WO2006137444A1 - リポアラビノマンナンの反応性除去方法とその応用 - Google Patents

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WO2006137444A1
WO2006137444A1 PCT/JP2006/312420 JP2006312420W WO2006137444A1 WO 2006137444 A1 WO2006137444 A1 WO 2006137444A1 JP 2006312420 W JP2006312420 W JP 2006312420W WO 2006137444 A1 WO2006137444 A1 WO 2006137444A1
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lam
metal salt
limulus reagent
limulus
reactivity
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PCT/JP2006/312420
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Inventor
Shigenori Tanaka
Shoji Takahashi
Original Assignee
Seikagaku Corporation
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
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    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25125—Digestion or removing interfering materials

Definitions

  • the present invention relates to a method for removing the reactivity of lipoarabinomannan to Limulus reagent, a method for measuring endotoxin in a sample containing lipoarabinomannan to which this is applied, and a method for detecting endotoxin-related diseases,
  • the present invention relates to an endotoxin measurement kit and a diagnostic kit for endotoxin-related diseases.
  • Limulus reagent (also referred to as lysate reagent) is a reagent mainly composed of kabutogani's amebocyte lysate, and is used to detect and measure Et and BG.
  • Limulus reagent has reactivity to Et and BG, and when Limulus reagent comes into contact with these substances, a cascade reaction involving various factors in Limulus reagent (hereinafter referred to as “Limulus reaction”) occurs. These substances can be detected and measured by detecting this reaction.
  • LAM is known to be a cell wall component peculiar to acid-fast bacteria (for example, Mycobacterium tuberculosis).
  • Patent Document 1 discloses an Et stabilizer containing an alkaline earth metal salt as one of active ingredients, an Et measurement method using the same, and the like. However, there is no disclosure or suggestion that this alkaline earth metal salt has the effect of removing the reactivity of LAM to Limulus reagent.
  • Patent Document 2 discloses a method for measuring Et or the like, characterized in that plasma or serum is treated with a mixed aqueous solution of calcium chloride and potassium hydroxide to obtain a test solution.
  • this salt calcium power has the effect of eliminating the reactivity of LAM to Limulus reagent There is no description or suggestion.
  • the lyophilized product of the Limulus reagent is usually used after being dissolved in water, a sample solution, a buffer solution or the like.
  • the buffer has the effect of eliminating the reactivity of LAM to Limulus reagent.
  • Patent Document 3 discloses a method for measuring a Limulus reagent-reactive substance in a specimen using a Limulus reagent containing Kabutoga-Amebosite 'lysate and a compound having a specific structure having a buffering action as an active ingredient. Etc. are described. However, there is no disclosure or suggestion that the above compounds have the effect of eliminating the reactivity of LAM to Limulus reagent.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-75751
  • Patent Document 2 JP-A-4-1366763
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 7-239332
  • the present inventors make it difficult for LAM to react with the Limulus reagent, and therefore, when using a sample containing both Et and LAM, it is difficult to quantitatively measure Et without the influence of LAM. I discovered that. Therefore, the present invention provides a method for removing the reactivity of LAM to a Limulus reagent, a method for measuring Et in a sample containing LAM and a method for detecting an Et-related disease, and a kit for measuring Et used in these. The problem is to provide diagnostic kits for Et-related diseases.
  • the present inventor made a sample containing LAM coexist with a metal salt or a buffer, whereby the LAM contained in the sample was tested against the Limulus reagent.
  • a method for removing reactivity of LAM to Limulus reagent, a method for measuring Et in a sample containing LAM and a method for detecting Et-related diseases, etc. We have provided Et measurement kits and diagnostic kits for Et-related diseases.
  • the present invention provides the method or kit described in the following (1) to (17).
  • the metal salt is one or more metal salts selected from sulfate, metal salt, and nitrate power.
  • a method for removing the reactivity of LAM in the sample with respect to the Limulus reagent which includes at least a step (step) in which a buffer is allowed to coexist in the sample containing LAM (hereinafter referred to as “removal method 2 of the present invention”) .
  • the buffer is one or more buffers selected as follows.
  • a method (hereinafter referred to as “the Et measurement method of the present invention”) including at least a step (process) to perform.
  • Et measuring method including at least the following steps (a) and (b);
  • a method for detecting an Et-related disease (hereinafter referred to as “the disease detection method of the present invention”), characterized in that the method according to any one of (8) to (11) is used. .
  • an Et measurement kit (hereinafter referred to as “the Et measurement kit of the present invention”) used for the measurement of Et with reduced effects of LAM, comprising a Limulus reagent and a metal salt or buffer as constituent components. ).
  • the metal salt is one or more metal salts selected from sulfate, metal salt, and nitrate power.
  • the disease diagnosis kit of the present invention comprising the kit according to any one of (13) to (17).
  • a reactive remover containing a metal salt as an active ingredient and used to remove the reactivity of LAM to Limulus reagent hereinafter referred to as “the present reactive remover 1”.
  • a reactive remover containing a buffer as an active ingredient and used to remove the reactivity of LAM to Limulus reagent (hereinafter referred to as “the present reactive remover 2”).
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between sodium sulfate concentration and relative LAM activity in Limulus reaction using Takipreus tridentus lysate.
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship between the sodium sulfate concentration and the relative activity of Et in the Limulus reaction using lysates derived from Takipreus' tridentatus.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the sodium sulfate concentration and the relative activity of LAM in the Limulus reaction using Limulus' polyphemus lysate.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between the sodium sulfate concentration and the relative activity of Et in the Limulus reaction using Limulus' polyphemus lysate.
  • FIG. 5 is a graph showing the relationship between sodium sulfate concentration and relative activity of LAM in a Limulus reaction using an Et-specific Limulus reagent.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between sodium sulfate concentration and the relative activity of Et in the Limulus reaction using an Et-specific Limulus reagent.
  • FIG. 7 is a graph showing the relationship between the sodium chloride sodium concentration and the relative activity of LAM in the Limulus reaction using an Et-specific Limulus reagent.
  • FIG. 8 is a graph showing the relationship between sodium chloride sodium concentration and the relative activity of Et in Limulus reaction using an Et-specific Limulus reagent.
  • FIG. 9 is a graph showing the relationship between the tris-HCl buffer concentration and the relative activity of LAM in the Limulus reaction using Takipreus tridentus-derived lysate.
  • FIG. 10 is a graph showing the relationship between the Tris-HCl buffer solution concentration and the relative activity of Et in the Limulus reaction using Takipreus tridentus lysate.
  • FIG. 11 is a graph showing the relationship between the concentration of Tris-HCl buffer and the relative activity of LAM in the Limulus reaction using Limulus * polypheme lysate.
  • the removal method 1 of the present invention is a method for removing the reactivity of LAM in a sample with respect to the Limulus reagent, including at least a step of allowing a metal salt to coexist in a sample containing LAM.
  • the "sample containing LAM” is not particularly limited as long as it is a sample containing or possibly containing LAM. Since LAM is a cell wall component peculiar to acid-fast bacteria, for example, live bacteria killed by acid-fast bacteria (e.g., Mycobacterium tuberculosis), the cell wall, a sample containing or possibly containing the cell wall component Etc. are exemplified. An example of such a sample is a tuberculosis vaccine.
  • a “biological sample” can also be used as a “sample containing LAM”.
  • the “biological sample” is not particularly limited, but is preferably a body fluid.
  • the body fluid is not particularly limited as long as it is a body fluid containing or possibly containing LAM.
  • blood used in this specification as a concept including serum and plasma
  • sputum sputum
  • cerebrospinal fluid urine
  • sweat saliva
  • tears joint fluid
  • I like blood I like blood.
  • a Limulus reaction interfering factor serpinase, serine protease inhibitor, etc.
  • JP-A-58-85162 a known method for removing or inactivate in advance by the method described in 1).
  • the metal salt may be any metal salt that can be used as long as it has an action of removing the reactivity of LAM to the Limulus reagent in the sample containing LAM.
  • the type, number, combination, etc. are not particularly limited.
  • the metal salt only one kind of metal salt may be used, or a plurality of kinds of metal salts may be used in combination. For example, a mixture of a plurality of types of metal salts may be used.
  • the metal salt is not limited by its existence state or form, for example, it may be a solid state metal salt itself that is made into a powder, but may be dissolved in a solution exemplified by purified water.
  • Metal salts include, for example, surfactants, anti-tuberculosis antibodies, anti-LAM antibodies, BG, carbo It may exist as a mixture with components other than the metal salts exemplified in xymethylated BG, strong alkaline substance, polymyxin B, colistin, concanavalin histidine, histamine and limulus reagent.
  • metal salt surfactant for example, metal salt surfactant, anti-tuberculosis antibody, anti-LAM antibody, BG, carboxymethylated BG, strong alkaline substance, polymyxin B, colistin, concanavalin-8, histidine and histamine If it is present as a mixture with a quality, it is more preferable to use the mixture, and the effect of removing the reactivity of LAM to the Limulus reagent is expected.
  • the metal salt is present as a mixture with the Limulus reagent, and the sample containing LAM contains or may contain Et
  • the Limulus reaction induced by Et in the sample after the coexistence is detected or measured. Can be measured without being affected by LAM or with reduced LAM.
  • the measurement method refer to ⁇ 3> Et measurement method of the present invention described later.
  • metal salt preferably include sulfate, metal chloride, nitrate, and the like.
  • metal salts selected from the following group strengths are more preferable.
  • the metal salt may contain either or both of sodium sulfate and sodium chloride, but it is particularly preferable that the metal salt contains at least sodium sulfate. .
  • the concentration of the metal salt in the sample after the coexistence of the metal salt in the step of coexisting the metal salt with the sample containing LAM (hereinafter simply referred to as "the metal salt in the sample”).
  • the final concentration is not particularly limited as long as it is a concentration capable of removing the reactivity of LAM to the Limulus reagent in a sample containing LAM.
  • the above reaction desired by those who implement Invention Removal Method 1. It can be appropriately set by those skilled in the art according to the degree of the effect of removing the property.
  • the effect of removing the reactivity of LAM to the Limulus reagent can be enhanced.
  • the final concentration of the metal salt in the sample is “removal of reactivity of LAM to the Limulus reagent” and “removal of the Limulus reagent”. It can be determined in the balance of “maintaining reactivity to Et”. For example, if the former is more important, the concentration of the metal salt in the sample should be increased even more at the expense of the latter. If the latter is more important, the concentration of the metal salt in the sample will be higher. It is preferable not to increase it.
  • the metal salt in order to eliminate the reactivity of LAM to the Limulus reagent while maintaining the reactivity of the Limulus reagent to Et, it is necessary to coexist the metal salt so that the final concentration of the metal salt in the sample is 20 to 500 mM. It is more preferable to make the metal salt coexist so that it is preferably 30 to 500 mM. Moreover, it is also preferable to coexist a metal salt so that it may become 30-300 mM.
  • the final concentration of sodium sulfate in the sample is 30 to 200 mM, preferably 30 to 100 mM. It is particularly preferable that the coexistence is such that the coexistence is 40 to 80 mM, and the coexistence is preferably about 60 mM, more preferably 50 to 70 mM.
  • sodium chloride used as the metal salt, it is preferable to coexist so that the final concentration of sodium chloride in the sample is 150 to 500 mM, and the ability to coexist to be 200 to 400 mM. More preferably, it is particularly preferable that the coexistence is 250 to 350 mM.
  • magnesium sulfate when used as the metal salt, it is more preferable to coexist so that the final concentration of magnesium sulfate in the sample is 80 to 300 mM, and it is more preferable to coexist so as to be 100 to 200 mM.
  • potassium sulfate when used as the metal salt, it is preferable to coexist so that the final concentration power of potassium sulfate in the sample is 50 to 200 mM, and more preferable to coexist so as to be 50 to 150 mM.
  • magnesium chloride when using magnesium chloride as the metal salt, It is preferable to coexist so that the final concentration of Nesym is 80 to 300 mM. It is more preferable to coexist so that it becomes 100-25 OmM.
  • salty potassium when using salty potassium as a metal salt, it is preferable to coexist so that the final concentration of salty potassium in the sample is 200 to 500 mM. Is more preferable.
  • sodium nitrate when sodium nitrate is used as the metal salt, it is preferable to coexist so that the final concentration of sodium nitrate in the sample is 150 to 400 mM, more preferably 200 to 300 mM.
  • potassium nitrate used as the metal salt, it is preferable to coexist so that the final concentration of nitric acid nitrate in the sample is 150 to 400 mM, more preferably 180 to 300 mM.
  • salty calcium when using salty calcium as a metal salt, it is preferable to coexist so that the final concentration of salty calcium in the sample is 100 to 300 mM, more preferably 130 to 200 mM. preferable.
  • the final concentration of the metal salt in the sample can be determined as appropriate depending on the degree of LAM reactivity removal desired by the person who performs the removal method 1 of the present invention. Specifically, it is preferable to select the final concentration of the metal salt in the sample so that the relative activity of LAM is 20% or less. The final concentration of the metal salt in the sample is selected so that it is 10% or less. Select the final concentration of the metal salt in the sample so that it is less than 1%, which is the most preferable. Is particularly preferred.
  • the relative activity of LAM is the reactivity value of LAM with respect to the Limulus reagent when a certain metal salt is present at a certain final concentration. It means the percentage (%) calculated by dividing by the value of reactivity of LAM to Limulus reagent when it is not used. Specifically, it can be calculated by the method described in the examples, so please refer to this.
  • the Limulus reagent is not particularly limited as long as it is a reagent mainly composed of Kabutoga two amibocyte lysate.
  • This kind of horseshoe is also not limited, but Limulus 'Polyphemus (North American power butuga), Takipreus' Tridentus, Takipreus 'Gigas, Takipreus' mouth Tandhi power Uda (above Asian power Butuga), Missing amemosite lysates can also be used.
  • Gamebosite Lai Seto is a known method (e.g., using a supernatant solution by rupturing amoebosite by adding distilled water to kabutoga-gamebosite and slowly swirling overnight on a shaking table at 4 ° C.
  • a 0.02M Tris-HCl buffer solution pH 8.0
  • a commercially available Limulus reagent may also be used.
  • Such a Limulus reagent may be a Limulus reagent that reacts with both Et and BG, but does not react with BG!
  • the Limulus reagent prepared as described above (in this application document, “Et It is preferably referred to as “specific limulus reagent”.
  • This Et-specific Limulus reagent can be prepared by a known method (eg, a method in which Liproz reagent coexists with aprotun, a method in which Limulus reagent coexists with alkyl dalcoside, (1 ⁇ 3) —polycarboxylic acid derivative of ⁇ D glucan or For example, Endspeciichi ES-50M (Seikagaku Corporation)) can be used.
  • Et-specific limulus reagents include, for example, amevosite lysates containing substances that suppress the G-factor-mediated limulus reaction, such as G-factor activity inhibitors and anti-G-factor antibodies. And the like are exemplified.
  • the removal method 1 of the present invention includes, as steps other than the step of coexisting a metal salt, for example, a step of preparing a sample containing LAM, a step of coexisting a component other than a metal salt in a sample containing LAM, Or a step of evaluating whether the reactivity of LAM to the Limulus reagent has been removed, or the like.
  • components other than the above metal salts include surfactants, anti-tuberculosis antibodies, anti-LAM antibodies, BG, carboxymethylated BG, strong alkaline substances, polymyxin B, colistin, concanavalin eight, histidine, and histamine. Is exemplified.
  • the removal method 1 of the present invention can be applied to specific measurement of Et by performing a step in which a Limulus reagent coexists, for example, as a component other than the above metal salt.
  • specific measurement of Et refer to 3> Invention Et measurement method of the present invention described later.
  • to remove reactivity means to completely remove reactivity. It is also used as a term that means to partially remove (reduce or reduce reactivity).
  • the removal method 2 of the present invention is a method for removing the reactivity of LAM in a sample with respect to the Limulus reagent, which includes at least a step of allowing a buffer to coexist in a sample containing LAM.
  • the concentration of the buffer in the sample after the coexistence of the buffer in the step of coexisting the buffer with the sample containing LAM (hereinafter simply referred to as "final concentration of the buffer in the sample”).
  • concentration of the buffer in the sample Is not particularly limited as long as it is a concentration that can exert the effect of removing the reactivity of LAM to the Limulus reagent in a sample containing LAM, and the type of buffer used and the removal of the present invention are not limited.
  • it can be set appropriately by those skilled in the art, but it is preferably 150-200 mM to coexist so as to be 100-300 mM. More preferably, the coexistence is more preferably about 200 mM! / ,.
  • the buffer is not particularly limited as long as it can have an action of removing the reactivity of LAM to the Limulus reagent in a sample containing LAM.
  • the number, combination, etc. are not particularly limited.
  • the buffer only a single type of buffer may be used, or a plurality of types of buffers may be used in combination. For example, a mixture of a plurality of types of buffering agents may be used.
  • the buffer is not limited by its presence state or form, for example, it may be a solid state buffer that is powdered, but it may be dissolved in a solution exemplified by purified water. May be present as a buffering agent.
  • Buffers include, for example, surfactants, anti-tuberculosis antibodies, anti-LAM antibodies, BG, carboxymethylated BG, strong alkaline substances, polymyxin B, colistin, concan In addition, it may be present as a mixture with components other than the buffering agents exemplified by the non-histamine, histamine and limulus reagents.
  • the mixture is present as a mixture with a quality, it is more preferable to use the mixture, and the effect of removing the reactivity of LAM to the Limulus reagent is expected.
  • the buffer is present as a mixture with the Limulus reagent, and the sample containing LAM contains or may contain Et
  • the Limulus reaction induced by Et in the sample after the coexistence is detected or measured. Can be measured specifically.
  • the measurement method reference was made to ⁇ 3> Et measurement method of the present invention described later.
  • the specific buffer is preferably tris (hydroxymethyl) aminomethane (hereinafter also referred to as “tris” or “Tris”! /), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperajuryl] ethanesulfonic acid (hereinafter referred to as “HEPES” or “HEPES”! /, U), N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid (hereinafter referred to as “TES”) Or “TES”!
  • HEPPSO 2-hydroxy-3- [4- (2-hydrochishetyl) -1-piperajuryl] propanesulfonic acid, monohydrate (hereinafter referred to as “HEPPSO”) N- [Tris (hydroxymethyl) methyl] glycine (hereinafter referred to as “tricine” or “Tricine”!), ⁇ , ⁇ -bis (2-hydroxyethyl) glycine (hereinafter referred to as “bicine”) Or “Bicine”! /, U), imidazole (hereinafter also referred to as “Imidazole”), and the like.
  • HEPPSO 2-hydroxy-3- [4- (2-hydrochishetyl) -1-piperajuryl] propanesulfonic acid, monohydrate
  • tricine Tris (hydroxymethyl) methyl] glycine
  • ⁇ , ⁇ -bis (2-hydroxyethyl) glycine hereinafter referred to as “bicine”
  • Bicine imidazole
  • the removal method 2 of the present invention includes, for example, a step of preparing a sample containing LAM as a step other than the step of coexisting a buffering agent, a step of coexisting components other than the buffering agent in a sample containing LAM, It further includes a step of evaluating whether or not the reactivity of LAM to the Limulus reagent has been removed.
  • components other than the above buffer include surfactants, anti-tuberculosis antibodies, anti-LAM antibodies, BG, carboxymethylated BG, strong alkaline substances, polymyxin B, colistin, concanavalin-8, histidine and histamine. Is done.
  • the removal method 2 of the present invention can be applied to the specific measurement of Et by performing a step in which a Limulus reagent coexists, for example, as a component other than the above-described buffer.
  • a Limulus reagent coexists, for example, as a component other than the above-described buffer.
  • specific measurement of Et refer to 3> Invention Et measurement method of the present invention described later.
  • sulfates such as sodium sulfate, magnesium sulfate and potassium sulfate, salty sodium, and salty magnesium as described in 1> Removal method 1 of the present invention.
  • Metal salts such as potassium salt and potassium salt, and metal salts exemplified by nitrates such as sodium nitrate and potassium nitrate coexist in a sample containing LAM and combined with a buffer. By using it, an excellent effect can be expected. In other words, this means that excellent effects can be expected by combining the removal methods 1 and 2 of the present invention.
  • the removal method 2 of the present invention as described above can be applied to a method of measuring Et in a state that is not affected by LAM or in a state where the effect of LAM is reduced. For details, see the Et measurement method of the present invention described later.
  • the Et measurement method of the present invention is a method for measuring Et in a sample containing LAM and Et using a Limulus reagent, and the step of removing the reactivity of LAM to the Limulus reagent by the removal method 1 or 2 of the present invention. It is a method including at least.
  • the Et measurement method of the present invention is obtained by applying the above-described removal method 1 or 2 of the present invention to an Et measurement method. Therefore, the description of “sample containing LAM” and “Limulus reagent” is the same as in ⁇ 1> the present invention removal method 1 and ⁇ 2> the present invention removal method 2. That is, this Limulus reagent is also preferably an Et-specific Limulus reagent. However, as a sample, in addition to LAM, a sample containing or possibly containing Et is used. In the present specification, “sample containing Et” means a sample containing Et or possibly containing Et.
  • removing the reactivity of LAM to the Limulus reagent by the present invention removing method 1 or 2 means that the reactivity of LAM to the Limulus reagent is the present invention removing method 1 Or both methods that can be removed by either method V, means you can remove it.
  • the Et measurement method of the present invention when the reactivity of LAM to the Limulus reagent is removed by the present invention removal method 1, the above-mentioned ⁇ 1> Reaction of LAM to the Limulus reagent is described in ⁇ 1> of the present invention removal method 1. From the point of view of Norrances of ⁇ removability of ionicity '' and ⁇ maintaining reactivity of Limulus reagent to Et '', the final concentration of metal salt in the sample is determined by the reaction of Limulus reagent to Et desired by those who perform the Et measurement method of the present invention. A person skilled in the art can appropriately determine the degree of maintaining the sex.
  • the final concentration of the metal salt in the sample so that the relative activity of Et is 50% or more.
  • the final concentration of the metal salt in the sample is preferably 65% or more. It is particularly preferable to select the final concentration of the metal salt in the sample so that it is 80% or more.
  • LAM in the relative activity of LAM described above was replaced with Et. Specifically, refer to the examples.
  • Et measurement by the Et measurement method of the present invention is performed by detecting or measuring the Limulus reaction caused by Et after removing or simultaneously removing the reactivity of LAM to the Limulus reagent by the present removal method 1 or 2. This can be achieved by doing so. Furthermore, the Et measurement method of the present invention may include other steps other than those described above.
  • the timing for removing the reactivity of LAM to the Limulus reagent by the removal method 1 or 2 of the present invention is not particularly limited.
  • the metal salt or buffer is mixed in advance with the Limulus reagent, which may be brought into contact with the sample. It is possible to remove the reactivity of LAM with respect to the Limulus reagent and simultaneously perform the Limulus reaction by bringing this into contact with the sample.
  • Et measurement method of the present invention also provides the following Et measurement method.
  • Et measurement method including at least the following steps (a) and (b);
  • both the metal salt and the buffer may coexist in the sample containing Et and LAM, or both of the metal salt and the buffer may coexist.
  • the Et measurement method of the present invention also provides the following Et measurement method.
  • Et measurement method including at least the following steps (a) and (b);
  • either the metal salt or the buffer may coexist in the Limulus reagent, and both the metal salt and the buffer may coexist.
  • the detection of the Limulus reaction caused by Et can be performed by a known method.
  • a known method such as a colorimetric method described in the Japanese Pharmacopoeia (endpoint atsease force enthusiastic assay), a gelling method, or a turbidimetric method (endpoint atsease force enthusiastic assay).
  • the detection method according to each method can be adopted.
  • measurement is a concept that includes not only quantitative measurement but also qualitative measurement (detection of the presence or absence of Et, etc.).
  • Various methods can be employed for the quantitative measurement of Et depending on the purpose. For example, using a sample with a known Et concentration, a calibration curve and a relational expression can be created for the relationship between the Et concentration and the intensity of the Limulus reaction, and this can be used for precise quantification. . If strict quantification is not required, the amount of Et between two or more samples may be compared. Since Et induces the Limulus reaction, the higher the intensity of the Limulus reaction, the greater the amount of Et in the sample.
  • the qualitative measurement of Et can be performed by detecting the presence or absence of a Limulus reaction.
  • Et induces a Limulus reaction, so if a Limulus reaction is detected, Et will be present in the sample.
  • the reactivity of LAM in a sample containing LAM to the Limulus reagent is removed, so that Et in the sample is not affected by LAM or Measurements can be made with a reduced LAM effect.
  • the disease detection method of the present invention is a method of detecting an Et-related disease characterized by using the Et measurement method of the present invention.
  • the disease detection method of the present invention is an application of the Et measurement method of the present invention to the detection of Et-related diseases.
  • a sample containing LAM in the Et measurement method of the present invention, a biological sample containing Et or possibly containing Et is used.
  • the explanation of the “biological sample” is the same as that described in 1> Removal method 1 of the present invention.
  • a limulus reaction interfering factor serrine protease, serine protease inhibitor, etc.
  • a known method for example, JP-A-58-85162. It is also preferable to remove or inactivate in advance by the method described in 1) above in the same manner as in 1> the removal method 1 of the present invention.
  • the Et-related disease to be detected is not particularly limited as long as it is a disease caused by Et. Examples include Et blood, sepsis, and Gram-negative bacterial infections.
  • “detection” is not only qualitative detection (detection of the presence or absence of an Et-related disease) but also quantitative detection (detection of the malignancy of an Et-related disease). Etc.).
  • Et-related diseases can be performed by applying quantitative measurement of Et.
  • quantitative measurement of Et please refer to the above 3> Et Et Measurement Method of the Present Invention.
  • Et induces the Limulus reaction, so if the intensity of the Limulus reaction is high, The amount of Et is also high, and correspondingly, it can be related to the high malignancy of Et-related diseases or the suspicion of it.
  • the Et measurement kit of the present invention is an Et measurement kit used for the measurement of Et with reduced influence of LAM, comprising a Limulus reagent and a metal salt or a buffer as constituent components.
  • the Et measurement method of the present invention can be easily performed.
  • “measurement of Et with reduced influence of LAM” means that LAM is not affected by LAM by removing reactivity to Limulus reagent, or the influence of LAM. It means Et measurement performed in a state where is reduced.
  • the degree to which the reactivity of LAM with respect to the Limulus reagent is removed is not particularly limited. For example, it is preferable to remove the reactivity so that the relative activity of LAM is 50% or less. It is preferable to remove the reactivity so that the RAM is 20% or less, and it is preferable to remove the reactivity so that the relative activity of the LAM is 10% or less. The relative activity of the LAM is 5% or less. It is preferable to remove the reactivity.
  • the Limulus reagent is preferably an Et-specific Limulus reagent.
  • metal salt is the same as that of ⁇ 3> the Et measurement method of the present invention.
  • preferred metal salts include, for example, sulfates such as sodium sulfate, magnesium sulfate and potassium sulfate, metal salts such as sodium chloride, magnesium chloride, potassium chloride and chloride chloride, Examples thereof include nitrates such as sodium nitrate and potassium nitrate.
  • buffering agent is the same as that of 3> Et measuring method of the present invention. Therefore, specific examples of preferable buffering agents include tris, hepes, tes, HEPPSO, tricine, bicine, and imidazole.
  • the Et measurement kit of the present invention is not particularly limited as long as it contains at least a Limulus reagent and a metal salt or a buffer as constituents.
  • “comprising a Limulus reagent and a metal salt or buffer as constituents” may include either a metal salt or a buffer in addition to the Limulus reagent as a constituent, Including both, mean, mean
  • the Et measurement kit of the present invention may further contain other components in addition to the above-described components. Examples of such components include blank test distilled water, reaction reagent solution, reaction buffer, Et standard substance, reaction substrate, and the like. Further, the Et measurement kit of the present invention may contain a positive control (QC control) for keeping the execution level between measurement batches at a certain level.
  • QC control positive control
  • the kit of the present invention has a method of use and an instruction manual describing that the metal salt or buffer contained in the kit is used to remove the reactivity of LAM in the sample to the Limulus reagent. It is preferable to include.
  • Et can be measured using the Et measurement kit of the present invention according to the above-described Et measurement method of the present invention.
  • the disease diagnostic kit of the present invention is a diagnostic kit for Et-related diseases comprising the Et measurement kit of the present invention.
  • the disease diagnosis kit of the present invention it is possible to easily diagnose an Et-related disease.
  • the Et-related disease to be diagnosed is not particularly limited as long as it is a disease caused by Et. Examples include Et blood, sepsis, and Gram-negative bacterial infections.
  • the explanation of the “biological sample” to be used is the same as 4> disease detection method of the present invention. That is, the “biological sample” to be used is preferably blood.
  • the “biological sample” to be used is preferably blood.
  • the diagnosis of Et-related diseases using the disease diagnosis kit of the present invention can be carried out by applying the ⁇ 4> the disease detection method of the present invention.
  • the reactive removal agent 1 of the present invention is a reactive removal agent that contains a metal salt as an active ingredient and is used to remove the reactivity of LAM to a Limulus reagent.
  • the reactive removal agent 2 of the present invention is a reactive removal agent that contains a buffering agent as an active ingredient and is used to remove the reactivity of LAM to Limulus reagents.
  • LAM The reactivity of Limulus reagent containing sodium sulfate as a metal salt was compared between LAM and Et.
  • Amebosite's lysate (kabutuga-blood cell extract component) is hereinafter referred to as “lysate”.
  • the LAM used in this example was isolated from a dead cell of Mycobacterium tuberculosis (Aoyama B; Mycobacterium tuberculosis Aoyama-B) and purified with high purity by organic solvent extraction and column chromatography. Sold by Litetester Co., Ltd.).
  • the concentration (mM) or amount of Tridentatus lysate in a reaction volume of 200 ⁇ L was 0, 10, 20, 30, 40, 50 mM sodium sulfate, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), magnesium sulfate.
  • Et-specific Limulus reagent containing sodium sulfate as a metal salt was compared between LAM and Et.
  • Et-specific Limulus reagent Endospeci ES-50M (Seikagaku Corporation) was used.
  • LAM and Et those similar to those in Example 1 were used.
  • Example 2 A similar test was conducted by replacing the sodium sulfate in Example 2 with sodium chloride salt. However, in this case, microtiter plate (Toxipet Plate LP, Seikagaku Corporation) so that the concentration of sodium chloride sodium is 0, 50, 100, 1 50, 200, 250 mM in a reaction volume of 100 ⁇ L. Added to. The results are shown in FIGS.
  • LAL lysate means Limnoles' polyphemus lysate
  • TAL lysate means Tachypreus tridentatus lysate
  • Tris-HCl buffer pH 8.0
  • magnesium sulfate chromogenic substrate
  • Tachypreus tridentas-derived lysate were used at a concentration (mM) or usage amount of Tris-HCl buffer (pH 8. 0) 25,50,100,150,200mM, magnesium sulfate 20mM, chromogenic substrate 0.167mM, Takipreus tridentus lysate 20L
  • Toxipet Plate LP To this plate was added lOOng / mL LAM 25 L or Ing / mL Et (derived from E. coli 0111: B4 strain) 25; z L, and the mixture was allowed to react for 30 minutes in Uenore Reader SK603.
  • the removal methods 1 and 2 of the present invention can be used to remove the influence of LAM in the Limulus reaction.
  • the Et measurement method, the disease detection method of the present invention, the Et measurement kit of the present invention, and the disease diagnosis kit of the present invention can be used for measurement and detection of Et and Et related diseases.
  • the removal method 1 or 2 of the present invention the reactivity of LAM with respect to the Limulus reagent in a sample containing LAM can be efficiently removed simply, rapidly and inexpensively.
  • the Et measurement method of the present invention can measure Et in the sample without being affected by LAM or by reducing the effect of LAM.
  • the disease detection method of the present invention can detect Et-related diseases with higher accuracy.
  • the present invention Et measurement kit and book With the inventive disease diagnosis kit, the Et measuring method and the disease detecting method of the present invention can be carried out simply and quickly.

Abstract

　リポアラビノマンナンを含有する試料に、金属塩又は緩衝剤を共存させるステップを少なくとも含む当該試料中のリポアラビノマンナンのリムルス試薬に対する反応性を除去する方法、並びに該方法を利用したエンドトキシンの測定方法、及びエンドトキシン関連疾患の検知方法。

Description

明 細 書
リポアラビノマンナンの反応性除去方法とその応用
技術分野
[0001] 本発明は、リポアラビノマンナンのリムルス試薬に対する反応性を除去する方法、こ れを応用したリポアラビノマンナンを含有する試料中のエンドトキシンの測定方法及 びエンドトキシン関連疾患の検知方法、これらに用いるエンドトキシンの測定キット及 びエンドトキシン関連疾患の診断キット等に関する。 背景技術
[0002] 本出願書類中で使用する略号を以下に示す。
LAM：リポアラビノマンナン
Et:エンドトキシン
BG : (1→3) - β—D—グノレカン
リムルス試薬 (ライセート試薬とも呼ばれている）は、カブトガ二のァメボサイト'ライセ ートを主成分とする試薬であって、 Etや BGの検知 '測定に用いられている。リムルス 試薬は Etや BGに対する反応性を有しており、リムルス試薬とこれらの物質が接触す ると、リムルス試薬中の種々の因子が関与するカスケード反応（以下、「リムルス反応」 という。）が惹起され、この反応を検知することでこれらの物質を検知 '測定することが できる。
[0003] 一方、 LAMは、抗酸菌（例えば、結核菌等）に特有の細胞壁成分であることが知ら れている。
[0004] 特許文献 1には、アルカリ土類金属塩を有効成分のひとつとして含有する Et安定 ィ匕剤及びこれを用いる Etの測定方法等が開示されている。し力しこのアルカリ土類 金属塩が、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を除去する効果を有することにつ ヽ ての開示や示唆はない。
[0005] 特許文献 2には、塩ィ匕カルシウムと水酸ィ匕カリウムの混合水溶液で、血漿又は血清 を処理して被検液とすることを特徴とする Etの測定法等が開示されて 、る。しかしこ の塩ィヒカルシウム力 LAMのリムルス試薬に対する反応性を除去する効果を有する ことは、記載も示唆もない。
[0006] また、リムルス試薬の凍結乾燥物は、通常、水、検体溶液又は緩衝液等で溶解され 、用いられている。しかし緩衝液が LAMのリムルス試薬に対する反応性を除去する 効果を有することについては、知られていない。
[0007] さらに特許文献 3には、カブトガ- ·ァメボサイト'ライセートと緩衝作用を有する特定 構造の化合物を有効成分として含有するリムルス試薬を用いて、検体中のリムルス試 薬反応性物質を測定する方法等が記載されている。しかし上記化合物が、 LAMのリ ムルス試薬に対する反応性を除去する効果を有することについての開示や示唆はな い。
[0008] 特許文献 1 :特開平 8— 75751号公報
特許文献 2 :特開平 4— 136763号公報
特許文献 3：特開平 7— 239332号公報
発明の開示
[0009] 本発明者らは、 LAMがリムルス試薬と反応すること、したがって、 Etと LAMを両方 含む試料を用いた場合は、 Etを LAMの影響なく定量的に測定することが困難であ ることを発見した。そこで、本発明は、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を除去す る方法、これを応用した LAMを含有する試料中の Etの測定方法及び Et関連疾患 の検知方法、これらに用いる Etの測定キット及び Et関連疾患の診断キット等を提供 することを課題とする。
[0010] 本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、 LAMを含有す る試料に、金属塩又は緩衝剤を共存させることにより、当該試料中の LAMのリムルス 試薬に対する反応性を除去することができることを見出し、 LAMのリムルス試薬に対 する反応性を除去する方法、これを応用した LAMを含有する試料中の Etの測定方 法及び Et関連疾患の検知方法、これらに用いる Etの測定キット及び Et関連疾患の 診断キット等を提供するに至った。
[0011] すなわち、本発明は、下記（1)〜（17)に記載の方法又はキットを提供する。
(l) LAMを含有する試料に、金属塩を共存させるステップ (工程)を少なくとも含む、 当該試料中の LAMのリムルス試薬に対する反応性を除去する方法 (以下、「本発明 除去方法 1」という）。
(2)金属塩が、硫酸塩、金属塩ィ匕物及び硝酸塩力 選択される 1又は 2以上の金属 塩である、前記（1)に記載の方法。
(3)金属塩が、下記の群力も選択される 1又は 2以上の金属塩である、前記（2)に記 載の方法；
硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕マグネシウム、 塩ィ匕カリウム、塩ィ匕カルシウム、硝酸ナトリウム及び硝酸カリウム。
(4)金属塩を、試料中の終濃度が 30mM以上となるように共存させることを特徴とす る、前記（1)〜（3)のいずれか 1つに記載の方法。
(5) LAMを含有する試料に、緩衝剤を共存させるステップ（工程)を少なくとも含む、 当該試料中の LAMのリムルス試薬に対する反応性を除去する方法 (以下、「本発明 除去方法 2」という）。
(6)緩衝剤が、下記の群力も選択される 1又は 2以上の緩衝剤である、前記（5)に記 載の方法；
トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン、 2-[4-(2-ヒドロキシェチル) - 1-ピぺラジュル]エタ ンスルホン酸、 N-トリス (ヒドロキシメチル)メチル -2-アミノエタンスルホン酸、 2-ヒドロキ シ- 3-[4-(2-ヒドロキシェチル) -1-ピぺラジュル]プロパンスルホン酸,一水和物、 N- [ト リス (ヒドロキシメチル)メチル]グリシン、 Ν,Ν-ビス (2-ヒドロキシェチル)グリシン、イミダゾ 一ノレ。
(7)緩衝剤を、試料中の終濃度が 100〜300mMとなるように共存させることを特徴と する、前記（5)又は（6)に記載の方法。
(8) LAMおよび Etを含有する試料中の Etをリムルス試薬を用いて測定する方法で あって、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を（1)〜（7)の!、ずれかの方法で除去 するステップ (工程)を少なくとも含む方法 (以下、「本発明 Et測定方法」という）。
(9)下記ステップ (a)及び (b)を少なくとも含む Etの測定方法；
(a) Et及び LAMを含有する試料に、金属塩又は緩衝剤を共存させるステップ；
(b)前記共存後の試料にリムルス試薬を接触させ、 Etによって惹起されるリムルス反 応を検知するステップ。 (10)下記ステップ (a)及び (b)を少なくとも含む Etの測定方法；
(a)リムルス試薬に金属塩又は緩衝剤を共存させるステップ；
(b) Et及び LAMを含有する試料に、前記共存後のリムルス試薬を接触させ、 Et〖こよ つて惹起されるリムルス反応を検知するステップ。
(11)リムルス試薬力 Et特異的リムルス試薬である、前記（8)〜（10)のいずれか 1 つに記載の方法。
( 12)前記（8)〜（ 11)の 、ずれか 1つに記載の方法を用 、ることを特徴とする、 Et関 連疾患の検知方法 (以下、「本発明疾患検知方法」という）。
(13)リムルス試薬と、金属塩又は緩衝剤とを構成成分として含む、 LAMの影響を低 減させた Etの測定のために用いられる Etの測定キット（以下、「本発明 Et測定キット」 という）。
(14)金属塩が、硫酸塩、金属塩ィ匕物及び硝酸塩力 選択される 1又は 2以上の金属 塩である、前記（13)に記載のキット。
(15)金属塩が、下記の群力も選択される 1又は 2以上の金属塩である、前記（14)に 記載のキット；
硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、塩ィ匕ナトリウム、塩化マグネシウム、 塩ィ匕カリウム、塩ィ匕カルシウム、硝酸ナトリウム及び硝酸カリウム。
(16)緩衝剤が、下記の群力も選択される 1又は 2以上の緩衝剤である、前記（13)に 記載のキット；
トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン、 2-[4-(2-ヒドロキシェチル) - 1-ピぺラジュル]エタ ンスルホン酸、 N-トリス (ヒドロキシメチル)メチル -2-アミノエタンスルホン酸、 2-ヒドロキ シ- 3-[4-(2-ヒドロキシェチル) -1-ピぺラジュル]プロパンスルホン酸,一水和物、 N- [ト リス (ヒドロキシメチル)メチル]グリシン、 Ν,Ν-ビス (2-ヒドロキシェチル)グリシン、イミダゾ 一ノレ。
(17)リムルス試薬力 Et特異的リムルス試薬である、前記（13)〜（16)のいずれか 1 つに記載のキット。
( 18)前記（ 13)〜（ 17)の 、ずれか 1つに記載のキットからなる、 Et関連疾患の診断 キット（以下、「本発明疾患診断キット」という)。 (19)金属塩を有効成分として含有する、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を除 去するために用いられる反応性除去剤 (以下、「本発明反応性除去剤 1」という)。
(20)緩衝剤を有効成分として含有する、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を除 去するために用いられる反応性除去剤 (以下、「本発明反応性除去剤 2」という)。 図面の簡単な説明
[図 1]タキプレウス'トリデンタツス由来ライセートを用いたリムルス反応における硫酸ナ トリウム濃度と、 LAMの相対活性との関係を示す図。
[図 2]タキプレウス'トリデンタツス由来ライセートを用いたリムルス反応における硫酸ナ トリウム濃度と、 Etの相対活性との関係を示す図。
[図 3]リムルス 'ポリフエムス由来ライセートを用いたリムルス反応における硫酸ナトリウ ム濃度と、 LAMの相対活性との関係を示す図。
[図 4]リムルス 'ポリフエムス由来ライセートを用いたリムルス反応における硫酸ナトリウ ム濃度と、 Etの相対活性との関係を示す図。
[図 5]Et特異的リムルス試薬を用いたリムルス反応における硫酸ナトリウム濃度と、 LA Mの相対活性との関係を示す図。
[図 6]Et特異的リムルス試薬を用いたリムルス反応における硫酸ナトリウム濃度と、 Et の相対活性との関係を示す図。
[図 7]Et特異的リムルス試薬を用いたリムルス反応における塩ィ匕ナトリウム濃度と、 LA Mの相対活性との関係を示す図。
[図 8]Et特異的リムルス試薬を用いたリムルス反応における塩ィ匕ナトリウム濃度と、 Et の相対活性との関係を示す図。
[図 9]タキプレウス'トリデンタツス由来ライセートを用いたリムルス反応におけるトリス 塩酸緩衝液濃度と、 LAMの相対活性との関係を示す図。
[図 10]タキプレウス'トリデンタツス由来ライセートを用いたリムルス反応におけるトリス 塩酸緩衝液濃度と、 Etの相対活性との関係を示す図。
[図 11]リムルス *ポリフエムス由来ライセートを用いたリムルス反応におけるトリス塩酸 緩衝液濃度と、 LAMの相対活性との関係を示す図。
[図 12]リムルス *ポリフエムス由来ライセートを用いたリムルス反応におけるトリス塩酸 緩衝液濃度と、 Etの相対活性との関係を示す図。
発明を実施するための最良の形態
[0013] < 1 > 本発明除去方法 1
本発明除去方法 1は、 LAMを含有する試料に、金属塩を共存させるステップを少 なくとも含む、当該試料中の LAMのリムルス試薬に対する反応性を除去する方法で ある。
[0014] 本明細書にお!、て、「LAMを含有する試料」とは、 LAMを含有するか又は含有す る可能性のある試料である限りにお 、て特に限定されな 、。 LAMは抗酸菌特有の 細胞壁成分であることから、例えば抗酸菌 (例えば結核菌等)の生菌ゃ死菌自体、そ の細胞壁、細胞壁成分を含有するか又は含有する可能性のある試料等が例示され る。このような試料としては、結核ワクチン等が例示される。また「LAMを含有する試 料」としては、「生体由来の試料」を用いることもできる。「生体由来の試料」も特に限 定されないが、体液であることが好ましい。体液は、 LAMが含有されている又はその 可能性がある体液である限りにおいて特に限定されない。例えば、血液 (本明細書で は、血清や血漿をも含む概念として用いる。）、喀痰、髄液、尿、汗、唾液、涙液、関 節液等を例示することができる。なかでも血液が好ま 、。
[0015] なお、「生体由来の試料」として血液用いる場合は、血液中のリムルス反応妨害因 子（セリンプロテアーゼ、セリンプロテアーゼインヒビター等）を公知の方法 (例えば、 特開昭 58— 85162号公報等に記載の方法)で予め除去又は不活ィ匕しておくことが 好ましい。
[0016] また本発明除去方法 1において、金属塩は、 LAMを含有する試料中の LAMのリ ムルス試薬に対する反応性を除去する作用を有し得るものであればよぐ使用する金 属塩の種類、数、組み合わせ等も特に限定されない。金属塩は、単一種類のものの みを用いてもよぐ複数種の金属塩を組み合わせて用いてもよい。例えば、複数種の 金属塩の混合物を用いてもよい。また金属塩は、その存在状態又は存在形態等によ つて限定されるものではなぐ例えば粉末にされる固体状態の金属塩そのものであつ てもよぐ精製水に例示される溶液に溶解された状態として存在する金属塩であって もよい。また金属塩は、例えば界面活性剤、抗結核抗体、抗 LAM抗体、 BG、カルボ キシメチル化された BG、強アルカリ性物質、ポリミキシン B、コリスチン、コンカナバリ ン ヒスチジン、ヒスタミン及びリムルス試薬に例示される金属塩以外の成分との混 合物として存在するものであってもよい。ここで例えば金属塩力 界面活性剤、抗結 核抗体、抗 LAM抗体、 BG、カルボキシメチル化された BG、強アルカリ性物質、ポリ ミキシン B、コリスチン、コンカナバリン八、ヒスチジン及びヒスタミン等に例示される物 質との混合物として存在するものである場合、当該混合物を用いることにより、さらに 好まし!/ヽ LAMのリムルス試薬に対する反応性を除去する効果が期待される。また例 えば金属塩が、リムルス試薬との混合物として存在するものである場合であって、且 つ LAMを含有する試料が、 Etを含有するか、含有する可能性がある試料である場 合、リムルス試薬と金属塩との混合物を LAMを含有する試料に共存させた後に、当 該共存後の試料中の Etによって惹起されるリムルス反応を検知又は測定すること〖こ より、上記試料中の Etを LAMの影響を受けることのない状態、又は LAMの影響が 低減された状態で測定することができる。当該測定方法に関するより具体的な説明 につ 、ては、後述する < 3 >本発明 Et測定方法を参照された 、。
[0017] 具体的な金属塩の種類としては、好ましくは、硫酸塩、金属塩化物、硝酸塩等が例 示される。上記の中でも、下記の群力 選択される 1又は 2以上の金属塩であることが より好まし 、。
硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕マグネシウム、 塩ィ匕カリウム、塩ィ匕カルシウム、硝酸ナトリウム及び硝酸カリウム。
[0018] 上記の中でも、硫酸ナトリウム又は塩ィ匕ナトリウムを少なくとも含むものであることがさ らに好ましい。なお、この場合、金属塩は、硫酸ナトリウム又は塩ィ匕ナトリウムのどちら か一方を含むものであっても良ぐ両方を含むものであっても良いが、硫酸ナトリウム を少なくとも含むものであることが特に好ましい。
[0019] さらに、本発明除去方法 1において、 LAMを含有する試料に金属塩を共存させる ステップにおける、金属塩の共存後の試料中の金属塩の濃度（以下、単に「試料中 の金属塩の終濃度」と記載する）は、 LAMを含有する試料中の LAMのリムルス試薬 に対する反応性を除去する作用を発揮し得る濃度である限りにおいて特に限定され ず、使用する金属塩の種類や、本発明除去方法 1を実施する者が欲する上記反応 性の除去の効果の程度等に応じて、当業者が適宜設定することができる。
[0020] 試料中の金属塩の終濃度を高めるほど、 LAMのリムルス試薬に対する反応性の 除去効果を高めることができる。具体的には、試料中の金属塩の終濃度が 20mM以 上となるように金属塩を共存させることが好ま U、。
[0021] ただし、試料中の金属塩の終濃度が高くなりすぎると、リムルス試薬の Etに対する 反応性は低下する傾向がある。したがって、本発明除去方法 1を、後述する本発明 E t測定方法において用いる場合には、試料中の金属塩の終濃度は、「LAMのリムル ス試薬に対する反応性の除去」と「リムルス試薬の Etに対する反応性の維持」とのバ ランスにおいて決定することができる。例えば、前者をより重視するならば後者を多少 犠牲にしてでも試料中の金属塩の濃度をなるベく高めた方がよぐ後者をより重視す るならば試料中の金属塩の濃度をなるベく高めないようにすることが好ましい。リムル ス試薬の Etに対する反応性を維持しつつ、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を 除去するためには、試料中の金属塩の終濃度力 20〜500mMとなるように金属塩 を共存させることが好ましぐ 30〜500mMとなるように金属塩を共存させることがより 好ましい。また、 30〜300mMとなるように金属塩を共存させることも好ましい。
[0022] さらに、例えば金属塩として硫酸ナトリウムを用いる場合、試料中の硫酸ナトリウムの 終濃度が、 30〜200mMとなるように共存させることが好ましぐ 30〜100mMとなる ように共存させることがより好ましぐ 40〜80mMとなるように共存させることがさらに 好ましぐ 50〜70mMとなるように共存させることが極めて好ましぐ約 60mMとなる ように共存させることが特に好ましい。また、金属塩として塩ィ匕ナトリウムを用いる場合 、試料中の塩ィ匕ナトリウムの終濃度が 150〜500mMとなるように共存させることが好 ましく、 200〜400mMとなるように共存させること力より好ましく、 250〜350mMとな るように共存させることが特に好ましい。また、金属塩として硫酸マグネシウムを用いる 場合、試料中の硫酸マグネシウムの終濃度力 80〜300mMとなるように共存させる ことが好ましぐ 100〜200mMとなるように共存させることがより好ましい。また、金属 塩として硫酸カリウムを用いる場合、試料中の硫酸カリウムの終濃度力 50〜200m Mとなるように共存させることが好ましく、 50〜 150mMとなるように共存させることが より好ましい。また、金属塩として塩ィ匕マグネシウムを用いる場合、試料中の塩化マグ ネシゥムの終濃度が、 80〜300mMとなるように共存させることが好ましぐ 100-25 OmMとなるように共存させることがより好ましい。また、金属塩として塩ィ匕カリウムを用 いる場合、試料中の塩ィ匕カリウムの終濃度力 200〜500mMとなるように共存させ ることが好ましぐ 200〜300mMとなるように共存させることがより好ましい。また、金 属塩として硝酸ナトリウムを用いる場合、試料中の硝酸ナトリウムの終濃度力 150〜 400mMとなるように共存させることが好ましぐ 200〜300mMとなるように共存させ ることがより好ましい。また、金属塩として硝酸カリウムを用いる場合、試料中の硝酸力 リウムの終濃度が、 150〜400mMとなるように共存させることが好ましぐ 180-300 mMとなるように共存させることがより好ましい。また、金属塩として塩ィ匕カルシウムを 用いる場合、試料中の塩ィ匕カルシウムの終濃度が、 100〜300mMとなるように共存 させることが好ましく、 130〜200mMとなるように共存させることがより好ましい。
[0023] また、前述したように、試料中の金属塩の終濃度は、本発明除去方法 1を実施する 者が欲する LAMの反応性の除去の程度によっても適宜決定することができる。具体 的には、 LAMの相対活性が 20%以下となるように試料中の金属塩の終濃度を選択 することが好ましぐ 10%以下となるように試料中の金属塩の終濃度を選択すること 力 り好ましぐ 5%以下となるように試料中の金属塩の終濃度を選択することが極め て好ましぐ 1%以下となるように試料中の金属塩の終濃度を選択することが特に好ま しい。
[0024] なお、本発明除去方法 1において LAMの相対活性とは、ある金属塩をある終濃度 となるように共存させたときの LAMのリムルス試薬に対する反応性の値を、当該金属 塩を共存させないときの LAMのリムルス試薬に対する反応性の値で割ることにより算 出される百分率（％)を意味する。具体的には実施例に記載の方法により算出するこ とができるので、これを参照されたい。
[0025] また、本発明除去方法において、リムルス試薬は、カブトガ二のァメボサイト'ライセ ートを主成分とする試薬である限りにお 、て特に限定されな 、。このカブトガ二の種 類も限定されず、リムルス 'ポリフエムス（北アメリカ産力ブトガ-)、タキプレウス'トリデ ンタツス、タキプレウス'ギガス、タキプレウス'口タンディ力ウダ（以上はアジア産の力 ブトガ-)の 、ずれのァメボサイト ·ライセートをも用いることができる。ァメボサイト ·ライ セートは、公知の方法 (例えば、カブトガ- ·ァメボサイトに蒸留水をカ卩えて 4°Cにて振 とうデーブル上で一晩ゆっくりと旋回させることによってァメボサイトを破裂させ、その 上澄液を用いる方法、力ブトガ-'ァメボサイトに 0. 02Mトリス—塩酸緩衝液 (pH8. 0)をカ卩えてホモジナイザーにて均一に破砕および抽出してその上澄液を用いる方法 等)で製造することができる。また、市販されているリムルス試薬を用いてもよい。この ようなリムルス試薬は、 Etにも BGにも反応するリムルス試薬であっても良いが、 BGに 反応しな!、ように調製されたリムルス試薬 (本出願書類中にぉ 、て、「Et特異的リムル ス試薬」という。）であることが好ましい。この Et特異的リムルス試薬は公知の方法 (例 えば、リムルス試薬にァプロチュンを共存させる方法、リムルス試薬にアルキルダルコ シドを共存させる方法、（1→3)— β D グルカン類のポリカルボン酸誘導体又は グリセリル誘導体を共存させる方法等)で製造することもでき、市販されて ヽるもの (例 えば、エンドスぺシ一 ES-50M (生化学工業株式会社)）を利用することもできる。 Et特 異的リムルス試薬としては、例えば、 G因子活性ィ匕阻害剤ゃ抗 G因子抗体といった、 G因子を介したリムルス反応を抑制する物質を含有するァメボサイト ·ライセートを主 成分又は主な構成成分とするもの等が例示される。
[0026] 本発明除去方法 1は、金属塩を共存させるステップ以外のステップとして、例えば L AMを含有する試料を調製するステップ、 LAMを含有する試料に金属塩以外の成 分を共存させるステップ、又は LAMのリムルス試薬に対する反応性が除去されたか 否かを評価するステップ等をさらに含んで 、でもよ 、。上記の金属塩以外の成分とし ては、例えば界面活性剤、抗結核抗体、抗 LAM抗体、 BG、カルボキシメチルイ匕さ れた BG、強アルカリ性物質、ポリミキシン B、コリスチン、コンカナバリン八、ヒスチジン 及びヒスタミンが例示される。これらの成分を共存させるステップを行うことは、さらに 優れた LAMのリムルス試薬に対する反応性を除去する効果が期待されるといった観 点から好ましい。また上記の金属塩以外の成分として、例えばリムルス試薬を共存さ せるステップを行うことにより、本発明除去方法 1を Etの特異的な測定に応用すること も可能である。 Etの特異的な測定については、後述するく 3 >本発明 Et測定方法を 参照されたい。
[0027] また、本出願書類にお!/、て「反応性を除去する」とは、反応性を完全に除き去ること のみならず、部分的に除き去る (反応性を減少もしくは低減させる）ことをも意味する 用語として用いる。
[0028] 以上のような本発明除去方法 1は、 LAMの影響を受けることのない状態、又は LA
Mの影響が低減された状態で Etを測定する方法に応用することができる。詳細は後 述する本発明 Et測定方法を参照された ヽ。
[0029] < 2> 本発明除去方法 2
本発明除去方法 2は、 LAMを含有する試料に、緩衝剤を共存させるステップを少 なくとも含む、当該試料中の LAMのリムルス試薬に対する反応性を除去する方法で ある。
[0030] 本発明除去方法 2において、 LAMを含有する試料に緩衝剤を共存させるステップ における、緩衝剤の共存後の試料中の緩衝剤の濃度 (以下、単に「試料中の緩衝剤 の終濃度」と記載する）は、 LAMを含有する試料中の LAMのリムルス試薬に対する 反応性を除去する作用を発揮し得る濃度である限りにおいて特に限定されず、使用 する緩衝剤の種類や、本発明除去方法 2を実施する者が欲する上記反応性の除去 の程度等に応じて、当業者が適宜設定することができるが、 100〜300mMとなるよう に共存させることが好ましぐ 150〜200mMとなるように共存させることがより好ましく 、約 200mMとなるように共存させることが特に好まし!/、。
[0031] 「LAMを含有する試料」や「リムルス試薬」についての説明は、前記 < 1 >本発明 除去方法 1と同様である。
[0032] また本発明除去方法 2において緩衝剤は、 LAMを含有する試料中の LAMのリム ルス試薬に対する反応性を除去する作用を有し得るものであればよぐ使用する緩 衝剤の種類、数、組み合わせ等も特に限定されない。緩衝剤は、単一種類のものの みを用いてもよぐ複数種の緩衝剤を組み合わせて用いてもよい。例えば、複数種の 緩衝剤の混合物を用いてもよい。また緩衝剤は、その存在状態又は存在形態等によ つて限定されるものではなぐ例えば粉末にされる固体状態の緩衝剤そのものであつ てもよぐ精製水に例示される溶液に溶解された状態として存在する緩衝剤であって もよい。また緩衝剤は、例えば界面活性剤、抗結核抗体、抗 LAM抗体、 BG、カルボ キシメチル化された BG、強アルカリ性物質、ポリミキシン B、コリスチン、コンカナバリ 、ノ kヽヒスチジン、ヒスタミン及びリムルス試薬に例示される緩衝剤以外の成分との混 合物として存在するものであってもよい。ここで例えば緩衝剤力 界面活性剤、抗結 核抗体、抗 LAM抗体、 BG、カルボキシメチル化された BG、強アルカリ性物質、ポリ ミキシン B、コリスチン、コンカナバリン八、ヒスチジン及びヒスタミン等に例示される物 質との混合物として存在するものである場合、当該混合物を用いることにより、さらに 好まし!/ヽ LAMのリムルス試薬に対する反応性を除去する効果が期待される。また例 えば緩衝剤が、リムルス試薬との混合物として存在するものである場合であって、且 つ LAMを含有する試料が、 Etを含有するか、含有する可能性がある試料である場 合、リムルス試薬と緩衝剤との混合物を LAMを含有する試料に共存させた後に、当 該共存後の試料中の Etによって惹起されるリムルス反応を検知又は測定すること〖こ より、上記試料中の Etを特異的に測定することができる。当該測定方法に関するより 具体的な説明につ 、ては、後述する < 3 >本発明 Et測定方法を参照された 、。
[0033] 具体的な緩衝剤としては、好ましくは、トリス (ヒドロキシメチル)ァミノメタン（以下、「ト リス」又は「Tris」とも!/、う）、 2-[4-(2-ヒドロキシェチル) - 1-ピぺラジュル]エタンスルホ ン酸（以下、「へぺス」又は「HEPES」とも!/、う）、 N-トリス (ヒドロキシメチル)メチル -2- アミノエタンスルホン酸（以下、 「テス」又は「TES」とも!/、う）、 2-ヒドロキシ- 3-[4-(2-ヒド 口キシェチル) -1-ピぺラジュル]プロパンスルホン酸,一水和物 (以下、 「HEPPSO」と もいう)、 N- [トリス (ヒドロキシメチル)メチル]グリシン（以下、 「トリシン」又は「Tricine」と も!、う）、 Ν,Ν-ビス (2-ヒドロキシェチル)グリシン（以下、 「ビシン」又は「Bicine」とも!/、う )、イミダゾール（以下、「Imidazole」ともいう）等が例示される。
[0034] 本発明除去方法 2は、緩衝剤を共存させるステップ以外のステップとして、例えば L AMを含有する試料を調製するステップ、 LAMを含有する試料に緩衝剤以外の成 分を共存させるステップ、 LAMのリムルス試薬に対する反応性が除去された力否か を評価するステップ等をさらに含んで 、でもよ 、。上記の緩衝剤以外の成分としては 、例えば界面活性剤、抗結核抗体、抗 LAM抗体、 BG、カルボキシメチル化された B G、強アルカリ性物質、ポリミキシン B、コリスチン、コンカナバリン八、ヒスチジン及びヒ スタミンが例示される。これらの成分を共存させるステップを行うことは、さらに優れた LAMのリムルス試薬に対する反応性を除去する効果が期待されるといった観点から 好ましい。また上記の緩衝剤以外の成分として、例えばリムルス試薬を共存させるス テツプを行うことにより、本発明除去方法 2を Etの特異的な測定に応用することも可 能である。 Etの特異的な測定については、後述するく 3 >本発明 Et測定方法を参 照されたい。
[0035] さらに、緩衝剤以外の物質として、前記く 1 >本発明除去方法 1で述べたような、硫 酸ナトリウム、硫酸マグネシウム及び硫酸カリウム等の硫酸塩、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕 マグネシウム、塩ィ匕カリウム及び塩ィ匕カルシウム等の金属塩ィ匕物、硝酸ナトリウム、硝 酸カリウム等の硝酸塩等に例示される金属塩を、 LAMを含有する試料に共存させ、 緩衝剤と併せて使用することによつても、優れた効果を期待できる。すなわちこれは、 本発明除去方法 1及び 2を組み合わせることによつても、優れた効果を期待できること を意味する。
[0036] 以上のような本発明除去方法 2は、 LAMの影響を受けることのない状態、又は LA Mの影響が低減された状態で Etを測定する方法に応用することができる。詳細は後 述する本発明 Et測定方法を参照された ヽ。
[0037] < 3 > 本発明 Et測定方法
本発明 Et測定方法は、 LAM及び Etを含有する試料中の Etをリムルス試薬を用い て測定する方法であって、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を本発明除去方法 1 又は 2で除去するステップを少なくとも含む方法である。
[0038] 本発明 Et測定方法は、前記の本発明除去方法 1又は 2を、 Etの測定方法に応用し たものである。したがって、「LAMを含有する試料」や「リムルス試薬」についての説 明は、前記 < 1 >本発明除去方法 1及び前記 < 2>本発明除去方法 2と同様である 。すなわち、このリムルス試薬も、 Et特異的リムルス試薬であることが好ましい。ただし 、試料としては、 LAMのほか、 Etを含有するか又は含有する可能性のある試料を用 いることになる。なお本明細書において、「Etを含有する試料」とは、 Etを含有するか 、又は Etを含有する可能性のある試料を意味する。
[0039] なお、本発明 Et測定方法において、「LAMのリムルス試薬に対する反応性を本発 明除去方法 1又は 2で除去する」とは、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を本発 明除去方法 1又は 2のどちらか一方の方法で除去してもよぐ両者の方法を併せて用 V、ることで除去してもよ 、ことを意味する。
[0040] LAMのリムルス試薬に対する反応性を本発明除去方法 1で除去する場合、金属 塩及び試料中の金属塩の終濃度についての説明は、前記く 1 >本発明除去方法 1 と同様であり、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を本発明除去方法 2で除去する 場合、緩衝剤及び試料中の緩衝剤の終濃度についての説明は、前記 < 2>本発明 除去方法 2と同様である。
[0041] さらに本発明 Et測定方法において、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を本発 明除去方法 1で除去する場合、前記 < 1 >本発明除去方法 1で述べた「LAMのリム ルス試薬に対する反応性の除去」と「リムルス試薬の Etに対する反応性の維持」との ノランスの観点から、試料中の金属塩の終濃度は、本発明 Et測定方法を実施する 者が欲するリムルス試薬の Etに対する反応性の維持の程度によっても当業者が適宜 決定することができる。具体的には、例えば、 Etの相対活性が 50%以上となるように 試料中の金属塩の終濃度を選択することが好ましぐ 65%以上となるように試料中の 金属塩の終濃度を選択することがより好ましぐ 80%以上となるように試料中の金属 塩の終濃度を選択することが特に好ましい。なお、 Etの相対活性については、前述 した LAMの相対活性における LAMを Etに置き換えたものである。具体的には実施 例を参照されたい。
[0042] 本発明 Et測定方法による Etの測定は、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を本 発明除去方法 1又は 2で除去した後、又は除去すると同時に、 Etによって引き起こさ れるリムルス反応の検知又は測定を行うことにより達成することができる。さらに、本発 明 Et測定方法は、上記以外のその他のステップを含んで 、ても良 、。
[0043] LAMのリムルス試薬に対する反応性を本発明除去方法 1又は 2で除去するタイミン グも特に限定されない。例えば、試料に予め金属塩又は緩衝剤を共存させて LAM のリムルス試薬に対する反応性を除去した後、この試料をリムルス試薬と接触させて もよぐリムルス試薬に予め金属塩又は緩衝剤を混合しておき、これを試料に接触さ せることにより LAMのリムルス試薬に対する反応性の除去とリムルス反応とを同時に 行うことちでさる。
[0044] すなわち本発明 Et測定方法は、下記に示される Etの測定方法をも提供する。 下記ステップ (a)及び (b)を少なくとも含む Etの測定方法；
(a) Et及び LAMを含有する試料に、金属塩又は緩衝剤を共存させるステップ；
(b)前記共存後の試料にリムルス試薬を接触させ、 Etによって惹起されるリムルス反 応を検知するステップ。
上記 (a)においては、 Et及び LAMを含有する試料に、金属塩又は緩衝剤のどちら か一方を共存させてもよぐ金属塩及び緩衝剤の両方を共存させてもよい。
[0045] また本発明 Et測定方法は、下記に示される Etの測定方法をも提供する。
下記ステップ (a)及び (b)を少なくとも含む Etの測定方法；
(a)リムルス試薬に金属塩又は緩衝剤を共存させるステップ；
(b) Et及び LAMを含有する試料に、前記共存後のリムルス試薬を接触させ、 Et〖こよ つて惹起されるリムルス反応を検知するステップ。
上記 (a)においては、リムルス試薬に、金属塩又は緩衝剤のどちらか一方を共存さ せてもよぐ金属塩及び緩衝剤の両方を共存させてもよい。
[0046] Etによって引き起こされるリムルス反応の検知は、公知の方法で行うことができる。
例えば、 日本薬局方等に記載の比色法 (エンドポイントアツセィゃ力イネティックアツ セィ）、ゲルイ匕法、比濁法 (エンドポイントアツセィゃ力イネティックアツセィ)等の公知 の方法で、それぞれの方法に応じた検知方法を採用することができる。
[0047] 本出願書類にお 、て「測定」とは、定量的な測定のみならず、定性的な測定 (Etの 存否の検知等)をも含む概念である。
[0048] Etの定量的な測定は、目的に応じて種々の方法を採用することができる。例えば、 Et濃度が既知の試料を用 、て Et濃度とリムルス反応の強度との関係につ 、て検量 線や関係式を作成しておき、これを用いることによって厳密な定量を行うことができる 。また、厳密な定量が必要ない場合には、 2つ以上の試料についてその試料間の Et 量の多少を比較してもよい。 Etはリムルス反応を惹起させることから、リムルス反応の 強度が高ければ、試料中の Et量も多いこととなる。
[0049] Etの定性的な測定は、リムルス反応の有無を検知することによって行うことができる 。 Etはリムルス反応を惹起させることから、リムルス反応が検知されれば、試料中に E tが存在することとなる。 [0050] 本発明 Et測定方法によれば、 LAMを含有する試料中の LAMのリムルス試薬に対 する反応性が除去されることから、当該試料中の Etを、 LAMの影響を受けることなく 又は LAMの影響を低減させて測定することができる。
[0051] <4> 本発明疾患検知方法
本発明疾患検知方法は、本発明 Et測定方法を用いることを特徴とする、 Et関連疾 患の検知方法である。
本発明疾患検知方法は、本発明 Et測定方法を、 Et関連疾患の検知に応用したも のである。本発明疾患検知方法では、本発明 Et測定方法における「LAMを含有す る試料」として、 Etを含有するか又は Etを含有する可能性がある生体由来の試料を 用いることとなる。「生体由来の試料」についての説明は、前記く 1 >本発明除去方 法 1と同様である。
[0052] なお、「生体由来の試料」として血液を用いる場合は、血液中のリムルス反応妨害 因子（セリンプロテアーゼ、セリンプロテアーゼインヒビター等）を公知の方法 (例えば 、特開昭 58— 85162号公報等に記載の方法)で予め除去又は不活ィ匕しておくこと が好ましいことも、前記く 1 >本発明除去方法 1と同様である。
[0053] 検知対象とする Et関連疾患は、 Etに基づいて引き起こされる疾患である限りにお いて特に限定されない。例えば、 Et血症、敗血症、グラム陰性菌感染症が例示され る。
[0054] 本発明疾患検知方法にお!、て、「検知」とは、定性的な検知 (Et関連疾患の存否の 検知)のみならず、定量的な検知 (Et関連疾患の悪性度の検知等)をも含む概念で ある。
[0055] Et関連疾患の定性的な検知は、 Etの定性的な測定を応用することにより行うことが できる。 Etの定性的な測定については、前記く 3 >本発明 Et測定方法を参照された い。リムルス反応が検知されれば、試料中に Etが存在することとなり、 Et関連疾患で あるか又はその疑 、があると!/、うことができる。
[0056] Et関連疾患の定量的な検知は、 Etの定量的な測定を応用することにより行うことが できる。 Etの定量的な測定については、前記く 3 >本発明 Et測定方法を参照された い。 Etはリムルス反応を惹起させることから、リムルス反応の強度が高ければ試料中 の Et量も多 ヽこととなり、これに対応して Et関連疾患の悪性度が高 ヽ又はその疑!ヽ があると関連づけることができる。
[0057] < 5 > 本発明 Et測定キット
本発明 Et測定キットは、リムルス試薬と、金属塩又は緩衝剤とを構成成分として含 む、 LAMの影響を低減させた Etの測定のために用いられる Etの測定キットである。
[0058] 本発明 Et測定キットを用いることにより、本発明 Et測定方法を簡便に行うことができ る。
本発明 Et測定キットにおいて、「LAMの影響を低減させた Etの測定」とは、 LAM のリムルス試薬に対する反応性を除去することにより、 LAMの影響を受けることのな い状態、又は LAMの影響が低減された状態で行われる Etの測定を意味する。ここ で、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を除去する程度については特に限定され ないが、例えば、 LAMの相対活性が 50%以下となるように反応性を除去することが 好ましぐ LAMの相対活性が 20%以下となるように反応性を除去することが好ましく 、 LAMの相対活性が 10%以下となるように反応性を除去することが好ましぐ LAM の相対活性が 5%以下となるように反応性を除去することが好ましい。
[0059] 「リムルス試薬」についての説明は、く 1 >本発明除去方法 1と同様である。したが つて、リムルス試薬は、 Et特異的リムルス試薬であることが好ましい。
[0060] また、「金属塩」についての説明は、く 3 >本発明 Et測定方法と同様である。したが つて、好ましい金属塩として、具体的には、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム及び硫 酸カリウム等の硫酸塩、塩ィ匕ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム及び塩化力 ルシゥム等の金属塩ィ匕物、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩等が例示される。
[0061] また、「緩衝剤」につ 、ての説明も、く 3 >本発明 Et測定方法と同様である。したが つて、好ましい緩衝剤として、具体的には、トリス、へぺス、テス、 HEPPSO、トリシン、 ビシン、イミダゾール等が例示される。
[0062] 本発明 Et測定キットは、少なくともリムルス試薬と、金属塩又は緩衝剤とを構成成分 として含む限りにおいて特に限定されない。ここで、 「リムルス試薬と金属塩又は緩衝 剤とを構成成分として含む」とは、構成成分として、リムルス試薬に加えて、金属塩又 は緩衝剤のどちらか一方を含んで 、てもよく、両方を含んで 、てもよ 、ことを意味す る。また本発明 Et測定キットは、上記の構成成分に加え、他の構成成分をさらに含ん でいてもよい。このような構成成分としては、例えばブランクテスト用蒸留水，反応試 薬溶解液、反応用緩衝液、 Et標準物質、反応基質等を挙げることができる。さらに本 発明 Et測定キットには、測定バッチ同士の実施レベルを一定水準に保っための陽 性コントロール (QCコントロール)等を含有させることもできる。
[0063] これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容し保存しておくことができる。本 発明のキットは、使用方法や、キットに含まれる金属塩又は緩衝剤が試料中の LAM のリムルス試薬に対する反応性を除去するために使用されるものであることを記載し た使用説明書を含むことが好ましい。
[0064] 本発明 Et測定キットを用いた Etの測定は、前記く 3 >の本発明 Et測定方法に従つ て行うことができる。
[0065] < 6 > 本発明疾患診断キット
本発明疾患診断キットは、本発明 Et測定キットからなる、 Et関連疾患の診断キット である。
本発明疾患診断キットを用いることにより、 Et関連疾患の診断を簡便に行うことがで きる。
[0066] 診断対象とする Et関連疾患は、 Etに基づいて引き起こされる疾患である限りにお いて特に限定されない。例えば、 Et血症、敗血症、グラム陰性菌感染症が例示され る。また、用いる「生体由来の試料」等の説明については、く 4>本発明疾患検知方 法と同様である。すなわち、用いる「生体由来の試料」は血液であることが好ましい。 また、「生体由来の試料」として血液を用いる場合に、血液中のリムルス反応妨害因 子（セリンプロテアーゼ、セリンプロテアーゼインヒビター等）を予め除去又は不活化し ておくことが好ましい点についても、前記く 4>と同様である。
[0067] 本発明疾患診断キットを用いた Et関連疾患の診断は、前記の <4>本発明疾患検 知方法を応用することにより行うことができる。
[0068] < 7>本発明反応性除去剤 1
本発明反応性除去剤 1は、金属塩を有効成分として含有する、 LAMのリムルス試 薬に対する反応性を除去するために用いられる反応性除去剤である。 上記の「金属塩」、「リムルス試薬」、「反応性を除去する」に関する説明については
、上記 < 1 >本発明除去方法 1における説明を参照されたい。
[0069] < 8 >本発明反応性除去剤 2
本発明反応性除去剤 2は、緩衝剤を有効成分として含有する、 LAMのリムルス試 薬に対する反応性を除去するために用いられる反応性除去剤である。
上記の「緩衝剤」、「リムルス試薬」及び「反応性を除去する」に関する説明について は、上記 < 2 >本発明除去方法 2における説明を参照されたい。
実施例
[0070] 以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は以下に示す実施例に限定され るものではない。
[0071] 1.硫酸ナトリウム存在下における、 LAMと Etのリムルス試薬に対する反応性の比 較—その 1
金属塩として硫酸ナトリウムを含むリムルス試薬に対する反応性を、 LAMと Etとで 比較した。なお、ァメボサイト'ライセート (カブトガ-血球抽出成分)を以後「ライセート 」という。また、本実施例で使用した LAMは、ヒト型結核菌（青山 B株; Mycobacterium tuberculosis Aoyama-B)株の死菌体から有機溶媒抽出とカラムクロマトグラフィーで 高純度に単離精製した LAMけ力ライテスタ株式会社販売)である。
[0072] 1 - 1 タキプレウス'トリデンタツス由来ライセートを用いた場合
硫酸ナトリウム、トリス塩酸緩衝液 (pH8.0)、硫酸マグネシウム、発色合成基質 (Boc- Leu-Gly-Arg-pNA (パラ-トロア-リン)塩酸塩）（株式会社ペプチド研究所製)及び タキプレウス'トリデンタツス由来ライセートを、反応液量 200 μ Lにおけるそれぞれの 濃度 (mM)又は使用量が、硫酸ナトリウム 0, 10, 20, 30, 40, 50mM、トリス塩酸緩衝液 ( pH8.0) 50mM、硫酸マグネシウム 20mM、発色合成基質（Boc- Leu- Gly- Arg- pNA塩 酸塩） 0.167mM、タキプレウス'トリデンタツス由来ライセート 20 Lとなるように、 Et及 び BGフリーのマイクロタイタープレート（トキシペットプレート LP、生化学工業株式会 社）にカロえた。このプレートに、 lOOng/mLの LAM 25 μ L又は Ing/mLの Et (Difco 社製、 E.coli 0111 :B4株由来） 25 μ Lを加え、マイクロプレートリーダー（ウエノレリーダ 一 SK603、生化学工業株式会社)内で 30分間反応させた。 1分間当たりの吸光度 [A 405nm-492nm (対照波長)]変化率 (mAbs/min)を自動測定し、それぞれの測定により 得られた値を硫酸ナトリウム濃度が OmMである場合の値 (コントロール値;これを 100 %とする）と比較し、 LAMの相対活性 (%)及び Etの相対活性 (%)を求めた。結果を図 1 及び図 2に示す。
[0073] 硫酸ナトリウム濃度 50mMにお!/、て、 LAMの相対活性は 0.3%を示し（すなわち LA Mの反応性の 99. 7%が除去された）、 LAMのリムルス試薬に対する反応性はほぼ 完全に抑制された（図 1)。一方、この濃度において、 Etの相対活性は 86.6%を示し、 Etのリムルス試薬に対する反応性は、 LAMのそれと比較して、極めて優位に維持さ れていることが明らかになった（図 2)。
[0074] 1 - 2 リムルス'ポリフエムス由来ライセートを用いた場合
上記 1 1におけるタキプレウス ·トリデンタツス由来ライセートの代わりにリムノレス ·ポ リフエムス由来ライセートを用い、また、使用する LAMの濃度を lOOOng/mLに、 Etの 濃度を 2ng/mLに変え、上記 1—1と同様の試験を行った。結果を図 3及び図 4に示す
[0075] 硫酸ナトリウム濃度 50mMにお!/、て、 LAMの相対活性は 0.9%を示し、 LAMのリムル ス試薬に対する反応性はほぼ完全に抑制された（図 3)。一方、この濃度において、 E tの相対活性は 67.3%を示し、 Etのリムルス試薬に対する反応性は、 LAMのそれと比 較して、優位に維持されて！、ることが明らかになった（図 4)。
[0076] 2.硫酸ナトリウム存在下における、 LAMと Etの Et特異的リムルス試薬に対する反 応性の比較 その 2
金属塩として硫酸ナトリウムを含む Et特異的リムルス試薬に対する反応性を、 LAM と Etとで比較した。なお、 Et特異的リムルス試薬としては、エンドスぺシ一 ES-50M ( 生化学工業株式会社)を使用した。また、 LAM及び Etについては、前記実施例 1と 同様のものを使用した。
[0077] 硫酸ナトリウムを、反応液量 100 μ Lにおける濃度力 0, 15, 30, 60, 90, 120mMと なるようにマイクロタイタープレート（トキシペットプレート LP、生化学工業株式会社） にカロえた。このプレートに、 20 μ g/mLの LAM 25 μ L又は 0.4ng/mLの Et 25 μ Lを 加え、エンドスぺシ一 ES-50Mに付属の緩衝液で溶解した主剤溶液 50 Lを加えた 。このプレートをマイクロプレートリーダー（ゥエルリーダー SK603、生化学工業株式 会社）内で 30分間反応させた。 1分間当たりの吸光度 [A405nm- 492 (対照波長)] 変化率 (mAbs/min)を自動測定し、前記実施例 1と同様の方法により、 LAMの相対活 性 (%)及び Etの相対活性 (%)を求めた。結果を図 5及び図 6に示す。
[0078] 硫酸ナトリウム濃度 120mMにお!/、て、 LAMの相対活性は 5.2%を示し、 LAMの Et 特異的リムルス試薬に対する反応性は著しく抑制された（図 5)。一方、この濃度にお いて、 Etの相対活性は 79.8%を示し、 Etの Et特異的リムルス試薬に対する反応性は LAMのそれと比較して、極めて優位に維持されていることが明らかになった（図 6)
[0079] 3.塩ィ匕ナトリウム存在下における、 LAMと Etの Et特異的リムルス試薬に対する反 応性の比較
前記実施例 2における硫酸ナトリウムを塩ィ匕ナトリウムに代え、同様の試験を行った 。ただしここでは、塩ィ匕ナトリウムを、反応液量 100 μ Lにおける濃度力 0, 50, 100, 1 50, 200, 250mMとなるようにマイクロタイタープレート（トキシペットプレート LP、生化 学工業株式会社）に加えた。結果を図 7及び図 8に示す。
[0080] 塩化ナトリウム濃度 250mMにお!/、て、 LAMの相対活性は 7.2%を示し、 LAMの Et 特異的リムルス試薬に対する反応性は著しく抑制された（図 7)。一方、この濃度にお いて、 Etの相対活性は 88.3%を示し、 Etの Et特異的リムルス試薬に対する反応性は LAMのそれと比較して、極めて優位に維持されていることが明らかになった（図 8)
[0081] 4.各種金属塩の LAM完全阻害濃度及び前記濃度における Etの相対活性
表 1に示す各種金属塩を使用し、前記の実施例 1 1及び 1 2と同様の操作を行 うことによって、反応時の金属塩の濃度の変化に伴う LAMの相対活性（％)の変化を 調べることにより、 LAMの相対活性（％)がほぼ完全に消失するときの金属塩濃度（ 以後、「LAM完全阻害濃度」という）を求めた。また、 LAM完全阻害濃度の金属塩 存在下における Etの相対活性 (%)を、実施例 1— 1及び 1― 2と同様の操作を行うこ とによって求めた。結果を表 1に示す。
[0082] [表 1] 各種金属塩存在下における LAM完全阻害濃度と Etの相対活性
Figure imgf000024_0001
(注） 反応液量 200 jL Lで測定したとき。
[0083] それぞれの金属塩について、表中の括弧内に示したロット数の回数の測定を行い
、それぞれ LAM完全阻害濃度及び Etの相対活性を求めた。
[0084] なお、上記表中で LAL ライセートはリムノレス'ポリフエムス由来ライセートを、 TAL ライセートはタキプレウス ·トリデンタツス由来ライセートを意味する。
[0085] 5.トリス緩衝液存在下における、 LAMと Etのリムルス試薬に対する反応性の比較 緩衝液としてトリス緩衝液を用い、リムルス試薬に対する反応性を LAMと Etとで比 較した。
[0086] 5- 1 タキプレウス'トリデンタツス由来ライセートを用いた場合
トリス塩酸緩衝液 (pH8.0)、硫酸マグネシウム、発色合成基質及びタキプレウス'トリ デンタツス由来ライセートを、反応液量 200 μ Lにおけるそれぞれの濃度 (mM)又は使 用量が、トリス塩酸緩衝液 (pH8.0) 25,50,100,150,200mM、硫酸マグネシウム 20mM、 発色合成基質 0.167mM、タキプレウス'トリデンタツス由来ライセート 20 Lとなるよう に、トキシペットプレート LP〖こカロえた。このプレートに、 lOOng/mLの LAM 25 L又 は Ing/mLの Et (E.coli 0111:B4株由来） 25 ;z Lを加え、ウエノレリーダー SK603内で 3 0分間反応させた。 1分間当たりの吸光度 [A405nm-492nm (対照波長)]変化率 (mAbs /min)を自動測定し、それぞれの測定により得られた値をトリス塩酸緩衝液濃度が 50m Mである場合の値 (コントロール値;これを 100%とする）と比較し、 LAMの相対活性（ %)及び Etの相対活性 (%)を求めた。結果を図 9及び図 10に示す。
[0087] トリス塩酸緩衝液濃度 200mMにお!/、て、 LAMの相対活性は 5.4%を示し（すなわち L AMの反応性の 94. 6%が除去された）、 LAMのリムルス試薬に対する反応性は著 しく抑制された（図 9)。一方、この濃度において、 Etの相対活性は 102.5%を示し、 Et のリムルス試薬に対する反応性は、 LAMのそれと比較して、極めて優位に維持され ていることが明らかになった（図 10)。
[0088] 5- 2 リムルス'ポリフエムス由来ライセートを用いた場合
上記 5— 1におけるタキプレウス ·トリデンタツス由来ライセートの代わりにリムノレス ·ポ リフエムス由来ライセートを用い、上記 5—1と同様の試験を行った。結果を図 11及び 図 12に示す。
[0089] トリス塩酸緩衝液濃度 200mMにお!/、て、 LAMの相対活性は 29.8%を示し、 LAMの リムルス試薬に対する反応性は大幅に抑制された（図 11)。一方、この濃度において 、 Etの相対活性は 85.0%を示し、 Etのリムルス試薬に対する反応性は、 LAMのそれ と比較して、優位に維持されていることが明らかになった（図 12)。
[0090] 6.各種緩衝剤存在下における、 LAMと Etのリムルス試薬に対する反応性の比較 表 2に示す各種緩衝剤を用い、上記 5— 1及び 5— 2と同様の試験を行い、各種緩 衝液濃度 200mMにおける LAMの相対活性及び Etの相対活性を求めた。結果を表 2に示す。
[0091] [表 2] 各種緩衝剤存在下における LAMの相対活性と Etの相対活性
Figure imgf000026_0001
(注）反応液量 200 jU Lで測定したとき。
[0092] 以上述べたように、金属塩または緩衝液の存在下では LAMのリムルス試薬への反 応性が低下することが明ら力となった。したがって、本発明においては、金属塩また は緩衝液を共存させた状態でリムルス試薬を用いて Etの測定を行うことで LAMの反 応性を除去して Etを正確に定量できる。
産業上の利用可能性
[0093] 本発明除去方法 1及び 2は、リムルス反応における LAMの影響の除去に利用する ことができる。
[0094] また、本発明 Et測定方法、本発明疾患検知方法、本発明 Et測定キット及び本発明 疾患診断キットは、 Etや Et関連疾患の測定'検知に利用することができる。
[0095] 本発明除去方法 1又は 2により、 LAMを含有する試料中の LAMのリムルス試薬に 対する反応性を、簡便、迅速かつ安価に、効率良く除去することができる。また、本発 明 Et測定方法により、上記試料中の Etを、 LAMの影響を受けることなく又は LAM の影響を低減させて測定することができる。また、本発明疾患検知方法により、 Et関 連疾患の検知を、より高い精度で行うことができる。さらに本発明 Et測定キット及び本 発明疾患診断キットにより、上記の本発明 Et測定方法及び本発明疾患検知方法を、 簡便かつ迅速に行うことができる。

Claims

請求の範囲
[1] リポアラビノマンナンを含有する試料に、金属塩を共存させるステップを少なくとも含 む、当該試料中のリポアラビノマンナンのリムルス試薬に対する反応性を除去する方 法。
[2] 金属塩が、硫酸塩、金属塩ィ匕物及び硝酸塩力 選択される 1又は 2以上の金属塩で ある、請求項 1に記載の方法。
[3] 金属塩が、下記の群力 選択される 1又は 2以上の金属塩である、請求項 2に記載の 方法；
硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、塩ィ匕ナトリウム、塩化マグネシウム、 塩ィ匕カリウム、塩ィ匕カルシウム、硝酸ナトリウム及び硝酸カリウム。
[4] 金属塩を、試料中の終濃度が 30〜500mMとなるように共存させることを特徴とする
、請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の方法。
[5] リポアラビノマンナンを含有する試料に、緩衝剤を共存させるステップを少なくとも含 む、当該試料中のリポアラビノマンナンのリムルス試薬に対する反応性を除去する方 法。
[6] 緩衝剤が、下記の群力も選択される 1又は 2以上の緩衝剤である、請求項 5に記載の 方法；
トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン、 2-[4-(2-ヒドロキシェチル) - 1-ピぺラジュル]エタ ンスルホン酸、 N-トリス (ヒドロキシメチル)メチル -2-アミノエタンスルホン酸、 2-ヒドロキ シ- 3-[4-(2-ヒドロキシェチル) -1-ピぺラジュル]プロパンスルホン酸,一水和物、 N- [ト リス (ヒドロキシメチル)メチル]グリシン、 Ν,Ν-ビス (2-ヒドロキシェチル)グリシン、イミダゾ 一ノレ。
[7] 緩衝剤を、試料中の終濃度が 100〜300mMとなるように共存させることを特徴とす る、請求項 5又は 6に記載の方法。
[8] リポアラビノマンナンおよびエンドトキシンを含有する試料中のエンドトキシンをリムル ス試薬を用いて測定する方法であって、リポアラビノマンナンのリムルス試薬に対する 反応性を請求項 1〜7のいずれ力 1項に記載の方法で除去するステップを少なくとも 含む方法。
[9] 下記ステップ (a)及び (b)を少なくとも含むエンドトキシンの測定方法；
(a)エンドトキシン及びリポアラビノマンナンを含有する試料に、金属塩又は緩衝剤を 共存させるステップ；
(b)前記共存後の試料にリムルス試薬を接触させ、エンドトキシンによって惹起される リムルス反応を検知するステップ。
[10] 下記ステップ (a)及び (b)を少なくとも含むエンドトキシンの測定方法；
(a)リムルス試薬に金属塩又は緩衝剤を共存させるステップ；
(b)エンドトキシン及びリポアラビノマンナンを含有する試料に、前記共存後のリムル ス試薬を接触させ、エンドトキシンによって惹起されるリムルス反応を検知するステツ プ。
[11] リムルス試薬力 エンドトキシン特異的リムルス試薬である、請求項 8〜10のいずれか 1項に記載の方法。
[12] 請求項 8〜： L 1のいずれか 1項に記載の方法を用いることを特徴とする、エンドトキシ ン関連疾患の検知方法。
[13] リムルス試薬と、金属塩又は緩衝剤とを構成成分として含む、 LAMの影響を低減さ せたエンドトキシンの測定のために用いられるエンドトキシンの測定キット。
[14] 金属塩が、硫酸塩、金属塩ィ匕物及び硝酸塩力 選択される 1又は 2以上の金属塩で ある、請求項 13に記載のキット。
[15] 金属塩が、下記の群力も選択される 1又は 2以上の金属塩である、請求項 14に記載 のキット；
硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、塩ィ匕ナトリウム、塩化マグネシウム、 塩ィ匕カリウム、塩ィ匕カルシウム、硝酸ナトリウム及び硝酸カリウム。
[16] 緩衝剤が、下記の群力も選択される 1又は 2以上の緩衝剤である、請求項 13に記載 のキット；
トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン、 2-[4-(2-ヒドロキシェチル) - 1-ピぺラジュル]エタ ンスルホン酸、 N-トリス (ヒドロキシメチル)メチル -2-アミノエタンスルホン酸、 2-ヒドロキ シ- 3-[4-(2-ヒドロキシェチル) -1-ピぺラジュル]プロパンスルホン酸,一水和物、 N- [ト リス (ヒドロキシメチル)メチル]グリシン、 Ν,Ν-ビス (2-ヒドロキシェチル)グリシン、イミダゾ 一ノレ。
[17] リムルス試薬力 エンドトキシン特異的リムルス試薬である、請求項 13〜16のいずれ 力 1項に記載のキット。
[18] 請求項 13〜17のいずれか 1項に記載のキットからなる、エンドトキシン関連疾患の診 断キット。
[19] 金属塩を有効成分として含有する、リポアラビノマンナンのリムルス試薬に対する反 応性を除去するために用いられる反応性除去剤。
[20] 緩衝剤を有効成分として含有する、リポアラビノマンナンのリムルス試薬に対する反 応性を除去するために用いられる反応性除去剤。
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