CN107847603A

CN107847603A - 脂质体佐剂组合物

Info

Publication number: CN107847603A
Application number: CN201680042420.3A
Authority: CN
Inventors: P·J·多米诺夫斯基; D·姆旺吉; S·K·雷; D·L·弗斯; T·K·戈得比; L·M·斯莱; S·马汉; S·武拉
Original assignee: Zoetis LLC
Current assignee: Zoetis LLC; Zoetis Services LLC
Priority date: 2015-07-20
Filing date: 2016-07-19
Publication date: 2018-03-27
Anticipated expiration: 2036-07-19
Also published as: CA2992892A1; PT3325015T; HK1250338A1; JP2018524388A; JP6975132B2; RS62015B1; UA125017C2; NZ739040A; ES2878475T3; BR112018001318B1; AU2016297529B2; HRP20210872T1; CL2018000155A1; WO2017015252A1; KR102085968B1; RU2018102114A; BR112018001318A2; CY1124319T1; PL3325015T3; SI3325015T1

Abstract

本发明提供包含外膜和内部隔室的脂质体佐剂组合物，所述外膜包含：季铵化合物、固醇、磷脂和糖脂。本发明还提供包含本发明的脂质体佐剂的疫苗组合物。

Description

脂质体佐剂组合物

相关申请的交叉参考

本申请要求2015年7月20日提交的美国临时申请No.62/194,355的权益，该申请的内容以引用的方式整体并入本文中。

技术领域

本发明属于疫苗佐剂领域。

发明背景

在疫苗学领域，以刺激针对抗原，且因此针对潜在病原体的免疫反应的方式向宿主中引入抗原。免疫反应的诱发取决于多种因素，所述因素被认为是抗原的化学组成、特征和构型，宿主的健康状况和免疫能力以及抗原的传递和施药方式。

免疫反应具有多个方面，其中一些由免疫系统的细胞(例如，树突状细胞、B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞)来展现。免疫系统的细胞通过与抗原或免疫系统的其他细胞相互作用来参与免疫反应，释放细胞激素而且对那些细胞激素具有反应性。适应性(获得)免疫反应便利地(但任意地)分为两个主要类别——体液介导和细胞介导的。免疫反应的体液组分包括产生对抗原具有特异性的抗体。细胞介导的组分包括产生迟发型超敏反应和对抗原具有特异性的细胞毒效应T-细胞。

佐剂是结合抗原使用时用于增强免疫反应的物质。在疫苗接种方案中使用佐剂例如可引发比单独抗原所引发的免疫反应更快或更大的免疫反应。另外，佐剂可用来引导对特异性免疫途径的免疫反应并充当抗原的递送载体。

脂质体和脂质体配制物是佐剂的实例。通常脂质体可负载抗原和/或其它免疫调节性化合物，或脂质体本身可充当独立的佐剂。抗原和/或其它免疫刺激性化合物可囊封在脂质体内部，和/或其可附着至脂质体或合并到脂质双层中。

影响给定的脂质体在给定的系统呈现中作为递送载体的适用性的因素尚不明确。因此，仍需要提供改良疗效的递送载体。所述改良的递送尤其是对于刺激和/或引发免疫反应的分子施用而言，例如抗原和免疫调节剂。

发明概要

本发明涉及用于增强疫苗性能的佐剂。

在某些方面，本发明提供一种包含脂质双层外膜和内部隔室的脂质体，所述脂质双层外膜包含：季铵化合物、固醇、磷脂和式I的糖脂：

其中，R¹和R²独立地为氢，或具有多达20个碳原子的饱和烷基；X为-CH₂-、-O-或-NH-；R²为氢，或具有多达20个碳原子的饱和或不饱和烷基；R³、R⁴和R⁵独立地为氢、-SO₄ ^2-、-PO₄ ^2-、-COC_1-10烷基；R⁶为L-丙氨酰基、L-α-氨基丁基、L-精氨酰基、L-天冬酰胺基、L-天冬氨酰基、L-半胱氨酰基、L-谷氨酰基、L-甘氨酰基、L-组氨酰基、L-羟脯氨酰基、L-异亮氨酰基、L-亮氨酰基、L-赖氨酰基、L-甲硫氨酰基、L-鸟氨酰基、L-苯丙氨酰基、L-脯氨酰基、L-丝氨酰基、L-苏氨酰基、L-酪氨酰基、L-色氨酰基和L-缬氨酰基或其D异构体。

在某些实施方案中，所述季铵化合物为DDA，所述固醇为胆固醇，所述磷脂为卵磷脂，且所述糖脂为N-(2-去氧-2-L-亮氨酰基氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基十二酰胺或其乙酸酯。

在某些实施方案中，所述脂质体基本上不含皂苷。

在某些实施方案中，所述脂质体还包含选自免疫刺激性核糖核苷酸、CpG寡脱氧核糖核苷酸和其组合的免疫刺激性寡核苷酸。在一些实施方案中，所述脂质体不含CpG寡脱氧核糖核苷酸。

在一些实施方案中，所述免疫刺激性寡核苷酸合并到脂质体的内部隔室中。在其它实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸与脂质体的外表面相缔合。

在一些实施方案中，所述免疫刺激性寡核苷酸包含SEQ ID NO 1-14中的任一者。

在某些方面，本发明提供一种包含如本文所述的脂质体的佐剂配制物。

在某些实施方案中，所述佐剂配制物基本上不含皂苷。在某些实施方案中，所述佐剂配制物基本上不含CpG寡脱氧核糖核苷酸。

在某些方面，本发明提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含有效量的抗原性组分和如本文所述的佐剂配制物。

在某些实施方案中，所述疫苗组合物基本上不含皂苷。

在某些实施方案中，所述疫苗组合物基本上不含CpG。在某些实施方案中，所述基本上不含CpG的疫苗组合物的抗原性组分含有(-)ssRNA病毒。

在某些实施方案中，所述(-)ssRNA病毒为流感病毒。在一些实施方案中，所述流感病毒为猪流感病毒。

在某些实施方案中，所述抗原性组分合并到所述脂质体的内部隔室中。

在所选择的适合牛的实施方案中，所述抗原性组分可包括BVDV-1和/或BVDV-2灭活病毒(和BHV-1)。在尤其适合家禽动物的其它实施方案中，抗原性组分包括抑制蛋白。

具体实施方式

定义：

术语‘约’或‘大约’在结合可测量的数字变量使用时，指的是变量的指定值和在指定值的实验误差以内(例如，在均值的95％置信区间内)或在指定值的10％以内的所有变量值，无论哪个较大，除非‘约’是参考以周计的时间间隔使用时，其中“约3周”为17天至25天，而约2周至约4周为10天至40天。

术语‘伴随发热’指的是疫苗接种动物在疫苗接种一天内体温升高。对于牛的情形来说，此术语指的是直肠温度超过103.5℉。

结合物种使用的术语‘抗原’指的是在所述物种中引起传染病的病原体或这些病原体的组分。因此，例如‘牛抗原’指的是在牛体内能引起传染病的病原体或这些病原体的组分。

术语‘基本上由……组成’等在用于本发明的脂质体和佐剂配制物时指的是组合物不含佐剂或免疫调节剂能够发挥可测量的辅助或免疫调节作用的量的所述额外的佐剂或免疫调节剂。

术语‘基本上不含皂苷’、‘大体上不含皂苷’等指的是组合物不含皂苷能够发挥可测量的辅助或免疫调节作用的量的皂苷。在某些实施方案中，基本上不含皂苷的组合物含有不足以引起全身性免疫反应(诸如发热)的量的皂苷。在某些实施方案中，基本上不含皂苷的组合物不含皂苷或含有检测极限或检测极限以下的皂苷。

类似地，术语‘基本上不含CpG脱氧核糖核苷酸’、‘大体上不含CpG脱氧核糖核苷酸’等指的是组合物不含CpG脱氧核糖核苷酸能够发挥可测量的辅助或免疫调节作用的量的CpG脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，基本上不含CpG脱氧核糖核苷酸的组合物不含CpG脱氧核糖核苷酸或含有检测极限或检测极限以下的CpG脱氧核糖核苷酸。术语‘基本上不含CpG脱氧核糖核苷酸’、‘大体上不含CpG脱氧核糖核苷酸’等尤其排除抗原中天然存在CpG脱氧核糖核苷酸的疫苗。

术语‘免疫刺激分子’指的是增强免疫反应的分子。

术语‘脂质体’指的是由围合水性隔室的脂质双层形成的微小球形颗粒。

术语‘肠胃外施药’指的是通过不包括消化道在内的途径向受试者体内引入诸如疫苗的物质。肠胃外施药包括皮下、肌肉内、经皮、皮内、腹膜内、眼内和静脉内施药。

术语‘治疗有效量’和‘有效量’指的是在接受抗原或疫苗的受试者体内诱发免疫反应的抗原或疫苗的量，此量足以预防或减轻由病原体(诸如病毒或细菌)感染引起的疾病征象或症状，包括对健康不利的作用或其组合。可诱发体液免疫或细胞介导的免疫，或诱发体液免疫和细胞介导的免疫两者。例如可以间接通过测量抗体效价、淋巴细胞增生分析、IFNγ ELISPOT分析、细胞毒性T细胞分析或直接通过监控野生型菌株攻毒后的征象和症状来评估疫苗在动物体内的免疫原性和疗效。例如可以通过测量临床征象的减少来评估疫苗所赋予的保护性免疫，所述临床征象诸如死亡率、发病率、发热、病毒血症、对临床病理、总体身体状况和总体健康状况的影响以及受试者的表现。治疗有效的疫苗量可视所用的特定佐剂、所用的特定抗原或受试者的病况而变化，并且可以由本领域技术人员来确定。

在某种程度上，本发明提供含有内部隔室和外膜的脂质体。脂质体可具有50和500nm之间的平均粒度。在某些非限制性实施方案中，脂质体的平均粒度为100nm至500nm，或150nm至450nm，或150nm至250nm，或300nm至400nm，或250nm至300nm。在某些实施方案中，膜包含季胺化合物、磷脂、固醇和糖脂。在某些实施方案中，脂质体基本上不含皂苷。

在某些实施方案中，外膜基本上由季胺化合物、磷脂、固醇和糖脂组成或由季胺化合物、磷脂、固醇和糖脂组成。在其它实施方案中，脂质体的外部隔室不含任何免疫刺激性寡核苷酸和/或其它免疫调节性化合物。因此，在所述实施方案中，脂质体基本上由内部隔室组成或由内部隔室组成，所述内部隔室基本上由免疫惰性的水性载体组成或由免疫惰性的水性载体组成，所述内部隔室周围为基本上由季胺化合物、磷脂、固醇和糖脂组成或由季胺化合物、磷脂、固醇和糖脂组成的外膜。

季胺化合物为具有四个烃基的铵基化合物。实际上，烃基通常限于烷基或芳基。在一组实施方案中，季胺化合物包含四个烷基链，其中两个为C10-C20烷基，而剩余的两个为C1-C4烷基。在某些实施方案中，季胺为二甲基双十八烷基铵(DDA)溴化物、氯化物或另一种药学上可接受的平衡离子。

固醇共用通常连接至碳-3的一个共同的化学核心，其为具有羟基(OH)的类固醇环结构。脂肪酸取代基的烃链长度不同，通常为16至20个碳原子，且可为饱和或不饱和的。固醇通常含有环结构的一个或多个双键以及连接到环的多个取代基。固醇和它们的脂肪酸酯基本上是不溶于水的。鉴于这些化学类似性，因此共用此化学核心的固醇在用于本发明的疫苗组合物中时将具有类似的特性。固醇在此项技术中众所周知并且可以商业购买。例如，在默克索引(Merck Index)第12版第369页中公开了胆固醇。合适的固醇包括(不限于)β-谷固醇、豆固醇、麦角固醇、麦角钙化醇和胆固醇。

合适的糖脂通常为活化Th2反应的那些糖脂。糖脂包括(不限于)式I涵盖的并且通常在美国专利公布20070196384(Ramasamy等人)中描述的那些糖脂。

在式I的结构中，R¹和R²独立地为氢，或具有多达20个碳原子的饱和烷基；X为-CH₂-、-O-或-NH-；R²为氢，或具有多达20个碳原子的饱和或不饱和烷基；R³、R⁴和R⁵独立地为氢、-SO₄ ^2-、-PO₄ ^2-、-COC_1-10烷基；R⁶为L-丙氨酰基、L-α-氨基丁基、L-精氨酰基、L-天冬酰胺基、L-天冬氨酰基、L-半胱氨酰基、L-谷氨酰基、L-甘氨酰基、L-组氨酰基、L-羟脯氨酰基、L-异亮氨酰基、L-亮氨酰基、L-赖氨酰基、L-甲硫氨酰基、L-鸟氨酰基、L-苯丙氨酰基、L-脯氨酰基、L-丝氨酰基、L-苏氨酰基、L-酪氨酰基、L-色氨酰基和L-缬氨酰基或其D异构体。

糖脂的实例为(不限于)N-(2-去氧-2-L-亮氨酰基氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基十二酰胺1005或R1005)或其盐(例如，乙酸盐)。

卵磷脂可以通过对未加工的植物油进行水洗，并且分离和干燥所得的水合胶状物而以磷脂和甘油三酸酯的混合物形式获得。可以通过对在通过丙酮洗涤除去甘油三酸酯和植物油之后留下的不溶于丙酮的磷脂和糖脂混合物进行分馏来获得精炼产品。或者，可以由各种商业来源获得卵磷脂。

其它合适的磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、酰基磷脂酰乙醇胺、双磷脂酰甘油、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酸、心磷脂和磷脂酰乙醇胺。磷脂可以由天然来源分离，或照惯例合成。

如本文所述的脂质体使得外膜各要素的比率变得灵活。在某些实施方案中，季铵化合物:固醇:磷脂:糖脂的重量比分别为1:0.75-1.25:1.5-2.5:1.5-2.5。在某些实施方案中，季铵化合物:固醇:磷脂:糖脂的重量比为1:1:2:2。

在其它实施方案中，季铵化合物和固醇的总重量约为糖脂和磷脂的总重量的一半(例如，40％、45％、50％、55％、60％)，其限制条件为季铵化合物占这四种化合物(季铵化合物、固醇、磷脂和糖脂)的总重量的至少约5％w/w，且所述糖脂为这四种化合物的总重量的至少约20％w/w。

在某些实施方案中，季铵化合物和固醇的总重量为糖脂和磷脂的总重量的约10-40％(例如，约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约33.3％、约35％、约40％)，其限制条件为季铵化合物占这四种化合物(季铵化合物、固醇、磷脂和糖脂)的总重量的至少约5％w/w，且所述糖脂为这四种化合物的总重量的至少约20％w/w。

在某些实施方案中，可施用免疫有效量的本发明的脂质体作为佐剂。在一些实施方案中，本发明提供一种疫苗组合，其如下文进一步描述包含免疫有效量的佐剂组合物和抗原性组分。

委托人的物种的重量最终表示本发明的佐剂组合物的剂量。

在适合牛、马和成年猪的某些实施方案中，一剂量含有1000至3000μg当量的外膜组分(即，季铵化合物、固醇、磷脂和糖脂的总重量)，或1000至2000μg当量、或1000至1500μg当量、或1300至1800μg当量、或1500至2000μg当量。

由于存在可含有免疫刺激性寡核苷酸、抗原组分、其它免疫调节剂等的内部隔室，因此脂质体组合物的重量可不等于膜组分的重量。使用脂质体膜组分的等效物使得可以均匀给药。其中引用的给药方案确保牛动物接受至少200μg糖脂和约50μg季铵化合物。

在适合绵羊和山羊的某些实施方案中，一剂量含有300至1000μg当量的外膜组分，例如300至500μg当量，或400至500μg当量，或400至1000μg当量，或500至1000μg当量，或600至1000μg当量，或600至800μg当量。

在适合小猪、狗和猫的某些实施方案中，一剂量含有100至400μg当量的外膜组分，或100至200μg当量，或100至150μg当量，或130至180μg当量，或150至200μg当量。

在适合家禽的某些实施方案中，一剂量含有50至200μg当量的外膜组分，或50至100μg当量，或50至75μg当量，或65至90μg当量，或75至100μg当量，或75至150μg当量。

脂质体的内部化合物可含有抗原或其它免疫调节分子。在某些实施方案中，适合内部隔室的所述免疫调节分子包括(不限于)抗原提取物、亚单位、合成物、全细胞或病毒。

在某些实施方案中，活性药物可封装在脂质体内。

可封装的免疫调节剂还包括(不限于)rmLT、MPLA、α-Gal-Cer、霍乱毒素(Choleratoxin)、LPS、脂磷壁酸、聚I:C、鞭毛蛋白、酵母聚糖、甲壳素和改性的甲壳素形式、β-葡聚糖、阿夫立定(avridine)、菊粉和改性的菊粉形式、乙烯苹果酸酐、普朗尼克类(如L121和L141)、CD40激动剂、TLR5激动剂以及任何TLR激动剂、GM-CSF。

在某些实施方案中，脂质体可携带可用作标记的各种分子，包括(不限于)OspA、OspC、百日咳杆菌粘附素和其它分子。

在某些实施方案中，本发明的佐剂组合物还包含免疫刺激性寡核苷酸，诸如CpG寡脱氧核糖核苷酸或免疫刺激性寡核糖核苷酸(ORN)，或其嵌合体。在SEQ ID NO 1-10中说明CpG寡脱氧核糖核苷酸的合适的非限制性实例，在SEQ ID NO 11-13中提供ORN的合适的非限制性实例，并且在SEQ ID NO:14中提供嵌合免疫刺激性寡核苷酸的合适的非限制性实例。

在一些实施方案中，这些免疫刺激性寡核苷酸存在于脂质体的内部隔室。

在某些实施方案中，免疫调节性寡核苷酸与脂质体的外表面相联结。此联结可归功于氢键、静电键、亲脂键、范德华力(Van der Waals force)等。

在某些实施方案中，带负电荷的免疫刺激性寡核苷酸由于与季铵化合物中带正电的季氮原子相互作用而与脂质体的外表面相联结。

CpG寡脱氧核糖核苷酸(也称为CpG脱氧核糖核苷酸或CpGODN)是最近描述的一类药物治疗剂，其特征在于在特异性的碱基序列情形中存在未甲基化的CG二核苷酸(CpG基元)。(Hansel TT,Barnes PJ(编):New Drugs for Asthma,Allergy and COPD.ProgRespir Res.Basel,Karger,2001,第31卷，第229-232页，其以引用方式并入本文中)。这些CpG基元在真核生物DNA中不可见，CG二核苷酸在真核生物DNA中受到抑制，而且当存在时通常是甲基化的，但在其赋予免疫刺激特性的细菌DNA中存在。

在某些实施方案中，本发明的佐剂利用所谓的P类免疫刺激性寡核苷酸，更优选的是改性的P类免疫刺激性寡核苷酸，甚至更优选的是E改性的P类寡核苷酸。P类免疫刺激性寡核苷酸是以存在回文序列为特征的CpG寡脱氧核糖核苷酸，通常长度为6至20个核苷酸。P类寡核苷酸能够体外和/或体内自发地自组装成多联体。这些寡核苷酸严格意义上为单股的，但存在回文序列使得可以形成多联体或可能形成茎环结构。P类免疫刺激性寡核苷酸的总长度在19至100个核苷酸之间，例如19至30个核苷酸、30至40个核苷酸、40至50个核苷酸、50至60个核苷酸、60至70个核苷酸、70至80个核苷酸、80至90个核苷酸、90至100个核苷酸。

在本发明的一个方面，免疫刺激性寡核苷酸含有5'TLR活化结构域和至少两个回文区，一个回文区为长度为至少6个核苷酸的5'回文区并且直接或通过间隔子连接至长度为至少8个核苷酸的3'回文区。

P类免疫刺激性寡核苷酸可根据本领域中已知的技术来改性。例如，J-改性指的是碘改性核苷酸。E-改性指的是乙基改性核苷酸。因此，E-改性P类免疫刺激性寡核苷酸是P类免疫刺激性寡核苷酸，其中至少一个核苷酸(优选为5’核苷酸)是乙基化的。其它改性包括连接6-硝基-苯并咪唑、O-甲基化、用丙炔基-dU改性、肌苷改性、2-溴乙烯基连接(优选与尿苷连接)。

P类免疫刺激性寡核苷酸也可以含有经改性的核苷酸间键联，包括(不限于)磷酸二酯键联和硫代磷酸酯键联。本发明的寡核苷酸可合成或由商业来源获得。

P类寡核苷酸和改性的P类寡核苷酸在2008年6月12日公布的PCT公布申请no.WO2008/068638中进一步公开。下文提供改性的P类免疫刺激性寡核苷酸的合适的非限制性实例(在SEQ ID NO 1-10中，“*”指的是硫代磷酸酯键且“_”指的是磷酸二酯键)。在SEQID NO 11-14中，所有键都是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键。

用于佐剂组合物中的免疫刺激性寡核苷酸的剂量最终取决于预期的物种。

例如，在适合牛、绵羊或成年猪的某些实施方案中，一剂量的本发明的佐剂组合物将包含约50与400μg之间(例如，对于成年猪来说为50至300μg、或100至250μg、或约50至约100μg，并且对于牛来说为约100至约250μg)的免疫刺激性寡核苷酸。

在适合宠物或小猪的某些实施方案中，一剂量的本发明的佐剂组合物将包含约5与100μg之间(例如，10至80μg或20至50μg)的免疫刺激性寡核苷酸。

在适合家禽的某些实施方案中，一剂量的本发明的佐剂组合物将包含约0.1与约5μg之间(例如，0.5至3μg或0.9至1.1μg)的免疫刺激性寡核苷酸。

本领域中众所周知制造脂质体的方法。简单来说，将脂质体组分并混合在有机溶剂(例如二氯甲烷)中，然后通过干燥除去溶剂以产生薄膜。薄膜稍后使用任选地含有将合并到脂质体内部隔室中的化合物的水性介质(例如，水或缓冲剂)再水合。在不同的实施方案中，化合物可包括免疫刺激性寡核苷酸、其它免疫调节剂和/或抗原组分。

再水合步骤后进行超声波处理和/或挤压以减小在再水合步骤期间形成的囊泡的大小。

主要有两种超声波处理的技术：探针/尖端超声波处理和浴式超声波处理。探针/尖端超声波处理具有高能输入，导致产生大量热量，因此有必要使用冰浴来维持脂质体分散液的温度，以防止脂质降解。或者，可使用浴超声发生器间接地对脂质体悬浮液赋予超声波能量，其中温度更易于控制，但能量损失相对更高。超声波处理通常产生小囊泡(约10nm)，所述囊泡随时间自发融合来释放高膜曲率的应力。

挤压方法包括使脂质体悬浮液通过具有确定孔径的膜。此方法的有利之处是由于确定的孔径促使脂质体群体中粒度的均匀性，尽管在低于脂质转变温度下挤压可能由于膜坚硬而比较困难。脂质体悬浮液常经过多次挤压来实现最终产品的低多分散性。

可能需要制备脂质体的储存稳定性制剂。在某些实施方案中，所述脂质体的储存稳定性制剂是通过冷冻干燥产生的。简单来说，使上述干燥薄膜在含有诸如蔗糖、海藻糖或其组合的冷冻保护剂和冻干保护剂的水性缓冲剂中再水合。在其它实施方案中，在再水合步骤之后添加冷冻保护剂和冻干保护剂。然后使用本领域中众所周知的技术使再水合制剂冻干。得到的冻干制剂是储存稳定的。需要时，可用合适的缓冲剂再水合。

可以在冷冻干燥之前或在最终的制备时添加其它免疫调节剂，包括(不限于)免疫刺激性寡核苷酸和抗原。

在某些实施方案中，在本发明的脂质体复水之后，将抗原与脂质体配制物混合。在其它实施方案中，制备脂质体、其它免疫调节剂和抗原性组分并一起干燥。

在某些实施方案中，本发明的组合物中存在其它免疫刺激性化合物。在本发明的佐剂组合物中，所述其它免疫刺激性化合物可存在于脂质体的内部隔室中，和/或与脂质体的外表面相联结，和/或与脂质体各不相干。

所述其它免疫刺激性化合物的合适的非限制性实例包括(但不限于)几类佐剂，诸如矿物盐，例如明矾、氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙；表面活性剂和微粒，例如非离子性嵌段聚合物表面活性剂、病毒体、皂苷(例如，Quil A、QS-21和GPI-0100)、蛋白酶体、免疫刺激复合物、螺旋体、吡啶、维生素A、维生素E；细菌产品，诸如RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)的细胞壁支架胞壁酰二肽(MDP)和三肽(MTP)、单磷酰脂质A(MPLA)、卡介苗(Bacillus Calmete-Guerin，BCG)、热不稳定大肠杆菌肠毒素、霍乱毒素、海藻糖二霉菌酸酯、细胞激素和激素，例如白介素(IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、脱氢表雄酮、1,25-二羟基维生素D₃；聚阴离子，例如葡聚糖；聚丙烯酸化物(例如，聚甲基丙烯酸甲酯、)；载剂，例如破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱毒素B亚单位、产肠毒素大肠杆菌的突变体热不稳定性肠毒素(rmLT)、热休克蛋白；水包油乳液，例如(Hydronics,USA)；聚阳离子载体(例如，DEAE Dextran或QAE Dextran)和油包水乳液，诸如弗氏完全和不完全佐剂(Freund's complete and incomplete adjuvant)。

其它合适的免疫调节剂包括α-Gal-Cer.LPS、脂磷壁酸、聚I:C、鞭毛蛋白、酵母聚糖、甲壳素和改性甲壳素形式、β-葡聚糖、阿夫立定、菊粉和改性菊粉形式、乙烯苹果酸酐、普朗尼克类(如L121和L141)、CD40激动剂、TLR5激动剂以及任何TLR激动剂。

抗原和疾病

在某些实施方案中，本发明的脂质体佐剂组合物可与抗原性组分合并，由此形成本发明的疫苗组合物。本发明的疫苗的抗原性组分可存在于脂质体的内部隔室中，和/或与脂质体的外表面相联结，和/或与脂质体各不相干。

在某些实施方案中，疫苗组合物大体上不含皂苷。在其它实施方案中，疫苗组合物基本上不含CpG脱氧核糖核苷酸。

如果疫苗中的抗原含有尽管靶向TLR7/8但仍具有免疫刺激性的完整ssRNA病毒((+)ssRNA或(-)ssRNA病毒)序列，那么其中疫苗组合物基本上不含CpG脱氧核糖核苷酸的实施方案是优选的。所述TLR 7/8刺激性序列包括富含聚U或GU的ssRNA序列。Heil F,HemmiH.等人,2004.Science 303(5663):1526-9。Diebold SS.,Kaisho T.等人,2004.Science303(5663):1529-31。

含有所述序列的病毒包括(不限于)不同的流感病毒(例如，牛流感病毒、犬流感病毒、马流感病毒、猪流感病毒等)。在尤其优选的实施方案中，基本上不含CpG ODN的疫苗的抗原性组分含有流感病毒。

在不同的示例性实施方案中，抗原性组分可包括牛抗原、山羊抗原、猪抗原、家禽抗原、马抗原、犬抗原、马抗原和猫抗原。

抗原可为能在受试者体内产生所需免疫反应的任意多种物质，包括(不限于)以下个别地或其任何组合中的一种或多种：病毒(灭活、减毒和改性活病毒)、细菌、寄生虫、核苷酸(包括(不限于)核酸基抗原，例如DNA疫苗或mRNA疫苗)、聚核苷酸、肽、聚肽、重组蛋白、合成肽、蛋白提取物、细胞(包括肿瘤细胞)、组织、多糖、碳水化合物、脂肪酸、脂磷壁酸、肽聚糖、脂质或糖脂。

用于本发明的佐剂中的抗原还包括可由本文中提及的生物体分离或化学或生物制造的核苷酸、聚核苷酸、肽、聚肽的免疫原性片段。

在受试者体内不会引起疾病的活的、改性活的以及减毒的病毒菌株已以非毒性形式分离或已使用本领域中众所周知的方法减毒，所述方法包括在合适的细胞系中连续传代或暴露于紫外光或化学突变原。灭活或被杀死的病毒菌株是由本领域技术人员已知的方法灭活的那些病毒菌株，所述方法包括用福尔马林(formalin)、β-丙内酯(BPL)、过氧化物、双乙烯亚胺(BEI)、杀菌照射、热量或其它此类方法处理。

可合并两种或两种以上的抗原来产生可保护受试者以免由病原体引起的多种疾病的多价组合物。目前，疫苗的商业制造商以及终端用户更青睐多价疫苗产品。尽管常规的佐剂在其可有效使用(单价或多价)的各种抗原中常受到限制，但本文所述的佐剂可与多种单价和多价的抗原有效地一起使用。因此，本文所述的抗原可合并在包含本文所述佐剂的单一组合物中。

可作为抗原与本文所述的佐剂组合物一起使用的细菌的实例包括(但不限于)醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、巴斯鲁安那醋酸杆菌(Acetobacterpaseruianus)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、闪烁古生球(Arhaeglobus fulgidus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophillus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、热链形芽孢杆菌(Bacillus thermocatenulatus)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、荚壳伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaglumae)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、胚胎弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、猪肠弯曲杆菌(Campylobacter hyointestinalis)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、衣原体属(Chlamydophila spp.)、染色粘性菌(Chromobacterium viscosum)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathieae)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、犬埃里希体(Ehrlichia canis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、猪螺杆菌(Helicobacter suis)、胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、莫拉克斯氏菌属(Moraxellsa sp.)、牛型结核分枝杆菌(Mycobactrium bovis)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、丝状支原体亚属(Mycoplasma mycoides subsp.，丝状亚种LC)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、小齿紫单胞菌(Odoribacter denticanis)、溶血巴氏杆菌(Pasteurellahaemolytica)(溶血曼海姆菌(Mannheimiahaemolytica))、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、发光杆菌(Photorhabdus luminescens)、咽喉卟啉单胞菌(Porphyromonas gulae)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、唾液卟啉单胞菌(Porphyromonas salivosa)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、威斯康辛假单胞菌(Pseudomonas wisconsinensis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens C9)、荧光假单胞菌SIKW1、莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)、浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)、食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)、假单胞菌属B11-1、真养产碱杆菌(Alcaligeseutrophus)、静止嗜冷杆菌(Psychrobacter immobilis)、普氏立克次体(Rickettsiaprowazekii)、立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、所有血清型肠道沙门氏菌(Salmonella enterica all serovars)、包括例如：鼠伤寒肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica Typhimurium)、邦戈肠道沙门氏菌(Salmonella enterica Bongori)、都柏林肠道沙门氏菌(Salmonella enterica Dublin)、猪霍乱肠道沙门氏菌(Salmonella entericaCholeraesuis)和纽波特肠道沙门氏菌(Salmonella enterica Newport)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、螺旋藻(Spirluina platensis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)、白色链霉菌(Streptomyces albus)、肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、猪型链球菌(Streptococcus suis)、脱叶链霉菌(Streptomyces exfoliates)、疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)、集胞藻属(Syechocystis sp.)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、微小密螺旋体(Treponemaminutum)、蚀疮溃疡密螺旋体(Treponema phagedenis)、屈曲密螺旋体(Treponemarefringens)、奋森密螺旋体(Treponema vincentii)、梅毒螺旋体(Treponemapalladium)、化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes)和钩端螺旋体(Leptospira)物种，诸如已知的病原体犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、感冒伤寒型钩端螺旋体(Leptospira grippotyposa)、哈德焦钩端螺旋体(Leptospira hardjo)、博氏哈德焦-牛钩端螺旋体(Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis)、博氏哈德焦-普拉伊特诺钩端螺旋体(Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno)、问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)、黄疸出血型钩端螺旋体(Leptospira icterohaemorrhagiae)、波摩那钩端螺旋体(Leptospira pomona)和伯拉第斯拉瓦钩端螺旋体(Leptospira bratislava)和其组合。

灭活病毒和减毒活病毒二者都可以用在佐剂组合物中。可用作抗原的病毒的一些实例包括(但不限于)禽疱疹病毒、牛疱疹病毒、犬疱疹病毒、马疱疹病毒、猫病毒性鼻气管炎病毒、马立克氏病病毒(Marek's disease virus)、绵羊疱疹病毒、猪疱疹病毒、猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea virus，PEDv)、假狂犬病病毒、禽副粘病毒、牛呼吸道合胞病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒、犬细小病毒、牛副流感病毒3、绵羊副流感3、牛瘟病毒、边界病病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、I型BVDV、II型BVDV、典型猪瘟病毒、禽白血病病毒、牛免疫缺陷病毒、牛白血病病毒、牛肺结核、马传染性贫血病毒、猫免疫缺陷病毒、猫白血病病毒(FeLV)、新城疫病毒、绵羊进行性肺炎病毒、绵羊肺腺癌病毒、犬冠状病毒(CCV)、泛嗜性CCV、犬呼吸道冠状病毒、牛冠状病毒、猫杯状病毒、猫肠冠状病毒、猫传染性腹膜炎,病毒、猪流行性腹泻病毒、猪血球凝集性脑脊髓炎病毒、猪细小病毒、I型猪圆环病毒(PCV)、II型PCV、猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)病毒、传染性胃肠炎病毒、土耳其冠状病毒、牛流行热病毒、狂犬病、轮状病毒、水疱性口炎病毒、慢病毒、禽流感、犀牛病毒、马流感病毒、猪流感病毒、犬流感病毒、猫流感病毒、人类流感病毒、东方马脑炎病毒(EEE)、委内瑞拉马脑炎病毒、西尼罗病毒、西方马脑炎病毒、人类免疫缺陷病毒、人类乳突状病毒、水痘带状疱疹病毒、肝炎B病毒、鼻病毒和麻疹病毒和其组合。

肽抗原的实例包括支气管炎博德特菌p68、GnRH、IgE肽、Fel d1和癌症抗原和其组合。其它抗原的实例包括核苷酸、碳水化合物、脂质、糖脂、肽、脂肪酸、脂磷壁酸和磷壁酸以及肽聚糖和其组合。

在本文所述的佐剂组合物中可用作抗原的寄生虫的实例包括(但不限于)红孢子虫属(Anaplasma)、肝片吸虫(Fasciola hepatica)(肝吸虫)、球虫亚纲(Coccidia)、艾美耳球虫属(Eimeria spp.)、犬新孢子虫(Neospora caninum)、刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)、贾第鞭毛虫属(Giardia)、恶丝虫属(Dirofilaria)(犬恶丝虫)、钩虫属(Ancylostoma)(钩虫)、古柏线虫(Cooperia)、捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)(捻转胃虫(Barber pole worm))、奥氏奥斯特线虫(Ostertagia ostertagi)(胃线虫)、胎生网尾线虫(Dictyocaulus viviparous)(肺线虫)、锥虫属(Trypanosoma spp.)、利什曼原虫属(Leishmania spp.)、毛滴虫属(Trichomonas spp.)、隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)、巴倍虫属(Babesia)、血吸虫属(Schistosoma)、绦虫属(Taenia)、类圆线虫属(Strongyloides)、蛔虫属(Ascaris)、旋毛虫属(Trichinella)、肉孢子虫属(Sarcocystis)、哈蒙属(Hammondia)和等孢子球虫属(Isopsora)和其组合。还涵盖外部寄生虫，包括(但不限于)扁虱，包括硬蜱属(Ixodes)、扇头蜱属(Rhipicephalus)、革蜱属(Dermacentor)、花蜱属(Amblyomma)、牛蜱属(Boophilus)、璃眼蜱属(Hyalomma)和血蜱属(Haemaphysalis)物种和其组合。

用于诱发免疫反应的抗原的量可视所用抗原、受试者和所需反应的磷脂水平而显著变化，并且可由本领域技术人员来确定。对于含有改性活病毒或减毒病毒的疫苗而言，抗原的治疗有效量通常在约10²组织培养感染剂量(TCID)₅₀至约10¹⁰TCID₅₀(包含在内)的范围内。对于多种此类病毒而言，治疗有效剂量通常在约10²TCID₅₀至约10⁸TCID₅₀(包含在内)的范围内。在一些实施方案中，治疗有效剂量的范围为约10³TCID₅₀至约10⁶TCID₅₀(包含在内)。在一些其它实施方案中，治疗有效剂量的范围为约10⁴TCID₅₀至约10⁵TCID₅₀(包含在内)。

对于含有灭活病毒的疫苗而言，抗原的治疗有效量通常为每剂量至少约100相对单位，且通常在每剂量约1,000至约4,500相对单位的范围内(包含在内)。在其它实施方案中，抗原的治疗有效量在每剂量约250至约4,000相对单位的范围内(包含在内)、在每剂量约500至约3,000相对单位的范围内(包含在内)、在每剂量约750至约2,000相对单位的范围内(包含在内)或在每剂量约1,000至约1,500相对单位的范围内(包含在内)。

含有灭活病毒的疫苗中的抗原的治疗有效量也可以根据每mL的相对效能(RP)来测量。治疗有效量通常在每mL约0.1至约50RP的范围内(包含在内)。在其它实施方案中，抗原的治疗有效量在每mL约0.5至约30RP的范围内(包含在内)、在每mL约1至约25RP的范围内(包含在内)、在每mL约2至约20RP的范围内(包含在内)、在每mL约3至约15RP的范围内(包含在内)或在每mL约5至约10RP的范围内(包含在内)。

在疫苗中施用的细菌抗原的细胞数量在每剂量约1×10⁶至约5×10¹⁰个集落形成单位(CFU)(包含在内)的范围内。在其它实施方案中，细胞的数量在每剂量约1×10⁷至5×10¹⁰个CFU(包含在内)、或每剂量约1×10⁸至5×10¹⁰个CFU(包含在内)的范围内。又在其它实施方案中，细胞的数量在每剂量约1×10²至5×10¹⁰个CFU(包含在内)、或每剂量约1×10⁴至5×10⁹个CFU(包含在内)、或每剂量约1×10⁵至5×10⁹个CFU(包含在内)、或每剂量约1×10⁶至5×10⁹个CFU(包含在内)、或每剂量约1×10⁶至5×10⁸个CFU(包含在内)、或每剂量约1×10⁷至5×10⁹个CFU(包含在内)的范围内。

在疫苗中施用的寄生虫抗原的细胞数量在每剂量约1×10²至约1×10¹⁰个(包含在内)的范围内。在其它实施方案中，细胞的数量在每剂量约1×10³至约1×10⁹个(包含在内)、或每剂量约1×10⁴至约1×10⁸个(包含在内)、或每剂量约1×10⁵至约1×10⁷个(包含在内)、或每剂量约1×10⁶至约1×10⁸个(包含在内)的范围内。

赋形剂

佐剂配制物和/或疫苗组合物可包括药学上可接受的载剂。如本文中所用，“药学上可接受的载剂”包括任何及所有溶剂、分散介质、涂料、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂等。就与组合物中其它组分的相容性且对受试者无害的意义而言，载剂必须是“可接受的”。载剂通常将是无菌的且不含热原，并且基于将使用的施药模式来选择。本领域技术人员众所周知，包含组合物的药学上可接受的载剂的优选配制物为在美国(US)农业部(the United States Department of Agriculture)或美国食品及药物管理局(US Food and Drug Administration)或非美国国家的同等政府机构颁布的适用规则中批准的那些药学载剂。因此，用于商业生产所述组合物的药学上接受的载剂为已由美国或外国国家的适当政府机构批准或将为其所批准的载剂。

组合物的施药

组合物的剂量大小视受试者和抗原而定通常在约1mL至约5mL(包含在内)的范围内。例如，对于犬或猫来说，通常使用约1mL的剂量，而牛通常使用约2至5mL的剂量。然而，这些佐剂也可以配制成微剂量，其中可使用约100μL的剂量。

佐剂组合物的施药途径包括肠胃外、经口、口鼻、鼻内、气管内、皮下、肌肉内、经皮、皮内、腹膜内、眼内、静脉内施药和卵细胞内施药。可使用任何合适的装置来施用组合物，包括注射器、点滴器、无针注射装置、膏药等。选择使用的途径和装置将取决于佐剂组合物、抗原和受试者并且这些是本领域技术人员众所周知的。

组合物的使用

本文所述的佐剂配制物易于制造且在4℃下稳定至少18个月。配制物在4℃下例如可稳定约18个月或约18至约24个月。在另一个实施方案中，配制物在4℃下稳定至少约24个月。加速试验程序也表明，本文所述的配制物在37℃下稳定至少两周，对应于在4℃下的约24个月。

本文所述的佐剂组合物可以安全有效地施用于多种受试者。已令人惊讶地发现，本文所述的佐剂组合物与其它佐剂组合物相比展示安全性改良。

提出以下实施例作为说明性实施方案，但不应认为是限制本发明的范畴。对于本发明的多种改变、变化、改进及其它用途和应用将为本领域技术人员所显而易见。

实施例

实施例1-表征脂质体

将DCRL脂质体(含有DDA、胆固醇、R1005和卵磷脂)调整成DDA、胆固醇、R1005和大豆卵磷脂的最终浓度分别为50、50、100和100μg/mL。

将化合物添加至250mL圆底烧瓶中并使用1mL Solvent Safe^TM吸管头(Sigma-Aldrich)用无水级氯仿(Sigma-Aldrich,Poole,Dorset,UK)填充至5mL的最终体积。在55℃下在真空下(KNF Neuberger,Witney,Oxfordshire,UK)使用旋转蒸发仪(Büchi,Flawil,Switzerland)持续1小时去除溶剂直到形成干燥的白色脂质薄膜。用来自包括逆向渗透以达到超高纯度的内部改性选项3(ELGA LabWater,Wycombe,Buckinghameshire,UK)的双蒸水(ddH₂O)或用由含有ddH₂O的锭剂复水的磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS；Sigma-Aldrich)使脂质体再水合。

再水合之后，用1mL的宽孔吸管头(VWR,Lutterworth,Leicestershire,UK)处理脂质体以减少剪应力。然后将脂质体悬浮液在浴(Sarose Scientific Instruments,Perivale,Middlesex,UK)中超声波处理1小时和/或使用装配有两个1mL注射器的微型挤压机单元通过100nm的聚碳酸酯核孔径迹蚀刻膜(Sigma-Aldrich)挤压至多3次。聚碳酸酯膜侧翼为10mm的漏斗架。

经过超声波处理的DCRL脂质体(1.14μm平均直径)显著大于经过挤压的脂质体(5.44倍)。与经过挤压的样本(209.6nm)相比，在超声波处理后紧接进行挤压并不显著影响囊泡大小。经挤压脂质体的多分散性低于经超声波处理脂质体的2.10倍。与经过挤压的脂质体相比，超声波处理与挤压组合使DCRL多分散性增加1.42倍。

为评估脂质体在水性溶液中的胶体稳定性，历经4周时间评估在ddH₂O中水合的DCRL脂质体。值得注意的是，在4℃下2年的大致热力学当量在37℃下储存4周，由此促使评估产品在4℃和37℃下的稳定性。评估空的(“-ODN”)DCRL脂质体和负载有示例性的免疫刺激性寡核苷酸CpG ODN(“+ODN”)的DCRL脂质体来确定阴离子性核酸对阳离子性脂质体胶体稳定性的影响。此处，通过用ddH₂O和ODN的溶液使脂质薄膜再水合来负载ODN。在ddH₂O中水合的DCRL脂质体的尺寸和多分散性(177nm,0.24)在统计学上与在PBS中水合的DCRL脂质体的尺寸和多分散性(210nm,0.17)类似。

在4℃下，+/-ODN DCRL脂质体的直径在28天后分别经历1.10倍和1.01倍的不明显增加。含有ODN的脂质体(+ODN脂质体)(417nm)显著大于不含ODN的脂质体(-ODN脂质体)(177nm)。类似地，+/-ODN脂质体的多分散性在28天后分别适当地减少1.08倍和1.03倍，尽管+ODN脂质体在第28天时的多分散性显著高于-ODN对应物(1.23倍)。

相反，在37℃下储存28天后，观察到脂质体的聚集行为。+/-ODN脂质体的直径在28天后分别显著增加3.24倍和2.00倍，但在21天后稳定。尽管由于ODN调节电荷补偿和丧失胶体稳定性，+ODN脂质体比-ODN脂质体大(在第28天时为1.46倍)，随时间变化的稳定性趋势定性地类似。然而，+ODN脂质体在7天后出现不稳定，而在-ODN脂质体中，直到第14天后仍维持稳定性。另外，+/-ODN脂质体的多分散性28天后在统计学上类似，多分散性与第0天的囊泡相比分别显著减小1.92倍和1.50倍。

这些结果表明需要研发用于保存脂质体的技术，而且也表明产生初始较小脂质体尺寸的更强大超声波处理和/或挤压技术可补偿脂质体的初始聚集。

对使用微流体化(Microfluidics Corp.,Model 110EH)和超声波处理制备的脂质体的大小进行比较。当用微流体化代替超声波处理步骤后，配制物产生平均直径约59nm的脂质体。

这些结果证实，使用微流体化制备的脂质体可使可能由添加ODN或ORN引起的脂质体聚集降到最低程度。

实施例2-冻干脂质体的稳定性

使用Dura-Stop冷冻干燥机(SP Scientific,Ipswich,Suffolk,UK)进行冻干。在冻干之前，将样本填充至10mL管状I型玻璃冷冻干燥小瓶(Schott,Stafford,Staffordshire,UK)中。冻干循环参数如下。将样本在5℃下冷冻30分钟、在-5℃下冷冻30分钟并在-40℃下冷冻60分钟，全部都以1.00℃/min的升温速度。进行初步干燥，在-37℃下持续59分钟、在-28℃下持续59分钟、在-23℃下持续59分钟并在-21℃下持续552分钟，全部都以0.50℃/min的升温速度。在20℃下持续360分钟以0.10℃/min的升温速度进行二次干燥。全部干燥都在57毫托(mTorr)的腔室压力下进行。在57毫托下进行交替初始干燥循环，在-38℃下持续59分钟、在-38℃下持续59分钟、在-37℃下持续59分钟并在-35℃下持续552分钟，全部都以0.50℃/min的升温速度。用14mm药品级丁基橡胶冻干塞(Fisher Scientific,Loughborough,Leicestershire,UK)和石蜡膜(Sigma-Aldrich)密封冻干样本。

将冻干保护剂D-甘露糖醇、D-(+)-葡萄糖、D-(-)-果糖、蔗糖、D-(+)-海藻糖二水合物(Sigma-Aldrich)或D(+)-甘露糖(Acros Organics)溶解于ddH₂O或PBS中，并且在如所示的冻干之前添加至脂质体悬浮液中直到2-4％w/v的最终浓度。

在不存在糖时，经ddH₂O-和PBS-再水合的脂质体在冻干之前为约210nm。不具有冻干保护剂时，冻干使得经ddH₂O-和PBS-再水合的样本中的脂质体尺寸分别增加3.55倍和6.05倍。在添加3％蔗糖、4％甘露糖醇或其组合后，在ddH₂O或PBS中再水合的DCRL脂质体并未发生显著的尺寸变化，证实在冻干后所观测到的聚集并非是直接由添加冻干保护剂所引起的。

对于在PBS中再水合的脂质体而言，只有在冷冻循环后不含冻干保护剂的样本中的脂质体尺寸显著增加(2.00倍)。然而，在整个冻干循环后，对于不含冻干保护剂、具有3％蔗糖、4％甘露糖醇和其组合的样本来说，脂质体尺寸分别显著增加6.05倍、3.03倍、5.15倍和4.13倍。类似地，对于不含冻干保护剂、具有3％蔗糖、4％甘露糖醇和其组合的DCRL来说，多分散性与冻干前的对照物相比分别显著增加2.61倍、2.61倍、2.85倍和2.79倍。

对于在ddH₂O中再水合的脂质体而言，不含冻干保护剂和具有4％甘露糖醇的脂质体在冷冻循环后的囊泡尺寸分别比冻干前的对照物显著增加17.90倍和11.45倍，而具有3％蔗糖或3％蔗糖与4％甘露糖醇组合的脂质体的变化可以忽略。在整个冻干循环后，对于不含冻干保护剂、具有3％蔗糖、具有4％甘露糖醇和具有其组合的样本来说，脂质体尺寸分别适当地变化3.55倍、0.88倍、3.48倍和1.47倍。

这些发现证实，如冻干后未变化的囊泡尺寸所说明的，在ddH₂O中再水合的脂质体比在PBS中再水合的脂质体具有更佳的胶体稳定性，而且对于赋予良好的胶体稳定性而言，3％的蔗糖可能是一种更理想的冻干保护剂。

为了最优化经ddH₂O再水合的DCRL脂质体的冻干流程，评估6种已知的糖冻干保护剂(个别和组合)在2％w/v时对囊泡尺寸和多分散性的影响。

试验蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、海藻糖、果糖和甘露糖作为冻干保护剂。只有2％的甘露糖醇作为冻干保护剂使囊泡尺寸(39.66倍)和多分散性(2.95倍)显著增加。然而，尽管用所有其它糖进行冻干并未导致适当的尺寸变化，但用葡萄糖、果糖和/或甘露糖冻干保护的产品塌陷成不可渗透的致密糖层和脂质体而难以再水合。与文献中一致，用蔗糖或海藻糖冻干保护的脂质体防止粒度变化且产生饼块，所述饼块可以复水成具有良好胶体稳定性的脂质体分散液。

也用糖组合来冻干DCRL。此研究证实只有2％蔗糖、2％海藻糖和2％蔗糖/2％海藻糖支持冻干后良好的胶体稳定性并且实现医药学上简洁的饼块结构。然而，就脂质体尺寸稳定性和多分散性而言，2％蔗糖/2％海藻糖的组合似乎并不优于单独用2％蔗糖或2％海藻糖冻干保护。

实施例3–IBR/BVDV疫苗

据报道，Quil A佐剂在引起全身性免疫反应时常伴随短期发热。相信这种发热与授乳奶牛体内的产奶量下降有关。此研究的目的在于评估不含皂苷的脂质体对由脂质体引起的免疫反应的作用和由佐剂所导致的潜在副作用。

此研究中使用八个月大的荷斯坦(Holstein)雄性小牛。对潜在的试验动物进行血清筛选，并且对于BVDV-1和BVDV-2而言血清中和(SN)效价<1:2的那些试验动物有资格入选用于此研究。另外，如由耳朵穿孔活组织检查和免疫组织化学所确定，动物并非受BVDV持续感染(PI)。将动物圈养于温度和适度受控的环境中并任意接受商业行为和城市系统的水。

研究第0天前约一周开始适应。在装运之前，小牛接受和

研究和相关数据分析中排除由于与研究无关的条件而濒死、受伤或死亡的试验动物。对濒死动物施以安乐死。

在第0天和第28天通过皮下施用2ml如表1中概述的疫苗对动物进行疫苗接种。

表1

在第49天，用2型非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒(菌株24515)对动物进行攻毒。使用压缩气体喷雾器通过鼻内施用5ml(每个鼻孔2.5ml)，每只动物接受每次给药大约4.88Log₁₀TCID₅₀。

在T02-T06组中，抗原性组分含有4500RU/病毒灭活前改性的BVDV1/2和改性的IBR(8.0log₁₀TCID₅₀)。

在第48天，使用压缩气体喷雾器通过鼻内施用5ml(每个鼻孔2.5ml)BVDV-2菌株24515(每次给药4.88Log₁₀TCID₅₀)对动物进行攻毒。

第一次和第二次疫苗接种后的直肠温度最小平方平均值和范围在表2中示出。

表2.对疫苗接种阶段直肠温度的最小平方平均值的分析

具有不同上标的值显著不同(p≤0.10)

一些T02和T07受试者的直肠温度显示在第一次和第二次疫苗接种后当日短暂增加。在第一次疫苗接种后，T02组动物的直肠温度增加显著高于(P≤0.10)其它组(T01、T03、T04、T05、T06和T07)持续1天。

在第一次疫苗接种后，T02组中4/9的动物具有高于103.5℉的温度(三只具有超过104.0℉的温度)。相反，在第一次疫苗接种后第一天，T05组中没有动物的温度超过102.5℉(数据未显示)。

在第二次疫苗接种后，T02和T07的直肠温度增加显著(P≤0.10)高于对照组和疫苗接种组(T03、T04、T05和T06)，然而，直肠温度升高是短暂的(表2)。T02组的个别反应在101.1℉与104.5℉之间的范围内。在第二次疫苗接种后，T02组中5/9的动物具有超过103.5℉的温度(而另一只动物具有103.5℉的温度)。在第二次疫苗接种后，T02组中只有3/9的动物具有低于103.5℉的温度。相反，DCRL配制物均未诱使直肠温度升高到大于103.7℉。T05组中的个别反应在101.4℉与102.6℉之间的范围内(数据未显示)。

在攻毒后的T01组中，8只动物中的8只均观测到发热反应(>104.5℉)；这满足成功攻毒的产出准则。所有疫苗接种组的直肠温度在研究的第53天与对照组相比(攻毒后4天)显著较低(P≤0.10)，而且在后续数日也存在一些差异(数据未显示)。在对照组中，作为对攻毒的响应，观测到直肠温度的典型双相升高。

根据以下计分系统确定攻毒后是否存在临床BVDV疾病(动物必须具有≥2的临床分值)：

0–无临床征象

1–临床征象总体来说对于急性BVD感染而言不具有特异性。临床征象可包括流鼻涕、呼吸异常和轻度嗜睡。

2–临床征象总体来说为中度并且对于急性BVD感染而言具有特异性。临床征象可包括流鼻涕、呼吸异常、嗜睡、消瘦、眼黏分泌物、多涎、腹泻、脱水、跛行和/或活动力降低。

3–临床征象总体来说为重度并且是急性BVD感染所特有的。临床征象可包括流鼻涕、呼吸异常、嗜睡、消瘦、眼黏分泌物、多涎、腹泻、过度瘀伤、脱水、躺卧、跛行和/或活动力降低。

对照组和疫苗接种组之间无显著差别。

白细胞减少症

研究结果符合有效研究的标准，因为100％的T01(对照组)患有白细胞减少症(当使用≥40％下降时)且75％的对照组具有<4000个细胞/μL。与疫苗接种治疗组T02、T03、T04、T05、T06和T07(P≤0.10)相比，在来自T01攻毒后的背景的白细胞中发生白细胞减少症≥40％减少的动物数量之间不存在显著差异。然而，在T01、T02、T03、T04、T05、T06和T07中分别在6/8(75％)、2/9(22.2％)、1/8(12.5％)、3/9(33.3％)、4/9(44.4％)、4/9(44.4％)和0/6中检测到更相关界定的临床白细胞减少症(<4000个细胞/μL)(表3)。T01组中白细胞减少症的持续时间与所有疫苗接种物相比当使用≥40％下降时显著更长(P≤0.10)，且与疫苗接种组T02、T03、T05、T06和T07相比当使用<4000μl时显著更长(P≤0.10)(表4)。

表3白细胞减少症攻毒阶段概述

表4.白细胞减少症的持续时间

具有不同上标的值显著不同(p≤0.10)

病毒血症

所有实验疫苗都防御病毒血症。一些组中为完全保护(T02和T05，两组都含有CpG)，而其它组中为部分保护(T03、T04、T06和T07)。T01中病毒血症动物的数量显著高于T02、T03、T04、T05、T06和T07中的数量(P≤0.10)(表5)。在T02和T05组中未见到病毒血症。然而，与对照组相比时，不含ORN、含有低剂量ORN和高剂量ORN的T03、T04和T06组中病毒血症动物的数量之间存在差异。

表5.病毒分离攻毒阶段概述

具有不同上标的值显著不同(p≤0.10)

T01组的病毒血症持续时间显著大于所有疫苗接种组(T02至T07)(P≤0.1)(表6)。T07的小牛接受包含含有Quil A的佐剂+BVDV-1病毒的重组gp53抗原的疫苗，并且也受到部分保护而且与T01相比具有显著更短的病毒血症持续时间。对于这些小牛而言，攻毒是用不同生物型的BVDV(2型)病毒，这反映出BVDV-1gp53抗原与攻毒菌株之间存在部分交叉保护。

表6阳性病毒脱落的天数

具有不同上标的值显著不同(p≤0.10)

SN效价

在第49天，在攻毒之前，所有T02至T07组的动物对于BVDV-1、BVDV-2均具有SN效价，而只有T02至T06的抗体与IBR抗原比≥1:8。所有疫苗都被认为具有足够的效能，因为它们都满足≥1:8的要求。在第一次和第二次疫苗接种后，对于BVDV-1和2的SN效价的最小平方平均值(第28天和第49天)在表7中示出。所有经过疫苗接种的动物都比对照组具有显著更高的SN效价，而且疫苗接种组的SN效价之间存在显著差异。脂质体疫苗(T03至T06)比由含有Quil A的组合物辅助的疫苗(T02)对于BVDV-1和2诱发显著较低的SN效价。向这些配制物中加入ORNS或CpG并未增强这些反应。由含有Quil A的组合物辅助的gp53疫苗到第49天也对BVDV-1抗原诱发高的SN效价，但对BVDV-2抗原诱发较低的SN效价。T07组的BVDV-1SN效价与T02的效价并无显著不同，但BVDV-2效价显著不同。在BVDV-2攻毒后，所有疫苗接种组的SN效价均增强，而T01组的小牛发生一级抗体反应(第63天)。

表7.最小平方平均值BVDV-1a和BVDV2SN效价

具有不同上标的值显著不同(p≤0.10)

表8最小平方平均值IBR SN效价

具有不同上标的值显著不同(p≤0.10)

注射部位反应

左颈和右颈的最小平方平均值注射部位反应(ISR)在表9和10中示出。在第1天，所有六个疫苗接种组中都发生小幅反应，但减弱了。T02和T07在第29天出现最大反应部位，分别为41.8和16.3。某些天的注射部位反应之间存在显著差异。所有疫苗由于注射部位反应快速解析而是安全的。

表9.注射部位反应的最小平方平均值(左颈)

具有不同上标的值显著不同(p≤0.10)

表10注射部位反应的最小平方平均值(右颈)

具有不同上标的值显著不同(p≤0.10)

细胞介导的免疫

BVDV IFNγ ELISPOT分析在攻毒之前在T01组中具有高背景，且因此被认为不足以证实这些疫苗对此抗原诱发CMI反应(数据未显示)。然而，对于IBR抗原的分析反映出各自疫苗诱发CMI(参见表11-13，对灭活IBR抗原的反应，T02至T06的IBR gB和gD肽回忆反应)。一般来说，最高反应在T02疫苗组和配制物中具有CpG的T05组中。由于攻毒是BVDV病毒攻毒，因此攻毒后的反应并未增强。据推测，疫苗对BVDV抗原诱发类似的CMI反应。

表11

具有不同上标的值显著不同(p≤0.10)

表12

具有不同上标的值显著不同(p≤0.10)

表13

具有不同上标的值显著不同(p≤0.10)

在病毒血症发生和持续期间观测到疫苗作用。所有实验疫苗都防御病毒血症。在一些组中观测到完全保护(含有CpG的T02和T05)，而在其它组中观测到部分保护(T03、T04、T06和T07)。直肠温度分布图显示，与T01对照组相比，治疗组T02和T07在第一次和第二次疫苗接种后一天短暂增加。与具有含有Quil A的佐剂的T02和T07相比，脂质体疫苗诱发直肠温度的较低升高。此含有Quil A的佐剂通常在疫苗接种后即刻诱发温度的单日升高。后者对于奶牛尤为重要，因为伴随疫苗接种的发热常导致不可接受的产奶量下降。脂质体配制物诱发强烈的抗体以及T细胞反应(即使不含其它免疫调节剂的脂质体)。与含有Quil A的疫苗相比，脂质体疫苗诱发对BVDV-1和2及IBR抗原显著较低的SN效价，尽管所达到的水平对于这些各自疾病而言被认为在保护范围以内(BVDV-1SN效价为1:256-512；BVDV-2为±256或更大；IBR SN效价为1:32)。

总之，脂质体配制物为向不仅需要抗体，而且也需要CMI来进行保护的疾病传递灭活抗原提供了一种安全的新选择。所述配制物与含有Quil-A的疫苗在疗效上相当。CpG对疗效的作用是可再现的，然而ORN对于增强针对BVDV攻毒的免疫性而言无效。

实施例4–猪流感病毒

此研究的目的在于评估含有新颖佐剂配制物和免疫调节剂的几种SIV-疫苗(灭活病毒、pH1N1和H3N2)的免疫反应和疗效。通过免疫学参数(体液和细胞)以及通过疗效终点(包括临床征象、病毒血症、病毒脱落和肺病变)来确定疗效。

动物。

使用两种性别的三周大(21+/-3天)小猪进行此研究。动物无暴露于PRRSV猪肺炎支原体的历史。动物或它们的母兽无疫苗接种或暴露于任何SIV血清型的历史。动物在疫苗接种前四至七天到达现场并标准定额喂饲，水随意取食。

在第0天(左颈)和第21天(右颈)用表14的组合物对猪进行疫苗接种并在第35天用H3N2病毒IN/12进行攻毒。

表14.实验设置

*4％角鲨烷碱性亚溶液稀释10倍用于最终产品(0.4％油)

收集血清在第35天和第40天用于血凝抑制(HAI)分析，并且收集全血在第28天、第35天和第40天用于ELISPOT(IFNγ)分析。在第40天(攻毒后5天)将猪处死并对每个脑叶(左颅骨、左中部、左尾部、右颅骨、右中部、右尾部和附属部分)的固结百分比计分并记录为0至100％之间的百分数。

疫苗接种均未导致全身性副作用或不可接受的注射副反应(数据未显示)。

HAI效价在表15中示出。

表15.HI效价(第35天-攻毒前，第40天-攻毒后)

^a具有不同上标的值与T01显著不同(p≤0.10)；未配对T试验，进行魏尔希校正(Welch’s correction)(GraphPad Prism，6.04版)。nd，不可检测；na，不适用。

肺病变分值在表16中示出。

表16肺病变分值概述(第40天)

^a具有不同上标的值与T01显著不同(p≤0.10)；未配对T试验，进行魏尔希校正(GraphPad Prism，6.04版)。NTX是一组未经疫苗接种、未经攻毒的猪。

T04组对于疫苗菌株之一(H1N1)具有最高HAI效价，而T07对于另一种菌株(H3H2)具有最高效价，T02至T08组的效价显著高于T01对照组。

所有疫苗(除T08以外)倾向于在攻毒后5天减少LLS。T06组(TXO)倾向于具有最低的肺病变分值。

表19和20中分别提供流感NP蛋白肽-特异性IFN-γ分泌细胞和完整流感病毒-特异性IFN-γ分泌细胞(二者都由ELISPOT确定)。池中的肽是具有12个氨基酸重叠的16聚体。四个池含有NP肽从N末端(池1)至C末端(池4)的序列。肽的序列在表17和18中提供。表17.用于IFN-γ ELISPOT的NP肽池(池1和2)

表18.用于IFN-γ ELISPOT的NP肽池(池3和4)

表19IFN-γ ELISPOT NP肽池(第40天)

^a具有不同上标的值与T01显著不同(p≤0.10)；未配对T试验，进行魏尔希校正(GraphPad Prism，6.04版)。

NP蛋白在SIV菌株之间通常高度保守，且因此，有效的CMI反应可能转化为更好的交叉保护潜能。

表20.IFN-γ ELISPOT病毒回忆抗原(第40天)

T07组(DCRL脂质体)对3/4的NP蛋白肽池和2/3的完整试验病毒提供最高的IFNγ反应。在疫苗接种后(攻毒前)观察到IFN-γ反应的唯一一组是T06(TXO)(数据未显示)。

加入CD40激动剂和CpG一致地倾向于减小效价，以及增加LLS，尤其是在脂质体配制物的情形下。

总体来说，这些结果表明，由DCRL脂质体辅助的疫苗就减小肺病变分值而言与配制物T02(与市售疫苗类似的实验配制物)同等有效。同时，DCRL脂质体在活化CMI反应方面比试验的其它疫苗有效得多，由此可能提供比商业产品更宽的交叉保护可能性并改进免疫性的持续时间。

实施例5在抑制蛋白疫苗接种后对巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)产生免疫

此研究的目的在于评估各种佐剂(Zoetis专有)对在抑制蛋白疫苗接种后对巨型艾美耳球虫产生免疫的作用。

新孵化的小鸡购自位于Elizabethtown,PA的Longenecker的孵化场。为小鸡提供可随意获取的饲料和水。将小鸟保持在不含艾美耳球虫的设施的孵卵器栅栏中，并在单独的位置转移到大的挂笼中，在其中使其受到感染并保持直到实验阶段结束。

将纯化的抑制蛋白(50μg/剂量)与如表21中提供的不同佐剂混合。

表21

随后在小鸟1天大和7天大时通过两次皮下注射(每剂量0.5mL)抑制蛋白加佐剂来对小鸟进行免疫。第二次免疫后的第7天(14天大时)，用巨型艾美耳球虫的1×10⁴个孢子化卵囊对小鸟(T01组的除外)进行攻毒。

攻毒后第6天和第15天测定体重增益。还测定攻毒后第6天至第9天粪便中脱落的卵囊。通过ELISA评估针对抑制蛋白的血清抗体。

对照组：PBS注射且无攻毒(未经疫苗接种的未攻毒对照组)、在第14天进行PBS注射和攻毒(未经疫苗接种的攻毒对照组)、抑制蛋白/无佐剂且在第14天进行攻毒(抗原对照组)。

为评估病变分值，在攻毒后第6天每组杀死六只小鸟。获得在支囊前后延伸10cm的大约20cm的肠段并纵向切割。轻轻去除肠内容物。视病变严重程度给定0至4范围内的分值。

为评估粪便卵囊产量，在攻毒后第6天至第9天单独收集每一组的粪便(每组8只小鸟；4个笼子，每个笼子2只小鸟)。从攻毒后第6天开始，设置收集笼并指示动物管理员不要清洁粪便。从每个笼子承载2只小鸟的每个卵囊收集笼中收集粪便滴落物。从注射后(pi)第6天开始，将收集盘放置在每个笼子下方持续3天，并将粪便物质收集到大的塑料罐中。将每个罐中的粪便滴落物在搅拌器中与水一起研磨，并且每种样本取两个35ml的随机样本。为了对球虫卵囊计数，初始进行各种稀释来确定用于列举每种样本的卵囊的最佳稀释。通过显微镜对卵囊进行计数。使用下式计算每只小鸡脱落的卵囊总数：总卵囊数/小鸟＝(卵囊数×稀释因子×粪便样本体积/计数室体积)/每个笼子中的小鸟数量。

在艾美耳球虫攻毒后第9天收集血液样本(4只小鸟/组)进行抗体反应测量。使血液样本在4℃下凝结4hr并分离血清。使用ELISA试验血清样本针对艾美耳球虫的抗体。简单来说，每孔用200ng重组球虫抗原过夜涂敷微量滴定盘、用PBS-0.05％吐温洗涤并用PBS-1％BSA阻断。添加血清稀释液、伴随连续轻柔震荡进行培育、洗涤并用过氧化物酶结合的兔抗鸡IgG(Sigma)和过氧化物酶特异性底物检测结合的Ab。用酶标仪(Bio-Rad,Richmond,CA)在450nm下测量光学密度(OD)。

所有值表达为平均值±SEM。在p<0.05时，认为平均值之间的差异是显著的。

阴性对照组和攻毒对照组在感染后第6天显著不同，但在感染后第15天并无显著不同。攻毒对照组在攻毒后第6天的重量损失与阴性对照组相比为约15％。无治疗组不同于无佐剂或攻毒对照组，但治疗组T05、T06和T08与任一阴性对照组并无不同。

刚好60％以下的小鸟具有2或更高的病变分值。无配制物与攻毒对照组显著不同。T09组表现最差。T04组表现最佳。

一般来说，<1log的产出减少并不认为生物相关，但仍可表示主动免疫。显著小于攻毒对照组的唯一配制物是T05和T09。

通常并不认为抗体反应与对球虫病的免疫性有关，因此也与其它标准无关。在上述实验中，T07组引发比由阴性对照组(未经疫苗接种、未经感染的小鸟)、阳性对照组(未经疫苗接种、经感染的小鸟)或只经抗原疫苗接种的小鸟所引发的反应更高的抗体反应。T05、T06和T08-T10组引发高于阴性对照组(未经疫苗接种、未经感染的小鸟)的抗体反应。

结果在表22中概述。在1天大和7天大时通过两次皮下注射抑制蛋白加各种佐剂对小鸟进行免疫，接着在14天大时用巨型艾美耳球虫的1×10⁴个卵囊进行攻毒后的重量增益、血清抗体水平(表达为未感染对照组的％)和病变分值、卵囊产量(表达为未感染对照组的％)。

表22

实施例6-由DCRL+CpG辅助的BVDV/IBR疫苗

在此实施例中，评估具有CpG(不含ORN)的DCRL脂质体的辅助潜能。另外，比较用于负载脂质体的不同方法。

实验设置如下(表21)：

T03至T06组中的疫苗也含有mBVD1(4,500RU/ds)+BVDV1(4500RU)、BVDV 2(4500RU)、mIBR 10⁸log₁₀TCID₅₀(灭活前剂量)。

此研究中登记健康的荷斯坦小牛(6-7个月大，对于BVDV1、BVDV2和IBR而言为血清阴性)(n＝9/治疗组)。在第0天和第28天通过皮下向小牛施用2mL指定疫苗。在第49天施用毒性BVDV2攻毒(4mL(每剂量5.14Log₁₀TCID₅₀)鼻内)。进行临床观察并在每次疫苗接种时测量注射部位和直肠温度。在第63天收集血液样本用于白细胞计数、病毒血症和血清学。

T02、T03、T04和T06的所有小牛在攻毒前针对BVDV-1a和BVDV2都达到1:8的效价，与T05的小牛相比为22.1％和11.1％。相信由于T5中使用主动负载，因此从疫苗制剂中去除了大部分的抗原。因此，T05组中的动物比T03、T04和T06组中的动物接受到更少的抗原。因此，应该慎重解释来自T05组的发现。

也就是说，在第28天、第49天和第63天，T05的BVDV-1a和BVDV2效价显著低于其它疫苗接种组。在攻毒之前，T02或T05中没有小牛针对BHV达到1:8的效价，而且在第28天、第49天和第63天，这些组与其它疫苗接种组相比也具有显著较低的效价。在第0天、第35天和第56天，T02中gp53-1SFC的最小平方平均值与所有其它治疗组相比显著较高，且在第35天和第56天，T02中gp53-2 SFC的最小平方平均值显著较高。

在T01和T05的所有小牛中都观察到病毒血症。T02中没有小牛在攻毒后发生病毒血症。在T03、T04和T06组中，22.2％、33.3％和33.3％小牛发生病毒血症；这些组与T02并无显著不同。T01和T05中病毒血症的持续时间与所有其它治疗组相比显著较长。通过WBC相对于基线减少40％确定白细胞减少症，T02中22.2％的小牛在攻毒后白细胞减少，而所有组中的所有小牛都白细胞减少。T01和T05的小牛与所有其它组相比具有显著更长的白细胞减少症持续时间(T01组至T06组分别为8.6天、0天、0.2天、0.7天、6.7天和0.8天)。在此研究中，攻毒后只观察到临床疾病的轻微征象。在T01对照组中，22.2％的小牛在攻毒后具有≥2的临床分值，而T05中11.1％的小牛在攻毒后具有≥2的临床分值。任何其它治疗组均没有小牛在攻毒后具有≥2的临床分值。

在第1天和第29天，在T02中观察到短期发热。所有其它小牛的温度在整个研究期间都是正常的。

表22.疫苗接种阶段直肠温度的LS平均值，℉

具有不同上标的值显著不同(p≤0.10)

表23.攻毒阶段直肠温度的LS平均值，℉

具有不同上标的值显著不同(p≤0.10)

对个别动物的分析揭示在T02组中(由含有Quil A的佐剂辅助)，四只动物在第一次注射后具有超过103.5F的温度，且两只动物在第二次注射后具有超过103.5F的温度。另外，一只动物在第1天(第一次疫苗接种后的一天)的温度为103.2F且五只在第29天(第二次疫苗接种后的一天)的温度在103.0至103.4F的范围内。相反，经不含Quil A的佐剂疫苗接种的动物在第一次或第二次疫苗接种后的温度都不超过103.5F。两只具有103.0至103.4F范围内的温度。

在此研究中未观察到>200cm³的注射部位反应。T02组(用含有Quil A的佐剂辅助)与所有其它治疗组相比在第2天、第7天和第29天具有显著更大的注射部位反应。T02(第二次注射)和T06(第一次注射)在第49天仍存在可测量的注射部位反应。

表1.第一次疫苗接种后注射部位反应的LS平均值(cm³)

具有不同上标的值显著不同(p≤0.10)

表25.第二次疫苗接种后注射部位反应的LS平均值(cm³)

具有不同上标的值显著不同(p≤0.10)

总而言之，对于在所有小牛中提供>1:8的BVDV2效价而言，疫苗候选物T02、T03、T04和T06满足产出准则。疫苗候选物T02还提供针对病毒血症的100％保护作用和针对白细胞减少症的完全保护作用(如WBC减少40％所测量)。这组的小牛经历短暂发热和注射部位反应。

说明书中引用的所有公布(专利公布和非专利公布)都表明本发明所属技术领域的技术人员的技术水平。所有这些公布都以引用的方式全部并入本文中，引用程度就如同特定地及个别地将各个公布以引用的方式并入一般。

尽管本文中已参考特定的实施方案描述本发明，但应了解这些实施方案仅是对本发明的原则和应用的说明。因此应了解，可对所述的说明性实施方案进行多种改进，而且在不偏离下文权利要求书中定义的本发明的精神和范畴的情况下，可设计其它配置。

序列表

<110> Zoetis Services LLC

Dominowski, Paul J

Mwangi, Duncan

Rai, Sharath K

Foss, Dennis L

Godbee, Traci K

Sly, Laurel M

Mahan, Suman

Vora, Shaunak

<120> 脂质体佐剂组合物

<130> ZP000111

<141> 2016-07-19

<150> US 62/194,355

<151> 2015-07-20

<160> 136

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

<400> 1

tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

<400> 2

tcgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

<400> 3

tcgacgtcga tcggcgcgcg ccgt 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(1)

<223> 5'-碘-2'-脱氧尿苷

<400> 4

ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(1)

<223> 5'-碘-2'-脱氧尿苷

<400> 5

ncgacgtcga tcggcgcgcg ccgt 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(1)

<223> 5'-碘-2'-脱氧尿苷

<400> 6

ncgacgtcga tcggcgcgcg ccgt 24

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(1)

<223> 5'-Ethyl-2'-脱氧尿苷

<400> 7

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

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<221> misc_特征

<222> (1)..(1)

<223> 5'-碘-2'-脱氧尿苷

<400> 8

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<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(1)

<223> 5'-碘-2'-脱氧尿苷

<400> 9

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<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

<400> 10

tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23

<210> 11

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫刺激性寡核糖核苷酸

<400> 11

uuguuguugu uguuguuguu 20

<210> 12

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫刺激性寡核糖核苷酸

<400> 12

uuauuauuau uauuauuauu 20

<210> 13

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫刺激性寡核糖核苷酸

<400> 13

aaacgcucag ccaaagcag 19

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA/RNA混合物

<220>

<221> misc_特征

<222> (11)..(17)

<223> 核糖核苷酸

<400> 14

tcgtcgtttt guuguguttt t 21

<210> 15

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 15

Met Ala Thr Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Gly

1 5 10 15

<210> 16

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 16

Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Gly Gly Glu Arg Gln

1 5 10 15

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 17

Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Gly Gly Glu Arg Gln Asp Ala Thr Glu

1 5 10 15

<210> 18

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 18

Met Glu Thr Gly Gly Glu Arg Gln Asp Ala Thr Glu Ile Lys Ala Ser

1 5 10 15

<210> 19

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 19

Gly Glu Arg Gln Asp Ala Thr Glu Ile Lys Ala Ser Val Gly Arg Met

1 5 10 15

<210> 20

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 20

Asp Ala Thr Glu Ile Lys Ala Ser Val Gly Arg Met Val Gly Gly Ile

1 5 10 15

<210> 21

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 21

Ile Lys Ala Ser Val Gly Arg Met Val Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr

1 5 10 15

<210> 22

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 22

Val Gly Arg Met Val Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys

1 5 10 15

<210> 23

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 23

Val Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys

1 5 10 15

<210> 24

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 24

Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys Leu Ser Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 25

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 25

Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu

1 5 10 15

<210> 26

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 26

Thr Glu Leu Lys Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser

1 5 10 15

<210> 27

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 27

Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu

1 5 10 15

<210> 28

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 28

Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu

1 5 10 15

<210> 29

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 29

Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp

1 5 10 15

<210> 30

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 30

Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn

1 5 10 15

<210> 31

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 31

Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 32

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 32

Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser

1 5 10 15

<210> 33

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 33

Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp

1 5 10 15

<210> 34

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 34

Lys Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr

1 5 10 15

<210> 35

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 35

Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile

1 5 10 15

<210> 36

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 36

Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile Tyr Arg Arg Val

1 5 10 15

<210> 37

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 37

Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile Tyr Arg Arg Val Asp Gly Lys Trp

1 5 10 15

<210> 38

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 38

Gly Gly Pro Ile Tyr Arg Arg Val Asp Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu

1 5 10 15

<210> 39

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 39

Tyr Arg Arg Val Asp Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp

1 5 10 15

<210> 40

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 40

Asp Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp Lys Glu Glu Ile

1 5 10 15

<210> 41

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 41

Met Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp Lys Glu Glu Ile Arg Arg Val Trp

1 5 10 15

<210> 42

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 42

Ile Leu Tyr Asp Lys Glu Glu Ile Arg Arg Val Trp Arg Gln Ala Asn

1 5 10 15

<210> 43

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 43

Lys Glu Glu Ile Arg Arg Val Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp

1 5 10 15

<210> 44

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 44

Arg Arg Val Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp Ala Thr Ala Gly

1 5 10 15

<210> 45

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 45

Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Ile

1 5 10 15

<210> 46

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 46

Asn Gly Glu Asp Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Ile Met Ile Trp His

1 5 10 15

<210> 47

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 47

Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Ile Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn

1 5 10 15

<210> 48

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 48

Leu Thr His Ile Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr

1 5 10 15

<210> 49

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 49

Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg

1 5 10 15

<210> 50

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 50

Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg

1 5 10 15

<210> 51

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 51

Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp

1 5 10 15

<210> 52

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 52

Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met Cys

1 5 10 15

<210> 53

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 53

Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln

1 5 10 15

<210> 54

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 54

Thr Gly Met Asp Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu

1 5 10 15

<210> 55

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 55

Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser

1 5 10 15

<210> 56

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 56

Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser Gly Ala Ala Gly

1 5 10 15

<210> 57

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 57

Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys

1 5 10 15

<210> 58

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 58

Pro Arg Arg Ser Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr

1 5 10 15

<210> 59

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 59

Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Ile Ala Met Glu

1 5 10 15

<210> 60

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 60

Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Ile Ala Met Glu Leu Ile Arg Met

1 5 10 15

<210> 61

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 61

Gly Val Gly Thr Ile Ala Met Glu Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly

1 5 10 15

<210> 62

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 62

Ile Ala Met Glu Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg

1 5 10 15

<210> 63

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 63

Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg

1 5 10 15

<210> 64

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 64

Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg Gly Glu Asn Gly

1 5 10 15

<210> 65

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 65

Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg

1 5 10 15

<210> 66

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 66

Asn Phe Trp Arg Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Ala Ala Tyr Glu

1 5 10 15

<210> 67

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 67

Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Ala Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn

1 5 10 15

<210> 68

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 68

Arg Arg Thr Arg Ala Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

<210> 69

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 69

Ala Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr

1 5 10 15

<210> 70

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 70

Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg

1 5 10 15

<210> 71

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 71

Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp

1 5 10 15

<210> 72

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 72

Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp Gln Val Arg Glu

1 5 10 15

<210> 73

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 73

Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro

1 5 10 15

<210> 74

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 74

Ala Met Met Asp Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu

1 5 10 15

<210> 75

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 75

Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu

1 5 10 15

<210> 76

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 76

Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu Ile Phe Leu Ala

1 5 10 15

<210> 77

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 77

Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu

1 5 10 15

<210> 78

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 78

Ile Glu Asp Leu Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Val Leu Arg Gly

1 5 10 15

<210> 79

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 79

Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Val Leu Arg Gly Ser Val Ala His

1 5 10 15

<210> 80

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 80

Arg Ser Ala Leu Val Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys Ser Cys Leu

1 5 10 15

<210> 81

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 81

Val Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val

1 5 10 15

<210> 82

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 82

Ser Val Ala His Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Ala

1 5 10 15

<210> 83

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 83

Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Ala Val Ala Ser Gly

1 5 10 15

<210> 84

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 84

Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Ala Val Ala Ser Gly His Asp Phe Glu

1 5 10 15

<210> 85

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 85

Tyr Gly Leu Ala Val Ala Ser Gly His Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr

1 5 10 15

<210> 86

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 86

Val Ala Ser Gly His Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly

1 5 10 15

<210> 87

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 87

His Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe

1 5 10 15

<210> 88

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 88

Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe Lys Leu Leu Gln

1 5 10 15

<210> 89

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 89

Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val

1 5 10 15

<210> 90

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 90

Ile Asp Pro Phe Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Phe Ser Leu Ile

1 5 10 15

<210> 91

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 91

Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Phe Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu

1 5 10 15

<210> 92

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 92

Asn Ser Gln Val Phe Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu Asn Pro Ala His

1 5 10 15

<210> 93

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 93

Phe Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu

1 5 10 15

<210> 94

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 94

Arg Pro Asn Glu Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala

1 5 10 15

<210> 95

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 95

Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala

1 5 10 15

<210> 96

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 96

Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala Ala Phe Glu Asp

1 5 10 15

<210> 97

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 97

Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser

1 5 10 15

<210> 98

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 98

Cys His Ser Ala Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Arg

1 5 10 15

<210> 99

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 99

Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Arg Gly Lys Lys Val

1 5 10 15

<210> 100

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 100

Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Arg Gly Lys Lys Val Ile Pro Arg Gly

1 5 10 15

<210> 101

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 101

Ser Phe Ile Arg Gly Lys Lys Val Ile Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr

1 5 10 15

<210> 102

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 102

Gly Lys Lys Val Ile Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln

1 5 10 15

<210> 103

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 103

Ile Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn

1 5 10 15

<210> 104

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 104

Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn Glu Asn Val Glu

1 5 10 15

<210> 105

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 105

Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn Glu Asn Val Glu Ala Met Asp Ser

1 5 10 15

<210> 106

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 106

Ile Ala Ser Asn Glu Asn Val Glu Ala Met Asp Ser Asn Thr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 107

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 107

Glu Asn Val Glu Ala Met Asp Ser Asn Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg

1 5 10 15

<210> 108

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 108

Ala Met Asp Ser Asn Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ile

1 5 10 15

<210> 109

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 109

Asn Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser

1 5 10 15

<210> 110

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 110

Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr

1 5 10 15

<210> 111

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 111

Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg

1 5 10 15

<210> 112

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 112

Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg Ala Ser Ala Gly

1 5 10 15

<210> 113

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 113

Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val

1 5 10 15

<210> 114

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 114

Asn Gln Gln Arg Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe

1 5 10 15

<210> 115

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 115

Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg

1 5 10 15

<210> 116

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 116

Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg Asn Leu Pro Phe

1 5 10 15

<210> 117

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 117

Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg Asn Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr

1 5 10 15

<210> 118

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 118

Ser Val Gln Arg Asn Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr Ile Met Ala Ala

1 5 10 15

<210> 119

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 119

Asn Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr Ile Met Ala Ala Phe Ser Gly Asn

1 5 10 15

<210> 120

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 120

Glu Arg Ala Thr Ile Met Ala Ala Phe Ser Gly Asn Asn Glu Gly Arg

1 5 10 15

<210> 121

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 121

Ile Met Ala Ala Phe Ser Gly Asn Asn Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met

1 5 10 15

<210> 122

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 122

Phe Ser Gly Asn Asn Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Val

1 5 10 15

<210> 123

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 123

Asn Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Val Ile Arg Met Met

1 5 10 15

<210> 124

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 124

Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Val Ile Arg Met Met Glu Ser Ala Lys

1 5 10 15

<210> 125

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 125

Arg Thr Glu Val Ile Arg Met Met Glu Ser Ala Lys Pro Glu Asp Leu

1 5 10 15

<210> 126

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 126

Ile Arg Met Met Glu Ser Ala Lys Pro Glu Asp Leu Ser Phe Gln Gly

1 5 10 15

<210> 127

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 127

Glu Ser Ala Lys Pro Glu Asp Leu Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe

1 5 10 15

<210> 128

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 128

Pro Glu Asp Leu Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe Glu Leu Ser Asp

1 5 10 15

<210> 129

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 129

Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr

1 5 10 15

<210> 130

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 130

Arg Gly Val Phe Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Ser Pro Ile Val

1 5 10 15

<210> 131

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 131

Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Ser Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp

1 5 10 15

<210> 132

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 132

Glu Lys Ala Thr Ser Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp Met Ser Asn Glu

1 5 10 15

<210> 133

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 133

Ser Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe

1 5 10 15

<210> 134

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 134

Pro Ser Phe Asp Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn

1 5 10 15

<210> 135

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 135

Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr

1 5 10 15

<210> 136

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猪流感病毒NP蛋白片段

<400> 136

Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr Asp Ser

1 5 10

Claims

1.一种包含脂质双层外膜和内部隔室的脂质体，所述外膜包含：

a)季铵化合物；

b)固醇；

c)磷脂；和

d)式I的糖脂：

其中，R¹和R²独立地为氢，或具有多达20个碳原子的饱和烷基；X为-CH₂-、-O-或-NH-；R²为氢，或具有多达20个碳原子的饱和或不饱和烷基；R³、R⁴和R⁵独立地为氢、-SO₄ ^2-、-PO₄ ^2-、-COC_1-10烷基；R⁶为L-丙氨酰基、L-α-氨基丁基、L-精氨酰基、L-天冬酰胺基、L-天冬氨酰基、L-半胱氨酰基、L-谷氨酰基、L-甘氨酰基、L-组氨酰基、L-羟脯氨酰基、L-异亮氨酰基、L-亮氨酰基、L-赖氨酰基、L-甲硫氨酰基、L-鸟氨酰基、L-苯丙氨酰基、L-脯氨酰基、L-丝氨酰基、L-苏氨酰基、L-酪氨酰基、L-色氨酰基和L-缬氨酰基或其D-异构体。

2.如权利要求1所述的脂质体，其中所述脂质体基本上不含皂苷。

3.如权利要求1或2所述的脂质体，其中所述季铵化合物为DDA，所述固醇为胆固醇，且所述糖脂为N-(2-去氧-2-L-亮氨酰基氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基十二酰胺或其盐。

4.如权利要求1至3中任一项所述的脂质体，在所述内部隔室中还包含选自免疫刺激性核糖核苷酸、CpG寡脱氧核糖核苷酸和其组合的免疫刺激性寡核苷酸。

5.如权利要求4所述的脂质体，其中所述免疫刺激性寡核苷酸包含SEQ ID NO 1-14中的任一者。

6.一种佐剂配制物，所述佐剂配制物包含根据权利要求1至5中任一项所述的脂质体。

7.如权利要求6所述的佐剂组合物，其中所述佐剂配制物基本上不含皂苷。

8.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含有效量的抗原性组分和如权利要求6或权利要求7所述的佐剂配制物。

9.如权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物基本上不含皂苷。

10.如权利要求8或9所述的疫苗组合物，其中所述抗原性组分是在所述内部隔室内。

11.如权利要求8至10中任一项所述的疫苗组合物，其中所述抗原性组分选自牛抗原、山羊抗原、猪抗原、家禽抗原、马抗原、犬抗原、马抗原和猫抗原。

12.如权利要求8至11中任一项所述的疫苗组合物，其中所述免疫刺激性寡核苷酸包含CpG寡脱氧核糖核苷酸。

13.如权利要求9所述的疫苗组合物，其中所述抗原性组分包含IBR、BVDV-1和BVDV-2，且其中所述疫苗组合物基本上不含皂苷。

14.一种在牛体内诱发针对BVDV的免疫反应的方法，所述方法包括向所述牛施用根据权利要求13所述的疫苗组合物。

15.如权利要求14所述的方法，其中诱发所述免疫反应，而未随之发生发热。

16.如权利要求12所述的疫苗组合物，其中所述抗原包含家禽抗原。

17.如权利要求16所述的疫苗组合物，其中所述抗原为抑制蛋白。

18.一种在感染艾美耳球虫属的家禽动物体内防止艾美耳球虫属卵囊脱落的方法，所述方法包括在所述感染之前向所述动物施用如权利要求18所述的疫苗组合物。

19.如权利要求11所述的疫苗组合物，其中所述抗原性组分包含ssRNA病毒，且其中所述疫苗组合物大体上不含CpG寡脱氧核糖核苷酸。

20.如权利要求19所述的疫苗，其中所述ssRNA病毒为流感病毒。

21.如权利要求20所述的疫苗，其中所述流感病毒为灭活猪流感病毒(SIV)。

22.一种制备如权利要求1所述的脂质体的方法，所述方法包括：

a)将所述季铵化合物、所述固醇、所述磷脂和所述式I的糖脂溶解于有机溶剂中：

其中，R¹和R²独立地为氢，或具有多达20个碳原子的饱和烷基；X为-CH₂-、-O-或-NH-；R²为氢，或具有多达20个碳原子的饱和或不饱和烷基；R³、R⁴和R⁵独立地为氢、-SO₄ ^2-、-PO₄ ^2-、-COC_1-10烷基；R⁶为L-丙氨酰基、L-α-氨基丁基、L-精氨酰基、L-天冬酰胺基、L-天冬氨酰基、L-半胱氨酰基、L-谷氨酰基、L-甘氨酰基、L-组氨酰基、L-羟脯氨酰基、L-异亮氨酰基、L-亮氨酰基、L-赖氨酰基、L-甲硫氨酰基、L-鸟氨酰基、L-苯丙氨酰基、L-脯氨酰基、L-丝氨酰基、L-苏氨酰基、L-酪氨酰基、L-色氨酰基和L-缬氨酰基或其D异构体；

b)去除所述有机溶剂且形成薄膜；

c)使所述薄膜在水性溶剂中再水合，由此形成再水合组合物；

d)使所述再水合组合物微流体化。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述水性溶剂包含免疫刺激性寡核苷酸。