JPWO2006137444A1 - リポアラビノマンナンの反応性除去方法とその応用 - Google Patents

Abstract

リポアラビノマンナンを含有する試料に、金属塩又は緩衝剤を共存させるステップを少なくとも含む当該試料中のリポアラビノマンナンのリムルス試薬に対する反応性を除去する方法、並びに該方法を利用したエンドトキシンの測定方法、及びエンドトキシン関連疾患の検知方法。

Description

本発明は、リポアラビノマンナンのリムルス試薬に対する反応性を除去する方法、これを応用したリポアラビノマンナンを含有する試料中のエンドトキシンの測定方法及びエンドトキシン関連疾患の検知方法、これらに用いるエンドトキシンの測定キット及びエンドトキシン関連疾患の診断キット等に関する。

本出願書類中で使用する略号を以下に示す。
ＬＡＭ：リポアラビノマンナン
Ｅｔ：エンドトキシン
ＢＧ：（１→３）−β−Ｄ−グルカン
リムルス試薬（ライセート試薬とも呼ばれている）は、カブトガニのアメボサイト・ライセートを主成分とする試薬であって、ＥｔやＢＧの検知・測定に用いられている。リムルス試薬はＥｔやＢＧに対する反応性を有しており、リムルス試薬とこれらの物質が接触すると、リムルス試薬中の種々の因子が関与するカスケード反応（以下、「リムルス反応」という。）が惹起され、この反応を検知することでこれらの物質を検知・測定することができる。

一方、ＬＡＭは、抗酸菌（例えば、結核菌等）に特有の細胞壁成分であることが知られている。

特許文献１には、アルカリ土類金属塩を有効成分のひとつとして含有するＥｔ安定化剤及びこれを用いるＥｔの測定方法等が開示されている。しかしこのアルカリ土類金属塩が、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去する効果を有することについての開示や示唆はない。

特許文献２には、塩化カルシウムと水酸化カリウムの混合水溶液で、血漿又は血清を処理して被検液とすることを特徴とするＥｔの測定法等が開示されている。しかしこの塩化カルシウムが、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去する効果を有することは、記載も示唆もない。

また、リムルス試薬の凍結乾燥物は、通常、水、検体溶液又は緩衝液等で溶解され、用いられている。しかし緩衝液がＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去する効果を有することについては、知られていない。

さらに特許文献３には、カブトガニ・アメボサイト・ライセートと緩衝作用を有する特定構造の化合物を有効成分として含有するリムルス試薬を用いて、検体中のリムルス試薬反応性物質を測定する方法等が記載されている。しかし上記化合物が、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去する効果を有することについての開示や示唆はない。

特開平８−７５７５１号公報 特開平４−１３６７６３号公報 特開平７−２３９３３２号公報

本発明者らは、ＬＡＭがリムルス試薬と反応すること、したがって、ＥｔとＬＡＭを両方含む試料を用いた場合は、ＥｔをＬＡＭの影響なく定量的に測定することが困難であることを発見した。そこで、本発明は、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去する方法、これを応用したＬＡＭを含有する試料中のＥｔの測定方法及びＥｔ関連疾患の検知方法、これらに用いるＥｔの測定キット及びＥｔ関連疾患の診断キット等を提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ＬＡＭを含有する試料に、金属塩又は緩衝剤を共存させることにより、当該試料中のＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去することができることを見出し、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去する方法、これを応用したＬＡＭを含有する試料中のＥｔの測定方法及びＥｔ関連疾患の検知方法、これらに用いるＥｔの測定キット及びＥｔ関連疾患の診断キット等を提供するに至った。

すなわち、本発明は、下記（１）〜（１７）に記載の方法又はキットを提供する。
（１）ＬＡＭを含有する試料に、金属塩を共存させるステップ（工程）を少なくとも含む、当該試料中のＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去する方法（以下、「本発明除去方法１」という）。
（２）金属塩が、硫酸塩、金属塩化物及び硝酸塩から選択される１又は２以上の金属塩である、前記（１）に記載の方法。
（３）金属塩が、下記の群から選択される１又は２以上の金属塩である、前記（２）に記載の方法；
硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硝酸ナトリウム及び硝酸カリウム。
（４）金属塩を、試料中の終濃度が３０ｍＭ以上となるように共存させることを特徴とする、前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の方法。
（５）ＬＡＭを含有する試料に、緩衝剤を共存させるステップ（工程）を少なくとも含む、当該試料中のＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去する方法（以下、「本発明除去方法２」という）。
（６）緩衝剤が、下記の群から選択される１又は２以上の緩衝剤である、前記（５）に記載の方法；
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸、2-ヒドロキシ-3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸,一水和物、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]グリシン、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン、イミダゾール。
（７）緩衝剤を、試料中の終濃度が１００〜３００ｍＭとなるように共存させることを特徴とする、前記（５）又は（６）に記載の方法。
（８）ＬＡＭおよびＥｔを含有する試料中のＥｔをリムルス試薬を用いて測定する方法であって、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を（１）〜（７）のいずれかの方法で除去するステップ（工程）を少なくとも含む方法（以下、「本発明Ｅｔ測定方法」という）。
（９）下記ステップ（ａ）及び（ｂ）を少なくとも含むＥｔの測定方法；
（ａ）Ｅｔ及びＬＡＭを含有する試料に、金属塩又は緩衝剤を共存させるステップ；
（ｂ）前記共存後の試料にリムルス試薬を接触させ、Ｅｔによって惹起されるリムルス反応を検知するステップ。
（１０）下記ステップ（ａ）及び（ｂ）を少なくとも含むＥｔの測定方法；
（ａ）リムルス試薬に金属塩又は緩衝剤を共存させるステップ；
（ｂ）Ｅｔ及びＬＡＭを含有する試料に、前記共存後のリムルス試薬を接触させ、Ｅｔによって惹起されるリムルス反応を検知するステップ。
（１１）リムルス試薬が、Ｅｔ特異的リムルス試薬である、前記（８）〜（１０）のいずれか１つに記載の方法。
（１２）前記（８）〜（１１）のいずれか１つに記載の方法を用いることを特徴とする、Ｅｔ関連疾患の検知方法（以下、「本発明疾患検知方法」という）。
（１３）リムルス試薬と、金属塩又は緩衝剤とを構成成分として含む、ＬＡＭの影響を低減させたＥｔの測定のために用いられるＥｔの測定キット（以下、「本発明Ｅｔ測定キット」という）。
（１４）金属塩が、硫酸塩、金属塩化物及び硝酸塩から選択される１又は２以上の金属塩である、前記（１３）に記載のキット。
（１５）金属塩が、下記の群から選択される１又は２以上の金属塩である、前記（１４）に記載のキット；
硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硝酸ナトリウム及び硝酸カリウム。
（１６）緩衝剤が、下記の群から選択される１又は２以上の緩衝剤である、前記（１３）に記載のキット；
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸、2-ヒドロキシ-3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸,一水和物、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]グリシン、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン、イミダゾール。
（１７）リムルス試薬が、Ｅｔ特異的リムルス試薬である、前記（１３）〜（１６）のいずれか１つに記載のキット。
（１８）前記（１３）〜（１７）のいずれか１つに記載のキットからなる、Ｅｔ関連疾患の診断キット（以下、「本発明疾患診断キット」という）。
（１９）金属塩を有効成分として含有する、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去するために用いられる反応性除去剤（以下、「本発明反応性除去剤１」という）。
（２０）緩衝剤を有効成分として含有する、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去するために用いられる反応性除去剤（以下、「本発明反応性除去剤２」という）。

タキプレウス・トリデンタツス由来ライセートを用いたリムルス反応における硫酸ナトリウム濃度と、ＬＡＭの相対活性との関係を示す図。 タキプレウス・トリデンタツス由来ライセートを用いたリムルス反応における硫酸ナトリウム濃度と、Ｅｔの相対活性との関係を示す図。 リムルス・ポリフェムス由来ライセートを用いたリムルス反応における硫酸ナトリウム濃度と、ＬＡＭの相対活性との関係を示す図。 リムルス・ポリフェムス由来ライセートを用いたリムルス反応における硫酸ナトリウム濃度と、Ｅｔの相対活性との関係を示す図。 Ｅｔ特異的リムルス試薬を用いたリムルス反応における硫酸ナトリウム濃度と、ＬＡＭの相対活性との関係を示す図。 Ｅｔ特異的リムルス試薬を用いたリムルス反応における硫酸ナトリウム濃度と、Ｅｔの相対活性との関係を示す図。 Ｅｔ特異的リムルス試薬を用いたリムルス反応における塩化ナトリウム濃度と、ＬＡＭの相対活性との関係を示す図。 Ｅｔ特異的リムルス試薬を用いたリムルス反応における塩化ナトリウム濃度と、Ｅｔの相対活性との関係を示す図。 タキプレウス・トリデンタツス由来ライセートを用いたリムルス反応におけるトリス塩酸緩衝液濃度と、ＬＡＭの相対活性との関係を示す図。 タキプレウス・トリデンタツス由来ライセートを用いたリムルス反応におけるトリス塩酸緩衝液濃度と、Ｅｔの相対活性との関係を示す図。 リムルス・ポリフェムス由来ライセートを用いたリムルス反応におけるトリス塩酸緩衝液濃度と、ＬＡＭの相対活性との関係を示す図。 リムルス・ポリフェムス由来ライセートを用いたリムルス反応におけるトリス塩酸緩衝液濃度と、Ｅｔの相対活性との関係を示す図。

＜１＞ 本発明除去方法１
本発明除去方法１は、ＬＡＭを含有する試料に、金属塩を共存させるステップを少なくとも含む、当該試料中のＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去する方法である。

本明細書において、「ＬＡＭを含有する試料」とは、ＬＡＭを含有するか又は含有する可能性のある試料である限りにおいて特に限定されない。ＬＡＭは抗酸菌特有の細胞壁成分であることから、例えば抗酸菌（例えば結核菌等）の生菌や死菌自体、その細胞壁、細胞壁成分を含有するか又は含有する可能性のある試料等が例示される。このような試料としては、結核ワクチン等が例示される。また「ＬＡＭを含有する試料」としては、「生体由来の試料」を用いることもできる。「生体由来の試料」も特に限定されないが、体液であることが好ましい。体液は、ＬＡＭが含有されている又はその可能性がある体液である限りにおいて特に限定されない。例えば、血液（本明細書では、血清や血漿をも含む概念として用いる。）、喀痰、髄液、尿、汗、唾液、涙液、関節液等を例示することができる。なかでも血液が好ましい。

なお、「生体由来の試料」として血液用いる場合は、血液中のリムルス反応妨害因子（セリンプロテアーゼ、セリンプロテアーゼインヒビター等）を公知の方法（例えば、特開昭５８−８５１６２号公報等に記載の方法）で予め除去又は不活化しておくことが好ましい。

また本発明除去方法１において、金属塩は、ＬＡＭを含有する試料中のＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去する作用を有し得るものであればよく、使用する金属塩の種類、数、組み合わせ等も特に限定されない。金属塩は、単一種類のもののみを用いてもよく、複数種の金属塩を組み合わせて用いてもよい。例えば、複数種の金属塩の混合物を用いてもよい。また金属塩は、その存在状態又は存在形態等によって限定されるものではなく、例えば粉末にされる固体状態の金属塩そのものであってもよく、精製水に例示される溶液に溶解された状態として存在する金属塩であってもよい。また金属塩は、例えば界面活性剤、抗結核抗体、抗ＬＡＭ抗体、ＢＧ、カルボキシメチル化されたＢＧ、強アルカリ性物質、ポリミキシンＢ、コリスチン、コンカナバリンＡ、ヒスチジン、ヒスタミン及びリムルス試薬に例示される金属塩以外の成分との混合物として存在するものであってもよい。ここで例えば金属塩が、界面活性剤、抗結核抗体、抗ＬＡＭ抗体、ＢＧ、カルボキシメチル化されたＢＧ、強アルカリ性物質、ポリミキシンＢ、コリスチン、コンカナバリンＡ、ヒスチジン及びヒスタミン等に例示される物質との混合物として存在するものである場合、当該混合物を用いることにより、さらに好ましいＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去する効果が期待される。また例えば金属塩が、リムルス試薬との混合物として存在するものである場合であって、且つＬＡＭを含有する試料が、Ｅｔを含有するか、含有する可能性がある試料である場合、リムルス試薬と金属塩との混合物をＬＡＭを含有する試料に共存させた後に、当該共存後の試料中のＥｔによって惹起されるリムルス反応を検知又は測定することにより、上記試料中のＥｔをＬＡＭの影響を受けることのない状態、又はＬＡＭの影響が低減された状態で測定することができる。当該測定方法に関するより具体的な説明については、後述する＜３＞本発明Ｅｔ測定方法を参照されたい。

具体的な金属塩の種類としては、好ましくは、硫酸塩、金属塩化物、硝酸塩等が例示される。上記の中でも、下記の群から選択される１又は２以上の金属塩であることがより好ましい。
硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硝酸ナトリウム及び硝酸カリウム。

上記の中でも、硫酸ナトリウム又は塩化ナトリウムを少なくとも含むものであることがさらに好ましい。なお、この場合、金属塩は、硫酸ナトリウム又は塩化ナトリウムのどちらか一方を含むものであっても良く、両方を含むものであっても良いが、硫酸ナトリウムを少なくとも含むものであることが特に好ましい。

さらに、本発明除去方法１において、ＬＡＭを含有する試料に金属塩を共存させるステップにおける、金属塩の共存後の試料中の金属塩の濃度（以下、単に「試料中の金属塩の終濃度」と記載する）は、ＬＡＭを含有する試料中のＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去する作用を発揮し得る濃度である限りにおいて特に限定されず、使用する金属塩の種類や、本発明除去方法１を実施する者が欲する上記反応性の除去の効果の程度等に応じて、当業者が適宜設定することができる。

試料中の金属塩の終濃度を高めるほど、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性の除去効果を高めることができる。具体的には、試料中の金属塩の終濃度が２０ｍＭ以上となるように金属塩を共存させることが好ましい。

ただし、試料中の金属塩の終濃度が高くなりすぎると、リムルス試薬のＥｔに対する反応性は低下する傾向がある。したがって、本発明除去方法１を、後述する本発明Ｅｔ測定方法において用いる場合には、試料中の金属塩の終濃度は、「ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性の除去」と「リムルス試薬のＥｔに対する反応性の維持」とのバランスにおいて決定することができる。例えば、前者をより重視するならば後者を多少犠牲にしてでも試料中の金属塩の濃度をなるべく高めた方がよく、後者をより重視するならば試料中の金属塩の濃度をなるべく高めないようにすることが好ましい。リムルス試薬のＥｔに対する反応性を維持しつつ、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去するためには、試料中の金属塩の終濃度が、２０〜５００ｍＭとなるように金属塩を共存させることが好ましく、３０〜５００ｍＭとなるように金属塩を共存させることがより好ましい。また、３０〜３００ｍＭとなるように金属塩を共存させることも好ましい。

さらに、例えば金属塩として硫酸ナトリウムを用いる場合、試料中の硫酸ナトリウムの終濃度が、３０〜２００ｍＭとなるように共存させることが好ましく、３０〜１００ｍＭとなるように共存させることがより好ましく、４０〜８０ｍＭとなるように共存させることがさらに好ましく、５０〜７０ｍＭとなるように共存させることが極めて好ましく、約６０ｍＭとなるように共存させることが特に好ましい。また、金属塩として塩化ナトリウムを用いる場合、試料中の塩化ナトリウムの終濃度が１５０〜５００ｍＭとなるように共存させることが好ましく、２００〜４００ｍＭとなるように共存させることがより好ましく、２５０〜３５０ｍＭとなるように共存させることが特に好ましい。また、金属塩として硫酸マグネシウムを用いる場合、試料中の硫酸マグネシウムの終濃度が、８０〜３００ｍＭとなるように共存させることが好ましく、１００〜２００ｍＭとなるように共存させることがより好ましい。また、金属塩として硫酸カリウムを用いる場合、試料中の硫酸カリウムの終濃度が、５０〜２００ｍＭとなるように共存させることが好ましく、５０〜１５０ｍＭとなるように共存させることがより好ましい。また、金属塩として塩化マグネシウムを用いる場合、試料中の塩化マグネシウムの終濃度が、８０〜３００ｍＭとなるように共存させることが好ましく、１００〜２５０ｍＭとなるように共存させることがより好ましい。また、金属塩として塩化カリウムを用いる場合、試料中の塩化カリウムの終濃度が、２００〜５００ｍＭとなるように共存させることが好ましく、２００〜３００ｍＭとなるように共存させることがより好ましい。また、金属塩として硝酸ナトリウムを用いる場合、試料中の硝酸ナトリウムの終濃度が、１５０〜４００ｍＭとなるように共存させることが好ましく、２００〜３００ｍＭとなるように共存させることがより好ましい。また、金属塩として硝酸カリウムを用いる場合、試料中の硝酸カリウムの終濃度が、１５０〜４００ｍＭとなるように共存させることが好ましく、１８０〜３００ｍＭとなるように共存させることがより好ましい。また、金属塩として塩化カルシウムを用いる場合、試料中の塩化カルシウムの終濃度が、１００〜３００ｍＭとなるように共存させることが好ましく、１３０〜２００ｍＭとなるように共存させることがより好ましい。

また、前述したように、試料中の金属塩の終濃度は、本発明除去方法１を実施する者が欲するＬＡＭの反応性の除去の程度によっても適宜決定することができる。具体的には、ＬＡＭの相対活性が２０％以下となるように試料中の金属塩の終濃度を選択することが好ましく、１０％以下となるように試料中の金属塩の終濃度を選択することがより好ましく、５％以下となるように試料中の金属塩の終濃度を選択することが極めて好ましく、１％以下となるように試料中の金属塩の終濃度を選択することが特に好ましい。

なお、本発明除去方法１においてＬＡＭの相対活性とは、ある金属塩をある終濃度となるように共存させたときのＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性の値を、当該金属塩を共存させないときのＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性の値で割ることにより算出される百分率（％）を意味する。具体的には実施例に記載の方法により算出することができるので、これを参照されたい。

また、本発明除去方法において、リムルス試薬は、カブトガニのアメボサイト・ライセートを主成分とする試薬である限りにおいて特に限定されない。このカブトガニの種類も限定されず、リムルス・ポリフェムス（北アメリカ産カブトガニ）、タキプレウス・トリデンタツス、タキプレウス・ギガス、タキプレウス・ロタンディカウダ（以上はアジア産のカブトガニ）のいずれのアメボサイト・ライセートをも用いることができる。アメボサイト・ライセートは、公知の方法（例えば、カブトガニ・アメボサイトに蒸留水を加えて４℃にて振とうデーブル上で一晩ゆっくりと旋回させることによってアメボサイトを破裂させ、その上澄液を用いる方法、カブトガニ・アメボサイトに０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えてホモジナイザーにて均一に破砕および抽出してその上澄液を用いる方法等）で製造することができる。また、市販されているリムルス試薬を用いてもよい。このようなリムルス試薬は、ＥｔにもＢＧにも反応するリムルス試薬であっても良いが、ＢＧに反応しないように調製されたリムルス試薬（本出願書類中において、「Ｅｔ特異的リムルス試薬」という。）であることが好ましい。このＥｔ特異的リムルス試薬は公知の方法（例えば、リムルス試薬にアプロチニンを共存させる方法、リムルス試薬にアルキルグルコシドを共存させる方法、（１→３）−β−Ｄ−グルカン類のポリカルボン酸誘導体又はグリセリル誘導体を共存させる方法等）で製造することもでき、市販されているもの（例えば、エンドスペシーES-50M（生化学工業株式会社））を利用することもできる。Ｅｔ特異的リムルス試薬としては、例えば、Ｇ因子活性化阻害剤や抗Ｇ因子抗体といった、Ｇ因子を介したリムルス反応を抑制する物質を含有するアメボサイト・ライセートを主成分又は主な構成成分とするもの等が例示される。

本発明除去方法１は、金属塩を共存させるステップ以外のステップとして、例えばＬＡＭを含有する試料を調製するステップ、ＬＡＭを含有する試料に金属塩以外の成分を共存させるステップ、又はＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性が除去されたか否かを評価するステップ等をさらに含んでいでもよい。上記の金属塩以外の成分としては、例えば界面活性剤、抗結核抗体、抗ＬＡＭ抗体、ＢＧ、カルボキシメチル化されたＢＧ、強アルカリ性物質、ポリミキシンＢ、コリスチン、コンカナバリンＡ、ヒスチジン及びヒスタミンが例示される。これらの成分を共存させるステップを行うことは、さらに優れたＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去する効果が期待されるといった観点から好ましい。また上記の金属塩以外の成分として、例えばリムルス試薬を共存させるステップを行うことにより、本発明除去方法１をＥｔの特異的な測定に応用することも可能である。Ｅｔの特異的な測定については、後述する＜３＞本発明Ｅｔ測定方法を参照されたい。

また、本出願書類において「反応性を除去する」とは、反応性を完全に除き去ることのみならず、部分的に除き去る（反応性を減少もしくは低減させる）ことをも意味する用語として用いる。

以上のような本発明除去方法１は、ＬＡＭの影響を受けることのない状態、又はＬＡＭの影響が低減された状態でＥｔを測定する方法に応用することができる。詳細は後述する本発明Ｅｔ測定方法を参照されたい。

＜２＞ 本発明除去方法２
本発明除去方法２は、ＬＡＭを含有する試料に、緩衝剤を共存させるステップを少なくとも含む、当該試料中のＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去する方法である。

本発明除去方法２において、ＬＡＭを含有する試料に緩衝剤を共存させるステップにおける、緩衝剤の共存後の試料中の緩衝剤の濃度（以下、単に「試料中の緩衝剤の終濃度」と記載する）は、ＬＡＭを含有する試料中のＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去する作用を発揮し得る濃度である限りにおいて特に限定されず、使用する緩衝剤の種類や、本発明除去方法２を実施する者が欲する上記反応性の除去の程度等に応じて、当業者が適宜設定することができるが、１００〜３００ｍＭとなるように共存させることが好ましく、１５０〜２００ｍMとなるように共存させることがより好ましく、約２００ｍMとなるように共存させることが特に好ましい。

「ＬＡＭを含有する試料」や「リムルス試薬」についての説明は、前記＜１＞本発明除去方法１と同様である。

また本発明除去方法２において緩衝剤は、ＬＡＭを含有する試料中のＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去する作用を有し得るものであればよく、使用する緩衝剤の種類、数、組み合わせ等も特に限定されない。緩衝剤は、単一種類のもののみを用いてもよく、複数種の緩衝剤を組み合わせて用いてもよい。例えば、複数種の緩衝剤の混合物を用いてもよい。また緩衝剤は、その存在状態又は存在形態等によって限定されるものではなく、例えば粉末にされる固体状態の緩衝剤そのものであってもよく、精製水に例示される溶液に溶解された状態として存在する緩衝剤であってもよい。また緩衝剤は、例えば界面活性剤、抗結核抗体、抗ＬＡＭ抗体、ＢＧ、カルボキシメチル化されたＢＧ、強アルカリ性物質、ポリミキシンＢ、コリスチン、コンカナバリンＡ、ヒスチジン、ヒスタミン及びリムルス試薬に例示される緩衝剤以外の成分との混合物として存在するものであってもよい。ここで例えば緩衝剤が、界面活性剤、抗結核抗体、抗ＬＡＭ抗体、ＢＧ、カルボキシメチル化されたＢＧ、強アルカリ性物質、ポリミキシンＢ、コリスチン、コンカナバリンＡ、ヒスチジン及びヒスタミン等に例示される物質との混合物として存在するものである場合、当該混合物を用いることにより、さらに好ましいＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去する効果が期待される。また例えば緩衝剤が、リムルス試薬との混合物として存在するものである場合であって、且つＬＡＭを含有する試料が、Ｅｔを含有するか、含有する可能性がある試料である場合、リムルス試薬と緩衝剤との混合物をＬＡＭを含有する試料に共存させた後に、当該共存後の試料中のＥｔによって惹起されるリムルス反応を検知又は測定することにより、上記試料中のＥｔを特異的に測定することができる。当該測定方法に関するより具体的な説明については、後述する＜３＞本発明Ｅｔ測定方法を参照されたい。

具体的な緩衝剤としては、好ましくは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下、「トリス」又は「Ｔｒｉｓ」ともいう）、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸（以下、「ヘペス」又は「ＨＥＰＥＳ」ともいう）、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸（以下、「テス」又は「ＴＥＳ」ともいう）、2-ヒドロキシ-3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸,一水和物(以下、「ＨＥＰＰＳＯ」ともいう)、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]グリシン（以下、「トリシン」又は「Ｔｒｉｃｉｎｅ」ともいう）、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン（以下、「ビシン」又は「Ｂｉｃｉｎｅ」ともいう）、イミダゾール（以下、「Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ」ともいう）等が例示される。

本発明除去方法２は、緩衝剤を共存させるステップ以外のステップとして、例えばＬＡＭを含有する試料を調製するステップ、ＬＡＭを含有する試料に緩衝剤以外の成分を共存させるステップ、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性が除去されたか否かを評価するステップ等をさらに含んでいでもよい。上記の緩衝剤以外の成分としては、例えば界面活性剤、抗結核抗体、抗ＬＡＭ抗体、ＢＧ、カルボキシメチル化されたＢＧ、強アルカリ性物質、ポリミキシンＢ、コリスチン、コンカナバリンＡ、ヒスチジン及びヒスタミンが例示される。これらの成分を共存させるステップを行うことは、さらに優れたＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去する効果が期待されるといった観点から好ましい。また上記の緩衝剤以外の成分として、例えばリムルス試薬を共存させるステップを行うことにより、本発明除去方法２をＥｔの特異的な測定に応用することも可能である。Ｅｔの特異的な測定については、後述する＜３＞本発明Ｅｔ測定方法を参照されたい。

さらに、緩衝剤以外の物質として、前記＜１＞本発明除去方法１で述べたような、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム及び硫酸カリウム等の硫酸塩、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム及び塩化カルシウム等の金属塩化物、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩等に例示される金属塩を、ＬＡＭを含有する試料に共存させ、緩衝剤と併せて使用することによっても、優れた効果を期待できる。すなわちこれは、本発明除去方法１及び２を組み合わせることによっても、優れた効果を期待できることを意味する。

以上のような本発明除去方法２は、ＬＡＭの影響を受けることのない状態、又はＬＡＭの影響が低減された状態でＥｔを測定する方法に応用することができる。詳細は後述する本発明Ｅｔ測定方法を参照されたい。

＜３＞ 本発明Ｅｔ測定方法
本発明Ｅｔ測定方法は、ＬＡＭ及びＥｔを含有する試料中のＥｔをリムルス試薬を用いて測定する方法であって、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を本発明除去方法１又は２で除去するステップを少なくとも含む方法である。

本発明Ｅｔ測定方法は、前記の本発明除去方法１又は２を、Ｅｔの測定方法に応用したものである。したがって、「ＬＡＭを含有する試料」や「リムルス試薬」についての説明は、前記＜１＞本発明除去方法１及び前記＜２＞本発明除去方法２と同様である。すなわち、このリムルス試薬も、Ｅｔ特異的リムルス試薬であることが好ましい。ただし、試料としては、ＬＡＭのほか、Ｅｔを含有するか又は含有する可能性のある試料を用いることになる。なお本明細書において、「Ｅｔを含有する試料」とは、Ｅｔを含有するか、又はＥｔを含有する可能性のある試料を意味する。

なお、本発明Ｅｔ測定方法において、「ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を本発明除去方法１又は２で除去する」とは、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を本発明除去方法１又は２のどちらか一方の方法で除去してもよく、両者の方法を併せて用いることで除去してもよいことを意味する。

ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を本発明除去方法１で除去する場合、金属塩及び試料中の金属塩の終濃度についての説明は、前記＜１＞本発明除去方法１と同様であり、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を本発明除去方法２で除去する場合、緩衝剤及び試料中の緩衝剤の終濃度についての説明は、前記＜２＞本発明除去方法２と同様である。

さらに本発明Ｅｔ測定方法において、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を本発明除去方法１で除去する場合、前記＜１＞本発明除去方法１で述べた「ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性の除去」と「リムルス試薬のＥｔに対する反応性の維持」とのバランスの観点から、試料中の金属塩の終濃度は、本発明Ｅｔ測定方法を実施する者が欲するリムルス試薬のＥｔに対する反応性の維持の程度によっても当業者が適宜決定することができる。具体的には、例えば、Ｅｔの相対活性が５０％以上となるように試料中の金属塩の終濃度を選択することが好ましく、６５％以上となるように試料中の金属塩の終濃度を選択することがより好ましく、８０％以上となるように試料中の金属塩の終濃度を選択することが特に好ましい。なお、Ｅｔの相対活性については、前述したＬＡＭの相対活性におけるＬＡＭをＥｔに置き換えたものである。具体的には実施例を参照されたい。

本発明Ｅｔ測定方法によるＥｔの測定は、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を本発明除去方法１又は２で除去した後、又は除去すると同時に、Ｅｔによって引き起こされるリムルス反応の検知又は測定を行うことにより達成することができる。さらに、本発明Ｅｔ測定方法は、上記以外のその他のステップを含んでいても良い。

ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を本発明除去方法１又は２で除去するタイミングも特に限定されない。例えば、試料に予め金属塩又は緩衝剤を共存させてＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去した後、この試料をリムルス試薬と接触させてもよく、リムルス試薬に予め金属塩又は緩衝剤を混合しておき、これを試料に接触させることによりＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性の除去とリムルス反応とを同時に行うこともできる。

すなわち本発明Ｅｔ測定方法は、下記に示されるＥｔの測定方法をも提供する。
下記ステップ（ａ）及び（ｂ）を少なくとも含むＥｔの測定方法；
（ａ）Ｅｔ及びＬＡＭを含有する試料に、金属塩又は緩衝剤を共存させるステップ；
（ｂ）前記共存後の試料にリムルス試薬を接触させ、Ｅｔによって惹起されるリムルス反応を検知するステップ。
上記（ａ）においては、Ｅｔ及びＬＡＭを含有する試料に、金属塩又は緩衝剤のどちらか一方を共存させてもよく、金属塩及び緩衝剤の両方を共存させてもよい。

また本発明Ｅｔ測定方法は、下記に示されるＥｔの測定方法をも提供する。
下記ステップ（ａ）及び（ｂ）を少なくとも含むＥｔの測定方法；
（ａ）リムルス試薬に金属塩又は緩衝剤を共存させるステップ；
（ｂ）Ｅｔ及びＬＡＭを含有する試料に、前記共存後のリムルス試薬を接触させ、Ｅｔによって惹起されるリムルス反応を検知するステップ。
上記（ａ）においては、リムルス試薬に、金属塩又は緩衝剤のどちらか一方を共存させてもよく、金属塩及び緩衝剤の両方を共存させてもよい。

Ｅｔによって引き起こされるリムルス反応の検知は、公知の方法で行うことができる。例えば、日本薬局方等に記載の比色法（エンドポイントアッセイやカイネティックアッセイ）、ゲル化法、比濁法（エンドポイントアッセイやカイネティックアッセイ）等の公知の方法で、それぞれの方法に応じた検知方法を採用することができる。

本出願書類において「測定」とは、定量的な測定のみならず、定性的な測定（Ｅｔの存否の検知等）をも含む概念である。

Ｅｔの定量的な測定は、目的に応じて種々の方法を採用することができる。例えば、Ｅｔ濃度が既知の試料を用いてＥｔ濃度とリムルス反応の強度との関係について検量線や関係式を作成しておき、これを用いることによって厳密な定量を行うことができる。また、厳密な定量が必要ない場合には、２つ以上の試料についてその試料間のＥｔ量の多少を比較してもよい。Ｅｔはリムルス反応を惹起させることから、リムルス反応の強度が高ければ、試料中のＥｔ量も多いこととなる。

Ｅｔの定性的な測定は、リムルス反応の有無を検知することによって行うことができる。Ｅｔはリムルス反応を惹起させることから、リムルス反応が検知されれば、試料中にＥｔが存在することとなる。

本発明Ｅｔ測定方法によれば、ＬＡＭを含有する試料中のＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性が除去されることから、当該試料中のＥｔを、ＬＡＭの影響を受けることなく又はＬＡＭの影響を低減させて測定することができる。

＜４＞ 本発明疾患検知方法
本発明疾患検知方法は、本発明Ｅｔ測定方法を用いることを特徴とする、Ｅｔ関連疾患の検知方法である。
本発明疾患検知方法は、本発明Ｅｔ測定方法を、Ｅｔ関連疾患の検知に応用したものである。本発明疾患検知方法では、本発明Ｅｔ測定方法における「ＬＡＭを含有する試料」として、Ｅｔを含有するか又はＥｔを含有する可能性がある生体由来の試料を用いることとなる。「生体由来の試料」についての説明は、前記＜１＞本発明除去方法１と同様である。

なお、「生体由来の試料」として血液を用いる場合は、血液中のリムルス反応妨害因子（セリンプロテアーゼ、セリンプロテアーゼインヒビター等）を公知の方法（例えば、特開昭５８−８５１６２号公報等に記載の方法）で予め除去又は不活化しておくことが好ましいことも、前記＜１＞本発明除去方法１と同様である。

検知対象とするＥｔ関連疾患は、Ｅｔに基づいて引き起こされる疾患である限りにおいて特に限定されない。例えば、Ｅｔ血症、敗血症、グラム陰性菌感染症が例示される。

本発明疾患検知方法において、「検知」とは、定性的な検知（Ｅｔ関連疾患の存否の検知）のみならず、定量的な検知（Ｅｔ関連疾患の悪性度の検知等）をも含む概念である。

Ｅｔ関連疾患の定性的な検知は、Ｅｔの定性的な測定を応用することにより行うことができる。Ｅｔの定性的な測定については、前記＜３＞本発明Ｅｔ測定方法を参照されたい。リムルス反応が検知されれば、試料中にＥｔが存在することとなり、Ｅｔ関連疾患であるか又はその疑いがあるということができる。

Ｅｔ関連疾患の定量的な検知は、Ｅｔの定量的な測定を応用することにより行うことができる。Ｅｔの定量的な測定については、前記＜３＞本発明Ｅｔ測定方法を参照されたい。Ｅｔはリムルス反応を惹起させることから、リムルス反応の強度が高ければ試料中のＥｔ量も多いこととなり、これに対応してＥｔ関連疾患の悪性度が高い又はその疑いがあると関連づけることができる。

＜５＞ 本発明Ｅｔ測定キット
本発明Ｅｔ測定キットは、リムルス試薬と、金属塩又は緩衝剤とを構成成分として含む、ＬＡＭの影響を低減させたＥｔの測定のために用いられるＥｔの測定キットである。

本発明Ｅｔ測定キットを用いることにより、本発明Ｅｔ測定方法を簡便に行うことができる。
本発明Ｅｔ測定キットにおいて、「ＬＡＭの影響を低減させたＥｔの測定」とは、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去することにより、ＬＡＭの影響を受けることのない状態、又はＬＡＭの影響が低減された状態で行われるＥｔの測定を意味する。ここで、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去する程度については特に限定されないが、例えば、ＬＡＭの相対活性が５０％以下となるように反応性を除去することが好ましく、ＬＡＭの相対活性が２０％以下となるように反応性を除去することが好ましく、ＬＡＭの相対活性が１０％以下となるように反応性を除去することが好ましく、ＬＡＭの相対活性が５％以下となるように反応性を除去することが好ましい。

「リムルス試薬」についての説明は、＜１＞本発明除去方法１と同様である。したがって、リムルス試薬は、Ｅｔ特異的リムルス試薬であることが好ましい。

また、「金属塩」についての説明は、＜３＞本発明Ｅｔ測定方法と同様である。したがって、好ましい金属塩として、具体的には、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム及び硫酸カリウム等の硫酸塩、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム及び塩化カルシウム等の金属塩化物、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩等が例示される。

また、「緩衝剤」についての説明も、＜３＞本発明Ｅｔ測定方法と同様である。したがって、好ましい緩衝剤として、具体的には、トリス、ヘペス、テス、ＨＥＰＰＳＯ、トリシン、ビシン、イミダゾール等が例示される。

本発明Ｅｔ測定キットは、少なくともリムルス試薬と、金属塩又は緩衝剤とを構成成分として含む限りにおいて特に限定されない。ここで、「リムルス試薬と金属塩又は緩衝剤とを構成成分として含む」とは、構成成分として、リムルス試薬に加えて、金属塩又は緩衝剤のどちらか一方を含んでいてもよく、両方を含んでいてもよいことを意味する。また本発明Ｅｔ測定キットは、上記の構成成分に加え、他の構成成分をさらに含んでいてもよい。このような構成成分としては、例えばブランクテスト用蒸留水，反応試薬溶解液、反応用緩衝液、Ｅｔ標準物質、反応基質等を挙げることができる。さらに本発明Ｅｔ測定キットには、測定バッチ同士の実施レベルを一定水準に保つための陽性コントロール（ＱＣコントロール）等を含有させることもできる。

これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容し保存しておくことができる。本発明のキットは、使用方法や、キットに含まれる金属塩又は緩衝剤が試料中のＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去するために使用されるものであることを記載した使用説明書を含むことが好ましい。

本発明Ｅｔ測定キットを用いたＥｔの測定は、前記＜３＞の本発明Ｅｔ測定方法に従って行うことができる。

＜６＞ 本発明疾患診断キット
本発明疾患診断キットは、本発明Ｅｔ測定キットからなる、Ｅｔ関連疾患の診断キットである。
本発明疾患診断キットを用いることにより、Ｅｔ関連疾患の診断を簡便に行うことができる。

診断対象とするＥｔ関連疾患は、Ｅｔに基づいて引き起こされる疾患である限りにおいて特に限定されない。例えば、Ｅｔ血症、敗血症、グラム陰性菌感染症が例示される。また、用いる「生体由来の試料」等の説明については、＜４＞本発明疾患検知方法と同様である。すなわち、用いる「生体由来の試料」は血液であることが好ましい。また、「生体由来の試料」として血液を用いる場合に、血液中のリムルス反応妨害因子（セリンプロテアーゼ、セリンプロテアーゼインヒビター等）を予め除去又は不活化しておくことが好ましい点についても、前記＜４＞と同様である。

本発明疾患診断キットを用いたＥｔ関連疾患の診断は、前記の＜４＞本発明疾患検知方法を応用することにより行うことができる。

＜７＞本発明反応性除去剤１
本発明反応性除去剤１は、金属塩を有効成分として含有する、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去するために用いられる反応性除去剤である。
上記の「金属塩」、「リムルス試薬」、「反応性を除去する」に関する説明については、上記＜１＞本発明除去方法１における説明を参照されたい。

＜８＞本発明反応性除去剤２
本発明反応性除去剤２は、緩衝剤を有効成分として含有する、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を除去するために用いられる反応性除去剤である。
上記の「緩衝剤」、「リムルス試薬」及び「反応性を除去する」に関する説明については、上記＜２＞本発明除去方法２における説明を参照されたい。

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は以下に示す実施例に限定されるものではない。

１．硫酸ナトリウム存在下における、ＬＡＭとＥｔのリムルス試薬に対する反応性の比較−その１
金属塩として硫酸ナトリウムを含むリムルス試薬に対する反応性を、ＬＡＭとＥｔとで比較した。なお、アメボサイト・ライセート（カブトガニ血球抽出成分）を以後「ライセート」という。また、本実施例で使用したＬＡＭは、ヒト型結核菌（青山Ｂ株；Mycobacterium tuberculosis Aoyama-B）株の死菌体から有機溶媒抽出とカラムクロマトグラフィーで高純度に単離精製したＬＡＭ（ナカライテスク株式会社販売）である。

１−１ タキプレウス・トリデンタツス由来ライセートを用いた場合
硫酸ナトリウム、トリス塩酸緩衝液(pH8.0)、硫酸マグネシウム、発色合成基質（Boc-Leu-Gly-Arg-pNA（パラニトロアニリン）塩酸塩）（株式会社ペプチド研究所製）及びタキプレウス・トリデンタツス由来ライセートを、反応液量200 μLにおけるそれぞれの濃度(mM)又は使用量が、硫酸ナトリウム 0, 10, 20, 30, 40, 50mM、トリス塩酸緩衝液(pH8.0) 50mM、硫酸マグネシウム 20mM、発色合成基質（Boc-Leu-Gly-Arg-pNA塩酸塩）0.167mM、タキプレウス・トリデンタツス由来ライセート 20μLとなるように、Ｅｔ及びＢＧフリーのマイクロタイタープレート（トキシペットプレート LP、生化学工業株式会社）に加えた。このプレートに、100ng/mLのＬＡＭ 25μL 又は 1ng/mLのＥｔ（Ｄｉｆｃｏ社製、E.coli 0111:B4株由来） 25μLを加え、マイクロプレートリーダー（ウエルリーダー SK603、生化学工業株式会社）内で30分間反応させた。１分間当たりの吸光度[A405nm-492nm(対照波長)] 変化率(mAbs/min)を自動測定し、それぞれの測定により得られた値を硫酸ナトリウム濃度が０mMである場合の値（コントロール値；これを１００％とする）と比較し、ＬＡＭの相対活性(%)及びＥｔの相対活性(%)を求めた。結果を図１及び図２に示す。

硫酸ナトリウム濃度50mMにおいて、ＬＡＭの相対活性は0.3%を示し（すなわちＬＡＭの反応性の９９．７％が除去された）、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性はほぼ完全に抑制された（図１）。一方、この濃度において、Ｅｔの相対活性は86.6%を示し、Ｅｔのリムルス試薬に対する反応性は、ＬＡＭのそれと比較して、極めて優位に維持されていることが明らかになった（図２）。

１−２ リムルス・ポリフェムス由来ライセートを用いた場合
上記１−１におけるタキプレウス・トリデンタツス由来ライセートの代わりにリムルス・ポリフェムス由来ライセートを用い、また、使用するＬＡＭの濃度を1000ng/mLに、Ｅｔの濃度を2ng/mLに変え、上記１−１と同様の試験を行った。結果を図３及び図４に示す。

硫酸ナトリウム濃度50mMにおいて、ＬＡＭの相対活性は0.9%を示し、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性はほぼ完全に抑制された（図３）。一方、この濃度において、Ｅｔの相対活性は67.3%を示し、Ｅｔのリムルス試薬に対する反応性は、ＬＡＭのそれと比較して、優位に維持されていることが明らかになった（図４）。

２．硫酸ナトリウム存在下における、ＬＡＭとＥｔのＥｔ特異的リムルス試薬に対する反応性の比較−その２
金属塩として硫酸ナトリウムを含むＥｔ特異的リムルス試薬に対する反応性を、ＬＡＭとＥｔとで比較した。なお、Ｅｔ特異的リムルス試薬としては、エンドスペシー ES-50M（生化学工業株式会社）を使用した。また、ＬＡＭ及びＥｔについては、前記実施例１と同様のものを使用した。

硫酸ナトリウムを、反応液量100 μLにおける濃度が、0, 15, 30, 60, 90, 120mM となるようにマイクロタイタープレート（トキシペットプレート LP、生化学工業株式会社）に加えた。このプレートに、20μg/mLのＬＡＭ 25μL 又は 0.4ng/mLのＥｔ 25μLを加え、エンドスペシー ES-50Mに付属の緩衝液で溶解した主剤溶液 50μLを加えた。このプレートをマイクロプレートリーダー（ウエルリーダー SK603、生化学工業株式会社）内で30分間反応させた。１分間当たりの吸光度[A405nm-492nm(対照波長)] 変化率(mAbs/min)を自動測定し、前記実施例１と同様の方法により、ＬＡＭの相対活性(%)及びＥｔの相対活性(%)を求めた。結果を図５及び図６に示す。

硫酸ナトリウム濃度120mMにおいて、ＬＡＭの相対活性は5.2%を示し、ＬＡＭのＥｔ特異的リムルス試薬に対する反応性は著しく抑制された（図５）。一方、この濃度において、Ｅｔの相対活性は79.8%を示し、ＥｔのＥｔ特異的リムルス試薬に対する反応性は、ＬＡＭのそれと比較して、極めて優位に維持されていることが明らかになった（図６）。

３．塩化ナトリウム存在下における、ＬＡＭとＥｔのＥｔ特異的リムルス試薬に対する反応性の比較
前記実施例２における硫酸ナトリウムを塩化ナトリウムに代え、同様の試験を行った。ただしここでは、塩化ナトリウムを、反応液量100 μLにおける濃度が、0, 50, 100, 150, 200, 250mM となるようにマイクロタイタープレート（トキシペットプレート LP、生化学工業株式会社）に加えた。結果を図７及び図８に示す。

塩化ナトリウム濃度250mMにおいて、ＬＡＭの相対活性は7.2%を示し、ＬＡＭのＥｔ特異的リムルス試薬に対する反応性は著しく抑制された（図７）。一方、この濃度において、Ｅｔの相対活性は88.3%を示し、ＥｔのＥｔ特異的リムルス試薬に対する反応性は、ＬＡＭのそれと比較して、極めて優位に維持されていることが明らかになった（図８）。

４．各種金属塩のＬＡＭ完全阻害濃度及び前記濃度におけるＥｔの相対活性
表１に示す各種金属塩を使用し、前記の実施例１−１及び１−２と同様の操作を行うことによって、反応時の金属塩の濃度の変化に伴うＬＡＭの相対活性（％）の変化を調べることにより、ＬＡＭの相対活性（％）がほぼ完全に消失するときの金属塩濃度（以後、「ＬＡＭ完全阻害濃度」という）を求めた。また、ＬＡＭ完全阻害濃度の金属塩存在下におけるＥｔの相対活性（％）を、実施例１−１及び１−２と同様の操作を行うことによって求めた。結果を表１に示す。

それぞれの金属塩について、表中の括弧内に示したロット数の回数の測定を行い、それぞれＬＡＭ完全阻害濃度及びＥｔの相対活性を求めた。

なお、上記表中でＬＡＬ−ライセートはリムルス・ポリフェムス由来ライセートを、ＴＡＬ−ライセートはタキプレウス・トリデンタツス由来ライセートを意味する。

５．トリス緩衝液存在下における、ＬＡＭとＥｔのリムルス試薬に対する反応性の比較 緩衝液としてトリス緩衝液を用い、リムルス試薬に対する反応性をＬＡＭとＥｔとで比較した。

５−１ タキプレウス・トリデンタツス由来ライセートを用いた場合
トリス塩酸緩衝液(pH8.0)、硫酸マグネシウム、発色合成基質 及びタキプレウス・トリデンタツス由来ライセートを、反応液量200 μLにおけるそれぞれの濃度(mM)又は使用量が、トリス塩酸緩衝液(pH8.0) 25,50,100,150,200mM、硫酸マグネシウム 20mM、発色合成基質 0.167mM、タキプレウス・トリデンタツス由来ライセート 20μLとなるように、トキシペットプレート LP に加えた。このプレートに、100ng/mLのＬＡＭ 25μL 又は 1ng/mLのＥｔ（E.coli 0111:B4株由来） 25μLを加え、ウエルリーダー SK603内で30分間反応させた。１分間当たりの吸光度[A405nm-492nm(対照波長)] 変化率(mAbs/min)を自動測定し、それぞれの測定により得られた値をトリス塩酸緩衝液濃度が50mMである場合の値（コントロール値；これを１００％とする）と比較し、ＬＡＭの相対活性(%)及びＥｔの相対活性(%)を求めた。結果を図９及び図１０に示す。

トリス塩酸緩衝液濃度200mMにおいて、ＬＡＭの相対活性は5.4%を示し（すなわちＬＡＭの反応性の９４．６％が除去された）、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性は著しく抑制された（図９）。一方、この濃度において、Ｅｔの相対活性は102.5%を示し、Ｅｔのリムルス試薬に対する反応性は、ＬＡＭのそれと比較して、極めて優位に維持されていることが明らかになった（図１０）。

５−２ リムルス・ポリフェムス由来ライセートを用いた場合
上記５−１におけるタキプレウス・トリデンタツス由来ライセートの代わりにリムルス・ポリフェムス由来ライセートを用い、上記５−１と同様の試験を行った。結果を図１１及び図１２に示す。

トリス塩酸緩衝液濃度200mMにおいて、ＬＡＭの相対活性は29.8%を示し、ＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性は大幅に抑制された（図１１）。一方、この濃度において、Ｅｔの相対活性は85.0%を示し、Ｅｔのリムルス試薬に対する反応性は、ＬＡＭのそれと比較して、優位に維持されていることが明らかになった（図１２）。

６．各種緩衝剤存在下における、ＬＡＭとＥｔのリムルス試薬に対する反応性の比較
表２に示す各種緩衝剤を用い、上記５−１及び５−２と同様の試験を行い、各種緩衝液濃度 200mMにおけるＬＡＭの相対活性及びＥｔの相対活性を求めた。結果を表２に示す。

以上述べたように、金属塩または緩衝液の存在下ではＬＡＭのリムルス試薬への反応性が低下することが明らかとなった。したがって、本発明においては、金属塩または緩衝液を共存させた状態でリムルス試薬を用いてＥｔの測定を行うことでＬＡＭの反応性を除去してＥｔを正確に定量できる。

本発明除去方法１及び２は、リムルス反応におけるＬＡＭの影響の除去に利用することができる。

また、本発明Ｅｔ測定方法、本発明疾患検知方法、本発明Ｅｔ測定キット及び本発明疾患診断キットは、ＥｔやＥｔ関連疾患の測定・検知に利用することができる。

本発明除去方法１又は２により、ＬＡＭを含有する試料中のＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を、簡便、迅速かつ安価に、効率良く除去することができる。また、本発明Ｅｔ測定方法により、上記試料中のＥｔを、ＬＡＭの影響を受けることなく又はＬＡＭの影響を低減させて測定することができる。また、本発明疾患検知方法により、Ｅｔ関連疾患の検知を、より高い精度で行うことができる。さらに本発明Ｅｔ測定キット及び本発明疾患診断キットにより、上記の本発明Ｅｔ測定方法及び本発明疾患検知方法を、簡便かつ迅速に行うことができる。

Claims (20)

1. リポアラビノマンナンを含有する試料に、金属塩を共存させるステップを少なくとも含む、当該試料中のリポアラビノマンナンのリムルス試薬に対する反応性を除去する方法。
2. 金属塩が、硫酸塩、金属塩化物及び硝酸塩から選択される１又は２以上の金属塩である、請求項１に記載の方法。
3. 金属塩が、下記の群から選択される１又は２以上の金属塩である、請求項２に記載の方法；
   硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硝酸ナトリウム及び硝酸カリウム。
4. 金属塩を、試料中の終濃度が３０〜５００ｍＭとなるように共存させることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. リポアラビノマンナンを含有する試料に、緩衝剤を共存させるステップを少なくとも含む、当該試料中のリポアラビノマンナンのリムルス試薬に対する反応性を除去する方法。
6. 緩衝剤が、下記の群から選択される１又は２以上の緩衝剤である、請求項５に記載の方法；
   トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸、2-ヒドロキシ-3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸,一水和物、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]グリシン、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン、イミダゾール。
7. 緩衝剤を、試料中の終濃度が１００〜３００ｍＭとなるように共存させることを特徴とする、請求項５又は６に記載の方法。
8. リポアラビノマンナンおよびエンドトキシンを含有する試料中のエンドトキシンをリムルス試薬を用いて測定する方法であって、リポアラビノマンナンのリムルス試薬に対する反応性を請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法で除去するステップを少なくとも含む方法。
9. 下記ステップ（ａ）及び（ｂ）を少なくとも含むエンドトキシンの測定方法；
   （ａ）エンドトキシン及びリポアラビノマンナンを含有する試料に、金属塩又は緩衝剤を共存させるステップ；
   （ｂ）前記共存後の試料にリムルス試薬を接触させ、エンドトキシンによって惹起されるリムルス反応を検知するステップ。
10. 下記ステップ（ａ）及び（ｂ）を少なくとも含むエンドトキシンの測定方法；
    （ａ）リムルス試薬に金属塩又は緩衝剤を共存させるステップ；
    （ｂ）エンドトキシン及びリポアラビノマンナンを含有する試料に、前記共存後のリムルス試薬を接触させ、エンドトキシンによって惹起されるリムルス反応を検知するステップ。
11. リムルス試薬が、エンドトキシン特異的リムルス試薬である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、エンドトキシン関連疾患の検知方法。
13. リムルス試薬と、金属塩又は緩衝剤とを構成成分として含む、ＬＡＭの影響を低減させたエンドトキシンの測定のために用いられるエンドトキシンの測定キット。
14. 金属塩が、硫酸塩、金属塩化物及び硝酸塩から選択される１又は２以上の金属塩である、請求項１３に記載のキット。
15. 金属塩が、下記の群から選択される１又は２以上の金属塩である、請求項１４に記載のキット；
    硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硝酸ナトリウム及び硝酸カリウム。
16. 緩衝剤が、下記の群から選択される１又は２以上の緩衝剤である、請求項１３に記載のキット；
    トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸、2-ヒドロキシ-3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸,一水和物、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]グリシン、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン、イミダゾール。
17. リムルス試薬が、エンドトキシン特異的リムルス試薬である、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載のキット。
18. 請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のキットからなる、エンドトキシン関連疾患の診断キット。
19. 金属塩を有効成分として含有する、リポアラビノマンナンのリムルス試薬に対する反応性を除去するために用いられる反応性除去剤。
20. 緩衝剤を有効成分として含有する、リポアラビノマンナンのリムルス試薬に対する反応性を除去するために用いられる反応性除去剤。

Images