TWI733071B - 治療或診斷ｔｎｆ相關發炎疾病的ｔｎｆ靶向適配體及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明涉及與腫瘤壞死因子α(TNF)結合的核酸適配體。本發明進一步提供包含此等抗TNF適配體的醫藥組成物，以及將其用於治療和診斷應用的方法，例如，減輕肝損傷和於體內或體外監測TNF的存在。

Description

治療或診斷TNF相關發炎疾病的TNF靶向適配體及其用途 相關申請案的交叉引用

本案主張於2018年4月20日提交的美國臨時申請案第62/660,324號的權益，其整體內容藉由引用的方式併入本文中。

本發明係關於用於治療腫瘤壞死因子α(TNF)相關發炎疾病的核酸適配體，以及將其用於診斷應用的方法。

腫瘤壞死因子α(TNF α或TNF)是參與發炎的細胞激素。它主要由活化的巨噬細胞和其他如淋巴細胞、嗜中性球和NK細胞之免疫細胞分泌。TNF在生理條件下形成同源三聚體，並與其受體TNFR1或TNFR2結合以觸發下游NF-κ B、MAPK或死亡信號傳導途徑，其調節細胞增殖、分化或凋亡。TNF在幾乎所有類型的發炎相關疾病中起作用，並且失調的TNF分泌引起包括類風濕性關節炎、牛皮癬、強直性脊柱炎、發炎性腸道疾病、神經變性疾病、肝損傷和癌症之疾病。

然而，直接對抗TNF的抗體可誘導對抗例如庫普弗細胞(Kupffer cell)和多形核白血球等表現膜結合性TNF的細胞的抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)和補體依賴性細胞毒性(CDC)，亦未有用於TNF濃度的常規預測標記或用於在體內檢測TNF的診斷工具。此外，如抗體之蛋白質類藥物需要基於細胞的生產系統，其通常昂貴且具有批次間的變化。

因此，開發用於靶向和檢測TNF的非蛋白質類試劑是非常有意義的。

本揭露係基於抗TNF α(即抗TNF)核酸適配體的開發，其在體外抑制TNF信號傳導並減弱體內TNF介導的急性肝損傷。

因此，本揭露的一態樣的特徵在於結合TNF且中和TNF活性的核酸適配體(抗TNF適配體)。本揭露的任何核酸適配體的長度可以長達200個核苷酸(nts)。例如，抗TNF核酸適配體可以由40至100個核苷酸組成。

於一些具體實施例中，核酸適配體包含具有5’-GCGCCACTACAGGGGAGCTGCCATTCGAATAGGTGGGCCGC-3’(SEQ ID NO：1)核苷酸序列的核酸基序(motif)。此抗TNF適配體可以包含與SEQ ID NO：1至少85%相同(例如，至少90%、至少95%或更高)的核酸序列。於一實施例中，核酸適配體包含SEQ ID NO： 1的核酸序列。於另一實施例中，核酸適配體由SEQ ID NO：1的核酸序列所組成。

於一些具體實施例中，核酸適配體與聚乙二醇(PEG)部分(moiety)共軛(例如，分子量為約15至40kDa的PEG部分)。

於一些具體實施例中，核酸適配體係呈現含有兩個核酸適配體複製物(copies)之二聚體形式。於一些具體實施例中，PEG部分鍵合該兩個核酸適配體複製物。

於一些具體實施例中，核酸適配體係與可檢測標記共軛。

本揭露另一態樣的特徵在於醫藥組成物，其包含本文所述的任何抗TNF適配體和藥學上可接受的載體。

在另一態樣中，本揭露提供用於抑制個體中TNF活性的方法，其包括向有此需要的個體施用有效量的本文所述的任何核酸適配體。於一些具體實施例中，該個體係患有由TNF α介導的疾病、疑似患有由TNF α介導的疾病、或有由TNF α介導的疾病風險的人類患者(例如，類風濕性關節炎、牛皮癬、克羅恩病、急性肝損傷、急性肺損傷(ALI)、急性肺衰竭、全身發炎反應綜合症候群(SIRS)相關性腦病、急性呼吸窘迫症候群、乾眼症、眼色素層炎、急性胰炎、急性腎小球損傷、急性腎功能衰竭、ANCA相關性血管炎或急性腦病)。於一些具體實施例中，個體已接受或正在進行涉及TNF拮抗劑的治療。在一些具體實施例中，個體處於疾病的急性期。

於另一態樣中，本揭露提供一種減輕肝損傷或促進肝再生的方法，包括將有效量的本文所述的任何核酸適配體施用至有需要的個體。於一些具體實施例中，該個體具有與肝臟疾病相關的肝損傷(例如，肝炎、肝硬化、肝纖維化、脂肪肝病、肝癌或急性肝損傷)。於一些具體實施例中，所施用的核酸適配體的量足以降低個體中血清天冬胺酸轉胺酶(AST)的水平(level)、血清丙胺酸轉胺酶(ALT)的水平或兩者皆有。於一些具體實施例中，所施用的核酸適配體的量足以減少嗜中性球浸潤至個體的肝臟中。

在本文公開的任何方法中，核酸適配體可以氣管內的方式施用於需要治療的個體。於一些具體實施例中，適配體可以藉由吸入或皮下注射施用。

此外，本揭露提供用於檢測樣品中TNF存在的方法，該方法包括將本文所述與可檢測標記共軛的抗TNF核酸適配體與疑似含有TNF的生物樣品接觸，以及檢查核酸適配體與樣品中TNF的結合。

於另一態樣中，本揭露提供一種體內監測腫瘤壞死因子α(TNF)的方法，該方法包括向有此需要的個體施用有效量的與可檢測標記共軛的抗TNF核酸適配體，以及基於可檢測標記所釋放的信號檢測核酸適配體的位置。在一些具體實施例中，個體是患有或疑似患有肝臟疾病的人類患者。於一些具體實施例中，檢測步驟係藉由測量位於人類患者肝臟處之可檢測標記所釋放的信號水平來進行。

在下面的描述中闡述了本發明的一個或多個具體實施例的細節。從以下附圖和若干實施例的詳細描述以及所附申請專利範圍，本發明的其他特徵或優點將顯而易見。

第1圖是顯示aptTNF-α和/或aptTNF-α-PEG可用於在急性損傷階段抑制TNF-α介導的細胞凋亡而不影響組織修復階段的增殖信號傳導的示意圖。

第2A至2G圖包括顯示aptTNF-α以高親和力結合人類TNF-α，並且可以用作體內監測TNF-α的分子成像探針的數據。第2A圖：示例性aptTNF-α的結構。該aptTNF-α包含SEQ ID NO：1。第2B圖：aptTNF-α和人類TNF-α的解離常數的圖表(左圖)和顯示aptTNF-α與人和小鼠TNF-α結合的圖表(n=3，右圖)。第2C圖：顯示在有ALI和沒有ALI的小鼠體內檢測aptTNF-α信號的照片(n=3)。第2D圖：量化第2C圖中的aptTNF-α信號的圖表。第2E圖：顯示在適配體施用後4小時(n=3)，IRDye®800 CW-標記的aptTNF-α的生物分佈的一系列照片。第2F圖：量化第2E圖中所示的IRDye®800 CW-標記的aptTNF-α的生物分佈圖表。第2G圖：顯示適配體施用後4小時，血清中LDH、AST和ALT水平的一系列圖表(n=5)。

第3A至3C圖包括顯示aptTNF-α-PEG對TNF-α途徑的抑制持續時間較抗TNF-α抗體短的數據。第3A圖：示例性二聚體aptTNF-α-PEG的示意圖，該aptTNF-α適配體含有兩個SEQ ID NO：1 複製物。第3B圖：顯示aptTNF-α-PEG與小鼠TNF-α(n=3)結合的圖表。第3C圖：顯示在經TNF-α處理之後4小時後(上圖)和24小時後(下圖)，藉由TNF-α/NF-kB報導基因測定確認aptTNF-α、aptTNF-α-PEG和抗TNF-α抗體的抑制作用的圖(n=3)。

第4A至4J圖包括顯示藉由氣管內(i.t.)或靜脈內(i.v.)遞送aptTNF-α和aptTNF-α-PEG以抑制LPS誘導的ALI的數據。第4A圖：顯示氣管內或靜脈內施用aptTNF-α-PEG對血氧飽和度水平影響的圖表。第4B圖：顯示氣管內或靜脈內施用aptTNF-α-PEG對經體重標準化的濕肺重量影響的圖表。第4C圖：顯示肺組織的蘇木精(haematoxylin)及曙紅(H & E)和嗜中性球染色的一系列照片。第4D圖：顯示氣管內或靜脈內施用aptTNF-α-PEG對肺損傷評分影響的圖表。第4E圖：顯示氣管內或靜脈內施用不同濃度的aptTNF-α-PEG對支氣管肺泡灌洗液(BALF)中總蛋白質影響的圖表。第4F圖：顯示氣管內或靜脈內施用不同濃度的aptTNF-α-PEG對BALF中總細胞數影響的圖表。第4G圖：顯示氣管內或靜脈內施用不同濃度的aptTNF-α-PEG對BALF中的骨髓過氧化酶(MPO)活性影響的圖表。第4H至4J圖：顯示肺組織中指定的細胞激素/趨化因子表現水平的一系列圖。第4A至4J圖包括來自不同處理組(n=6)的數據。處理劑量表示為μg/kg。

第5A至5G圖包括顯示AptTNF-α和aptTNF-α-PEG減弱D-GalN/TNF-α誘導的急性肝損傷程度並加強早期肝再生的數據。第5A圖：一系列照片顯示aptTNF-PEG共軛物挽救了由TNF和D-GalN誘導的肝組織中嚴重的肝細胞死亡和出血(H & E染色)，以及經aptTNF-α- PEG處理抑制了嗜中性球浸潤(嗜中性球染色)。第5B圖：顯示與NAC相比，aptTNF-α和aptTNF-α-PEG對降低由D-GalN和TNF誘導的AST血清水平具優異作用的圖表。第5C圖：顯示aptTNF和aptTNF-α-PEG處理顯著抑制急性肝損傷小鼠模型中TNF和D-GalN誘導的ALT血清水平的圖表。第5D至5F圖：一系列圖表顯示促炎細胞激素(IL1 β、IL6)和嗜中性球募集趨化因子(CXCL2)的表現水平經TNF和D-GalN注射而增加，並且經aptTNF-α或aptTNF-α-PEG處理而降低。第5G圖：顯示急性肝損傷小鼠模型中，aptTNF-α或aptTNF-α-PEG處理增加PCNA蛋白表現並促進肝再生的照片。第5A至5G圖包括來自不同處理組(n=6)的肝組織的數據。處理劑量表示為μg/kg。

第6圖是顯示aptTNF-α或aptTNF-α-PEG抑制肝組織中半胱天冬酶-3(caspase-3)活化的照片。

第7圖是一系列圖表，顯示巨噬細胞募集趨化因子(CCL2)及嗜中性球募集趨化因子(IL23和IL17)的表現水平藉由TNF-α和D-GalN注射而增加並藉由aptTNF-α-PEG處理而降低。

第8圖是一系列圖表，顯示急性肝損傷小鼠模型中，aptTNF-α和aptTNF-α-PEG處理增加細胞週期蛋白d1(CCND1)和PCNA mRNA表現並促進肝再生。

第9A至9C圖包括顯示aptTNF-α可用作體內監測肝臟TNF-α的診斷劑的數據。第9A圖：一系列照片顯示IRDye®800CW標記的aptTNF-α特異性地定位於具有經LPS和D-GalN誘導的內源性TNF-α分泌和急性肝損傷的小鼠肝臟，而未定位於沒有LPS和D-GalN注射的 小鼠肝臟，儘管兩組中的aptTNF-α皆排出到膀胱。第9B圖：顯示來自肝臟的IRDye®800DW標記的aptTNF-α隨時間的總通量圖表。第9C圖：顯示在LPS和D-GalN注射誘導的急性肝損傷小鼠模型中，IRDye®800DW標記的aptTNF-α定位於腎臟和肝臟的照片。

本揭露部分係基於抗TNF核酸適配體(aptTNF)及其PEG共軛物的開發，其對於抑制TNF信號傳導和於體內減輕TNF介導的急性肝損傷顯示出優異的效果。例如，示例性適配體(例如，aptTNF或aptTNF-PEG)被發現其對於體外抑制TNF信號傳導而言與抗TNF抗體一樣有效或優於抗TNF抗體。此外，從急性肝損傷的動物模型獲得的結果顯示，對於降低血清胺基轉移酶的水平而言，示例性抗TNF適配體顯示出與N-乙醯半胱胺酸(一種常用的急性肝損傷治療劑)相似或更有效的治療效果，其導致浸潤到肝臟的嗜中性球的減少並促進肝再生。因此，如本文所述的抗TNF適配體可用於減輕發炎、減少肝損傷和/或促進肝再生，從而有效治療由TNF介導的疾病，例如肝臟疾病。抗TNF適配體也在急性肺損傷的小鼠模型中顯示出組織保護作用和全身性抗炎作用。此外，鑑於對TNF的結合親和力，任何抗TNF適配體也可用作診斷試劑，用於在體外或體內檢測TNF的存在和/或水平。TNF的存在和/或水平可以作為與TNF信號傳導相關的發炎性病症和癌症相關的生物標誌物(biomarker)。

因此，本文描述了抗TNF適配體、包含其之醫藥組成物，以及將其用於治療和/或診斷目的的方法。

抗TNF適體

本文描述的是與TNF結合並抑制TNF介導的信號傳導的核酸適配體(抗TNF適配體)，其如所預期的將減少發炎。如本文所用的核酸適配體是指對特定靶分子(TNF，例如人類TNF)具有結合活性的核酸分子(DNA或RNA)。適配體可以藉由與TNF分子結合來阻斷TNF介導的信號傳導。本揭露的抗TNF適配體，呈線性或環狀形式，可以是RNA、DNA(例如，單鏈DNA)、經修飾的核酸或其混合物。抗TNF適配體可以是非天然存在的分子(例如，含有不存在於天然基因中的核苷酸序列或含有天然不存在的經修飾核苷酸)。替代地或另外地，抗TNF適配體可不含有編碼功能肽的核苷酸序列。

TNF，指腫瘤壞死因子(也稱為腫瘤壞死因子α、TNF α、惡病毒素(cachexin)或惡病質素(cachectin))，是一種與發炎有關的細胞激素。它主要由活化的巨噬細胞產生，但也可以由其他細胞類型產生，包括嗜中性球、肥大細胞和淋巴細胞。在人類中，TNF由TNFA基因編碼，示例性人類TNF序列以GenBank登錄號NP_000585.2提供。

本文揭露的抗TNF核酸適配體可包含與5’-GCGCCACTACAGGGGAGCTGCCATTCGAATAGGTGGGCCGC-3’(SEQ ID NO：1)至少85%(例如，90%、95%或98%)相同的核苷酸序列。

兩種核酸的「相似性百分比」係使用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873_5877所改進的Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法確定。此等算法被併入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程式(2.0版)中。可以用NBLAST程式，得分(score)=100，12字長(wordlength)進行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發明的核酸分子同源的核苷酸序列。當兩個序列之間存在間隙(gap)時，可以使用Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402所述的Gapped BLAST程式。當使用BLAST和Gapped BLAST程式時，可以使用各別程式(例如，XBLAST和NBLAST)的預設參數。

在其他具體實施例中，與5’-GCGCCACTACAGGGGAGCTGCCATTCGAATAGGTGGGCCGC-3’(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列相比，本文所述的抗TNF適配體可含有最多5個(例如，最多5、4、3、2或1個)核苷酸變異。如第2A圖所示，SEQ ID NO：1的某些部分形成雙鏈體結構。在一些情況下，任何雙鏈體區段中的一個或多個鹼基對所涉及的核苷酸可以用不同的鹼基對轉換或替換。此等變體將保持與第2A圖中所示的SEQ ID NO：1相同的二級結構，並保持所有的環結構/序列。

本文公開的任何抗TNF適配體可含有至多200個核苷酸(nts)，例如150 nts、100 nts、80 nts、70 nts、60 nts、50 nts、40 nts或30 nts。在一些實施例中，抗TNF適配體可含有範圍為30至150 nts、30至100 nts、30至80 nts、30至70 nts、30至60 nts、30至50 nts或30至40 nts的 核苷酸。

抗TNF適配體可以特異性結合人類TNF。或者，適配體可以結合來自不同物種(例如人類和小鼠)的TNF分子。當與TNF結合時，此適配體可以阻斷TNF介導的細胞信號傳導至少20%(例如，40%、50%、80%、100%、2倍、5倍、10倍、100倍或1,000倍)。TNF適配體對TNF介導的信號傳導的抑制活性可以藉由常規測定和/或以下實施例中描述的那些測定而確認。

於一些具體實施例中，本文所述的抗TNF適配體可含有非天然存在的核鹼基、糖或共價核苷間鍵合(骨架(backbones))。此經修飾的寡核苷酸賦予所需的性質，例如增強的細胞攝取、改善的對靶核酸的親和力和增加的體內穩定性。

於一實施例中，本文所述的適配體具有經修飾的骨架，包括保留磷原子者(參見例如，美國專利第3,687,808號、第4,469,863號、第5,321,131號、第5,399,676號和第5,625,050號)和不具有磷原子者(參見例如，美國專利第5,034,506號、第5,166,315號和第5,792,608號)。含磷的經修飾骨架實例包括但不限於，硫代磷酸酯、掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基磷酸酯(包括3'-亞烷基磷酸酯、5'-亞烷基磷酸酯和掌性磷酸酯)、次磷酸酯(phosphinates)、磷醯胺(phosphoramidates)(包括3'-胺基磷醯胺和胺基烷基磷醯胺)、硫代磷醯胺、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼烷磷酸酯，具有3'-5'鍵合，或2'-5'鍵合。此等骨架還包括具有反極性的骨架，即3'至3'、5'至5'或2'至2'鍵合。不含磷原子的經修飾骨 架係由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵合，混合雜原子和烷基或環烷基核苷間鍵合，或一個或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵合而形成。此等骨架包括具有嗎啉代鍵合的骨架(部分由核苷的糖部分形成)；矽氧烷骨架；硫化物、亞碸和碸骨架；甲醯基和硫代甲醯基骨架；亞甲基甲醯基和硫代甲醯基骨架；核糖乙醯骨架；含有骨架的烯烴；胺基磺酸骨架；亞甲基亞胺基和亞甲基肼基(methylenehydrazino)骨架；磺酸鹽和磺醯胺骨架；醯胺骨架；和其他具有混合的N、O、S和CH₂組分的其他組分。

於另一實施例中，本文描述的適配體包括一個或多個經取代的糖部分。此等經取代的糖部分可以包括在其2'位置之下列基團之一：OH；F；O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基；O-炔基、S-炔基、N-炔基和O-烷基-O-烷基。在此等基團中，烷基、烯基和炔基可以是經取代或未經取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。它們還可以在它們的2'位置上包括雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代的矽基、RNA裂解基團、報導基團、嵌入劑、用於改善寡核苷酸的藥代動力學性質的基團、或用於改善寡核苷酸的藥效學特性的基團。較佳的經取代的糖部分包括具有2'-甲氧基乙氧基、2'-二甲基胺基氧基乙氧基和2'-二甲基胺基乙氧基乙氧基的那些部分。參見Martin等人(1995)Helv.Chim.Acta,78,486-504。

替代地或另外地，本文所述的適配體包括一種或多種經修飾的天然核鹼基(即腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)。經修飾的核鹼基包括如下列所述者：美國專利第3,687,808號；簡明的高分子科學與工程百科全書，第858-859頁，Kroschwitz,J.I.編輯，John Wiley & Sons,1990年；Englisch等人，Angewandte Chemie，國際版，1991年，30，613；以及Sanghvi,Y.S.，第15章，反義研究和應用，第289-302頁，CRC出版社，1993年。其中某些核鹼基特別有用於增加適配體分子與其靶向位點的結合親和力。此等包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和O-6經取代的嘌呤(例如2-胺基丙基-腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞略啶)。參見Sanghvi等人編輯，反義研究與應用，CRC出版社，Boca Raton，1993年，第276-278頁。

本文所述的任何適配體可藉由常規方法製備，例如化學合成或體外轉錄。它們如本文所述的預期生物活性可以藉由如以下實施例中所描述者來驗證。用於表現任何抗TNF適配體的載體也在本揭露的範圍內。

本文所述的任何適配體可藉由共價鍵、非共價鍵或兩者，與一個或多個聚醚部分(例如聚乙二醇(PEG)部分)共軛。因此，於一些具體實施例中，本文描述的適配體是聚乙二醇化的。本揭露並不意味著限制特定分子量的PEG部分。於一些具體實施例中，聚乙二醇部分的分子量範圍為5kDa至100kDa、10kDa至80kDa、20kDa至70kDa、20kDa至60kDa、20kDa至50kDa、10kDa至40kDa、10kDa至30kDa、15kDa至40kDa、15kDa至30kDa、15kDa至35kDa、15kDa至25kDa、20kDa至40kDa、20kDa至35kDa、或20kDa至30kDa。在一些實施例中，PEG部分具有20kDa的分子量。與本文所述的抗TNF適配體共軛的PEG部分可以是直鏈或支鏈的。它可以與核酸適配體的5'末端、適配體的3'末端或兩者共軛。需要時，PEG部分可以共價共軛到核酸適配體的3'末端。預期PEG 共軛會延長核酸適配體的半衰期。

用於將PEG部分與核酸共軛的方法是本領域已知的，並且先前已描述於例如，在PCT公開第WO2009/073820 A2號中，其相關教導藉由引用而併入本文。應當理解，經PEG共軛的核酸適配體和用於將PEG共軛至本文所述的核酸適配體的方法是示例性的，並不意味著限制。

在一些情況下，核酸適配體可以與一個或多個N-乙醯基葡糖胺(GalNAc)部分共軛，以促進組織特異性遞送(例如，肝臟遞送)。

抗TNF核酸適配體可以是呈現多聚體形式，例如，二聚體形式。於一些具體實施例中，抗TNF適配體二聚體可以包含藉由合適的聚合物部分鍵合的兩種抗TNF適配體，所述聚合物部分可以是如本文所述的PEG部分。二聚抗TNF適配體的非限制性實例顯示於第3A圖中。二聚體中的兩個適配體中的一個或兩個可以包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列。兩個抗TNF適配體可以相同或不同。例如，抗TNF適配體中的一個或兩個可以包含SEQ ID NO：1。於一些具體實施例中，抗TNF核酸適配體是抗TNF適配體二聚體，其中具有SEQ ID NO：1的兩個適配體藉由PEG連接。

本文描述的任何抗TNF適配體可化學合成。適配體可用官能團操作，以與用於治療目的的藥物共軛，或者與用於體內或體外診斷目的的可檢測標記(例如，成像劑，如造影劑)共軛。如本文所用，「共軛的」或「附著的」意指兩個實體係締合的，較佳係具有足夠的親和力，從而實現兩個實體之間的締合的治療/診斷益處。兩個實體之間的締合可以 是直接的或透過連接基(linker)，例如聚合物連接基。共軛的或附著的可以包括共價或非共價鍵合以及其他形式的締合，例如一個實體在另一個之上或之內，或者在第三實體之上或之內的任一個或兩個實體的包埋(entrapment)，例如微膠粒(micelle)。

於一實施例中，如本文所述的抗TNF適配體係附著於可檢測標記，該標記是能夠直接或間接釋放可檢測信號的化合物，使得可以在體外或體內檢測、測量和/或鑑定適配體。此等「可檢測標記」的實例旨在包括但不限於，螢光標記、化學發光標記、比色標記、酶標記、放射性同位素和親和標記，例如生物素。此等標記可以直接或間接藉由常規方法與適配體共軛。

於一些具體實施例中，可檢測標記是適合於對由TNF介導的疾病成像的藥劑，其可以是放射性分子、放射性藥物或氧化鐵顆粒。適用於體內成像的放射性分子包括但不限於，¹²²I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁸F、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br、²¹¹At、²²⁵Ac、¹⁷⁷Lu、¹⁵³Sm、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁶⁷Cu、²¹³Bi、²¹²Bi、²¹²Pb和⁶⁷Ga。適用於體內成像的示例性放射性藥物包括¹¹¹In氧喹啉、¹³¹I碘化鈉、^99mTc甲溴苯寧(Mebrofenin)和^99mTc紅血球、¹²³I碘化鈉、^99mTc依沙鎂肟(Exametazime)、^99mTc大顆粒(Macroaggregate)白蛋白、^99mTc亞甲磷酸鹽(Medronate)、^99mTc巰替肽(Mertiatide)、^99mTc奧昔磷酸鹽(Oxidronate)、^99mTc噴替酸鹽(Pentetate)、^99mTc高鎝酸鹽(Pertechnetate)、^99mTc司他比(Sestamibi)、^99mTc硫膠體、^99mTc替曲磷(Tetrofosmin)、鉈-201和氙(Xenon)-133。報導劑也可以是染料，例如螢光團，其有用於在組織樣品中檢測由TNF介導的疾病。

不受特定理論的束縛，本文所述的抗TNF適配體可賦予至少以下益處。第一，抗TNF適配體是小尺寸分子(例如，具有約14kDa的分子量)，其可以穿透血腦屏障(BBB)並且有用於治療神經變性疾病。第二，製造抗TNF適配體不需要基於細胞的系統，並且具有成本效益。第三，與蛋白質類的治療劑(例如單株抗體)相比，抗TNF適配體在體內具有更短的半衰期。因此，抗TNF適配體可能更適合用於治療急性發炎疾病，因為預期它們會阻斷急性期TNF信號傳導而不影響對抗感染的長期先天性免疫。

醫藥組成物

可以將如本文所述的一種或多種抗TNF適配體(單體或多聚體，如二聚體)或其PEG共軛物與藥學上可接受的載體(賦形劑)混合，以形成用於治療目標疾病的醫藥組成物。「可接受的」是指載體必須與組成物的活性成分相容(並且較佳地，能夠穩定活性成分)，並且對待治療的個體無害。包含緩衝劑的藥學上可接受的賦形劑(載體)，其是本領域熟知的。參見，例如，Remington：藥學的科學與實踐，第20版(2000年)，Lippincott Williams和Wilkins，K.E.Hoover編輯。

用於本發明方法的醫藥組成物可包含藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑，並呈凍乾製劑或水溶液的形式。參見，例如，Remington：藥學的科學與實踐，第20版(2000年)，Lippincott Williams和Wilkins，K.E.Hoover編輯。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在使用的劑量和濃度下對接受者無毒，並且可包含緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽 和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和蛋胺酸；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、丁基或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)的多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，如甘胺酸、谷胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或賴胺酸；單醣、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚醣；螯合劑，如EDTA；醣類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，如鈉；金屬複合物(例如，鋅-蛋白質複合物)；和/或非離子表面活性劑，例如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

在一些實施例中，本文所述的醫藥組成物包含含有TNF結合適配體(或用於產生適配體的載體)的脂質體，其可藉由本領域已知的方法製備，例如Epstein等人(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688；Hwang等人(1980)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030；以及美國專利第4,485,045號和第4,544,545號。具有增強循環時間的脂質體公開於美國專利第5,013,556號。特別有用的脂質體可以藉由反相蒸發法，利用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇和PEG衍生的磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂質組成物而產生。藉由具有確定孔徑的過濾器擠出脂質體，以產生具有所欲直徑的脂質體。

如本文所述的抗TNF適配體也可以包埋在例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備的微膠囊中，例如分別在膠體藥物遞送系統中(例 如，脂質體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒和納米膠囊)或在粗乳液中的羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚-(甲基-甲基丙烯酸酯)微膠囊。此等技術是本領域已知的，參見例如Remington，藥學的科學與實踐，第20版，Mack Publishing(2000)。

在其他實施例中，本文所述的醫藥組成物可以配製成緩釋形式。緩釋製劑的合適實例包括含有TNF結合適配體的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質是成形製品的形式，例如，薄膜或微膠囊。緩釋基質的實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利第3,773,919號)、L-谷胺酸和7乙基-L-谷胺酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)、乙酸異丁酸蔗糖酯和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。

用於體內施用的醫藥組成物必須是無菌的。這可以藉由例如無菌過濾膜過濾而輕易地實現。可將治療性TNF結合適配體組成物置於具有無菌進入口的容器中，例如具有可由皮下注射針刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。

本文所述的醫藥組成物可以是單位劑型，例如片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、溶液劑或混懸劑，或用於口服、腸胃外或直腸給藥的栓劑，或藉由吸入或吹入給藥。

為了製備固體組成物如片劑，可以將主要活性成分與藥物載體(例如常規壓片成分，如玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠)以及其它藥物稀釋劑(例如水)混 合，以形成含有本發明化合物或其藥學上可接受的無毒鹽的均勻混合物的固體預製劑組成物。當將此等預製劑組成物稱為均勻時，意指活性成分均勻地分散在整個組成物中，使得組成物可以容易地細分成等效的單位劑型，例如片劑、丸劑和膠囊劑。然後將該固體預製劑組成物再分成上述類型的單位劑型，其含有0.1至約500mg本發明的活性成分。新組成物的片劑或丸劑可被包覆或以其它方式混合，以提供具有延長作用優點的劑型。例如，片劑或丸劑可包含內劑型和外劑型組分，後者在前者上形成包膜。這兩種組分可以藉由腸溶層(enteric layer)分開，所述腸溶層用於抵抗胃中的崩解並允許內部組分完整地進入十二指腸或延遲釋放。多種材料可用於此等腸溶層或塗層，此等材料包括許多聚合酸和聚合酸與諸如蟲膠、鯨蠟醇和乙酸纖維素的材料的混合物。

合適的表面活性劑特別包括非離子試劑，例如聚氧乙烯山梨糖醇(例如Tween^TM 20、40、60、80或85)和其他脫水山梨糖醇(例如Span^TM 20、40、60、80或85)。具有表面活性劑的組成物將方便地包含0.05至5%的表面活性劑，並且可以介於0.1及2.5%之間。應當理解，如果需要，可以加入其他成分，例如甘露醇或其他藥學上可接受的載體。

合適的乳液可使用市售的脂肪乳液製備，例如Intralipid^TM、Liposvn^TM、Infonutrol^TM、Lipofundin^TM和Lipiphysan^TM。活性成分可以溶解在預混合的乳液組成物中，或者可以溶解在油(例如大豆油、紅花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中，並且在與磷脂(例如，卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合時形成乳液。應當理解，可以加入其他成分，例如甘油或葡萄糖，以調節乳液的張力。合適的乳液 通常含有高達20%的油，例如5至20%。脂肪乳劑可包含0.1至1.0μm，特別是0.1至0.5μm的脂肪滴，並具有5.5至8.0的pH。

乳液組成物可以是藉由將抗TNF適配體與Intralipid^TM或其組分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而製備。

用於吸入或吹入的醫藥組成物包括在藥學上可接受的水性或有機溶劑或其混合物中的溶液和懸浮液，以及粉末。液體或固體組成物可含有如上所述的合適的藥學上可接受的賦形劑。於一些具體實施例中，該組成物藉由口服或鼻腔呼吸途徑施用，用於局部或全身作用。

較佳無菌的藥學上可接受的溶劑中的組成物可以藉由使用氣體進行霧化。霧化溶液可以直接從霧化裝置呼吸，或者霧化裝置可以連接到面罩、帳篷或間歇正壓呼吸機。溶液、懸浮液或粉末組成物可以適當方式從裝置遞送製劑而施用，較佳為口服或經鼻施用。

治療和診斷應用

TNF在幾乎所有類型的發炎相關疾病中起作用，並且失調的TNF分泌引起諸如類風濕性關節炎、牛皮癬、強直性脊柱炎、發炎性腸道疾病、神經退行性疾病、急性肺損傷(或急性肺衰竭)、急性肝損傷、成人呼吸窘迫症候群和癌症等疾病。因此，調節TNF介導的信號傳導和/或檢測TNF的存在/水平可以有效地治療或診斷TNF介導的疾病。

如本文所述的任何抗TNF適配體或其PEG共軛物可用於治療和診斷用途。例如，抗TNF適配體可用於抑制TNF介導的信號傳導，從而有效治療由TNF介導的疾病，包括類風濕性關節炎、牛皮癬、克羅恩病、 哮喘、全身發炎反應綜合徵(SIRS)相關性腦病、肝臟疾病(如急性肝損傷)、急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群、乾眼症、眼色素層炎、急性胰炎、急性腎小球損傷、急性腎功能衰竭、ANCA相關性血管炎或急性腦病。

急性肝功能衰竭(ALF)或急性肝損傷是一種罕見但危及生命的疾病，其中大多數肝細胞在先前未存在肝臟疾病的情況下經歷細胞死亡(Bernal et al.,N.Engl.J.Med.2013；369：2525-34)。隨著ALF的進展，其他組織(包括心血管、呼吸、腎臟、中樞神經、血液系統)的功能障礙將很快發生。在肝移植之前唯一可用的ALF治療是靜脈輸注N-乙醯半胱胺酸(NAC)(Mumtaz et al.,Hepatol.Int.2009；3(4)：563-70；Sales et al.,Ann.Hepatol.2013；12(1)：6-10)。然而，NAC顯示對患有晚期腦水腫的ALF患者沒有益處(Lee et al.,Gastroenterology 2009；137：856-64)。因此，臨床的替代選擇仍然是ALF患者(特別是腦病)和沒有肝移植設施的中心所未滿足的需求。

ALF背後的潛在機制包括肝細胞和不同類型的免疫細胞之間的相互作用(Possamai等人，J.Hepatol.2014；61(2)：439-45)。一旦肝細胞經歷細胞死亡，所釋放的危險相關分子模式(DAMP)將活化常駐的嗜中性球和肝巨噬細胞(庫普弗細胞)。經活化的庫普弗細胞將分泌腫瘤壞死因子(TNF)和趨化因子，以將更多的單核細胞和嗜中性球募集到受損的肝組織中，從而加重肝細胞中的死亡信號傳導(Krenkel等人，2014；3(6)：331-43；Bantel等人，Front Physiol.2012；3：79)。此外，TNF將影響血腦屏障通透性，引起神經發炎，並引發腦水腫和腦病(Lv等人， Liver Int.2010；30(8)：1198-210；Bémeur等人，Neurochem.Int.2010；56(2)：213-5；Butterworth等人，Hepatology.2011；53(4)：1372-6)。儘管TNF阻斷劑在動物模型中顯示出有希望的治療功效，但它們在急性酒精性肝炎患者中引起嚴重感染(Naveau等人，Hepatology 2004；39：1390-1397；Boetticher等人，Gastroenterology 2008；135：1953-1960)。嚴重感染可能由不必要的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和補體依賴性細胞毒性(CDC)效應引起，其係由抗體或Fc融合重組蛋白所造成，該Fc融合重組蛋白識別在巨噬細胞、活化T淋巴細胞和多形核白血球上表現的膜結合TNF(Naveau等人，Hepatology 2004；39：1390-1397；Tracey等人，Pharmacol.Ther.2008；117(2)：244-79)。此外，由於此等TNF阻斷劑的長半衰期導致的TNF/NF-κ B信號傳導的持續抑制，阻止了急性肝損傷後的肝再生(Naveau等人，Hepatology 2004；39：1390-1397；Tracey等人，Pharmacol.Ther.2008；117(2)：244-79；Bhushan等人，Am.J.Pathol.2014；184(11)：3013-25)。

血清中TNF濃度較高的患者可能對抗TNF治療有較好的反應，並減少感染的副作用。然而，仍沒有TNF濃度的常規預測標記或用於在體內檢測TNF的診斷工具。如上所述，本文公開的TNF-適配體可以被操作和修飾以共軛至成像劑，用於CT、MRI、超音波和內視鏡檢測(Bird-Lieberman等人，Nat.Med.2012；18(2)：315-21；Van den Brande et al.,Gut.2007；56(4)：509-17)。使用適配體預篩選抗TNF治療的潛在反應者可以提高安全性和療效。於一些具體實施例中，本文公開的抗TNF 適配體具有診斷治療效果，且可用作潛在的監測工具。在TNF移植之前，抗TNF適配體可以為ALF患者提供替代治療方法。

此外，用於aptTNF-/aptTNF-α-PEG的解毒劑是適配體本身的互補序列，可以容易地設計和合成，這可以允許即時施用解毒劑。不受特定理論的束縛，本文所述的抗TNF適配體視需要地與適配體抑制劑(包括反義序列)一起，可以允許在急性組織損傷階段適當抑制TNF-α途徑，避免組織修復階段時抑制再生，並在需要時加強對抗效果的即時終止。

SIRS是終末器官(end-organ)損害期間發生的常見現象(Bernal等人，N.Engl.J.Med.2013；369：2525-34；Ware等人，N.Engl.J.Med.2000；342：1334-49；Gattinoni等人，Am.J.Resp.Crit.Care.2016；194：1051-2)。如下文所述的ALI模型中所證明的，在LPS誘導的ALI中，全身性LDH、AST和ALT水平增加，並且在主要重要器官中檢測到aptTNF-α信號。細胞激素風暴的激增將單一器官疾病推進為全身性發炎疾病，並且可導致多器官功能障礙，包括中樞神經、心血管、呼吸、胃腸、腎和血液系統等。不受特定理論的束縛，本文所述的小分子大小的適配體可以允許有效的組織穿透。於一些具體實施例中，本文描述的適配體可以穿透血腦屏障。不受特定限制，本文所述的抗TNF適配體可用於治療重症監護醫學中常見的SIRS相關腦病。

為了實施本文公開的方法，可以藉由合適的途徑(例如靜脈內)將有效量的本文所述的含有至少一種抗TNF適配體的醫藥組成物施用於需要治療的個體(例如人類)，其係透過合適的途徑，例如推注或藉 由連續輸注一段時間之靜脈內施用、藉由肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口服、吸入或局部途徑施用。用於液體製劑的市售噴霧器，包括噴射霧化器和超音波霧化器，有用於給藥。液體製劑可以直接霧化，而凍乾粉末可以在重構後霧化。或者，本文所述的含有抗TNF適配體的組成物可以使用碳氟化合物製劑和定量吸入器霧化，或者作為凍乾和研磨的粉末吸入。

如本文所用，「有效量」是指單獨或與一種或多種其他活性劑組合賦予個體治療效果所需的每種活性劑的量。於一些具體實施例中，治療效果是阻斷TNF介導的細胞信號傳導、減少發炎、減少肝損傷和/或增加肝再生。確定TNF結合適配體的量是否達到治療效果對於本領域技術人員來說是顯而易見的。如本領域技術人員所知，有效量根據所治療的具體病症、病症的嚴重程度、個體患者參數，包括年齡、身體狀況、大小、性別和體重、治療持續時間、同時點療法的性質(如果有的話)、特定的給藥途徑以及醫療人員的知識和專業中的相似因素而有所不同。此等因素是本領域普通技術人員所熟知的，並且可以僅藉由常規實驗來解決。通常較佳是使用各個組分或其組合的最大劑量，即根據合理的醫學判斷的最高安全劑量。

如半衰期的實證考量通常將有助於確定劑量。施用頻率可以在治療過程中確定和調整，並且通常是(但不是必需地)基於目標疾病/病症的治療和/或抑制和/或改善和/或延遲。或者，TNF結合適配體的持續連續釋放製劑可能是合適的。用於實現緩釋的各種製劑和裝置是本領域已知的。

於一實施例中，如本文所述的抗TNF適配體的劑量可以在已經施用一次或多次TNF結合適配體的個體中憑經驗確定。給予個體增量劑量的拮抗劑。為了評估拮抗劑的功效，可以遵循疾病/病症的指標。

通常，對於施用本文所述的任何抗TNF適配體，可以向需要治療的個體給予初始候選劑量，其可以基於個體對抗TNF適配體的反應進行調整。出於本揭露的目的，取決於上述因素，典型的日劑量可以為約0.1μg/kg至100mg/kg或更高中的任何一者。

於一些具體實施例中，對於體重正常的成年患者，可以施用劑量範圍為約0.3至5.00mg/kg。具體的劑量方案，即劑量、時間和重複，將取決於特定個人和個人的病史，以及個人藥劑的性質(例如藥劑的半衰期和本領域熟知的其他考慮因素)。

為了本揭露的目的，如本文所述的TNF結合適配體的合適劑量將取決於特異性TNF結合適配體、疾病/病症的類型和嚴重性、TNF結合適配體是否用於預防或治療目的、既往療法、患者的臨床病史和對拮抗劑的反應，以及主治醫師的自由裁量權。臨床醫生可以施用TNF結合適配體，直到達到所需結果的劑量。於一些具體實施例中，期望的結果是發炎減少(例如，減少嗜中性球浸潤到組織中)、肝損傷減少和/或肝再生增加。確定劑量是否產生所需結果的方法對於本領域技術人員而言是顯而易見的。一種或多種TNF結合適配體的施用可以是連續的或間歇的，這取決於例如受體的生理條件、施用的目的是治療性的還是預防性的，以及技術人員已知的其他因素。TNF結合適配體的施用可以在預選的時間段內基本上連續，或者可以是一系列間隔劑量，例如在目標疾病或病症發展之前、 期間或之後。

如本文所用，術語「治療」是指向個體施予或施用包含一種或多種活性劑的組成物，所述個體具有目標疾病或病症、所述疾病/病症的症狀或對所述疾病/病症的易感性，其目的是治癒、痊癒、減輕、緩解、改變、補救、改進、改善或影響疾病、疾病的症狀或對疾病或病症的易感性。

減輕目標疾病/病症包括延遲疾病的發展或進展、或降低疾病的嚴重程度。減輕疾病並不一定需要治療效果。如其中所使用的，「延遲」目標疾病或病症的發展意味著推遲、阻礙、減緩、延緩、穩定和/或推遲疾病的進展。此等延遲可以具有不同的時間長度，這取決於疾病的歷史和/或被治療的個體。一種「延遲」或減輕疾病發展或延遲疾病發作的方法是一種降低在給定時間範圍內發生一種或多種疾病症狀的可能性和/或減少症狀程度的方法。在給定的時間範圍內，與不使用該方法相比，此等比較通常基於臨床研究，使用足以給出統計學顯著結果的多個個體。

疾病的「發展」或「進展」意指疾病的初始表現和/或隨後的進展。可以使用本領域熟知的標準臨床技術檢測和評估疾病的發展。然而，發展也指可能無法察覺的進展。出於本揭露的目的，發展或進展是指症狀的生物學過程。「發展」包括發生、復發和發作。如本文所用，目標疾病或病症的「發作」或「發生」包括初始發作和/或復發。

於一些具體實施例中，將本文所述的TNF結合適配體以足以將TNF介導的信號傳導降低至少5%(例如，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高)的量施用於需要治療的個 體，其可以藉由常規測定和/或以下實施例中描述者確認。於一些具體實施例中，TNF結合適配體施用的量是在個體體內組織中有效減少至少5%(例如，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高)的發炎(例如，減少嗜中性球浸潤、減少一種或多種促炎細胞激素(例如，IL1 β和IL-6)、一種或多種巨噬細胞募集趨化因子(例如，CCL2)、一種或多種嗜中性球募集趨化因子(例如，IL23和IL17)或其組合)。

在其他具體實施例中，TNF結合適配體以有效降低個體中(例如，在患有肝損傷的個體中)的胺基轉移酶(例如丙胺酸轉胺酶(ALT)或天冬胺酸轉胺酶(AST))的血清水平的量施用，以降低至少5%(例如，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高)。在一些具體實施例中，抗TNF適配體以有效增加肝臟中細胞週期基因(例如，細胞週期蛋白D1或PCNA)的表現(從而促進肝再生)至少5%(例如，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高)的量施用。

可以使用醫藥領域普通技術人員已知的常規方法將醫藥組成物施用至個體，這取決於待治療的疾病類型或疾病部位。該組成物還可以藉由其他常規途徑施用，例如口服、腸胃外、藉由吸入噴霧、局部、直腸、鼻腔、口腔、陰道或藉由植入的儲庫(reservoir)施用。本文所用的術語「腸胃外」包括皮下、皮內、靜脈內、肌肉內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞘內、病灶內和顱內注射或輸注技術。另外，其可以藉由可注射的貯庫(depot)施用途徑給予個體，例如使用1個月、3個月或6個 月貯庫的可注射或可生物降解的材料和方法。在一些實施例中，醫藥組成物藉由眼內或玻璃體內施用。在一些實施例中，醫藥組成物經氣管內施用。在其他實施例中，醫藥組成物可以藉由吸入或皮下注射施用。

可注射組成物可含有各種載體，例如植物油、二甲基乳醯胺、二甲基甲醯胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉荳蔻酸異丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)。對於靜脈內注射，可以藉由滴注方法施用水溶性TNF結合適配體，由此輸注含有TNF結合適配體和生理學上可接受的賦形劑的藥物製劑。生理學上可接受的賦形劑可包括例如5%葡萄糖、0.9%鹽水、林格氏溶液或其他合適的賦形劑。肌肉內製劑，例如TNF結合適配體的合適可溶性鹽形式的無菌製劑，可以溶解在藥物賦形劑中並加以施用，例如注射用水，0.9%鹽水或5%葡萄糖溶液。

在一具體實施例中，藉由位點特異性或靶向局部遞送技術施用TNF結合適配體。位點特異性或靶向局部遞送技術的實例包括TNF結合適配體的各種可植入的貯庫來源或局部遞送導管，例如輸注導管、留置導管或針導管、合成移植物、外膜包裹物、分流器和支架或其他可植入設備、特定部位載體(site specific carrier)、直接注射或直接應用。參見，例如，PCT公開第WO 00/53211號和美國專利第5,981,568號。

於一些具體實施例中，本文所述的適配體與不同的材料相容，並且可以製成用於局部用途的不同製劑。在一些具體實施例中，在具有急性肺損傷的個體中藉由氣管內途徑增加施用本文所述的抗TNF適配體比藉由靜脈內途徑在較低的藥物濃度下可獲得最佳效果。在一些具體實施例中，局部遞送增加局部有效藥物濃度並降低全身副作用，其可用於發炎 性疾病，包括哮喘。

含有反義多核苷酸、表現載體或亞基因組多核苷酸的治療組成物的靶向遞送也可以使用。受體介導的DNA遞送技術描述於例如Findeis等人(1993)，趨勢生物技術(Trends Biotechnol.)，11：202；Chiou等人(1994)，基因治療：直接基因轉移的方法和應用(Gene Therapeutics：Methods and Applications of Direct Gene Transfer)(J.A.Wolff編輯)；Wu等人(1988)，生物化學期刊(J.Biol.Chem.)，263：621；Wu等人(1994)，生物化學期刊(J.Biol.Chem.)，269：542；Zenke等人(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87：3655；Wu等人(1991)，生物化學期刊(J.Biol.Chem.)，266：338。

含有多核苷酸的治療組成物(例如，本文所述的TNF結合適配體或用於其產生的載體)以約100ng至約200mg的DNA給藥，用於基因治療方案中的局部給藥。於一些具體實施例中，在基因治療方案期間，也可以使用約500ng至約50mg、約1μg至約2mg、約5μg至約500μg和約20μg至約100μg的DNA或更多的濃度範圍。

藉由本文描述的方法治療的個體可以是哺乳動物，例如農場動物、運動動物(sport animal)、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓、小鼠和大鼠。於一實施例中，個體是人類。含有抗TNF適配體的組成物可用於在需要治療的個體中減輕發炎、促進肝再生、減少肝損傷、減少腫瘤負荷。在一些實施例中，個體可以是相對於健康人類個體(例如，沒有與TNF相關的疾病者)具有升高的TNF血清水平的人類個體。可以使用常規醫學實踐評估個體內(例如，個體的血清中)TNF的水平。

在一些實施例中，個體可以是具有由TNF介導的疾病、疑似患有由TNF介導的疾病或具有由TNF介導的疾病風險的人類患者(包括類風濕性關節炎、牛皮癬、強直性脊柱炎、發炎性腸道疾病、急性肺損傷、神經變性疾病、與肝損傷相關的肝臟疾病和癌症)。示例性肝臟疾病包括肝炎、肝硬化、肝纖維化、脂肪肝病和肝癌。在一些實施例中，個體可以是患有TNF介導的急性炎性病症的人類患者。實例包括急性肝損傷、急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群、乾眼症、眼色素層炎、急性胰炎、急性腎小球損傷、急性腎衰竭、ANCA相關性血管炎、急性腦病。

具有目標疾病或病症(例如，TNF介導的疾病，包括類風濕性關節炎、牛皮癬、強直性脊柱炎、發炎性腸道疾病、神經變性疾病、急性肺損傷、急性肝損傷和癌症)的個體可以藉由常規醫學檢查來鑑定，例如實驗室測試、器官功能測試、CT掃描或超音波。疑似患有任何此等目標疾病/病症的個體可能表現出疾病/病症的一種或多種症狀。具有疾病/病症風險的個體可以是具有與該疾病/病症相關的一種或多種風險因子的個體。此個體也可以藉由常規醫學實踐來識別。還可以使用本文描述的方法評估個體內的TNF水平。於一些具體實施例中，具有較高TNF濃度的患者對抗TNF療法(例如，抗TNF適配體治療)具有更好的反應，並且減少由感染引起的副作用。

在本文描述的方法中使用的具體劑量方案，即劑量、時間和重複將取決於特定個體(例如，人類患者)和個體的病史。

於一些具體實施例中，抗TNF適配體可以與另一種合適的治療劑共同用於目標疾病，如本文中所述。替代地或另外地，抗TNF適配 體也可以與其他用於增強和/或補充藥劑有效性的藥劑聯合使用。

目標疾病/病症的治療功效可以藉由例如以下實施例中描述的方法評估。

於一些具體實施例中，將與本文揭露的可檢測標記物(例如顯像劑)共軛的抗TNF適配體施用於個體，以評估個體中的TNF水平。此TNF檢測可用於鑑定相關患者的抗TNF治療(例如，用本文揭露的抗TNF醫藥組成物治療或用抗TNF抗體治療)。

可以使用本文所述的任何適配體藉由常規方法在體外檢測樣品(例如，疑似含有TNF的生物樣品，包括但不限於血液樣品和尿液樣品)中的TNF。在一些情況下，適配體可以與可檢測標記共軛，其可以直接或間接釋放信號，指明樣品中TNF的存在和/或水平。或者，抗TNF適配體可用於體內成像TNF在個體(例如，如本文所述的人類患者)中的存在和位置。從本文所述的任何診斷測定(體外或體內)獲得的結果可以指明與TNF相關的疾病的風險或狀態。

用於治療或診斷的試劑盒

本揭露還提供用於減少發炎(例如，減少發炎性蛋白質的產生或減少嗜中性球浸潤、減輕TNF介導的疾病(例如，類風濕性關節炎、牛皮癬、強直性脊柱炎、發炎性腸道疾病、急性肺病、神經退行性疾病、與肝臟疾病和癌症相關的肝損傷)和檢測個體中的TNF水平。此類試劑盒可包括一個或多個包含結合TNF適配體的容器，例如本文所述的任何適配體。

於一些具體實施例中，試劑盒可包含根據本文所述任何方法使用的說明書。所包括的說明書可以包括適配體施用的描述，以治療、延遲發作或減輕目標疾病，如本文中所述。試劑盒可以進一步包括基於鑑定該個體是否患有目標疾病來選擇適合於治療的個體的描述。在其他具體實施例中，說明書包括向具有目標疾病風險的個體施用適配體的描述。

關於TNF結合適配體使用的說明書通常包括關於預期治療的劑量、給藥方案和給藥途徑的信息。容器可以是單位劑量、散裝包裝(例如，多劑量包裝)或亞單位劑量。本發明的試劑盒中提供的說明書通常是在標籤或包裝說明書(例如，包括在試劑盒中的紙張)上的書面說明，但機器可讀指令(例如，磁性或光學儲存碟上攜帶的說明書)也是可以接受的。

標籤或包裝說明書表明該組成物用於與癌症相關的疾病或病症之治療、延遲發作和/或緩解，例如本文所述者。可以提供用於實踐本文描述的任何方法的說明書。

本發明的試劑盒處於合適的包裝中。合適的包裝包括但不限於小瓶(vial)、瓶子(bottle)、廣口瓶、軟包裝(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。還考慮了與特定裝置結合使用的包裝，例如吸入器、鼻腔給藥裝置(例如霧化器)或輸液裝置，例如微型泵。試劑盒可具有無菌進入口(例如，容器可以是靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。容器還可以具有無菌進入口(例如，容器可以是靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。組成物中的至少一種活性劑是如本文所述的TNF結合適配體。

試劑盒可以視需要地提供額外的組件，例如緩衝器和解釋信息。通常，該試劑盒包括容器和在容器上或與容器相關聯的標籤或包裝插件。在一些具體實施例中，本發明提供了包含上述試劑盒的內容物的製品。

一般技術

除非另有說明，本發明的實踐將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規技術，此等技術在本領域的技術範圍內。分子選殖：實驗室手冊，第二版(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；寡核苷酸合成(M.J.Gait編輯，1984)；分子生物學方法，Humana Press；細胞生物學：實驗室筆記本(J.E.Cellis編輯，1998)Academic Press；動物細胞培養(R.I.Freshney編輯，1987)；細胞和組織培養介紹(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；細胞和組織培養：實驗室程序(A.Doyle、J.B.Griffiths和D.G.Newell編輯，1993-8)J.Wiley and Sons；酶學方法(Academic Press，Inc.)；實驗免疫學手冊(D.M.Weir和C.C.Blackwell，編輯)；用於哺乳動物細胞的基因轉移載體(J.M.Miller、M.P.Calos編輯，1987)；分子生物學現行方案(F.M.Ausubel等人編輯，1987)；PCR：聚合酶鏈鎖反應，(Mullis等人編輯，1994)；免疫學現行方案(J.E.Coligan等人編輯，1991)；分子生物學短協議(Wiley and Sons，1999)；免疫生物學(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；抗體(P.Finch，1997)； 抗體：實用方法(D.Catty編輯，IRL Press，1988-1989)；單株抗體：一種實用的方法(P.Shepherd和C.Dean編輯，Oxford University Press，2000)；使用抗體：實驗室手冊(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；抗體(M.Zanetti和J.D.Capra編輯，Harwood Academic Publishers，1995)。無需進一步詳細說明，相信本領域技術人員基於以上描述可以最大程度地利用本發明。因此，以下具體實施例應被解釋為僅是說明性的，並且不以任何方式限制本揭露的其餘部分。出於本文引用的目的或申請標的，本文引用的所有出版物均以參照方式併入。

實施例 實施例1：TNF靶向核酸適配體及其對急性肺損傷(ALI)的治療作用 材料和方法 化學品和寡核苷酸

所有化學品均購自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)，寡核苷酸藉由Integrated DNA Technologies(Coralville，IA，USA)合成。aptTNF-α的序列是5’-GCGCCACTACAGGGGAGCTGCCATTCGAATAGGTGGGCCGC-3’(SEQ ID NO：1)。

SELEX

藉由硝酸纖維素濾膜SELEX鑑定人類TNF-α靶向適配體。合成的單鏈DNA庫由80個核苷酸長的單鏈DNA組成，其中40個隨機序列側為引子序列5’-ACGCTCGGATGCCACTACAG[N]₄₀CTCATGGACGTGCTGGTGAC(SEQ ID NO：2)，其中N=A、T、G、C。在第一回SELEX循環中，將10¹⁵分子ssDNA庫與重組人類TNF-α蛋白(R & D Systems，Minneapolis，MN，USA)一起培育。藉由硝酸纖維素濾膜收集與TNF-α蛋白結合的ssDNA，並藉由重複洗滌除去未結合的ssDNA。然後藉由加熱洗脫TNF-α結合的ssDNA，與白蛋白一起培育用於陰性選擇，然後通過硝酸纖維素濾膜。收集流出物並藉由PCR擴增。SELEX重複了十回。將TNF-α結合的ssDNA和白蛋白結合的ssDNA進行次世代測序(Illumina MiSeq System，Illumina，San Diego，CA)。輸出讀數由FASTApatmer成簇(Alam等人，Mol.Ther.Nucleic Acids.2015；4：e230)並用白蛋白結合組中出現的簇(cluster)減去。然後使用Mfold對在剩餘簇中具有最高讀數的代表性序列進行結構分析。根據預測的二級結構設計它們的截短衍生物。

PEG共軛物

將過量的胺標記的aptTNF-α與雙功能N-羥基琥珀醯亞胺聚乙二醇(NHS-PEG-NHS，分子量20kDa，Polysciences Inc.，Warrington，PA)在碳酸氫鈉緩衝液(pH 8.3)中於37℃培育18小時，藉由非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳純化PEG化二聚體aptTNF-α(aptTNF-α- PEG)，並藉由Nanodrop分光光度計(Thermo Scientific，Hudson，NH，USA)測定濃度。

結合親和力測定

將人類TNF-α蛋白(0、8.75、17.5、35、70、140nM，R & D Systems)與aptTNF-α(50nM)在37℃下培育1小時。此外，將小鼠TNF-α蛋白(140nM)或BSA(140nM)與aptTNF-α(50nM)或aptTNF-α-PEG(50nM)一起培育。然後藉由硝酸纖維素濾膜收集與蛋白質結合的適配體，並藉由加熱洗脫。藉由定量PCR(LightCycler 480 System，Roche Applied Science，Mannheim，Germany)定量經洗脫的適配體的量。藉由GraphPad Prism 5(GraphPad Software，San Diego，CA)使用等式Y=Amax×X/(Kd+X)計算解離常數(Kd)。蛋白質結合適配體(人類TNF-α蛋白和小鼠TNF-α蛋白)的相對量表示為倍數變化，使用BSA作為參考(1倍)。

aptTNF-α的生物分佈

小鼠購自國家實驗動物中心(台灣台北)。所有動物實驗均根據中央研究院動物設施的指導進行。給6週齡Balb/c雄性小鼠施用LPS(10mg/kg，氣管內)以誘導ALI。在LPS施用後1小時靜脈內注射IRDye®800CW標記的aptTNF-α(Integrated DNA Technologies)。在適配體施用後2小時、4小時、7小時、10小時和24小時，Xenogen IVIS成像系統200系列(Caliper Life Sciences，Alameda)分別檢測aptTNF-α 發出的螢光信號(Cakarova等人，Am.J.Respir.Crit.Care Med.2009；180：521-32)。另外，在適配體施用後4小時犧牲IRDye^®800CW標記的aptTNF-α處理組的小鼠。收集重要器官，包括心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和膀胱，並檢測aptTNF-α發出的螢光信號。取樣血液，並藉由Fuji Dri-Chem 4000i(Fujifilm，Tokyo，Japan)測定LDH、AST和ALT的水平。

細胞培養和螢光素酶活性測定

將HEK293細胞在含有10% FBS(Gibco)的DMEM(Gibco BRL，Life Technologies，Grand Island，NY，USA)中培養，並用NF-κ B報導基因(pGL4.32，Promega，Madison，WI，USA)轉染。在轉染後24小時，用潮黴素處理細胞，以選擇抗生素抗性純株。將表現NF-κ B報導基因的HEK293細胞接種到96孔板(每個2000個細胞)中過夜培養。將TNF-α蛋白(5ng)與aptTNF-α(50、500nM)、aptTNF-α-PEG(10、50nM)或抗人類TNF-α抗體(10、50nM，R & D Systems)加入每個獨立的孔。培育4或24小時後，根據製造商的方案，藉由螢光素酶測定系統(Promega)測定螢光素酶活性。數據表示為相對螢光素酶活性，使用未經處理的組作為陰性對照(0%活性)和用TNF-α處理組作為陽性對照(100%活性)。

急性肺損傷(ALI)動物研究

為了誘導ALI，用LPS(10mg/kg)氣管內處理6週齡 Balb/c雄性小鼠。LPS處理後1小時，氣管內或靜脈內給予aptTNF-α(1600μg/kg)或aptTNF-α-PEG(32、320μg/kg)。藉由MouseMonitor^TM S Plus脈搏血氧計模塊(Indus Instruments，Webster，TX，USA)在處理後24小時記錄血氧飽和度。在一個研究組中，犧牲小鼠。測量肺的重量並對組織進行RNA和蛋白質提取以及免疫化學染色。另一組中，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)。計算BALF中的總細胞數，藉由Nanodrop分光光度計定量BALF中的總蛋白質濃度，並且按照製造商的方案，藉由骨髓過氧化酶(MPO)螢光活性測定試劑盒(BioVision)測定BALF中的MPO活性。

定量PCR

藉由Trizol(Invitrogen)從小鼠肝組織中提取RNA，並根據製造商的方案，使用隨機六聚體(Invitrogen)，藉由SuperScript III逆轉錄酶(Invitrogen)合成cDNA。在LightCycler 480系統(Roche Applied Science，Mannheim，Germany)上進行定量PCR。qPCR中使用的針對小鼠cDNA的引子序列如下所列：il-1β，5’-agttgacggaccccaaaag-3’(正向)(SEQ ID NO：3)和5’-agctggatgctctcatcagg-3’(反向)(SEQ ID NO：4)；il-6，5’-gctaccaaactggatataatcagga-3’(正向)(SEQ ID NO：5)和5’-ccaggtagctatggtactccagaa-3’(反向)(SEQ ID NO：6)；cxcl2，5’-aatcatccaaaagatactgaacaaag-3’(正向)(SEQ ID NO：7)和5’-ttctctttggttcttccgttg-3’(反向)(SEQ ID NO：8)；actb，5’-ctaaggccaaccgtgaaaag-3’(正向)(SEQ ID NO：9)和5’- accagaggcatacagggaca-3’(反向)(SEQ ID NO：10)，CCL2，5’-catccacgtgttggctca-3’(正向)(SEQ ID NO：11)和5’-gatcatcttgctggtgaatgagt-3’(反向)(SEQ ID NO：12)；IL17，5’-cagggagagcttcatctgtgt-3’(正向)(SEQ ID NO：13)和5’-gctgagctttgagggatgat-3’(反向)(SEQ ID NO：14)；IL23，5’-tccctactaggactcagccaac-3’(正向)(SEQ ID NO：15)和5’-agaactcaggctgggcatc-3’(反向)(SEQ ID NO：16)；CCND1，5’-tttctttccagagtcatcaagtgt-3’(正向)(SEQ ID NO：17)和5’-tgactccagaagggcttcaa-3’(反向)(SEQ ID NO：18)；和PCNA，5’-ctagccatgggcgtgaac-3’(正向)(SEQ ID NO：19)和5’-gaatactagtgctaaggtgtctgcatt-3’(反向)(SEQ ID NO：20)。

西方墨點轉漬法和免疫組織化學染色

用於西方墨點轉漬法的初級抗體如下所列：抗GAPDH(Santa Cruz)和抗PCNA(Cell Signaling Technology，Beverly，MA，USA)。蘇木精和伊紅染色(H & E)於中央研究院生物醫學科學研究所的病理核心室內進行。根據由動物急性肺損傷研究組(Matute-Bello等人，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.2011；44：725-38)設計的評分系統計算肺損傷評分。對於免疫組織化學染色，以1：100稀釋使用抗Ly6G(單株1A8，Biolegend，San Diego，CA，USA)抗體。使用ImmPRESS^TM HRP抗大鼠IgG，小鼠吸附(過氧化酶)聚合物檢測試劑盒(Vectors Laboratories，Burlingame，CA，USA)來擴增信號，並使用DAB過氧化 酶(HRP)基質試劑盒(Vectors Laboratories)進行顯色。

統計

結果顯示為平均值±平均值的標準誤差，P值藉由學生t檢定計算。雙尾P值低於0.05被定義為具有統計學意義。

結果 AptTNF-α以高親和力結合TNF-α，並在體內靶定TNF-α

藉由硝酸纖維素濾膜SELEX選擇TNF-α靶向適配體(aptTNF或aptTNF-α，第2A圖)，藉由FASTAptamer分析，並使用Mfold基於預測的二級結構進行最佳化。aptTNF-α和人類TNF-α的解離常數(Kd)為8nM(第2B圖，左圖)。由於數據進一步顯示aptTNF-α也與小鼠TNF-α結合(第2B圖，右圖)，隨後使用ALI小鼠模型研究aptTNF-α的體內結合效應。

數據顯示，在ALI組中，在2小時和4小時時在胸腔中清楚地觀察到aptTNF-α信號，但在LPS誘導的ALI後24小時消失(第2C及2D圖)。該觀察結果與ALI時肺組織中報導的TNF-α動力學一致(Cakarova等人，Am.J.Respir.Crit.Care Med.2009；180：521-32)。由於SIRS可能在ALI後發生並導致多器官損害，因此在給予aptTNF-α後4小時收集重要器官，並檢查其生物分佈。數據顯示，施用相同劑量的aptTNF-α，與對照組相比，ALI組的肝、脾、肺和腎中的aptTNF-α信號顯著增加(第2E及2F圖)。在對照組中，aptTNF-α信號主要在腎臟和 膀胱中觀察到，器官參與適配體排泄，但信號強度低於ALI組。進一步的血液檢查也顯示ALI組的LDH、AST和ALT水平顯著增加。該數據支持aptTNF-α生物分佈圖像研究中觀察到的終末器官損害的發生(第2G圖)。總之，數據顯示aptTNF-α對人類TNF-α具有良好的體外結合親和力，並且可以在體內靶定TNF-α，如小鼠ALI模型所示。

AptTNF-α-PEG抑制TNF-α介導的信號傳導

接下來，研究了aptTNF-α或其衍生物是否有效抑制TNF-α介導的信號傳導。由於生理活性的TNF-α在生理條件下以三聚體形式存在，因此藉由在兩個aptTNF-α單體(aptTNF-α-PEG，第3A圖)之間添加聚乙二醇(PEG)連接基來合成二聚體aptTNF-α，以加強aptTNF-α的潛在拮抗作用。數據顯示二聚體aptTNF-α-PEG還對人和小鼠TNF-α蛋白具有特異性結合活性(第3B圖)。

此外，報導子測定顯示，雖然單體aptTNF-α在500nM濃度下有效抑制TNF-α/NF-κ B信號傳導，但二聚體aptTNF-α-PEG在TNF-α處理後4小時測量的50nM信號傳導時具有更好的抑制TNF-α/NF-κB的效力(第3C圖，上圖)。此外，單體aptTNF-α在TNF-α處理後24小時消退的抑制作用和二聚體aptTNF-α-PEG的抑制作用降低至原始功效的約40%。相反地，在TNF-α處理後24小時，抗TNF-α抗體的抑制作用仍然存在(第3C圖，下圖)。此等數據表明aptTNF-α和aptTNF-α-PEG在具有全身性發炎反應的急性疾病中的潛在作用，因為它們僅抑制急性期TNF-α信號傳導。這可以避免組織修復階段所需的基礎 TNF-α信號傳導的干擾以及與持久抑制先天免疫相關的副作用。

AptTNF-α可減輕急性肺損傷的嚴重程度

接下來，使用LPS誘導的ALI小鼠模型研究aptTNF-α和aptTNF-α-PEG的體內作用。如氧飽和度的顯著降低所表明，數據顯示LPS治療引起呼吸窘迫(第4A圖)。LPS處理組中濕肺重量的增加表明肺泡-毛細血管膜對LPS誘導的損傷具有增強的通透性(第4B圖)。LPS誘導的ALI組的組織學檢查顯示在肺泡間隔中，肺泡中隔增厚和紅血球、嗜中性球和纖維蛋白鏈有積聚的現象，並且伴隨肺損傷評分增加(第4C及4D圖)。對BALF的進一步分析顯示總蛋白水平增加、總細胞數增加、骨髓過氧化酶(MPO)活性增強、促炎細胞激素/趨化因子(il-1 β、il-6和cxcl2)的表現上調(第4E至4J圖)。此等表型和分子結果符合預期的組織反應級聯(cascade)，其由細胞激素和趨化因子反應ALI協調。

隨後，顯示氣管內或靜脈內施用aptTNF-α-PEG，以劑量依賴性方式在表型、組織學和分子上挽救LPS誘導的損傷(第4A至4J圖)。數據顯示，當藉由氣管內途徑遞送時，與全身遞送相比，aptTNF-α-PEG具有更好的功效，這可能與更高的局部濃度相關。儘管氣管內施用aptTNF-α也在一定程度上抑制了LPS誘導的ALI，但這僅在相對高的藥物濃度(aptTNF-α-PEG的5倍)中實現，表明aptTNF-α-PEG的效力更高。總之，數據表明aptTNF-α-PEG或aptTNF-α可以抑制由TNF-α途徑和隨後的細胞激素風暴介導的急性期細胞凋亡信號，其最終導致ALI中 的組織損傷。

實施例2：新型TNF靶向適配體對急性肝衰竭(ALF)具有治療作用 材料和方法

除了下面描述的動物研究之外，使用的材料方法與實施例1中的相同。

急性肝衰竭(ALF)動物研究。

為了誘導ALF，給6週齡Balb/c雄性小鼠注射D-半乳糖胺(D-GalN，100mg/kg，腹膜內)和人類TNF-α(40μg/kg，靜脈內)。接下來，靜脈內給予N-乙醯半胱胺酸(NAC，600mg/kg)、aptTNF-α(1600μg/kg)或aptTNF-α-PEG(3.2、32、320μg/kg)處理，血液在處理後6小時取樣(Saito等人，Hepatology.2010；51：246-54；Sass等人，Cytokine.2002；19：115-20)。血液用於AST和ALT分析(Fuji Dri-Chem 4000i)。處理後6或24小時犧牲小鼠。收集肝組織用於RNA、蛋白質提取以及免疫化學染色。

結果 AptTNF-α減弱TNF-α介導的急性肝衰竭(ALF)並加強早期肝再生

對於具有猛暴型結果的ALF患者，肝移植前目前可用的治療是全身輸注N-乙醯半胱胺酸(NAC)(Bernal等人，N.Engl.J.Med.2013；369：2525-34)。由於ALF是TNF-α介導的，隨後研究了aptTNF- α和aptTNF-α-PEG在ALF中的作用，並使用D-半乳糖胺(D-GalN)/TNF-α誘導的小鼠ALF模型將其作用與NAC進行比較。

數據顯示注射D-GalN/TNF-α誘導嚴重的肝細胞死亡，並伴隨組織出血和嗜中性球浸潤。用aptTNF-α-PEG處理減少了觀察到的肝損傷(第5A圖)。血清AST/ALT和組織促炎細胞激素/趨化因子(il-1鮻、il-6和cxcl2)的進一步分析顯示，aptTNF-α(1600μg/kg)或aptTNF-α-PEG(3.2μg/kg至320μg/kg)至NAC(600mg/kg)具有優異的肝臟保護作用(第5B至5F圖)。巨噬細胞募集趨化因子(CCL2)和嗜中性球募集趨化因子(IL23、IL17)也藉由TNF和D-GalN注射而增加，並且藉由aptTNF-α-PEG處理而減少(第7圖)。此外，aptTNF-α-PEG具有劑量依賴性的肝保護作用，並且再次優於aptTNF-α(第5B至5F圖)。

此外，由於肝細胞在急性損傷期後從G0轉變為G1期，因此在肝再生期間通常可觀察到PCNA表現的上調。數據顯示，與NAC處理組相比，aptTNF-α-和aptTNF-α-PEG處理組皆具有更高的PCNA蛋白(第5G圖)和mRNA(第8圖)表現。數據表明，在急性損傷後，aptTNF-α/aptTNF-α-PEG處理組中肝細胞在較早時間點進入G1期(第5G圖)。

aptTNF-PEG組也顯示出顯著更高的細胞週期蛋白D1的蛋白和mRNA表現(數據未顯示和第8圖)，NAC組中的表現僅略微增加(第8圖和數據未顯示)，也表明aptTNF-PEG組中的肝細胞在較早的時間點進入了再生過程。

此外，顯示在接受aptTNF-α或aptTNF-α-PEG處理的組中，AST和ALT升高逆轉的程度相同。儘管如此，雖然在NAC治療組中的ALT升高可以逆轉，但AST仍然很高(第5B及5C圖)。在肝組織中，所有處理(包括使用NAC、aptTNF或aptTNF-PEG的處理)抑制半胱天冬酶-3活化(第6圖)。ALT是主要在肝臟中表現的酶。相反地，AST不僅在肝臟中表現，也在心臟、肌肉和腦組織中表現。由於肝功能衰竭不僅僅是單一器官疾病，而且可導致SIRS和多器官功能衰竭，我們的數據表明，使用aptTNF-α/aptTNF-α-PEG治療不僅可以挽救急性肝損傷，還可以抑制SIRS過程。該數據暗示了aptTNF-α/aptTNF-α-PEG在ALF中的潛在全身保護作用。總之，本文所述的數據顯示aptTNF-α/aptTNF-α-PEG具有良好的肝臟保護作用，並且還可能抑制SIRS的過程，從而防止在臨床實踐中常見的多器官衰竭。

實施例3：AptTNF-α用作監測肝臟體內TNF-α的診斷劑 材料和方法 生物分佈分析

對於內源性小鼠TNF誘導，將6週齡Balb/c雄性小鼠以腹膜內注射D-GalN(650mg/kg)和LPS(10μg/kg)，以誘導急性肝衰竭。處理後6小時犧牲小鼠，收集血清和肝組織。對於生物分佈測定，在D-GalN和LPS處理後0.5小時，靜脈注射經IRDye®800CW標記的aptTNF(Integrated DNA Technologies)，並藉由Xenogen IVIS成像系統 200系列(Caliper Life Sciences，Alameda)檢測aptTNF發出的螢光信號。

結果 AptTNF-α用作體內監測TNF-α的診斷劑

肝組織中，TNF-α濃度較高的患者對抗TNF-α治療的反應可能更好。然而，沒有常規的TNF-α濃度預測標記或診斷工具來檢測體內TNF-α。為了減少抗TNF-α治療對無反應者的不良副作用，研究了aptTNF-α作為體內監測TNF-α的診斷劑的可行性。為了誘導小鼠內源性TNF-α分泌和急性肝損傷，將LPS和D-GalN注射到小鼠中。在LPS和D-GalN注射後30分鐘施用螢光標記的aptTNF-α。沒有LPS和D-GalN注射但經螢光標記的aptTNF-α施用的小鼠用作陰性對照。與陰性對照組相比，AptTNF-α在LPS和D-GalN注射組的肝組織中顯著積累(第9A至9C圖)，儘管兩組中大量的aptTNF-α從腎臟過濾排泄到膀胱。

其他具體實施例

本說明書中公開的所有特徵可以任何組合進行結合。本說明書中揭露的每個特徵可以由用於相同、等同或類似目的的替代特徵代替。因此，除非另有明確說明，否則所揭露的每個特徵僅是一系列等效或類似特徵的示例。

根據以上描述，本領域技術人員可以容易地確定本發明的基本特徵，並且在不脫離其精神和範圍的情況下，可以對本發明進行各種 改變和修飾，以使其適應各種用途和條件。因此，其他實施例也在申請專利範圍內。

等同物

雖然本文已經描述和說明了若干發明實施例，但是本領域普通技術人員將容易想到用於執行功能和/或獲得結果的各種其他裝置和/或結構和/或本文所描述的一個或多個優點。此等變化和/或修飾中的每一者被認為是在本文描述的發明具體實施例的範圍內。更一般地，本領域技術人員將容易理解，本文描述的所有參數、尺寸、材料和配置旨在示例性的，並且實際參數、尺寸、材料和/或配置將取決於具體應用或應用。本領域技術人員將認識到或者能夠使用不超過常規的實驗確定本文所述的具體發明具體實施例的許多等同物。因此，應該理解，前述實施例僅作為示例呈現，並且在所附申請專利範圍及其等同物的範圍內，本發明的實施例可以不同於具體描述和要求保護的方式實施。本揭露的發明實施例涉及本文描述的每個單獨的特徵、系統、物品、材料、試劑盒和/或方法。此外，如果此等特徵、系統、物品、材料、試劑盒和/或方法不相互矛盾，則包括兩個或更多此等特徵、系統、物品、材料、試劑盒和/或方法的任何組合係包含於本發明的發明範圍。

如本文定義和使用的所有定義應理解為字典所控制的定義、藉由引用併入的文獻中的定義，和/或所定義的術語的普通含義。

本文揭露的所有參考文獻、專利和專利申請均藉由參照方式併入本文所引用的個別標的，在某些情況下可涵蓋整個文件。

除非明確相反指出，否則本說明書和申請專利範圍書中使用的不定冠詞「一(a)」和「一個(an)」應理解為表示「至少一個」。

本說明書和申請專利範圍中使用的短語「和/或」應理解為表示如此結合的元件中的「其中一個或兩個」，即在某些情況下元件係結合地存在而在其他情況下係分離地存在。用「和/或」列出的多個元件應以相同的方式解釋，即，如此結合的「一個或多個」元件。除了與「和/或」子句具體標示的元件之外，可以視需要地存在其他元件，無論是與具體標示的那些元件相關還是不相關。因此，作為非限制性示例，當與諸如「包括」的開放式語言結合使用時，對「A和/或B」的引用在一個實施例中可以僅指A(視需要地包括除了B之外的元件)；在另一個實施例中，僅限於B(視需要地包括除A之外的元件)；在又一個具體實施例中，A和B兩者(視需要地包括其他元件)等等。

如本說明書和申請專利範圍書中所用，「或」應理解為具有與如上所定義的「和/或」相同的含義。例如，當列表中的分隔項目時，「或」或「和/或」應被解釋為包含性(inclusive)的，即，包含至少一個，但也包括多個元件的數量或列表，以及視需要的其他未列出的項目。只有明確表示相反的術語，例如「僅一個」或「恰好一個」，或者，當在申請專利範圍中使用時，「由……組成」將指的是包含數字或列表中的一個元件。一般而言，此處使用的術語「或」僅應被解釋為表示排他性條款之前的唯一替代方案(即「一個或另一個但不是兩個」)，例如「任 一」、「其中之一」或「正是其中之一」。當在申請專利範圍中使用時，「基本上由……組成」應具有其在專利法領域中使用的普通含義。

如本說明書和申請專利範圍中所使用的，關於一個或多個元件的列表，短語「至少一個」應理解為表示選自元件列表中的任何一個或多個元件中的至少一個元件，但不一定包括元件列表中具體列出的每個元件中的至少一個元件，並且不排除元件列表中元件的任何組合。此定義還允許除了在短語「至少一個」所指的元件列表內具體標示的元件之外，視需要地存在的元件，無論是與具體標示的那些元件相關還是不相關。因此，作為非限制性示例，「A和B中的至少一個」(或等效地，「A或B中的至少一個」，或等效地「A和/或B中的至少一個」)可以參考在一個具體實施例中，至少一個，視需要地包括多於一個，A，不存在B(並且視需要地包括除B之外的元件)；在另一個具體實施例中，至少一個，視需要地包括多於一個，B，不存在A(並且視需要地包括除A之外的元件)；在又一個具體實施例中，至少一種，視需要地包括多於一個，A，和至少一個，視需要地包括多於一個，B(和視需要地包括其他元件)等等。

還應該理解，除非明確相反地指出，否則在本文要求保護的包括一個以上步驟或動作的任何方法中，該方法的步驟或動作的順序不一定限於該方法所述的步驟或行為。

<110> 中央研究院 國立台灣大學

<120> 治療或診斷TNF相關發炎疾病的TNF靶向適配體及其用途

<140> 107147202

<141> 2018-12-26

<150> US 62/660,324

<151> 2018-04-20

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成多核苷酸

<400> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成多核苷酸

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<221> misc_feature

<222> (21)..(60)

<223> n為a、c、g、或t

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<223> 合成多核苷酸

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<223> 合成多核苷酸

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<400> 20

Claims (26)

1. 一種能與人類腫瘤壞死因子α(TNF α)結合的核酸適配體，其係包含與GCGCCACTACAGGGGAGCTGCCATTCGAATAGGTGGGCCGC(SEQ ID NO：1)至少95%相同且保持相同二級結構的核酸序列。
2. 如申請專利範圍第1項所述之核酸適配體，其係包含GCGCCACTACAGGGGAGCTGCCATTCGAATAGGTGGGCCGC(SEQ ID NO：1)的核酸序列。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述之核酸適配體，其係包含40至100個核苷酸。
4. 如申請專利範圍第2項所述之核酸適配體，其係由GCGCCACTACAGGGGAGCTGCCATTCGAATAGGTGGGCCGC(SEQ ID NO：1)的核酸序列所組成。
5. 如申請專利範圍第1至2項及第4項中任一項所述之核酸適配體，其係與聚乙二醇(PEG)部分共軛。
6. 如申請專利範圍第5項所述之核酸適配體，其中，該PEG部分的分子量係約15kDa至40kDa。
7. 如申請專利範圍第1至2項及第4項中任一項所述之核酸適配體，其係呈現含有兩個該核酸適配體複製物之二聚體形式。
8. 如申請專利範圍第7項所述之核酸適配體，其中，該兩個核酸適配體複製物係藉由該PEG部分鍵合。
9. 如申請專利範圍第1至2項及第4項中任一項所述之核酸適配體，其係與可檢測標記共軛。
10. 一種醫藥組成物，包含如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之核酸適配體以及藥學上可接受的載體。
11. 一種如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的核酸適配體用於製備藥物之用途，該藥物係用於抑制個體之TNF α活性。
12. 如申請專利範圍第11項所述之用途，其中，該個體係患有由TNF α介導的疾病、疑似患有由TNF α介導的疾病、或有由TNF α介導的疾病風險的人類患者。
13. 如申請專利範圍第12項所述之用途，其中，該由TNF-α介導的疾病係類風濕性關節炎、牛皮癬、克羅恩病、急性肝損傷、急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群、乾眼症、全身發炎反應症候群發炎(SIRS)相關性腦病、哮喘、眼色素層炎、急性胰炎、急性腎小球損傷、急性腎功能衰竭、ANCA相關性血管炎或急性腦病。
14. 如申請專利範圍第11至13項中任一項所述之用途，其中，該個體係已接受或正在進行涉及TNF α拮抗劑的治療。
15. 一種如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之核酸適配體用於製備藥物之用途，該藥物係用於減輕個體之肝損傷或促進肝再生。
16. 如申請專利範圍第15項所述之用途，其中，該個體患有與肝臟疾病相關的肝損傷。
17. 如申請專利範圍第16項所述之用途，其中，該肝臟疾病係肝炎、肝硬化、肝纖維化、脂肪肝、肝癌或急性肝損傷。
18. 如申請專利範圍第15至17項中任一項所述之用途，其中，該個體係處於該疾病的急性期。
19. 如申請專利範圍第11至13或15至17項中任一項所述之用途，其中，該核酸適配體的量係足以降低該個體中的血清天冬胺酸轉胺酶(AST)水平、血清丙胺酸轉胺酶(ALT)水平或兩者皆有。
20. 如申請專利範圍第11至13或15至17項中任一項所述之用途，其中，該核酸適配體的量係足以減少嗜中性球浸潤至該個體的肝臟中。
21. 如申請專利範圍第11至13或15至17項中任一項所述之用途，其中，該核酸適配體係氣管內施用。
22. 如申請專利範圍第11至13或15至17項中任一項所述之用途，其中，該核酸適配體係藉由吸入或皮下注射施用。
23. 一種檢測樣品中腫瘤壞死因子α(TNF α)存在的方法，包括將如申請專利範圍第9項所述之核酸適配體與疑似含有TNF α的生物樣品接觸，以及檢測該核酸適配體與該TNF α在該樣品中的結合。
24. 一種如申請專利範圍第9項所述之核酸適配體用於製備監測個體中腫瘤壞死因子α之組成物之用途，該監測係基於該可檢測標記所釋放的信號檢測該核酸適配體的位置。
25. 如申請專利範圍第24項所述之用途，其中，該個體係患有肝臟疾病或疑似患有肝臟疾病的人類患者。
26. 如申請專利範圍第25項所述之用途，其中，該檢測的步驟係藉由測量位於該人類患者的肝臟處的該可檢測標記所釋放的信號之水平來進行。

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