TWI655002B

TWI655002B - 脂質體佐劑組合物

Info

Publication number: TWI655002B
Application number: TW105122775A
Authority: TW
Inventors: 保羅喬瑟夫多明諾斯基; 鄧肯萬其; 夏拉斯Ｋ瑞; 丹尼斯Ｌ弗斯; 特萊西Ｋ佳德比; 羅瑞兒瑪麗斯萊; 蘇曼曼哈; 韶娜克維拉
Original assignee: 碩騰服務有限責任公司
Priority date: 2015-07-20
Filing date: 2016-07-19
Publication date: 2019-04-01
Also published as: CN107847603B; HRP20210872T1; HUE054422T2; PT3325015T; DK3325015T3; CY1124319T1; SI3325015T1; TW201711675A; WO2017015252A1; RU2018102114A3; BR112018001318A2; CA2992892C; UA125017C2; BR112018001318B1; KR20180025977A; NZ739040A; HK1250338A1; MX2018000879A; RU2018102114A; CL2018000155A1

Abstract

本發明提供一種脂質體佐劑組合物，其包含外部膜及內部隔室，該外部膜包含：四級銨化合物；固醇；磷脂；及醣脂。亦提供疫苗組合物，其包含本發明之脂質體佐劑。

Description

脂質體佐劑組合物

[相關申請案之交叉引用]

本申請案主張2015年7月20日申請之美國臨時申請案第62/194,355號之權益，該美國臨時申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。

本發明係屬於疫苗佐劑之領域。

在疫苗學之領域中，以一定方式將抗原引入宿主體內以刺激對該抗原且因此對潛在病原體之免疫反應。對免疫反應之誘導視許多因素而定，在該等因素當中鹹信有抗原之化學組成、特徵及組態、宿主之健康情況及免疫能力、以及傳遞及投予抗原之方式。

免疫反應有許多方面，其中一些係由免疫系統之細胞(例如樹突細胞、B-淋巴球、T-淋巴球、巨噬細胞、及漿細胞)所表現。免疫系統之細胞經由與抗原或免疫系統之其他細胞相互作用、釋放細胞激素以及對彼等細胞激素之反應性來參與免疫反應。適應性(後天性)免疫反應宜(但任意)分成兩個主要類別，即體液免疫反應及細胞介導之免疫反應。免疫反應之體液組成部分包括產生對抗原具有特異性之抗體。細胞介導之組成部分包括產生遲發型過敏反應及對抗原具有特異性之細胞毒性效應T細胞。

佐劑為用於在與抗原結合使用時加強免疫反應之物質。在疫苗接種方案中使用佐劑可以例如引出比單獨用抗原所將引出之免疫反應更快或更大之免疫反應。此外，佐劑可以用於將免疫反應引導至特定免疫途徑以及用作抗原之傳遞媒劑。

脂質體及脂質體調配物為佐劑之實例。通常，脂質體可以負載有抗原及/或其他免疫調節化合物，或脂質體本身可以用作獨立佐劑。抗原及/或其他免疫刺激化合物可以囊封於脂質體內部，及/或其可以連接至脂質體或併入於脂質雙層中。

影響既定脂質體作為傳遞媒劑在既定系統呈現中之適合性的因素仍不清楚。因此，仍需要提供改良之功效的傳遞媒劑。該種改良之傳遞係特定用於投予刺激及/或引出免疫反應之分子，例如抗原及免疫調節劑。

本發明係關於用於增強疫苗之效能之佐劑。

在某些態樣中，本發明提供一種脂質體，該脂質體包含外部脂質雙層膜及內部隔室，該外部脂質雙層膜包含：四級銨化合物；固醇；磷脂；及式I之醣脂：

其中R¹及R²獨立地為氫、或具有至多20個碳原子之飽和烷基；X為-CH₂-、-O-或-NH-；R²為氫、或具有至多20個碳原子之飽和或不飽和烷基；R³、R⁴及R⁵獨立地為氫、-SO₄ ^2-、-PO₄ ^2-、-COC_1-10烷基；R⁶為L-丙胺醯基、L-α-胺基丁基、L-精胺醯基、L-天冬醯胺醯基、L-天冬胺醯基、L-半胱胺醯基、L-麩胺醯基、L-甘胺醯基、L-組胺醯基、L-羥脯胺醯基、L-異白胺醯基、L-白胺醯基、L-離胺醯基、L-甲硫胺醯基、L-鳥胺醯基、L-苯丙胺醯基、L-脯胺醯基、L-絲胺醯基、L-蘇胺醯基、L-酪胺醯基、L-色胺醯基、及L-纈胺醯基或其D-異構體。

在某些具體實例中，該四級銨化合物為DDA，該固醇為膽固醇，該磷脂為卵磷脂，且該醣脂為N-(2-去氧-2-L-白胺醯基胺基-β-D-葡萄哌喃醣基)-N-十八烷基十二醯基醯胺或其乙酸鹽。

在某些具體實例中，該脂質體基本上不含皂苷。

在某些具體實例中，該脂質體進一步包含選自由以下組成之群的免疫刺激性寡核苷酸：免疫刺激性核糖核苷酸、CpG寡去氧核糖核苷酸、及其組合。在一些具體實例中，該脂質體不含CpG寡去氧核糖核苷酸。

在一些具體實例中，該免疫刺激性寡核苷酸係併入於該脂質體之內部隔室內。在其他具體實例中，該免疫刺激性寡核苷酸與該脂質體之外表面締合。

在一些具體實例中，該免疫刺激性寡核苷酸包含SEQ ID NO 1-14中之任一者。

在某些態樣中，本發明提供一種佐劑調配物，其包含如本文所述之脂質體。

在某些具體實例中，該佐劑調配物基本上不含皂苷。在某些具體實例中，該佐劑調配物基本上不含CpG寡去氧核糖核苷酸。

在某些態樣中，本發明提供一種疫苗組合物，其包含有效量之抗原組分及如本文所述之佐劑調配物。

在某些具體實例中，該疫苗組合物基本上不含皂苷。

在某些具體實例中，該疫苗組合物基本上不含CpG。在某些具體實例中，該基本上不含CpG之疫苗組合物之抗原組分含有(-)ssRNA病毒。

在某些具體實例中，該(-)ssRNA病毒為流行性感冒病毒。在一些具體實例中，該流行性感冒病毒為豬流行性感冒病毒。

在某些具體實例中，該抗原組分係併入於該脂質體之內部隔室內。

在適用於牛之所選擇之具體實例中，該抗原組分可包括BVDV-1及/或BVDV-2不活化病毒(及BHV-1)。在尤其適用於家禽動物之其他具體實例中，該抗原組分包括組裝抑制蛋白(profilin)。

定義：

術語『約』或『大約』在結合可量測之數值變數使用時係指該變數之指示值及該變數之在指示值之實驗誤差內(例如在平均值之95%信賴區間內)或在指示值之10%內(以較大者為準)的所有值，除了『約』用於提及以週計之時間間隔，其中「約3週」為17天至25天，且約2週至約4週為10天至40天。

術語『伴有發熱』係指在疫苗接種之一天內接受疫苗接種之動物的溫度升高。在牛之狀況下，該術語係指超過103.5℉之直腸溫度。

與物種組合之術語『抗原』係指引起該物種之感染性疾病的病原體或此等病原體之組分。因此，例如，『牛抗原』係指能夠引起牛之感染性疾病之病原體或此等病原體之組分。

如對於本發明之脂質體及佐劑調配物所應用之術語『基本上由......組成』及其類似術語係指組合物不含如下量之其他佐劑或免疫調節劑，在該等量下該藥劑會發揮可量測之輔佐或免疫調節作用。

術語『基本上不含皂苷』、『實質上不含皂苷』及其類似術語係指組合物不含如下量之皂苷，在該等量下，皂苷會發揮可量測之輔佐或免疫調節作用。在某些具體實例中，基本上不含皂苷之組合物含有不足以引起全身免疫反應，諸如發熱之量的皂苷。在某些具體實例中，基本上不含皂苷之組合物不含皂苷或含有等於或低於偵測限度之皂苷。

類似地，術語『基本上不含CpG去氧核糖核苷酸』、『實質上不含CpG去氧核糖核苷酸』及其類似術語係指組合物不含如下量之CpG去氧核糖核苷酸，在該等量下，CpG去氧核糖核苷酸會發揮可量測之輔佐或免疫調節作用。在某些具體實例中，基本上不含CpG去氧核糖核苷酸之組合物不含CpG去氧核糖核苷酸或含有等於或低於偵測限度之CpG去氧核糖核苷酸。術語『基本上不含CpG去氧核糖核苷酸』、『實質上不含CpG去氧核糖核苷酸』及其類似術語明確排除其中CpG去氧核糖核苷酸天然存在於抗原中之疫苗。

術語『免疫刺激分子』係指增強免疫反應之分子。

術語『脂質體』係指由包封含水隔室之脂質雙層形成之微觀球狀顆粒。

術語『非經腸投藥』係指經由或藉助不包括消化道之途徑將諸如疫苗之物質引入受試者體內。非經腸投藥包括皮下、肌內、經皮、皮內、腹膜內、眼內、及靜脈內投藥。

術語『治療有效量』及『有效量』係指抗原或疫苗將在接受該抗原或疫苗之受試者中誘導足以預防或減輕疾病之體征或症狀之免疫反應的量，該疾病係由諸如病毒或細菌之病原體感染所引起，包括不良健康影響或其併發症。可以誘導體液免疫或細胞介導免疫或者體液免疫及細胞介導免疫兩者。可以例如間接經由量測抗體效價、淋巴球增殖分析、IFN γ ELISPOT分析、細胞毒性T細胞分析或直接經由監測在用野生型毒株攻擊後之體征及症狀來評價疫苗在動物中之免疫原性及功效。可藉由量測例如受試者之諸如死亡、發病、發熱、病毒血症、在臨床病理學上之影響、總體身體狀況、以及總體健康情況及效能之臨床體征的減輕來評價由疫苗所賦予之保護性免疫。具有治療有效性之疫苗的量可視所使用之特定佐劑、所使用之特定抗原、或受試者之病況而不同且可由熟習此項技術者確定。

本發明部分地提供含有內部隔室及外部膜之脂質體。脂質體可具有50nm至500nm之平均粒度。在某些非限制性具體實例中，脂質體之平均粒度為100nm-500nm、或150nm-450nm、或150nm-250nm、或300nm-400nm、或250nm-300nm。在某些具體實例中，該膜包含四級胺化合物、磷脂、固醇、及醣脂。在某些具體實例中，該脂質體基本上不含皂苷。

在某些具體實例中，該外部膜基本上由以下組成或由以下組成：四級胺化合物、磷脂、固醇及醣脂。在其他具體實例中，該脂質體之外部隔室不含任何免疫刺激性寡核苷酸及/或其他免疫調節化合物。因此，在該等具體實例中，該脂質體基本上由以下組成或由以下組成：基本上由免疫惰性含水媒劑組成或由免疫惰性含水媒劑組成之內部隔室，該內部隔室由外部膜包圍，該外部膜基本上由以下組成或由以下組成：四級胺化合物、磷脂、固醇及醣脂。

四級胺化合物為具有四個烴基之基於銨之化合物。實際上，烴基一般限於烷基或芳基。在一組具體實例中，四級胺化合物由四個烷基鏈構成，其中兩者為C10-C20烷基且其餘兩者為C1-C4烷基。在某些具體實例中，四級胺為二甲基二-十八烷基銨(DDA)溴化物、氯化物或另一醫藥學上可接受之相對離子。

固醇共有共同之化學核心，該化學核心為類固醇環結構，具有羥基(OH)，通常連接至碳-3。脂肪酸取代基之烴鏈在長度上不同，通常為16個至20個碳原子，且可為飽和或不飽和的。固醇通常在環結構中含有一或多個雙鍵以及多個連接至環之取代基。固醇及其脂肪酸酯基本上不溶於水。鑒於此等化學相似性，因此在用於本發明之疫苗組合物中時，共有此化學核心之固醇有可能將具有相似之特性。固醇在此項技術中為熟知的且可購得。舉例而言，膽固醇係揭示於《默克索引(Merck Index)》，第12版，第369頁中。適合之固醇包括(而不限於)β-榖甾醇、豆甾醇、麥角甾醇、麥角沈鈣醇、及膽固醇。

適合之醣脂一般為活化Th2反應之彼等醣脂。醣脂包括(而不限於)由式I所涵蓋以及美國專利公開案20070196384(Ramasamy等人)中一般性描述之彼等醣脂。

在式I之結構中，R¹及R²獨立地為氫、或具有至多20個碳原子之飽和烷基；X為-CH₂-、-O-或-NH-；R²為氫、或具有至多20個碳原子之飽和或不飽和烷基；R³、R⁴及R⁵獨立地為氫、-SO₄ ^2-、-PO₄ ^2-、-COC_1-10烷基；R⁶為L-丙胺醯基、L-α-胺基丁基、L-精胺醯基、L-天冬醯胺醯基、L-天冬胺醯基、L-半胱胺醯基、L-麩胺醯基、L-甘胺醯基、L-組胺醯基、L-羥脯胺醯基、L-異白胺醯基、L-白胺醯基、L-離胺醯基、L-甲硫胺醯基、L-鳥胺醯基、L-苯丙胺醯基、L-脯胺醯基、L-絲胺醯基、L-蘇胺醯基、L-酪胺醯基、L-色胺醯基、及L-纈胺醯基或其D-異構體。

醣脂之實例為(而不限於)N-(2-去氧-2-L-白胺醯基胺基-β-D-葡萄哌喃醣基)-N-十八烷基十二醯基醯胺(BayR®1005或R1005)或其鹽(例如乙酸鹽)。

卵磷脂可藉由對粗植物油進行水洗滌，且將所得之水合膠分離且乾燥而以磷脂及三酸甘油酯之混合物的形式獲得。精製產品可藉由將在藉由丙酮洗滌移除三酸甘油酯及植物油後剩餘之丙酮不溶性磷脂及醣脂之混合物分離而獲得。或者，卵磷脂可獲自各種商業來源。

其他適合之磷脂包括磷脂醯膽鹼、磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇、磷脂醯絲胺酸、醯基磷脂醯乙醇胺、二磷脂醯甘油、溶血磷脂醯乙醇胺、溶血磷脂醯膽鹼、磷脂酸、心磷脂、及磷脂醯乙醇胺。磷脂可自天然來源分離或慣常合成。

如本文所述之脂質體允許外部膜之要素之靈活比率。在某些具體實例中，四級銨化合物：固醇：磷脂：醣脂之重量比分別為1：0.75-1.25：1.5-2.5：1.5-2.5。在某些具體實例中，四級銨化合物：固醇：磷脂：醣脂之重量比為1：1：2：2。

在其他具體實例中，四級銨化合物及固醇之總重量為醣脂及磷脂之總重量之約一半(例如40%、45%、50%、55%、60%)，其限制條件為四級銨化合物佔此四種化合物(四級銨化合物、固醇、磷脂及醣脂)之總重量的至少約5% w/w，且醣脂佔此四種化合物之總重量的至少約20% w/w。

在某些具體實例中，四級銨化合物及固醇之總重量佔醣脂及磷脂之總重量的約10%-40%(例如約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約33.3%、約35%、約40%)，其限制條件為四級銨化合物佔此四種化合物(四級銨化合物、固醇、磷脂、及醣脂)之總重量的至少約5% w/w，且醣脂佔此四種化合物之總重量之至少約20% w/w。

在某些具體實例中，免疫有效量之本發明之脂質體可作為佐劑投予。在一些具體實例中，本發明提供一種疫苗組合，其包含免疫有效量之佐劑組合物及抗原組分，如下文進一步所述。

接受物種(client species)之體重最終決定本發明之佐劑組合物之劑量。

在適用於牛、馬、及成年豬之某些具體實例中，一劑含有1000μg-3000μg外部膜組分(亦即四級銨化合物、固醇、磷脂及醣脂之總重量)之相等物、或1000μg-2000μg之相等物、或1000μg-1500μg之相等物、或1300μg-1800μg之相等物、或1500μg-2000μg之相等物。

脂質體組合物之重量由於內部隔室之存在而可能不等於膜組分之重量，該內部隔室可含有免疫刺激性寡核苷酸、抗原組分、其他免疫調節劑等。脂質體膜組分之相等物的使用允許均一給藥。其中所敍述之給藥方案確保牛動物接受至少200μg醣脂及約50μg四級銨化合物。

在適用於綿羊及山羊之某些具體實例中，一劑含有300μg-1000μg外部膜組分之相等物，例如300μg-500μg之相等物、或400μg-500μg之相等物、或400μg-1000μg之相等物、或500μg-1000μg之相等物、或600μg-1000μg之相等物、或600μg-800μg之相等物。

在適用於仔豬、狗及貓之某些具體實例中，一劑含有100μg-400μg之外部膜組分之相等物、或100μg-200μg之相等物、或100μg-150μg之相等物、或130μg-180μg之相等物、或150μg-200μg之相等物。

在適用於家禽之某些具體實例中，一劑含有50μg-200μg外部膜組分之相等物、或50μg-100μg之相等物、或50μg-75μg之相等物、或65μg-90μg之相等物、或75μg-100μg之相等物、或75μg-150μg之相等物。

脂質體之內部化合物可含有抗原或其他免疫調節分子。在某些具體實例中，該等適用於內部隔室之免疫調節分子包括(而不限於)抗原提取物、次單元、合成物、全細胞或病毒。

在某些具體實例中，活性藥物可包裝於脂質體內部。

可經包裝之免疫調節劑亦包括(而不限於)rmLT、MPLA、α-半乳糖苷基神經醯胺(Alpha-Gal-Cer.)、霍亂毒素、LPS、脂磷壁質酸、聚肌胞苷酸(poly I：C)、鞭毛蛋白、酵母聚糖、幾丁質及經修飾之幾丁質形式、β-葡聚糖、阿夫立定(avridine)、菊糖及經修飾之菊糖形式、乙烯順丁烯二酸酐、普魯蘭尼克(pluronic)，如L121及L141；CD40促效劑、TLR5促效劑以及任何TLR促效劑、GM-CSF。

在某些具體實例中，脂質體可攜帶可用作標記之各種分子，包括(而不限於)OspA、OspC、百日咳桿菌黏附素(pertactin)及其他者。

在某些具體實例中，本發明之佐劑組合物進一步包含免疫刺激性寡核苷酸，諸如CpG寡去氧核糖核苷酸或免疫刺激性寡核糖核苷酸(ORN)、或其嵌合體。CpG寡去氧核糖核苷酸之適合之非限制性實例示於SEQ ID NO 1-10中，ORN之適合之非限制性實例提供於SEQ ID NO 11-13中，且嵌合免疫刺激性寡核苷酸之適合之非限制性實例提供於SEQ ID NO：14中。

在一些具體實例中，此等免疫刺激性寡核苷酸存在於脂質體之內部隔室中。

在某些具體實例中，免疫調節寡核苷酸與脂質體之外表面締合。該締合可歸因於氫鍵、靜電鍵、親脂鍵、凡得瓦力(Van der Waals force)及其類似物。

在某些具體實例中，帶負電荷之免疫刺激性寡核苷酸由於與四級銨化合物中帶正電荷之四級氮原子相互作用而與脂質體之外表面締合。

CpG寡去氧核糖核苷酸(亦稱為CpG去氧核糖核苷酸或CpG ODN)為最近描述之一類醫藥治療劑，該等醫藥治療劑之特徵在於在特定之鹼基序列背景下存在未甲基化之CG二核苷酸(CpG基元)。(Hansel TT,Barnes PJ(編)：《用於哮喘、過敏及COPD之新藥(New Drugs for Asthma,Allergy and COPD)》,Prog Respir Res.Basel,Karger,2001，第31卷，第229-232頁，其以引用方式併入本文中)。此等CpG基元在真核生物DNA中並未見到，其中CG二核苷酸受到抑制且在存在時，通常經甲基化，但存在於細菌DNA中，其向細菌DNA賦予免疫刺激特性。

在某些具體實例中，本發明之佐劑利用所謂之P類免疫刺激性寡核苷酸，更佳，經修飾之P類免疫刺激性寡核苷酸，甚至更佳，E修飾之P類寡核苷酸。P類免疫刺激性寡核苷酸為特徵在於存在迴文序列之CpG寡去氧核糖核苷酸，該等迴文序列一般為6個-20個核苷酸長。P類寡核苷酸具有在試管內及/或活體內自發自行組裝成多聯體之能力。此等寡核苷酸在嚴格意義上為單股的，但迴文序列之存在允許形成多聯體或可能之莖環結構。P類免疫刺激性寡核苷酸之總長度為19個至100個核苷酸，例如19個-30個核苷酸、30個-40個核苷酸、40個-50個核苷酸、50個-60個核苷酸、60個-70個核苷酸、70個-80個核苷酸、80個-90個核苷酸、90個-100個核苷酸。

在本發明之一個態樣中，免疫刺激性寡核苷酸含有5' TLR活化域及至少兩個迴文區，一個迴文區為具有至少6個核苷酸之長度的5'迴文區且該5'迴文區直接或經由間隔區連接至3'迴文區，該3'迴文區具有至少8個核苷酸之長度。

P類免疫刺激性寡核苷酸可根據此項技術中已知之技術來修飾。舉例而言，J-修飾係指碘修飾之核苷酸。E-修飾係指乙基修飾之核苷酸。因此，E修飾之P類免疫刺激性寡核苷酸為P類免疫刺激性寡核苷酸，其中至少一個核苷酸(較佳5'核苷酸)經乙基化。其他修飾包括6-硝基-苯并咪唑之連接、O-甲基化、用丙炔基-dU進行之修飾、肌苷修飾、2-溴乙烯基連接(較佳連接至尿苷)。

P類免疫刺激性寡核苷酸亦可含有經修飾之核苷酸間鍵，包括(而不限於)磷酸二酯鍵及硫代磷酸酯鍵。本發明之寡核苷酸可合成或獲自商業來源。

P類寡核苷酸及經修飾之P類寡核苷酸進一步揭示於2008年6月12日公開之公開PCT申請案第WO2008/068638號中。經修飾之P類免疫刺激性寡核苷酸之適合之非限制性實例提供於下文中(在SEQ ID NO 1-10中，「*」係指硫代磷酸酯鍵且「_」係指磷酸二酯鍵)。在SEQ ID NO 11-14中，所有鍵均為磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵。

SEQ ID NO：1 5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'

SEQ ID NO：2 5' T*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'

SEQ ID NO：3 5' T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3'

SEQ ID NO：4 5' JU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'

SEQ ID NO：5 5' JU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C* G*T 3'

SEQ ID NO：6 5' JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C* G*T 3'

SEQ ID NO：7 5' EU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'

SEQ ID NO：8 5' JU*C_G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C* G*T 3'

SEQ ID NO：9 5' JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C* G*T 3'

SEQ ID NO：10 5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'

SEQ ID NO：11 5'-UUGUUGUUGUUGUUGUUGUU-3'

SEQ ID NO：12 5'-UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU-3'

SEQ ID NO：13 5'-AAACGCUCAGCCAAAGCAG-3'

SEQ ID NO：14 5'-dTdCdGdTdCdGdTdTdTdTrGrUrUrGrUrGrUdTdTdTdT-3'。

用於佐劑組合物中之免疫刺激性寡核苷酸之劑量最終視預期物種而定。

舉例而言，在適用於牛、綿羊或成年豬之某些具體實例中，本發明之佐劑組合物之一劑將包含約50μg至400μg(例如對於成年豬而言，50μg-300μg、或100μg-250μg、或約50μg至約100μg及對於牛而言，約100μg至約250μg)之免疫刺激性寡核苷酸。

在適用於伴侶動物或仔豬之某些具體實例中，本發明之佐劑組合物之一劑將包含約5μg至100μg(例如10μg-80μg、或20μg-50μg)之免疫刺激性寡核苷酸。

在適用於家禽之某些具體實例中，本發明之佐劑組合物之一劑將為約0.1μg至約5μg(例如0.5μg-3μg、或0.9μg-1.1μg)之免疫刺激性寡核苷酸。

製備脂質體之方法在此項技術中為熟知的。簡言之，將脂質體之組分在例如二氯甲烷之有機溶劑中溶解且混合，且接著藉由乾燥移除溶劑以得到膜。隨後使用含水介質(例如水或緩衝液)將膜再水化，該含水介質視情況含有欲併入於脂質體之內部隔室內之化合物。在不同具體實例中，該等化合物可包括免疫刺激性寡核苷酸、其他免疫調節劑及/或抗原組分。

在再水化之步驟後為音波處理及/或擠出以減小在再水化步驟期間形成之囊泡之尺寸。

存在兩種主要之音波處理技術：探針/尖端音波處理及浴槽音波處理。探針/尖端音波處理具有高能量輸入，此會引起顯著之熱量產生，因此需要使用冰浴來維持脂質體分散液之溫度以防止脂質降解。或者，可使用浴槽超音波發生器間接地向脂質體懸浮液賦予超音波能量，其中溫度較容易受到控制，但能量損失比較高。音波處理一般產生小囊泡(約10nm)，該等囊泡隨時間推移自發融合以減輕高膜曲率之應力。

擠出方法包括使脂質體懸浮液穿過具有確定孔徑之膜。此方法為有利的，此係因為該確定之孔徑促進脂質體群體內粒度之均一性，但在低於脂質轉變溫度下擠出可能由於膜剛性而較為困難。通常將脂質體懸浮液多次擠出以達成最終產物中較低之多分散性。

可能需要製備脂質體之儲存穩定性製劑。在某些具體實例中，脂質體之該儲存穩定性製劑係藉由冷凍乾燥而產生。簡言之，在含有低溫保護劑及凍乾保護劑，諸如蔗糖、海藻糖、或其組合之含水緩衝液中將上文所述之乾膜再水化。在其他具體實例中，在再水化步驟後添加低溫保護劑及凍乾保護劑。接著使用此項技術中熟知之技術將再水化之製劑凍乾。所得之凍乾製劑具有儲存穩定性。在所需之時間，可用適合之緩衝液將其再水化。

可在冷凍乾燥之前或在最終製備時添加包括(而不限於)免疫刺激性寡核苷酸及抗原之其他免疫調節劑。

在某些具體實例中，在將本發明之脂質體復原後將抗原與脂質體調配物混合。在其他具體實例中，製備脂質體、其他免疫調節劑、及抗原組分且將其共同乾燥。

在某些具體實例中，在本發明之組合物中存在其他免疫刺激性化合物。該等其他免疫刺激性化合物可存在於脂質體之內部隔室內及/或與脂質體之外表面締合、及/或獨立於脂質體存在於本發明之佐劑組合物中。

該等其他免疫刺激性化合物之適合之非限制性實例包括(但不限於)若干佐劑類別，諸如無機鹽，例如明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁及磷酸鈣；表面活性劑及微粒，例如非離子嵌段聚合物界面活性劑、病毒體、皂苷(例如奎爾A(Quil A)、QS-21及GPI-0100)、蛋白體、免疫刺激複合物、脂質卷(cochleate)、吡啶、維生素A、維生素E；細菌產物，諸如RIBI佐劑系統(Ribi公司)、牛草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)之細胞壁骨架(Detox®)、胞壁醯二肽(MDP)及胞壁醯三肽(MTP)、單磷醯脂質A(MPLA)、卡介苗(Bacillus Calmete-Guerin，BCG)、熱不穩定性大腸桿菌腸毒素、霍亂毒素、海藻糖二黴菌酸酯、細胞激素及激素，例如介白素(IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18)、粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子、去氫表雄固酮、1,25-二羥基維生素D₃；聚陰離子，例如葡聚糖；聚丙烯酸類(例如聚甲基丙烯酸甲酯、CARBOPOL®934P)；載劑，例如破傷風類毒素、白喉類毒素、霍亂毒素B次單元、產腸毒素性大腸桿菌之突變型熱不穩定性腸毒素(rmLT)、熱休克蛋白；水包油乳液，例如AMPHIGEN®(美國Hydronics公司)；聚陽離子載劑(例如DEAE葡聚糖或QAE葡聚糖)、及油包水乳液，諸如弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)及不完全佐劑。

其他適合之免疫調節劑包括α-半乳糖苷基神經醯胺、LPS、脂磷壁質酸、聚肌胞苷酸、鞭毛蛋白、酵母聚糖、幾丁質及經修飾之幾丁質形式、β-葡聚糖、阿夫立定、菊糖及經修飾之菊糖形式、乙烯順丁烯二酸酐、普魯蘭尼克，如L121及L141；CD40促效劑、TLR5促效劑以及任何TLR促效劑。

抗原及疾病

在某些具體實例中，本發明之脂質體佐劑組合物可與抗原組分組合，從而形成本發明之疫苗組合物。本發明之疫苗之抗原組分可存在於脂質體之內部隔室內、及/或與脂質體之外表面締合、及/或獨立於脂質體。

在某些具體實例中，該疫苗組合物實質上不含皂苷。在其他具體實例中，該疫苗組合物基本上不含CpG去氧核糖核苷酸。

若雖然靶向TLR7/8，但疫苗中之抗原含有具有免疫刺激性之全ssRNA病毒((+)ssRNA或(-)ssRNA病毒)序列，則疫苗組合物基本上不含CpG去氧核糖核苷酸之具體實例較佳。該等TLR 7/8刺激序列包括聚尿嘧啶或富含GU之ssRNA序列。Heil F,Hemmi H.等人，2004.Science 303(5663)：1526-9。Diebold SS.,Kaisho T.等人，2004.Science 303(5663)：1529-31。

含有該等序列之病毒包括(而不限於)不同流行性感冒病毒(例如牛流行性感冒病毒、犬流行性感冒病毒、馬流行性感冒病毒、豬流行性感冒病毒及其類似物)。在尤其較佳之具體實例中，基本上不含CpG ODN之疫苗之抗原組分含有流行性感冒病毒。

在不同之例示性具體實例中，抗原組分可包括牛抗原、山羊抗原、豬抗原、家禽抗原、馬抗原、犬抗原、馬抗原及貓抗原。

抗原可為能夠在受試者中產生所需之免疫反應之多種多樣物質中之任一者，包括(而不限於)個別或呈任何組合形式之以下一或多者：病毒(不活化病毒、減毒病毒、及經修飾之活病毒)、細菌、寄生物、核苷酸(包括(而不限於)基於核酸之抗原，例如DNA疫苗或mRNA疫苗)、聚核苷酸、肽、多肽、重組蛋白、合成肽、蛋白質提取物、細胞(包括腫瘤細胞)、組織、多醣、碳水化合物、脂肪酸、脂磷壁酸、肽聚醣、脂質、或醣脂。

與本發明之佐劑一起使用之抗原亦包括核苷酸、聚核苷酸、肽、多肽之免疫原性片段，該等片段可自本文所提及之生物體中分離、或以化學方式或生物學方式製造。

在受試者中不會引起疾病之活病毒株、經修飾之活病毒株、及減毒病毒株已經使用此項技術中熟知之方法以非毒性形式分離或已經減毒，該等方法包括在適合之細胞系中連續繼代或暴露於紫外光或化學突變原。不活化或殺死之病毒株為已經藉由熟習此項技術者已知之方法不活化之彼等病毒株，該等方法包括用福馬林、β-丙內酯(BPL)、過氧化物、二乙烯亞胺(BEI)、滅菌輻射、熱、或其他此類方法處理。

兩種或多於兩種抗原可組合以產生多價組合物，該多價組合物可保護受試者防止由病原體所引起之多種多樣之疾病。當前，疫苗之商業製造商以及最終使用者青睞多價疫苗產品。雖然習知佐劑在其可與之一起有效使用(單價或多價)之抗原的多樣性方面往往受限，但本文所述之佐劑可與廣泛抗原一起有效使用(單價及多價兩者)。因此，本文所述之抗原可組合於包含本文所述之佐劑之單一組合物中。

可作為抗原與本文所述之佐劑組合物一起使用之細菌的實例包括(但不限於)醋酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)、巴氏醋酸桿菌(Acetobacter paseruianus)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、酸熱脂環酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、閃爍古球菌(Arhaeglobus fulgidus)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophillus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、嗜熱鏈狀芽孢桿菌(Bacillus thermocatenulatus)、支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、洋蔥伯克氏菌(Burkholderia cepacia)、類鼻疽伯克氏菌(Burkholderia glumae)、大腸彎曲桿菌(Campylobacter coli)、胎兒彎曲桿菌(Campylobacter fetus)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、豚腸彎曲桿菌(Campylobacter hyointestinalis)、鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、披衣菌屬菌種(Chlamydophila spp.)、黏稠色桿菌(Chromobacterium viscosum)、紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathieae)、單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)、犬埃立克體(Ehrlichia canis)、大腸桿菌、流行性感冒嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、睡眠嗜血桿菌(Haemophilus somnus)、豬螺桿菌(Helicobacter suis)、細胞內勞索尼亞氏菌(Lawsonia intracellularis)、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophilia)、莫拉菌屬菌種(Moraxellsa sp.)、牛結核桿菌(Mycobactrium bovis)、豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、絲狀支原體絲狀亞種LC型(Mycoplasma mycoides subsp.mycoides LC)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、犬牙周臭味菌(Odoribacter denticanis)、溶血性巴氏桿菌(Pasteurella haemolytica)(溶血曼海姆氏菌(Mannheimia haemolytica))、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、發光光桿狀菌(Photorhabdus luminescens)、喉管卟啉單胞菌(Porphyromonas gulae)、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、唾液卟啉單胞菌(Porphyromonas salivosa)、痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、威斯康星假單胞菌(Pseudomonas wisconsinensis)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)C9、螢光假單胞菌SIKW1、莓實假單胞菌(Pseudomonas fragi)、淺黃假單胞菌(Pseudomonas luteola)、食油假單胞菌(Pseudomonas oleovorans)、假單胞菌屬菌種B11-1、真養產鹼桿菌(Alcaliges eutrophus)、不動嗜冷桿菌(Psychrobacter immobilis)、普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)、腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)所有血清變異型，包括例如：鼠傷寒腸道沙門氏菌(Salmonella enterica Typhimurium)、邦戈爾腸道沙門氏菌(Salmonella enterica Bongori)、都柏林腸道沙門氏菌(Salmonella enterica Dublin)、豬霍亂腸道沙門氏菌(Salmonella enterica Choleraesuis)、及新港腸道沙門氏菌(Salmonella enterica Newport)；黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)、鈍頂節螺藻(Spirluina platensis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、豬葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)、白色鏈黴菌(Streptomyces albus)、肉桂鏈黴菌(Streptomyces cinnamoneus)、乳房鏈球菌(Streptococcus uberis)、豬鏈球菌(Streptococcus suis)、脫葉鏈黴菌(Streptomyces exfoliates)、瘡痂病鏈黴菌(Streptomyces scabies)、嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius)、集胞藻屬(Syechocystis)菌種、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、博氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、齒垢密螺旋體(Treponema denticola)、微小密螺旋體(Treponema minutum)、潰蝕齒密螺旋體(Treponema phagedenis)、屈折密螺旋體(Treponema refringens)、文氏密螺旋體(Treponema vincentii)、梅毒密螺旋體(Treponema palladium)、化膿隱秘桿菌(Trueperella pyogenes)及鉤端螺旋體屬(Leptospira)種，諸如已知之病原體犬鉤端螺旋體(Leptospira canicola)、流行性傷寒鉤端螺旋體(Leptospira grippotyposa)、哈德焦鉤端螺旋體(Leptospira hardjo)、博氏哈德焦-牛鉤端螺旋體(Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis)、博氏哈德焦-帕希諾鉤端螺旋體(Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno)、問號鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)、出血性黃疸鉤端螺旋體(Leptospira icterohaemorrhagiae)、波蒙那鉤端螺旋體(Leptospira pomona)、及伯拉第斯拉瓦鉤端螺旋體(Leptospira bratislava)以及其組合。

不活化病毒及減毒活病毒兩者均可用於佐劑組合物中。可用作抗原之病毒之一些實例包括(但不限於)禽皰疹病毒、牛皰疹病毒、犬皰疹病毒、馬皰疹病毒、貓病毒性鼻氣管炎病毒、馬立克氏病病毒(Marek's disease virus)、綿羊皰疹病毒、豬皰疹病毒、豬流行性腹瀉病毒(PEDv)、偽狂犬病病毒、禽副黏病毒、牛呼吸道合胞病毒、犬瘟熱病毒、犬副流行性感冒病毒、犬腺病毒、犬細小病毒、牛副流行性感冒病毒第3型、綿羊副流行性感冒第3型、牛瘟病毒、邊界病病毒、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、BVDV第I型、BVDV第II型、典型豬瘟病毒、禽白血病病毒、牛免疫缺乏病毒、牛白血病病毒、牛結核病、馬傳染性貧血病毒、貓免疫缺乏病毒、貓白血病病毒(FeLV)、新城雞瘟病毒(Newcastle Disease virus)、綿羊進行性肺炎病毒、綿羊肺腺癌病毒、犬冠狀病毒(CCV)、泛嗜性CCV、犬呼吸道冠狀病毒、牛冠狀病毒、貓杯狀病毒、貓腸道冠狀病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬血球凝集性腦脊髓炎病毒、豬細小病毒、豬圓環病毒(PCV)第I型、PCV第II型、豬繁殖及呼吸症候群(PRRS)病毒、傳染性胃腸炎病毒、火雞冠狀病毒、牛短暫熱病毒、狂犬病、輪狀病毒、水泡性口炎病毒、慢病毒、禽流行性感冒、鼻病毒、馬流行性感冒病毒、豬流行性感冒病毒、犬流行性感冒病毒、貓流行性感冒病毒、人類流行性感冒病毒、東方馬腦炎病毒(EEE)、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、西尼羅病毒(West Nile virus)、西方馬腦炎病毒、人類免疫缺乏病毒、人類乳突狀瘤病毒、水痘帶狀皰疹病毒、B型肝炎病毒、鼻病毒、及麻疹病毒、以及其組合。

肽抗原之實例包括支氣管炎博德特氏菌p68、GnRH、IgE肽、Fel d1、及癌症抗原、以及其組合。其他抗原之實例包括核苷酸、碳水化合物、脂質、醣脂、肽、脂肪酸、脂磷壁酸及磷壁酸、及肽聚醣、以及其組合。

可作為抗原與本文所述之佐劑組合物一起使用之寄生物的實例包括(但不限於)邊蟲(Anaplasma)、肝片吸蟲(Fasciola hepatica)(肝吸蟲)、球蟲(Coccidia)、艾美球蟲屬種(Eimeria spp.)、犬新孢子蟲(Neospora caninum)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)、賈第鞭毛蟲(Giardia)、惡絲蟲(Dirofilaria)(心絲蟲(heartworms))、鉤口線蟲(Ancylostoma)(鉤蟲)、古柏線蟲(Cooperia)、撚轉血矛線蟲(Haemonchus contortus)(撚轉胃蟲(Barber pole worm))、奧斯他胃蟲(Ostertagia ostertagi)(胃蟲)、胎生網尾線蟲(Dictyocaulus viviparous)(肺蟲)、錐體蟲屬種(Trypanosoma spp.)、利什曼蟲屬種(Leishmania spp.)、毛滴蟲屬種(Trichomonas spp.)、小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)、巴貝蟲(Babesia)、血吸蟲(Schistosoma)、絛蟲(Taenia)、圓線蟲(Strongyloides)、蛔蟲(Ascaris)、毛線蟲(Trichinella)、肉孢子蟲(Sarcocystis)、哈蒙德蟲(Hammondia)、及等孢子球蟲(Isopsora)、以及其組合。亦涵蓋外寄生物，包括(但不限於)蜱，包括硬蜱屬(Ixodes)、扇頭蜱屬(Rhipicephalus)、革蜱屬 (Dermacentor)、鈍眼蜱屬(Amblyomma)、方頭蜱屬(Boophilus)、玻眼蜱屬(Hyalomma)、及血蜱屬(Haemaphysalis)物種、以及其組合。

用於誘導免疫反應之抗原的量將視所用之抗原、受試者、及所需之反應程度而顯著不同，且可由熟習此項技術者確定。對於含有經修飾之活病毒或減毒病毒之疫苗而言，抗原之治療有效量一般在約10²組織培養感染劑量(TCID)₅₀(包括)至約10¹⁰ TCID₅₀(包括)範圍內。對於許多此類病毒，治療有效劑量一般在約10² TCID₅₀(包括)至約10⁸ TCID₅₀(包括)範圍內。在一些具體實例中，治療有效劑量之範圍為約10³ TCID₅₀(包括)至約10⁶ TCID₅₀(包括)。在一些其他具體實例中，治療有效劑量之範圍為約10⁴ TCID₅₀(包括)至約10⁵ TCID₅₀(包括)。

對於含有不活化病毒之疫苗，抗原之治療有效量一般為每劑至少約100個相對單位，且通常在每劑約1,000個相對單位(包括)至約4,500個相對單位(包括)範圍內。在其他具體實例中，抗原之治療有效量在以下範圍內：每劑約250個相對單位(包括)至約4,000個相對單位(包括)；每劑約500個相對單位(包括)至約3,000個相對單位(包括)；每劑約750個相對單位(包括)至約2,000個相對單位(包括)；或每劑約1,000個相對單位(包括)至約1,500個相對單位(包括)。

含有不活化病毒之疫苗中抗原之治療有效量亦可以每毫升相對效能(RP)來量測。治療有效量通常在每毫升約0.1 RP(包括)至約50 RP(包括)之範圍內。在其他具體實例中，抗原之治療有效量在以下範圍內：每毫升約0.5 RP(包括)至約30 RP(包括)；每毫升約1 RP(包括)至約25 RP(包括)；每毫升約2 RP(包括)至約20 RP(包括)；每毫升約3 RP(包括)至約15 RP(包括)；或每毫升約5 RP(包括)至約10 RP(包括)。

在疫苗中所投予之細菌抗原之細胞數在每劑約1×10⁶個(包括)至約5×10¹⁰個菌落形成單位(CFU)(包括)之範圍內。在其他具體實例中，細胞數在約1×10⁷ CFU/劑(包括)至5×10¹⁰ CFU/劑(包括)、或約1×10⁸ CFU/劑(包括)至5×10¹⁰ CFU/劑(包括)範圍內。在其他具體實例中，細胞數在以下範圍內：約1×10² CFU/劑(包括)至5×10¹⁰ CFU/劑(包括)；或約1×10⁴ CFU/劑(包括)至5×10⁹ CFU/劑(包括)；或約1×10⁵ CFU/劑(包括)至5×10⁹ CFU/劑(包括)；或約1×10⁶ CFU/劑(包括)至5×10⁹ CFU/劑(包括)；或約1×10⁶ CFU/劑(包括)至5×10⁸ CFU/劑(包括)；或約1×10⁷ CFU/劑(包括)至5×10⁹ CFU/劑(包括)。

在疫苗中所投予之寄生物抗原之細胞數在每劑約1×10²個(包括)至約1×10¹⁰個(包括)範圍內。在其他具體實例中，細胞數在以下範圍內：每劑約1×10³個(包括)至約1×10⁹個(包括)；或每劑約1×10⁴個(包括)至約1×10⁸個(包括)；或每劑約1×10⁵個(包括)至約1×10⁷個(包括)；或每劑約1×10⁶個(包括)至約1×10⁸個(包括)。

賦形劑

佐劑調配物及/或疫苗組合物可包括醫藥學上可接受之載劑。如本文所用之「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、包衣劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑、及其類似物。載劑須在與組合物之其他組分相容及對受試者無害之意義上為「可接受的」。通常，載劑將無菌且無熱原質，且基於欲使用之投藥方式來選擇。熟習此項技術者熟知醫藥學上可接受之載劑之包含組合物之較佳調配物為在由美國(US)農業部(Department of Agriculture)或美國食品藥物管理局(US Food and Drug Administration)或非美國國家之等效政府機構所頒佈之適用法規中獲得批准之彼等醫藥載劑。因此，用於商業生產組合物之醫藥學上接受之載劑為已經由美國或外國之適當政府機構批准或將由該政府機構批准之載劑。

組合物之投藥

組合物之劑量大小通常在約1mL(包括)至約5mL(包括)範圍內，視受試者及抗原而定。舉例而言，對於犬或貓，通常使用約1mL之劑量，而在牛中，通常使用約2mL-5mL之劑量。然而，此等佐劑亦可調配成微劑量，其中可使用約100μL之劑量。

佐劑組合物之投藥途徑包括非經腸、經口、口鼻、鼻內、氣管內、皮下、肌內、經皮、皮內、腹膜內、眼內、靜脈內投藥及卵子內。可使用任何適合之裝置來投予組合物，包括注射器、滴管、無針注射裝置、貼劑及其類似物。所選用之途徑及裝置將視佐劑之組成、抗原、及受試者而定且該等方面係由熟習此項技術者所熟知。

組合物之用途

本文所述之佐劑調配物容易製造且在4℃下保持穩定至少18個月。調配物可在4℃下保持穩定例如約18個月、或約18個至約24個月。在另一具體實例中，調配物在4℃下保持穩定至少約24個月。加速測試程序亦表明本文所述之調配物在37℃下保持穩定至少兩週，此對應於在4℃下約24個月。

本文所述之佐劑組合物可安全且有效地向廣泛之受試者投予。已驚人地發現，本文所述之佐劑組合物在與其他佐劑組合物相比較時表現出安全性改良。

以下實施例係作為說明性具體實例呈現，但不應當視為限制本發明之範疇。本發明之許多改變、變化、修改、以及其他用途及應用對熟習此項技術者將顯而易見。

實施例

實施例I：脂質體之表徵

將DCRL脂質體(含有DDA、膽固醇、Bay®R1005、及卵磷脂)調整至分別50μg/mL、50μg/mL、100μg/mL及100μg/mL之DDA、膽固醇、R1005及大豆卵磷脂之最終濃度。

將化合物添加至250mL圓底燒瓶中且使用1mL溶劑Safe^TM移液器尖端(Sigma-Aldrich)用無水級氯仿(Sigma-Aldrich,Poole,Dorset,UK)填充至5mL之最終體積。使用旋轉蒸發器(Büchi,Flawil,Switzerland)在55℃下在真空下(KNF Neuberger,Witney,Oxfordshire,UK)移除溶劑，持續1小時直至形成乾燥之白色脂質膜為止。用來自包括針對超高純度進行逆滲透之內部改裝之Option 3淨水器(ELGA LabWater,Wycombe,Buckinghameshire,UK)之再蒸餾水(ddH₂O)或用ddH₂O由錠劑復原之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS；Sigma-Aldrich)將脂質體再水化。

在再水化後，用1mL寬孔口移液器尖端(VWR,Lutterworth,Leicestershire,UK)處理脂質體以減少剪切。接著，在浴槽(Sarose scientificInstruments,Perivale,Middlesex,UK)中將脂質體懸浮液音波處理1小時及/或使用裝有兩個1mL注射器之小型擠出機單元將其擠出穿過100nm聚碳酸酯Whatman® Nucleopore徑跡蝕刻膜(Sigma-Aldrich)至多3次。聚碳酸酯膜由10mm過濾器支撐件側接。

經音波處理之DCRL脂質體(1.14μm平均直徑)顯著大於(5.44倍)擠出之脂質體。與擠出之樣品(209.6nm)相比，在音波處理後進行擠出並未顯著影響囊泡尺寸。擠出之脂質體的多分散性為經音波處理之脂質體的10/21。與擠出之脂質體相比，音波處理與擠出之組合使DCRL多分散性顯著增加至1.42倍。

為評價脂質體在水溶液中之膠態穩定性，經4週評定於ddH₂O中水化之DCRL脂質體。值得注意的是，在4℃下2年之近似熱力學相等方案為在37℃下儲存4週，因此促使在4℃及37℃兩者下評定產品穩定性。評定空(「-ODN」)DCRL脂質體及負載有例示性免疫刺激性寡核苷酸CpG ODN之DCRL脂質體(「+ODN」)兩者以確定陰離子核酸對陽離子型脂質體膠態穩定性之影響。在此，藉由用ddH₂O及ODN之溶液將脂質膜再水化來負載ODN。於ddH₂O中水化之DCRL脂質體之尺寸及多分散性(177nm，0.24)在統計學上類似於在PBS中水化之彼等脂質體(210nm，0.17)。

在4℃下，+/-ODN DCRL脂質體之直徑在28天后分別不顯著地增加至1.10倍及1.01倍。含有ODN之脂質體(+ODN脂質體)(417nm)顯著大於缺乏ODN之脂質體(-ODN脂質體)(177nm)。類似地，+/-ODN脂質體之多分散性在28天后分別小幅降低至25/27及100/103，但+ODN脂質體在第28天時之多分散性與-ODN對應物相比顯著較高(1.23倍)。

相反，在37℃下儲存時在28天后觀測到脂質體之聚集行為。+/-ODN脂質體之直徑在28天后分別顯著增加至3.24倍及2.00倍，但在第21天后穩定。雖然+ODN脂質體由於ODN介導之電荷補償及喪失膠態穩定性而大於(在第28天時為1.46倍)-ODN脂質體，但隨時間推移之穩定性趨勢在定性上為相似的。然而，在第7天后出現+ODN脂質體之失穩，而在-ODN脂質體中，維持穩定性直至第14天后為止。此外，+/-ODN脂質體之多分散性在28天后在統計學上為相似的，其多分散性與第0天時之囊泡相比，分別顯著降低至25/48及2/3。

此等結果表明需要研發用於保存脂質體之技術且亦表明產生初始較小之脂質體尺寸之較強效之音波處理及/或擠出技術可抵消脂質體之初始聚集。

比較使用微流體化(微流體公司(Microfluidics Corp.)，型號110EH)與音波處理所製備之脂質體的尺寸。在將音波處理之步驟替換為微流體化時，調配物產生具有約59nm之平均直徑的脂質體。

此等結果證實使用微流體化製備之脂質體可使脂質體之聚集減至最少，該聚集可能潛在地由添加ODN或ORN所引起。

實施例2：凍乾之脂質體的穩定性

使用Dura-Stop冷凍乾燥器(SP Scientific,Ipswich,Suffolk,UK)進行凍乾。在凍乾之前將樣品填充至10mL管式第I型玻璃冷凍乾燥小瓶 (Schott,Stafford,Staffordshire,UK)中。凍乾循環參數如下。將樣品在5℃下冷凍30分鐘，在-5℃下冷凍30分鐘且在-40℃下冷凍60分鐘，全部均以1.00℃/分鐘之升降溫速率。將一次乾燥在-37℃下進行59分鐘，在-28℃下進行59分鐘，在-23℃下進行59分鐘且在-21℃下進行552分鐘，全部均以0.50℃/分鐘之升降溫速率。將二次乾燥以0.10℃/分鐘之升降溫速率在20℃下進行360分鐘。所有乾燥均在57毫托之腔室壓力下進行。在57毫托下將替代性一次乾燥循環在-38℃下進行59分鐘，在-38℃下進行59分鐘，在-37℃下進行59分鐘且在-35℃下進行552分鐘，全部均以0.50℃/分鐘之升降溫速率。將凍乾樣品用14mm醫藥級丁基橡膠冷凍乾燥塞(Fisher Scientific,Loughborough,Leicestershire,UK)及Parafilm M®(Sigma-Aldrich)密封。

在如所示之凍乾之前，將凍乾保護劑D-甘露糖醇、D-(+)-葡萄糖、D-(-)-果糖、蔗糖、D-(+)-海藻糖二水合物(Sigma-Aldrich)或D(+)-甘露糖(Acros Organics)溶解於ddH₂O或PBS中且添加至脂質體懸浮液中達2%-4% w/v之最終濃度。

在不存在糖之情況下，ddH₂O再水化及PBS再水化之脂質體在凍乾前為約210nm。在不存在凍乾保護劑之情況下，凍乾使ddH₂O再水化之樣品及PBS再水化之樣品的脂質體尺寸分別增加至3.55倍及6.05倍。在添加3%蔗糖、4%甘露糖醇或組合之後，在ddH₂O或PBS中再水化之DCRL脂質體未經歷顯著之尺寸改變，此係證實在凍乾後觀測到之聚集並非直接由添加凍乾保護劑所引起。

對於在PBS中再水化之脂質體，在冷凍循環之後僅在不含凍乾保護劑之樣品中脂質體尺寸顯著增加(2.00倍)。然而，在完全凍乾循環之後，不含凍乾保護劑之樣品、含3%蔗糖之樣品、含4%甘露糖醇之樣品及含組合之樣品的脂質體尺寸分別顯著增加至6.05倍、3.03倍、5.15倍及4.13倍。類似地，與凍乾前對照相比，不含凍乾保護劑之 DCRL、含3%蔗糖之DCRL、含4%甘露糖醇之DCRL及含組合之DCRL的多分散性分別顯著增加至2.61倍、2.61倍、2.85倍及2.79倍。

對於在ddH₂O中再水化之脂質體，不含凍乾保護劑之脂質體及含4%甘露糖醇之脂質體在冷凍循環後之囊泡尺寸相對於凍乾前對照分別顯著增加至17.90倍及11.45倍，而含3%蔗糖或3%蔗糖與4%甘露糖醇之組合的脂質體經歷可忽略不計之改變。在完全凍乾循環後，不含凍乾保護劑之樣品、含3%蔗糖之樣品、含4%甘露糖醇之樣品及含組合之樣品的脂質體尺寸分別適度變至3.55倍、0.88倍、3.48倍及1.47倍。

此等發現證實在ddH₂O中再水化之脂質體與在PBS中再水化之彼等脂質體相比具有較佳之膠態穩定性，如由在凍乾後不變之囊泡尺寸所說明，且3%蔗糖可為較理想之凍乾保護劑以賦予良好之膠態穩定性。

為了將ddH₂O再水化之DCRL脂質體之凍乾流程最佳化，評價2% w/v之6種已知之糖凍乾保護劑(個別及呈組合形式)對囊泡尺寸及多分散性之影響。

測試作為凍乾保護劑之蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、海藻糖、果糖及甘露糖。只有作為凍乾保護劑之2%甘露糖醇使囊泡尺寸(39.66倍)及多分散性(2.95倍)顯著增加。然而，雖然在存在所有其他糖之情況下凍乾未引起明顯之尺寸改變，但用葡萄糖、果糖及/或甘露糖進行凍乾保護之產品塌陷成糖及脂質體之不可滲透之緻密層，其難以再水化。與文獻一致，用蔗糖或海藻糖凍乾保護之脂質體阻止粒度改變且產生餅狀物，其可復原成具有良好膠態穩定性之脂質體分散液。

亦將DCRL與糖之組合一起凍乾。該研究顯示只有2%蔗糖、2%海藻糖及2%蔗糖/2%海藻糖支持凍乾後良好之膠態穩定性且達成醫藥學上優質之餅狀結構。然而，相對於單獨用2%蔗糖或2%海藻糖進行之凍乾保護，2%蔗糖/2%海藻糖之組合在脂質體尺寸穩定性及多分散性方面似乎並非有利的。

實施例3：IBR/BVDV疫苗

奎爾A佐劑已經報導會引起常常伴有短暫發熱之全身免疫反應。鹹信該發熱與泌乳母牛之產乳量下降有關。該研究之目的在於評價不含皂苷之脂質體對由該等脂質體所引出之免疫反應的影響及由佐劑所引起之潛在副作用。

將八個月大之荷蘭雄性小牛用於該研究。以血清學方式篩選潛在之測試動物，且針對BVDV-1及BVDV-2具有<1：2之血清中和(SN)效價之彼等動物適合於招收至該研究中。此外，動物未持續感染(PI)BVDV，如由耳鑽孔活組織檢查及免疫組織化學所確定。將動物圈養在溫度及濕度受控之環境中且任意接受市售飼料及城市系統水。

在研究第0天前約一週開始適應。小牛在裝運前接受DRAXXIN®及DECTOMAX®。

由於與研究無關之狀況而變得瀕死、受損、或死亡之測試動物係排除在研究及相關數據分析之外。將瀕死動物處以安樂死。

在第0天及第28天藉由皮下投予2ml疫苗來對動物進行疫苗接種，如表1中所彙總。

在第49天，用非致細胞病變性牛病毒性腹瀉病毒第2型(毒株24515)攻擊動物。各動物每劑接受使用壓縮氣體噴霧器鼻內(每個鼻孔2.5ml)投予之5ml中的約4.88 Log₁₀TCID₅₀。

在組T02-T06中，抗原組分含有4500RU/病毒預先不活化之經修飾之BVDV ½及經修飾之IBR(8.0 log₁₀TCID₅₀)。

在第48天，使用壓縮氣體噴霧器用5ml BVDV-2毒株24515(每劑4.88 Log10TCID50)鼻內(每個鼻孔2.5ml)攻擊動物。

在首次及第二次疫苗接種後的直腸溫度最小二乘平均值及範圍示於表2中。

具有不同上標之值具有顯著差異(p0.10)

一些T02及T07受試者之直腸溫度在首次疫苗接種及第二次疫苗接種後一天均顯示短暫升高。在首次疫苗接種後1天內，組T02中動物之直腸溫度的升高顯著高於(P 0.10)其他組(T01、T03、T04、T05、T06、及T07)中之升高。

在首次疫苗接種後，組T02中9隻動物中有四隻動物具有大於103.5℉之溫度(三隻動物具有超過104.0℉之溫度)。相比之下，組T05中無動物在首次疫苗接種後一天具有超過102.5℉之溫度(數據未示)。

在第二次疫苗接種後，T02及T07之直腸溫度的升高顯著(P 0.10)高於對照組及疫苗接種組(T03、T04、T05、及T06)，然而，升高之直腸溫度為短暫的(表2)。組T02中之個體反應在101.1℉至104.5℉範圍內。在第二次疫苗接種後，組T02中九隻動物中有五隻動物具有超過103.5℉之溫度(且另一動物具有溫度103.5℉)。在第二次疫苗接種後一天，組T02中九隻動物中僅有三隻動物具有低於103.5℉之溫度。相比之下，DCRL調配物中無一者誘導大於103.7℉之直腸溫度的升高。組T05中之個體反應在101.4℉至102.6℉範圍內(數據未示)。

在攻擊後在T01組中8隻動物中之8隻動物中觀測到發熱反應(>104.5℉)；此符合成功攻擊之結果準則。在研究第53天時，與對照組相比(在攻擊後4天時)，所有疫苗接種組之直腸溫度顯著較低(P 0.10)且在隨後幾天存在一些差異(數據未示)。在對照組中，回應於攻擊，觀測到直腸溫度之典型雙相升高。

根據以下評分系統確定攻擊後臨床BVDV疾病的存在(動物必須具有2之臨床分數)：

0：無臨床體征；

1：臨床體征在總體上並非急性BVD感染所特有的。臨床體征可包括流鼻涕、呼吸異常及輕度嗜睡。

2：臨床體征在總體上具有中度之程度且為急性BVD感染所特有。臨床體征可包括流鼻涕、呼吸異常、嗜睡、消瘦、眼分泌物、流涎過多、腹瀉、脫水、跛行及/或不願移動。

3：臨床體征在總體上具有重度之程度且為急性BVD感染特徵性的。臨床體征可包括流鼻涕、呼吸異常、嗜睡、消瘦、眼分泌物、流涎過多、腹瀉、過多瘀傷、脫水、仰臥、跛行及/或不願移動。

對照組與疫苗接種組之間無顯著性差異。

白血球減少症

研究結果符合有關有效研究之準則，此係因為在使用40%下降時，T01(對照組)中之100%有白血球減少症且對照組中有75%具有<4000個細胞/微升。T01中在攻擊後產生白血球減少症白血球自背景減少40%之動物數與疫苗接種處理組T02、T03、T04、T05、T06、及T07相比無顯著性差異(P 0.10)。然而，分別在T01、T02、T03、T04、T05、T06、及T07中8隻動物中之6隻動物(75%)、9隻動物中之2隻動物(22.2%)、8隻動物中之1隻動物(12.5%)、9隻動物中之3隻動物(33.3%)、9隻動物中之4隻動物(44.4%)、9隻動物中之4隻動物(44.4%)、及6隻動物中之0隻動物中偵測到作為更相關定義之臨床白血球減少症(<4000個細胞/微升)(表3)。在使用40%下降時，與所有疫苗接種組相比，T01組中白血球減少症之持續時間顯著較長(P 0.10)，且在使用<4000μl時，與疫苗接種組T02、T03、T05、T06及T07相比，T01組中白血球減少症之持續時間顯著較長(P 0.10)(表4)。

表3：攻擊階段白血球減少症之彙總

具有不同上標之值具有顯著差異(p0.10)

病毒血症

所有實驗疫苗均防止病毒血症。在一些組中，存在完全保護(均含有CpG之T02及T05)且在其他組中，存在部分保護(T03、T04、T06、及T07)。T01中有病毒血症之動物的數目顯著高於T02、T03、 T04、T05、T06及T07中之數目(P 0.10)(表5)。在T02組及T05組中未看到病毒血症。然而，在與對照組相比時，不含ORN、含有低劑量ORN及含有高劑量ORN之組T03、T04、及T06中有病毒血症之動物的數目之間存在差異。

具有不同上標之值具有顯著差異(p0.10)

T01組之病毒血症之持續時間顯著大於所有疫苗接種組(T02至T07)之持續時間(P 0.1)(表6)。T07中之小牛接受含有含奎爾A之佐劑+BVDV-1病毒之重組gp53抗原的疫苗且亦受到部分保護且與T01相比較，具有顯著較短之病毒血症持續時間。對於此等小牛，攻擊係使用BVDV(第2型)病毒之不同生物型進行，此反映BVDV-1 gp53抗原與攻擊毒株之間存在部分交叉保護。

具有不同上標之值具有顯著差異(p0.10)

SN效價

在第49天，在攻擊前，T02至T07組動物全部均具有1：8之針對BVDV-1、BVDV-2之SN效價，且僅T02至T06具有1：8之針對IBR抗原之抗體。所有疫苗均被認為具有足夠之效能，因為其滿足1：8之要求。在首次疫苗接種及第二次疫苗接種後針對BVDV-1及BVDV-2之SN效價(第28天及第49天)之最小二乘平均值示於表7中。所有接種疫苗之動物均具有顯著高於對照組之SN效價且在疫苗接種組之SN效價之間存在顯著性差異。與經含有奎爾A之組合物佐劑化之疫苗(T02)相比，脂質體疫苗(T03至T06)誘導顯著較低之針對BVDV-1及BVDV-2之SN效價。將ORNS或CpG添加至此等調配物中未增強此等反應。經含有奎爾A之組合物佐劑化之gp53疫苗到第49天時亦誘導針對BVDV-1抗原之高SN效價，但針對BVDV-2抗原之SN效價較低。T07組之BVDV-1 SN效價與T02之效價無顯著差異，但BVDV-2效價有顯著差異。在BVDV-2攻擊後，所有疫苗接種組之SN效價均提高，而T01組小牛產生初級抗體反應(第63天)。

具有不同上標之值具有顯著差異(p0.10)

注射部位反應

左側頸部及右側頸部兩者之注射部位反應(ISR)之最小二乘平均值示於表9及表10中。在第1天時，在所有六個疫苗接種組中均出現小反應，但有所減小。在第29天時，在T02及T07中出現最大反應部位，分別為41.8及16.3。在某幾天，注射部位反應之間存在顯著性差異。所有疫苗均為安全的，因為注射部位反應快速消退。

表9：注射部位反應之最小二乘平均值(左側頸部)

具有不同上標之值具有顯著差異(p0.10)

細胞介導之免疫

在攻擊前在T01組中，BVDV IFNγ ELISPOT分析具有高背景，且因此，被認為對於表明由此等疫苗針對此抗原對CMI反應之誘導而言不可靠(數據未示)。然而，針對IBR抗原進行之分析反映出各別疫苗對CMI之誘導(參見表11-13，對殺死之IBR抗原、IBR gB及gD肽之反應回憶T02至T06之反應)。一般而言，最高反應出現在調配物中具有 CpG之T02疫苗組及T05組中。攻擊後反應未增強，因為攻擊為BVDV病毒攻擊。據推測，該等疫苗針對BVDV抗原誘導相似之CMI反應。

具有不同上標之值具有顯著差異(p0.10)

表13

具有不同上標之值具有顯著差異(p0.10)

觀測到疫苗對病毒血症之產生及持續時間的作用。所有實驗疫苗均防止病毒血症。在一些組(含有CpG之T02及T05)中觀測到完全保護，而在其他組(T03、T04、T06及T07)中觀測到部分保護。直腸溫度曲線顯示與T01對照組相比，處理組T02及T07在首次疫苗接種及第二次疫苗接種後一天均有短暫升高。與具有含有奎爾A之佐劑之T02及T07相比，脂質體疫苗誘導直腸溫度之較低升高。此含有奎爾A之佐劑通常在疫苗接種後立即誘導溫度單日升高。後者對於乳用母牛而言尤為重要，因為伴隨疫苗接種之發熱常常造成不可接受之產乳量下降。脂質體調配物誘導穩固之抗體以及T細胞反應(即使不具其他免疫調節劑之脂質體)。與含有奎爾A之疫苗相比較，脂質體疫苗針對BVDV-1及BVDV-2以及IBR抗原誘導顯著較低之SN效價，但所達到之程度被認為處於針對此等各別疾病之保護範圍內(1：256-512之BVDV-1SN效價；BVDV-2±256或大於256；1：32之IBR SN效價)。

總之，脂質體調配物提供一種針對不僅需要抗體，且亦需要CMI進行保護之疾病傳遞殺死之抗原的安全且新型之選擇方案。該等調配物在功效上與含有奎爾A之疫苗相似。CpG對功效之作用為可再現的，然而ORN在增強針對BVDV攻擊之免疫方面無效。

實施例4：豬流行性感冒病毒

此研究之目的在於評價含有新穎佐劑調配物及免疫調節劑之若干SIV疫苗(殺死之病毒，pH1N1及H3N2)之免疫反應及功效。藉由免疫學參數(體液及細胞)及藉由功效終點來確定功效，該等功效終點包括臨床體征、病毒血症、病毒脫落及肺部病變。

動物

將兩種性別之三週大(21+/-3天)之豬用於此研究。動物無暴露於PRRSV、豬肺炎支原體之歷史。動物或其母畜無針對任何SIV血清型接受疫苗接種或暴露於任何SIV血清型之歷史。動物在疫苗接種前四天至七天到達現場且任意餵食標準口糧及水。

在第0天(左側頸部)及第21天(右側頸部)用表14之組合物對豬進行疫苗接種且在第35天用H3N2病毒IN/12攻擊。

在第35天及第40天採集血清以進行血球凝集抑制(HAI)分析，且在第28天、第35天及第40天採集全血進行ELISPOT(IFNγ)分析。在第40天(攻擊後5天)將豬處死且對各肺葉(左側顱側、左側中間、左側尾側、右側顱側、右側中間、右側尾側及副葉)之實變百分比進行評分且記錄為0%至100%之百分比。

疫苗接種中無一者產生全身副作用或不可接受之注射側反應(數據未示)。

HAI效價示於表15中。

^a具有不同上標之值與T01有顯著差異(p0.10)；具有韋爾奇校正(Welch's correction)之非配對T檢驗(Unpaired T test)(GraphPad Prism，第6.04版)。nd：未偵測出；na：不適用。

肺部病變分數示於表16中。

^a具有不同上標之值與T01有顯著差異(p0.10)；具有韋爾奇校正之非配對T檢驗(GraphPad Prism，第6.04版)。NTX為未接種疫苗、未受攻擊之豬的組。

組T04針對疫苗株中之一者(H1N1)具有最高之HAI效價，而T07針對另一毒株(H3H2)具有最高之效價，儘管組T02-T08中之效價顯著高於T01對照組中之效價。

在攻擊後5天時，所有疫苗(除T08外)均趨向於降低LLS。組T06(TXO)趨向於具有最低之肺部病變分數(Lung Lesion Score)。

分泌流行性感冒NP蛋白質肽特異性IFN-γ之細胞及分泌全流行性感冒病毒特異性IFN-γ之細胞(兩者由ELISPOT確定)分別提供於表19及表20中。池中之肽為具有12個胺基酸重疊之16聚體。四個池含有NP 肽自N末端(池1)至C末端(池4)之序列。該等肽之序列提供於表17及表18中。

^a具有不同上標之值與T01有顯著差異(p0.10)；具有韋爾奇校正之非配對T檢驗(GraphPad Prism，第6.04版)。

NP蛋白質在SIV株間一般為高度保守的，且因此，有效之CMI反應可能轉化成較佳之交叉保護潛能。

組T07(DCRL脂質體)針對四個NP蛋白質肽池中之三者以及所測試之三種全病毒中之兩者提供最高之IFNγ反應。唯一之具有在疫苗接種後(攻擊前)所觀測到之IFN-γ反應之組為T06(TXO)(數據未示)。

添加CD40促效劑及CpG均一地趨向於降低效價以及增加LLS，尤其在脂質體調配物之背景下。

總體而言，此等結果表明用DCRL脂質體佐劑化之疫苗在降低肺部病變分數方面與調配物T02(類似於市售疫苗之實驗調配物)同樣有效。同時，DCRL脂質體在活化CMI反應方面比所測試之其他疫苗有效得多，因此可能提供比市售產品寬之交叉保護潛能及改良之免疫持續時間。

實施例5：在組裝抑制蛋白疫苗接種後產生對巨型艾美球蟲(Eimeria maxima)之免疫力

該研究之目的在於評價各種佐劑(碩騰公司(Zoetis)專有)對在組裝抑制蛋白疫苗接種後針對巨型艾美球蟲之免疫力的產生之影響。

新孵化之小雞購自賓夕法尼亞州伊麗莎白鎮之朗格內克孵化場(Longenecker's hatchery,Elizabethtown,PA)。任意向小雞提供飼料及水。將雞關在無艾美球蟲之設施中之育雛欄中且轉移至處於獨立位置之大的懸掛籠中，其中其受感染且保持直至實驗期結束為止。

將經純化之組裝抑制蛋白(50μg/劑)與如表21中所提供之不同佐劑混合。

藉由在1天大時及隨後在7天大時兩次皮下注射(每劑0.5mL)組裝抑制蛋白加上佐劑來對雞進行免疫接種。在第二次免疫接種後七天(14天大)時，用巨型艾美球蟲之1×10⁴個孢子化卵囊攻擊雞(除組T01中之雞之外)。

在攻擊後第6天及第15天測定體重增加。亦確定在攻擊後第6天-第9天糞便中脫落之卵囊。藉由ELISA評價針對組裝抑制蛋白之血清抗體。

對照組：注射PBS且無攻擊(未接種疫苗之未受攻擊之對照組)；注射PBS且在第14天攻擊(未接種疫苗之受攻擊之對照組)；組裝抑制蛋白/無佐劑且在第14天攻擊(抗原對照組)。

為評定病變分數，在攻擊後6天時將六隻雞/組殺死。獲得前方延伸10cm且後方延伸至憩室之約20cm腸段且縱向切割。輕輕地移除腸內容物。給出0至4範圍內之分數，視病變之嚴重程度而定。

為評定糞便卵囊產生，在攻擊後6天至9天時分別採集各組之糞便(8隻雞/組；4個籠具，2隻雞/籠)。自攻擊後之6天開始，設置採集籠且告知動物管理員不清除糞便。自每籠容納2隻雞之各卵囊採集籠採集糞便排泄物。自感染後(pi)6天開始將採集盤置放於各籠下方，持續3天，且將糞料採集至大塑膠罐中。將各罐中之糞便排泄物在摻合器中與水一起研磨，且自各樣品獲取兩個35ml隨機樣品。為對球蟲卵囊進行計數，最初製備各種稀釋液以確定用於對各樣品之卵囊進行計數的最佳稀釋液。用顯微鏡對卵囊進行計數。使用下式計算每隻雞脫落之卵囊總數：總卵囊/雞=(卵囊計數×稀釋因數×糞便樣品體積/計數室體積)/每籠雞之數目。

在艾美球蟲攻擊後第9天採集血液樣品(4隻雞/組)以進行抗體反應量測。在4℃下使血液樣品凝結4小時，且分離血清。使用ELISA測試血清樣品之針對艾美球蟲之抗體。簡言之，將微量滴定盤用200ng/孔之重組球蟲抗原塗佈隔夜，用PBS-0.05% Tween洗滌，且用PBS-1% BSA封閉。添加血清稀釋液，在連續輕微振盪下培育，洗滌，且用與過氧化酶結合之兔抗雞IgG(Sigma)及過氧化酶特異性受質偵測結合之Ab。用微盤讀數器(Bio-Rad,Richmond,CA)在450nm下量測光密度(OD)。

所有值均表示為平均值±SEM。平均值間之差異在p<0.05時被認為具有顯著性。

陰性對照組與攻擊對照組在感染後6天時有顯著差異，但在感染後15天時無顯著差異。與陰性對照組相比，攻擊對照組中在攻擊後第6天之體重減輕為約15%。處理組與無佐劑或攻擊對照組無差異，但處理組T05、T06、及T08與陰性對照組亦並無差異。

僅低於60%之雞有2或高於2之病變分數。調配物與攻擊對照組無顯著差異。組T09為最差表現組。T04為最佳表現組。

一般而言，輸出之<1 log之降低並不被認為具有生物學相關性，但仍可指示自動免疫。顯著小於攻擊對照組之調配物僅為T05及T09。

抗體反應一般並不被認為與對球蟲病之免疫力有關，因此可能與其他準則無關聯。在上述實驗中，組T07引出之抗體反應高於由陰性對照組(未接種疫苗之未受感染之雞)、陽性對照組(未接種疫苗之受感染之雞)、或僅用抗原接種疫苗之雞所引出之反應。組T05、T06、及T08-T10引出之抗體反應高於陰性對照組(未接種疫苗之未受感染之雞)。

結果彙總於表22中。藉由在1天大及7天大時兩次皮下注射組裝抑制蛋白加上各種佐劑對雞進行免疫接種且後續在14天大時用巨型艾美球蟲之1×10⁴個卵囊攻擊後的體重增加、血清抗體含量(表示為相對於未受感染之對照組的%)及病變分數、卵囊產生(表示為相對於受感染之對照組的%)。

實施例6：經DCRL+CpG佐劑化之BVDV/IBR疫苗

在此實施例中，評估含有CpG(不含ORN)之DCRL脂質體的佐劑化潛能。此外，比較將脂質體負載之不同方法。

實驗設置如下(表21)：

組T03-T06中之疫苗亦含有mBVD1(4,500RU/劑)+BVDV1(4500RU)、BVDV 2(4500RU)、mIBR 10⁸log₁₀ TCID₅₀(不活化前劑量)。

在此研究中招收健康之荷蘭小牛(6-7個月大，BVDV1、BVDV2及IBR呈血清陰性)(n=9/處理組)。在第0天及第28天向小牛皮下投予2mL指定之疫苗。在第49天投予毒性BVDV2攻擊(4mL(每劑5.14 Log₁₀TCID₅₀)，鼻內)。圍繞各次疫苗接種進行臨床觀測且量測注射部位及直腸溫度。針對白血球計數、病毒血症及血清學採集血液樣品直至第63天。

T02、T03、T04及T06中之所有小牛在攻擊前均達成針對BVDV-1a及BVDV2之1：8效價，相比之下，T05中之小牛有22.1%及11.1%達成。鹹信由於T5中所用之主動負載，因此自疫苗製劑中移除大部分抗原。因而，組T05中之動物比組T03、T04、及T06中之動物接受更少之抗原。因此，應對來自組T05之發現的解釋作出謹慎解釋。

儘管如此，在第28天、第49天及第63天，T05之BVDV-1a效價及BVDV2效價顯著低於其他疫苗接種組。T02或T05中無小牛在攻擊前達成針對BHV之1：8效價，且在第28天、第49天及第63天，與其他疫苗接種組相比，此等組亦具有顯著較低之效價。在第0天、第35天及第56天，與所有其他處理組相比，T02之gp53-1 SFC之最小二乘平均值顯著較高，且在第35天及第56天，T02之gp53-2 SFC之最小二乘平均值顯著較高。

在T01及T05中之所有小牛中均觀測到病毒血症。T02中無小牛在攻擊後產生病毒血症。在組T03、T04及T06中，22.2%、33.3%及33.3%之小牛產生病毒血症；此等組與T02無顯著差異。與所有其他處理組相比，在T01及T05中病毒血症之持續時間顯著較長。當藉由WBC自基線減少40%來確定白血球減少症時，T02中有22.2%之小牛在攻擊後有白血球減少症，而所有組中之所有小牛均有白血球減少症。與所有其他組相比，T01及T05中之小牛的白血球減少症之持續時間顯著較長(組T01-T06分別為8.6天、0天、0.2天、0.7天、6.7天、及0.8天)。在此研究中在攻擊後僅觀測到臨床疾病之輕微體征。在T01對照組中，22.2%之小牛在攻擊後具有2之臨床分數，而T05中有11.1%之小牛在攻擊後具有2之臨床分數。任何其他處理組中無小牛在攻擊後具有2之臨床分數。

在第1天及第29天，在T02中觀測到短暫發熱。所有其他小牛之溫度在整個研究期間正常。

具有不同上標之值具有顯著差異(p0.10)

對個別動物之分析顯示在組T02(經含有奎爾A之佐劑佐劑化)中，四隻動物在首次注射後具有超過103.5℉之溫度，且兩隻動物在第二次注射後具有超過103.5℉之溫度。此外，一隻動物在第1天(首次疫苗接種後一天)具有溫度103.2℉，且五隻在第29天(第二次疫苗接種後一天)具有103.0℉-103.4℉範圍內之溫度。相比之下，用缺少奎爾A之佐劑接種疫苗之動物中無一者在首次疫苗接種後或第二次疫苗接種後具有超過103.5℉之溫度。兩者具有103.0℉-103.4℉範圍內之溫度。

在此研究中未觀測到>200cm³之注射部位反應。與所有其他處理組相比，在第2天、第7天及第29天，組T02(經含有奎爾A之佐劑佐劑化)具有顯著較大之注射部位反應。在T02(第二次注射)及T06(首次注射)中，在第49天，可量測之注射部位反應仍存在。

具有不同上標之值具有顯著差異(p0.10)

總之，疫苗候選者T02、T03、T04及T06符合在所有小牛中提供BVDV2效價>1：8之結果準則。疫苗候選者T02亦提供針對病毒血症之100%保護及針對白血球減少症(如藉由WBC減少40%所量測)之完全保護。該組中之小牛遭受短暫發熱及注射部位反應。

本說明書中所引用之所有出版物(專利公開案及非專利出版物兩者)皆指示熟習本發明所屬技術者之技能水準。所有此等出版物均以引用方式完全併入本文中，其程度如同特定及個別地指示各個別出版物以引用方式併入本文中一般。

儘管在本文已參考特定具體實例描述本發明，但應瞭解，此等具體實例僅僅說明本發明之原理及應用。因此應瞭解，可對說明性具體實例作出許多修改且可設計其他配置而不脫離如由以下申請專利範圍所確定之本發明的精神及範疇。

<110> Zoetis Services LLC Dominowski,Paul J Mwangi,Duncan Rai,Sharath K Foss,Dennis L Godbee,Traci K Sly,Laurel M Mahan,Suman Vora,Shaunak

<120> 脂質體佐劑組合物

<130> ZP000111

<150> US 62/194,355

<151> 2015-07-20

<160> 136

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

<400> 1

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

<400> 2

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

<400> 3

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 5’-碘-2’-去氧尿苷

<400> 4

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 5’-碘-2’-去氧尿苷

<400> 5

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 5’-碘-2’-去氧尿苷

<400> 6

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 5’-乙基-2’-去氧尿苷

<400> 7

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 5’-碘-2’-去氧尿苷

<400> 8

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 5’-碘-2’-去氧尿苷

<400> 9

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG寡核苷酸

<400> 10

<210> 11

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫刺激性寡核糖核苷酸

<400> 11

<210> 12

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫刺激性寡核糖核苷酸

<400> 12

<210> 13

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫刺激性寡核糖核苷酸

<400> 13

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA/RNA雜合體

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(17)

<223> 核糖核苷酸

<400> 14

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 15

<210> 16

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 16

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

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<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 18

<210> 19

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 19

<210> 20

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 20

<210> 21

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 21

<210> 22

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 22

<210> 23

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 23

<210> 24

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 24

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<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

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<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

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<212> PRT

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<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

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<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 31

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<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 34

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

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<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 36

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<211> 16

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<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 38

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<211> 16

<212> PRT

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<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 39

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 40

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 41

<210> 42

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 42

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 43

<210> 44

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 44

<210> 45

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 45

<210> 46

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 46

<210> 47

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 47

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 48

<210> 49

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 49

<210> 50

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 50

<210> 51

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 51

<210> 52

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 52

<210> 53

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 53

<210> 54

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 54

<210> 55

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 55

<210> 56

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 56

<210> 57

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 57

<210> 58

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 58

<210> 59

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 59

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 60

<210> 61

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 61

<210> 62

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 62

<210> 63

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

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<210> 64

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 64

<210> 65

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 65

<210> 66

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 66

<210> 67

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 67

<210> 68

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 68

<210> 69

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 69

<210> 70

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 70

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 71

<210> 72

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 72

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 73

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 74

<210> 75

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 75

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 76

<210> 77

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 77

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 78

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 79

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 80

<210> 81

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 81

<210> 82

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 82

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 83

<210> 84

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 84

<210> 85

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 85

<210> 86

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 86

<210> 87

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 87

<210> 88

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 88

<210> 89

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 89

<210> 90

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 90

<210> 91

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 91

<210> 92

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 92

<210> 93

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 93

<210> 94

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 94

<210> 95

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 95

<210> 96

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 96

<210> 97

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 97

<210> 98

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 98

<210> 99

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 99

<210> 100

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 100

<210> 101

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 101

<210> 102

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 102

<210> 103

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 103

<210> 104

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 104

<210> 105

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 105

<210> 106

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 106

<210> 107

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 107

<210> 108

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 108

<210> 109

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 109

<210> 110

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 110

<210> 111

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 111

<210> 112

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 112

<210> 113

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 113

<210> 114

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 114

<210> 115

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 115

<210> 116

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 116

<210> 117

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 117

<210> 118

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 118

<210> 119

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 119

<210> 120

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 120

<210> 121

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 121

<210> 122

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 122

<210> 123

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 123

<210> 124

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 124

<210> 125

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 125

<210> 126

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 126

<210> 127

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 127

<210> 128

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 128

<210> 129

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 129

<210> 130

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 130

<210> 131

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 131

<210> 132

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 132

<210> 133

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 133

<210> 134

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 134

<210> 135

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 135

<210> 136

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬流行性感冒病毒NP蛋白質之片段

<400> 136

Claims

一種脂質體，其包含外部脂質雙層膜及內部隔室，該外部膜包含：a)四級銨化合物；b)固醇；c)磷脂；及d)式I之醣脂：
其中R¹及R²獨立地為氫、或具有至多20個碳原子之飽和烷基；X為-CH₂-、-O-或-NH-；R²為氫、或具有至多20個碳原子之飽和或不飽和烷基；R³、R⁴及R⁵獨立地為氫、-SO₄ ^2-、-RO₄ ^2-、-COC_1-10烷基；R⁶為L-丙胺醯基、L-α-胺基丁基、L-精胺醯基、L-天冬醯胺醯基、L-天冬胺醯基、L-半胱胺醯基、L-麩胺醯基、L-甘胺醯基、L-組胺醯基、L-羥脯胺醯基、L-異白胺醯基、L-白胺醯基、L-離胺醯基、L-甲硫胺醯基、L-鳥胺醯基、L-苯丙胺醯基、L-脯胺醯基、L-絲胺醯基、L-蘇胺醯基、L-酪胺醯基、L-色胺醯基、及L-纈胺醯基或其D-異構體，其中該脂質體基本上不含皂苷。
如請求項1之脂質體，其中該脂質體不含皂苷。
如請求項1之脂質體，其中該四級銨化合物為二甲基二-十八烷基銨(dimethyldioctade cylammonium；DDA)，該固醇為膽固醇，且該醣脂為N-(2-去氧-2-L-白胺醯基胺基-β-D-葡萄哌喃醣基)-N-十八烷基十二醯基醯胺或其鹽。
如請求項1之脂質體，其在該內部隔室中進一步包含選自由以下組成之群的免疫刺激性寡核苷酸：免疫刺激性核糖核苷酸、CpG寡去氧核糖核苷酸及其組合。
如請求項4之脂質體，其中該免疫刺激性寡核苷酸包含SEQ ID NO 1-14中之任一者。
一種佐劑調配物，其包含如請求項1至5中任一項之脂質體，其中該佐劑調配物基本上不含皂苷。
如請求項6之佐劑組合物，其中該佐劑調配物不含皂苷。
一種疫苗組合物，其包含有效量之抗原組分及如請求項6之佐劑調配物，其中該疫苗組合物基本上不含皂苷。
如請求項8之疫苗組合物，其中該疫苗組合物不含皂苷。
如請求項8之疫苗組合物，其中該抗原組分處於該內部隔室內。
如請求項8之疫苗組合物，其中該抗原組分係選自由以下組成之群之感染下列之病原體的抗原：牛、山羊、豬、家禽、馬、犬及貓。
如請求項8之疫苗組合物，其中該免疫刺激性寡核苷酸包含CpG寡去氧核糖核苷酸。
如請求項9之疫苗組合物，其中該抗原組分包含牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBR)、牛病毒性腹瀉病毒-1(BVDV-1)、及牛病毒性腹瀉病毒-2(BVDV-2)，且其中該疫苗組合物不含皂苷。
一種如請求項8至13中任一項之疫苗組合物的用途，其係用於製備在牛中誘導針對牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)之免疫反應的藥物。
如請求項14之用途，其中誘導該免疫反應而不伴有發熱。
如請求項12之疫苗組合物，其中該抗原包含家禽抗原。
如請求項16之疫苗組合物，其中該抗原為組裝抑制蛋白(profilin)。
一種如請求項8至13、16及17中任一項之疫苗組合物的用途，其係用於製備在感染艾美球蟲(Eimeria)之家禽動物中預防艾美球蟲卵囊脫落之藥物。
如請求項11之疫苗組合物，其中該抗原組分包含ssRNA病毒，且其中該疫苗組合物實質上不含CpG寡去氧核糖核苷酸。
如請求項19之疫苗組合物，其中該ssRNA病毒為流行性感冒病毒。
如請求項20之疫苗組合物，其中該流行性感冒病毒為不活化豬流行性感冒病毒(SIV)。
一種製備如請求項1之脂質體的方法，該方法包括：a)將該四級銨化合物、該固醇、該磷脂、及該式I之醣脂溶解於有機溶劑中：
其中R¹及R²獨立地為氫、或具有至多20個碳原子之飽和烷基；X為-CH₂-、-O-或-NH-；R²為氫、或具有至多20個碳原子之飽和或不飽和烷基；R³、R⁴及R⁵獨立地為氫、-SO₄ ^2-、-PO₄ ^2-、-COC_1-10烷基；R⁶為L-丙胺醯基、L-α-胺基丁基、L-精胺醯基、L-天冬醯胺醯基、L-天冬胺醯基、L-半胱胺醯基、L-麩胺醯基、L-甘胺醯基、L-組胺醯基、L-羥脯胺醯基、L-異白胺醯基、L-白胺醯基、L-離胺醯基、L-甲硫胺醯基、L-鳥胺醯基、L-苯丙胺醯基、L-脯胺醯基、L-絲胺醯基、L-蘇胺醯基、L-酪胺醯基、L-色胺醯基、及L-纈胺醯基或其D-異構體；b)移除該有機溶劑且形成膜；c)將該膜在含水溶劑中再水化，從而形成再水化之組合物；d)將該再水化之組合物微流體化。
如請求項22之方法，其中該含水溶劑包含免疫刺激性寡核苷酸。