEQ ID NO:54)。
[0018]还提供了编码本发明的阳离子肽的核酸序列,包含这些多聚核苷酸的载体和含有这些载体的宿主细胞。
具体实施方式
[0019]本发明提供了可由一组通式表征的新颖的阳离子多肽,它们能够调节(例如,增量调控和/或减量调控)多聚核苷酸的表达,由此调控和炎症应答和/或先天免疫。
[0020]在此使用的“先天免疫”是指一种生物防御病原体入侵、保护自己的先天具有的能力。在此使用的病原体或微生物可以包括,但不限于细菌、真菌、寄生虫和病毒。先天免疫与获得性/适应性免疫不同,对于后者,生物主要是基于抗体和/或免疫淋巴细胞来发展自己的防御机制,其特征是特异性、可放大性和辨认自身与非自身。先天免疫提供了广泛的非特异性免疫,并且对于以前的暴露没有免疫记忆。先天免疫的特点是能够有效地抵抗广范围的各种潜在病原体,而不依赖于对一种病原体的先前接触,先天免疫的另一个特点是能够快速的生效(与特异性免疫应答相比较而言,特异性免疫应答的激发需要数天到数周的时间)。而且,先天免疫包括影响到其它疾病的免疫应答,这些疾病例如癌症、炎症疾病、多发性硬化症、各种病毒感染,等等。
[0021]正如在此所使用的,术语“阳离子肽”是指约5到约50个氨基酸长的氨基酸序列。在一个方面,本发明的阳离子肽的长度为约10到约35个氨基酸。如果一个肽具有足够的正电荷氨基酸,以致于pI大于约9.0,则认为该肽是“阳离子肽”,其中,pI(等电点)=当该肽的净电荷是中性时的pH值。通常,该阳离子肽的氨基酸残基中至少有两个是带正电荷的,例如赖氨酸和精氨酸。“具正电荷”是指在pH 7.0时具有净的正电荷的氨基酸残基侧链。自然出现的阳离子抗微生物肽的例子包括防御素、cathelicidins、爪蟾抗菌肽、峰毒肽(melittin)、杀菌肽、bactenecins(来自牛嗜中性粒细胞的抗微生物多肽)、indolicidins、polyphemusins、tachyplesins(来自马蹄蟹血细胞的抗微生物多肽),以及它们的类似物,这些自然出现的阳离子抗微生物多肽可以依据本发明重组产生。许多生物都制造阳离子肽,把这些分子作为抵抗微生物的非特异性防御机制的一部分来使用。分离出来的这些肽对广范围的各种微生物具有毒性,包括细菌、真菌和某些带被膜的病毒。当阳离子肽对许多病原体发挥抵抗作用时,显著的异常和不同程度的毒性是存在的。然而,本专利揭露了对微生物不具毒性却能够通过刺激先天免疫防御感染的其它阳离子肽,并且本发明并不限于具有抗微生物活性的阳离子肽。事实上,在本发明中使用的许多肽并没有抗微生物活性。
[0022]在本技术领域已知的阳离子肽包括,例如人cathelicindin IL-37、牛嗜中性细胞多肽indolicidin、以及牛bactenecin的变体,Bac2A。
IL-37 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(SEQ ID:1)
Indolicidin ILPWKWPWWPWRR-NH2(SEQ ID NO:2)
Bac2A RLARIVVIRVAR-NH2(SEQ ID NO:3)
[0023] 在先天免疫中,免疫应答并不依赖于抗原。先天免疫过程可以包括分泌性分子和前面提出的细胞组分的产生。先天免疫中,病原体由在生殖种系中编码的受体识别。这些Toll样受体具有广泛的特异性,能够识别许多病原体。当阳离子肽出现在免疫应答中时,它们辅助宿主对病原体的应答。在免疫应答中的这种变化诱导趋化因子的释放,趋化因子促使免疫细胞集中到感染发生的部位。
[0024] 趋化因子或化学诱导细胞因子属于一类免疫因子,它们介导趋化和其它促炎症现象(参见,Schall,1991,Cytokine 3:165-183)。趋化因子是长度大约70-80残基的小分子,通常被分为两小类,具有由单个氨基酸隔开的N端半胱氨酸(CxC)的α亚类,和在N端具有两个相邻半胱氨酸(CC)的β亚类。RANTES、MIP-1α和MIP-1β属于β亚类(参见综述:Horuk,R.1994,Trends Pharmacol.Sci,15:159-165;Murphy,P.M.1994,Annu.Rev.Immunol.12:593-633)。β型趋化因子RANTES、MCP-1和MCP-3的氨基末端关联到介导细胞迁移和由这些趋化因子诱导的炎症反应的调节。这种关联由实验观察看出,剔除MCP-1氨基末端的8个残基、MCP-3氨基末端的9个残基和RANTES氨基末端的8个残基,以及将一个甲硫氨酸增加到RANTES的氨基末端,会对其趋化性、钙转移和/或由它们的天然相似物刺激的酶释放产生拮抗作用(Gong等,1996 J.Biol. Chem.271:10521-10527;Proudfoot等,1996 J.Biol.Chem.271:2599-2603)。另外,可以通过将Tyr28和Arg30通过双突变变为亮氨酸和缬氨酸,将与α型趋化因子类似的趋化活性引入到MCP-1中,这表明该蛋白的内部区域在调控趋化活性时也发挥着作用(Beall等,1992,J.Biol. Chem.267:3455-3459)。
[0025]迄今已获表征的所有趋化因子的单体形式都具有明显的结构同源性,尽管α型和β型的四级结构有所不同。β型和α型趋化因子的单体结构非常类似,但是这两种类型的二聚体结构则完全不同。还鉴别出了另外一种趋化因子,淋巴细胞趋化因子(lymphotactin),它只有一个N端半胱氨酸,它代表了趋化因子的第三个亚家族(γ)(Yoshida等,1995,FEBSLett.360:155-159;和Kelner等,1994.Science 266:1395-1399)。
[0026] 趋化因子的受体属于与G蛋白偶联的具有7个跨膜结构域的受体(GCR’s)大家族(参见综述:Horuk,R.1994,Trends Pharmacol.Sci.15:159-165;和Murphy,P.M.1994,Annu.Rev.Immunol. 12:593-633)。竞争结合和交互失敏(cross-desensitization)研究已表明趋化因子受体在结合配体时具有明显的混杂性。证明β趋化因子间的混杂性的例子包括:CC CKR-1结合RANTES和MIP-1α(Neote等,1993,Cell 72:415-425),CC CKR-4结合RNATES、MIP-1α和MCP-1(Power等,1995,J.Biol.Chem.270:19495-19500),以及CC CKR-5结合RNATES、MIP-1α和MIP-1β(Alkhatib等,1996,Science,in press和Dragic等,1996,Nature 381:667-674)。红细胞具有一种能够结合α和β趋化因子的受体(被称为Duffy antigen(达菲抗原))(Horuk等,1994,J.Biol.Chem.269:17730-17733;Neote等,1994,Blood 84:44-52;和Neote等,1993,J.Biol.Chem.268:12247-12249)。因此,趋化因子以及它们的受体间的明显的序列和结构同源性使得在受体-配体的相互作用中存在着重叠。
[0027]一方面,本发明提供了包括本发明的阳离子肽在内的化合物通过直接作用于宿主细胞而减少脓毒症和炎症应答的应用。在这一方面,一种鉴别被一种或多种脓毒症或炎症诱导物调控的多聚核苷酸的方法被提供,其中该调控被阳离子肽改变。所述的脓毒症或炎症诱导物包括,但不限于内毒性脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)和/或CpG DNA或完整的细菌或其它细菌组分。该鉴别方法是依靠将多聚核苷酸与脓毒症或炎症诱导物接触,并同时或随后立即与阳离子肽接触。在存在阳离子肽和缺少阳离子肽时,对多聚核苷酸的表达进行观察,表达上的变化说明该核苷酸或该类型的核苷酸受脓毒症或炎症诱导物的调控,并受阳离子肽的抑制。在另一个方面,本发明提供了由该方法鉴定的多聚核苷酸。
[0028]这样的多聚核苷酸一旦被鉴定出来,就可用于筛选能够通过影响该多聚核苷酸的表达而阻止脓毒症或炎症的化合物。对表达的这种影响可以是表达的增量调控(up regulation)或减量调控(down regulation)。通过鉴定不激发脓毒症反应的化合物和能够阻止或抑止炎症或脓毒症反应的化合物,本发明还提出了一种鉴别先天免疫强化剂的方法。此外,本发明提供了在上述方法中使用和鉴别出的化合物。
[0029]候选化合物从广泛的来源获得,包括各种合成化合物和天然化合物。例如,可以利用许多方法来随机和定向合成出各种有机化合物和生物分子,包括随机寡聚核苷酸和寡聚多肽的表达。作为选择,以细菌、真菌、植物和动物提取物形式存在的天然化合物的文库(libraries)可被利用或方便地生产。此外,可以通过传统的化学、物理和生化手段方便地修饰天然的或合成产生的文库和化合物,也可利用这些文库和化合物得到组合文库(combinatorial libraries)。已知的药理学的药剂可以作定向或随机的化学修饰,例如酰基化、烷基化、酯化、酰胺化等等,从而得到结构类似物(structural analogs)。候选试剂也可以从生物分子中找到,包括但不限于:肽、肽模拟物(peptidiomimetics)、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、多肽、多聚核苷酸、化合物(chemical compounds)、衍生物(derivatives)、结构类似物(structural analogs)或它们的组合(combinations)。
[0030]筛选实验的温育要素(components)包括允许受测化合物与感兴趣的多聚核苷酸相互接触的条件。接触可以是在液相中、固相中,或者在细胞中。为了筛选出多个化合物,受测化合物可以选择为组合文库。依本发明的方法鉴定出的化合物可以通过在检测化合物时通常使用的任何方法,在溶液中或者在结合到固体支持物之后,被进一步评估、检测、克隆、测序等等。
[0031]一般而言,在本发明的方法中,利用阳离子肽来检测和定位在脓毒症和炎症过程中必需的多聚核苷酸。一旦被鉴定出来,就可以通过观察其在阳离子肽存在和缺乏时的表达来获得多聚核苷酸的表达谱型(pattern)。在阳离子肽存在的情况下获得的谱型对于鉴定能够抑制该多聚核苷酸的表达并由此阻止脓毒症或炎症的其它化合物又是很有用的。对于本领域技术人员而言,已熟知的是,非肽类化合物和肽模拟物能够模拟肽结合受体的能力和酶结合位点,并由此可被用来阻断或激发生物反应。当一种感兴趣的另外的化合物提供了与在阳离子肽存在时相类似的多聚核苷酸表达谱型时,也可该应用化合物来调节脓毒症或先天免疫应答。如此讲来,本发明的阳离子肽在作为脓毒症和炎症的已知抑制剂和先天免疫的已知强化剂的同时,也可用作鉴定抑制脓毒症和炎症和强化先天免疫的其它化合物的工具。
[0032]正如在后面的实施例中看到的,本发明的肽具有广泛的减少由LPS调控的多聚核苷酸表达的能力。在严重的感染或炎症期间所看到的许多症状例如发烧和白血细胞数目升高都归咎于血液中的高水平内毒素。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的一种组分,它是脓毒症在病理生理学上强有效的引发剂(trigger)。炎症和脓毒症的基本机制是相关联的。在实施例1中,利用多聚核苷酸阵列来确定阳离子肽对上皮细胞的转录应答的影响。特别地,观察了对由LPS诱导的超过14,000个不同的特定多聚核苷酸的影响。表格显示了用肽处理过的细胞与对照细胞相比所见到的变化。得到的数据表明该肽具有降低由LPS诱导的多聚核苷酸表达的能力。
[0033]类似地,实施例2说明了本发明的肽能够中和革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌产物对免疫细胞的刺激。另外,注意到,某些促炎症的多聚核苷酸受阳离子肽的减量调节,这些阳离子肽在表24中写出,例如TLR1(AI339155)、TLR2(T57791)、TLR5(N41021)、TNF受体相关因子2(T55353)、TNF受体相关因子3(AA504259)、TNF受体超家族成员12(W71984)、TNF受体超家族成员17(AA987627)、小分子诱导性细胞因子亚家族B成员6(AI889554)、IL-12Rβ2(AA977194)、IL-18受体1(AA482489),而抗炎症的多聚核苷酸受阳离子多肽的增量调节,这些阳离子多肽在表25中写出,例如IL-1R拮抗剂同源物1(AI167887)、IL-10Rβ(AA486393)、TNF受体成员1B(AA150416)、TNF受体成员5(H98636)、TNF受体成员11b(AA194983)、HLA II的IK细胞因子减量调节物(R39227)、可由TGF-B诱导的早期生长应答2(AI473938)或CD2(AA927710)。这些结果的适用性和应用通过对鼠的体内应用证实。实施例3证明了这些肽对与之接触的宿主细胞基本上不会产生毒性。
[0034]在实施例4中可以看到,本发明的阳离子肽可改变巨噬细胞和上皮细胞中的多聚核苷酸表达。此实施例的结果说明,促炎症的多聚核苷酸受阳离子肽的减量调节(down-regulated)(表24),而抗炎症的多聚核苷酸受阳离子肽的增量调节(up-regulated)(表25)。
[0035]在另一个方面,本发明提供了鉴定可强化先天免疫的试剂的方法。在此方法中,将宿主细胞中编码涉及先天免疫的多肽的多聚核苷酸与感兴趣的试剂接触。在存在该试剂和缺少该试剂的情况下,测定该多聚核苷酸的表达。比较表达情况,表达的特异性调节说明先天免疫被强化。在另一方面,该试剂并不激发脓毒症反应,如同缺乏促炎症细胞因子TNF-α的增量调节(upregulation)时所揭示的。仍然在另一个方面,该试剂降低或阻断炎症或脓毒症应答。还是在另一个方面,该试剂降低TNF-α和/或白介素的表达,白介素包括但不限于IL-1β、IL-6、IL-12 p40、IL-12 p70和IL-8。
[0036]在另一方面,本发明提供了利用阳离子肽进行直接的多聚核苷酸调节的方法和包括阳离子肽在内的化合物在激化先天免疫的元素(elements)中的应用。在这一方面,本发明提供了为了鉴定可强化先天免疫的化合物而确定多聚核苷酸表达谱型的方法。在本发明的该方法中,对与阳离子肽接触的和未与阳离子肽接触的细胞作了多聚核苷酸表达谱型的初步检测。在该肽存在的情况下得出的多聚核苷酸表达谱型表明先天免疫受到刺激。然后检测了在受测化合物存在的情况下多聚核苷酸的表达谱型,其中使用受测化合物得到与在阳离子肽存在时相类似的表达谱型,说明这是一个可强化先天免疫的化合物。在另一个方面,本发明提供了在上述方法中确认的化合物。在另一个方面,本发明的化合物刺激趋化因子或趋化因子受体的表达。趋化因子或趋化因子受体可以包括,但不限于CXCR4、CXCR1、CXCR2、CCR2、CCR4、CCR5、 CCR6、MIP-1a、MDC、MIP-3α、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5和RANTES。仍然是在另一方面,该化合物是肽、肽模拟物(peptidomimetic)、化合物(chemical compounds)或核酸分子。
[0037]仍然是在另一方面,该多聚核苷酸表达谱型包括促炎症的多聚核苷酸的表达。这些促炎症多聚核苷酸包括,但不限于环指蛋白10(D87451)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MASK(AB040057)、KIAA0912蛋白(AB020719)、KIAA0239蛋白(D87076)、RAP1、GTP酶激活蛋白1(M64788)、FEM-1样死亡受体结合蛋白(AB007856)、组织蛋白酶S(M90696)、假想蛋白FLJ20308(AK000315)、pim-1癌基因(M54915)、蛋白酶体亚基β型5(D29011)、KIAA0239蛋白(D87076)、气管支气管黏蛋白5亚型B(AJ001403)、cAMP应答元件结合蛋白CREBPa、整连蛋白αM(J03925)、与Rho相关的激酶2(NM_004850)、PTD017蛋白(AL050361)、未知基因(AK001143、AK034348、AL049250、AL161991、AL031983)和它们的任意组合。仍然在另一个方面,该多聚核苷酸表达谱型包括细胞表面受体的表达,细胞表面受体包括但不限于视黄酸受体(X06614)、G蛋白偶联受体(Z94155、X81892、U52219、U22491、AF015257、U66579)、趋化因子(C-C基序)受体7(L31584)、肿瘤坏死因子受体超家族成员17(Z29575)、干扰素γ受体2(U05875)、细胞因子受体样因子1(AF059293)、I类细胞因子受体(AF053004)、凝集因子II(凝血酶)受体样2(U92971)、白血病抑制因子受体(NM_002310)、干扰素γ受体1(AL050337)。
[0038]在后面例如表1-15中将说明,阳离子肽能够中和宿主对感染原的信号分子的应答,还能改变宿主细胞的转录应答,这些主要是通过减量调节促炎应答和/或增量调节抗炎应答来完成。实施例5说明,该阳离子肽能够通过诱导趋化因子的释放来辅助宿主对病原体的应答,趋化因子促使免疫细胞聚集到感染位点。这些结果通过鼠的体内应用被证实。
[0039]从后面的实施例可以看到,阳离子肽明显影响宿主对病原体的应答,原因在于阳离子肽诱导选择性的促炎应答,例如促使免疫细胞聚集到感染位点的应答,但不诱导明显有害的促炎细胞因子,由此辅助宿主免疫应答的调控。脓毒症似乎部分地是由对感染原的过度促炎应答引起的。阳离子肽诱导抗炎应答和抑制某些具有潜在危害的促炎应答,由此帮助宿主对病原体产生一种“平衡”的应答。
[0040]在实施例7中,为了研究阳离子肽与细胞相互作用时产生这些效果的基本机制,对所选择的MAP激酶的活化作了分析。巨噬细胞在应答细菌感染时激活MEK/ERK激酶。MEK是MAP激酶激酶,当它被激活时,便会磷酸化下游的激酶ERK(细胞外调节性激酶),然后ERK形成二聚体并转移到细胞核,它在那里激活转录因子如ElK-1,由此改变多聚核苷酸的表达。已经表明MEK/ERK激酶可削弱巨噬细胞内沙门氏菌(salmonella)的复制。由MEK激酶和NADPH氧化酶介导的信号传导(signal transduction)在对细胞内病原体的先天性防御中发挥着重要的作用。如下面所示,阳离子肽通过影响MAP激酶,对细菌感染产生影响。这些阳离子肽可以直接影响激酶。表21显示了在肽的应答中MAP激酶多聚核苷酸表达的变化,但是不限于这些。这些激酶包括MAP激酶激酶6(H070920)、MAP激酶激酶5(W69649)、MAP激酶7(H39192)、MAP激酶12(AI936909)和被MAP激酶激活的蛋白激酶3(W68281)。
[0041]在另一方法中,本发明的方法可以被组合使用,以鉴定具有多种特征的试剂,即具有抗炎症/抗脓毒症活性和能够部分地通过体内诱导趋化因子而强化先天免疫的肽。
[0042]在另一个方面,本发明提供了由哺乳动物个体的核酸样品推断该个体的感染状态的方法,该方法是依靠于确定核酸样品中的多聚核苷酸表达谱型,其例证是表55中的至少两个多聚核苷酸与未感染的个体相比,多聚核苷酸表达增加。在另一方面,本发明提供了由哺乳动物个体的核酸样品推断该个体的感染状态的方法,该方法是依靠于确定核酸样品中的多聚核苷酸表达谱型,其例证是表56或表57中的至少两个多聚核苷酸与未感染的个体相比较的多聚核苷酸表达。在本发明的一个方面,感染状态的原因在于感染原或从它们那里得到的信号分子,例如,但不限于革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、病毒、真菌或寄生虫。在另一个方面,本发明提供了依据上述方法确定的受感染个体的多聚核苷酸表达谱型。一旦经确定,这样的多聚核苷酸将可用于诊断与这些感染原或信号分子的存在或活性相关的症状。
[0043]实施例10显示了本发明的这个方面。特别地,表61证明了MEK和NADPH氧化酶抑制剂都能限制细菌的复制(鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)对由IFN-γ引发的巨噬细胞的感染激化了MEK激酶)。这是通过改变宿主细胞信号分子而如何影响细菌存活的一个例子。
[0044]仍然在本发明的另一个方面,提出了可抑制由基质细胞源性因子1(SDF-1)诱导的T细胞趋化性的化合物。还提出了可降低SDF-1受体表达的化合物。这些化合物也可以用作CXCR-4的拮抗剂或抑制剂。在一个方面,本发明提供了作为CXCR-4拮抗剂的阳离子肽。在另一个方面,本发明提供了鉴定作为CXCR-4拮抗剂的阳离子肽的方法。该方法包括,在存在受测肽和缺少受测肽时,将T细胞与SDF-1接触,并测量趋化性。在受测肽存在的情况下,趋化性的降低表明该肽是CXCR-4的拮抗剂。这些化合物和方法在HIV病人的治疗应用中是有用的。这些类型的化合物及其实用性已经被证明,例如实施例11(也参见表格62,63)。在该实施例中,已经表明阳离子肽可抑制细胞迁移(cell migration)以及抗病毒活性。
[0045]在一个实施方案中,本发明提供了具有下述通式(通式A)的氨基酸序列的被分离的阳离子肽:
X1X2X3IX4PX4IPX5X2X1(SEQ ID NO:4),其中X1是一个或两个R、L或K,X2是一个C、S或A,X3是一个R或P,X4是一个A或V,X5是一个V或W。
本发明的肽的例子包括,但不限于:
LLCRIVPVIPWCK(SEQ ID NO:5),LRCPIAPVIPVCKK(SEQ ID NO:6),KSRIVPAIPVSLL(SEQ ID NO:7),KKSPIAPAIPWSR(SEQ ID NO:8),RRARIVPAIPVARR(SEQ ID NO:9)和LSRIAPAIPWAKL(SEQ ID NO:10)。
[0046]在另一个实施方案中,本发明提供了具有下述通式(通式B)的氨基酸序列的被分离的线性阳离子肽:
X1LX2X3KX4X2X5X3PX3X1(SEQ ID NO:11),其中X1是一个或两个D、E、S、T或N,X2是一个或两个P、G或D,X3是一个G、A、V、L、I或Y,X4是一个R、K或H,X5是一个S、T、C、M或R。本发明的肽的例子包括,但不限于:DLPAKRGSAPGST(SEQ ID NO:12),SELPGLKHPCVPGS(SEQ IDNO:13),TTLGPVKRDSIPGE(SEQ ID NO:14),SLPIKHDRLPATS(SEQ ID NO:15),ELPLKRGRVPVE(SEQ ID NO:16)和NLPDLKKPRVPATS(SEQ ID NO:17)。
[0047]在另一个实施方案中,本发明提供了具有下述通式(通式C)的氨基酸序列的被分离的线性阳离子肽:
X1X2X3X4WX4WX4X5K(SEQ ID NO:18)(此式包括CP12a和CP12d),其中X1是一至四个选自A、P或R的氨基酸,X2是一个或两个芳香性氨基酸(F、Y和W),X3是一个P或K,X4是零至两个选自A、P、Y或W的氨基酸,X5是一至三个选自R或P的氨基酸。本发明的肽的例子包括,但不限于:
RPRYPWWPWWPYRPRK(SEQ ID NO:19),RRAWWKAWWARRK(SEQ ID NO:20),RAPYWPWAWARPRK(SEQ ID NO:21),RPAWKYWWPWPWPRRK(SEQID NO:22),RAAFKWAWAWWRRK(SEQ ID NO:23)和RRRWKWAWPRRK(SEQ ID NO:24)。
[0048]在另一个实施方案中,本发明提供了具有下述通式(通式D)的氨基酸序列的被分离的十六聚体阳离子肽:
X1X2X3X4X1VX3X4RGX4X3X4X1X3X1(SEQ ID NO:25),其中X1是一个或两个R或K,X2是一个极性或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H),X3是C、S、M、D或A,X4是F、I、V、M或R。本发明的肽的例子包括,但不限于:RRMCIKVCVRGVCRRKCRK(SEQ ID NO:26),KRSCFKVSMRGVSRRRCK(SEQ ID NO:27),KKDAIKKVDIRGMDMRRAR(SEQ ID NO:28),RKMVKVDVRGIMIRKDRR(SEQ ID NO:29),KQCVKVAMRGMALRRCK(SEQ ID NO:30)和RREAIRRVAMRGRDMKRMRR(SEQ ID NO:31)。
[0049]在另一个实施方案中,本发明提供了具有下述通式(通式E)的氨基酸序列的被分离的十六聚体阳离子肽:
X1X2X3X4X1VX5X4RGX4X5X4X1X3X1(SEQ ID NO:32),其中X1是一个或两个R或K,X2是一个极性或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H),X3是一个C、S、M、D或A,X4是一个F、 I、V、M或R,X5是一个A、I、S、M、D或R。本发明的肽的例子包括,但不限于:RTCVKRVAMRGIIRKRCR(SEQID NO:33),KKQMMKRVDVRGISVKRKR(SEQ ID NO:34),KESIKVIIRGMMVRMKK(SEQ ID NO:3 5),RRDCRRVMVRGIDIKAK(SEQ IDNO:36),KRTAIKKVSRRGMSVKARR(SEQ ID NO:37)和RHCIRRVSMRGIIMRRCK(SEQ ID NO:38)。
[0050]在另一个实施方案中,本发明提供了具有下述通式(通式F)的氨基酸序列的被分离的更长的阳离子肽:
KX1KX2FX2KMLMX2ALKKX3(SEQ ID NO:39),其中X1是一个极性氨基酸(C、S、T、M、N和Q);X2是一个A、L、S或K,X3是1-17个选自G、A、V、L、I、P、F、S、T、K和H的氨基酸。本发明的肽的例子包括,但不限于:
KCKLFKKMLMLALKKVLTTGLPALKLTK (SEQ ID NO:40),
KSKSFLKMLMKALKKVLTTGLPALIS(SEQ ID NO:41),
KTKKFAKMLMMALKKVVSTAKPLAILS(SEQ ID NO:42),
KMKSFAKMLMLALKKVLKVLTTALTLKAGLPS(SEQ ID NO:43),
KNKAFAKMLMKALKKVTTAAKPLTG(SEQ ID NO:44) 和
KQKLFAKMLMSALKKKTLVTTPLAGK(SEQ ID NO:45)。
[0051]在另一个实施方案中,本发明提供了具有下述通式(通式G)的氨基酸序列的被分离的更长的阳离子肽:
KWKX2X1X1X2X2X1X2X2X1X1X2X2IFHTALKPISS(SEQ ID NO:46),其中,X1是疏水性氨基酸,X2是亲水性氨基酸。本发明的肽的例子包括,但不限于:
KWKSFLRTFKSPVRTIFHTALKPISS(SEQ ID NO:47),
KWKSYAHTIMSPVRLIFHTALKPISS(SEQ ID NO:48),
KWKRGAHRFMKFLSTIFHTALKPISS(SEQ ID NO:49),
KWKKWAHSPRKVLTRIFHTALKPISS(SEQ ID NO:50),
KWKSLVMMFKKPARRIFHTALKPISS(SEQ ID NO:51),和
KWKHALMKAHMLWHMIFHTALKPISS(SEQ ID NO:52)。
[0052]在另一个实施方案中,本发明提供了具有下述式子的氨基酸序列的被分离的阳离子肽:
KWKSFLRTFKSPVRTVFHTALKPISS(SEQ ID NO:53)或
KWKSYAHTIMSPVRLVFHTALKPISS(SEQ ID NO:54)。
[0053] 在此使用的术语“分离的”是指基本上没有其它蛋白质、脂类和核酸(例如,与体内产生的肽天然联系在一起的细胞组分)的肽。优选地,该肽的纯度依重量来算至少为70%、80%,或者最优选90%。
[0054]本发明还包括被列举的多肽的类似物(analogs)、衍生物(derivatives)、保守变异体(conservative variations)和阳离子肽变体(cationic peptide variants),只要这些类似物、衍生物、保守变异体或变体具有可检测到的强化先天免疫或抗炎症的活性。肽的类似物、衍生物、保守变异体或变体的活性不一必与该肽的活性完全相同。
[0055]阳离子肽“变体”是指具有所参照的阳离子肽的变化形式的肽。例如,术语“变体”包括参照肽的至少一个氨基酸在表达文库中被替换而得到的阳离子肽。术语“参照”肽是指本发明的任何阳离子肽(例如,在上面式子中所定义的),由它们得到变体、衍生物、类似物或保守变异。术语“衍生物”包括杂合肽,它包括两种阳离子肽中的每一种的至少一部分(例如,两种阳离子肽中的每一种的30-80%)。还包括将一个或多个氨基酸从在此列举的肽的序列中删去所得到的肽,只要该衍生物具有强化先天免疫或抗炎症的活性。由此可以开发得到同样具有效用的更小的活性分子。例如,可以移去那些对于强化先天免疫和肽的抗炎活性并不是必要的氨基端氨基酸或羧基端氨基酸。同样,可以将一个或一些(例如,少于5个)氨基酸添加到阳离子肽上而且不会完全抑制该肽的活性,这样便得到另外的衍生物。此外,C端衍生物,例如C端甲基酯,和N端衍生物可以被获得,而且它们被包括在本发明内。本发明的肽包括本发明所公开的肽的任何类似物、同源物(homolog)、突变体(mutant)、异构体(isomer)或衍生物,只要在此所述的生物活性仍然保留着。还包括前面提出的通式所包含的肽的反向序列。此外,可以用“L”构型的氨基酸替代“D”构型的氨基酸,反之亦然。作为选择,可以通过化学方法或者在其序列中增加两个或多个半胱氨酸残基并氧化形成二硫键,将该肽环化。
[0056]本发明还包括作为在此列举的那些肽的保守变异体的肽。在此使用的术语“保守变异体”是指至少一个氨基酸被别的生物活性类似的残基替换所得到的多肽。保守变异体的例子包括用一个疏水性残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸替代另一个疏水性残基,或者用一个极性残基替代另一个极性残基,例如,精氨酸替代赖氨酸,谷氨酸替代天冬氨酸,谷氨酰胺替代天冬酰胺,等等。可以彼此替换的中性亲水性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。“保守变异体”还包括用取代的氨基酸替换未取代的原氨基酸(parent amino acids)所得到的肽。这些取代的氨基酸可以包括甲基化的或酰胺化的氨基酸。其它替代对于本领域技术人员是熟知的。在一个方面,由取代的多肽制出的抗体也能够特异地结合未取代的多肽。
[0057]本发明的肽可以用普遍使用的方法合成,例如,该方法包括α氨基的t-BOC或FMOC保护。两种方法都涉及逐步合成步骤,其中从该肽的C末端开始,每一步增加一个氨基酸(参见,Coligan等,Current Protocols in Immunology,WileyInterscience,1991,第9单元)。本发明的肽也可以用已熟知的固相肽合成方法合成,例如由Merrifield(J.Am.Chem.Soc.85:2149,1962)以及Stewart和Young(SolidPhase Peptides Synthesis,Freeman,San Francisco,1969,第27-62页)描述的方法,其中使用了苯乙烯-二乙烯基苯共聚聚合物,每克聚合物中有0.1-1.0毫摩尔胺。化学合成完成后,用HF-10%苯甲醚在0℃处理1/4-1小时,将该肽脱保护并从聚合物上切割下来。待试剂蒸发后,用1%乙酸溶液将肽从聚合物中提取出来,然后冻干得到粗产物。使用例如凝胶过滤的技术将该肽纯化,例如在Sephadex G-15上使用5%乙酸作为溶剂。将柱洗脱物的合适级分冻干,便可产生匀质的肽,然后用标准的技术例如氨基酸分析、薄层色谱、高效液相色谱、紫外吸收光谱、摩尔旋光或者溶解性测量对它进行表征。如果需要的话,该肽可以使用固相Edman降解定量。
[0058]本发明也包括编码本发明的肽的被分离的核酸(例如,DNA、cDNA或RNA)。编码在此描述的肽的类似物、突变体、保守变异体和变体的核酸也包括在内。在此使用的术语“分离的”是指基本上除去了与体内产生的核酸天然联系着的蛋白、脂和其它核酸所得到的核酸。优选地,该核酸的纯度在重量上为至少70%、80%或优选90%。可以使用体外合成核酸的传统方法替代体内方法。正如在此使用的,“核酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物,它们可以是一个独立的片断,也可以是一个大的遗传构建物(construct)的一部分(例如,将一个启动子连接到编码本发明的肽的核酸上)。大量的遗传构建物(例如,质粒和其它表达载体)在本领域是已知的,它们可被用于在无细胞系统或原核细胞或真核(例如酵母、昆虫或哺乳动物)细胞中制造本发明的肽。考虑到遗传密码的简并性,本领域普通技术人员能够容易地合成编码本发明的多肽的核酸。可以方便地使用传统的分子生物学方法利用本发明的核酸获得本发明的肽。
[0059]可以将编码本发明的阳离子肽的DNA插入到“表达载体”中。术语“表达载体”是指一种遗传构建物例如质粒、病毒或其他本领域已知的载体,它们可以经过设计而含有编码本发明的多肽的核酸。这些表达载体优选为含有启动子序列的质粒,启动子有助于插入的基因序列在宿主细胞中的转录。表达载体通常含有复制起点、启动子和能实现被转化的细胞的表型选择的多聚核苷酸(例如,抗生素抗性多聚核苷酸)。在本发明中可以使用各种启动子,包括诱导型启动子和组成型启动子。通常,该表达载体含有复制子位点和由与宿主细胞相容的物种所获得的控制序列。
[0060]可以使用本领域技术人员已熟知的传统技术,将本发明的核酸转化或转染到受体(recipient)中。例如,当宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)时,可以使用本领域已知的CaCl2、MgCl2或RbCl方法制备能够吸收DNA的感受态细胞。作为选择,可以使用物理方法,例如电穿孔或微注射。电击转化是通过高电压脉冲将核酸转移到细胞中。此外,可以使用本领域已熟知的方法,通过原生质体融合将核酸引入宿主细胞中。用于转化真核细胞的合适方法例如电穿孔和脂转染也是已知的。
[0061]本发明所包含的“宿主细胞”或“受体细胞”是指可以在其中用本发明的核酸来表达本发明的多肽的任何细胞。该术语也包括受体细胞或宿主细胞的任何子代。本发明优选的受体细胞或宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)、金黄葡萄球菌(S.aureus)和绿脓杆菌(P.aeruginosa),尽管其它的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、真菌和哺乳动物细胞和本领域已知的其它生物也可以被利用,只要该表达载体含有复制起点以允许其在该宿主中表达。
[0062]根据本发明的方法所使用的阳离子肽多聚核苷酸序列可以从生物体中分离得到,或者在实验室合成。编码感兴趣的阳离子肽的特定DNA序列可以通过如下方法获得:1)从基因组DNA从分离出双链DNA序列;2)化学合成DNA序列以提供感兴趣的阳离子肽所需的密码子:和3)利用从供体细胞分离出的mRNA的反转录在体外合成双链DNA序列。在后一种情况中,可以得到mRNA的双链DNA互补序列,它通常被称之为cDNA。
[0063]当所需要的肽产物的氨基酸残基的整个序列都是已知时,合成其DNA序列通常是被选择的方法。在本发明中,合成DNA序列具有一个优点,即允许整合进最可能被细菌宿主识别的密码子,由此便没有翻译上的困难,可以获得高水平的表达。此外,事实上任何肽都可以被合成,包括那些编码天然阳离子肽的肽、它们的变体或合成的肽。
[0064]当所需要的肽的整个序列是未知的时候,DNA序列的直接合成便不可能,此时可以选择的方法是获得cDNA序列。分离出感兴趣的cDNA序列的标准程序包括构建含有cDNA文库的质粒或噬菌体,cDNA文库是由存在于供体细胞中具有高水平遗传表达的大量mRNA的反转录获得。当同聚合酶链式反应一起被使用时,即使稀有表达产物也能被克隆。当阳离子肽的氨基酸序列的重要部分是已知时,可以制作标记的单链或双链DNA或RNA探针,其序列被认为是存在于目标cDNA中,于是在已变性成为单链形式的cDNA克隆拷贝上进行DNA/DNA杂交实验时就可以应用这些探针(Jay等,Nuc.Acid.Res.11:2325,1983)。
[0065]可以通过注射或一段时间内的逐渐输注方式不经肠道地施用本发明的肽。该肽可以静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内或透皮施用。传送该肽的优选方法包括通过微球体或类蛋白形式的胶囊进行口服,以气雾剂形式传送至肺,或者利用离子电渗透或电穿孔经皮传送。其它的施用方法对本领域技术人员是已知的。
[0066]本发明的肽的不经肠道施用形式的制备包括无菌的含水或无水溶液、悬浮液和乳液。无水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油,以及可注射用的有机酯例如油酸乙酯。含水载剂包括水、乙醇/水溶液、乳液或悬浮液,包括盐水和含缓冲介质的不经肠道载体,包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖液、葡萄糖和氯化钠、乙酸钠、柠檬酸钠、乳酸化林格氏溶液或非挥发性油。静脉内施用的载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如它们可基于林格氏葡萄糖液),等等。也可以含有防腐剂和其它添加剂,例如抗微生物试剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体和类似物。
[0067]现在通过引用下面的非限制性实施例,更详细地描述本发明。通过引用本发明的一些优选实施方案,本发明被更详细地描述,同时,应该理解,修改和变化亦在被描述和要求保护的内容的精神和范围之内。
实施例1
抗脓毒症/抗炎症活性
[0068]利用多聚核苷酸阵列来确定阳离子肽对上皮细胞转录应答的影响。将A549人上皮细胞系保持在DMEM(Gibco)中,并补充以10%胎牛血清(FBS,Medicorp)。将A549细胞铺在100mm组织培养皿中,每个培养皿含2.5×106个细胞,过夜培养,然后和100ng/ml的E.coli O111:B4 LPS(Sigma)共同温育4小时,其中含有50μg/ml的肽及培养基,或者不含有肽而只有培养基,作为对照。经刺激后,用焦碳酸二乙酯处理的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞一次,再用细胞刷刮下细胞。用RNAquesous(Ambion,Austin,TX)分离总RNA。用含有Superase-In(RNA酶抑制剂;Ambion)的无RNA酶的水重悬RNA沉淀物。用DNA-free试剂盒(Ambion)除掉DNA污染。通过1%琼脂糖凝胶电泳估计RNA的质量。
[0069]所使用的多聚核苷酸阵列是Human Operon阵列(该基因组的识别号(identification number)是PRHU04-S1),它由双份的14,000个的人寡聚体点组成。用10μg总RNA制备探针,探针用Cy3或Cy5标记的dUTP进行标记。该探针经纯化后杂交到印刷玻璃片上,42℃过夜,然后洗涤。洗涤之后,用Perkin Elmer阵列扫描仪获取图象。用图象处理软件(Imapolynucleotide 5.0,Marina Del Rey,CA)确定点的平均强度,中间强度和背景强度。使用“自制的”程序除去背景。该程序计算将每个子小格(subgrid)的底部强度计为10%,并对每个小格(grid)减去此值。使用Genespring软件(Redwood City,CA)进行分析。从一个玻片内的点数值的集合中,获得中间点强度值,并将该值与此实验中所有玻片的数值比较,从而使每个点的强度标准化。肽处理的细胞和对照细胞之间的相对变化可以在表1和表2中看到。表2只显示了那些在受测的14,000个多聚核苷酸中表达发生明显变化的多聚核苷酸。该数据表明,该肽具有广泛地降低由LPS诱导的多聚核苷酸表达的能力。
[0070]在表1中,多聚核苷酸微阵列的研究表明了SEQ ID NO:27的肽有效地降低了由E.coli O111:B4 LPS增量调节的多种多聚核苷酸的表达。肽(50μg/ml)和LPS(0.1μg/ml)与A549细胞一起温育4小时,或者LPS单独与A549细胞温育4小时,然后分离出RNA。利用5μg总RNA制作出Cy 3/Cy 5标记的cDNA探针,并杂交到Human Operon阵列(PRHU04)上。表1的第三列显示未受刺激的细胞的强度。“比值:LPS/对照”一列是指用LPS刺激的细胞中的多聚核苷酸表达的强度除以未受刺激的细胞的强度所得到的结果。“比值:LPS+ID27/对照”一列是指用LPS和肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达的强度除以未受刺激的细胞的强度所得到的结果。
表1:肽SEQ ID 27降低
由E.coli O111:B4 LPS增量调控的A549人上皮细胞多聚核苷酸表达
序列登记号a | 多聚核苷酸基因功能 | 对照:仅有培养基强度 | 比值:LPS/对昭 | 比值:LPS+ID27/对照 |
AL031983 | 未知 | 0.032 | 302.8 | 5.1 |
L04510 | ADP-核糖基化因子 | 0.655 | 213.6 | 1.4 |
D87451 | 环指蛋白10 | 3.896 | 183.7 | 2.1 |
AK000869 | 假想蛋白 | 0.138 | 120.1 | 2.3 |
U78166 | 在神经元中表达的Ric样 | 0.051 | 91.7 | 0.2 |
AJ001403 | 气管支气管黏蛋白5亚型B | 0.203 | 53.4 | 15.9 |
AB040057 | 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MASK | 0.95 | 44.3 | 15.8 |
Z99756 | 未知 | 0.141 | 35.9 | 14.0 |
L42243 | 干扰素受体2 | 0.163 | 27.6 | 5.2 |
MN_016216 | RNA套索脱分支酶 | 6.151 | 22.3 | 10.9 |
AK001589 | 假想蛋白 | 0.646 | 19.2 | 1.3 |
AL137376 | 未知 | 1.881 | 17.3 | 0.6 |
AB007856 | FEM-1样死亡受体结合蛋白 | 2.627 | 15.7 | 0.6 |
AB007854 | 生长阻滞特异蛋白7 | 0.845 | 14.8 | 2.2 |
AK000353 | 细胞溶质卵巢肿瘤抗原1 | 0.453 | 13.5 | 1.0 |
D14539 | 髓样/淋巴样或混合谱系白血病;发生易位的;1(MLLT1) | 2.033 | 11.6 | 3.1 |
X76785 | 爱泼斯坦-巴尔病毒的整合位点 | 0.728 | 11.6 | 1.9 |
M54915 | pim-1癌基因 | 1.404 | 11.4 | 0.6 |
NM_006092 | 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)征募结构域4 | 0.369 | 11.0 | 0.5 |
J03925 | 整连蛋白αM | 0.272 | 9.9 | 4.2 |
NM_001663 | ADP-核糖基化因子6 | 0.439 | 9.7 | 1.7 |
M23379 | RAS p21蛋白激活剂 | 0.567 | 9.3 | 2.8 |
K02581 | 可溶性胸苷激酶1 | 3.099 | 8.6 | 3.5 |
U94831 | 跨膜9超家族成员1 | 3.265 | 7.1 | 1.5 |
X70394 | 锌指蛋白146 | 1.463 | 6.9 | 1.7 |
AL137614 | 假想蛋白 | 0.705 | 6.8 | 1.0 |
U43083 | 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白 | 0.841 | 6.6 | 1.6 |
AL137648 | DKFZp434J1813蛋白 | 1.276 | 6.5 | 0.8 |
AF085692 | ATP-结合盒亚家族C(CFTR-MRP)成员3 | 3.175 | 6.5 | 2.4 |
AK001239 | 假想蛋白FLJ10377 | 2.204 | 6.4 | 1.3 |
NM_001679 | ATP酶Na+/K+转运β3多肽 | 2.402 | 6.3 | 0.9 |
L24804 | 无活性孕酮受体 | 3.403 | 6.1 | 1.1 |
U15932 | 双重特异性磷酸酶5 | 0.854 | 6.1 | 2.1 |
M36067 | ATP依赖性DNA连接酶I | 1.354 | 6.1 | 2.2 |
AL161951 | 未知 | 0.728 | 5.8 | 1.9 |
M59820 | 集落刺激因子3受体 | 0.38 | 5.7 | 2.0 |
AL050290 | 亚精胺/精胺N1-酰基转移酶 | 2.724 | 5.6 | 1.4 |
NM_002291 | 层黏连蛋白β-1 | 1.278 | 5.6 | 1.8 |
X06614 | 视黄酸受体α | 1.924 | 5.5 | 0.8 |
AB007896 | 推定的L型中性氨基酸转运蛋白 | 0.94 | 5.3 | 1.8 |
AL050333 | DKFZP564B116蛋白 | 1.272 | 5.3 | 0.6 |
AK001093 | 假想蛋白 | 1.729 | 5.3 | 2.0 |
NM_016406 | 假想蛋白 | 1.314 | 5.2 | 1.2 |
M86546 | 前B细胞白血病转录因子1 | 1.113 | 5.2 | 2.2 |
X56777 | 透明带糖蛋白3A | 1.414 | 5.0 | 1.4 |
NM_013400 | 复制起始区域蛋白 | 1.241 | 4.9 | 2.0 |
NM_002309 | 白血病抑制因子 | 1.286 | 4.8 | 1.9 |
NM_001940 | 齿状红核苍白球萎缩症 | 2.034 | 4.7 | 1.2 |
U91316 | 细胞溶质酰基辅酶A硫酯水解酶 | 2.043 | 4.7 | 1.4 |
X76104 | 死亡相关蛋白激酶1 | 1.118 | 4.6 | 1.8 |
AF131838 | 未知 | 1.879 | 4.6 | 1.4 |
AL050348 | 未知 | 8.502 | 4.4 | 1.7 |
D42085 | KIAA0095基因产物 | 1.323 | 4.4 | 1.2 |
X92896 | 未知 | 1.675 | 4.3 | 1.5 |
U26648 | 突触融合蛋白5A | 1.59 | 4.3 | 1.4 |
X85750 | 与单核细胞到巨噬细胞的分化有关 | 1.01 | 4.3 | 1.1 |
D14043 | CD164抗原_唾液酸粘蛋白 | 1.683 | 4.2 | 1.0 |
J04513 | 成纤维生长因子2 | 1.281 | 4.0 | 0.9 |
U19796 | 黑素瘤相关抗原 | 1.618 | 4.0 | 0.6 |
AK000087 | 假想蛋白 | 1.459 | 3.9 | 1.0 |
AK001569 | 假想蛋白 | 1.508 | 3.9 | 1.2 |
AF189009 | 泛蛋白2 | 1.448 | 3.8 | 1.3 |
U60205 | 固醇-C4-甲基氧化酶样 | 1.569 | 3.7 | 0.8 |
AK000562 | 假想蛋白 | 1.166 | 3.7 | 0.6 |
AL096739 | 未知 | 3.66 | 3.7 | 0.5 |
AK000366 | 假想蛋白 | 15.192 | 3.5 | 1.0 |
NM_006325 | RAN成员RAS癌基因超家族 | 1.242 | 3.5 | 1.4 |
X51688 | 细胞周期蛋白A2 | 1.772 | 3.3 | 1.0 |
U34252 | 醛脱氢酶 | 1.264 | 3.3 | 1.2 |
NM_013241 | 含有FH1/FH2结构域的蛋白 | 1.264 | 3.3 | 0.6 |
AF112219 | 酯酶/甲酰谷胱甘肽水解酶 | 1.839 | 3.3 | 1.1 |
NM_016237 | 间期促进性复合物亚基5 | 2.71 | 3.2 | 0.9 |
AB014569 | KIAA0669基因产物 | 2.762 | 3.2 | 0.2 |
AF151047 | 假想蛋白 | 3.062 | 3.1 | 1.0 |
X92972 | 蛋白磷酸酶6催化性亚基 | 2.615 | 3.1 | 1.1 |
AF035309 | 蛋白酶体26S亚基ATP酶5 | 5.628 | 3.1 | 1.3 |
U52960 | SRB7同源物 | 1.391 | 3.1 | 0.8 |
J04058 | 电子转移黄素蛋白α多肽 | 3.265 | 3.1 | 1.2 |
M57230 | 白介素6信号转导物 | 0.793 | 3.1 | 1.0 |
U78027 | α半乳糖苷酶 | 3.519 | 3.1 | 1.1 |
AK000264 | 未知 | 2.533 | 3.0 | 0.6 |
X80692 | 有丝分裂原活化蛋白激酶6 | 2.463 | 2.9 | 1.3 |
L25931 | 核纤层蛋白B受体 | 2.186 | 2.7 | 0.7 |
X13334 | CD14抗原 | 0.393 | 2.5 | 1.1 |
M32315 | 肿瘤坏死因子受体超家族成员1B | 0.639 | 2.4 | 0.4 |
NM_004862 | 由LPS诱导的TNF-α因子 | 6.077 | 2.3 | 1.1 |
AL050337 | 干扰素γ受体1 | 2.064 | 2.1 | 1.0 |
a表1到表64中的所有登记号均指GenBank登记号(Accession Numbers)。
[0071]在表2中,多聚核苷酸微阵列的研究表明了浓度为50μg/ml的阳离子肽有效地降低了由100ng/ml的E.coli O111:B4 LPS增量调节的许多多聚核苷酸的表达。肽和LPS与A549细胞一起温育4小时,或者LPS单独与A549细胞温育4小时,然后分离出RNA。利用5μg总RNA制作出Cy 3/Cy 5标记的cDNA探针,并杂交到Human Operon阵列(PRHU04)上。表2的第三列显示未受刺激的细胞的强度。“比值:LPS/对照”一列是指用LPS刺激的细胞中的多聚核苷酸表达的强度除以未受刺激的细胞的强度所得到的结果。其它列是指用LPS和肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达的强度除以未受刺激的细胞的强度所得到的结果。
[0072]表2:由E.coli O111:B4 LPS增量调控的和由阳离子肽降低的人A549上皮细胞多聚核苷酸表达
登记号 | 基因 | 对照:仅有培养基强度 | 比值:LPS/对昭 | 比值:LPS+ID27/对照 | 比值:LPS+ID16/对昭 | 比值:LPS+ID22/对昭 |
AL031983 | 未知 | 0.03 | 302.8 | 5.06 | 6.91 | 0.3 1 |
L04510 | ADP-核糖基化因子 | 0.66 | 213.6 | 1.4 | 2.44 | 3.79 |
D87451 | 环指蛋白 | 3.90 | 183.7 | 2.1 | 3.68 | 4.28 |
AK000869 | 假想蛋白 | 0.14 | 120.1 | 2.34 | 2.57 | 2.58 |
U78166 | Ric样 | 0.05 | 91.7 | 0.20 | 16.88 | 21.37 |
X03066 | II类MHCDOβ | 0.06 | 36.5 | 4.90 | 12.13 | 0.98 |
AK001904 | 假想蛋白 | 0.03 | 32.8 | 5.93 | 0.37 | 0.37 |
AB037722 | 未知 | 0.03 | 21.4 | 0.30 | 0.30 | 2.36 |
AK001589 | 假想蛋白 | 0.65 | 19.2 | 1.26 | 0.02 | 0.43 |
AL137376 | 未知 | 1.88 | 17.3 | 0.64 | 1.30 | 1.35 |
L19185 | 硫氧还蛋白依赖型过氧化物 | 0.06 | 16.3 | 0.18 | 2.15 | 0.18 |
还原酶1 | ||||||
J05068 | 转钴胺素蛋白I | 0.04 | 15.9 | 1.78 | 4.34 | 0.83 |
AB007856 | FEM-1样死亡受体结合蛋白 | 2.63 | 15.7 | 0.62 | 3.38 | 0.96 |
Ak000353 | 细胞溶质卵巢肿瘤抗原1 | 0.45 | 13.5 | 1.02 | 1.73 | 2.33 |
X16940 | 平滑肌肠肌动蛋白γ2 | 0.21 | 11.8 | 3.24 | 0.05 | 2.26 |
M54915 | pim-1癌基因 | 1.40 | 11.4 | 0.63 | 1.25 | 1.83 |
AL122111 | 假想蛋白 | 0.37 | 10.9 | 0.21 | 1.35 | 0.03 |
M95678 | 磷脂酶Cβ2 | 0.22 | 7.2 | 2.38 | 0.05 | 1.33 |
AK001239 | 假想蛋白 | 2.20 | 6.4 | 1.27 | 1.89 | 2.25 |
AC004849 | 未知 | 0.14 | 6.3 | 0.07 | 2.70 | 0.07 |
X06614 | 视黄酸受体_α | 1.92 | 5.5 | 0.77 | 1.43 | 1.03 |
AB007896 | 推定的L型中性氨基酸转运蛋白 | 0.94 | 5.3 | 1.82 | 2.15 | 2.41 |
AB010894 | BAI1相关性蛋白 | 0.69 | 5.0 | 1.38 | 1.03 | 1.80 |
U52522 | RAC1伴侣 | 1.98 | 2.9 | 1.35 | 0.48 | 1.38 |
AK001440 | 假想蛋白 | 1.02 | 2.7 | 0.43 | 1.20 | 0.01 |
NM_001148 | 神经元的锚蛋白2 | 0.26 | 2.5 | 0.82 | 0.04 | 0.66 |
X07173 | α间抑制剂H2 | 0.33 | 2.2 | 0.44 | 0.03 | 0.51 |
AF095687 | 脑和鼻咽癌敏感性蛋白 | 0.39 | 2.1 | 0.48 | 0.03 | 0.98 |
NM_016382 | NK细胞激活诱导配体NAIL | 0.27 | 2.1 | 0.81 | 0.59 | 0.04 |
AB023198 | KIAA0981蛋白 | 0.39 | 2.0 | 0.43 | 0.81 | 0.92 |
实施例2
中和对免疫细胞的刺激
[0073]测试了化合物压制革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌产物对免疫细胞的刺激的能力。细菌产物刺激免疫系统的细胞,由此产生炎症细胞因子,当它们不受压制时,就可能导致脓毒症。开始的实验是利用由美国典型培养物收藏中心(Manassas,VA)获得的鼠巨噬细胞系RAW 264.7,人上皮细胞系A549和来自BALB/c鼠骨髓的原代巨噬细胞(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)。用150mm培养板培养来自鼠骨髓的细胞,培养基为达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM;Life Technologies,Burlington,ON),并补充以20%FBS(Sigma ChemicalCo,St.Louis,MO)和20%L细胞条件培养液作为M-CSF来源。当巨噬细胞铺满60-80%时,移去培养基中的L细胞条件培养液,培养14-16小时,直到它们进入静态,然后用10ng/ml LPS或100ng/ml LPS+20μg/ml肽处理24小时。用ELISA(R&D Systems,Minneapolis,MN)测定释放到培养物上清中的细胞因子。细胞系RAW 264.7和A549被保持在补充有10%胎小牛血清的DMEM中。将RAW 264.7细胞以每孔106个细胞的密度接种到含有DMEM的24孔板中,将A549细胞以每孔105个细胞的密度接种到含有DMEM的24孔板中,两者均于37℃在5%CO2中过夜培养。从过夜生长的细胞中吸去DMEM,换以新鲜培养基。在一些实验中,通过静脉穿刺将志愿者的血液收集(按照UBC临床研究道德委员会承认的程序,证明号C00-0537)到含有14.3 USP单位肝素/ml血液的试管(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中。将血液与带有肽或者没有肽的LPS,于37℃在聚丙烯管中混合6小时。样品于2000×g离心5分钟,收集血浆,然后贮存于-20℃,直到用ELISA(R&D Systems)对其作IL-8分析时才取出。在这些细胞实验中,将细胞与LPS或其它细菌产物于37℃在5%CO2中温育6-24小时。鼠伤寒沙门氏菌LPS和E.coli 0111:B4 LPS购自Sigma。将来自金黄葡萄球菌(Sigma)的脂磷壁酸(LTA)重悬于无内毒素的水(Sigma)中。对LTA制备物进行鲎变形细胞溶解物试验(Sigma)以确定其没有受到明显的内毒素污染。内毒素污染小于1ng/ml,该浓度不会导致RAW 264.7细胞产生明显的细胞因子产物。无帽的脂阿拉伯甘露聚糖(AraLAM)由Colorado State University的John T.Belisle博士馈赠。将分支杆菌(Mycobacterium)的AraLAM过滤灭菌,用鲎变形细胞试验测定内毒素污染,发现为3.75ng/1.0mg LAM。在加入LPS的同时(或者在一些特别指出的地方,是在随后加入),加入一定浓度范围的阳离子肽。移走上清,用ELISA(R&D Systems)对产生的细胞因子进行检测。所有实验都至少进行三次,得到的是类似的结果。为了证实体内的抗脓毒症活性,将2或3μg E.coli 0111:B4 LPS的磷酸缓冲盐溶液(PBS;pH 7.2)经腹膜注射到半乳糖胺敏化的8-10周雌性CD-1或BALB/c鼠体内,由此诱导脓毒症。在其他实验中,将400μg E.coli 0111:B4 LPS注射进入CD-1鼠,10分钟后,再通过腹膜内注射导入肽(200μg)。注射后对存活情况进行48小时监测。
[0074]传统上认为产生过量的TNF-α是与脓毒症的发生联系在一起的。在此实施例中使用的三种类型LPS、LTA或AraLAM代表了由革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌释放的产物。SEQ ID NO:1的肽能够明显降低由鼠伤寒沙门氏菌、洋葱伯克霍尔德菌(B.cepacia)和E.coli 0111:B4 LPS刺激的TNF-α生成,前者所受的影响要稍小些(表3)。在后两种情况中可以看到,浓度低至1μg/ml的肽(0.25nM)也能导致TNF-α生成的显著降低。一种不同的肽,SEQ ID NO:3并不降低RAW巨噬细胞中LPS诱导的TNF-α生成,说明这是阳离子肽的一个并不统一和不可预测的性质。还测试了每个式子的代表性肽影响由E.coli 0111:B4LPS刺激的TNF-α生成的能力(表4)。尽管这些肽中有许多都降低了TNF-α生成的至少60%,但是它们降低TNF-α生成的能力是有差别的。
[0075]一定浓度的肽SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2还能够削弱细菌产物刺激上皮细胞系生成IL-8的能力。已经知道LPS能够有效地刺激上皮细胞生成IL-8。肽在低浓度(1-20μg/ml)时能压制上皮细胞对LPS的IL-8生成应答(表5-7)。肽SEQ ID 2也抑制由LPS诱导的人全血中的IL-8生成(表4)。相反,高浓度的肽SEQ ID NO:1(50-100μg/ml)实际上会导致IL-8的水平升高(表5)。这表明肽在不同的浓度具有不同的效果。
[0076]肽对炎症刺激的影响也在原代鼠细胞中得到了证实,肽SEQ ID NO:1明显降低了BALB/c鼠的源自骨髓的巨噬细胞中的TNF-α生成(>90%),该细胞已经用100ng/ml E.coli 0111:B4 LPS刺激过(表8)。这些实验都是在存在血清的情况下进行的,其中含有LPS结合蛋白(LBP),这是一种能够介导LPS快速结合到CD14上的蛋白。在用100ng/ml E.coli LPS进行刺激后一小时再将SEQ ID NO:1延迟加入到巨噬细胞上清中,仍然导致TNF-α生成的明显降低(70%,表9)。
[0077]SEQ ID NO:1能够阻止LPS在体外诱导生成TNF-α,与此相一致,某些肽也能使鼠避免由高浓度LPS诱发的致死性休克。在一些实验中,通过预先注射半乳糖胺使CD-1鼠对LPS产生过敏性。由半乳糖胺敏化的小鼠在注射以3μg的E.coli 0111:B4 LPS之后4-6小时内被处死。在注射LPS后15分钟,再注射200μg的SEQ ID NO:1,有50%的小鼠存活(表10)。在其它实验中,将更高浓度的LPS注射到没有预先注射D型半乳糖胺的BALB/c鼠中,肽提供的保护是100%,与之相比,在对照组中无一存活(表13)。发现被选择的其它肽在这些模型中也是具有保护性的(表11,12)。
[0078]阳离子肽还能够减缓革兰氏阳性细菌的产物对巨噬细胞的刺激,这些细菌产物例如分支杆菌的无帽脂阿拉伯甘露聚糖(AraLAM)和金黄葡萄球菌(S.aureus)的LTA。例如,SEQ ID NO:1抑制革兰氏阳性细菌产物LTA(表14)和AraLAM(表15)对RAW 264.7细胞中的TNF-α的诱导,后者的程度稍轻些。还发现另一个肽SEQ ID NO:2降低了LTA对RAW 264.7细胞中的TNF-α的诱导。浓度为1μg/ml的SEQ ID NO:1能够明显降低(>75%)1μg/ml的金黄葡萄球菌LTA对TNF-α生成的诱导。在SEQ ID NO:1浓度为20μg/ml时,AraLAM诱导TNF-α的抑制率>60%。可以引入多黏菌素B(PMB)作为对照,以证明在SEQ ID NO:1对AraLAM诱导TNF-α的抑制中,内毒素污染不是一个显著因素。这些结果证明阳离子肽能够减弱免疫系统对细菌产物的促炎细胞因子应答。
[0079]表3:在RAW 264.7细胞中SEQ ID NO:1减少由LPS诱导的TNF-α生成。在存在指定浓度的SEQ ID 1的情况下,用100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、100ng/ml洋葱伯克霍尔德菌LPS和100ng/ml E.coli 0111:B4 LPS,刺激RAW 264.7鼠巨噬细胞6小时。用ELISA测定释放到培养物上清中的TNF-α的浓度。100%是表示单独用LPS温育RAW 264.7细胞6小时所获得的TNF-α的量(鼠伤寒沙门氏菌LPS=34.5±3.2ng/ml,洋葱伯克霍尔德菌LPS=11.6±2.9ng/ml,E.coli 0111:B4LPS=30.8±2.4ng/ml)。不加以刺激地培养了6小时的RAW 264.7细胞的TNF-α生成的背景水平为0.037-0.192ng/ml。实验数据来自于两份相同的样品,并且表示成三个实验的平均值+标准偏差的形式。
SEQ ID 1的量(μg/ml) | 对TNF-α的抑制(%)* | ||
洋葱伯克霍尔德菌LPS | 大肠杆菌LPS | 鼠伤寒沙门氏菌LPS | |
0.1 | 8.5±2.9 | 0.0±0.6 | 0.0±0 |
1 | 23.0±11.4 | 36.6±7.5 | 9.8±6.6 |
5 | 55.4±8 | 65.0±3.6 | 31.1±7.0 |
10 | 63.1±8 | 75.0±3.4 | 37.4±7.5 |
20 | 71.7±5.8 | 81.0±3.5 | 58.5±10.5 |
50 | 86.7±4.3 | 92.6±2.5 | 73.1±9.1 |
[0080]表4:在RAW 264.7细胞中阳离子肽减少由E.coli LPS诱导的TNF-α生成。在存在指定浓度的阳离子肽的情况下,用100ng/ml E.coli 0111:B4 LPS刺激RAW264.7鼠巨噬细胞6小时。用ELISA测定释放到培养物上清中的TNF-α的浓度。不加以刺激地培养了6小时的RAW 264.7细胞的TNF-α生成的背景水平为0.037-0.192ng/ml。实验数据来自于两份相同的样品,并且表示成三个实验的平均值+标准偏差的形式。
肽(20μg/ml) | 对TNF-α的抑制(%) |
SEQ ID 5 | 65.6±1.6 |
SEQ ID 6 | 59.8±1.2 |
SEQ ID 7 | 50.6±0.6 |
SEQ ID 8 | 39.3±1.9 |
SEQ ID 9 | 58.7±0.8 |
SEQ ID 10 | 55.5±0.52 |
SEQ ID 12 | 52.1±0.38 |
SEQ ID 13 | 62.4±0.85 |
SEQ ID 14 | 50.8±1.67 |
SEQ ID 15 | 69.4±0.84 |
SEQ ID 16 | 37.5±0.66 |
SEQ ID 17 | 28.3±3.71 |
SEQ ID 19 | 69.9±0.09 |
SEQ ID 20 | 66.1±0.78 |
SEQ ID 21 | 67.8±0.6 |
SEQ ID 22 | 73.3±0.36 |
SEQ ID 23 | 83.6±0.32 |
SEQ ID 24 | 60.5±0.17 |
SEQ ID 26 | 54.9±1.6 |
SEQ ID 27 | 51.1±2.8 |
SEQ ID 28 | 56±1.1 |
SEQ ID 29 | 58.9±0.005 |
SEQ ID 31 | 60.3±0.6 |
SEQ ID 33 | 62.1±0.08 |
SEQ ID 34 | 53.3±0.9 |
SEQ ID 35 | 60.7±0.76 |
SEQ ID 36 | 63±0.24 |
SEQ ID 37 | 58.9±0.67 |
SEQ ID 38 | 54±1 |
SEQ ID 40 | 75±0.45 |
SEQ ID 41 | 86±0.37 |
SEQ ID 42 | 80.5±0.76 |
SEQ ID 43 | 88.2±0.65 |
SEQ ID 44 | 44.9±1.5 |
SEQ ID 45 | 44.7±0.39 |
SEQ ID 47 | 36.9±2.2 |
SEQ ID 48 | 64±0.67 |
SEQ ID 49 | 86.9±0.69 |
SEQ ID 53 | 46.5±1.3 |
SEQ ID 54 | 64±0.73 |
[0081]表5:在A549细胞中SEQ ID 1减少由LPS诱导的IL-8生成。在存在LPS(100ng/ml E.coli 0111:B4)的情况下,用浓度逐渐增高的SEQ ID 1刺激A549细胞24小时。用ELISA测定培养物中的IL-8浓度。单独的细胞的IL-8背景水平为0.172±0.029ng/ml。数据表示成三个实验的平均值+标准偏差的形式。
SEQ ID 1(μg/ml) | 对IL-8的抑制(%) |
0.1 | 1±0.3 |
1 | 32±10 |
10 | 60±9 |
20 | 47±12 |
50 | 40±13 |
100 | 0 |
[0082]表6:在A549细胞中SEQ ID 2减少由E.coli LPS诱导的IL-8生成。在存在LPS(100ng/ml E.coli O111:B4)的情况下,用浓度逐渐增高的SEQ ID 2刺激人A549上皮细胞24小时。用ELISA测定培养物上清中的IL-8浓度。数据表示成三个实验的平均值+标准偏差的形式。
SEQ ID 2的浓度(μg/ml) | 对IL-8的抑制(%) |
0.1 | 6.8±9.6 |
1 | 12.8±24.5 |
10 | 29.0±26.0 |
50 | 39.8±1.6 |
100 | 45.0±3.5 |
[0083]表7:在人血液中SEQ ID 2减少由E.coli LPS诱导的IL-8生成。用E.coliO111:B4 LPS和浓度逐渐增高的肽刺激人全血4小时。将人全血样品离心,移走血清并用ELISA测定IL-8浓度。数据表示成两个供血者的平均值。
SEQ ID 2(μg/ml) | IL-8(pg/ml) |
0 | 3205 |
10 | 1912 |
50 | 1458 |
[0084]表8:在鼠骨髓巨噬细胞中SEQ ID 1减少由E.coli LPS诱导的TNF-α生成。在存在20μg/ml的肽或者没有肽的情况下,将源自BALB/c鼠骨髓的巨噬细胞与100ng/ml E.coli O111:B4 LPS共同培养6小时或24小时。收集上清并用ELISA测定TNF-α的水平。数据表示TNF-α的量,它来自两份相同的实验,源自骨髓的巨噬细胞与LPS单独温育6小时(1.1±0.09ng/ml)或24小时(1.7±0.2ng/ml)。TNF-α的背景水平为:6小时是0.038±0.008ng/ml,24小时是0.06±0.012ng/ml。
SEQ ID 1(μg/ml) | TNF-α的生成量(ng/ml) | |
6小时 | 24小时 | |
只有LPS | 1.1 | 1.7 |
1 | 0.02 | 0.048 |
10 | 0.036 | 0.08 |
100 | 0.033 | 0.044 |
没有LPS对照 | 0.038 | 0.06 |
[0085]表9:推迟加入到A549细胞中的SEQ ID 1抑制由E.coli LPS诱导的TNF-α生成。在逐渐后延的时间点,将肽(20μg/ml)加入到已含有A549人上皮细胞和100ng/ml E.coli O111:B4 LPS的培养孔中。6小时之后收集上清并用ELISA测定TNF-α水平。数据表示成三个实验的平均值+标准偏差的形式。
在加入LPS之后加入SEQ ID 1的时间(分钟) | 对TNF-α的抑制(%) |
0 | 98.3±0.3 |
15 | 89.3±3.8 |
30 | 83±4.6 |
60 | 68±8 |
90 | 53±8 |
[0086]表10:通过SEQ ID 1对半乳糖胺敏化的CD-1鼠中的致命性内毒素血症进行防御。通过三次腹膜内注射半乳糖胺(20mg,溶于0.1ml无菌PBS中),使CD-1鼠(9周大)对内毒素产生过敏性。然后通过腹膜内注射E.coli O111:B4 LPS(3μg,在0.1mlPBS中)诱导内毒素休克。注射LPS后15分钟,再在一个不同的位点注射肽SEQ ID 1(200μg/只鼠=8mg/kg)。对鼠进行48小时监测并记录下结果。
D-半乳糖胺 | E.coli O111:B4LPS | 肽或缓冲液 | 鼠的总数 | 内毒素休克后 |
处理 | 的存活量 | |||
0 | 3μg | PBS | 5 | 5(100%) |
20mg | 3μg | PBS | 12 | 0(0%) |
20mg | 3μg | SEQ ID 1 | 12 | 5(50%) |
[0087]表11:通过阳离子肽对半乳糖胺敏化的CD-1鼠中的致命性内毒素血症进行防御。通过腹膜内注射半乳糖胺(20mg,溶于0.1ml无菌PBS中),使CD-1鼠(9周大)对内毒素产生过敏性。然后通过腹膜内注射E.coli O111:B4 LPS(2μg,在0.1ml PBS中)诱导内毒素休克。注射LPS后15分钟,再在一个不同的位点注射肽(200μg/只鼠=8mg/kg)。对鼠进行48小时监测并记录下结果。
肽处理 | 加入的E.coli O111:B4 LPS | 鼠的数目 | 存活(%) |
对照(没有肽) | 2μg | 5 | 0 |
SEQ ID 6 | 2μg | 5 | 40 |
SEQ ID 13 | 2μg | 5 | 20 |
SEQ ID 17 | 2μg | 5 | 40 |
SEQ ID 24 | 2μg | 5 | 0 |
SEQ ID 27 | 2μg | 5 | 20 |
[0088]表12:通过阳离子肽对半乳糖胺敏化的BALB/c鼠中的致命性内毒素血症进行防御。通过腹膜内注射半乳糖胺(20mg,溶于0.1ml无菌PBS中),使BALB/c鼠(8周大)对内毒素产生过敏性。然后通过腹膜内注射E.coli O111:B4 LPS(2μg,在0.1ml PBS中)诱导内毒素休克。注射LPS后15分钟,再在一个不同的位点注射肽(200μg/只鼠=8mg/kg)。对鼠进行48小时监测并记录下结果。
肽处理 | 加入的E.coliO111:B4 LPS | 鼠的数目 | 存活(%) |
没有肽 | 2μg | 10 | 10 |
SEQ ID 1 | 2μg | 6 | 17 |
SEQ ID 3 | 2μg | 6 | 0 |
SEQ ID 5 | 2μg | 6 | 17 |
SEQ ID 6 | 2μg | 6 | 17 |
SEQ ID 12 | 2μg | 6 | 17 |
SEQ ID 13 | 2μg | 6 | 33 |
SEQ ID 15 | 2μg | 6 | 0 |
SEQ ID 16 | 2μg | 6 | 0 |
SEQ ID 17 | 2μg | 6 | 17 |
SEQ ID 23 | 2μg | 6 | 0 |
SEQ ID 24 | 2μg | 6 | 17 |
SEQ ID 26 | 2μg | 6 | 0 |
SEQ ID 27 | 2μg | 6 | 50 |
SEQ ID 29 | 2μg | 6 | 0 |
SEQ ID 37 | 2μg | 6 | 0 |
SEQ ID 38 | 2μg | 6 | 0 |
SEQ ID 41 | 2μg | 6 | 0 |
SEQ ID 44 | 2μg | 6 | 0 |
SEQ ID 45 | 2μg | 6 | 0 |
[0089]表13:通过SEQ ID 1对BALB/c鼠的致命性内毒素血症进行防御。将400μg E.coli O111:B4 LPS腹膜内注射到BALB/c鼠体内。在一个不同的腹膜位点注射肽(200μg/只鼠=8mg/kg)。对鼠进行48小时监测并记录下结果。
肽处理 | 加入的E.coliO111:B4 LPS | 鼠的数目 | 存活(%) |
没有肽 | 400μg | 5 | 0 |
SEQ ID 1 | 400μg | 5 | 100 |
[0090]表14:肽抑制由金黄葡萄球菌LTA诱导的TNF-α生成。在存在浓度逐渐升高的肽和没有肽的情况下,用1μg/ml金黄葡萄球菌LPS刺激RAW 264.7鼠巨噬细胞。收集上清并用ELISA测定TNF-α的水平。不加以刺激地培养了6小时的RAW 264.7细胞的TNF-α生成的背景水平为0.037-0.192ng/ml。数据表示成三个或更多个实验的平均值+标准偏差的形式。
加入的SEQ ID 1(μg/ml) | 对TNF-α的抑制(%) |
0.1 | 44.5±12.5 |
1 | 76.7±6.4 |
5 | 91±1 |
10 | 94.5±1.5 |
20 | 96±1 |
[0091]表15:肽抑制由分支杆菌的无帽脂阿拉伯甘露聚糖诱导的TNF-α生成。在存在20μg/ml肽或多黏菌素B(Polymyxin B)或者没有肽的情况下,用1μg/mlAraLAM刺激RAW 264.7鼠巨噬细胞。收集上清并用ELISA测定TNF-α的水平。不加以刺激地培养了6小时的RAW 264.7细胞的TNF-α生成的背景水平为0.037-0.192ng/ml。数据表示成三个或更多个实验的平均值+标准偏差的形式。
肽(20μg/ml) | 对TNF-α的抑制(%) |
没有肽 | 0 |
SEQ ID 1 | 64±5.9 |
多黏菌素B | 15±2 |
实施例3
阳离子肽的毒性评价
[0092]使用两种方法测量肽的潜在毒性。第一种,使用细胞毒性检测试剂盒(Cytotoxicity Detection Kit,Roche)(乳酸脱氢酶-LDH)分析。这是一种对细胞死亡和细胞裂解进行定量的比色分析,它的基础是从损伤细胞的细胞溶质释放到上清的LDH的活性测量。LDH是存在于所有细胞中的稳定的细胞质酶,当质膜受损时,它便释放到细胞培养物的上清中。死亡细胞或质膜受损细胞的数量增加导致培养物上清中的LDH酶活增加,可以采用ELISA平板记录仪测量OD490nm(在此分析中形成的颜色的量与裂解细胞的数目成正比)。在此分析中,将人支气管上皮细胞(16HBEo14,HBE)与100μg的肽共同温育24小时,移走上清并测定LDH。用来测量阳离子肽的毒性的另一种分析是WST-1分析(Roche)。该分析是对细胞繁殖和细胞成活进行定量的比色分析,它的基础是活细胞中的线粒体脱氢酶能裂解四唑盐WST-1(作为对[3H]-胸苷吸收分析的替代,它没有放射性)。在此分析中,将HBE细胞与100μg的肽共同温育24小时,然后每孔加入10μl细胞繁殖试剂(Cell Proliferation Reagent)WST-1。将细胞与试剂一起温育,然后用ELISA平板记录仪测量OD490nm。
[0093]下面在表16和17中显示的结果表明大多数肽对受测细胞都是没有毒性的。然而,两种分析的测量结果表明式F的肽中有四个(SEQ ID NOS:40,41,42和43)确实导致膜损害。
[0094]表16:通过LDH释放分析测量阳离子肽的毒性。将人HBE支气管上皮细胞与100μg/ml肽或多黏菌素B共同温育24小时。测量细胞培养物上清中的LDH活性。作为对照,加入TritonX-100以释放出100%的LDH。数据表示成平均值±标准偏差。只有肽SEQ ID 40、41、42和43显示出一些明显的毒性。
处理 | LDH释放(OD490nm) |
无细胞的对照 | 0.6±0.1 |
Triton X-100的对照 | 4.6±0.1 |
没有肽的对照 | 1.0±0.05 |
SEQ ID 1 | 1.18±0.05 |
SEQ ID 3 | 1.05±0.04 |
SEQ ID 6 | 0.97±0.02 |
SEQ ID 7 | 1.01±0.04 |
SEQ ID 9 | 1.6±0.03 |
SEQ ID 10 | 1.04±0.04 |
SEQ ID 13 | 0.93±0.06 |
SEQ ID 14 | 0.99±0.05 |
SEQ ID 16 | 0.91±0.04 |
SEQ ID 17 | 0.94±0.04 |
SEQ ID 19 | 1.08±0.02 |
SEQ ID 20 | 1.05±0.03 |
SEQ ID 21 | 1.06±0.04 |
SEQ ID 22 | 1.29±0.12 |
SEQ ID 23 | 1.26±0.46 |
SEQ ID 24 | 1.05±0.01 |
SEQ ID 26 | 0.93±0.04 |
SEQ ID 27 | 0.91±0.04 |
SEQ ID 28 | 0.96±0.06 |
SEQ ID 29 | 0.99±0.02 |
SEQ ID 31 | 0.98±0.03 |
SEQ ID 33 | 1.03±0.05 |
SEQ ID 34 | 1.02±0.03 |
SEQ ID 35 | 0.88±0.03 |
SEQ ID 36 | 0.85±0.04 |
SEQ ID 37 | 0.96±0.04 |
SEQ ID 38 | 0.95±0.02 |
SEQ ID 40 | 2.8±0.5 |
SEQ ID 41 | 3.3±0.2 |
SEQ ID 42 | 3.4±0.2 |
SEQ ID 43 | 4.3±0.2 |
SEQ ID 44 | 0.97±0.03 |
SEQ ID 45 | 0.98±0.04 |
SEQ ID 47 | 1.05±0.05 |
SEQ ID 48 | 0.95±0.05 |
SEQ ID 53 | 1.03±0.06 |
多黏菌素B | 1.21±0.03 |
[0095]表17:通过WST-1分析测量阳离子肽的毒性。将HBE细胞与100μg/ml肽或多黏菌素B共同温育24小时,然后测量细胞存活。数据表示成平均值±标准偏差。作为对照,加入Triton X-100以释放出100%的LDH。只有肽SEQ ID 40、41、42和43显示出一些明显的毒性。
处理 | OD490nm |
无细胞的对照 | 0.24±0.01 |
Triton X-100的对照 | 0.26±0.01 |
没有肽的对照 | 1.63±0.16 |
SEQ ID 1 | 1.62±0.34 |
SEQ ID 3 | 1.35±0.12 |
SEQ ID 10 | 1.22±0.05 |
SEQ ID 6 | 1.81±0.05 |
SEQ ID 7 | 1.78±0.10 |
SEQ ID 9 | 1.69±0.29 |
SEQ ID 13 | 1.23±0.11 |
SEQ ID 14 | 1.25±0.02 |
SEQ ID 16 | 1.39±0.26 |
SEQ ID 17 | 1.60±0.46 |
SEQ ID 19 | 1.42±0.15 |
SEQ ID 20 | 1.61±0.21 |
SEQ ID 21 | 1.28±0.07 |
SEQ ID 22 | 1.33±0.07 |
SEQ ID 23 | 1.14±0.24 |
SEQ ID 24 | 1.27±0.16 |
SEQ ID 26 | 1.42±0.11 |
SEQ ID 27 | 1.63±0.03 |
SEQ ID 28 | 1.69±0.03 |
SEQ ID 29 | 1.75±0.09 |
SEQ ID 31 | 1.84±0.06 |
SEQ ID 33 | 1.75±0.21 |
SEQ ID 34 | 0.96±0.05 |
SEQ ID 35 | 1.00±0.08 |
SEQ ID 36 | 1.58±0.05 |
SEQ ID 37 | 1.67±0.02 |
SEQ ID 38 | 1.83±0.03 |
SEQ ID 40 | 0.46±0.06 |
SEQ ID 41 | 0.40±0.01 |
SEQ ID 42 | 0.39±0.08 |
SEQ ID 43 | 0.46±0.10 |
SEQ ID 44 | 1.49±0.39 |
SEQ ID 45 | 1.54±0.35 |
SEQ ID 47 | 1.14±0.23 |
SEQ ID 48 | 0.93±0.08 |
SEQ ID 53 | 1.51±0.37 |
多黏菌素B | 1.30±0.13 |
实施例4
通过阳离子肽进行多聚核苷酸调控
[0096]利用多聚核苷酸阵列来测量阳离子肽本身对巨噬细胞和上皮细胞的转录应答的影响。将鼠巨噬细胞RAW 264.7、人支气管细胞(HBE)或A549人上皮细胞涂到150mm组织培养皿中,密度为每个培养皿5.6×106个细胞,过夜培养,然后与50μg/ml的肽共同温育4小时,或者只与培养基温育而不含有肽。经刺激后,用焦碳酸二乙酯处理过的PBS洗涤细胞一次,再用细胞刷从培养皿上刮下细胞。用Trizol(Gibco Life Technologies)分离总RNA。用含有RNA酶抑制剂(Ambion,Austin,TX)的无RNA酶的水重悬RNA沉淀物。在37℃用DNaseI(Clontech,PaloAlto,CA)处理该RNA一小时。加入终止混合物(0.1 M EDTA[pH8.0],1mg/ml糖原)之后,样品用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)洗一次,再用氯仿洗一次。然后加入2.5体积100%乙醇和1/10体积乙酸钠,pH5.2将RNA沉淀。该RNA重悬于含有RNA酶抑制剂(Ambion)的无RNA酶的水中,并贮存于-70℃。通过1%琼脂糖凝胶电泳估计RNA的质量。用分离出来的RNA作为模板,使用β肌动蛋白特异性引物(5′-GTCCCTGTATGCCTCTGGTC-3′(SEQ ID NO:55)和5′-GATGTCACGCACGATTTCC-3′(SEQ ID NO:56))进行PCR扩增,以判断是否有基因组DNA污染。琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色证实经过35次循环并没有扩增产物出现。
[0097]Atlas cDNA表达阵列(Clontech,Palo Alto,CA)由双份(duplcate)点在正电荷膜上的588个经由选择的鼠cDNA组成,它们在较早的多聚核苷酸阵列研究中被使用(表18,19)。用5μg总RNA制备得到32P放射性标记的cDNA探针,将其与阵列于71℃温育过夜。进行泛洗,然后于4℃暴露于磷屏成像系统(phosphoimager screen,Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)3天。使用MolecularDynamics PSI磷屏成像(phosphoimager)获取图像。使用AtlasImage 1.0图象分析软件(Clontech)和Excel(Microsoft,Redmond,WA)分析杂交信号。针对背景水平对每个点的强度进行校正,并针对探针标记间的差异对强度进行标准化处理,方法是利用被发现在刺激条件间几乎没有变化的5个多聚核苷酸的平均值:β肌动蛋白、泛蛋白、核糖体蛋白S29、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和Ca2+结合蛋白。当一个给定的cDNA的标准化杂交信号小于20时,则将其值定为20,由此计算比值和相对表达。
[0098]下步使用的多聚核苷酸阵列(表21-26)是Resgen Human cDNA阵列(该基因组的识别号(identification number)是PRHU03-S3),它由双份的7,458个人cDNA点组成。用15-20μg总RNA制备探针,探针用Cy 3标记的dUTP进行标记。该探针经纯化后杂交到印刷玻璃片上,42℃过夜,然后洗涤。洗涤之后,用Virtek玻片记录仪获取图象。用图象处理软件(Imagene 4.1,Marina Del Rey,CA)确定点的平均强度,中间强度和背景强度。使用Genespring软件(Redwood City,CA)进行标准化处理和分析。将平均背景强度从Imagene测定的平均强度中减去,计算出强度值。从一个玻片内的点的数值集合中获得中间点强度,并将该值与此实验中所有玻片的数值比较,从而使每个点的强度标准化。肽处理的细胞和对照细胞之间的相对变化可以在下面的表格中看到。
[0099]所使用的其它多聚核苷酸阵列(表27-35)是Human Operon阵列(该基因组的识别号(identification number)是PRHU04-S1),它由双份的14,000个人寡聚体点组成。用10μg总RNA制备探针,探针用Cy 3或Cy 5标记的dUTP进行标记。在这些实验中,将A549上皮细胞涂到100mm组织培养皿中,密度为每个培养皿2.5×106个细胞。用RNAqueous(Ambion)分离总RNA。用除DNA试剂盒(Ambion)除去DNA污染。由总RNA制备的探针经纯化后杂交到印刷玻璃片上,42℃过夜,然后洗涤。洗涤之后,用Perkin Elmer阵列扫描仪获取图象。用图象处理软件(Imagene 5.0,Marina Del Rey,CA)确定点的平均强度,中间强度和背景强度。使用“自制的”程序除去背景。该程序将每个子小格的底部强度计算为10%,并对每个小格减去此值。使用Genespring软件(Redwood City,CA)进行分析。从一个玻片内的点的数值集合中获得中间点强度,并将该值与此实验中所有玻片的数值比较,从而使每个点的强度标准化。肽处理的细胞和对照细胞之间的相对变化可以在下面的表格中看到。
[00100]实施半定量RT-PCR以证实多聚核苷酸阵列的结果。在热循环仪中将1μgRNA样品和1μl寡聚dT(500μg/ml)以及浓度为1mM的1μl混合dNTP储液,于65℃温育5分钟,反应体积为12μl,使用的水为焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水。加入4μl 5×第一链缓冲液,2μl 0.1M DTT和1μl RNaseOUT重组的核糖核酸酶抑制剂(40 units/μl),于42℃温育2分钟,然后加入1μl(200 units)的SuperscriptII(Invitrogen,Burlington,ON)。对于每个cDNA来源,在没有Superscript II的情况下进行平行实验,以提供阴性对照。利用5’和3’引物(1.0μM)、0.2mM dNTP混合物、1.5mM MgCl2、1U Taq DNA聚合酶(New England Biolabs,Missiauga,ON)和1×PCR缓冲液扩增cDNA。每个PCR均在热循环仪上进行,包括30-40个循环,每个循环包括94℃变性30秒,52℃或55℃退火30秒,72℃延伸40秒。针对每种引物和每份RNA样品,优化PCR的循环次数,使其位于反应的线性范围内。为了评估抽提步骤和估计RNA的量,在每个实验中对管家(housekeeping)多聚核苷酸β肌动蛋白基因进行了扩增。用电泳观察反应产物,并用光密度分析法(densitometry)进行分析,这样就可参考β肌动蛋白多聚核苷酸的扩增计算出起始的RNA相对浓度。
[00101]表18显示,在小块Atlas微阵列上,所选择的已知多聚核苷酸中,SEQ IDNO:1对RAW 264.7细胞的处理增量调节了其中30多个不同的多聚核苷酸的表达。由肽SEQ ID NO:1增量调节的多聚核苷酸主要来自两类:一类包括受体(生长因子、趋化因子、白介素、干扰素、激素、神经递质)、细胞表面抗原和细胞粘连,另一类包括细胞-细胞通讯(生长因子、细胞因子、趋化因子、白介素、干扰素、激素)、细胞骨架、细胞游动和蛋白质更新。受增量调节的特定多聚核苷酸包括编码下列蛋白的多聚核苷酸:趋化因子MCP-3、抗炎细胞因子IL-10、巨噬细胞集落刺激因子和受体例如IL-1R-2(结合到IL-1R1上的多产性IL-1的公认拮抗物)、PDGF受体B、NOTCH4、LIF受体、LFA-1、TGF β受体1、G-CSF受体和IFN γ受体。该肽还增量调控编码几种金属蛋白酶及其抑制物的多聚核苷酸,包括骨形态发生蛋白BMP-1、BMP-2、BMP-8a、TIMP 2和TIMP 3。而且,该肽增量调节一些特异性转录因子,包括JunD,以及YY和LIM-1转录因子,和激酶例如Etk1和Csk,表明它具有广泛的影响。多聚核苷酸阵列的研究还发现,SEQ ID NO:1减量调节了RAW 264.7巨噬细胞中的至少20个多聚核苷酸(表19)。由肽减量调节的多聚核苷酸包括DNA修复蛋白和几种炎症介质例如MIP-1α、制癌蛋白M(oncostatin M)和IL-12。肽对多聚核苷酸表达的许多影响都被RT-PCR证实(表20)。利用中等大小的微阵列(7835个多聚核苷酸)还发现,肽SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:1,以及每个式子的代表性肽改变了人上皮细胞系中的转录应答。SEQ ID NO:1对多聚核苷酸表达的影响在两种人上皮细胞系A549和HBE中加以比较。表21描述的是被2种或更多种肽增量调控的与宿主免疫应答相关的多聚核苷酸,与未受刺激的细胞相比,它们的增量比率为2倍多。表22描述的是被2种或更多种肽减量调控的与宿主免疫应答相关的多聚核苷酸,与未受刺激的细胞相比,它们的减量比率为2倍多。表23和表24分别显示了受增量调节和减量调节的人上皮促炎多聚核苷酸。表25和表26显示了受阳离子肽影响的促炎多聚核苷酸。一个明显的趋向是阳离子肽增量调节抗炎症应答,减量调节促炎症应答。要找到一个与抗炎症应答相关却又受减量调节的多聚核苷酸,是非常困难的(表26)。被阳离子肽增量调控的促炎多聚核苷酸主要是与迁移和粘连相关的多聚核苷酸。应该注意到,在受减量调控的促炎多聚核苷酸中,有几种toll样受体(TLR)多聚核苷酸受到所有阳离子肽的影响,TLR多聚核苷酸对于宿主对感染原的应答的信号传导是非常重要的。被所有的肽增量调控的一种重要的抗炎多聚核苷酸是IL-10受体多聚核苷酸。IL-10是涉及调控促炎细胞因子的重要细胞因子。对于肽SEQ ID NO:6,当使用的是原代人巨噬细胞时,也可以观察到对多聚核苷酸表达的这些影响,如表27和28所示。下面的表31-37显示了每个式子的代表性肽对人上皮细胞表达所选多聚核苷酸(受测的14,000个)的影响。为了测试肽改变人上皮多聚核苷酸表达的能力,每个式子至少选用了6种肽,它们确实具有广泛的刺激效果。对每个式子而言,通常至少有50个多聚核苷酸被该组中的每一个肽增量调节。
[00102]表18:RAW巨噬细胞中被肽SEQ ID NO:1处理增量调节的多聚核苷酸a。发现浓度为50μg/ml的阳离子肽有效地诱导了数种多聚核苷酸的表达。将肽与RAW细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与Atlas阵列杂交。未被刺激的细胞的强度显示在第三列。“比值 肽∶未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
[00103]管家多聚核苷酸的标准化后的强度的变化范围为0.8-1.2倍,因此这些多聚核苷酸可以有效地用于标准化过程。当一个给定的cDNA的标准杂交强度低于20时,将其值定为20,由此计算比值和相对表达。该分析实验用不同的RNA制备物重复三次,平均的倍数变化如下所示。显示了相对表达水平发生两倍或更大变化的多聚核苷酸。
多聚核苷酸/蛋白 | 多聚核苷酸功能 | 未被刺激的强度 | 比值肽∶未刺激 | 序列登记号 |
Etk 1 | 酪氨酸蛋白激酶受体 | 20 | 43 | M68513 |
PDGFRB | 生长因子受体 | 24 | 25 | X04367 |
促肾上腺皮质素释放因子受体 | 20 | 23 | X72305 | |
NOTCH4 | 原癌多聚核苷酸 | 48 | 18 | M80456 |
IL-1R2 | 白介素受体 | 20 | 16 | X59769 |
MCP-3 | 趋化因子 | 56 | 14 | S71251 |
BMP-1 | 骨形态发生蛋白 | 20 | 14 | L24755 |
内皮素b受体 | 受体 | 20 | 14 | U32329 |
c-ret | 癌多聚核苷酸前体 | 20 | 13 | X67812 |
LIFR | 细胞因子受体 | 20 | 12 | D26177 |
BMP-8a | 骨形态发生蛋白 | 20 | 12 | M97017 |
Zfp92 | 锌指蛋白92 | 87 | 11 | U47104 |
MCSF | 巨噬细胞集落刺激因子1 | 85 | 11 | X05010 |
GCSFR | 粒细胞集落刺激因子受体 | 20 | 11 | M58288 |
IL-8RB | 趋化因子受体 | 112 | 10 | D17630 |
IL-9R | 白介素受体 | 112 | 6 | M84746 |
Cas | Crk相关性底物 | 31 | 6 | U48853 |
p58/GTA | 激酶 | 254 | 5 | M58633 |
CASP2 | 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)前体 | 129 | 5 | D28492 |
IL-1β前体 | 白介素前体 | 91 | 5 | M15131 |
SPI2-2 | 丝氨酸蛋白酶抑制物 | 62 | 5 | M64086 |
C5AR | 趋化因子受体 | 300 | 4 | S46665 |
L-myc | 癌多聚核苷酸 | 208 | 4 | X13945 |
IL-10 | 白介素 | 168 | 4 | M37897 |
p19ink4 | cdk4和cdk6抑制物 | 147 | 4 | U19597 |
ATOH2 | 无调性基因同源物2 | 113 | 4 | U29086 |
DNAse1 | DNA酶 | 87 | 4 | U00478 |
CXCR-4 | 趋化因子受体 | 36 | 4 | D87747 |
细胞周期蛋白D3 | 细胞周期蛋白 | 327 | 3 | U43844 |
IL-7Ra | 白介素受体 | 317 | 3 | M29697 |
POLA | DNA聚合酶α | 241 | 3 | D17384 |
Tie-2 | 癌多聚核苷酸 | 193 | 3 | S67051 |
DNL1 | DNA连接酶I | 140 | 3 | U04674 |
BAD | 细胞调亡蛋白 | 122 | 3 | L37296 |
GADD45 | 可诱导DNA损伤的蛋白 | 88 | 3 | L28177 |
Sik | Scr相关性激酶 | 82 | 3 | U16805 |
整连蛋白α4 | 整连蛋白 | 2324 | 2 | X53176 |
TGF β R1 | 生长因子受体 | 1038 | 2 | D25540 |
LAMR1 | 受体 | 1001 | 2 | J02870 |
Crk | Crk衔接蛋白 | 853 | 2 | S72408 |
ZFX | 染色体蛋白 | 679 | 2 | M32309 |
细胞周期蛋白E1 | 细胞周期蛋白 | 671 | 2 | X75888 |
POLD1 | DNA聚合酶亚基 | 649 | 2 | Z21848 |
Vav | 原癌多聚核苷酸 | 613 | 2 | X64361 |
YY(NF-E1) | 转录因子 | 593 | 2 | L13968 |
JunD | 转录因子 | 534 | 2 | J050205 |
Csk | c-src激酶 | 489 | 2 | U05247 |
Cdk7 | 细胞周期蛋白依赖性激酶 | 475 | 2 | U11822 |
MLC1A | 肌球蛋白轻亚基同等型 | 453 | 2 | M19436 |
ERBB-3 | 受体 | 435 | 2 | L47240 |
UBF | 转录因子 | 405 | 2 | X60831 |
TRAIL | 细胞调亡配体 | 364 | 2 | U37522 |
LFA-1 | 细胞粘连受体 | 340 | 2 | X14951 |
SLAP | Src样衔接蛋白 | 315 | 2 | U29056 |
IFNGR | 干扰素γ受体 | 308 | 2 | M28233 |
LIM-1 | 转录因子 | 295 | 2 | Z27410 |
ATF-2 | 转录因子 | 287 | 2 | S76657 |
FST | 滤泡素抑制素前体 | 275 | 2 | Z29532 |
TIMP3 | 蛋白酶抑制物 | 259 | 2 | L19622 |
RU49 | 转录因子 | 253 | 2 | U41671 |
IGF-1Ra | 胰岛素样生长因子受体 | 218 | 2 | U00182 |
细胞周期蛋白G2 | 细胞周期蛋白 | 214 | 2 | U95826 |
fyn | 酪氨酸蛋白激酶 | 191 | 2 | U70324 |
BMP-2 | 骨形态发生蛋白 | 186 | 2 | L25602 |
Brn-3.2 POU | 转录因子 | 174 | 2 | S68377 |
KIF1A | 驱动蛋白家族蛋白 | 169 | 2 | D29951 |
MRC1 | 甘露糖受体 | 167 | 2 | Z11974 |
PAI2 | 蛋白酶抑制物 | 154 | 2 | X19622 |
BKLF | CACCC序列框结合蛋白 | 138 | 2 | U36340 |
TIMP2 | 蛋白酶抑制物 | 136 | 2 | X62622 |
Mas | 原癌基因 | 131 | 2 | X67735 |
NURR-1 | 转录因子 | 129 | 2 | S53744 |
[00104]表19:RAW巨噬细胞中被SEQ ID NO:1处理减量调节的多聚核苷酸a。发现浓度为50μg/ml的阳离子肽减少了数种多聚核苷酸的表达。将肽与RAW细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与AtIas阵列杂交。未被刺激的细胞的强度显示在第三列。“比值 肽∶未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。该分析实验用不同的细胞重复三次,平均的倍数变化如下所示。显示了相对表达水平发生大约两倍或更大变化的多聚核苷酸。
多聚核苷酸/蛋白 | 多聚核苷酸功能 | 未被刺激的强度 | 比值肽∶未刺激 | 序列登记号 |
钠通道 | 电压门控离子通道 | 257 | 0.08 | L36179 |
XRCC1 | DNA修复蛋白 | 227 | 0.09 | U02887 |
est-2 | 癌多聚核苷酸 | 189 | 0.11 | J04103 |
XPAC | DNA修复蛋白 | 485 | 0.12 | X74351 |
EPOR | 受体前体 | 160 | 0.13 | J04843 |
PEA 3 | Ets相关性蛋白 | 158 | 0.13 | X63190 |
孤儿受体 | 细胞核受体 | 224 | 0.2 | U11688 |
N-钙依粘连蛋白 | 细胞粘连受体 | 238 | 0.23 | M31131 |
OCT3 | 转录因子 | 583 | 0.24 | M34381 |
PLCβ | 磷脂酶 | 194 | 0.26 | U43144 |
KRT18 | 中间纤丝蛋白 | 318 | 0.28 | M11686 |
THAM | 酶 | 342 | 0.32 | X58384 |
CD40L | CD40配体 | 66 | 0.32 | X65453 |
CD86 | T淋巴细胞抗原 | 195 | 0.36 | L25606 |
制癌蛋白M | 细胞因子 | 1127 | 0.39 | D31942 |
PMS2 DNA | DNA修复蛋白 | 200 | 0.4 | U28724 |
IGFBP6 | 生长因子 | 1291 | 0.41 | X81584 |
MIP-1β | 细胞因子 | 327 | 0.42 | M23503 |
ATBF1 | AT基序结合因子 | 83 | 0.43 | D26046 |
Nucleobindin(核结合蛋白) | 高尔基体驻留蛋白 | 367 | 0.43 | M96823 |
bcl-x | 细胞凋亡蛋白 | 142 | 0.43 | L35049 |
尿调理素(uromodulin) | 糖蛋白 | 363 | 0.47 | L33406 |
IL-12 p40 | 白介素 | 601 | 0.48 | M86671 |
MmRad52 | DNA修复蛋白 | 371 | 0.54 | Z32767 |
Tob1 | 抗增生因子 | 956 | 0.5 | D78382 |
Ung1 | DNA修复蛋白 | 535 | 0.51 | X99018 |
KRT19 | 中间纤丝蛋白 | 622 | 0.52 | M28698 |
PLCγ | 磷脂酶 | 251 | 0.52 | X95346 |
整连蛋白α6 | 细胞粘连受体 | 287 | 0.54 | X69902 |
GLUT1 | 葡萄糖转运蛋白 | 524 | 0.56 | M23384 |
CTLA4 | 免疫球蛋白超家族 | 468 | 0.57 | X05719 |
FRA2 | Fos相关性抗原 | 446 | 0.57 | X83971 |
MTRP | 溶酶体缔合性蛋白 | 498 | 0.58 | U34259 |
[00105]表20:在对肽SEQ ID NO:1的应答中多聚核苷酸表达的变化能够通过RT-PCR证实。将RAW 264.7巨噬细胞与50μg/ml的肽共同温育4小时,或者单独与培养基温育4小时。分离总RNA,进行半定量RT-PCR。每种多聚核苷酸的特异性引物对被用于扩增RNA。β肌动蛋白的扩增被用作阳性对照并被用于进行标准化。对RT-PCR产物进行密度测量分析。结果表示为被肽处理的细胞与单独同培养基温育的细胞相比,其多聚核苷酸表达中的相对倍数变化。数据表示为三次实验的平均值±标准偏差。
多聚核苷酸 | 阵列比值-* | RT-PCR-* |
CXCR-4 | 4.0±1.7 | 4.1±0.9 |
IL-8RB | 9.5±7.6 | 7.1±1.4 |
MCP-3 | 13.5±4.4 | 4.8±0.88 |
IL-10 | 4.2±2.1 | 16.6±6.1 |
CD14 | 0.9±0.1 | 0.8±0.3 |
MIP-1B | 0.42±0.09 | 0.11±0.04 |
XRCC1 | 0.12±0.01 | 0.25±0.093 |
MCP-1 | 没有阵列 | 3.5±1.4 |
[00106]表21:A549上皮细胞中被肽处理增量调节的多聚核苷酸a。发现浓度为50μg/ml的阳离子肽增加数种多聚核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与人cDNA阵列ID#PRHU03-S3杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第二列。“比值 肽∶未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
多聚核苷酸/蛋白 | 未被刺激强度 | 比值肽∶未刺激 | 登记号 | |||
ID 2 | ID 3 | ID 19 | ID 1 | |||
IL-1 R拮抗剂同源物1 | 0.00 | 3086 | 1856 | 870 | AI167887 | |
IL-10Rβ | 0.53 | 2.5 | 1.6 | 1.9 | 3.1 | AA486393 |
IL-11Rα | 0.55 | 2.4 | 1.0 | 4.9 | 1.8 | AA454657 |
IL-17R | 0.54 | 2.1 | 2.0 | 1.5 | 1.9 | AW029299 |
TNF R超家族,成员1B | 0.28 | 18 | 3.0 | 15 | 3.6 | AA150416 |
TNF R超家族,成员5(CD40LR) | 33.71 | 3.0 | 0.02 | H98636 | ||
TNF R超家族,成员11b | 1.00 | 5.3 | 4.50 | 0.8 | AA194983 | |
IL-8 | 0.55 | 3.6 | 17 | 1.8 | 1.1 | AA102526 |
白介素增强子结合因子2 | 0.75 | 1.3 | 2.3 | 0.8 | 4.6 | AA894687 |
白介素增强子结合因子1 | 0.41 | 2.7 | 5.3 | 2.5 | R56553 | |
可由细胞因子诱导的含SH2的蛋白 | 0.03 | 33 | 44 | 39 | 46 | AA427521 |
IK细胞因子,HLAII的减量调节物 | 0.50 | 3.1 | 2.0 | 1.7 | 3.3 | R39227 |
可由细胞因子诱导的含SH2的蛋白 | 0.03 | 33 | 44 | 39 | 46 | AA427521 |
小分子诱导性细胞因子亚家族A(Cys-Cys),成员21 | 1.00 | 3.9 | 2.4 | AI922341 | ||
TGFB诱导的早期生长应答2 | 0.90 | 2.4 | 2.1 | 0.9 | 1.1 | AI473938 |
NK细胞R | 1.02 | 2.5 | 0.7 | 0.3 | 1.0 | AA463248 |
CCR6 | 0.14 | 4.5 | 7.8 | 6.9 | 7.8 | N57964 |
细胞粘连分子 | 0.25 | 4.0 | 3.9 | 3.9 | 5.1 | R40400 |
黑素瘤粘连分子 | 0.05 | 7.9 | 20 | 43 | 29.1 | AA497002 |
CD31 | 0.59 | 2.7 | 3.1 | 1.0 | 1.7 | R22412 |
整连蛋白,α2(CD49B,VLA-2受体的α2亚基) | 1.00 | 0.9 | 2.4 | 3.6 | 0.9 | AA463257 |
整连蛋白,α3(CD49C,VLA-3受体的α3亚基) | 0.94 | 0.8 | 2.5 | 1.9 | 1.1 | AA424695 |
整连蛋白,αE | 0.01 | 180 | 120 | 28 | 81 | AA42545 1 |
整连蛋白,β1 | 0.47 | 2.1 | 2.1 | 7.0 | 2.6 | W67174 |
整连蛋白,β3 | 0.55 | 2.7 | 2.8 | 1.8 | 1.0 | AA037229 |
整连蛋白,β3 | 0.57 | 2.6 | 1.4 | 1.8 | 2.0 | AA666269 |
整连蛋白,β4 | 0.65 | 0.8 | 2.2 | 4.9 | 1.5 | AA485668 |
整连蛋白β4结合蛋白 | 0.20 | 1.7 | 5.0 | 6.6 | 5.3 | AI017019 |
钙和整连蛋白结合蛋白 | 0.21 | 2.8 | 4.7 | 9.7 | 6.7 | AA487575 |
解整连蛋白和金属蛋白酶结构域8 | 0.46 | 3.1 | 2.2 | 3.8 | AA2791 88 | |
解整连蛋白和金属蛋白酶结构域9 | 0.94 | 1.1 | 2.3 | 3.6 | 0.5 | H59231 |
解整连蛋白和金属蛋白酶结构域10 | 0.49 | 1.5 | 2.1 | 3.3 | 2.2 | AA043347 |
解整连蛋白和金属蛋白酶结构域23 | 0.44 | 1.9 | 2.3 | 2.5 | 4.6 | H11006 |
钙依粘连蛋白1,1型,E-钙依粘连蛋白(上皮) | 0.42 | 8.1 | 2.2 | 2.4 | 7.3 | H97778 |
钙依粘连蛋白12,2型(N-钙依粘连蛋白2) | 0.11 | 13 | 26 | 9.5 | AI740827 | |
原钙依粘连蛋白12 | 0.09 | 14.8 | 11.5 | 2.6 | 12.4 | AI652584 |
原钙依粘连蛋白γ亚家族C,3 | 0.34 | 3.0 | 2.5 | 4.5 | 9.9 | R89615 |
连环蛋白(钙依粘连蛋白相关的蛋白),δ1 | 0.86 | 1.2 | 2.2 | 2.4 | AA025276 | |
层粘连蛋白R1(67kD,核糖体蛋白SA) | 0.50 | 0.4 | 2.0 | 4.4 | 3.0 | AA629897 |
杀伤细胞凝集素样受体亚家族C,成员2 | 0.11 | 9.7 | 9.0 | 4.1 | 13.4 | AA190627 |
杀伤细胞凝集素样受体亚家族C,成员3 | 1.00 | 3.2 | 1.0 | 0.9 | 1.3 | W93370 |
杀伤细胞凝集素样受体亚家族G,成员1 | 0.95 | 2.3 | 1.7 | 0.7 | 1.1 | AI433079 |
C型凝集素样受体2 | 0.45 | 2.1 | 8.0 | 2.2 | 5.3 | H70491 |
CSF 3R | 0.40 | 1.9 | 2.5 | 3.5 | 4.0 | AA458507 |
巨噬细胞刺激1R | 1.00 | 1.7 | 2.3 | 0.4 | 0.7 | AA173454 |
BMP R型IA | 0.72 | 1.9 | 2.8 | 0.3 | 1.4 | W15390 |
甲酰肽受体1 | 1.00 | 3.1 | 1.4 | 0.4 | AA425 767 | |
CD2 | 1.00 | 2.6 | 0.9 | 1.2 | 0.9 | AA927710 |
CD36 | 0.18 | 8.2 | 5.5 | 6.2 | 2.5 | N39161 |
维生素DR | 0.78 | 2.5 | 1.3 | 1.1 | 1.4 | AA485226 |
人蛋白酶激活R-2 | 0.54 | 6.1 | 1.9 | 2.2 | AA454652 | |
前列腺素E受体3(EP3亚型) | 0.25 | 4.1 | 4.9 | 3.8 | 4.9 | AA406362 |
PDGF Rβ多肽 | 1.03 | 2.5 | 1.0 | 0.5 | 0.8 | R56211 |
VIPR2 | 1.00 | 3.1 | 2.0 | AI057229 | ||
生长因子受体粘合蛋白2 | 0.51 | 2.2 | 2.0 | 2.4 | 0.3 | AA44983 1 |
鼠乳腺肿瘤病毒受体同源物 | 1.00 | 6.9 | 16 | W93891 | ||
腺苷A2a R | 0.41 | 3.1 | 1.8 | 4.0 | 2.5 | N57553 |
腺苷A3 R | 0.83 | 2.0 | 2.3 | 1.0 | 1.2 | AA863086 |
T细胞Rδ基因座 | 0.77 | 2.7 | 1.3 | 1.8 | AA670107 | |
前列腺素E受体1(EP1亚型) | 0.65 | 7.2 | 6.0 | 1.5 | AA972293 | |
生长因子受体粘合蛋白14 | 0.34 | 3.0 | 6.3 | 2.9 | R24266 | |
爱泼斯坦-巴尔病毒诱导的多聚核苷酸2 | 0.61 | 1.6 | 2.4 | 8.3 | AA037376 | |
补体组分受体2 | 0.22 | 26 | 4.5 | 2.6 | 18.1 | AA521362 |
内毒素受体A型 | 0.07 | 12 | 14 | 14 | 16 | AA450009 |
v-SNARE R | 0.56 | 11 | 12 | 1.8 | AA704511 | |
酪氨酸激酶,非受体,1 | 0.12 | 7.8 | 8.5 | 10 | 8.7 | AI936324 |
受体酪氨酸激酶样孤儿受体2 | 0.40 | 7.3 | 5.0 | 1.6 | 2.5 | N94921 |
蛋白酪氨酸磷酸酶,非受体型3 | 1.02 | 1.0 | 13.2 | 0.5 | 0.8 | AA682684 |
蛋白酪氨酸磷酸酶,非受体型9 | 0.28 | 2.5 | 4.0 | 0.9 | 5.3 | AA434420 |
蛋白酪氨酸磷酸酶, | 0.42 | 2.9 | 2.4 | 2.2 | 3.0 | AA995560 |
非受体型11 | ||||||
蛋白酪氨酸磷酸酶,非受体型12 | 1.00 | 2.3 | 2.2 | 0.8 | 0.5 | AA446259 |
蛋白酩氨酸磷酸酶,非受体型13 | 0.58 | 1.7 | 2.4 | 3.6 | 1.7 | AA679180 |
蛋白酪氨酸磷酸酶,非受体型18 | 0.52 | 3.2 | 0.9 | 1.9 | 6.5 | AI668897 |
蛋白酪氨酸磷酸酶,受体型,A | 0.25 | 4.0 | 2.4 | 16.8 | 12.8 | H82419 |
蛋白酪氨酸磷酸酶,受体型,J | 0.60 | 3.6 | 3.2 | 1.6 | 1.0 | AA045326 |
蛋白酪氨酸磷酸酶,受体型,T | 0.73 | 1.2 | 2.8 | 3.0 | 1.4 | R52794 |
蛋白酪氨酸磷酸酶,受体型,U | 0.20 | 6.1 | 1.2 | 5.6 | 5.0 | AA644448 |
蛋白酪氨酸磷酸酶,受体型,C相关蛋白 | 1.00 | 5.1 | 2.4 | AA481547 | ||
磷脂酶A2受体1 | 0.45 | 2.8 | 2.2 | 1.9 | 2.2 | AA086038 |
被MAP激酶激活的蛋白激酶3 | 0.52 | 2.1 | 2.7 | 1.1 | 1.9 | W68281 |
MAP激酶激酶6 | 0.10 | 18 | 9.6 | 32 | H07920 | |
MAP激酶激酶5 | 1.00 | 3.0 | 5.2 | 0.8 | 0.2 | W69649 |
MAP激酶7 | 0.09 | 11.5 | 12 | 33 | H39192 | |
MAP激酶12 | 0.49 | 2.1 | 1.7 | 2.2 | 2.0 | AI936909 |
G蛋白偶联受体4 | 0.40 | 3.7 | 3.0 | 2.4 | 2.5 | AI719098 |
G蛋白偶联受体49 | 0.05 | 19 | 19 | 27 | AA460530 | |
G蛋白偶联受体55 | 0.08 | 19 | 15 | 12 | N58443 | |
G蛋白偶联受体75 | 0.26 | 5.2 | 3.1 | 7.1 | 3.9 | H84878 |
G蛋白偶联受体85 | 0.20 | 6.8 | 5.4 | 4.9 | 5.0 | N62306 |
G蛋白信号传导作用的调节蛋白20 | 0.02 | 48 | 137 | 82 | AI264190 | |
G蛋白信号传导作用的调节蛋白6 | 0.27 | 3.7 | 8.9 | 10.6 | R39932 | |
与BCL2作用的杀伤蛋白(诱导细胞凋亡) | 1.00 | 1.9 | 5.2 | AA291323 | ||
细胞凋亡抑制物5 | 0.56 | 2.8 | 1.6 | 2.4 | 1.8 | AI972925 |
caspase 6,细胞凋亡相关性半胱氨酸蛋白酶 | 0.79 | 0.7 | 2.6 | 1.3 | 2.8 | W45688 |
细胞凋亡相关性蛋白PNAS-1 | 0.46 | 2.2 | 1.4 | 2.3 | 2.9 | AA521316 |
caspase 8,细胞凋亡相关性半胱氨酸蛋 | 0.95 | 2.2 | 1.0 | 0.6 | 2.0 | AA448468 |
白酶 |
[00107]表22:A549上皮细胞中被肽处理减量调节的多聚核苷酸a。发现浓度为50μg/ml的阳离子肽减少数种多聚核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与人cDNA阵列ID#PRHU03-S3杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第二列。“比值 肽∶未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
多聚核苷酸/蛋白 | 未被刺激强度 | 比值 肽∶未刺激 | 登记号 | |||
ID 3 | ID 3 | ID 19 | ID 1 | |||
TLR 1 | 3.22 | 0.35 | 0.31 | 0.14 | 0.19 | AI339155 |
TLR 2 | 2.09 | 0.52 | 0.31 | 0.48 | 0.24 | T57791 |
TLR 5 | 8.01 | 0.12 | 0.39 | N41021 | ||
TLR 7 | 5.03 | 0.13 | 0.11 | 0.20 | 0.40 | N30597 |
TNF受体相关因子2 | 0.82 | 1.22 | 0.45 | 2.50 | 2.64 | T55353 |
TNF受体相关因子3 | 3.15 | 0.15 | 0.72 | 0.32 | AA504259 | |
TNF受体超家族,成员12 | 4.17 | 0.59 | 0.24 | 0.02 | W71984 | |
TNF R超家族,成员17 | 2.62 | 0.38 | 0.55 | 0.34 | AA987627 | |
TRAF和TNF受体相关蛋白 | 1.33 | 0.75 | 0.22 | 0.67 | 0.80 | AA488650 |
IL-1受体,I型 | 1.39 | 0.34 | 0.72 | 1.19 | 0.34 | AA464526 |
IL-2受体,α | 2.46 | 0.41 | 0.33 | 0.58 | AA903183 | |
IL-2受体,γ(严重联合免疫缺陷) | 3.34 | 0.30 | 0.24 | 0.48 | N54821 | |
IL-12受体,β2 | 4.58 | 0.67 | 0.22 | AA977194 | ||
IL-18受体1 | 1.78 | 0.50 | 0.42 | 0.92 | 0.56 | AA482489 |
TGFβ受体III | 2.42 | 0.91 | 0.24 | 0.41 | 0.41 | H62473 |
白三烯b4受体(趋化因子受体样-1) | 1.00 | 1.38 | 4.13 | 0.88 | AI982606 | |
小分子诱导性细胞因子亚家族A(Cys-Cys),成员1 8 | 2.26 | 0.32 | 0.44 | 1.26 | AA495985 | |
小分子诱导性细胞因子亚家族A(Cys-Cys),成员20 | 2.22 | 0.19 | 0.38 | 0.45 | 0.90 | AI285199 |
小分子诱导性细胞因子亚家族A(Cys-Cys),成员23 | 2.64 | 0.38 | 0.31 | 1.53 | AA916836 | |
小分子诱导性细胞因子亚家族B(Cys-X-Cys),成员6 | 3.57 | 0.11 | 0.06 | 0.28 | 0.38 | AI889554 |
(粒细胞趋化性蛋白2) | ||||||
小分子诱导性细胞因子亚家族B(Cys-X-Cys),成员10 | 2.02 | 0.50 | 1.07 | 0.29 | 0.40 | AA878880 |
小分子诱导性细胞因子A3(与鼠Mip-1a同源) | 2.84 | 1.79 | 0.32 | 0.35 | AA677522 | |
细胞因子诱导性激酶 | 2.70 | 0.41 | 0.37 | 0.37 | 0.34 | AA489234 |
补体成分C1q受体 | 1.94 | 0.46 | 0.58 | 0.51 | 0.13 | AI761788 |
钙依粘连蛋白11,2型,OB-钙依粘连蛋白(成骨细胞) | 2.00 | 0.23 | 0.57 | 0.30 | 0.50 | AA136983 |
钙依粘连蛋白3,1型,P-钙依粘连蛋白(胎盘) | 2.11 | 0.43 | 0.53 | 0.10 | 0.47 | AA425217 |
钙依粘连蛋白,EGFLAG seven-pass G型受体2,flamingo(果蝇)同源物 | 1.67 | 0.42 | 0.41 | 1.21 | 0.60 | H39187 |
钙依粘连蛋白13,H-钙依粘连蛋白(心脏) | 1.78 | 0.37 | 0.40 | 0.56 | 0.68 | R41787 |
选凝素L(淋巴细胞粘连分子1) | 4.43 | 0.03 | 0.23 | 0.61 | H00662 | |
血管细胞黏附分子1 | 1.40 | 0.20 | 0.72 | 0.77 | 0.40 | H16591 |
分子间黏附分子3 | 1.00 | 0.12 | 0.31 | 2.04 | 1.57 | AA479188 |
整连蛋白,α1 | 2.42 | 0.41 | 0.26 | 0.56 | AA450324 | |
整连蛋白,α7 | 2.53 | 0.57 | 0.39 | 0.22 | 0.31 | AA055979 |
整连蛋白,α9 | 1.16 | 0.86 | 0.05 | 0.01 | 2.55 | AA865557 |
整连蛋白,α10 | 1.00 | 0.33 | 0.18 | 1.33 | 2.55 | AA460959 |
整连蛋白,β5 | 1.00 | 0.32 | 1.52 | 1.90 | 0.06 | AA434397 |
整连蛋白,β8 | 3.27 | 0.10 | 1.14 | 0.31 | 0.24 | W56754 |
解整连蛋白和金属蛋白酶结构域18 | 2.50 | 0.40 | 0.29 | 0.57 | 0.17 | AI205675 |
解整连蛋白样和金属蛋白酶具有血小板结合蛋白1基序,3 | 2.11 | 0.32 | 0.63 | 0.47 | 0.35 | AA398492 |
解整连蛋白样和金属蛋白酶具有血小板结合蛋白1基序, | 1.62 | 0.39 | 0.42 | 1.02 | 0.62 | AI375048 |
5 | ||||||
T细胞受体作用分子 | 1.00 | 0.41 | 1.24 | 1.41 | 0.45 | AI453185 |
白喉毒素受体(肝素结合表皮生长因子样生长因子) | 1.62 | 0.49 | 0.85 | 0.62 | 0.15 | R45640 |
血管活性肠肽受体1 | 2.31 | 0.43 | 0.31 | 0.23 | 0.54 | H73241 |
IgG的Fc片段,低亲和力IIIb,受体为(CD16) | 3.85 | -0.20 | 0.26 | 0.76 | 0.02 | H20822 |
IgG的Fc片段,低亲和力IIb,受体为(CD32) | 1.63 | 0.27 | 0.06 | 1.21 | 0.62 | R68106 |
IgE的Fc片段,高亲和力I,受体为;α多肽 | 1.78 | 0.43 | 0.00 | 0.56 | 0.84 | AI676097 |
白细胞免疫球蛋白样受体,亚家族A | 2.25 | 0.44 | 0.05 | 0.38 | 0.99 | N63398 |
白细胞免疫球蛋白样受体,亚家族B(具有TM和ITIM结构域),成员3 | 14.21 | 1.10 | 0.07 | AI815229 | ||
白细胞免疫球蛋白样受体,亚家族B(具有TM和ITIM结构域),成员4 | 2.31 | 0.75 | 0.43 | 0.19 | 0.40 | AA076350 |
白细胞免疫球蛋白样受体,亚家族B | 1.67 | 0.35 | 0.60 | 0.18 | 0.90 | H54023 |
过氧化物酶体增殖蛋白激活性受体,α | 1.18 | 0.38 | 0.85 | 0.87 | 0.26 | AI739498 |
蛋白酪氨酸磷酸酶,受体型,f多肽(PTPRF),相互作用蛋白(liprin),α1 | 2.19 | 0.43 | 1.06 | 0.46 | N49751 | |
蛋白酪氨酸磷酸酶,受体型,C | 1.55 | 0.44 | 0.64 | 0.30 | 0.81 | H74265 |
蛋白酪氨酸磷酸酶,受体型,E | 2.08 | 0.23 | 0.37 | 0.56 | 0.48 | AA464542 |
蛋白酪氨酸磷酸酶,受体型,N多肽2 | 2.27 | 0.02 | 0.44 | 0.64 | AA464590 | |
蛋白酪氨酸磷酸酶,受体型,H | 2.34 | 0.11 | 0.43 | 0.24 | 0.89 | AI924306 |
蛋白酪氨酸磷酸酶,受体型,Z多肽1 | 1.59 | 0.63 | 0.34 | 0.72 | 0.35 | AA476461 |
蛋白酪氨酸磷酸酶, | 1.07 | 0.94 | 0.43 | 0.25 | 1.13 | H03504 |
非受体型21 | ||||||
MAP激酶8相互作用蛋白2 | 1.70 | 0.07 | 0.85 | 0.47 | 0.59 | AA418293 |
MAP激酶激酶激酶4 | 1.27 | 0.37 | 0.79 | 1.59 | -5.28 | AA402447 |
MAP激酶激酶激酶14 | 1.00 | 0.34 | 0.66 | 2.10 | 1.49 | W61116 |
MAP激酶8相互作用蛋白2 | 2.90 | 0.16 | 0.35 | 0.24 | 0.55 | AI202738 |
MAP激酶激酶激酶12 | 1.48 | 0.20 | 0.91 | 0.58 | 0.68 | AA053674 |
MAP激酶激酶激酶激酶3 | 2.21 | 0.45 | 0.20 | 1.03 | 0.41 | AA043537 |
MAP激酶激酶激酶6 | 2.62 | 0.37 | 0.38 | 0.70 | AW084649 | |
MAP激酶激酶激酶激酶4 | 1.04 | 0.96 | 0.09 | 0.29 | 2.79 | AA417711 |
MAP激酶激酶激酶11 | 1.53 | 0.65 | 0.41 | 0.99 | 0.44 | R80779 |
MAP激酶激酶激酶10 | 1.32 | 1.23 | 0.27 | 0.50 | 0.76 | H01340 |
MAP激酶9 | 2.54 | 0.57 | 0.39 | 0.16 | 0.38 | AA157286 |
MAP激酶激酶激酶1 | 1.23 | 0.61 | 0.42 | 0.81 | 1.07 | AI538525 |
MAP激酶激酶激酶8 | 0.66 | 1.52 | 1.82 | 9.50 | 0.59 | W56266 |
被MAP激酶激活的蛋白激酶3 | 0.52 | 2.13 | 2.68 | 1.13 | 1.93 | W68281 |
MAP激酶激酶2 | 0.84 | 1.20 | 3.35 | 0.02 | 1.31 | AA425 826 |
MAP激酶激酶激酶7 | 1.00 | 0.97 | 1.62 | 7.46 | AA460969 | |
MAP激酶7 | 0.09 | 11.45 | 11.80 | 33.43 | H39192 | |
MAP激酶激酶6 | 0.10 | 17.83 | 9.61 | 32.30 | H07920 | |
G蛋白信号传导作用的调节蛋白5 | 3.7397 | 0.27 | 0.06 | 0.68 | 0.18 | AA668470 |
G蛋白信号传导作用的调节蛋白13 | 1.8564 | 0.54 | 0.45 | 0.07 | 1.09 | H70047 |
G蛋白偶联性受体 | 1.04 | 1.84 | 0.16 | 0.09 | 0.96 | R91916 |
G蛋白偶联性受体17 | 1.78 | 0.32 | 0.56 | 0.39 | 0.77 | AI953187 |
G蛋白偶联性受体激酶7 | 2.62 | 0.34 | 0.91 | 0.38 | AA488413 | |
孤儿七次跨膜受体,与趋化因子关联 | 7.16 | 1.06 | 0.10 | 0.11 | 0.14 | AI131555 |
细胞凋亡拮抗性转 | 1.00 | 0.28 | 2.50 | 1.28 | 0.19 | AI439571 |
录因子 | ||||||
caspase 1,细胞凋亡相关性半胱氨酸蛋白酶(白介素1,β,转换酶) | 2.83 | 0.44 | 0.33 | 0.35 | T95052 | |
程序性细胞死亡8(诱导细胞凋亡的因子) | 1.00 | 1.07 | 0.35 | 1.94 | 0.08 | AA496348 |
[00108]表23:A549细胞中被肽处理增量调节的促炎多聚核苷酸。发现浓度为50μg/ml的阳离子肽增加某些促炎多聚核苷酸的表达(数据是表21的一部分)。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与人cDNA阵列ID#PRHU03-S3杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第二列。“比值 肽∶未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
多聚核苷酸/蛋白和功能 | 未被刺激强度 | 比值肽∶未刺激 | 登记号 | |||
ID 2 | ID 3 | ID 19 | ID 1 | |||
IL-11 Ra;促炎细胞因子的受体,炎症 | 0.55 | 2.39 | 0.98 | 4.85 | 1.82 | AA454657 |
IL-17 R;IL-17受体,上皮细胞中产生细胞因子的诱导物 | 0.54 | 2.05 | 1.97 | 1.52 | 1.86 | AW029299 |
小分子诱导性细胞因子亚家族A,成员21;一种趋化因子 | 1.00 | 3.88 | 2.41 | AI922341 | ||
CD31;白细胞和细胞与细胞的黏附(PECAM) | 0.59 | 2.71 | 3.13 | 1.01 | 1.68 | R22412 |
CCR6;细胞因子MIP-3α的受体 | 0.14 | 4.51 | 7.75 | 6.92 | 7.79 | N57964 |
整连蛋白,α2(CD49B,VLA-2受体的α2亚基);与白细胞的黏附 | 1.00 | 0.89 | 2.44 | 3.62 | 0.88 | AA463257 |
整连蛋白,α3(CD49C,VLA-3受体的α3亚基);与白细胞的黏附 | 0.94 | 0.79 | 2.51 | 1.88 | 1.07 | AA424695 |
整连蛋白,αE;黏附 | 0.01 | 179.33 | 120.12 | 28.48 | 81.37 | AA425451 |
整连蛋白,β4;白细胞黏附 | 0.65 | 0.79 | 2.17 | 4.94 | 1.55 | AA485668 |
C型凝集素样受体2;白细胞黏附 | 0.45 | 2.09 | 7.92 | 2.24 | 5.29 | H70491 |
[00109]表24:A549细胞中被肽处理减量调节的促炎多聚核苷酸。发现浓度为50μg/ml的阳离子肽减少某些促炎多聚核苷酸的表达(数据是表22的一部分)。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与人cDNA阵列ID#PRHU03-S3杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第二列。“比值 肽∶未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
多聚核苷酸/蛋白;功能 | 未被刺激强度 | 比值肽∶未刺激 | 登记号 | |||
ID 2 | ID 3 | ID 19 | ID 1 | |||
Toll样受体(TLR)1;对革兰氏阳性细菌进行应答 | 3.22 | 0.35 | 0.31 | 0.14 | 0.19 | AI339155 |
TLR2;对革兰氏阳性细菌和酵母进行应答 | 2.09 | 0.52 | 0.31 | 0.48 | 0.24 | T57791 |
TLR5;可以增强其他TLR应答,对鞭毛蛋白的应答性 | 8.01 | 0.12 | 0.39 | N41021 | ||
TLR7;推导的宿主防御机制 | 5.03 | 0.13 | 0.11 | 0.20 | 0.40 | N30597 |
TNF受体相关因子2;炎症 | 0.82 | 1.22 | 0.45 | 2.50 | 2.64 | T55353 |
TNF受体相关因子3;炎症 | 3.15 | 0.15 | 0.72 | 0.32 | AA504259 | |
TNF受体超家族,成员12;炎症 | 4.17 | 0.59 | 0.24 | 0.02 | W71984 | |
TNF受体超家族,成员17;炎症 | 2.62 | 0.38 | 0.55 | 0.34 | AA987627 | |
TRAF和TNF受体相关蛋白;TNF信号传导 | 1.33 | 0.75 | 0.22 | 0.67 | 0.80 | AA488650 |
小分子诱导性细胞因子亚家族A,成员18;趋化因子 | 2.26 | 0.32 | 0.44 | 1.26 | AA495985 | |
小分子诱导性细 | 2.22 | 0.19 | 0.38 | 0.45 | 0.90 | AI285199 |
胞因子亚家族A,成员20;趋化因子 | ||||||
小分子诱导性细胞因子亚家族A,成员23;趋化因子 | 2.64 | 0.38 | 0.31 | 1.53 | AA916836 | |
小分子诱导性细胞因子亚家族B,成员6;(粒细胞趋化性蛋白);趋化因子 | 3.57 | 0.11 | 0.06 | 0.28 | 0.38 | AI889554 |
小分子诱导性细胞因子亚家族B,成员10;趋化因子 | 2.02 | 0.50 | 1.07 | 0.29 | 0.40 | AA878880 |
小分子诱导性细胞因子A3(与鼠Mip-1a同源);趋化因子 | 2.84 | 1.79 | 0.32 | 0.35 | AA677522 | |
IL-12受体,β2;白介素和干扰素受体 | 4.5g | 0.67 | 0.22 | AA977194 | ||
IL-18受体1;诱导INF-γ | 1.78 | 0.50 | 0.42 | 0.92 | 0.56 | AA482489 |
选凝素L(白细胞黏附分子1);白细胞黏附 | 4.43 | 0.03 | 0.23 | 0.61 | H00662 | |
血管细胞黏附分子1;白细胞黏附 | 1.40 | 0.20 | 0.72 | 0.77 | 0.40 | H16591 |
细胞间黏附分子3;白细胞黏附 | 1.00 | 0.12 | 0.31 | 2.04 | 1.57 | AA479188 |
整连蛋白,α1;白细胞黏附 | 2.42 | 0.41 | 0.26 | 0.56 | AA450324 |
[00110]表25:A549细胞中被肽处理增量调节的抗炎多聚核苷酸。发现浓度为50μg/ml的阳离子肽增加某些抗炎多聚核苷酸的表达(数据是表21的一部分)。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与人cDNA阵列ID#PRHU03-S3杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第二列。“比值 肽∶未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
多聚核苷酸/蛋白;功能 | 未被刺激强度 | 比值 肽∶未刺激 | 登记号 | |||
ID 2 | ID 3 | ID 19 | ID 1 | |||
IL-1R拮抗剂同源物1;脓毒症休克的抑制 | 0.00 | 3085.96 | 1855.90 | 869.57 | AI167887 |
物 | ||||||
IL-10 Rβ;细胞因子合成抑制物的受体 | 0.53 | 2.51 | 1.56 | 1.88 | 3.10 | AA486393 |
TNF R,成员1B;细胞凋亡 | 0.28 | 17.09 | 3.01 | 14.93 | 3.60 | AA150416 |
TNF R,成员5;细胞凋亡(CD40L) | 33.71 | 2.98 | 0.02 | H98636 | ||
TNF R,成员11b;细胞凋亡 | 1.00 | 5.29 | 4.50 | 0.78 | AA194983 | |
IK细胞因子,HLAII的减量调节物;抑制抗原呈递 | 0.50 | 3.11 | 2.01 | 1.74 | 3.29 | R39227 |
可由TGFB诱导的早期生长应答蛋白2;抗炎细胞因子 | 0.90 | 2.38 | 2.08 | 0.87 | 1.11 | AI473938 |
CD2;黏附分子,结合LFAp3 | 1.00 | 2.62 | 0.87 | 1.15 | 0.88 | AA927710 |
[00111]表26:A549细胞中被肽处理减量调节的抗炎多聚核苷酸。发现浓度为50μg/ml的阳离子肽减少某些抗炎多聚核苷酸的表达(数据是表21的一部分)。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与人cDNA阵列ID#PRHU03-S3杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第二列。“比值 肽∶未刺激”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
多聚核苷酸/蛋白;功能 | 未被刺激强度 | 比值 肽∶未刺激 | 登记号 | |||
ID 2 | ID 3 | ID 19 | ID 1 | |||
MAP激酶9 | 2.54 | 0.57 | 0.39 | 0.16 | 0.38 | AA157286 |
[00112]表27:原代人巨噬细胞中被SEQ ID NO:6增量调节的多聚核苷酸。发现浓度为50μg/ml的肽SEQ ID NO:6增加了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人巨噬细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与HumanOperon阵列(PRHU04)杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第二列。“比值 肽处理∶对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
基因(登记号) | 对照:未被刺激的细胞 | 比值 肽处理∶对照 |
蛋白聚糖2(Z26248) | 0.69 | 9.3 |
未知(AK001843) | 26.3 | 8.2 |
磷酸化酶激酶α1(X73874) | 0.65 | 7.1 |
辅肌动蛋白,α3(M86407) | 0.93 | 6.9 |
DKFZP586B2420蛋白(AL050143) | 0.84 | 5.9 |
未知(AL109678) | 0.55 | 5.6 |
转录因子21(AF047419) | 0.55 | 5.4 |
未知(A433612) | 0.62 | 5.0 |
染色体缩聚1-样(AF060219) | 0.69 | 4.8 |
未知(AL137715) | 0.66 | 4.4 |
细胞凋亡抑制物4(U75285) | 0.55 | 4.2 |
与TERF1(TRF1)作用的细胞核因子2(NM_012461) | 0.73 | 4.2 |
LINE反转录转座元件1(M22333) | 6.21 | 4.0 |
1-酰基甘油-3-磷酸酯O-酰基转移酶1(U56417) | 0.89 | 4.0 |
空泡质子性ATP酶,亚基D;V-ATP酶,亚基D(X71490) | 1.74 | 4.0 |
KIAA0592蛋白(AB011164) | 0.70 | 4.0 |
电压门控钾通道KQT样亚家族成员4(AF105202) | 0.59 | 3.9 |
CDC14同源物A(AF000367) | 0.87 | 3.8 |
组蛋白折叠蛋白CHRAC17(AF070640) | 0.63 | 3.8 |
隐花色素1(D83702) | 0.69 | 3.8 |
胰腺酶原粒膜缔合性蛋白(AB035541) | 0.71 | 3.7 |
Sp3转录因子(X68560) | 0.67 | 3.6 |
假想蛋白FLJ20495(AK000502) | 0.67 | 3.5 |
E2F转录因子5,p130结合(U31556) | 0.56 | 3.5 |
假想蛋白FLJ20070(AK000077) | 1.35 | 3.4 |
糖蛋白IX(X52997) | 0.68 | 3.4 |
KIAA1013蛋白(AB023230) | 0.80 | 3.4 |
真核细胞翻译起始因子4A,同工型2(AL137681) | 2.02 | 3.4 |
FYN结合蛋白(AF198052) | 1.04 | 3.3 |
鸟苷酸结合蛋白,γ转导活性多肽1(U41492) | 0.80 | 3.3 |
磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(X54232) | 0.74 | 3.2 |
黏膜血管地址素细胞黏附分子1(U43628) | 0.65 | 3.2 |
淋巴细胞抗原(M38056) | 0.70 | 3.2 |
H1组蛋白家族,成员4(M60748) | 0.81 | 3.0 |
翻译抑制蛋白p14.5(X95384) | 0.78 | 3.0 |
假想蛋白FLJ20689(AB032978) | 1.03 | 2.9 |
KIAA1278蛋白(AB03104) | 0.80 | 2.9 |
未知(AL031864) | 0.95 | 2.9 |
胰凝乳蛋白酶样蛋白酶(X71877) | 3.39 | 2.9 |
网腔钙结合蛋白(NM_001219) | 2.08 | 2.9 |
蛋白激酶,cAMP依赖性,调节性,I型,β(M65066) | 7.16 | 2.9 |
POU结构域,第4类,转录因子2(U06233) | 0.79 | 2.8 |
POU结构域,第2类,相关因子1(Z49194) | 1.09 | 2.8 |
KIAA0532蛋白(AB011104) | 0.84 | 2.8 |
未知(AF068289) | 1.01 | 2.8 |
未知(AL117643) | 0.86 | 2.7 |
组织蛋白酶E(M84424) | 15.33 | 2.7 |
间质金属蛋白酶23A(AF056200) | 0.73 | 2.7 |
干扰素受体2(L42243) | 0.70 | 2.5 |
MAP激酶激酶1(L11284) | 0.61 | 2.4 |
蛋白激酶C,α(X52479) | 0.76 | 2.4 |
c-Cbl作用蛋白(AF230904) | 0.95 | 2.4 |
c-fos诱导性生长因子(Y12864) | 0.67 | 2.3 |
细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物1B(S76988) | 0.89 | 2.2 |
锌指蛋白266(X78924) | 1.67 | 2.2 |
MAP激酶14(L35263) | 1.21 | 2.2 |
KIAA0922蛋白(AB023 139) | 0.96 | 2.1 |
骨形态发生蛋白1(NM_006129) | 1.10 | 2.1 |
NADH脱氢酶1α亚复合体,10(AF087661) | 1.47 | 2.1 |
骨形态发生蛋白受体,1B型(U89326) | 0.50 | 2.1 |
干扰素调节性因子2(NM002199) | 1.46 | 2.0 |
蛋白酶,丝氨酸,21(AB031331) | 0.89 | 2.0 |
[00113]表28:原代人巨噬细胞中被SEQ ID NO:6减量调节的多聚核苷酸。发现浓度为50μg/ml的肽SEQ ID NO:6降低了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人巨噬细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与HumanOperon阵列(PRHU04)杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第二列。“比值 肽处理∶对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
基因(登记号) | 对照:未被刺激的细胞 | 比值肽处理∶对照 |
未知(AL049263) | 17 | 0.06 |
整连蛋白关联性激酶(U40282) | 2.0 | 0.13 |
KIAA0842蛋白(AB020649) | 1.1 | 0.13 |
未知(AB037838) | 13 | 0.14 |
颗粒体蛋白(AF055008) | 8.6 | 0.14 |
谷胱甘肽过氧化酶3(NM_002084) | 1.2 | 0.15 |
KIAA0152基因产物(D63486) | 0.9 | 0.17 |
TGFB1诱导性抗细胞凋亡因子1(D86790) | 0.9 | 0.19 |
解整连蛋白蛋白酶(Y13323) | 1.5 | 0.21 |
蛋白酶体亚基β型7(D38048) | 0.7 | 0.22 |
Sp1转录激活亚基3所需的辅助因子(AB033042) | 0.9 | 0.23 |
TNF受体超家族,成员14(U81232) | 0.8 | 0.26 |
蛋白酶体26S亚基非ATP酶8(D38047) | 1.1 | 0.28 |
蛋白酶体亚基β型,4(D26600) | 0.7 | 0.29 |
TNF受体超家族成员1B(M32315) | 1.7 | 0.29 |
细胞色素c氧化酶亚基Vic(X13238) | 3.3 | 0.30 |
S100钙结合蛋白A4(M80563) | 3.8 | 0.31 |
蛋白酶体亚基α型,6(X59417) | 2.9 | 0.31 |
蛋白酶体26S亚基非ATP酶,10(AL031177) | 1.0 | 0.32 |
MAP激酶激酶激酶2(NM_006609) | 0.8 | 0.32 |
核糖体蛋白L11(X79234) | 5.5 | 0.32 |
间质金属蛋白酶14(Z48481) | 1.0 | 0.32 |
蛋白酶体亚基β型,5(D29011) | 1.5 | 0.33 |
被MAP激酶激活的蛋白激酶2(U12779) | 1.5 | 0.34 |
caspase 3(U13737) | 0.5 | 0.35 |
junD原癌基因(X56681) | 3.0 | 0.35 |
蛋白酶体26S亚基,ATP酶,3(M34079) | 1.3 | 0.35 |
IL-1受体样1(AB012701) | 0.7 | 0.35 |
干扰素α诱导性蛋白(AB019565) | 13 | 0.35 |
SDF受体1(NM_012428) | 1.6 | 0.35 |
组织蛋白酶D(M63138) | 46 | 0.36 |
MAP激酶激酶3(D87116) | 7.4 | 0.37 |
TGF,β诱导性(M77349) | 1.8 | 0.37 |
TNF受体超家族,成员10b(AF016266) | 1.1 | 0.37 |
蛋白酶体亚基β型,6(M34079) | 1.3 | 0.38 |
细胞核受体结合蛋白(NM_013392) | 5.2 | 0.38 |
未知(AL050370) | 1.3 | 0.38 |
蛋白酶抑制物1α-1-抗胰蛋白酶(X01683) | 0.7 | 0.40 |
蛋白酶体亚基α型,7(AF054185) | 5.6 | 0.40 |
LPS诱导性TNF-α因子(NM_004862) | 5.3 | 0.41 |
运铁蛋白受体(X01060) | 14 | 0.42 |
蛋白酶体26S亚基非ATP酶13(AB009398) | 1.8 | 0.44 |
MAP激酶激酶5(U25265) | 1.3 | 0.44 |
组织蛋白L(X12451) | 15 | 0.44 |
IL-1受体相关激酶1(L76191) | 1.7 | 0.45 |
MAP激酶激酶激酶激酶2(U07349) | 1.1 | 0.46 |
过氧化物酶体增殖蛋白激活性受体δ(AL022721) | 2.2 | 0.46 |
TNF超家族,成员15(AF039390) | 16 | 0.46 |
细胞死亡防御物1(D15057) | 3.9 | 0.46 |
TNF超家族成员10(U37518) | 287 | 0.46 |
组织蛋白H(X16832) | 14 | 0.47 |
蛋白酶抑制物12(Z81326) | 0.6 | 0.48 |
蛋白酶体亚基α型,4(D00763) | 2.6 | 0.49 |
蛋白酶体26S亚基ATP酶,1(L02426) | 1.8 | 0.49 |
蛋白酶体26S亚基ATP酶,2(D11094) | 2.1 | 0.49 |
caspase 7(U67319) | 2.4 | 0.49 |
间质金属蛋白酶7(Z11887) | 2.5 | 0.49 |
[00114]表29:HBE细胞中被SEQ ID NO:1增量调节的多聚核苷酸。发现浓度为50μg/ml的肽SEQ ID NO:1增加了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人HBE上皮细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与HumanOperon阵列(PRHU04)杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第三列。“比值 肽处理∶对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
登记号 | 基因 | 对照:未被刺激的细胞 | 比值 肽处理∶对照 |
AL110161 | 未知 | 0.22 | 5218.3 |
AF131842 | 未知 | 0.01 | 573.1 |
AJ000730 | 溶质载体家族 | 0.01 | 282.0 |
Z25884 | 氯离子通道1 | 0.01 | 256.2 |
M93426 | 蛋白酪氨酸磷酸酶受体-型,ζ | 0.01 | 248.7 |
X65857 | 嗅觉受体,家族1,亚家族D,成员2 | 0.01 | 228.7 |
M55654 | TATA序列框结合蛋白 | 0.21 | 81.9 |
AK001411 | 假想蛋白 | 0.19 | 56.1 |
D29643 | 多萜二磷寡聚糖-蛋白糖基转移酶 | 1.56 | 55.4 |
AF006822 | 髓磷脂转录因子2 | 0.07 | 55.3 |
AL117601 | 未知 | 0.05 | 53.8 |
AL117629 | DKFZP434C245蛋白 | 0.38 | 45.8 |
M59465 | 肿瘤坏死因子,α诱导性蛋白3 | 0.50 | 45.1 |
AB013456 | 水通道蛋白8 | 0.06 | 41.3 |
AJ131244 | SEC24相关性基因家族,成员A | 0.56 | 25.1 |
AL110179 | 未知 | 0.87 | 24.8 |
AB037844 | 未知 | 1.47 | 20.6 |
Z47727 | 聚合酶II多肽K | 0.11 | 20.5 |
AL035694 | 未知 | 0.81 | 20.4 |
X68994 | 人类CREB基因 | 0.13 | 19.3 |
AJ238379 | 假想蛋白 | 1.39 | 18.5 |
NM_003519 | H2B组蛋白家族成员 | 0.13 | 18.3 |
U16126 | 谷氨酸受体,亲离子kainate 2 | 0.13 | 17.9 |
U29926 | 腺苷单磷酸脱氨酶 | 0.16 | 16.3 |
AK001160 | 假想蛋白 | 0.39 | 14.4 |
U18018 | ets变种基因4 | 0.21 | 12.9 |
D80006 | KIAA0184蛋白 | 0.21 | 12.6 |
AK000768 | 假想蛋白 | 0.30 | 12.3 |
X99894 | 胰岛素启动子因子1 | 0.26 | 12.0 |
AL031177 | 未知 | 1.09 | 11.2 |
AF052091 | 未知 | 0.28 | 10.9 |
L38928 | 5,10-甲叉亚甲基四氢叶酸合成酶 | 0.22 | 10.6 |
AL117421 | 未知 | 0.89 | 10.1 |
AL133606 | 假想蛋白 | 0.89 | 9.8 |
NM_016227 | 膜蛋白CH1 | 0.28 | 9.6 |
NM_006594 | 连接蛋白相关性蛋白复合物4 | 0.39 | 9.3 |
U54996 | ZW10同源物,蛋白 | 0.59 | 9.3 |
AJ007557 | 钾通道 | 0.28 | 9.0 |
AF043938 | 肌肉RAS癌基因 | 1.24 | 8.8 |
AK001607 | 未知 | 2.74 | 8.7 |
AL031320 | 过氧化物酶体生物发生因子30 | 0.31 | 8.4 |
D38024 | 未知 | 0.31 | 8.3 |
AF059575 | LIM同源框TF | 2.08 | 8.2 |
AF043724 | 肝炎A病毒细胞受体1 | 0.39 | 8.1 |
AK002062 | 假想蛋白 | 2.03 | 8.0 |
L13436 | 钠尿多肽受体 | 0.53 | 7.8 |
U33749 | 甲状腺转录因子1 | 0.36 | 7.6 |
AF011792 | 细胞周期进程2蛋白 | 0.31 | 7.6 |
AK000193 | 假想蛋白 | 1.18 | 6.8 |
AF039022 | 输出蛋白(expotin),tRNA | 0.35 | 6.8 |
M17017 | 白介素8 | 0.50 | 6.7 |
AF044958 | NADH脱氢酶 | 0.97 | 6.5 |
U35246 | 囊泡分选蛋白 | 0.48 | 6.5 |
AK001326 | 四次跨膜蛋白(tetraspan)3 | 1.59 | 6.5 |
M55422 | 克鲁佩尔相关性锌指蛋白 | 0.34 | 6.4 |
U44772 | 棕榈酰-蛋白硫酯酶 | 1.17 | 6.3 |
AL117485 | 假想蛋白 | 0.67 | 5.9 |
AB037776 | 未知 | 0.75 | 5.7 |
AF131827 | 未知 | 0.69 | 5.6 |
AL137560 | 未知 | 0.48 | 5.2 |
X05908 | 膜联蛋白A1 | 0.81 | 5.1 |
X68264 | 黑素瘤黏附分子 | 0.64 | 5.0 |
AL161995 | neurturin | 0.86 | 4.9 |
AF037372 | 细胞色素c氧化酶 | 0.48 | 4.8 |
NM_016187 | 桥接整合蛋白2 | 0.65 | 4.8 |
AL137758 | 未知 | 0.57 | 4.8 |
U59863 | TRAF家族成员相关NFKB激活物 | 0.46 | 4.7 |
Z30643 | 氯离子通道Ka | 0.70 | 4.7 |
D16294 | 乙酰辅酶A酰基转移酶2 | 1.07 | 4.6 |
AJ132592 | 锌指蛋白281 | 0.55 | 4.6 |
X82324 | POU结构域TF | 1.73 | 4.5 |
NM_016047 | CGI-110蛋白 | 1.95 | 4.5 |
AK001371 | 假想蛋白 | 0.49 | 4.5 |
M60746 | H3组蛋白家族成员D | 3.05 | 4.5 |
AB033071 | 假想蛋白 | 4.47 | 4.4 |
AB002305 | KIAA0307基因产物 | 1.37 | 4.4 |
X92689 | UDP-N-乙酰基-α-D-半乳糖胺:多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶 | 0.99 | 4.4 |
AL049543 | 谷胱甘肽过氧化酶5 | 1.62 | 4.3 |
U43148 | PTCH(patched homolog) | 0.96 | 4.3 |
M67439 | 多巴胺受体D5 | 2.61 | 4.2 |
U09850 | 锌指蛋白143 | 0.56 | 4.2 |
L20316 | 胰高血糖素受体 | 0.75 | 4.2 |
AB037767 | 解整连蛋白样和金属蛋白酶 | 0.69 | 4.2 |
NM_017433 | 肌球蛋白IIIA | 99.20 | 4.2 |
D26579 | 解整连蛋白和金属蛋白酶结构域8 | 0.59 | 4.1 |
L10333 | reticulon 1 | 1.81 | 4.1 |
AK000761 | 未知 | 1.87 | 4.1 |
U91540 | NK同源盒家族3,A | 0.80 | 4.1 |
Z17227 | 白介素10受体,β | 0.75 | 4.0 |
[00115]表30:HBE细胞中被肽SEQ ID NO:1(50μg/ml)减量调节的多聚核苷酸。发现浓度为50μg/ml的肽SEQ ID NO:1降低了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人HBE上皮细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。在未被刺激的细胞中多聚核苷酸的强度显示在第三列。“比值 肽处理∶对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
登记号 | 基因 | 对照:未被刺激的细胞 | 比值 肽处理∶对照 |
AC004908 | 未知 | 32.4 | 0.09 |
S70622 | G1期特异性基因 | 43.1 | 0.10 |
Z97056 | DEAD/H框多肽 | 12.8 | 0.11 |
AK002056 | 假想蛋白 | 11.4 | 0.12 |
L33930 | CD24抗原 | 28.7 | 0.13 |
X77584 | 硫氧还蛋白 | 11.7 | 0.13 |
NM_014106 | PR01914蛋白 | 25.0 | 0.14 |
M37583 | H2A组蛋白家族成员 | 22.2 | 0.14 |
U89387 | 聚合酶(RNA)II多肽D | 10.2 | 0.14 |
D25274 | ras相关性C3肉毒杆菌毒素底物 | 10.3 | 0.15 |
1 | |||
J04173 | 磷酸甘油酯变位酶1 | 11.4 | 0.15 |
U19765 | 锌指蛋白9 | 8.9 | 0.16 |
X67951 | 增殖相关基因A | 14.1 | 0.16 |
AL096719 | 肌动蛋白抑制蛋白2 | 20.0 | 0.16 |
AF165217 | 原肌球调节蛋白4 | 14.6 | 0.16 |
NM_014341 | 线粒体载体蛋白同源物1 | 11.1 | 0.16 |
AL022068 | 未知 | 73.6 | 0.17 |
X69150 | 核糖体蛋白S18 | 42.8 | 0.17 |
AL031577 | 未知 | 35.0 | 0.17 |
AL031281 | 未知 | 8.9 | 0.17 |
AF090094 | 人鸟氨酸脱羧酶抗酶的mRNA | 10.3 | 0.17 |
AL022723 | HLA-G组织相容性抗原,I类,G | 20.6 | 0.18 |
U09813 | ATP合成酶,H+转运性线粒体F0复合物 | 9.8 | 0.18 |
AF000560 | 人类TTF-1相互作用性多肽20 | 20.2 | 0.19 |
NM_016094 | HSPC042蛋白 | 67.2 | 0.19 |
AF047183 | NADH脱氢酶 | 7.5 | 0.19 |
D14662 | 抗氧化剂蛋白2(非硒谷胱甘肽过氧化酶,酸性钙依赖性磷脂酶) | 8.1 | 0.19 |
X16662 | 膜联蛋白A8 | 8.5 | 0.19 |
U14588 | 桩蛋白 | 11.3 | 0.19 |
AL117654 | DKFZP586D0624蛋白 | 12.6 | 0.20 |
AK001962 | 假想蛋白 | 7.7 | 0.20 |
L41559 | 6-丙酮酰四氢蝶呤合酶/肝细胞核因子1α的二聚作用辅助因子 | 9.1 | 0.20 |
NM_016139 | 16.7Kd蛋白 | 21.0 | 0.21 |
NM_016080 | CGI-150蛋白 | 10.7 | 0.21 |
U86782 | 26S蛋白酶体相关pad1同源物 | 6.7 | 0.21 |
AJ400717 | 肿瘤蛋白,翻译控制蛋白1 | 9.8 | 0.21 |
X07495 | 同源框C4 | 31.0 | 0.21 |
AL034410 | 未知 | 7.3 | 0.22 |
X14787 | 血小板结合蛋白1 | 26.2 | 0.22 |
AF081192 | 富含嘌呤元件结合蛋白B | 6.8 | 0.22 |
D49489 | 蛋白二硫键异构酶相关性蛋白 | 11.0 | 0.22 |
NM_014051 | PTD011蛋白 | 9.3 | 0.22 |
AK001536 | 未知 | 98.0 | 0.22 |
X62534 | 2组高速泳动蛋白 | 9.5 | 0.22 |
AJ005259 | 内皮分化相关性因子1 | 6.7 | 0.22 |
NM_000120 | 环氧化物水解酶1,微粒体的 | 10.0 | 0.22 |
M38591 | S100钙结合蛋白A10 | 23.9 | 0.23 |
AF071596 | 即时早期相应蛋白2 | 11.5 | 0.23 |
X16396 | 甲叉四氢叶酸脱氢酶 | 8.3 | 0.23 |
AK000934 | ATP酶抑制物前体 | 7.6 | 0.23 |
AL117612 | 未知 | 10.7 | 0.23 |
AF119043 | 转录中间因子1 γ | 7.3 | 0.23 |
AF037066 | 溶质载体家族22成员1-样反义 | 7.6 | 0.23 |
AF134406 | 细胞色素c氧化酶亚基 | 13.3 | 0.23 |
AE000661 | 未知 | 9.2 | 0.24 |
AL157424 | synaptojanin 2 | 7.2 | 0.24 |
X56468 | 酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白 | 7.2 | 0.24 |
U39318 | 泛蛋白缀合酶E2D3 | 10.7 | 0.24 |
AL034348 | 未知 | 24.4 | 0.24 |
D26600 | 蛋白酶体亚基β型4 | 11.4 | 0.24 |
AB032987 | 未知 | 16.7 | 0.24 |
J04182 | 溶酶体缔合性膜蛋白1 | 7.4 | 0.24 |
X78925 | 锌指蛋白267 | 16.1 | 0.25 |
NM_000805 | 胃泌素 | 38.1 | 0.25 |
U29700 | 抗缪氏激素受体,II型 | 12.0 | 0.25 |
Z98200 | 未知 | 13.4 | 0.25 |
U07857 | 信号识别颗粒 | 10.3 | 0.25 |
L05096 | 人类核糖体蛋白L39 | 25.3 | 0.25 |
AK001443 | 假想蛋白 | 7.5 | 0.25 |
K03515 | 磷酸葡萄糖异构酶 | 6.2 | 0.25 |
X57352 | 干扰素诱导性跨膜蛋白3 | 7.5 | 0.26 |
J02883 | 胰腺辅脂肪酶 | 5.7 | 0.26 |
M24069 | 冷休克结构域蛋白 | 6.3 | 0.26 |
AJ269537 | 软骨素-4-磺基转移酶 | 60.5 | 0.26 |
AL137555 | 未知 | 8.5 | 0.26 |
U89505 | RNA结合基序蛋白 | 5.5 | 0.26 |
U82938 | CD27结合蛋白 | 7.5 | 0.26 |
X99584 | SMT3同源物1 | 12.8 | 0.26 |
AK000847 | 未知 | 35.8 | 0.27 |
NM_014463 | Lsm3蛋白 | 7.8 | 0.27 |
AL133645 | 未知 | 50.8 | 0.27 |
X78924 | 锌指蛋白266 | 13.6 | 0.27 |
NM_004304 | 恶性淋巴瘤激酶 | 15.0 | 0.27 |
X57958 | 核糖体蛋白L7 | 27.9 | 0.27 |
U63542 | 未知 | 12.3 | 0.27 |
AK000086 | 假想蛋白 | 8.3 | 0.27 |
X57138 | H2A组氨酸家族成员N | 32.0 | 0.27 |
AB023206 | KIAA0989蛋白 | 6.5 | 0.27 |
AB021641 | 促性腺素诱导性转录遏制物1 | 5.5 | 0.28 |
AF050639 | NADH脱氢酶 | 5.5 | 0.28 |
M62505 | 补体成分5受体1 | 7.5 | 0.28 |
X64364 | basigin | 5.8 | 0.28 |
AJ224082 | 未知 | 22.5 | 0.28 |
AF042165 | 细胞色素c氧化酶 | 20.4 | 0.28 |
AK001472 | anillin | 10.9 | 0.28 |
X86428 | 蛋白磷酸酶2A亚基 | 12.7 | 0.28 |
AF227132 | 候补味觉受体T2R5 | 5.1 | 0.28 |
Z98751 | 未知 | 5.3 | 0.28 |
D21260 | 网格蛋白重多肽 | 8.3 | 0.28 |
AF041474 | 肌动蛋白样6 | 15.1 | 0.28 |
NM_005258 | GTP环水解酶I蛋白 | 7.6 | 0.28 |
L20859 | 溶质载体家族20 | 9.6 | 0.29 |
Z80783 | H2B组蛋白家族成员 | 9.0 | 0.29 |
AB011105 | 层黏连蛋白α5 | 7.1 | 0.29 |
AL008726 | β-半乳糖苷酶的保护蛋白 | 5.2 | 0.29 |
D29012 | 蛋白酶体亚基 | 12.6 | 0.29 |
X63629 | 钙依粘连蛋白3 P-钙依粘连蛋白 | 6.8 | 0.29 |
X02419 | 纤溶酶原激活物尿激酶 | 12.9 | 0.29 |
X13238 | 细胞色素c氧化酶 | 8.0 | 0.29 |
X59798 | 细胞周期蛋白D1 | 12.7 | 0.30 |
D78151 | 蛋白酶体26S亚基 | 7.6 | 0.31 |
AF054185 | 蛋白酶体亚基 | 18.8 | 0.31 |
J03890 | 肺相关的表面活性蛋白C | 5.5 | 0.32 |
M34079 | 蛋白酶体26S亚基 | 5.2 | 0.33 |
[00116]表31:A549细胞中被式A的肽诱导的多聚核苷酸表达的增量调节。发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多聚核苷酸的强度显示在第三列和第四列,它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的cDNA。“ID#:对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
登记号 | 基因 | 对照-Cy3 | 对照-Cy5 | ID5:对照 | ID6:对照 | ID7:对照 | ID8:对照 | ID9:对照 | ID10:对照 |
U12472 | 谷胱甘肽S-转移酶 | 0.09 | 0.31 | 13.0 | 3.5 | 4.5 | 7.0 | 4.3 | 16.4 |
X66403 | 胆碱能受体 | 0.17 | 0.19 | 7.8 | 9.9 | 6.0 | 6.4 | 5.0 | 15.7 |
AK001932 | 未知 | 0.11 | 0.25 | 19.4 | 4.6 | 9.9 | 7.6 | 8.1 | 14.5 |
X58079 | S100钙结合蛋白 | 0.14 | 0.24 | 12.2 | 7.6 | 8.1 | 4.3 | 4.5 | 13.2 |
U18244 | 溶质载体家族1 | 0.19 | 0.20 | 6.1 | 9.7 | 11.9 | 5.0 | 3.7 | 10.6 |
U20648 | 锌指蛋白 | 0.16 | 0.13 | 5.3 | 6.2 | 5.6 | 3.1 | 6.8 | 9.5 |
AB037832 | 未知 | 0.10 | 0.29 | 9.0 | 4.2 | 9.4 | 3.1 | 2.6 | 8.7 |
AC002542 | 未知 | 0.15 | 0.07 | 10.5 | 15.7 | 7.8 | 10.1 | 11.7 | 8.2 |
M89796 | 跨膜4-结构域,亚家族A | 0.15 | 0.14 | 2.6 | 6.1 | 7.6 | 3.5 | 13.3 | 8.1 |
AF042163 | 细胞色素c氧化酶 | 0.09 | 0.19 | 3.9 | 3.2 | 7.6 | 6.3 | 4.9 | 7.9 |
AL032821 | Vanin2 | 0.41 | 0.23 | 2.5 | 5.2 | 3.2 | 2.1 | 4.0 | 7.9 |
U25341 | 褪黑素受体1B | 0.04 | 0.24 | 33.1 | 5.1 | 23.3 | 6.6 | 4.1 | 7.6 |
U52219 | G蛋白偶联性受体 | 0.28 | 0.20 | 2.1 | 6.2 | 6.9 | 2.4 | 3.9 | 7.1 |
X04506 | 载脂蛋白B | 0.29 | 0.32 | 7.9 | 3.4 | 3.3 | 4.8 | 2.6 | 7.0 |
AB011138 | IV型ATP酶 | 0.12 | 0.07 | 3.5 | 12.9 | 6.6 | 6.4 | 21.3 | 6.9 |
AF055018 | 未知 | 0.28 | 0.22 | 3.8 | 6.9 | 5.0 | 2.3 | 3.1 | 6.8 |
AK00203 7 | 假想蛋白 | 0.08 | 0.08 | 2.9 | 7.9 | 14.1 | 7.9 | 20.1 | 6.5 |
AK001024 | 鸟苷酸结合蛋白 | 0.16 | 0.11 | 7.7 | 11.9 | 5.0 | 10.3 | 6.0 | 6.3 |
AF240467 | TLR-7 | 0.11 | 0.10 | 20.4 | 9.0 | 3.4 | 9.4 | 12.9 | 6.1 |
AF105367 | 胰高血糖素样多肽2受体 | 0.15 | 0.35 | 23.2 | 2.6 | 3.0 | 10.6 | 2.9 | 5.7 |
AL009183 | TNFR超家族,成员9 | 0.46 | 0.19 | 10.6 | 4.7 | 3.7 | 2.8 | 6.5 | 5.7 |
X54380 | 孕区带蛋白 | 0.23 | 0.08 | 4.7 | 11.9 | 7.2 | 12.7 | 3.8 | 5.5 |
AL137736 | 未知 | 0.22 | 0.15 | 2.1 | 7.2 | 3.3 | 7.1 | 4.6 | 5.5 |
X05615 | 甲状腺球蛋白 | 0.28 | 0.42 | 6.3 | 2.7 | 7.7 | 2.4 | 3.1 | 5.4 |
D28114 | 髓磷脂相关性蛋白 | 0.24 | 0.08 | 2.5 | 15.9 | 13.0 | 7.1 | 13.7 | 5.4 |
AK000358 | 微纤维缔合蛋白3 | 0.28 | 0.28 | 8.7 | 4.2 | 7.2 | 3.2 | 2.4 | 5.3 |
AK001351 | 未知 | 0.12 | 0.22 | 3.9 | 7.6 | 8.7 | 3.9 | 2.3 | 5.2 |
U79289 | 未知 | 0.14 | 0.27 | 2.5 | 2.7 | 2.8 | 2.0 | 4.3 | 5.1 |
AB014546 | 锌指蛋白 | 0.12 | 0.34 | 6.8 | 2.4 | 4.1 | 2.7 | 2.0 | 5.0 |
AL117428 | DKFZP434A236蛋白 | 0.10 | 0.07 | 2.8 | 16.1 | 12.8 | 9.7 | 14.2 | 4.9 |
AL050378 | 未知 | 0.41 | 0.14 | 3.5 | 8.7 | 11.7 | 3.5 | 7.0 | 4.9 |
AJ250562 | 跨膜4超家族成员2 | 0.13 | 0.10 | 5.2 | 5.7 | 14.2 | 3.8 | 10.3 | 4.8 |
NM_001756 | 皮质类固醇激素结合性球蛋白 | 0.28 | 0.13 | 4.0 | 7.9 | 6.5 | 14.9 | 5.6 | 4.8 |
AL137471 | 假想蛋白 | 0.29 | 0.05 | 3.7 | 18.0 | 6.2 | 7.2 | 16.3 | 4.7 |
M19684 | 蛋白酶抑制物1 | 0.41 | 0.14 | 3.5 | 4.6 | 5.4 | 2.8 | 9.4 | 4.7 |
NM_001963 | 表皮生长因子 | 0.57 | 0.05 | 3.4 | 6.2 | 1.8 | 32.9 | 14.7 | 4.4 |
NM_000910 | 神经肽Y受体 | 0.62 | 0.36 | 3.1 | 2.7 | 2.3 | 2.6 | 3.1 | 4.4 |
AF022212 | Rho GTP酶激活蛋白6 | 0.19 | 0.02 | 9.0 | 45.7 | 25.6 | 12.4 | 72.2 | 4.4 |
AK001674 | Sp1所需的辅助因子 | 0.11 | 0.13 | 8.4 | 6.5 | 7.9 | 4.5 | 7.4 | 4.3 |
U51920 | 信号识别颗粒 | 0.23 | 0.27 | 3.4 | 3.8 | 2.1 | 4.1 | 8.8 | 4.2 |
AK000576 | 假想蛋白 | 0.27 | 0.06 | 4.4 | 14.7 | 7.4 | 14.1 | 8.6 | 4.2 |
AL080073 | 未知 | 0.17 | 0.20 | 21.6 | 3.9 | 4.3 | 8.8 | 2.6 | 4.1 |
U59628 | 成对盒基因9 | 0.34 | 0.06 | 3.4 | 14.1 | 5.4 | 7.9 | 4.9 | 4.1 |
U90658 | 嗜乳汁蛋白,亚家族3,成员A3 | 0.41 | 0.31 | 2.3 | 4.7 | 5.5 | 6.8 | 3.4 | 4.1 |
M19673 | 胱蛋白酶抑制剂SA | 0.43 | 0.26 | 2.3 | 8.5 | 4.5 | 2.5 | 4.1 | 3.8 |
AL161972 | ICAM2 | 0.44 | 0.37 | 2.0 | 3.6 | 2.0 | 2.7 | 5.5 | 3.8 |
X54938 | 肌醇1,4,5-三磷酸3-激酶A | 0.32 | 0.22 | 3.9 | 3.3 | 6.2 | 3.1 | 4.4 | 3.7 |
AB014575 | KIAA0675基因产物 | 0.04 | 0.13 | 46.2 | 4.5 | 10.2 | 8.0 | 6.2 | 3.4 |
M83664 | MHC II,DPβ1 | 0.57 | 0.29 | 2.9 | 2.1 | 2.0 | 3.1 | 6.6 | 3.4 |
AK000043 | 假想蛋白 | 0.34 | 0.14 | 2.7 | 7.1 | 3.7 | 9.4 | 8.8 | 3.3 |
U60666 | 睾丸特异性富含亮氨酸重复单位的蛋白 | 0.21 | 0.11 | 9.9 | 9.0 | 4.1 | 5.5 | 13.0 | 3.3 |
AK000337 | 假想蛋白 | 0.49 | 0.19 | 4.3 | 5.1 | 4.7 | 10.6 | 7.1 | 3.3 |
AF050198 | 推断为线粒体空间蛋白 | 0.34 | 0.15 | 7.0 | 6.3 | 3.6 | 5.6 | 11.9 | 3.3 |
AJ251029 | 气味结合蛋白2A | 0.28 | 0.12 | 4.4 | 9.4 | 7.2 | 8.8 | 7.1 | 3.2 |
X74142 | 分叉头型框G1B | 0.12 | 0.33 | 19.5 | 4.5 | 8.4 | 6.4 | 4.4 | 3.2 |
AB029033 | KIAA1110蛋白 | 0.35 | 0.24 | 3.1 | 2.2 | 5.6 | 5.2 | 3.1 | 3.1 |
D85606 | 缩胆囊肽A受体 | 0.51 | 0.14 | 4.3 | 3.9 | 4.6 | 3.5 | 7.2 | 3.1 |
X84195 | 酰基磷酸酶2肌肉型 | 0.32 | 0.19 | 4.8 | 3.7 | 5.0 | 11.2 | 9.8 | 3.0 |
U57971 | ATP酶钙离子转运细胞质膜3 | 0.29 | 0.13 | 2.2 | 7.9 | 1.8 | 6.3 | 4.8 | 3.0 |
J02611 | 载脂蛋白D | 0.28 | 0.10 | 2.8 | 11.0 | 3.7 | 10.3 | 8.4 | 3.0 |
AF071510 | 卵磷脂视黄醇酰基转移酶 | 0.07 | 0.05 | 7.9 | 3.8 | 11.7 | 46.0 | 16.3 | 3.0 |
AF131757 | 未知 | 0.10 | 0.08 | 4.8 | 9.0 | 44.3 | 9.3 | 10.7 | 3.0 |
L10717 | IL2诱导性T细胞激酶 | 0.45 | 0.21 | 2.5 | 4.9 | 2.8 | 10.9 | 4.5 | 2.9 |
L32961 | 4-氨基丁酸酯氨基转移酶 | 0.64 | 0.32 | 3.6 | 2.9 | 3.2 | 5.3 | 2.3 | 2.9 |
NM_003631 | 多(ADP-核糖)糖水解酶 | 0.46 | 0.41 | 9.7 | 3.9 | 4.1 | 3.8 | 2.8 | 2.7 |
AF098484 | pronaspin A | 0.28 | 0.14 | 3.7 | 3.7 | 5.6 | 11.6 | 3.7 | 2.5 |
NM_009589 | 酰基硫酸酯酶D | 0.73 | 0.16 | 3.2 | 5.6 | 6.0 | 48.6 | 7.2 | 2.4 |
M14764 | TNFR超家族,成员16 | 0.49 | 0.15 | 2.3 | 3.5 | 10.6 | 13.6 | 6.8 | 2.2 |
AL035250 | 内毒素3 | 0.52 | 0.14 | 2.1 | 7.3 | 4.8 | 4.5 | 3.7 | 2.2 |
M97925 | 防御素,α5,帕内特细胞特异性 | 0.33 | 0.07 | 4.0 | 14.7 | 7.8 | 9.4 | 3.5 | 2.1 |
D43945 | 转录因子EC | 0.46 | 0.19 | 6.6 | 2.9 | 8.2 | 4.0 | 3.5 | 2.1 |
D16583 | 组氨酸脱羧酶 | 0.46 | 0.09 | 3.2 | 13.8 | 4.2 | 8.8 | 13.7 | 2.1 |
[00117]表32:A549细胞中被式B的肽诱导的多聚核苷酸表达的增量调节。发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多聚核苷酸的强度显示在第三列和第四列,它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的eDNA。“ID#:对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
登记号 | 基因 | 对照-Cy3 | 对照-Cy5 | ID12:对照 | ID13:对照 | ID14:对照 | ID15:对照 | ID16:对照 | ID17:对照 |
AL157466 | 未知 | 0.05 | 0.06 | 18.0 | 21.4 | 16.7 | 5.2 | 6.8 | 8.6 |
AB023215 | KIAA0998蛋白 | 0.19 | 0.07 | 14.8 | 10.6 | 7.9 | 14.4 | 6.6 | 16.1 |
AL031121 | 未知 | 0.24 | 0.08 | 14.1 | 5.7 | 3.8 | 5.5 | 2.8 | 4.6 |
NM_016331 | 锌指蛋白 | 0.16 | 0.08 | 12.8 | 7.2 | 11.0 | 5.3 | 11.2 | 9.7 |
M14565 | 细胞色素P450 | 0.16 | 0.12 | 10.6 | 12.5 | 5.0 | 3.6 | 10.1 | 6.3 |
U22492 | G蛋白偶联性受体 | 0.28 | 0.07 | 10.4 | 8.9 | 4.8 | 10.8 | 6.6 | 3.6 |
U76010 | 溶质载体家族30 | 0.14 | 0.07 | 9.7 | 18.6 | 3.7 | 4.8 | 5.6 | 8.9 |
AK000685 | 未知 | 0.51 | 0.10 | 9.0 | 3.1 | 2.8 | 3.9 | 15.3 | 3.0 |
AF013620 | 免疫球蛋白重链可变区4-4 | 0.19 | 0.18 | 8.5 | 2.6 | 6.2 | 5.7 | 8.2 | 3.8 |
AL049296 | 未知 | 0.61 | 0.89 | 8.1 | 3.2 | 2.7 | 3.2 | 2.7 | 2.0 |
AB006622 | KIAA0284蛋白 | 0.47 | 0.28 | 7.5 | 5.0 | 2.8 | 11.1 | 5.5 | 4.6 |
X04391 | CD5抗原 | 0.22 | 0.13 | 7.2 | 16.7 | 2.7 | 7.7 | 6.1 | 5.9 |
AK000067 | 假想蛋白 | 0.80 | 0.35 | 7.1 | 4.6 | 2.1 | 3.2 | 8.5 | 2.2 |
AF053712 | TNF超家族成员11 | 0.17 | 0.08 | 6.9 | 17.7 | 3.0 | 6.2 | 12.3 | 5.2 |
X58079 | S100钙结合蛋白A1 | 0.14 | 0.24 | 6.7 | 6.7 | 5.9 | 6.5 | 5.3 | 2.5 |
M91036 | 向纤蛋白_γA | 0.48 | 0.36 | 6.7 | 14.2 | 2.1 | 2.9 | 2.7 | 4.8 |
AF055018 | 未知 | 0.28 | 0.22 | 6.3 | 10.7 | 2.7 | 2.6 | 4.6 | 6.5 |
L17325 | 前T/NK细胞相关蛋白 | 0.19 | 0.29 | 6.1 | 4.4 | 6.5 | 4.7 | 4.0 | 4.0 |
D45399 | 磷酸二酯酶 | 0.21 | 0.18 | 6.1 | 4.6 | 5.0 | 2.8 | 10.8 | 4.0 |
AB023188 | KIAA0971蛋白 | 0.29 | 0.13 | 5.9 | 10.6 | 3.6 | 3.4 | 10.6 | 7.2 |
NM_012177 | F-框蛋白 | 0.26 | 0.31 | 5.9 | 5.5 | 3.8 | 2.8 | 3.0 | 6.8 |
D38550 | E2FTF3 | 0.43 | 0.39 | 5.8 | 3.4 | 2.1 | 4.5 | 2.5 | 2.4 |
AL050219 | 未知 | 0.26 | 0.04 | 5.7 | 17.0 | 3.1 | 9.2 | 30.3 | 16.1 |
AL137540 | 未知 | 0.67 | 0.79 | 5.5 | 3.2 | 3.9 | 10.9 | 2.9 | 2.3 |
D50926 | KIAA0136蛋白 | 0.57 | 0.21 | 5.4 | 5.6 | 2.0 | 3.3 | 4.4 | 3.2 |
AL137658 | 未知 | 0.31 | 0.07 | 5.4 | 12.1 | 2.6 | 10.8 | 3.9 | 8.6 |
U21931 | 果糖二磷酸酶1 | 0.48 | 0.14 | 5.4 | 4.1 | 2.9 | 3.6 | 6.0 | 3.2 |
AK001230 | DKFZP586D211蛋白 | 0.43 | 0.26 | 5.0 | 4.6 | 2.1 | 2.2 | 2.5 | 2.7 |
AL137728 | 未知 | 0.67 | 0.47 | 5.0 | 5.9 | 2.2 | 6.8 | 5.9 | 2.1 |
AB022847 | 未知 | 0.39 | 0.24 | 4.5 | 2.2 | 3.5 | 4.3 | 3.8 | 3.7 |
X75311 | 甲羟戊酸激酶 | 0.67 | 0.22 | 4.3 | 4.0 | 2.0 | 8.3 | 4.0 | 5.1 |
AK000946 | DKFZP566C243蛋白 | 0.36 | 0.29 | 4.1 | 3.8 | 3.9 | 5.4 | 25.8 | 2.7 |
AB023197 | KIAA0980蛋白 | 0.25 | 0.30 | 4.0 | 8.3 | 2.1 | 8.8 | 2.2 | 4.9 |
AB014615 | 成纤维细胞生长因子8 | 0.19 | 0.07 | 3.9 | 3.3 | 7.0 | 3.4 | 2.2 | 7.7 |
X04014 | 未知 | 0.29 | 0.16 | 3.8 | 2.5 | 2.2 | 3.0 | 5.5 | 3.1 |
U76368 | 溶质载体家族7 | 0.46 | 0.17 | 3.8 | 3.8 | 2.8 | 3.2 | 4.2 | 3.0 |
AB032436 | 未知 | 0.14 | 0.21 | 3.8 | 2.7 | 6.1 | 3.2 | 4.5 | 2.6 |
AB020683 | KIAA0876蛋白 | 0.37 | 0.21 | 3.7 | 4.2 | 2.2 | 5.3 | 2.9 | 9.4 |
NM_012126 | 糖类磺基转移酶5 | 0.31 | 0.20 | 3.7 | 5.2 | 3.2 | 3.4 | 3.9 | 2.5 |
AK002037 | 假想蛋白 | 0.08 | 0.08 | 3.7 | 17.1 | 4.6 | 12.3 | 11.0 | 8.7 |
X78712 | 甘油激酶假基因2 | 0.17 | 0.19 | 3.6 | 2.5 | 4.5 | 5.3 | 2.2 | 3.3 |
NM_014178 | HSPC156蛋白 | 0.23 | 0.12 | 3.5 | 8.4 | 2.9 | 6.9 | 14.4 | 5.5 |
AC004079 | 同源框A2 | 0.31 | 0.11 | 3.5 | 7.0 | 2.1 | 2.0 | 7.3 | .9.1 |
AL080182 | 未知 | 0.51 | 0.21 | 3.4 | 3.5 | 2.2 | 2.1 | 2.9 | 2.4 |
M91036 | 血纤蛋白γG | 0.22 | 0.02 | 3.4 | 26.3 | 5.8 | 6.8 | 30.4 | 21.6 |
AJ000512 | 血清/糖皮质激素调节性激酶 | 0.27 | 0.43 | 3.3 | 2.1 | 4.9 | 2.3 | 3.9 | 2.7 |
AK002140 | 假想蛋白 | 0.28 | 0.14 | 3.3 | 9.9 | 2.8 | 2.1 | 16.6 | 7.2 |
AL137284 | 未知 | 0.22 | 0.04 | 3.3 | 7.2 | 4.1 | 6.0 | 12.2 | 3.7 |
Z11898 | POU结构域类型5 TF 1 | 0.12 | 0.29 | 3.2 | 3.7 | 8.2 | 2.5 | 6.6 | 2.2 |
AB017016 | 脑特异性蛋白 | 0.27 | 0.29 | 3.1 | 2.8 | 2.5 | 2.8 | 3.3 | 5.5 |
X54673 | 溶质载体家族6 | 0.34 | 0.08 | 2.9 | 12.0 | 2.2 | 10.4 | 7.4 | 5.9 |
AL033377 | 未知 | 0.40 | 0.22 | 2.6 | 2.6 | 2.6 | 2.3 | 4.5 | 2.2 |
X85740 | CCR4 | 0.34 | 0.05 | 2.6 | 2.3 | 2.6 | 2.5 | 12.5 | 5.2 |
AB010419 | 核心结合蛋白 | 0.59 | 0.20 | 2.5 | 12.8 | 2.0 | 2.8 | 2.9 | 5.9 |
AL109726 | 未知 | 0.14 | 0.15 | 2.3 | 9.0 | 4.3 | 4.4 | 2.6 | 3.7 |
NM_012450 | 硫酸盐转运蛋白1 | 0.15 | 0.10 | 2.2 | 3.1 | 8.2 | 9.9 | 4.7 | 5.9 |
J04599 | 双糖链蛋白聚糖 | 0.39 | 0.30 | 2.1 | 3.3 | 6.6 | 2.2 | 2.7 | 5.4 |
AK000266 | 假想蛋白 | 0.49 | 0.35 | 2.1 | 3.5 | 3.5 | 6.6 | 4.3 | 4.0 |
[00118]表33:A549细胞中被式C的肽诱导的多聚核苷酸表达的增量调节。发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多聚核苷酸的强度显示在第三列和第四列,它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的cDNA。“ID#:对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
登记号 | 基因 | 对照-Cy3 | 对照-Cy5 | ID19:对照 | ID20:对照 | ID21:对照 | ID22:对照 | ID23:对照 | ID24:对照 |
NM_014139 | 电压门控钠通道 | 0.04 | 0.05 | 31.6 | 25.2 | 18.0 | 9.7 | 22.2 | 11.2 |
X84003 | TATA框结合蛋白 | 0.47 | 0.07 | 31.8 | 12.7 | 2.5 | 2.8 | 18.0 | 14.2 |
AF144412 | 晶状体上皮细胞蛋白 | 0.25 | 0.07 | 23.9 | 8.0 | 6.8 | 3.4 | 16.2 | 3.5 |
AL080107 | 未知 | 0.11 | 0.06 | 17.8 | 34.4 | 12.4 | 6.2 | 5.4 | 7.9 |
AF052116 | 未知 | 0.34 | 0.07 | 15.5 | 3.9 | 9.2 | 3.0 | 6.9 | 2.7 |
AB033063 | 未知 | 0.46 | 0.13 | 15.2 | 10.3 | 4.0 | 2.6 | 7.2 | 11.2 |
AK000258 | 假想蛋白 | 0.27 | 0.07 | 13.9 | 8.0 | 3.5 | 3.4 | 26.5 | 11.5 |
NM_006963 | 锌指蛋白 | 0.10 | 0.08 | 12.8 | 6.8 | 6.2 | 5.9 | 17.2 | 1241.2 |
NM_014099 | PRO1768蛋白 | 0.30 | 0.06 | 12.3 | 17.4 | 5.4 | 5.4 | 19.5 | 3.4 |
AK000996 | 假想蛋白 | 0.17 | 0.07 | 10.0 | 8.0 | 9.7 | 7.4 | 20.7 | 16.3 |
M81933 | 细胞分裂周期蛋白25A | 0.13 | 0.21 | 8.8 | 7.8 | 19.6 | 15.6 | 4.8 | 3.8 |
AF181286 | 未知 | 0.05 | 0.22 | 8.8 | 2.7 | 12.0 | 35.6 | 5.9 | 2.3 |
AJ272208 | IL-1R辅助蛋白样2 | 0.22 | 0.17 | 8.8 | 2.9 | 5.0 | 3.2 | 9.8 | 7.3 |
AF030555 | 脂肪酸辅酶A连接酶 | 0.10 | 0.39 | 8.7 | 2.2 | 11.3 | 9.9 | 3.0 | 2.1 |
AL050125 | 未知 | 0.23 | 0.07 | 8.6 | 14.3 | 5.2 | 2.8 | 18.7 | 8.3 |
AB011096 | KIAA0524蛋白 | 0.21 | 0.08 | 8.5 | 24.4 | 4.7 | 6.8 | 10.4 | 7.5 |
J03068 | N-酰氨基酰基-肽水解酶 | 0.54 | 0.21 | 8.3 | 2.4 | 2.2 | 4.1 | 3.0 | 6.0 |
M33906 | II类MHC,DQα1 | 0.14 | 0.08 | 7.6 | 4.5 | 15.2 | 6.1 | 7.5 | 7.9 |
AJ272265 | 分泌磷蛋白 | 0.21 | 0.09 | 7.6 | 9.0 | 3.3 | 4.9 | 18.8 | 14.5 |
J00210 | 干扰素α 13 | 0.41 | 0.07 | 7.2 | 15.0 | 2.8 | 3.1 | 11.0 | 4.3 |
AK001952 | 假想蛋白 | 0.42 | 0.21 | 6.9 | 4.9 | 2.5 | 3.1 | 7.6 | 4.5 |
X54131 | 蛋白酪氨酸磷酸酶,受体型 | 0.09 | 0.20 | 6.4 | 6.5 | 7.7 | 15.0 | 5.6 | 4.1 |
AF064493 | LIM结合结构域2 | 0.46 | 0.14 | 5.9 | 5.6 | 2.2 | 2.9 | 8.5 | 5.8 |
AL117567 | DKFZP566O084蛋白 | 0.44 | 0.22 | 5.8 | 3.3 | 2.9 | 2.3 | 5.7 | 14.9 |
L40933 | 磷酸葡糖变位酶5 | 0.16 | 0.03 | 5.6 | 11.0 | 4.8 | 3.5 | 8.5 | 76.3 |
M27190 | regenerating islet-derived 1 alpha(胰石蛋白)· | 0.19 | 0.28 | 5.3 | 3.0 | 3.8 | 3.6 | 5.8 | 3.6 |
AL031121 | 未知 | 0.24 | 0.09 | 5.3 | 3.8 | 3.2 | 3.9 | 3.0 | 27.9 |
U27655 | G蛋白信号传导的调节物 | 0.24 | 0.29 | 5.0 | 9.0 | 4.5 | 8.3 | 4.2 | 4.5 |
AB037786 | 未知 | 0.12 | 0.03 | 4.7 | 54.1 | 2.8 | 2.3 | 2.2 | 11.0 |
X73113 | 肌球蛋白结合蛋白C | 0.29 | 0.13 | 4.7 | 6.5 | 6.0 | 2.4 | 6.7 | 6.3 |
AB010962 | 基质金属蛋白酶 | 0.08 | 0.12 | 4.7 | 6.2 | 2.4 | 4.7 | 10.9 | 4.2 |
AL096729 | 未知 | 0.36 | 0.13 | 4.7 | 7.7 | 3.2 | 2.4 | 6.3 | 6.2 |
AB018320 | Arg/Abl相互作用性蛋白 | 0.16 | 0.18 | 4.6 | 7.1 | 3.0 | 3.3 | 5.8 | 8.9 |
AK001024 | 鸟苷酸结合蛋白 | 0.16 | 0.11 | 4.6 | 2.0 | 9.8 | 2.6 | 7.6 | 14.1 |
AJ21931 | 未知 | 0.15 | 0.08 | 4.6 | 17.3 | 5.4 | 9.2 | 5.1 | 5.5 |
U21931 | 果糖二磷酸酶1 | 0.48 | 0.14 | 4.6 | 4.3 | 2.6 | 2.1 | 8.4 | 9.6 |
X66403 | 胆碱能受体 | 0.17 | 0.19 | 4.4 | 9.0 | 10.9 | 9.3 | 5.1 | 6.7 |
X67734 | contactin 2 | 0.25 | 0.09 | 4.3 | 6.8 | 3.1 | 5.8 | 7.9 | 8.4 |
U92981 | 未知 | 0.20 | 0.23 | 4.3 | 3.2 | 4.8 | 5.6 | 5.4 | 6.3 |
X68879 | 空气门同源物1 | 0.05 | 0.08 | 4.3 | 2.0 | 12.3 | 2.7 | 5.6 | 4.7 |
AL137362 | 未知 | 0.22 | 0.22 | 4.2 | 4.1 | 2.7 | 4.1 | 9.3 | 4.2 |
NM_001756 | 皮质类固醇激素结合性球蛋白 | 0.28 | 0.13 | 4.4 | 10.6 | 3.9 | 2.7 | 10.3 | 5.5 |
U80770 | 未知 | 0.31 | 0.14 | 4.1 | 4.1 | 23.3 | 2.7 | 7.0 | 10.1 |
AL109792 | 未知 | 0.16 | 0.19 | 4.0 | 4.5 | 4.3 | 8.8 | 8.7 | 3.9 |
X65962 | 细胞色素P450 | 0.33 | 0.05 | 3.8 | 25.3 | 5.7 | 5.1 | 19.8 | 12.0 |
AK001856 | 未知 | 0.40 | 0.21 | 3.8 | 7.0 | 2.6 | 3.1 | 2.9 | 7.8 |
AL022723 | MHC,I类,F | 0.55 | 0.18 | 3.7 | 5.7 | 4.4 | 2.3 | 3.3 | 5.2 |
D38449 | 推定的G蛋白偶联性受体 | 0.18 | 0.09 | 3.5 | 11.1 | 13.3 | 5.8 | 4.8 | 5.2 |
AL137489 | 未知 | 0.74 | 0.26 | 3.3 | 2.9 | 2.6 | 3.3 | 2.5 | 5.4 |
AB000887 | 小分子诱导性细胞因子亚家族A | 0.76 | 0.18 | 3.3 | 5.0 | 2.6 | 2.4 | 5.9 | 10.3 |
NM_012450 | 硫酸盐转运蛋白1 | 0.15 | 0.10 | 3.3 | 9.0 | 10.0 | 10.9 | 4.6 | 8.7 |
U86529 | 谷胱甘肽S-转移酶ζ1 | 0.55 | 0.15 | 3.2 | 6.8 | 4.4 | 2.3 | 9.3 | 5.1 |
AK001244 | 未知 | 0.79 | 0.31 | 3.2 | 5.5 | 2.3 | 2.3 | 3.9 | 2.8 |
AL133602 | 未知 | 0.16 | 0.21 | 3.1 | 7.8 | 8.7 | 2.6 | 4.1 | 5.6 |
AB033080 | 细胞周期进程8蛋白 | 0.31 | 0.31 | 3.1 | 4.6 | 3.0 | 3.5 | 2.2 | 4.2 |
AF023466 | 推定的甘氨酸-N-酰基转移酶 | 0.27 | 0.18 | 3.1 | 5.0 | 4.2 | 7.4 | 10.1 | 3.8 |
AL117457 | 肌动蛋白素(cofilin)2 | 0.68 | 0.53 | 3.0 | 4.6 | 3.3 | 2.4 | 7.4 | 3.4 |
AC007059 | 未知 | 0.37 | 0.35 | 3.0 | 5.7 | 3.1 | 2.4 | 2.6 | 2.4 |
U60179 | 生长激素受体 | 0.34 | 0.21 | 2.9 | 3.5 | 2.3 | 3.1 | 8.0 | 4.7 |
M37238 | 磷脂酶C,γ2 | 0.60 | 0.36 | 2.9 | 2.0 | 3.2 | 2.1 | 2.9 | 4.6 |
L22569 | 组织蛋白酶B | 0.32 | 0.12 | 2.9 | 2.1 | 6.2 | 3.0 | 13.1 | 16.7 |
M80359 | MAP/微管亲和调控激酶3 | 0.37 | 0.76 | 2.9 | 3.1 | 6.1 | 7.6 | 2.1 | 3.3 |
S70348 | 整连蛋白β3 | 0.58 | 0.31 | 2.6 | 4.8 | 4.1 | 2.6 | 2.6 | 2.6 |
L13720 | 生长阻滞特异蛋白6 | 0.36 | 0.26 | 2.4 | 2.5 | 6.8 | 4.8 | 3.9 | 3.7 |
AL049423 | 未知 | 0.33 | 0.30 | 2.4 | 3.7 | 3.8 | 2.8 | 2.9 | 3.4 |
AL050201 | 未知 | 0.68 | 0.29 | 2.2 | 3.1 | 3.7 | 3.0 | 3.0 | 2.2 |
AF050078 | 生长阻滞特异蛋白11 | 0.87 | 0.33 | 2.1 | 8.4 | 2.5 | 2.2 | 2.6 | 4.4 |
AK001753 | 假想蛋白 | 0.53 | 0.28 | 2.1 | 5.0 | 2.2 | 2.8 | 3.6 | 4.6 |
X05323 | 未知 | 0.39 | 0.13 | 2.1 | 7.8 | 2.6 | 2.4 | 21.5 | 3.5 |
AB014548 | KIAA0648蛋白 | 0.61 | 0.30 | 2.0 | 2.4 | 4.8 | 3.4 | 4.9 | 3.9 |
[00119]表34:A549细胞中被式D的肽诱导的多聚核苷酸表达的增量调节。发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多聚核苷酸的强度显示在第三列和第四列,它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的cDNA。“ID#:对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
登记号 | 基因 | 对照-Cy3 | 对照-Cy5 | ID26:对照 | ID27:对照 | ID28:对照 | ID29:对照 | ID30:对照 | ID31:对照 |
U68018 | MAD同源物2 | 0.13 | 0.71 | 11.2 | 2.2 | 8.0 | 2.3 | 6.7 | 25.6 |
NM_016015 | CGI-68蛋白 | 0.92 | 1.59 | 2.3 | 2.3 | 3.5 | 3.7 | 3.4 | 22.9 |
AF071510 | 卵磷脂视黄醇酰基转移酶e | 0.07 | 0.05 | 15.4 | 10.3 | 5.3 | 44.1 | 2.1 | 21.2 |
AC005154 | 未知 | 0.17 | 1.13 | 2.7 | 7.2 | 12.6 | 6.4 | 3.3 | 20.6 |
M81933 | 细胞分裂周期25A | 0.13 | 0.21 | 4.3 | 3.1 | 3.2 | 4.3 | 5.6 | 18.2 |
AF124735 | LIM框基因2 | 0.17 | 0.21 | 2.1 | 4.4 | 5.9 | 5.2 | 7.6 | 17.0 |
AL110125 | 未知 | 0.30 | 0.08 | 5.0 | 2.7 | 6.8 | 10.2 | 2.8 | 12.0 |
NM_004732 | 电压门控钾通道 | 0.15 | 0.16 | 7.6 | 4.0 | 3.4 | 2.2 | 2.9 | 11.4 |
AF030555 | 脂肪酸辅酶A连接酶_长链4 | 0.10 | 0.39 | 10.5 | 2.2 | 6.4 | 3.0 | 5.1 | 10.7 |
AF000237 | 1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶e 2 | 1.80 | 2.37 | 3.4 | 2.5 | 2.4 | 2.1 | 3.7 | 9.9 |
AL031588 | 假想蛋白 | 0.40 | 0.26 | 5.8 | 20.2 | 2.8 | 4.7 | 5.6 | 9.1 |
AL080077 | 未知 | 0.15 | 0.21 | 2.4 | 2.0 | 11.9 | 3.8 | 2.3 | 8.7 |
NM_014366 | 推定为核苷酸结合蛋白_雌二醇诱导性 | 0.90 | 2.52 | 2.4 | 4.3 | 2.4 | 2.6 | 3.0 | 8.6 |
AB002359 | 磷酸核糖甲酰基甘氨脒合成酶 | 0.81 | 2.12 | 3.2 | 2.7 | 5.5 | 2.5 | 2.8 | 6.9 |
U33547 | II类MHC抗原HLA_DRB6 mRNA_ | 0.14 | 0.16 | 2.5 | 5.3 | 4.5 | 5.0 | 3.1 | 6.6 |
AL133051 | 未知 | 0.09 | 0.07 | 7.7 | 6.3 | 5.4 | 23.1 | 5.4 | 6.5 |
AK000576 | 假想蛋白 | 0.27 | 0.06 | 7.1 | 9.3 | 5.0 | 6.9 | 2.9 | 6.2 |
AF042378 | 纺锤体极体蛋白 | 0.36 | 0.39 | 3.3 | 3.0 | 9.5 | 4.5 | 3.4 | 6.2 |
AF093265 | Homer神经元即刻早期基因_3 | 0.67 | 0.53 | 2.7 | 13.3 | 6.5 | 5.0 | 2.9 | 6.2 |
D80000 | 有丝分裂染色体的分离1 | 1.01 | 1.56 | 3.6 | 2.5 | 4.9 | 3.2 | 6.3 | 6.1 |
AF035309 | 蛋白酶体26S亚基ATP酶5 | 3.61 | 4.71 | 2.7 | 6.6 | 5.2 | 4.9 | 2.7 | 6.0 |
M34175 | 连接蛋白相关性蛋白复合物2 β 1亚基 | 4.57 | 5.13 | 3.2 | 3.1 | 4.0 | 4.6 | 2.7 | 6.0 |
AB020659 | KIAA0852蛋白 | 0.18 | 0.37 | 4.1 | 7.6 | 5.7 | 4.8 | 2.5 | 5.7 |
NM_004862 | LPS诱导性TNF α因子 | 2.61 | 3.36 | 3.8 | 4.8 | 4.1 | 4.9 | 3.2 | 5.6 |
U00115 | 锌指蛋白51 | 0.51 | 0.07 | 18.9 | 2.2 | 3.5 | 7.2 | 21.2 | 5.6 |
AF088868 | fibrousheathin II | 0.45 | 0.20 | 4.7 | 10.0 | 3.2 | 6.4 | 6.0 | 5.6 |
AK001890 | 未知 | 0.42 | 0.55 | 2.4 | 3.5 | 3.6 | 2.3 | 2.2 | 5.6 |
AL137268 | KIAA0759蛋白 | 0.49 | 0.34 | 3.8 | 2.3 | 5.0 | 3.5 | 3.3 | 5.4 |
X63563 | 聚合酶II多肽B | 1.25 | 1.68 | 2.5 | 8.1 | 3.4 | 4.8 | 5.2 | 5.4 |
D12676 | CD36抗原 | 0.35 | 0.39 | 2.9 | 3.4 | 2.6 | 2.2 | 3.5 | 5.3 |
AK000161 | 假想蛋白 | 1.06 | 0.55 | 3.4 | 8.7 | 2.1 | 6.7 | 2.9 | 5.1 |
AF052138 | 未知 | 0.64 | 0.51 | 2.9 | 2.8 | 2.7 | 5.2 | 3.6 | 5.0 |
AL096803 | 未知 | 0.36 | 0.03 | 20.1 | 18.3 | 3.7 | 19.3 | 16.1 | 4.9 |
S49953 | DNA结合转录激活物 | 0.70 | 0.15 | 3.7 | 4.0 | 2.1 | 6.6 | 4.0 | 4.8 |
X89399 | RAS p21蛋白激活物 | 0.25 | 0.10 | 8.5 | 14.9 | 4.8 | 18.6 | 4.3 | 4.8 |
AJ005273 | recA蛋白的抗原决定簇 | 0.70 | 0.10 | 7.6 | 11.1 | 2.8 | 9.9 | 12.0 | 4.6 |
AK001154 | 假想蛋白 | 1.70 | 0.96 | 2.4 | 4.4 | 2.9 | 8.9 | 2.4 | 4.5 |
AL133605 | 未知 | 0.26 | 0.15 | 12.4 | 4.2 | 4.4 | 3.3 | 3.3 | 4.1 |
U71092 | G蛋白偶联性受体24 | 0.53 | 0.06 | 19.0 | 9.1 | 2.2 | 12.0 | 3.3 | 4.1 |
AF074723 | RNA聚合物II转录调节介质 | 0.67 | 0.54 | 4.0 | 3.2 | 3.1 | 3.4 | 6.0 | 4.0 |
AL137577 | 未知 | 0.32 | 0.12 | 31.4 | 6.2 | 5.3 | 10.1 | 25.3 | 3.9 |
AF151043 | 假想蛋白 | 0.48 | 0.35 | 2.6 | 2.2 | 2.0 | 3.3 | 2.2 | 3.8 |
AF131831 | 未知 | 0.67 | 0.81 | 2.1 | 7.0 | 3.5 | 3.2 | 3.9 | 3.7 |
D50405 | 组氨酸脱乙酰基酶1 | 1.52 | 1.62 | 3.1 | 7.2 | 2.9 | 4.1 | 2.8 | 3.7 |
U78305 | 蛋白质磷酸酶1D | 1.21 | 0.20 | 4.7 | 13.0 | 3.5 | 5.9 | 4.2 | 3.7 |
AL035562 | 成对框基因1 | 0.24 | 0.01 | 30.2 | 81.9 | 5.6 | 82.3 | 6.2 | 3.7 |
U67156 | 促细胞分裂剂激活性蛋白激酶激酶激酶5 | 1.15 | 0.30 | 6.6 | 3.0 | 2.2 | 2.3 | 2.5 | 3.6 |
AL031121 | 未知 | 0.24 | 0.09 | 5.2 | 3.7 | 2.3 | 6.5 | 9.1 | 3.6 |
U13666 | G蛋白偶联性受体1 | 0.34 | 0.14 | 3.8 | 5.4 | 3.1 | 3.3 | 2.8 | 3.6 |
AB018285 | KIAA0742蛋白 | 0.53 | 0.13 | 14.9 | 13.9 | 5.9 | 18.5 | 15.2 | 3.5 |
D42053 | 位点1蛋白酶 | 0.63 | 0.40 | 2.6 | 7.1 | 5.6 | 9.2 | 2.6 | 3.5 |
AK001135 | Sec23相互作用性蛋白p125 | 0.29 | 0.53 | 5.7 | 4.5 | 3.4 | 2.6 | 11.3 | 3.4 |
AL137461 | 未知 | 0.25 | 0.02 | 23.8 | 9.0 | 2.7 | 59.2 | 12.5 | 3.3 |
NM_006963 | 锌指蛋白22 | 0.10 | 0.08 | 3.2 | 7.6 | 3.7 | 7.9 | 11.2 | 3.2 |
AL137540 | 未知 | 0.67 | 0.79 | 3.9 | 2.6 | 5.6 | 4.2 | 3.5 | 3.1 |
AL137718 | 未知 | 0.95 | 0.18 | 4.7 | 8.0 | 4.0 | 13.3 | 3.0 | 3.1 |
AF012086 | RNA结合蛋白2样1 | 1.20 | 0.59 | 4.6 | 4.0 | 2.0 | 4.6 | 3.6 | 3.1 |
S57296 | HER2/neu受体 | 0.59 | 0.17 | 7.3 | 12.1 | 2.3 | 20.0 | 22.2 | 3.0 |
NM_013329 | 富含GC序列DNA结合因子候补物 | 0.16 | 0.08 | 6.9 | 14.3 | 9.7 | 3.3 | 7.2 | 3.0 |
AF038664 | UDP-Gal:β GlcN Acβ1_4-半乳糖基转移酶 | 0.15 | 0.03 | 13.4 | 22.2 | 5.4 | 15.8 | 17.6 | 3.0 |
AF080579 | 人类整合性膜蛋白 | 0.34 | 1.03 | 3.3 | 3.0 | 6.7 | 2.1 | 2.9 | 2.9 |
AK001075 | 假想蛋白 | 0.67 | 0.10 | 2.1 | 2.6 | 2.6 | 8.9 | 2.2 | 2.9 |
AB011124 | KIAA0552基因产物 | 0.46 | 0.04 | 9.6 | 72.0 | 6.0 | 33.9 | 13.6 | 2.9 |
J03068 | N-酰氨基酰基-肽水解酶 | 0.54 | 0.21 | 2.2 | 5.0 | 2.4 | 5.2 | 3.6 | 2.8 |
D87120 | 造骨细胞蛋白 | 0.87 | 0.87 | 2.2 | 2.0 | 4.7 | 2.3 | 2.0 | 2.8 |
AB006537 | IL-1R辅助蛋白 | 0.17 | 0.07 | 2.9 | 7.0 | 14.5 | 5.3 | 6.6 | 2.8 |
L34587 | 转录延伸因子B | 2.49 | 1.23 | 2.2 | 16.3 | 5.0 | 15.8 | 5.5 | 2.7 |
D31891 | SET结构域_分叉_1 | 1.02 | 0.29 | 3.9 | 6.0 | 4.3 | 4.9 | 6.6 | 2.7 |
D00760 | 蛋白酶体亚基_α型_2 | 4.97 | 4.94 | 4.1 | 2.6 | 2.0 | 2.8 | 2.7 | 2.7 |
AC004774 | distal-less同源框5 | 0.25 | 0.12 | 2.3 | 6.3 | 3.8 | 5.2 | 5.2 | 2.6 |
AL024493 | 未知 | 1.46 | 0.54 | 4.8 | 13.5 | 2.1 | 11.6 | 6.8 | 2.6 |
AB014536 | copine III | 1.80 | 1.29 | 3.2 | 9.5 | 3.8 | 6.8 | 2.6 | 2.6 |
X59770 | IL-1R型II | 0.59 | 0.16 | 9.6 | 4.7 | 3.9 | 3.2 | 4.9 | 2.5 |
AF052183 | 未知 | 0.65 | 0.76 | 4.0 | 3.7 | 2.3 | 5.0 | 3.0 | 2.5 |
AK000541 | 假想蛋白 | 0.92 | 0.27 | 4.5 | 13.9 | 3.6 | 18.1 | 4.3 | 2.5 |
U88528 | cAMP应答元件结合蛋白 | 1.37 | 0.86 | 3.1 | 5.4 | 2.1 | 2.8 | 2.1 | 2.4 |
M97925 | 防御素α5_帕内特细胞特异性 | 0.33 | 0.07 | 4.6 | 35.9 | 2.0 | 7.8 | 6.5 | 2.4 |
NM_013393 | 细胞分裂蛋白FtsJ | 1.38 | 0.94 | 3.1 | 5.8 | 2.1 | 4.2 | 2.6 | 2.3 |
X62744 | II类MHC DMα | 0.86 | 0.32 | 4.0 | 4.7 | 2.3 | 2.9 | 6.1 | 2.3 |
AF251040 | 推定为细胞核蛋白 | 0.64 | 0.30 | 6.7 | 3.4 | 2.9 | 3.9 | 5.7 | 2.2 |
AK000227 | 假想蛋白 | 1.49 | 0.43 | 3.4 | 7.1 | 2.3 | 3.3 | 9.1 | 2.1 |
U88666 | SFRS蛋白激酶2 | 1.78 | 0.37 | 3.4 | 5.9 | 2.6 | 8.4 | 6.1 | 2.0 |
[00120]表35:A549细胞中被式E的肽诱导的多聚核苷酸表达的增量调节。发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多聚核苷酸的强度显示在第三列和第四列,它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的cDNA。“ID#:对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
登记号 | 基因 | 对照-Cy3 | 对照-Cy5 | ID33:对照 | ID34:对照 | ID35:对照 | ID36:对照 | ID37:对照 | ID38:对照 |
AL049689 | 新的人mRNA | 0.25 | 0.05 | 2.7 | 26.5 | 3.3 | 21.7 | 5.4 | 37.9 |
AK000576 | 假想蛋白 | 0.27 | 0.06 | 3.0 | 19.1 | 3.9 | 23.0 | 3.1 | 28.3 |
X74837 | 甘露糖苷酶,α类1A成员1 | 0.10 | 0.07 | 5.6 | 10.0 | 10.8 | 12.3 | 12.0 | 19.9 |
AK000258 | 假想蛋白 | 0.27 | 0.07 | 14.0 | 11.1 | 7.9 | 16.1 | 6.2 | 18.9 |
X89067 | 瞬时受体 | 0.20 | 0.14 | 3.7 | 2.2 | 2.4 | 2.6 | 8.0 | 18.1 |
AL137619 | 未知 | 0.16 | 0.08 | 6.3 | 6.7 | 10.8 | 10.5 | 7.9 | 16.5 |
NM_003445 | 锌指蛋白 | 0.17 | 0.07 | 4.0 | 23.6 | 2.9 | 13.6 | 4.3 | 14.4 |
X03084 | 补体成分1 | 0.36 | 0.15 | 2.4 | 3.1 | 2.9 | 7.7 | 3.4 | 13.7 |
U27330 | 岩藻糖基转移酶5 | 0.39 | 0.08 | 2.4 | 2.5 | 2.6 | 12.1 | 3.5 | 13.0 |
AF070549 | 未知 | 0.16 | 0.09 | 2.7 | 4.7 | 7.9 | 10.3 | 4.2 | 12.6 |
AB020335 | sel-1样 | 0.19 | 0.24 | 2.9 | 2.6 | 2.0 | 7.3 | 4.7 | 12.4 |
M26901 | 肾素 | 0.09 | 0.12 | 14.9 | 2.2 | 7.3 | 12.0 | 20.8 | 12.0 |
Y07828 | 锌指蛋白 | 0.09 | 0.06 | 9.0 | 26.6 | 8.9 | 16.0 | 3.6 | 11.6 |
AK001848 | 假想蛋白 | 0.21 | 0.07 | 6.2 | 8.2 | 2.7 | 5.2 | 5.5 | 10.9 |
NM_016331 | 锌指蛋白 | 0.16 | 0.08 | 7.6 | 5.1 | 7.0 | 25.5 | 5.5 | 10.9 |
U75330 | 神经细胞黏附分子2 | 0.42 | 0.08 | 2.5 | 3.6 | 2.0 | 5.8 | 6.2 | 9.9 |
AB037826 | 未知 | 0.16 | 0.11 | 3.8 | 6.0 | 3.4 | 13.4 | 6.0 | 9.8 |
M34041 | 肾上腺素能α-2B受体 | 0.30 | 0.13 | 4.5 | 4.5 | 3.7 | 8.6 | 5.6 | 9.8 |
D38449 | 推定为G蛋白偶联性受体 | 0.18 | 0.09 | 2.3 | 25.8 | 11.7 | 2.3 | 3.2 | 9.5 |
AJ250562 | 跨膜4超家族成员2 | 0.13 | 0.10 | 10.0 | 8.4 | 2.2 | 8.1 | 16.3 | 9.1 |
AK001807 | 假想蛋白 | 0.18 | 0.12 | 4.2 | 5.3 | 4.6 | 3.2 | 4.0 | 8.3 |
AL133051 | 未知 | 0.09 | 0.07 | 5.1 | 13.6 | 6.0 | 9.1 | 2.2 | 8.2 |
U43843 | 神经-d4同源物 | 0.61 | 0.10 | 2.0 | 6.4 | 2.3 | 16.6 | 2.2 | 8.1 |
NM_013227 | 软骨聚集蛋白聚糖1 | 0.28 | 0.15 | 7.5 | 3.1 | 2.5 | 6.9 | 8.5 | 7.8 |
AF226728 | 生长激素抑制素受体相互作用性蛋白 | 0.23 | 0.17 | 7.0 | 3.6 | 3.1 | 5.5 | 3.5 | 7.7 |
AK001024 | 鸟苷酸结合蛋白 | 0.16 | 0.11 | 0.39 | 12.3 | 2.7 | 7.4 | 3.3 | 7.0 |
AC002302 | 未知 | 0.13 | 0.14 | 16.1 | 5.8 | 5.8 | 2.6 | 9.6 | 6.2 |
AB007958 | 未知 | 0.17 | 0.27 | 2.0 | 2.3 | 11.3 | 3.3 | 3.0 | 6.1 |
AF059293 | 细胞因子受体样因子1 | 0.19 | 0.22 | 3.6 | 2.5 | 10.2 | 3.8 | 2.7 | 5.9 |
V01512 | v-fos | 0.27 | 0.21 | 6.7 | 3.7 | 13.7 | 9.3 | 3.7 | 5.4 |
U82762 | 唾液酸转移酶8 | 0.23 | 0.15 | 3.2 | 6.5 | 2.7 | 9.2 | 5.7 | 5.4 |
U44059 | 促甲状腺胚胎因子 | 0.05 | 0.13 | 22.9 | 7.1 | 12.5 | 7.4 | 9.7 | 5.4 |
X05323 | 由单克隆抗体确认的抗原 | 0.39 | 0.13 | 4.3 | 2.5 | 2.2 | 7.4 | 2.8 | 5.1 |
U72671 | ICAM5 | 0.25 | 0.14 | 5.3 | 2.7 | 3.7 | 10.0 | 3.2 | 4.8 |
AL133626 | 假想蛋白 | 0.26 | 0.25 | 2.2 | 4.2 | 2.9 | 3.0 | 2.6 | 4.7 |
X96401 | MAX结合蛋白 | 0.31 | 0.29 | 6.9 | 2.3 | 4.9 | 3.1 | 2.9 | 4.6 |
AL117533 | 未知 | 0.05 | 0.26 | 8.2 | 2.7 | 11.1 | 2.5 | 11.9 | 4.5 |
AK001550 | 假想蛋白 | 0.10 | 0.30 | 8.0 | 2.0 | 4.9 | 2.1 | 7.8 | 4.5 |
AB032436 | 人类BNP1 mRNA | 0.14 | 0.21 | 5.1 | 2.2 | 9.1 | 4.5 | 6.4 | 4.4 |
AL035447 | 假想蛋白 | 0.28 | 0.23 | 4.3 | 3.7 | 8.7 | 5.2 | 3.7 | 4.2 |
U09414 | 锌指蛋白 | 0.28 | 0.25 | 4.0 | 2.2 | 4.7 | 3.3 | 7.2 | 4.2 |
AK001256 | 未知 | 0.09 | 0.08 | 5.3 | 6.5 | 31.1 | 12.7 | 6.4 | 4.1 |
L14813 | 羧酸酯连接酶样 | 0.64 | 0.21 | 2.7 | 6.2 | 3.1 | 2.1 | 3.4 | 3.9 |
AF038181 | 未知 | 0.06 | 0.18 | 34.1 | 6.4 | 4.5 | 8.7 | 11.3 | 3.9 |
NM_001486 | 葡糖激酶 | 0.21 | 0.08 | 3.0 | 2.2 | 6.5 | 12.4 | 5.7 | 3.9 |
AB033000 | 假想蛋白 | 0.24 | 0.22 | 3.4 | 3.3 | 7.1 | 5.5 | 4.5 | 3.8 |
AL117567 | DKFZP566O084蛋白 | 0.44 | 0.22 | 2.2 | 2.7 | 3.9 | 4.0 | 4.5 | 3.7 |
NM_012126 | 糖类磺基转移酶5 | 0.31 | 0.20 | 5.5 | 5.4 | 3.8 | 5.5 | 2.6 | 3.5 |
AL031687 | 未知 | 0.16 | 0.27 | 5.9 | 2.6 | 3.4 | 2.3 | 4.9 | 3.5 |
X04506 | 载脂蛋白B | 0.29 | 0.32 | 5.4 | 4.4 | 6.9 | 5.5 | 2.1 | 3.5 |
NM_006641 | CCR9 | 0.35 | 0.11 | 3.3 | 3.3 | 2.2 | 16.5 | 2.3 | 3.5 |
Y00970 | 顶体蛋白酶 | 0.12 | 0.14 | 8.2 | 8.8 | 3.1 | 6.2 | 17.5 | 3.4 |
X67098 | rTSβ蛋白 | 0.19 | 0.26 | 2.4 | 3.1 | 7.8 | 3.5 | 4.4 | 3.3 |
U51990 | 前mRNA剪接因子 | 0.56 | 0.19 | 2.2 | 3.0 | 2.8 | 13.7 | 2.9 | 3.0 |
AF030555 | 脂肪酸辅酶A | 0.10 | 0.39 | 3.5 | 6.9 | 13.3 | 4.4 | 7.5 | 2.9 |
AL009183 | TNFR超家族,成员9 | 0.46 | 0.19 | 6.0 | 4.1 | 2.8 | 8.6 | 2.6 | 2.8 |
AF045941 | sciellin | 0.16 | 0.21 | 11.6 | 2.4 | 2.8 | 2.2 | 4.1 | 2.8 |
AF072756 | 激酶锚蛋白4 | 0.33 | 0.07 | 2.5 | 5.3 | 3.9 | 32.7 | 2.3 | 2.7 |
X78678 | 己酮激酶 | 0.10 | 0.20 | 18.0 | 3.5 | 4.1 | 2.5 | 14.6 | 2.6 |
AL031734 | 未知 | 0.03 | 0.39 | 43.7 | 2.3 | 41.7 | 4.0 | 10.8 | 2.5 |
D87717 | KIAA0013基因产物 | 0.35 | 0.42 | 4.2 | 2.3 | 3.6 | 2.6 | 2.9 | 2.5 |
U01824 | 溶质载体家族1 | 0.42 | 0.29 | 4.8 | 2.3 | 4.2 | 7.1 | 4.2 | 2.4 |
AF055899 | 溶质载体家族27 | 0.14 | 0.31 | 9.5 | 12.3 | 7.4 | 4.7 | 6.6 | 2.3 |
U22526 | 羊毛甾醇合成酶 | 0.09 | 0.45 | 4.1 | 3.4 | 10.4 | 2.2 | 17.9 | 2.3 |
AB032963 | 未知 | 0.19 | 0.34 | 6.3 | 6.1 | 2.9 | 2.1 | 5.7 | 2.2 |
NM_015974 | λ-晶体蛋白 | 0.17 | 0.25 | 11.4 | 2.8 | 5.9 | 2.4 | 5.8 | 2.2 |
X82200 | 受激的反式作用因子 | 0.23 | 0.15 | 8.2 | 3.4 | 3.0 | 2.8 | 11.3 | 2.2 |
AL137522 | 未知 | 0.12 | 0.26 | 12.1 | 3.7 | 12.6 | 6.9 | 4.3 | 2.2 |
Z99916 | 晶体蛋白,β B3 | 0.28 | 0.65 | 2.5 | 2.1 | 3.6 | 2.2 | 2.6 | 2.1 |
AF233442 | 泛蛋白特异性蛋白酶21 | 0.41 | 0.31 | 2.6 | 3.6 | 3.6 | 4.5 | 3.4 | 2.1 |
AK001927 | 假想蛋白 | 0.24 | 0.52 | 7.6 | 5.6 | 5.0 | 2.5 | 4.1 | 2.0 |
[00121]表36:A549细胞中被式F的肽诱导的多聚核苷酸表达的增量调节。发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多聚核苷酸的强度显示在第三列和第四列,它们分别对应于用染料Cy3和Cy5标记的cDNA。“比值ID#:对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
登记号 | 基因 | 对照-Cy3 | 对照-Cy5 | 比值ID40:对照 | 比值ID42:对照 | 比值ID43:对照 | 比值ID44:对照 | 比值ID45:对照 |
AF025840 | 聚合酶ε2 | 0.34 | 0.96 | 3.4 | 2.0 | 2.0 | 2.1 | 4.3 |
AF132495 | CGI-133蛋白 | 0.83 | 0.67 | 3.0 | 2.2 | 2.6 | 2.8 | 5.1 |
AL137682 | 假想蛋白 | 0.73 | 0.40 | 2.0 | 5.3 | 4.8 | 2.9 | 8.2 |
U70426 | G蛋白信号传导的调节物16 | 0.23 | 0.25 | 3.1 | 3.0 | 5.3 | 3.1 | 12.2 |
AK001135 | Sec23相互作用性蛋白p125 | 0.29 | 0.53 | 3.2 | 2.6 | 3.3 | 14.4 | 5.2 |
AB023155 | KIAA0938蛋白 | 0.47 | 0.21 | 2.7 | 4.8 | 8.1 | 4.2 | 10.4 |
AB033080 | 细胞周期进程8蛋白 | 0.31 | 0.31 | 4.4 | 2.2 | 5.9 | 4.3 | 6.9 |
AF061836 | Ras关联结构域家族1 | 0.29 | 0.31 | 3.2 | 2.5 | 11.1 | 18.8 | 6.8 |
AK000298 | 假想蛋白 | 0.48 | 0.27 | 3.3 | 2.2 | 7.1 | 5.6 | 7.7 |
L75847 | 锌指蛋白 | 0.35 | 0.52 | 3.2 | 3.0 | 4.0 | 3.0 | 3.9 |
X97267 | 蛋白酪氨酸磷酸酶 | 0.19 | 0.24 | 4.1 | 9.3 | 2.4 | 4.2 | 8.3 |
Z11933 | POU结构域类3 TF 2 | 0.09 | 0.23 | 8.7 | 2.5 | 3.6 | 4.3 | 8.2 |
AB037744 | 未知 | 0.37 | 0.57 | 2.6 | 2.9 | 2.7 | 3.0 | 3.1 |
U90908 | 未知 | 0.12 | 0.16 | 11.8 | 7.7 | 3.4 | 7.8 | 11.2 |
AL050139 | 未知 | 0.29 | 0.60 | 5.2 | 2.4 | 3.3 | 3.0 | 2.8 |
AB014615 | 成纤维细胞生长因子8 | 0.19 | 0.07 | 5.4 | 3.5 | 8.5 | 3.2 | 22.7 |
M28825 | CD1A抗原 | 0.51 | 0.36 | 4.1 | 2.6 | 2.0 | 4.6 | 4.4 |
U27330 | 岩藻糖基转移酶5 | 0.39 | 0.08 | 3.3 | 2.1 | 24.5 | 8.2 | 19.3 |
NM_006963 | 锌指蛋白 | 0.10 | 0.08 | 10.4 | 12.6 | 12.3 | 29.2 | 20.5 |
AF093670 | 过氧化物酶体生物发生因子 | 0.44 | 0.53 | 4.0 | 2.6 | 2.6 | 4.3 | 2.9 |
AK000191 | 假想蛋白 | 0.50 | 0.18 | 2.3 | 3.6 | 4.4 | 2.2 | 8.2 |
AB022847 | 未知 | 0.39 | 0.24 | 2.1 | 6.9 | 4.5 | 2.8 | 6.2 |
AK000358 | 微纤维缔合蛋白3 | 0.28 | 0.28 | 5.7 | 2.0 | 3.5 | 5.2 | 5.2 |
X74837 | 甘露糖酶_α类1A | 0.10 | 0.07 | 13.1 | 18.4 | 23.6 | 16.3 | 20.8 |
AF053712 | TNF超家族成员11 | 0.17 | 0.08 | 11.3 | 9.3 | 13.4 | 10.6 | 16.6 |
AL133114 | DKFZP586P2421蛋白 | 0.11 | 0.32 | 8.5 | 3.4 | 4.9 | 5.3 | 4.3 |
AF049703 | E74样因子5 | 0.22 | 0.24 | 5.1 | 6.0 | 3.3 | 2.7 | 5.4 |
AL137471 | 假想蛋白 | 0.29 | 0.05 | 4.0 | 15.0 | 10.1 | 2.7 | 25.3 |
AL035397 | 未知 | 0.33 | 0.14 | 2.3 | 2.8 | 10.6 | 4.6 | 9.3 |
AL035447 | 假想蛋白 | 0.28 | 0.23 | 3.8 | 6.8 | 2.7 | 3.0 | 5.7 |
X55740 | CD73 | 0.41 | 0.61 | 2.1 | 3.3 | 2.9 | 3.2 | 2.1 |
NM_004909 | 紫杉醇抗性相关基因3 | 0.20 | 0.22 | 3.9 | 2.9 | 6.5 | 3.2 | 5.6 |
AF233442 | 泛蛋白特异性蛋白酶 | 0.41 | 0.31 | 2.9 | 4.7 | 2.7 | 3.5 | 3.9 |
U92980 | 未知 | 0.83 | 0.38 | 4.2 | 4.1 | 4.8 | 2.3 | 3.1 |
AF105424 | 肌球蛋白重多肽样 | 0.30 | 0.22 | 2.8 | 3.3 | 4.4 | 2.3 | 5.3 |
M26665 | histatin3 | 0.29 | 0.26 | 7.9 | 3.5 | 4.6 | 3.5 | 4.5 |
AF083898 | 神经肿瘤腹侧抗原2 | 0.20 | 0.34 | 18.7 | 3.8 | 2.2 | 3.6 | 3.5 |
AJ009771 | ariadne_果蝇_同源物 | 0.33 | 0.06 | 2.3 | 17.6 | 15.9 | 2.5 | 20.3 |
AL022393 | 假想蛋白P1 | 0.05 | 0.33 | 32.9 | 2.4 | 3.0 | 69.4 | 3.4 |
AF039400 | 钙激活的氯离子通道家族成员1 | 0.11 | 0.19 | 8.4 | 2.9 | 5.1 | 18.1 | 5.9 |
AJ012008 | 二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶 | 0.42 | 0.43 | 5.1 | 3.3 | 3.2 | 6.2 | 2.6 |
AK000542 | 假想蛋白 | 0.61 | 0.24 | 2.1 | 4.5 | 5.0 | 3.7 | 4.4 |
AL133654 | 未知 | 0.27 | 0.40 | 2.8 | 2.1 | 2.5 | 2.5 | 2.6 |
AL137513 | 未知 | 0.43 | 0.43 | 6.4 | 3.2 | 3.8 | 2.3 | 2.3 |
U05227 | GTP结合蛋白 | 0.38 | 0.36 | 5.0 | 3.1 | 3.1 | 2.2 | 2.8 |
D38449 | 推定为G蛋白偶联性受体 | 0.18 | 0.09 | 5.8 | 6.7 | 6.7 | 9.1 | 10.4 |
U80770 | 未知 | 0.31 | 0.14 | 3.9 | 3.8 | 6.6 | 3.1 | 6.8 |
X61177 | IL-5Rα | 0.40 | 0.27 | 2.6 | 4.4 | 9.8 | 8.1 | 3.6 |
U35246 | 囊泡分选蛋白45A | 0.15 | 0.42 | 5.8 | 2.8 | 2.6 | 4.5 | 2.2 |
AB017016 | 脑特异性蛋白p25α | 0.27 | 0.29 | 6.0 | 2.6 | 3.4 | 3.1 | 3.1 |
X82153 | 组织蛋白酶K | 0.45 | 0.20 | 4.2 | 5.2 | 4.8 | 4.4 | 4.6 |
AC005162 | 很可能为羧肽酶前体 | 0.12 | 0.28 | 11.9 | 3.4 | 6.8 | 18.7 | 3.2 |
AL137502 | 未知 | 0.22 | 0.16 | 3.9 | 4.9 | 7.3 | 3.9 | 5.3 |
U66669 | 3-羟基异丁酰辅酶A水解酶 | 0.30 | 0.40 | 10.3 | 3.5 | 5.2 | 2.3 | 2.1 |
AK000102 | 未知 | 0.39 | 0.30 | 2.8 | 5.3 | 5.2 | 4.1 | 2.8 |
AF034970 | 对接蛋白2 | 0.28 | 0.05 | 3.3 | 8.5 | 15.7 | 4.0 | 17.3 |
AK000534 | 假想蛋白 | 0.13 | 0.29 | 6.8 | 2.3 | 4.0 | 20.6 | 2.9 |
J04599 | 双糖链蛋白聚糖 | 0.39 | 0.30 | 4.0 | 3.7 | 4.0 | 4.8 | 2.8 |
AL133612 | 未知 | 0.62 | 0.33 | 2.7 | 3.4 | 5.2 | 3.0 | 2.5 |
D10495 | 蛋白激酶C δ | 0.18 | 0.10 | 12.0 | 20.7 | 8.7 | 6.8 | 8.1 |
X58467 | 细胞色素P450 | 0.07 | 0.24 | 15.4 | 4.7 | 7.9 | 34.4 | 3.4 |
AF131806 | 未知 | 0.31 | 0.25 | 2.6 | 3.4 | 5.7 | 7.0 | 3.2 |
AK000351 | 假想蛋白 | 0.34 | 0.13 | 4.0 | 6.9 | 5.5 | 2.8 | 6.3 |
AF075050 | 假想蛋白 | 0.55 | 0.09 | 2.7 | 17.8 | 5.1 | 2.2 | 8.3 |
AK000566 | 假想蛋白未知 | 0.15 | 0.35 | 6.7 | 2.2 | 6.8 | 6.4 | 2.1 |
U43328 | 软骨连接蛋白1 | 0.44 | 0.19 | 2.5 | 6.2 | 6.9 | 7.8 | 3.8 |
AF045941 | sciellin | 0.16 | 0.21 | 6.8 | 7.5 | 4.8 | 6.9 | 3.4 |
U27655 | G蛋白信号传导的调节物3 | 0.24 | 0.29 | 5.5 | 4.9 | 2.9 | 4.9 | 2.4 |
AK000058 | 假想蛋白 | 0.25 | 0.15 | 5.0 | 9.7 | 16.4 | 2.7 | 4.5 |
AL035364 | 假想蛋白 | 0.32 | 0.26 | 4.4 | 4.2 | 7.3 | 2.8 | 2.6 |
AK001864 | 未知 | 0.40 | 0.25 | 3.7 | 3.7 | 4.6 | 3.2 | 2.6 |
AB015349 | 未知 | 0.14 | 0.24 | 10.5 | 2.8 | 3.7 | 8.0 | 2.7 |
V00522 | II类MHC DRβ3 | 0.62 | 0.22 | 4.8 | 3.9 | 4.7 | 2.5 | 3.0 |
U75330 | 神经细胞黏附分子2 | 0.42 | 0.08 | 2.1 | 9.6 | 13.2 | 3.3 | 7.8 |
NM_007199 | IL-1R相关激酶M | 0.15 | 0.25 | 8.7 | 7.8 | 8.6 | 16.1 | 2.5 |
D30742 | 钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV | 0.28 | 0.09 | 6.2 | 28.7 | 7.4 | 2.4 | 6.8 |
X05978 | 胱蛋白A(cystatinA) | 0.63 | 0.17 | 2.7 | 4.8 | 9.4 | 2.2 | 3.6 |
AF240467 | TLR-7 | 0.11 | 0.10 | 13.8 | 13.3 | 4.7 | 7.7 | 4.9 |
[00122]表37:A549细胞中被式G的肽和其它的肽诱导的多聚核苷酸表达的增量调节。发现浓度为50μg/ml的肽增加了许多多聚核苷酸的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多聚核苷酸的强度显示在第二列和第三列,它们分别对应于用染料Cy 3和Cy 5标记的cDNA。“比值ID#:对照”一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。登记号和基因表示为:U00115,锌指蛋白;M91036,血红蛋白γG;AK000070,假想蛋白;AF055899,溶质载体家族27;AK001490,假想蛋白;X97674,细胞核受体辅激活物2;AB022847,未知;AJ275986,转录因子;D10495,蛋白激酶C,δ;L36642,EphA7;M3 1166,pentaxin相关性基因;AF176012,未知;AF072756,激酶锚蛋白4;NM_014439,IL-1超家族z;AJ271351,推定的转录调节物;AK000576,假想蛋白;AJ272265,分泌磷蛋白2;AL122038,假想蛋白;AK000307,假想蛋白;AB029001,KIAA1078蛋白;U62437,胆碱能受体;AF064854,未知;AL031588,假想蛋白;X89388,RAS p21蛋白激活物;D45399,磷酸二酯酶;AB037716,假想蛋白;X79981,钙依粘连蛋白5;AF034208,RIG样7-1;AL133355,染色体21开放阅读框架53;NM_016281,STE20样激酶;AF023614,跨膜激活物和CAML相互作用蛋白;AF056717,ash2样;AB029039,KIAA1116蛋白;J03634,抑制素,βA;U80764,未知;AB032963,未知;X82835,IX型电压门控钠离子通道。
登记号 | 对照-Cy3 | 对照-Cy5 | ID53:对照 | ID54:对照 | ID47:对照 | ID48:对照 | ID49:对照 | ID50:对照 | ID51:对照 | ID52:对照 |
U00115 | 0.51 | 0.07 | 27.4 | 7.3 | 2.4 | 3.1 | 4.8 | 8.3 | 3.5 | 20.0 |
M91036 | 0.22 | 0.02 | 39.1 | 32.5 | 5.2 | 2.2 | 37.0 | 6.0 | 16.2 | 18.0 |
AK000070 | 0.36 | 0.18 | 3.8 | 7.6 | 2.6 | 15.1 | 12.2 | 9.9 | 17.2 | 15.3 |
AF055899 | 0.14 | 0.31 | 6.7 | 3.7 | 9.7 | 10.0 | 2.2 | 16.7 | 5.4 | 14.8 |
AK001490 | 0.05 | 0.02 | 14.1 | 35.8 | 3.2 | 28.6 | 25.0 | 20.2 | 56.5 | 14.1 |
X97674 | 0.28 | 0.28 | 3.2 | 3.7 | 4.0 | 10.7 | 3.3 | 3.1 | 4.0 | 13.2 |
AB022847 | 0.39 | 0.24 | 4.1 | 4.4 | 4.5 | 2.7 | 3.7 | 10.4 | 5.0 | 11.3 |
AJ275986 | 0.26 | 0.35 | 5.8 | 2.3 | 5.7 | 2.2 | 2.5 | 9.7 | 4.3 | 11.1 |
D10495 | 0.18 | 0.10 | 8.0 | 3.4 | 4.6 | 2.0 | 6.9 | 2.5 | 12.7 | 10.3 |
L36642 | 0.26 | 0.06 | 5.8 | 14.2 | 2.6 | 4.1 | 8.9 | 3.4 | 6.5 | 6.6 |
M31166 | 0.31 | 0.12 | 4.8 | 3.8 | 12.0 | 3.6 | 9.8 | 2.4 | 8.8 | 6.4 |
AF176012 | 0.45 | 0.26 | 3.1 | 2.9 | 2.8 | 2.6 | 2.3 | 6.9 | 3.0 | 5.8 |
AF072756 | 0.33 | 0.07 | 9.9 | 9.3 | 4.4 | 4.3 | 3.2 | 4.9 | 11.9 | 5.4 |
NM_014439 | 0.47 | 0.07 | 12.0 | 7.1 | 3.3 | 3.3 | 4.7 | 5.9 | 5.0 | 5.4 |
AJ271351 | 0.46 | 0.12 | 3.4 | 3.5 | 2.3 | 4.7 | 2.3 | 2.7 | 6.9 | 5.2 |
AK000576 | 0.27 | 0.06 | 7.4 | 15.7 | 2.9 | 4.7 | 9.0 | 2.4 | 8.2 | 5.1 |
AJ272265 | 0.21 | 0.09 | 6.2 | 7.9 | 2.3 | 3.7 | 10.3 | 4.5 | 4.6 | 4.7 |
AL122038 | 0.46 | 0.06 | 6.7 | 4.5 | 2.6 | 4.3 | 16.4 | 6.5 | 26.6 | 4.6 |
AK000307 | 0.23 | 0.09 | 3.7 | 4.0 | 4.3 | 3.2 | 5.3 | 2.9 | 13.1 | 4.4 |
AB029001 | 0.52 | 0.21 | 14.4 | 4.3 | 4.6 | 4.4 | 4.8 | 21.9 | 3.2 | 4.2 |
U62437 | 0.38 | 0.13 | 12.6 | 6.5 | 4.2 | 6.7 | 2.2 | 3.7 | 4.8 | 3.9 |
AF064854 | 0.15 | 0.16 | 2.6 | 2.9 | 6.2 | 8.9 | 14.4 | 5.0 | 9.1 | 3.9 |
AL031588 | 0.40 | 0.26 | 8.3 | 5.2 | 2.8 | 3.3 | 5.3 | 9.0 | 5.6 | 3.4 |
X89388 | 0.25 | 0.10 | 15.8 | 12.8 | 7.4 | 4.2 | 16.7 | 6.9 | 12.7 | 3.3 |
D45399 | 0.21 | 0.18 | 3.0 | 4.7 | 3.3 | 4.4 | 8.7 | 5.3 | 5.1 | 3.3 |
AB037716 | 0.36 | 0.40 | 5.1 | 7.5 | 2.6 | 2.1 | 3.5 | 3.1 | 2.4 | 2.8 |
X79981 | 0.34 | 0.10 | 4.7 | 7.2 | 3.2 | 4.6 | 6.5 | 5.1 | 5.8 | 2.7 |
AF034208 | 0.45 | 0.24 | 2.7 | 10.9 | 2.1 | 3.7 | 2.3 | 5.9 | 2.2 | 2.5 |
AL133355 | 0.22 | 0.23 | 2.3 | 3.4 | 7.3 | 2.7 | 3.3 | 4.3 | 2.8 | 2.5 |
NM_016281 | 0.40 | 0.19 | 6.6 | 10.6 | 2.1 | 2.8 | 5.0 | 11.2 | 10.6 | 2.5 |
AF023614 | 0.11 | 0.42 | 2.2 | 2.2 | 6.0 | 7.5 | 5.0 | 2.7 | 2.0 | 2.4 |
AF056717 | 0.43 | 0.62 | 4.3 | 3.2 | 5.1 | 4.0 | 4.6 | 9.7 | 3.1 | 2.2 |
AB029039 | 0.79 | 0.49 | 2.7 | 3.3 | 3.7 | 2.0 | 2.3 | 2.4 | 4.8 | 2.2 |
J03634 | 0.40 | 0.12 | 3.7 | 2.3 | 2.3 | 4.0 | 10.5 | 4.1 | 9.1 | 2.2 |
U80764 | 0.31 | 0.18 | 2.3 | 7.4 | 4.2 | 2.3 | 5.1 | 3.3 | 8.8 | 2.1 |
AB032963 | 0.19 | 0.34 | 4.0 | 7.3 | 5.0 | 3.0 | 2.9 | 6.7 | 3.8 | 2.1 |
X82835 | 0.25 | 0.38 | 2.0 | 2.7 | 2.9 | 7.7 | 3.3 | 3.1 | 3.5 | 2.0 |
实施例5
细胞系、人全血和鼠中用肽诱导趋化因子
[00123]使用了鼠巨噬细胞系RAW 264.7、THP-1细胞(人单核细胞)、人上皮细胞系(A549)、人支气管上皮细胞(16HBEo14)和人全血。HBE细胞在含有厄尔溶液的MEM(最低必须培养基)中生长。THP-1细胞在RPMI 1640培养基中生长和维持。RAW和A549细胞系维持在补充以10%胎小牛血清的DMEM中。将这些细胞接种到具有DMEM的24孔板中,密度为每孔106个细胞(见上),将A549细胞接种到具有DMEM的24孔板中,密度为每孔105个细胞(见上),它们都于37℃在5%CO2中温育过夜。将DMEM从过夜生长的细胞中吸去,代之以新鲜培养基。在这些细胞与肽温育后,用ELISA(R&D Systems,Minneapolis,MN)测定释放到培养物上清中的趋化因子。
[00124]动物研究经由UBC动物管理委员会同意(UBCACC#A01-0008)。BALB/c鼠购自Charles River Laboratories,并用标准的动物设施喂养。年龄、性别和体重匹配的成年鼠通过腹膜内注射阿佛丁(4.4mM 2-2-2-三溴乙醇,2.5%2-甲基-2-丁醇,在蒸馏水中)被麻醉,剂量为每10g体重200μl。使用改自Ho和Furst 1973的非外科的气管内滴注方法实施滴注。简单的说,将已麻醉的鼠的上颌牙钩在支撑架顶部的金属丝上,使其颚处于打开状态,用弹簧推压胸部,使其咽、喉和气管处于一条垂直线上。从外面照亮气管,将一根插管导管插入到被清楚照亮的气管内腔。将20μl肽悬液或无菌水置于插管近端的小孔中,并将其用200μl空气慢慢滴注到该气管中。滴注之后,将这些动物于竖直位置保持2分钟,以使该流体流到呼吸树内。4小时后,通过腹膜内注射300mg/kg的戊巴比妥,将这些鼠无痛致死。将该气管暴露,将一个静脉内导管插入到气管近端,并用缝合线适当地系结。进行灌洗:通过气管插管将0.75毫升无菌PBS引入肺中,在数秒后,吸出该流体。该步骤用同样的PBS样品重复三次。将灌洗液放在管子中,并置于冰上,每只鼠的总回收体积约为0.5ml。将此支气管肺泡灌洗(BAL)液1200rpm高速离心10分钟,移走上清,用ELISA检测其中的TNF-α和MCP-1。
[00125]阳离子肽对趋化因子的增量调节作用在多个不同的系统中被证实。鼠MCP-1是人MCP-1的同源物,它是β(C-C)趋化因子家族的成员。已经证明MCP-1能招集单核细胞、NK细胞和一些T淋巴细胞。当来自RAW 264.7巨噬细胞和3个供体的人全血被浓度不断增加的肽SEQ ID NO:1刺激时,ELISA表明它们在其上清中产生了明显量的MCP-1(表36)。被浓度范围为20-50μg/ml的肽刺激了24小时的RAW 264.7细胞产生了明显量的MCP-1(背景之上200-400 pg/ml)。当用100μg/ml的LL-37刺激这些细胞(24小时)和全血(4小时)时,产生了高水平的MCP-1。
[00126]阳离子肽诱导趋化因子的效应也在一种完全不同的细胞系统,A549人上皮细胞中被检测。有趣的是,尽管这些细胞应答LPS时会产生MCP-1,并且这种应答会被肽拮抗;但是A549细胞直接应答肽SEQ ID NO:1时,并没有MCP-1产生。然而,高浓度的肽SEQ ID NO:1的确诱导产生了一种嗜中性粒细胞特异性趋化因子IL-8(表37)。因此,SEQ ID NO:1在不同的浓度和在不同的细胞类型中能够诱导不同范围的应答。测试了各个式子对应的大量肽在A549细胞中诱导IL-8的能力(表38)。低浓度10μg/ml的这些肽中有许多在背景水平上诱导出IL-8。还发现高浓度(100μg/ml)的SEQ ID NO:13在全血中诱导出IL-8(表39)。在HBE细胞(表40)和未分化的THP-1细胞(表41)中肽SEQ ID NO:2也明显诱导IL-8。
[00127]通过气管内滴注给予BALB/c鼠SEQ ID NO:1或无内毒素的水,3-4小时后检测支气管肺泡灌洗液中的MCP-1和TNF-α水平。发现用50μg/ml肽SEQ IDNO:1处理的鼠与只给予水或麻醉剂的鼠相比,前者产生的MCP-1水平明显增高(表42)。对肽SEQ ID NO:1并没有促炎应答,因为与只给予水或麻醉剂的鼠相比,该肽没有明显诱导出更多的TNF-α。还发现,在用肽SEQ ID NO:1(高到100μg/ml)处理的RAW 264.7细胞和骨髓源巨噬细胞中,肽SEQ ID NO:1没有明显诱导TNF-α的生成(表43)。因此,肽SEQ ID NO:1选择性地诱导趋化因子的产生,而不诱导炎症介导物例如TNF-α的产生。这说明肽SEQ ID NO:1具有双重作用,它既作为能够阻止细菌产物诱导的炎症的因子,又有助于招集可清除感染的吞噬细胞。
[00128]表38:RAW 264.7细胞和人全血中MCP-1的诱导。用浓度不断增加的LL-37刺激RAW 264.7鼠巨噬细胞和人全血4个小时。将人全血样品高速离心,移走血清,用ELISA检测其中的MCP-1,同时用ELISA检测RAW 264.7细胞的上清中的MCP-1。RAW细胞的数据表示为三个或更多个实验的平均值±标准偏差,人全血的数据表示为来自三个不同供体的平均值±标准偏差。
肽,SEQ ID NO:1(μg/ml) | 单核细胞化学诱导蛋白(MCP)-1(pg/ml)* | |
RAW细胞 | 全血 | |
0 | 135.3±16.3 | 112.7±43.3 |
10 | 165.7±18.2 | 239.3±113.3 |
50 | 367±11.5 | 371±105 |
100 | 571±17.4 | 596±248.1 |
[00129]表39:A549细胞和人全血中IL-8的诱导。用浓度不断增加的肽分别刺激A549细胞和人全血24小时和4小时。将人全血样品高速离心,移走血清,用ELISA检测其中的IL-8,同时用ELISA检测A549细胞的上清中的IL-8。A549细胞的数据表示为三个或更多个实验的平均值±标准偏差,人全血的数据表示为来自三个不同供体的平均值±标准偏差。
肽,SEQ ID NO:1(μg/ml) | IL-8(pg/ml) |
A549细胞 | 全血 | |
0 | 172±29.1 | 660.7±126.6 |
1 | 206.7±46.1 | |
10 | 283.3±28.4 | 945.3±279.9 |
20 | 392±31.7 | |
50 | 542.3±66.2 | 1160.3±192.4 |
100 | 1175.3±188.3 |
[00130]表40:A549细胞中阳离子肽诱导IL-8。用10μg肽刺激A549人上皮细胞24小时。移走上清,并用ELISA检测其中的IL-8。
肽(10μg/ml) | IL-8(ng/ml) |
没有肽 | 0.164 |
LPS,没有肽 | 0.26 |
SEQ ID NO:1 | 0.278 |
SEQ ID NO:6 | 0.181 |
SEQ ID NO:7 | 0.161 |
SEQ ID NO:9 | 0.21 |
SEQ ID NO:10 | 0.297 |
SEQ ID NO:13 | 0.293 |
SEQ ID NO:14 | 0.148 |
SEQ ID NO:16 | 0.236 |
SEQ ID NO:17 | 0.15 |
SEQ ID NO:19 | 0.161 |
SEQ ID NO:20 | 0.151 |
SEQ ID NO:21 | 0.275 |
SEQ ID NO:22 | 0.314 |
SEQ ID NO:23 | 0.284 |
SEQ ID NO:24 | 0.139 |
SEQ ID NO:26 | 0.201 |
SEQ ID NO:27 | 0.346 |
SEQ ID NO:28 | 0.192 |
SEQ ID NO:29 | 0.188 |
SEQ ID NO:30 | 0.284 |
SEQ ID NO:31 | 0.168 |
SEQ ID NO:33 | 0.328 |
SEQ ID NO:34 | 0.315 |
SEQ ID NO:35 | 0.301 |
SEQ ID NO:36 | 0.166 |
SEQ ID NO:37 | 0.269 |
SEQ ID NO:38 | 0.171 |
SEQ ID NO:40 | 0.478 |
SEQ ID NO:41 | 0.371 |
SEQ ID NO:42 | 0.422 |
SEQ ID NO:43 | 0.552 |
SEQ ID NO:44 | 0.265 |
SEQ ID NO:45 | 0.266 |
SEQ ID NO:47 | 0.383 |
SEQ ID NO:48 | 0.262 |
SEQ ID NO:49 | 0.301 |
SEQ ID NO:50 | 0.141 |
SEQ ID NO:51 | 0.255 |
SEQ ID NO:52 | 0.207 |
SEQ ID NO:53 | 0.377 |
SEQ ID NO:54 | 0.133 |
[00131]表41:人血液中肽诱导IL-8。用浓度不断增加的肽刺激人全血4小时。将人血样品离心,移走血清,并用ELISA检测其中的IL-8。数据来自两个供体的平均值。
SEQ ID NO:3(μg/ml) | IL-8(pg/ml) |
0 | 85 |
10 | 70 |
100 | 323 |
[00132]表42:HBE细胞中IL-8的诱导。将浓度不断增加的肽与HBE细胞共同温育8小时,移走上清,并用ELISA检测其中的IL-8。数据表示为三个或更多个实验的平均值±标准偏差。
SEQ ID NO:2(μg/ml) | IL-8(pg/ml) |
0 | 552±90 |
0.1 | 670±155 |
1 | 712±205 |
10 | 941±15 |
50 | 1490±715 |
[00133]表43:未分化的THP-1细胞中IL-8的诱导。将指定浓度的肽与人单核细胞THP-1细胞共同温育8小时,移走上清,并用ELISA检测其中的IL-8。
SEQ ID NO:3(μg/ml) | IL-8(pg/ml) |
0 | 10.6 |
10 | 17.2 |
50 | 123.7 |
[00134]表44:在鼠的气道中肽SEQ ID NO:1诱导MCP-1。用阿佛丁将BALB/c鼠麻醉,并对其气管内滴注肽或水,或者不进行滴注(不作处理)。对鼠进行4小时监测,并分离出BAL流体,用ELISA分析其中的MCP-1和TNF-α浓度。数据表示为各种条件的四只或五只鼠的平均值±标准偏差。
条件 | MCP-1(pg/ml) | TNF-α(pg/ml) |
水 | 16.5±5 | 664±107 |
肽 | 111±30 | 734±210 |
阿佛丁(avertin) | 6.5±0.5 | 393±129 |
[00135]表45:阳离子肽没有明显诱导TNF-α。将指定的肽(40μg/ml)与RAW246.7巨噬细胞共同温育6小时。收集上清,并用ELISA检测其中的TNF-α水平。数据表示为三个或更多个实验的平均值±标准偏差。
肽处理 | TNF-α(pg/ml) |
培养基背景 | 56±8 |
LPS处理,没有肽 | 15207±186 |
SEQ ID NO:1 | 274±15 |
SEQ ID NO:5 | 223±45 |
SEQ ID NO:6 | 297±32 |
SEQ ID NO:7 | 270±42 |
SEQ ID NO:8 | 166±23 |
SEQ ID NO:9 | 171±33 |
SEQ ID NO:10 | 288±30 |
SEQ ID NO:12 | 299±65 |
SEQ ID NO:13 | 216±42 |
SEQ ID NO:14 | 226±41 |
SEQ ID NO:15 | 346±41 |
SEQ ID NO:16 | 341±68 |
SEQ ID NO:17 | 249±49 |
SEQ ID NO:19 | 397±86 |
SEQ ID NO:20 | 285±56 |
SEQ ID NO:21 | 263±8 |
SEQ ID NO:22 | 195±42 |
SEQ ID NO:23 | 254±58 |
SEQ ID NO:24 | 231±32 |
SEQ ID NO:26 | 281±34 |
SEQ ID NO:27 | 203±42 |
SEQ ID NO:28 | 192±26 |
SEQ ID NO:29 | 242±40 |
SEQ ID NO:31 | 307±71 |
SEQ ID NO:33 | 196±42 |
SEQ ID NO:34 | 204±51 |
SEQ ID NO:35 | 274±76 |
SEQ ID NO:37 | 323±41 |
SEQ ID NO:38 | 199±38 |
SEQ ID NO:43 | 947±197 |
SEQ ID NO:44 | 441±145 |
SEQ ID NO:45 | 398±90 |
SEQ ID NO:48 | 253±33 |
SEQ ID NO:49 | 324±38 |
SEQ ID NO:50 | 311±144 |
SEQ ID NO:53 | 263±40 |
SEQ ID NO:54 | 346±86 |
实施例6
阳离子肽增加趋化因子受体的表面表达
[00136]为了分析IL-8RB、CXCR-4、CCR2和LFA-1的细胞表面表达,RAW巨噬细胞用10μg/ml适当的第一抗体(Santa Cruz Biotechnology)染色,接着用FITC偶联的羊抗兔IgG[IL-8RB和CXCR-4(Jackson ImmunoResearch Laboratories,WestGrove,PA)]或FITC偶联的驴抗羊IgG(Santa Cruz)。用FACscan对细胞进行分析,计数10,000次并开启前部和侧部分散器以排除细胞碎片。
[00137]多聚核苷酸阵列数据表明,与未受刺激的细胞相比,一些肽分别增量调节了趋化因子受体IL-8RB、CXCR-4和CCR2的表达10、4和1.4倍。为了证实该多聚核苷酸阵列数据,用流式细胞仪检测用肽刺激了4小时的RAW细胞上的受体的表面表达。当50μg/ml的肽与RAW细胞共同温育4小时时,IL-8RB平均被增量调节超过未刺激的细胞2.4倍,CXCR-4平均被增量调节超过未刺激的细胞1.6倍,CCR2被增量调节超过未刺激的细胞1.8倍(表46)。作为对照,CEMA被证明可导致类似的增量调节。Bac2A是唯一可明显增量调节LFA-1(高于对照细胞3.8倍)的肽。
[00138]表46:在对肽的应答中,CXCR-4、IL-8RB和CCR2的表面表达增加。用肽刺激RAW巨噬细胞4小时。清洗该细胞,用适当的第一抗体和FITC标记的第二抗体染色。显示的数据表示平均值(用肽刺激的RAW细胞的倍数变化)±标准偏差。
肽 | 浓度(μg/ml) | 蛋白表达的倍数增加 | ||
IL-8RB | CXCR-4 | CCR2 | ||
SEQ ID NO:1 | 10 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
SEQ ID NO:1 | 50 | 1.3±0.05 | 1.3±0.03 | 1.3±0.03 |
SEQ ID NO:1 | 100 | 2.4±0.6 | 1.6±0.23 | 1.8±0.15 |
SEQ ID NO:3 | 100 | 2.0±0.6 | 没有做 | 4.5 |
CEMA | 50 | 1.6±0.1 | 1.5±02 | 1.5±0.15 |
100 | 3.6±0.8 | 没有做 | 4.7±1.1 |
实施例7
阳离子肽导致的MAP激酶的磷酸化
[00139]以2.5×105-5×105个细胞/ml的密度接种细胞,并让其过夜。在早晨,用无血清的培养基洗细胞一次(无血清培养基-4小时)。去掉该培养基并换之以PBS,然后于37℃放置15分钟,再于室温15分钟。加入肽(浓度为0.1μg/ml-50μg/ml)或水,温育10分钟。迅速移去PBS,代之以冰冷的放射免疫沉淀(RIPA)缓冲液和抑制剂(NaF、B-甘油磷酸、MOL、钒酸盐、PMSF、亮抑蛋白酶肽抑蛋白酶肽)。将培养板在冰上摇动10-15分钟,或者摇至细胞裂解,收集裂解物。对于THP-1细胞,步骤稍有不同;要使用更多的细胞(5×106)。它们在缺乏血清的情况下过夜,加入1ml冰冷的PBS以停止反应,然后放置在冰上5-10分钟,旋转沉淀,然后用RIPA重悬。使用蛋白质分析(Pierce,Rockford,IL.)测定蛋白浓度。细胞裂解物(20μg蛋白)用SDS-PAGE分离,并转移到硝酸纤维素膜上。该膜用10mMTris-HCl,pH7.5,150mM NaCl(TBS)/5%脱脂奶粉封闭1小时,然后在冷的含有第一抗体的TBS/0.05%Tween 20中过夜温育。用TBS/0.05%Tween 20清洗30分钟后,再于室温与辣根过氧化酶偶联的羊抗鼠IgG(1∶10,000,在TBS/0.05%Tween20中)温育1小时。用TBS/0.1%Tween 20清洗该膜30分钟后,利用增强化学发光(ECL)检测可以看到免疫反应性条带。对于使用外周血单核细胞的实验:外周血(50-100ml)采自所有个体。在Ficoll-Hypaque上通过密度梯度离心从外周血分离出单核细胞。间期细胞(单核细胞)被回收、洗涤,然后重悬于含有10%胎小牛血清(FCS)和1%L-谷酰胺的推荐的细胞培养的首要培养基(RPMI-1640)中。以每孔4×106个细胞的密度将细胞加到6孔培养板中,于37℃在5%CO2气体中放置1小时,让黏附发生。洗去浮在表面的培养基和未黏附的细胞,加入适当的培养基和肽。由它们排斥台盼蓝的能力估计新鲜收获的细胞中应有>99%存活。用肽进行刺激后,在各种磷酸酶抑制剂和激酶抑制剂存在的情况下,用RIPA缓冲液裂解细胞,收集裂解物。分析蛋白含量,将各个样品的大约30μg加载到12%SDS-PAGE凝胶上。将胶中蛋白转移点到硝酸纤维素上,用含有5%脱脂奶粉和1%Triton X 100的Tris缓冲盐(TBS)封闭1小时。用磷酸化特异性抗体检测磷酸化。
[00140]由肽诱导的磷酸化的结果总结于表46。发现在鼠巨噬RAW细胞系和HBE细胞中,SEQ ID NO:2导致p38和ERK1/2发生剂量依赖的磷酸化。在THP-1人单核细胞系中,SEQ ID NO:3导致MAP激酶的磷酸化,在鼠RAW细胞系中,SEQID NO:3导致ERK1/2的磷酸化。
[00141]表47:在对肽的应答中MAP激酶的磷酸化。
细胞系 | 肽 | MAP激酶磷酸化的 | |
p38 | ERK1/2 | ||
RAW 264.7 | SEQ ID NO:3 | - | + |
SEQ ID NO:2 | + | + | |
HBE | SEQ ID NO:3 | + | |
SEQ ID NO:2 | + | + | |
THP-1 | SEQ ID NO:3 | + | + |
SEQ ID NO:2 |
[00142]表48:在人血单核细胞中MAP激酶的肽磷酸化(SEQ ID NO:1,50μg/ml)被用来促进磷酸化。
P38磷酸化 | ERK1/2磷酸化 | ||
15分钟 | 60分钟 | 15分钟 | 60分钟 |
+ | - | + | + |
实施例8
阳离子肽通过强化免疫应答对细菌感染进行防御
[00143]通过腹膜内注射对BALB/c鼠施以1×105沙门氏菌和阳离子肽(200μg)。对鼠进行24小时监测,此时它们死亡,取出脾脏,匀浆化,重悬于PBS,涂在含有卡那霉素(50μg/ml)的Luria Broth琼脂平板上。平板于37℃温育过夜,对存活细菌进行计数(表49和50)。通过腹膜内注射对CD-1鼠施以含有1×108金黄葡萄球菌的5%猪粘蛋白液和阳离子肽(200μg)(表51)。对鼠进行3天的监测,此时它们死亡,取出血液,涂板,计算活细胞数。通过腹膜内(IP)注射对CD-1雄鼠施以5.8×106 CFU EHEC细菌和阳离子肽(200μg),监测3天(表52)。在这些动物模型的每一个中都有一部分肽表现出对感染的防御。当将表49和50中的防御分析结果与表31-37中的基因表达结果作比较时,发现在沙门氏菌模型中最具防御性的肽能够诱导上皮细胞中共同的一套基因(表53)。这清楚地表明基因表达的谱型与肽展示防御的能力是一致的。最小抑制浓度(MIC)测试的结果(表54)表明,这些阳离子肽中有许多并不直接抵抗微生物。这表明肽防御感染的能力依赖于该肽刺激宿主先天免疫的能力,而不是依赖于直接的抗微生物活性。
[00144]表49:在BALB/c鼠中阳离子肽对沙门氏菌感染的影响。将沙门氏菌和肽腹膜内注射到BALB/c鼠中,24小时后,这些动物无痛死亡,取出脾脏,匀浆化,用PBS稀释,平板计数,确定细菌存活数。
肽处理 | 脾脏中的存活细菌(CFU/ml) | 统计显著性(p值) |
对照 | 2.70±0.84 ×105 | |
SEQ ID NO:1 | 1.50±0.26 ×105 | 0.12 |
SEQ ID NO:6 | 2.57±0.72 ×104 | 0.03 |
SEQ ID NO:13 | 3.80±0.97 ×104 | 0.04 |
SEQ ID NO:17 | 4.79±1.27 ×104 | 0.04 |
SEQ ID NO:27 | 1.01±0.26 ×105 | 0.06 |
[00145]表50:在BALB/c鼠中阳离子肽对沙门氏菌感染的影响。将沙门氏菌和肽腹膜内注射到BALB/c鼠中,24小时后,这些动物无痛死亡,取出脾脏,匀浆化,用PBS稀释,平板计数,确定细菌存活数。
肽处理 | 脾脏中的存活细菌(CFU/ml) |
对照 | 1.88±0.16 ×104 |
SEQ ID NO:48 | 1.98±0.18 ×104 |
SEQ ID NO:26 | 7.1±1.37 ×104 |
SEQ ID NO:30 | 5.79±0.43 ×103 |
SEQ ID NO:37 | 1.57±0.44 ×104 |
SEQ ID NO:5 | 2.75±0.59 ×104 |
SEQ ID NO:7 | 5.4±0.28 ×103 |
SEQ ID NO:9 | 1.23±0.87 ×104 |
SEQ ID NO:14 | 2.11±0.23 ×103 |
SEQ ID NO:20 | 2.78±0.22 ×104 |
SEQ ID NO:23 | 6.16±0.32 ×104 |
[00146]表51:在鼠的金黄葡萄球菌感染模型中阳离子肽的效应。将含有1×108细菌的5%猪粘蛋白液腹膜内(IP)注射到CD-1鼠中。经由单独的一次腹膜内注射施以阳离子肽(200μg)。监测3天,这些鼠无痛死亡,取出血液,涂板计算存活数。下列的肽在控制金黄葡萄球菌感染方面是没有效果的:SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:26。
处理 | CFU/ml(血液) | #存活的鼠(3天)/该组的鼠总数 |
没有肽 | 7.61±1.7 ×103 | 6/8 |
SEQID NO:1 | 0 | 4/4 |
SEQ ID NO:27 | 2.25±0.1 ×102 | 3/4 |
SEQ ID NO:30 | 1.29±0.04 ×102 | 4/4 |
SEQ ID NO:37 | 9.65±0.41 ×102 | 4/4 |
SEQ ID NO:5 | 3.28±1.7 ×103 | 4/4 |
SEQ ID NO:6 | 1.98±0.05 ×102 | 3/4 |
SEQ ID NO:7 | 3.8±0.24 ×103 | 4/4 |
SEQ ID NO:9 | 2.97±0.25 ×102 | 4/4 |
SEQ ID NO:13 | 4.83±0.92 ×103 | 3/4 |
SEQ ID NO:17 | 9.6±0.41 ×102 | 4/4 |
SEQ ID NO:20 | 3.41±1.6 ×103 | 4/4 |
SEQ ID NO:23 | 4.39±2.0 ×103 | 4/4 |
[00147]表52:在鼠的EHEC感染模型中阳离子肽的效应。将5.8×106CFU EHEC细菌腹膜内(IP)注射到CD-1雄鼠(5周大)中。经由单独的一次腹膜内注射施以阳离子肽(200μg)。对这些鼠进行3天的监测。
处理 | 肽 | 存活(%) |
对照 | 无 | 25 |
SEQ ID NO:23 | 200μg | 100 |
[00148]表53:在体内有活性的肽诱导A549上皮细胞中基因表达谱型的增量调节。发现在用浓度为50μg/ml的肽SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:13处理4小时后,每一种肽都增加了一套基因的表达。将肽与人A549上皮细胞共同温育4小时,分离RNA,转化为标记的cDNA探针,并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的对照细胞中的多聚核苷酸的强度显示在第二列(用Cy3和Cy5标记cDNA两种情况的平均值)。增量调节倍数一列是指受肽刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。表中还包括作为阴性对照的肽SEQ ID NO:37,它在鼠的感染模型中没有活性。
目标(登记号) | 未刺激的细胞强度 | 基因表达相对于未处理的细胞的增量调节倍数 | |||
SEQ IDNO:30 | SEQ IDNO:7 | SEQ IDNO:13 | SEQ IDNO:37 | ||
锌指蛋白(AF061261) | 13 | 2.6 | 9.4 | 9.4 | 1.0 |
细胞周期基因(S70622) | 1.62 | 8.5 | 3.2 | 3.2 | 0.7 |
IL-10受体(U00672) | 0.2 | 2.6 | 9 | 4.3 | 0.5 |
转移酶(AF038664) | 0.09 | 12.3 | 9.7 | 9.7 | 0.1 |
同源框蛋白(AC004774) | 0.38 | 3.2 | 2.5 | 2.5 | 1.7 |
分叉头型蛋白(AF042832) | 0.17 | 14.1 | 3.5 | 3.5 | 0.9 |
未知(AL096803) | 0.12 | 4.8 | 4.3 | 4.3 | 0.6 |
KIAA0284蛋白(AB006622) | 0.47 | 3.4 | 2.1 | 2.1 | 1.3 |
假想蛋白(AL022393) | 0.12 | 4.4 | 4.0 | 4.0 | 0.4 |
受体(AF112461) | 0.16 | 2.4 | 10.0 | 10.0 | 1.9 |
假想蛋白(AK002104) | 0.51 | 4.7 | 2.6 | 2.6 | 1.0 |
蛋白(AL050261) | 0.26 | 3.3 | 2.8 | 2.8 | 1.0 |
多肽(AF105424) | 0.26 | 2.5 | 5.3 | 5.3 | 1.0 |
SPR1蛋白(AB031480) | 0.73 | 3.0 | 2.7 | 2.7 | 1.3 |
脱氢酶(D]7793) | 4.38 | 2.3 | 2.2 | 2.2 | 0.9 |
转移酶(M63509) | 0.55 | 2.7 | 2.1 | 2.1 | 1.0 |
过氧化物酶体因子(AB013818) | 0.37 | 3.4 | 2.9 | 2.9 | 1.4 |
[00149]表54:在此研究的多数阳离子肽,特别是在感染模型中有效的阳离子肽并不是明显抗微生物的。将系列稀释的肽与指定的细菌在96孔板中温育过夜。杀死该细菌的肽的最低浓度表示为MIC。符号>表示MIC太大而不能测量。8μg/ml或更低的MIC被认为是临床上有意义的活性。缩写:E.coli,大肠埃希氏菌(Escherichia coli);S.aureus,金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus);P.aerug,铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa);S.typhim,鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellaenteritidis ssp.typhimurium),C.rhod(Citobacter rhodensis);EHEC,肠出血性大肠埃希氏菌(Enterohaemorrhagic E.coli)。
肽 | MIC(μg/ml) | |||||
E.coli | S.aureus | P.aerug | S.typhim | C.rhod | EHEC | |
多黏菌素 | 0.25 | 16 | 0.25 | 0.5 | 0.25 | 0.5 |
庆大霉素 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.5 |
SEQ ID NO:1 | 32 | > | 96 | 64 | 8 | 4 |
SEQ ID NO:5 | 128 | > | > | > | 64 | 64 |
SEQ ID NO:6 | 128 | > | > | 128 | 64 | 64 |
SEQ ID NO:7 | > | > | > | > | > | > |
SEQ ID NO:8 | > | > | > | > | > | > |
SEQ ID NO:9 | > | > | > | > | > | > |
SEQ ID NO:10 | > | > | > | > | > | 64 |
SEQ ID NO:12 | > | > | > | > | > | > |
SEQ ID NO:13 | > | > | > | > | > | > |
SEQ ID NO:14 | > | > | > | > | > | > |
SEQ ID NO:15 | 128 | > | > | > | 128 | 64 |
SEQ ID NO:16 | > | > | > | > | > | > |
SEQ ID NO:17 | > | > | > | > | > | > |
SEQ ID NO:19 | 8 | 16 | 16 | 64 | 4 | 4 |
SEQ ID NO:2 | 4 | 16 | 32 | 16 | 64 | |
SEQ ID NO:20 | 8 | 8 | 8 | 8 | 16 | 8 |
SEQ ID NO:21 | 64 | 64 | 96 | 64 | 32 | 32 |
SEQ ID NO:22 | 8 | 12 | 24 | 8 | 4 | 4 |
SEQ ID NO:23 | 4 | 8 | 8 | 16 | 4 | 4 |
SEQ ID NO:24 | 16 | 16 | 4 | 16 | 16 | 4 |
SEQ ID NO:26 | 0.5 | 32 | 64 | 2 | 2 | 0.5 |
SEQ ID NO:27 | 8 | 64 | 64 | 16 | 2 | 4 |
SEQ ID NO:28 | > | > | > | 64 | 64 | 128 |
SEQ ID NO:29 | 2 | > | > | 16 | 32 | 4 |
SEQ ID NO:30 | 16 | > | 128 | 16 | 16 | 4 |
SEQ ID NO:31 | > | > | 128 | > | > | 64 |
SEQ ID NO:33 | 16 | 32 | > | 16 | 64 | 8 |
SEQ ID NO:34 | 8 | > | > | 32 | 64 | 8 |
SEQ ID NO:35 | 4 | 128 | 64 | 8 | 8 | 4 |
SEQ ID NO:36 | 32 | > | > | 32 | 32 | 16 |
SEQ ID NO:37 | > | > | > | > | > | > |
SEQ ID NO:38 | 0.5 | 32 | 64 | 4 | 8 | 4 |
SEQ ID NO:40 | 4 | 32 | 8 | 4 | 4 | 2 |
SEQ ID NO:41 | 4 | 64 | 8 | 8 | 2 | 2 |
SEQ ID NO:42 | 1.5 | 64 | 4 | 2 | 2 | 1 |
SEQ ID NO:43 | 8 | 128 | 16 | 16 | 8 | 4 |
SEQ ID NO:44 | 8 | > | 128 | 128 | 64 | 64 |
SEQ ID NO:45 | 8 | > | 128 | 128 | 16 | 16 |
SEQ ID NO:47 | 4 | > | 16 | 16 | 4 | 4 |
SEQ ID NO:48 | 16 | > | 128 | 16 | 1 | 2 |
SEQ ID NO:49 | 4 | > | 16 | 8 | 4 | 4 |
SEQ ID NO:50 | 8 | > | 16 | 16 | 16 | 8 |
SEQ ID NO:51 | 4 | > | 8 | 32 | 4 | 8 |
SEQ ID NO:52 | 8 | > | 32 | 8 | 2 | 2 |
SEQ ID NO:53 | 4 | > | 8 | 8 | 16 | 8 |
SEQ ID NO:54 | 64 | > | 16 | 64 | 16 | 32 |
实施例9
由细菌信号传导分子诱导的多聚核苷酸在诊断/筛选中的应用
[00150]鼠伤寒沙门氏菌LPS和Ecoli 0111:B4 LPS购自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)。将金黄葡萄球菌的LTA(Sigma)重悬于无内毒素的水(Sigma)中。对LTA制备物开展鲎变形细胞溶解物试验(Sigma)以确定其没有受到明显的内毒素污染(即,小于1ng/ml,这个浓度并不会导致RAW细胞产生明显的细胞因子产物)。使用Applied Biosystem(应用生物系统公司)(Missisauga,ON.)的Model 392DNA/RNA合成仪合成CpG寡聚脱氧核苷酸,经纯化后重悬于无内毒素的水(Sigma)中。使用如下序列CpG:5′-TCATGACGTTCCTGACGTT-3′(SEQ ID NO:57)和非CpG:5′-TTCAGGACTTICCTCAGGTT-3′(SEQ ID NO:58)。测试了非CpG寡聚物刺激细胞因子生成的能力,发现它没有导致TNF-α或IL-6的明显产生,因此可看作一种阴性对照。将RAW 264.7细胞与单独的培养基、100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、1μg/ml金黄葡萄球菌LTA或1μM CpG共同温育4小时(这些浓度可最佳地诱导RAW细胞产生肿瘤坏死因子(TNF-α)),再从这些细胞中分离出RNA。使用该RNA制备出多聚核苷酸cDNA探针,将其与Clontech Atlas多聚核苷酸阵列滤膜杂交,如前面所述。cDNA探针与各个固定化DNA的杂交可以通过放射自显影法显现,并且可以使用磷光显像系统进行定量。表55-59总结了至少2-3个独立实验的结果。发现用LPS处理RAW 264.7细胞导致超过60种多聚核苷酸的表达量增加,这些多聚核苷酸编码的蛋白包括炎症蛋白,例如IL-1β、诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2α、CD40和多种转录因子。将LPS、LTA和CpG DNA诱导的多聚核苷酸表达的变化进行比较,发现所有这三种细菌产物都以相类似的程度增加促炎多聚核苷酸的表达,例如iNOS、MIP-1α、MIP-2α、IL-1β、IL-15、TNFR1和NF-κB(表57)。表57描述了被细菌产物以类似的程度增量调节的19种多聚核苷酸,它们的刺激比值在这三种细菌产物间的差异不超过1.5倍。也有几种多聚核苷酸是被LPS、LTA和CpG以类似的程度减量调节。还发现在对这三种细菌产物的应答中,有许多多聚核苷酸是被不同地调节的(表58),包括其表达水平在一种或多种细菌产物间的差异大于1.5倍的许多多聚核苷酸。与LPS或CpG相比较而言,表达受LTA处理差异影响的多聚核苷酸最多,包括对Jun-D、Jun-B、Elk-1和细胞周期蛋白G2和A1的超量刺激。仅仅有一些多聚核苷酸的表达被LPS或CpG处理更多地改变。与LTA或CpG处理相比较而言,LPS处理更能够增加一些多聚核苷酸的表达,包括cAMP应答元件DNA结合蛋白(CRE-BP)、干扰素诱导性蛋白1和CACCC框结合蛋白BKLF。与LPS或LTA处理相比较而言,CpG处理更能够增加一些多聚核苷酸的表达,包括白血病抑制因子(LIF)和蛋白酶连接蛋白1(PN-1)。这些结果表明,尽管LPS、LTA和CpG DNA刺激表达应答的多聚核苷酸大部分重叠,但是它们对某些多聚核苷酸的调节也表现出不同的能力。
[00151]被使用的其它多聚核苷酸阵列是Human Operon阵列(该基因组的识别号是PRHU04-S1),它由点成双份的约14,000个人寡聚体点组成。用5μg总RNA制备探针,探针用Cy 3或Cy 5标记的dUTP进行标记。在这些实验中,将A549上皮细胞涂到100mm组织培养皿中,密度为每个培养皿2.5×106个细胞,过夜温育,然后用100ng/ml E.coli O111:B4 LPS刺激4小时。用RNAqueous(Ambion)分离总RNA。用除DNA试剂盒(Ambion)除去DNA污染。由总RNA制备的探针经纯化后杂交到印刷玻璃片上,42℃过夜,然后洗涤。洗涤之后,用Perkin Elmer阵列扫描仪获取图象。用图象处理软件(Imapolynucleotide 5.0,Marina Del Rey,CA)确定点的平均强度,中间强度和背景强度。使用“自制的”程序除去背景。该程序将每个子小格的底部强度计算为10%,并对每个小格减去此值。使用Polynucleotidespring软件(Redwood City,CA)进行分析。从一个玻片内的点的数值集合中获得中间点强度,并将该值与此实验中所有玻片的数值比较,从而使每个点的强度标准化。LPS处理的细胞和对照细胞之间的相对变化可以在下面的表格中看到。表60描述了许多以前未曾报道的变化,它们在诊断感染方面将是有用的。
[00152]为了证实和评估这些变化在功能上的显著性,通过密度分析法对所选择的mRNA和蛋白的水平进行估计和定量。应用CD14、波形蛋白和三重四脯氨酸碱性蛋白特异性探针进行Northern印迹杂交,证明用所有三种细菌产物进行刺激后出现的是类似的表达(表60)。应用Griess试剂估计炎症介导物NO的水平,发现24小时后产生的NO水平是可比较的,由于NO的水平可作为一氧化氮合成酶iNOS的酶活的标志,因此可知iNOS表达的增量调节是类似的(表59)。Western印迹杂交分析证明CpG更优先地刺激白血病抑制因子(LIF,细胞因子IL-6家族的成员)(表59)。其他的验证性实验证明,LPS增量调节TNF-α和IL-6的表达,如ELISA的分析结果;还增量调节MIP-2α和IL-1β mRNA的表达和减量调节DP-1和细胞周期蛋白D mRNA的表达,如Northern印迹杂交的结果。通过检测细菌元件刺激全血中促炎细胞因子生成的能力,可以将该分析扩展到与临床更相关的体外系统。发现E.coli LPS、鼠伤寒沙门氏菌LPS和金黄葡萄球菌LTA都刺激类似生成量的血清TNF-α和IL-1β。CpG也刺激这些细胞因子的产生,尽管其水平要低得多,但还是部分地支持了细胞系的数据。
[00153]表55:A549上皮细胞中被E coli O111:B4 LPS增量调节的多聚核苷酸。多聚核苷酸微阵列的研究表明,Ecoli O111:B4 LPS(100ng/ml)增加许多多聚核苷酸的表达。将LPS与A549细胞共同温育4小时,分离出RNA。用5μg总RNA制备用Cy3/Cy5标记的cDNA探针,并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的细胞中的强度显示在表55的第三列。“比值:LPS/对照”一列是指被LPS刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
登记号 | 基因 | 对照:只有培养基强度 | 比值:LPS/对照 |
D87451 | 环指蛋白10 | 715.8 | 183.7 |
AF061261 | C3H型锌指蛋白 | 565.9 | 36.7 |
D17793 | 醛-酮还原酶家族1,成员C3 | 220.1 | 35.9 |
M14630 | 胸腺素原α | 168.2 | 31.3 |
AL049975 | 未知 | 145.6 | 62.3 |
L04510 | ADP-核糖基化因子结构域蛋白1,64kD | 139.9 | 213.6 |
U10991 | G2蛋白 | 101.7 | 170.3 |
U39067 | 真核翻译起始因子3,亚基2 | 61.0 | 15.9 |
X03342 | 核糖体蛋白L32 | 52.6 | 10.5 |
NM_004850 | Rho相关的,含有卷曲螺旋的蛋白激酶2 | 48.1 | 11.8 |
AK000942 | 未知 | 46.9 | 8.4 |
AB040057 | 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MASK | 42.1 | 44.3 |
AB020719 | KIAA0912蛋白 | 41.8 | 9.4 |
AB007856 | FEM-1样死亡受体结合蛋白 | 41.2 | 16.7 |
J02783 | 原胶原-脯氨酸,2-氧代戊二酸4-双加氧酶 | 36.1 | 14.1 |
AL137376 | 未知 | 32.5 | 17.3 |
AL137730 | 未知 | 29.4 | 11.9 |
D25328 | 磷酸果糖激酶,血小板 | 27.3 | 8.5 |
AF047470 | 苹果酸脱氢酶2,NAD | 25.2 | 8.2 |
M86752 | 应激诱导性磷蛋白1 | 22.9 | 5.9 |
M90696 | 组织蛋白酶S | 19.6 | 6.8 |
AK001143 | 未知 | 19.1 | 6.4 |
AF038406 | NADH脱氢酶 | 17.7 | 71.5 |
AK000315 | 假想蛋白FLJ20308 | 17.3 | 17.4 |
M54915 | pim-1癌基因 | 16.0 | 11.4 |
D29011 | 蛋白酶体亚基,β型,5 | 15.3 | 41.1 |
AK000237 | 胆碱能突触小泡的膜蛋白 | 15.1 | 9.4 |
AL034348 | 未知 | 15.1 | 15.8 |
AL161991 | 未知 | 14.2 | 8.1 |
AL049250 | 未知 | 12.7 | 5.6 |
AL050361 | PTD017蛋白 | 12.6 | 13.0 |
U74324 | RAB相互作用性因子 | 12.3 | 5.2 |
M22538 | NADH脱氢酶 | 12.3 | 7.6 |
D87076 | KIAA0239蛋白 | 11.6 | 6.5 |
NM_006327 | (酵母)线粒体内膜异位酶23的同源物 | 11.5 | 10.0 |
AK001083 | 未知 | 11.1 | 8.6 |
AJ001403 | 粘蛋白5,亚型B,气管支气管的 | 10.8 | 53.4 |
M64788 | RAP1,GTP酶激活蛋白1 | 10.7 | 7.6 |
X06614 | 视黄酸受体,α | 10.7 | 5.5 |
U85611 | 钙和整连蛋白结合蛋白 | 10.3 | 8.1 |
U23942 | 细胞色素P450,51 | 10.1 | 10.2 |
AL031983 | 未知 | 9.7 | 302.8 |
NM_007171 | 蛋白-甘露糖基转移酶 | 9.5 | 6.5 |
AK000403 | 假想蛋白FLJ20396 | 9.5 | 66.6 |
NM_002950 | 核糖体受体蛋白I | 9.3 | 35.7 |
L05515 | cAMP应答元件结合蛋白CRE-BPa | 8.9 | 6.2 |
X83368 | 磷酸肌醇3-激酶,催化的,γ多肽 | 8.7 | 27.1 |
M30269 | 巢蛋白(enactin) | 8.7 | 5.5 |
M91083 | 染色体11开放阅读框架13 | 8.2 | 6.6 |
D29833 | 唾液的富含脯氨酸的蛋白 | 7.7 | 5.8 |
AB024536 | 含有富含亮氨酸的重复序列的免疫球蛋白超家族 | 7.6 | 8.0 |
U39400 | 染色体11开放阅读框架4 | 7.4 | 7.3 |
AF028789 | unc119(C.elegans)同源物 | 7.4 | 27.0 |
NM_003144 | 信号序列受体,α(易位子相关蛋白α) | 7.3 | 5.9 |
X52195 | 花生四烯酸5-脂加氧酶激活蛋白 | 7.3 | 13.1 |
U43895 | 人生长因子调节性酪氨酸激酶底物 | 6.9 | 6.9 |
L25876 | 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物3 | 6.7 | 10.3 |
L04490 | NADH脱氢酶 | 6.6 | 11.1 |
Z18948 | S100钙结合蛋白 | 6.3 | 11.0 |
D10522 | 肉豆蔻酰基化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物 | 6.1 | 5.8 |
NM_014442 | 唾液酸结合Ig样凝集素8 | 6.1 | 7.6 |
U81375 | 溶质载体家族29 | 6.0 | 6.4 |
AF041410 | 恶性肿瘤相关蛋白 | 5.9 | 5.3 |
U24077 | 杀伤细胞免疫球蛋白样受体 | 5.8 | 14.4 |
AL137614 | 假想蛋白 | 4.8 | 6.8 |
NM_002406 | 甘露糖基(α-1,3-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡糖氨基转移酶 | 4.7 | 5.3 |
AB002348 | KIAA0350蛋白 | 4.7 | 7.6 |
AF165217 | 原肌球条件蛋白4(肌肉) | 4.6 | 12.3 |
Z14093 | 支链酮酸脱氢酶E1,α多肽 | 4.6 | 5.4 |
U82671 | 钙牵蛋白 | 3.8 | 44.5 |
AL050136 | 未知 | 3.6 | 5.0 |
NM_005135 | 溶质载体家族12 | 3.6 | 5.0 |
AK001961 | 假想蛋白FLJ11099 | 3.6 | 5.9 |
AL034410 | 未知 | 3.2 | 21.3 |
S74728 | antiquitin 1 | 3.1 | 9.2 |
AL049714 | 核糖体蛋白L34假基因2 | 3.0 | 19.5 |
NM_014075 | PRO0593蛋白 | 2.9 | 11.5 |
AF189279 | 磷脂酶A2,IIE类 | 2.8 | 37.8 |
J03925 | 整连蛋白,α M | 2.7 | 9.9 |
NM_012177 | F框蛋白Fbx5 | 2.6 | 26.2 |
NM_004519 | 电压门控钾通道,KQT样亚家族,成员3 | 2.6 | 21.1 |
M28825 | CD1A抗原,多肽 | 2.6 | 16.8 |
X16940 | 肌动蛋白,γ 2,肠平滑肌 | 2.4 | 11.8 |
X03066 | II类主要组织相容性复合物,DOβ | 2.2 | 36.5 |
AK001237 | 假想蛋白FLJ10375 | 2.1 | 18.4 |
AB028971 | KIAA1048蛋白 | 2.0 | 9.4 |
AL137665 | 未知 | 2.0 | 7.3 |
[00154]表56:A549上皮细胞中被Ecoli O111:B4 LPS减量调节的多聚核苷酸。多聚核苷酸微阵列的研究表明,Ecoli O111:B4 LPS(100ng/ml)降低了A549细胞中许多多聚核苷酸的表达。将LPS与A549细胞共同温育4小时,分离出RNA。用5μg总RNA制备用Cy3/Cy5标记的cDNA探针,并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的细胞中的强度显示在表格5的第三列。“比值:LPS/对照”一列是指被LPS刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
登记号 | 因 | 对照:只有培养基强度 | 比值:LPS/对照 |
NM_017433 | 肌球蛋白IIIA | 167.8 | 0.03 |
X60484 | H4组蛋白家族成员E | 36.2 | 0.04 |
X60483 | H4组蛋白家族成员D | 36.9 | 0.05 |
AF151079 | 假想蛋白 | 602.8 | 0.05 |
M96843 | DNA结合的抑制蛋白2,负显性螺旋-环-螺旋蛋白 | 30.7 | 0.05 |
S79854 | 脱碘酶,碘代甲腺原氨酸,III型 | 39.4 | 0.06 |
AB018266 | matrin 3 | 15.7 | 0.08 |
M33374 | NADH脱氢酶 | 107.8 | 0.09 |
AF005220 | 人NUP98-HOXD13融合蛋白的mRNA,部分cds | 105.2 | 0.09 |
Z80783 | H2B组蛋白家族,成员L | 20.5 | 0.10 |
Z46261 | H3组蛋白家族,成员A | 9.7 | 0.12 |
Z80780 | H2B组蛋白家族,成员H | 35.3 | 0.12 |
U33931 | 红血球膜蛋白带7.2(stomatin) | 18.9 | 0.13 |
M60750 | H2B组蛋白家族,成员A | 35.8 | 0.14 |
Z83738 | H2B组蛋白家族,成员E | 19.3 | 0.15 |
Y14690 | 胶原蛋白,V型,α 2 | 7.5 | 0.15 |
M30938 | XRCC5,X射线修复,补充中国仓鼠细胞的缺陷修复功能 | 11.3 | 0.16 |
L36055 | 真核翻译起始因子4E结合蛋白 | 182.5 | 0.16 |
Z80779 | H2B组蛋白家族,成员G | 54.3 | 0.16 |
AF226869 | 5(3)-脱氧核糖核酸酶;RB相关性KRAB阻遏物 | 7.1 | 0.18 |
D50924 | KIAA0134基因产物 | 91.0 | 0.18 |
AL133415 | 波形蛋白 | 78.1 | 0.19 |
AL050179 | 原肌球蛋白1(α) | 41.6 | 0.19 |
AJ005579 | RD元件 | 5.4 | 0.19 |
M80899 | AHNAK细胞核蛋白 | 11.6 | 0.19 |
NM_004873 | BCL2相关性athanogene 5 | 6.2 | 0.19 |
X57138 | H2A组蛋白家族,成员N | 58.3 | 0.20 |
AF081281 | 溶血磷脂酶I | 7.2 | 0.22 |
U96759 | von Hippel-Linau结合蛋白I | 6.6 | 0.22 |
U85977 | 人核糖体蛋白L12假基因,部分cds | 342.6 | 0.22 |
D13315 | 乙二醛酶 | 7.5 | 0.22 |
AC003007 | 未知 | 218.2 | 0.22 |
AB032980 | RU2S | 246.6 | 0.22 |
U40282 | 整连蛋白关联性激酶 | 10.1 | 0.22 |
U81984 | 内皮PAS结构域蛋白1 | 4.7 | 0.23 |
X91788 | 氯通道,核苷酸敏感的,1A | 9.6 | 0.23 |
AF018081 | 胶原蛋白,XVIII型,α1 | 6.9 | 0.24 |
L31881 | 细胞核因子I/X(CCAAT结合性转录因子) | 13.6 | 0.24 |
X61123 | B细胞易位基因1,抗增殖 | 5.3 | 0.24 |
L32976 | 促细胞分裂剂激活性蛋白激酶激酶激酶11 | 6.3 | 0.24 |
M27749 | 免疫球蛋白λ样多肽3 | 5.5 | 0.24 |
X57128 | H3组蛋白家族,成员C | 9.0 | 0.25 |
X80907 | 磷酸肌醇-3-激酶,调节性亚基,多肽2 | 5.8 | 0.25 |
Z34282 | 人类粘蛋白的(MAR11)MUC5ACmRNA(部分) | 100.6 | 0.26 |
X00089 | H2A组蛋白家族,成员M | 4.7 | 0.26 |
AL035252 | CD39样2 | 4.6 | 0.26 |
X95289 | I类MHC区域的PERB11家族成员 | 27.5 | 0.26 |
AJ001340 | U3 snoRNP相关性55kDa蛋白 | 4.0 | 0.26 |
NM_014161 | HSPC071蛋白 | 10.6 | 0.27 |
U60873 | 未知 | 6.4 | 0.27 |
X91247 | 硫氧还蛋白还原酶1 | 84.4 | 0.27 |
AK001284 | 假想蛋白FLJ10422 | 4.2 | 0.27 |
U90840 | 滑膜肉瘤,X breakpoint 3 | 6.6 | 0.27 |
X53777 | 核糖体蛋白L17 | 39.9 | 0.27 |
AL035067 | 未知 | 10.0 | 0.28 |
AL117665 | DKFZP586M1824蛋白 | 3.9 | 0.28 |
L14561 | ATP酶,钙离子转运,质膜1 | 5.3 | 0.28 |
L19779 | H2A组蛋白家族,成员O | 30.6 | 0.28 |
AL049782 | 未知 | 285.3 | 0.28 |
X00734 | 微管蛋白,β,5 | 39.7 | 0.29 |
AK001761 | 视黄酸诱导性3 | 23.7 | 0.29 |
U72661 | ninjurin 1 | 4.4 | 0.29 |
S48220 | 脱碘酶,碘代甲腺原氨酸,I型 | 1,296.1 | 0.29 |
AF025304 | EphB2 | 4.5 | 0.30 |
S82189 | 胰凝乳蛋白酶C | 4.1 | 0.30 |
Z80782 | H2B组蛋白家族,成员K | 31.9 | 0.30 |
X68194 | 突触小泡蛋白样蛋白 | 7.9 | 0.30 |
AB028869 | 未知 | 4.2 | 0.30 |
AK000761 | 未知 | 4.3 | 0.30 |
[00155]表57:被细菌产物LPS、LTA和CpG DNA刺激后,以类似的程度表达的多聚核苷酸。发现细菌产物(100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、1μg/ml金黄葡萄球菌LTA或1μM CpG)有效地诱导数种多聚核苷酸的表达。将细菌产物与RAW细胞共同温育4小时,分离出RNA,转变为标记的cDNA探针,并将其与Atlas阵列杂交。未被刺激的对照细胞中的强度显示在第二列。“比值:LPS/LTA/CpG:对照”一列是指被细菌产物刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
登记号 | 对照未刺激强度 | 比值LPS:对照 | 比值LTA:对照 | 比值CpG:对照 | 蛋白/多聚核苷酸 |
M15131 | 20 | 82 | 80 | 55 | IL-1β |
M57422 | 20 | 77 | 64 | 90 | 三重四脯氨酸碱性蛋白 |
X53798 | 20 | 73 | 77 | 78 | MIP-2α |
M35590 | 188 | 50 | 48 | 58 | MIP-1β |
L28095 | 20 | 49 | 57 | 50 | ICE |
M87039 | 20 | 37 | 38 | 45 | iNOS |
X57413 | 20 | 34 | 40 | 28 | TGFβ |
X15842 | 20 | 20 | 21 | 15 | c-rel原癌多聚核苷酸 |
X12531 | 489 | 19 | 20 | 26 | MIP-1α |
U14332 | 20 | 14 | 15 | 12 | IL-15 |
M59378 | 580 | 10 | 13 | 11 | TNFR1 |
U37522 | 151 | 6 | 6 | 6 | TRAIL |
M57999 | 172 | 3.8 | 3.5 | 3.4 | NF-κB |
U36277 | 402 | 3.2 | 3.5 | 2.7 | I-κB(α亚基) |
X76850 | 194 | 3 | 3.8 | 2.5 | MAPKAP-2 |
U06924 | 858 | 2.4 | 3 | 3.2 | Stat1 |
X14951 | 592 | 2 | 2 | 2 | CD18 |
X60671 | 543 | 1.9 | 2.4 | 2.8 | NF-2 |
M34510 | 5970 | 1.6 | 2 | 1.4 | CD14 |
X5143g | 2702 | 1.3 | 2.2 | 2.0 | 波形蛋白 |
X68932 | 4455 | 0.5 | 0.7 | 0.5 | c-Fms |
Z21848 | 352 | 0.5 | 0.6 | 0.6 | DNA聚合酶 |
X70472 | 614 | 0.4 | 0.6 | 0.5 | B-myb |
[00156]表58:被细菌产物LPS、LTA和CpG DNA有差异地调节的多聚核苷酸。发现细菌产物(100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、1μg/ml金黄葡萄球菌LTA或1μMCpG)有效地诱导数种多聚核苷酸的表达。将细菌产物与RAW细胞共同温育4小时,分离出RNA,转变为标记的cDNA探针,并将其与Atlas阵列杂交。未被刺激的对照细胞中的强度显示在第二列。“比值:LPS/LTA/CpG:对照”一列是指被细菌产物刺激的细胞中的多聚核苷酸表达强度除以未受刺激的细胞的强度得到的结果。
登记号 | 对照未刺激强度 | 比值LPS:对照 | 比值LTA:对照 | 比值CpG:对照 | 蛋白/多聚核苷酸 |
X72307 | 20 | 1.0 | 23 | 1.0 | 肝细胞生长因子 |
L38847 | 20 | 1.0 | 21 | 1.0 | 肝癌跨膜激酶配体 |
L34169 | 393 | 0.3 | 3 | 0.5 | 血小板生成素 |
J04113 | 289 | 1 | 4 | 3 | Nur77 |
Z50013 | 20 | 7 | 21 | 5 | H-ras原癌多聚核苷酸 |
X84311 | 20 | 4 | 12 | 2 | 细胞周期蛋白A1 |
U95826 | 20 | 5 | 14 | 2 | 细胞周期蛋白G2 |
X87257 | 123 | 2 | 4 | 1 | Elk-1 |
J05205 | 20 | 18 | 39 | 20 | Jun-D |
J03236 | 20 | 11 | 19 | 14 | Jun-B |
M83649 | 20 | 71 | 80 | 42 | Fas1受体 |
M83312 | 20 | 69 | 91 | 57 | CD40L受体 |
X52264 | 20 | 17 | 23 | 9 | ICAM-1 |
M13945 | 573 | 2 | 3 | 2 | Pim-1 |
U60530 | 193 | 2 | 3 | 3 | Mad相关蛋白 |
D10329 | 570 | 2 | 3 | 2 | CD7 |
X06381 | 20 | 55 | 59 | 102 | 白血病抑制因子(LIF) |
X70296 | 20 | 6.9 | 13 | 22 | 蛋白酶连接蛋白1(PN-1) |
U36340 | 20 | 38 | 7 | 7 | CACCC框结合蛋白BKLF |
S76657 | 20 | 11 | 6 | 7 | CRE-BPI |
U19119 | 272 | 10 | 4 | 4 | 干扰素诱导性蛋白1 |
[00157]表59:证实表57和表58的阵列数据。a)总RNA分离自未刺激的RAW巨噬细胞和用100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、1μg/ml金黄葡萄球菌LTA、1μMCpG DNA或单独的培养基处理了4小时的细胞,实施Northern印迹杂交,探查膜上的GAPDH、CD14、波形蛋白和三重四脯氨酸碱性蛋白,如以前所述[Scott等]。将Northern印迹的杂交强度与GAPDH作比较,以发现上样方面的不一致。这些实验至少被重复三次,表示的数据是各种条件相对于培养基的平均水平(使用密度分析法测量)±标准偏差。
b)用100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、1μg/ml金黄葡萄球菌LTA、1μM CpGDNA或单独的培养基刺激RAW 264.7细胞24小时。制备蛋白裂解物,在SDS-PAGE凝胶上分离,实施Western印迹杂交以检测LIF(R&D系统)。这些实验至少被重复三次,表示的数据是LIF相对于培养基的水平(使用密度分析法测量)±标准偏差。
c)用100ng/ml鼠伤寒沙门氏菌LPS、1μg/ml金黄葡萄球菌LTA、1μM CpG DNA或单独的培养基刺激RAW巨噬细胞24小时,收集细胞上清,使用Griess试剂检测上清中的NO形成量,NO量是用稳定的NO代谢物亚硝酸盐的积累量来估计的,方法如前面所述[Scott等]。表示的数据是三个实验的平均值±标准偏差。
产物 | 相对水平 | |||
未处理 | LPS | LTA | CpG | |
CD14a | 1.0 | 2.2±0.4 | 1.8±0.2 | 1.5±0.3 |
波形蛋白a | 1.0 | 1.2±0.07 | 1.5±0.05 | 1.3±0.07 |
三重四脯氨酸碱性蛋白a | 1.0 | 5.5±0.5 | 5.5±1.5 | 9.5±1.5 |
LIFb | 1.0 | 2.8±1.2 | 2.7±0.6 | 5.1±1.6 |
NOc | 8±1.5 | 47±2.5 | 20±3 | 21±1.5 |
[00158]表60:A549人上皮细胞中被细菌信号传导分子(LPS)增量调节的基因表达谱型。多聚核苷酸微阵列的研究表明,Ecoli O111:B4 LPS(100ng/ml)增加A549细胞中许多多聚核苷酸的表达。将LPS与A549细胞共同温育4小时,分离出RNA。用5μg总RNA制备Cy3/Cy5标记的cDNA探针,并将其与Human Operon阵列(PRHU04)杂交。未被刺激的细胞中的强度显示在表55的第三列。被LPS刺激的细胞中的多聚核苷酸表达变化的这些例子代表着它们与未处理的细胞相比,强度水平的变化在2倍以上。
登记号 | 基因 |
AL050337 | 干扰素γ受体1 |
U05875 | 干扰素γ受体2 |
NM_002310 | 白血病抑制因子受体 |
U92971 | 凝固作用因子II(凝血酶)受体样2 |
Z29575 | 肿瘤坏死因子受体超家族成员17 |
L31584 | 趋化因子受体7 |
J03925 | cAMP应答元件结合蛋白 |
M64788 | RAP1,GTP酶激活蛋白 |
NM_004850 | Rho相关性激酶2 |
D87451 | 环指蛋白10 |
AL049975 | 未知 |
U39067 | 真核翻译起始因子3,亚基2 |
AK000942 | 未知 |
AB040057 | 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MASK |
AB020719 | KIAA0912蛋白 |
AB007856 | FEM-1样死亡受体结合蛋白 |
AL137376 | 未知 |
AL137730 | 未知 |
M90696 | 组织蛋白酶S |
AK001143 | 未知 |
AF038406 | NADH脱氢酶 |
AK000315 | 假想蛋白FLJ20308 |
M54915 | pim-1癌基因 |
D29011 | 蛋白酶体亚基,β型,5 |
AL034348 | 未知 |
D87076 | KIAA0239蛋白 |
AJ001403 | 气管支气管粘蛋白5,亚型B, |
J03925 | 整连蛋白,αM |
实施例10
改变信号传导以防御细菌感染
[00159]鼠伤寒沙门氏菌株SL1344由美国典型培养物保藏中心(ATCC;Manassas,VA)获得,在Luria-Bertani(LB)液体培养基中培养。为了实施巨噬细胞感染,将冷冻的甘油储物接种到盛于125ml摇瓶的10ml LB中,37℃振荡过夜培养至稳定相。将RAW 264.7细胞(1×105个细胞/孔)接种到24孔板中。用培养基稀释细菌直至可获得标称复合感染(MOI),约为100,通过1000rpm的10分钟离心使细菌离心到单层细胞上,以使感染同步发生,再让感染于37℃在5%CO2培养箱中继续进行20分钟。用PBS洗细胞3次以除去细胞外的细菌,然后将细胞在含有100μg/ml庆大霉素(Sigma,St.Louis,MO)的DMEM+10%FBS中温育以杀死任何残留的细胞外细菌,避免再感染。两小时后,将庆大霉素浓度降至10μg/ml,并在整个分析中维持该值。细胞在感染前用具有以下浓度的抑制剂预处理30分钟:50μM PD98059(Calbiochem),50μM U 0126(Promega),2mM二苯碘(DPI),250μM乙酰香兰酮(夹竹桃麻素,Aldrich),1mM抗坏血酸(Sigma),30mM N-乙酰半胱氨酸(Sigma)和2mM NG-L-一甲基精氨酸(L-NMMA,Molecular Probe)或2mM NG-D-一甲基精氨酸(D-NMMA,Molecular Probe)。在感染后的即刻、2小时和6-8小时再加入新鲜的抑制剂,以保证效力。对照细胞用每毫升培养基同等体积的二甲基亚砜(DMSO)处理。鼠伤寒沙门氏菌SL1344在细胞内的存活/复制用庆大霉素抗性分析测定,如以前所述。简单地说,在感染后2小时和24小时,细胞用PBS洗两次以除去庆大霉素,用含有1%Triton X-100/0.1%SDS的PBS裂解,细胞内的细菌数目由LB琼脂平板上的菌落数计算出。在这些感染条件下,由标准的平板计数估计,巨噬细胞平均每个细胞含有一个细菌,这样便可在感染后的24小时对巨噬细胞进行分析。细菌的纤丝化(filamentation)与细菌应力(stress)有关。NADPH氧化酶和iNOS能被MEK/ERK信号传导激活。结果(表61)清楚的说明,改变细胞信号传导是可藉以解决细胞内沙门氏菌感染的一种方法。由于细菌增量调节人细胞内的多种基因,所以阻断信号传导的这种策略代表了抗感染治疗的一种普遍方法。
[00160]表61:在IFN-γ致敏的RAW细胞中信号传导分子MEK对细胞内细菌的影响。
处理a | 效果b |
0 | 无 |
MEK抑制剂U0126 | 降低细菌纤丝化(细菌应力)c增加细胞内鼠伤寒沙门氏菌数目 |
MEK抑制剂PD98059 | 降低细菌纤丝化(细菌应力)c增加细胞内鼠伤寒沙门氏菌数目 |
NADPH氧化酶抑制剂d | 降低细菌纤丝化(细菌应力)c增加细胞内鼠伤寒沙门氏菌数目 |
实施例11
抗病毒活性
[00161]SDF-1是一种C-X-C趋化因子,它是HIV-1共受体CXCR-4的自然配体。为了抑制HIV-1的复制,考虑趋化因子受体CXCR-4和CCR5作为可能的目标。SDF-1的晶体结构表现出反平行的β-片层和带正电荷的表面,这些特征对于其结合CXCR-4中带负电荷的细胞外环是非常重要的。这些发现说明,趋化因子衍生物、小的CXCR4拮抗剂,或模拟趋化因子的结构或离子性质的激动剂都可以成为治疗X4 HIV-1感染的有用试剂。发现阳离子肽抑制SDF-1诱导的T细胞迁移,这暗示这些肽可以用作CXCR-4拮抗剂。迁移分析如下进行。用趋化性培养基(RPMI1640/10mM Hepes/0.5%BSA)将人Jurkat T细胞重悬至5×106个细胞/ml。利用5μm聚碳酯Transwell插件(Costar)在24孔板中实施迁移分析。简单地说,肽或对照用趋化性培养基稀释,并置于下位腔中,同时将0.1ml细胞(5×106个/ml)加入到上位腔中。37℃ 3小时后,用流式细胞仪测定迁移到下位腔中的细胞数目。下位腔的培养物用30秒的时间穿过FACscan,开启前部和侧部分散器以排出细胞碎片。将活细胞的数目与“100%迁移对照”作比较,对于后者,5×105个细胞被直接移液到下位腔中,然后用FACscan计数30秒。结果说明,肽的加入导致人JurkatT细胞的迁移受到抑制(表62),这很可能是因为CXCR-4的表达受到影响(表63和64)。
[00162]表62:肽抑制人Jurkat T细胞的迁移:
迁移(%) | ||||
实验 | 阳性对照 | SDF-1(100ng/ml) | SDF-I+SEQ ID 1(50μg/ml) | 阴性对照 |
1 | 100% | 32% | 0% | <0.01% |
2 | 100% | 40% | 0% | 0% |
[00163]表63:对应于表56的多聚核苷酸阵列数据:
多聚核苷酸/蛋白 | 多聚核苷酸功能 | 未刺激强度 | 比值肽:未刺激 | 登记号 |
CXCR-4 | 趋化因子受体 | 36 | 4 | D87747 |
[00164]表64:对应于表62和63的FACs数据:
肽 | 浓度(μg/ml) | 蛋白表达的倍数增加CXCR-4 |
SEQ ID NO:1 | 10 | 没有变化 |
SEQ ID NO:1 | 50 | 1.3±0.03 |
SEQ ID NO:1 | 100 | 1.6±0.23 |
SEQ ID NO:3 | 100 | 1.5±0.2 |
[00164]尽管本发明已经通过引用优选的实施方案被描述,但是应该理解,可以在不脱离本发明的精神的情况下作出各种改变。因此,本发明仅受权利要求的限制。
Claims (99)
1.一种鉴定受一种或多种脓毒症或炎症诱导物调节和被肽变更的多聚核苷酸或多聚核苷酸谱型的方法,该方法包括将一种或多种多聚核苷酸与一种或多种脓毒症或炎症诱导物接触,并同时或随后立即将该种或该多种多聚核苷酸与肽接触,检测表达上的变化,其中一种变化作为受脓毒症或炎症诱导物调节和被肽降低的多聚核苷酸或多聚核苷酸谱型的标志。
2.根据权利要求1的方法,其中该脓毒症或炎症诱导物为LPS,LTA或CpGDNA,细菌成分或整个细胞,或相关试剂。
3.根据权利要求1的方法,其中所述检测表达上的变化包括在和脓毒症或炎症诱导物接触之前和之后检测多聚核苷酸的表达水平。
4.通过权利要求1的方法确定的多聚核苷酸或多聚核苷酸谱型。
5.根据权利要求4的多聚核苷酸或多聚核苷酸谱型,其中该多聚核苷酸编码涉及炎症或脓毒症应答的多肽。
6.一种鉴定阻止脓毒症或炎症的试剂的方法,该方法包括将含有权利要求5的多聚核苷酸的细胞与一种试剂接触,其中,与不存在该试剂时的表达相比较,在存在该试剂时该多聚核苷酸的表达受到了调节,并且在表达上的这种调节影响炎症或脓毒症应答。
7.根据权利要求6的方法,其中该影响为抑制炎症或脓毒症应答。
8.通过权利要求6的方法确定的试剂。
9.根据权利要求8的试剂,其中该试剂为肽、肽模拟物、化学化合物、核酸分子或多肽。
10.根据权利要求9的试剂,其中该肽是选自SEQ ID NO:11-54。
11.一种鉴定代表炎症或脓毒症应答受抑制的多聚核苷酸表达谱型的方法,该方法包括:
在存在或缺少肽的情况下,将细胞与LPS、LTA、CpG DNA和/或完整细菌或细菌成分接触;以及
检测在存在或缺少该肽的情况下细胞的多聚核苷酸表达谱型,其中在该肽存在时的谱型代表炎症或脓毒症应答受到抑制。
12.一种鉴定抑制炎症或脓毒症应答的化合物的方法,该方法包括将细胞与一种或多种被怀疑能够抑制炎症或脓毒症应答的化合物接触,确定提供了与权利要求11所述方法中得到的抑制炎症或脓毒症应答的肽所得到的相类似的谱型的多聚核苷酸表达谱型的化合物。
13.通过权利要求12的方法确定的化合物。
14.一种鉴定强化先天免疫的试剂的方法,该方法包括:
将一种或多种编码涉及先天免疫的多肽的多聚核苷酸与感兴趣的试剂接触,其中,与不存在该试剂时的多聚核苷酸表达相比较,在存在该试剂时该多聚核苷酸的表达被调节,并且该被调节的表达导致先天免疫的强化。
15.根据权利要求14的方法,其中该试剂不刺激脓毒症反应。
16.根据权利要求14的方法,其中该试剂减少炎症或脓毒症应答。
17.根据权利要求14的方法,其中该试剂阻止炎症或脓毒症应答。
18.根据权利要求16或17中任一项所述的方法,其中该试剂增加编码抗炎基因的多聚核苷酸的表达。
19.根据权利要求18的方法,其中抗炎基因选自包括IL-1 R拮抗剂同源物1(AI167887)、IL-10Rβ(AA486393)、IL-10 Rα(U00672)、TNF受体成员1B(AA150416)、TNF受体成员5(H98636)、TNF受体成员11b(AA194983)、HLAII的IK细胞因子减量调节物(R39227)、TGF-B诱导性早期生长应答2(AI473938)、CD2(AA927710)、糖皮质素相关性多聚核苷酸(AK000892)或IL-10(M57627)的基因。
20.根据权利要求16的方法,其中该试剂抑制TNF-α的表达。
21.根据权利要求16的方法,其中该试剂抑制白介素的表达。
22.根据权利要求21的方法,其中该白介素为IL-8。
23.根据权利要求16的方法,其中该试剂为肽。
24.根据权利要求23的方法,其中该肽选自SEQ ID NO:11-54。
25.根据权利要求16或17中任一项所述的方法,其中所述的试剂降低蛋白酶体亚基表达。
26.根据权利要求25的方法,其中所述的蛋白酶体亚基包括具有登记号D11094,L02426,D00763,AB009398,AF054185,M34079,M34079或AL031177的多聚核苷酸。
27.根据权利要求14的方法,其中该试剂为锌指蛋白(AF061261);细胞周期基因(S70622);IL-10受体(U00672);转移酶(AF038664);同源框蛋白(AC004774)分叉头型蛋白(AF042832)未知(AL096803);KIAA0284蛋白(AB006622);假想蛋白(AL022393)受体(AF112461);假想蛋白(AK002104);蛋白(AL050261);多肽(AF105424);SPR1蛋白(AB031480);脱氢酶(D17793);转移酶(M63509);和过氧化物酶体因子(AB013818)。
28.通过权利要求14的方法确定的试剂。
29.权利要求28所述的试剂,其中该试剂为肽、肽模拟物、化学化合物或核酸分子。
30.一种鉴定多聚核苷酸表达谱型以确定选择性地强化先天免疫的化合物的方法,该方法包括:
检测在有肽接触时和无肽接触时细胞的多聚核苷酸表达谱型,其中,在该肽存在时的谱型代表刺激先天免疫;
检测在有一种受测化合物接触时细胞的多聚核苷酸表达谱型,其中,使用该受测化合物时的谱型与在该肽存在时观察到的谱型相类似,则表示化合物强化先天免疫。
31.根据权利要求30的方法,其中该化合物不刺激脓毒症反应。
32.根据权利要求30的方法,其中该多聚核苷酸表达谱型包括炎性的多聚核苷酸的表达。
33.根据权利要求32的方法,其中该炎性的多聚核苷酸包括环指蛋白10(D87451)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MASK(AB040057)、KIAA0912蛋白(AB020719)、KIAA0239蛋白(D87076)、RAP1、GTP酶激活蛋白1(M64788)、FEM-1样死亡受体结合蛋白(AB007856)、组织蛋白酶S(M90696)、假想蛋白FLJ20308(AK000315)、pim-1癌基因(M54915)、蛋白酶体亚基β型5(D29011)、KIAA0239蛋白(D87076)、气管支气管黏蛋白5亚型B(AJ001403)、cAMP应答元件结合蛋白CREBPa、整连蛋白αM(J03925)、与Rho相关的激酶2(NM_004850)、PTD017蛋白(AL050361)、未知基因(AK001143、AK034348、AL049250、AL161991、AL031983)、视黄酸受体(X06614)、G蛋白偶联受体(Z94155、X81892、U52219、U22491、AF015257、U66579)、趋化因子(C-C基序)受体7(L31584)、肿瘤坏死因子受体超家族成员17(Z29575)、干扰素γ受体2(U05875)、细胞因子受体样因子1(AF059293)、I类细胞因子受体(AF053004)、凝集因子II(凝血酶)受体样2(U92971)、白血病抑制因子受体(NM_02310)、干扰素γ受体1(AL050337)或它们的任意组合。
34.根据权利要求30的方法,其中该表达谱型包括编码趋化因子的多聚核苷酸的表达。
35.根据权利要求34的方法,其中该趋化因子包括CXCR4、CXCR1、CXCR2、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、MIP-1α、MDC、MIP-3α、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5和RANTES。
36.根据权利要求30的方法,其中该表达谱型包括细胞分化因子的表达。
37.根据权利要求36的方法,其中该细胞分化因子包括TGFβ诱导性早期生长应答2(AI473938),锌指蛋白(AF061261,U00115,X78924),和转录因子(U31556,AL137681,X68560)。
38.根据权利要求30的方法,其中该多聚核苷酸表达谱型包括细胞表面受体的表达。
39.根据权利要求38的方法,其中该细胞表面受体包括趋化因子受体或整连蛋白受体。
40.通过权利要求30的方法确定的化合物。
41.权利要求40所述的化合物,其中该化合物刺激趋化因子或趋化因子受体表达。
42.权利要求41所述的化合物,其中该趋化因子或趋化因子受体是CXCR4、CCR5、CCR2、CCR6、MIP-1α、IL-8、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4或MCP-5。
43.权利要求40所述的化合物,其中该化合物为肽、肽模拟物、化学化合物或核酸分子。
44.根据权利要求43的化合物,其中所述的肽是选自SEQ ID NO:11-54。
45.根据权利要求40的化合物,其中该化合物改变激酶活性。
46.根据权利要求45的化合物,其中该激酶选自MAP激酶激酶3(D87116),MAP激酶激酶6(H07920),MAP激酶激酶5(W69649),MAP激酶7(H39192),MAP激酶12(AI936909),被MAP激酶激活的蛋白激酶3(W68281),或MAP激酶激酶1(L11284)。
47.一种鉴定能够选择性强化先天免疫的试剂的方法,包括:
将含有一种或多种编码涉及先天免疫的多肽的多聚核苷酸的细胞与感兴趣的试剂接触,其中,与不存在该试剂时的表达相比较,在存在该试剂时该种多聚核苷酸或该多种多聚核苷酸的表达被调节,并且该被调节的表达导致先天免疫的强化。
48.根据权利要求47的方法,其中该表达谱型被应用于筛选强化先天免疫的化合物。
49.一种鉴定既能够抑制或阻止脓毒症或炎症应答又能够强化先天免疫的试剂的方法,包括:
将含有i)一种或多种编码能够抑制炎症或脓毒症应答的多肽的多聚核苷酸和ii)一种或多种编码涉及先天免疫的多肽的多聚核苷酸的细胞与感兴趣的试剂接触,其中,与不存在该试剂时的该种多聚核苷酸或该多种多聚核苷酸表达相比较,在存在该试剂时该种多聚核苷酸或该多种多聚核苷酸的表达被调节,并且该被调节的表达导致炎症或脓毒症应答的抑制和先天免疫的强化。
50.一种由哺乳动物个体的核酸样品推断该个体的感染状态的方法,该方法包括鉴定该核酸样品中的多聚核苷酸表达谱型,例示为表55中的至少两种多聚核苷酸的表达与未感染的个体相比有增加。
51.一种由哺乳动物个体的核酸样品推断该个体的感染状态的方法,该方法包括鉴定该核酸样品中的多聚核苷酸表达谱型,例示为表56中的至少两种多聚核苷酸的表达与未感染的个体相比有减少。
52.一种由哺乳动物个体的核酸样品推断该个体的感染状态的方法,该方法包括鉴定该核酸样品中的多聚核苷酸表达谱型,例示为表57中的至少两种多聚核苷酸与未感染的个体相比较的多聚核苷酸表达。
53.一种用于由其核酸样本推断哺乳动物个体感染情况的方法,该方法包括鉴别该核酸样本中的多聚核苷酸谱型,多聚核苷酸谱型由至少两个选自下列各项的多聚核苷酸变化为例:登记号D87451,环指蛋白10;登记号AL049975,未知;登记号U39067,真核翻译起始因子3亚基2;登记号AK000942,未知;登记号AB040057,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MASK;登记号AB020719,KIAA0912蛋白;登记号AB007856,FEM-1样死亡受体结合蛋白;登记号AL137376,未知;登记号AL137730,未知;登记号M90696,组织蛋白酶S;登记号;登记号AK001143,未知;登记号AF038406,NADH脱氢酶;登记号AK000315,假想蛋白FLJ20308;登记号M54915,pim-1癌基因;登记号D29011,蛋白酶体亚基β型5;登记号AL034348,未知;登记号D87076,KIAA0239蛋白;登记号AJ001403,气管支气管粘蛋白5亚型B;登记号J03925,整连蛋白αM:与Rho相关的激酶2(NM_004850)、PTD017蛋白(AL050361)、未知基因(AK001143、AK034348、AL049250、AL161991、AL031983),视黄酸受体(X06614)、G蛋白偶联受体(Z94155、X81892、U52219、U22491、AF015257、U66579)、趋化因子(C-C基序)受体7(L31584)、肿瘤坏死因子受体超家族成员17(Z29575)、干扰素γ受体2(U05875)、细胞因子受体样因子1(AF059293)、I类细胞因子受体(AF053004)、凝集因子II(凝血酶)受体样2(U92971)、白血病抑制因子受体(NM_002310)、干扰素γ受体1(AL050337)或它们的任意组合。
54.根据权利要求50、51、52或53的任意一个的方法,其中该感染状态由细菌、病毒、真菌或寄生物引起。
55.根据权利要求50、51、52或53的任意一个的方法,其中该感染状态由革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌引起。
56.具有由权利要求50、51、52或53的方法鉴定的感染状态的个体的多聚核苷酸表达谱型。
57.作为CXCR-4的拮抗剂的肽。
58.一种鉴定作为CXCR-4的拮抗剂的肽的方法,包括在该肽存在或不存在的情况下将T细胞和SDF-1接触,并测量趋化性,其中,在该肽存在时趋化性降低,则表明该肽是CXCR-4的拮抗剂。
59.包含通式X1LX2X3KX4X2X5X3PX3X1(SEQ ID NO:11)的被分离的肽,其中X1是一个或两个D、E、S、T或N,X2是一个或两个P、G或D,X3是一个G、A、V、L、I或Y,X4是一个R、K或H,X5是一个S、T、C、M或R。
60.根据权利要求59的肽,其中该肽选自:DLPAKRGSAPGST(SEQ ID NO:12),SELPGLKHPCVPGS(SEQ ID NO:13),TTLGPVKRDSIPGE(SEQ ID NO:14),SLPIKHDRLPATS(SEQ ID NO:15),ELPLKRGRVPVE(SEQ ID NO:16)和NLPDLKKPRVPATS(SEQ ID NO:17)。
61.根据权利要求59的肽,其中该肽具有抗炎症活性。
62.根据权利要求59的肽,其中该肽具有抗脓毒症活性。
63.包含通式X1X2X3X4WX4WX4X5K(SEQ ID NO:18)的被分离的肽,其中X1是一至四个选自A、P或R的氨基酸,X2是一个或两个芳香性氨基酸(F、Y和W),X3是一个P或K,X4是零至两个选自A、P、Y或W的氨基酸,X5是一至三个选自R或P的氨基酸。
64.根据权利要求63的肽,其中该肽选自:RPRYPWWPWWPYRPRK(SEQID NO:19),RRAWWKAWWARRK(SEQ ID NO:20),RAPYWPWAWARPRK(SEQ ID NO:21),RPAWKYWWPWPWPRRK(SEQ ID NO:22),RAAFKWAWAWWRRK(SEQ ID NO:23)和RRRWKWAWPRRK(SEQ ID NO:24)。
65.根据权利要求63的肽,其中该肽具有抗炎症活性。
66.根据权利要求63的肽,其中该肽具有抗脓毒症活性。
67.包含通式X1X2X3X4X1VX3X4RGX4X3X4X1X3X1(SEQ ID NO:25)的被分离的肽,X1是一个或两个R或K,X2是一个极性或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H),X3是C、S、M、D或A,X4是F、I、V、M或R。
68.根据权利要求67的肽,其中该肽选自:RRMCIKVCVRGVCRRKCRK(SEQID NO:26),KRSCFKVSMRGVSRRRCK(SEQ ID NO:27),KKDAIKKVDIRGMDMRRAR(SEQ ID NO:28),RKMVKVDVRGIMIRKDRR(SEQ ID NO:29),KQCVKVAMRGMALRRCK(SEQ ID NO:30)和RREAIRRVAMRGRDMKRMRR(SEQ ID NO:31)。
69.根据权利要求67的肽,其中该肽具有抗炎症活性。
70.根据权利要求67的肽,其中该肽具有抗脓毒症活性。
71.包含通式X1X2X3X4X1VX5X4RGX4X5X4X1X3X1(SEQ ID NO:32)的被分离的肽,X1是一个或两个R或K,X2是一个极性或带电荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H),X3是一个C、S、M、D或A,X4是一个F、I、V、M或R,X5是一个A、I、S、M、D或R。
72.根据权利要求71的肽,其中该肽选自:RTCVKRVAMRGIIRKRCR(SEQID NO:33),KKQMMKRVDVRGISVKRKR(SEQ ID NO:34),KESIKVIIRGMMVRMKK(SEQ ID NO:35),RRDCRRVMVRGIDIKAK(SEQ IDNO:36), KRTAIKKVSRRGMSVKARR(SEQ ID NO:37)和RHCIRRVSMRGIIMRRCK(SEQ ID NO:38)。
73.根据权利要求71的肽,其中该肽具有抗炎症活性。
74.根据权利要求71的肽,其中该肽具有抗脓毒症活性。
75.包含通式KX1KX2FX2KMLMX2ALKKX3(SEQ ID NO:39)的被分离的肽,其中X1是一个极性氨基酸(C、S、T、M、N和Q);X2是一个A、L、S或K,X3是1-17个选自G、A、V、L、I、P、F、S、T、K和H的氨基酸。
76.根据权利要求75的肽,其中该肽选自:KCKLFKKMLMLALKKVLTTGLPALKLTK(SEQ ID NO:40),KSKSFLKMLMKALKKVLTTGLPALIS(SEQ ID NO:41),KTKKFAKMLMMALKKVVSTAKLAILS(SEQ ID NO:42),KMKSFAKMLMLALKKVLKVLTTALTLKAGLPS(SEQ ID NO:43),KNKAFAKMLMKALKKVTTAAKPLTG (SEQ ID NO:44)和KQKLFAKMLMSALKKKTLVTTPLAGK(SEQ ID NO:45)。
77.根据权利要求75的肽,其中该肽具有抗炎症活性。
78.根据权利要求75的肽,其中该肽具有抗脓毒症活性。
79.包含通式KWKX2X1X1X2X2X1X2X2X1X1X2X2IFHTALKPISS(SEQ ID NO:46)的被分离的肽,其中,X1是疏水性氨基酸,X2是亲水性氨基酸。
80.根据权利要求79的肽,其中该肽选自:KWKSFLRTFKSPVRTIFHTALKPISS(SEQ ID NO:47),KWKSYAHTIMSPVRLIFHTALKPISS(SEQ ID NO:48),KWKRGAHRFMKFLSTIFHTALKPISS(SEQ ID NO:49),KWKKWAHSPRKVLTRIFHTALKPISS(SEQ ID NO:50),KWKSLVMMFKKPARRIFHTALKPISS(SEQ ID NO:51)和KWKHALMKAHMLWHMIFHTALKPISS(SEQ ID NO:52)。
81.根据权利要求79的肽,其中该肽具有抗炎症活性。
82.根据权利要求79的肽,其中该肽具有抗脓毒症活性。
83.含有序列KWKSFLRTFKSPVRTVFHTALKPISS(SEQ ID NO:53)的被分离的肽。
84.含有序列KWKSYAHTIMSPVRLVFHTALKPISS(SEQ ID NO:54)的被分离的肽。
85.降低SDF-1受体的多聚核苷酸表达的被分离的肽。
86.根据权利要求59-84的任何一项的肽,其中所述的肽包含至少一个D-对映异构体的氨基酸。
87.根据权利要求59-84的任何一项的肽,其中所述的肽是环状的。
88.根据权利要求57或59-87的任何一项的肽,其中所述的肽是阳离子性的。
89.根据权利要求86或88的肽,其中所述的肽是环状的。
90.一种刺激个体的先天免疫的方法,该方法包括给予个体一个可以达到医疗效果的数量的肽来刺激免疫应答,所述的肽被阐述在SEQ ID NO:1-3、11、18、25、32、39、46、53或54中。
91.根据权利要求90的方法,其中所述的先天免疫被宿主免疫细胞的激活、增殖、分化、细胞表面的抗原表达、细胞骨架的重构或者MAP激酶通路的激活所证明。
92.根据权利要求91的方法,其中所述的MAP激酶是MEK和/或ERK。
93.根据权利要求90的方法,其中所述的肽有抗炎症活性。
94.根据权利要求90的方法,其中所述的肽有抗脓毒症活性。
95.根据权利要求90的方法,其中所述的肽包含至少一个D-对映异构体的氨基酸。
96.根据权利要求90的方法,其中所述的肽是环状的。
97.根据权利要求1-3、11、12、23、24、30-39、58、90-96的任何一项的方法,其中所述的肽是阳离子性的。
98.根据权利要求1-3、11、12、23、24、30-39、58、90-97的任何一项的方法,其中所述的肽是反向的。
99.根据权利要求57或59-89的任何一项的肽,其中所述的肽是反向的。
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