JP2018524388A - リポソームアジュバント組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、外部膜及び内部区画を含むリポソームアジュバント組成物を提供し、外部膜は、第四級アンモニウム化合物；ステロール；リン脂質；及び糖脂質を含む。本発明のリポソームアジュバントを含むワクチン組成物も提供する。
【選択図】なし

Description

[０００１]
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年７月２０日に出願された米国仮出願第６２／１９４，３５５号の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

[０００２]
本発明は、ワクチンアジュバントの分野である。

[０００３]
ワクチン学の領域において、抗原、従って、潜在的な病原菌に対する免疫応答を刺激するように、抗原は、宿主に導入される。免疫応答の誘発は、多くの要因に依存しており、とりわけ、抗原の化学組成物、特徴及び構成、宿主の健康及び免疫能力、及び抗原の送達及び投与様式であると考えられる。

[０００４]
免疫応答は、多くの様相を有しており、それらのいくつかは、免疫系の細胞（例えば、樹状細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、マクロファージ、及び血漿細胞）により示される。免疫系の細胞は、免疫系の抗原または他の細胞との相互作用、サイトカインの放出、及びそれらのサイトカインに対する反応性を通じて免疫応答に参加する。適応（後天性）免疫応答は、好都合（であるが任意）に２つの主要カテゴリー、体液性及び細胞性に分けられる。免疫応答の体液性成分は、抗原に特異的な抗体の産生を含む。細胞性成分は、遅延型過敏症及び抗原に特異的な細胞毒性エフェクターＴ細胞の生成を含む。

[０００５]
アジュバントは、抗原と組み合わせて使用した場合に免疫応答を強化するために使用される物質である。ワクチン接種プロトコルにおけるアジュバントの使用は、例えば、抗原のみで誘発されるものよりもより速くかつより大きな免疫応答を誘発し得る。加えて、アジュバントを用いて、免疫応答を特定の免疫経路に仕向けて、抗原の送達ビヒクルとして機能し得る。

[０００６]
リポソーム及びリポソーム製剤は、アジュバントの例である。典型的には、リポソームは、抗原（複数可）及び／または他の免疫調節化合物と共にロードすることができ、またはリポソーム自体は、スタンドアロンアジュバントとして機能し得る。抗原及び／または他の免疫刺激化合物は、リポソームの内部に封入され得、及び／またはそれらは、リポソームに付着することができるかまたは脂質二重層に組み込むことができる。

[０００７]
所与のシステムプレゼンテーションにおける送達ビヒクルとして所与のリポソームの適合性に影響を及ぼす要因は、不明なままである。従って、有効性の改善をもたらす送達ビヒクルの必要性が依然としてある。そのような送達の改善は、特に、免疫応答を刺激及び／または引き起こす分子、例えば、抗原及び免疫調節剤に対してである。

[０００８]
本発明は、ワクチンの性能を強化するためのアジュバントに関する。
[０００９]
ある特定の態様では、本発明は、外部脂質二重膜及び内部区画を含むリポソームを提供し、外部脂質二重膜は、第四級アンモニウム化合物；ステロール；リン脂質；及び式Ｉの糖脂質を含み：

式中、Ｒ^１及びＲ^２は、独立して、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキルラジカルであり；Ｘは、−ＣＨ_２−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり；Ｒ^２は、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和もしくは不飽和アルキルラジカルであり；Ｒ^３、Ｒ^４、及びＲ^５は、独立して、水素、−ＳＯ_４ ^２−、−ＰＯ_４ ^２−、−ＣＯＣ_１−１０アルキルであり；Ｒ^６は、Ｌ−アラニル、Ｌ−α−アミノブチル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパルギニル、Ｌ−アスパルチル、Ｌ−システイニル、Ｌ−グルタミル、Ｌ−グリシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−ヒドロキシプロリル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシル、Ｌ−リシル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチニル、Ｌ−フェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ−トレオニル、Ｌ−チロシル、Ｌ−トリプトファニル、及びＬ−バリルまたはそれらのＤ型異性体である。

[００１０]
ある特定の実施形態では、第四級アンモニウム化合物は、ＤＤＡであり、ステロールは、コレステロールであり、リン脂質は、レシチンであり、糖脂質は、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドまたはその酢酸塩である。

[００１１]
ある特定の実施形態では、リポソームは、本質的にサポニンを含まない。
[００１２]
ある特定の実施形態では、リポソームは、免疫刺激リボヌクレオチド、ＣｐＧオリゴデオキシリボヌクレオチド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される免疫刺激オリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、リポソームは、ＣｐＧオリゴデオキシリボヌクレオチドを含まない。

[００１３]
いくつかの実施形態では、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、リポソームの内部区画内に組み込まれる。他の実施形態では、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、リポソームの外表面と関連付けられる。

[００１４]
いくつかの実施形態では、前記免疫刺激オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１４のいずれか１つを含む。

[００１５]
ある特定の態様では、本発明は、本明細書に記載のリポソームを含むアジュバント製剤を提供する。

[００１６]
ある特定の実施形態では、アジュバント製剤は、本質的にサポニンを含まない。ある特定の実施形態では、アジュバント製剤は、ＣｐＧオリゴデオキシリボヌクレオチドを本質的に含まない。

[００１７]
ある特定の態様では、本発明は、有効量の抗原成分及び本明細書に記載のアジュバント製剤を含むワクチン組成物を提供する。

[００１８]
ある特定の実施形態では、ワクチン組成物は、本質的にサポニンを含まない。
[００１９]
ある特定の実施形態では、ワクチン組成物は、ＣｐＧを本質的に含まない。ある特定の実施形態では、本質的にＣｐＧを含まないワクチン組成物の抗原成分は、（−）ｓｓＲＮＡウイルスを含有する。

[００２０]
ある特定の実施形態では、（−）ｓｓＲＮＡウイルスは、インフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルスは、ブタインフルエンザウイルスである。

[００２１]
ある特定の実施形態では、抗原成分は、リポソームの内部区画内に組み込まれる。
[００２２]
抗原成分は、ウシに適した選択実施形態では、ＢＶＤＶ−１及び／またはＢＶＤＶ−２不活性化ウイルス（及びＢＨＶ−１）を含み得る。家禽動物に特に適した他の実施形態では、抗原成分は、プロフィリンを含む。

[００２３]
定義：
[００２４]
測定可能な数値変数に関して使用する場合、「約」または「おおよそ」とは、「約３週間」が１７〜２５日間であり、約２〜４週間が１０〜４０日間である週単位の時間間隔に関して「約」を使用しない限り、変数の示された値、及び示された値の実験誤差内（例えば、平均の９５％信頼区間内）または示された値の１０パーセント以内のどちらか大きい方に入る変数のすべての値を指す。

[００２５]
「随伴発熱」という用語は、ワクチン接種の１日以内にワクチン接種された動物の温度の上昇を指す。ウシの場合には、用語は、華氏１０３．５を上回る直腸温度を指す。

[００２６]
種と組み合わせた「抗原」という用語は、前記種中で感染症を引き起こす病原菌、またはこれらの病原菌の成分を指す。従って、例えば、「ウシ抗原」は、ウシ中で感染症を引き起こすことが可能な病原菌、またはこれらの病原菌の成分を指す。

[００２７]
本発明のリポソーム及びアジュバント製剤に適用した際の「から本質的になる」などの用語は、追加のアジュバント剤または免疫調節剤を、前記薬剤が測定可能なアジュバント効果または免疫調節効果を発揮する量で含有しない組成物を指す。

[００２８]
「本質的にサポニンを含まない」、「実質的にサポニンを含まない」などの用語は、サポニンが測定可能なアジュバント効果または免疫調節効果を発揮する量でサポニンを含有しない組成物を指す。ある特定の実施形態では、本質的にサポニンを含まない組成物は、発熱などの全身免疫応答を引き起こすのに不十分な量でサポニンを含有する。ある特定の実施形態では、本質的にサポニンを含まない組成物は、サポニンを全く含有しない、または検出限界でもしくは検出限界を下回るサポニンを含有する。

[００２９]
同様に、「ＣｐＧデオキシリボヌクレオチドを本質的に含まない」、「ＣｐＧデオキシリボヌクレオチドを実質的に含まない」などの用語は、ＣｐＧデオキシリボヌクレオチドが測定可能なアジュバント効果または免疫調節効果を発揮する量でＣｐＧデオキシリボヌクレオチドを含有しない組成物を指す。ある特定の実施形態では、ＣｐＧデオキシリボヌクレオチドを本質的に含まない組成物は、ＣｐＧデオキシリボヌクレオチドを全く含有しない、または検出限界でもしくは検出限界を下回るＣｐＧデオキシリボヌクレオチドを含有する。「ＣｐＧデオキシリボヌクレオチドを本質的に含まない」、「ＣｐＧデオキシリボヌクレオチドを実質的に含まない」などの用語は、ＣｐＧデオキシリボヌクレオチドが抗原に自然に存在するワクチンを特に除外する。

[００３０]
「免疫刺激分子」という用語は、免疫応答を強化する分子を指す。
[００３１]
「リポソーム」という用語は、水性区画を囲む脂質二重層により形成された微視的球状粒子を指す。

[００３２]
「非経口投与」という用語は、消化管を含まない経路の経由または経路を介して対象の身体にワクチンなどの物質の導入を指す。非経口投与は、皮下、筋肉内、経皮、皮内、腹腔内、眼内、及び静脈内投与を含む。

[００３３]
「治療有効量」及び「有効量」という用語は、ウイルスまたは細菌などの病原菌への感染により引き起こされる有害な健康作用もしくはその合併症をはじめとする疾患の兆候もしくは症状を予防または減少するのに十分な抗原またはワクチンを受けた対象において免疫応答を誘導する抗原またはワクチンの量を指す。体液性免疫もしくは細胞性免疫のいずれか、または体液性及び細胞性免疫の両方が、誘導され得る。動物におけるワクチンの免疫原性及び有効性は、例えば、抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイ、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、細胞毒性Ｔ細胞アッセイを通して間接的に、または野生株でのチャレンジ後の兆候及び症状をモニタリングすることにより直接、評価され得る。ワクチンにより付与される防御免疫は、例えば、対象の死亡率、罹患率、発熱、ウイルス血症、臨床病理学への影響、全体的身体状態、並びに全体的健康及び行動などの臨床兆候の低減を測定することにより評価することができる。治療に有効なワクチンの量は、使用した特定のアジュバント、使用した特定の抗原、または対象の状態に応じて変化し得、当業者によって決定することができる。

[００３４]
本発明は、一部は、内部区画及び外部膜を含有するリポソームを提供する。リポソームは、５０〜５００ｎｍの平均粒径を有し得る。ある特定の非限定実施形態では、リポソームの平均粒径は、１００〜５００ｎｍ、または１５０〜４５０ｎｍ、または１５０〜２５０ｎｍ、または３００〜４００ｎｍ、または２５０〜３００ｎｍである。ある特定の実施形態では、膜は、第四級アミン化合物、リン脂質、ステロール、及び糖脂質を含む。ある特定の実施形態では、リポソームは、サポニンを本質的に含まない。

[００３５]
ある特定の実施形態では、外部膜は、第四級アミン化合物、リン脂質、ステロール、及び糖脂質から本質的になるまたはからなる。他の実施形態では、リポソームの外部区画は、任意の免疫刺激オリゴヌクレオチド及び／または他の免疫調節化合物を含有しない。従って、かかる実施形態では、リポソームは、免疫学的に不活性な水性ビヒクルから本質的になるかまたはからなる内部区画から本質的になるまたはからなり、前記内部区画は、第四級アミン化合物、リン脂質、ステロール、及び糖脂質から本質的になるまたはからなる外部膜によって包囲されている。

[００３６]
第四級アミン化合物は、４つの炭化水素基を有するアンモニウムベースの化合物である。実際に、炭化水素基は、一般に、アルキルまたはアリール基に限定される。一組の実施形態では、第四級アミン化合物は、４つのアルキル鎖で構成され、そのうちの２つは、Ｃ１０〜Ｃ２０アルキルであり、残りの２つは、Ｃ１〜Ｃ４アルキルである。ある特定の実施形態では、第四級アミンは、臭化もしくは塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、または薬学的に許容できる対イオンである。

[００３７]
ステロールは、共通の化学的コアを有しており、コアは、ステロイド環構造（複数可）であり、通常は３位炭素に結合した、ヒドロキシル（ＯＨ）基を有する。脂肪酸置換基の炭化水素鎖は、長さが種々で通常１６〜２０炭素原子であり、飽和または不飽和であり得る。ステロールは、共通して環構造内の１つまたは複数の二重結合、及び環に結合した種々の置換基を含む。ステロール及びそれらの脂肪酸エステルは、本質的に水に不溶性である。従って、これらの化学的類似性の観点から、この化学的コアを共有するステロールは、本発明のワクチン組成物中で用いられた場合に類似の特性を有する可能性がある。ステロールは、当該技術分野で周知であり、購入することができる。例えば、コレステロールは、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，１２ｔｈ Ｅｄ．，ｐ．３６９に開示されている。適切なステロールとしては、β‐シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール、及びコレステロールが挙げられるが、これらに限定されない。

[００３８]
適切な糖脂質は、一般に、Ｔｈ２応答を活性化する糖脂質である。糖脂質としては、式Ｉによりもたらされ、米国特許公開第２００７０１９６３８４号（Ｒａｍａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ）に概ね記載される糖脂質が挙げられるが、これらに限定されない。

[００３９]
式Ｉの構造では、Ｒ^１及びＲ^２は、独立して、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキルラジカルであり；Ｘは、‐ＣＨ_２‐、‐Ｏ‐、または‐ＮＨ‐であり；Ｒ^２は、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和もしくは不飽和アルキルラジカルであり；Ｒ^３、Ｒ^４、及びＲ^５は、独立して、水素、‐ＳＯ_４ ^２‐、‐ＰＯ_４ ^２‐、‐ＣＯＣ_１‐１０アルキルであり；Ｒ^６は、Ｌ‐アラニル、Ｌ‐α‐アミノブチル、Ｌ‐アルギニル、Ｌ‐アスパルギニル、Ｌ‐アスパルチル、Ｌ‐システイニル、Ｌ‐グルタミル、Ｌ‐グリシル、Ｌ‐ヒスチジル、Ｌ‐ヒドロキシプロリル、Ｌ‐イソロイシル、Ｌ‐ロイシル、Ｌ‐リシル、Ｌ‐メチオニル、Ｌ‐オルニチニル、Ｌ‐フェニルアラニル、Ｌ‐プロリル、Ｌ‐セリル、Ｌ‐トレオニル、Ｌ‐チロシル、Ｌ‐トリプトファニル、及びＬ‐バリル、またはそれらのＤ型異性体である。

[００４０]
糖脂質の例としては、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミド（ＢａｙＲ（登録商標）１００５、またはＲ１００５）またはその塩（例えば、酢酸塩）であるが、それらに限定されない。

[００４１]
レシチンは、粗植物油を水洗し、得られた含水ゴムを分離及び乾燥させることにより、ホスファチドとトリグリセリドとの混合物として得ることができる。トリグリセリド及び植物油をアセトン洗浄により除去した後に残留するアセトン不溶性のリン脂質と糖脂質について混合物を分画することにより、精製された生成物を得ることができる。あるいは、レシチンは、種々の商業的供給源から得ることができる。

[００４２]
他の適切なリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、アシルホスファチジルエタノールアミン、ジホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、及びホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。リン脂質は、天然の供給源から単離されても、または従来通り合成されてもよい。

[００４３]
本明細書に記載のリポソームにより、外部膜の要素の柔軟な比が可能になる。ある特定の実施形態では、第四級アンモニウム化合物：ステロール：リン脂質：糖脂質の重量比は、それぞれ、１：０．７５〜１．２５：１．５〜２．５：１．５〜２．５である。ある特定の実施形態では、第四級アンモニウム化合物：ステロール：リン脂質：糖脂質の重量比は、１：１：２：２である。

[００４４]
他の実施形態では、第四級アンモニウム化合物及びステロールの総重量は、糖脂質及びリン脂質の総重量の約半分（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％）であり、ただし、第四級アンモニウム化合物は、これらの４つの化合物（第四級アンモニウム化合物、ステロール、リン脂質、及び糖脂質）の総重量の少なくとも約５％ｗ／ｗを含み、糖脂質は、これらの４つの化合物の総重量の少なくとも約２０％ｗ／ｗである。

[００４５]
ある特定の実施形態では、第四級アンモニウム化合物及びステロールの総重量は、糖脂質及びリン脂質の総重量の約１０〜４０％（例えば、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３３．３％、約３５％、約４０％）であり、ただし、第四級アンモニウム化合物は、これらの４つの化合物（第四級アンモニウム化合物、ステロール、リン脂質、及び糖脂質）の総重量の少なくとも約５％ｗ／ｗを含み、糖脂質は、これらの４つの化合物の総重量の少なくとも約２０％ｗ／ｗである。

[００４６]
ある特定の実施形態では、本発明のリポソームの免疫学的有効量をアジュバントとして投与し得る。いくつかの実施形態では、本発明は、以下でさらに説明するように、免疫学的有効量のアジュバント組成物、及び抗原成分を含むワクチン組み合わせを提供する。

[００４７]
クライアント種の重量は、本発明のアジュバント組成物の用量を最終的に決定づける。
[００４８]
ウシ、ウマ、及び成熟ブタに適したある特定の実施形態では、一用量は、外部膜成分（すなわち、第四級アンモニウム化合物、ステロール、リン脂質、及び糖脂質の総重量）の１０００〜３０００μｇの同等物、または１０００〜２０００μｇの同等物、または１０００〜１５００μｇの同等物、または１３００〜１８００μｇの同等物、または１５００〜２０００μｇの同等物を含有する。

[００４９]
リポソーム組成物の重量は、免疫刺激オリゴヌクレオチド、抗原成分、他の免疫調節剤などを含有し得る内部区画の存在により、膜成分の重量と等しくなくてもよい。リポソーム膜成分と同等物の使用により均一な投与が可能になる。本明細書に記載される投与レジメンにより、ウシ動物は、少なくとも２００μｇの糖脂質、及び約５０μｇの第四級アンモニウム化合物を受けることが保証される。

[００５０]
ヒツジ及びヤギに適したある特定の実施形態では、一用量は、外部膜成分の３００〜１０００μｇの同等物、例えば、３００〜５００μｇの同等物、または４００〜５００μｇの同等物、または４００〜１０００μｇの同等物、または５００〜１０００μｇの同等物、または６００〜１０００μｇの同等物、または６００〜８００μｇの同等物を含有する。

[００５１]
子豚、イヌ、及びネコに適したある特定の実施形態では、一用量は、外部膜成分の１００〜４００μｇの同等物、または１００〜２００μｇの同等物、または１００〜１５０μｇの同等物、または１３０〜１８０μｇの同等物、または１５０〜２００μｇの同等物を含有する。

[００５２]
家禽に適したある特定の実施形態では、一用量は、外部膜成分の５０〜２００μｇの同等物、または５０〜１００μｇの同等物、または５０〜７５μｇの同等物、または６５〜９０μｇの同等物、または７５〜１００μｇの同等物、または７５〜１５０μｇの同等物を含有する。

[００５３]
リポソームの内部化合物は、抗原または他の免疫調節分子を含有し得る。ある特定の実施形態では、内部区画に適したそのような免疫調節分子としては、抗原抽出物、サブユニット、合成物、全細胞またはウイルスが挙げられるが、これらに限定さらない。

[００５４]
ある特定の実施形態では、活性薬剤をリポソーム内に包装してもよい。
[００５５]
包装され得る免疫調節剤としてはまた、ｒｍＬＴ、ＭＰＬＡ、α−Ｇａｌ−Ｃｅｒ、コレラ毒素、ＬＰＳ、リポテイコ酸、ポリＩ：Ｃ、フラジェリン、ザイモサン、キチン及び修飾キチン形態、β−グルカン、アブリジン、イヌリン及び修飾イヌリン形態、エチレン無水マレイン酸、Ｌ１２１及びＬ１４１のようなプルロニック、ＣＤ４０アゴニスト、ＴＬＲ５アゴニスト、並びに任意のＴＬＲアゴニスト、ＧＭ−ＣＳＦが挙げられるが、これらに限定されない。

[００５６]
ある特定の実施形態では、リポソームは、限定されないが、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ペルラクチン及び他のものをはじめとするマーカーとして使用することができる種々の分子を担持し得る。

[００５７]
ある特定の実施形態では、本発明のアジュバント組成物は、例えば、ＣｐＧオリゴデオキシリボヌクレオチドまたは免疫刺激オリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）、またはそれらのキメラなどの免疫刺激オリゴヌクレオチドをさらに含む。ＣｐＧオリゴデオキシリボヌクレオチドの適切な非限定例は、配列番号１〜１０に示され、ＯＲＮの適切な非限定例は、配列番号１１〜１３に提供され、キメラ免疫刺激オリゴヌクレオチドの適切な非限定例は、配列番号１４に提供される。

[００５８]
これらの免疫刺激オリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、リポソームの内部区画に存在する。

[００５９]
ある特定の実施形態では、免疫調節オリゴヌクレオチドは、リポソームの外表面と会合している。会合は、水素結合、静電結合、親油性結合、ファンデルワールス力などによるものであろう。

[００６０]
ある特定の実施形態では、負に帯電した免疫刺激オリゴヌクレオチドは、第四級アンモニウム化合物中の正に帯電した第四級窒素原子との相互作用によりリポソームの外表面と会合している。

[００６１]
ＣｐＧオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＣｐＧデオキシリボヌクレオチドまたはＣｐＧＯＤＮとも呼ばれる）は、特定の塩基配列状態（ＣｐＧモチーフ）における非メチル化ＣＧジヌクレオチドの存在により特徴付けられる薬物療法剤の近年記載された分類である（参照により本明細書に組み込まれるＨａｎｓｅｌ ＴＴ，Ｂａｒｎｅｓ ＰＪ（ｅｄｓ）：Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ ｆｏｒ Ａｓｔｈｍａ，Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ ＣＯＰＤ．Ｐｒｏｇ Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ．Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ，２００１，ｖｏｌ ３１，ｐｐ２２９−２３２）。これらのＣｐＧモチーフは、ＣＧジヌクレオチドが抑制された真核細胞ＤＮＡ中には認められず、存在する場合には通常メチル化されているが、細菌ＤＮＡ中には存在して、免疫刺激特性を付与する。

[００６２]
ある特定の実施形態では、本発明のアジュバントは、いわゆるＰクラス免疫刺激オリゴヌクレオチド、より好ましくは、修飾されたＰクラス免疫刺激オリゴヌクレオチド、さらにより好ましくは、Ｅ修飾されたＰクラスオリゴヌクレオチドを利用する。Ｐクラス免疫刺激オリゴヌクレオチドは、パリンドロームの存在を特徴とし、一般に６〜２０ヌクレオチド長のＣｐＧオリゴデオキシリボヌクレオチドである。Ｐクラスオリゴヌクレオチドは、インビトロ及び／またはインビボのいずれかで自発的にコンカタマーに自己組織化する能力を有する。これらのオリゴヌクレオチドは、厳密に言えば一本鎖であるが、パリンドロームの存在によりコンカタマー、またはことによるとステム・ループ構造の形成が可能になる。Ｐクラス免疫刺激オリゴヌクレオチドの全長は、１９〜１００ヌクレオチド、例えば、１９〜３０ヌクレオチド、３０〜４０ヌクレオチド、４０〜５０ヌクレオチド、５０〜６０ヌクレオチド、６０〜７０ヌクレオチド、７０〜８０ヌクレオチド、８０〜９０ヌクレオチド、９０〜１００ヌクレオチドである。

[００６３]
本発明の一態様では、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、５’ＴＬＲ活性化ドメイン及び少なくとも２つのパリンドローム領域を含み、一方のパリンドローム領域は、少なくとも６ヌクレオチド長の５’パリンドローム領域であり、少なくとも８ヌクレオチド長の３’パリンドローム領域に直接またはスペーサーを介して連結されている。

[００６４]
Ｐクラス免疫刺激オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で公知の技術により修飾され得る。例えば、Ｊ修飾は、ヨード修飾されたヌクレオチドを指す。Ｅ修飾は、エチル修飾されたヌクレオチド（複数可）を指す。従って、Ｅ修飾されたＰクラス免疫刺激オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチド（好ましくは、５’ヌクレオチド）がエチル化されているＰクラス免疫刺激オリゴヌクレオチドである。追加の修飾としては、６‐ニトロベンゾイミダゾールの結合、Ｏ‐メチル化、プロニリル‐ｄＵでの修飾、イノシン修飾、２‐ブロモビニル結合（好ましくは、ウリジンへの）が挙げられる。

[００６５]
Ｐクラス免疫刺激オリゴヌクレオチドはまた、非限定的にホスホジエステル結合及びホスホロチオエート結合をはじめとする、修飾されたヌクレオチド間結合を含有し得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、合成されていても、または商業的供給源から得られてもよい。

[００６６]
Ｐクラスオリゴヌクレオチド及び修飾されたＰクラスオリゴヌクレオチドは、２００８年６月１２日出願の発行された公開ＰＣＴ出願第ＷＯ２００８／０６８６３８号にさらに開示されている。修飾されたＰクラス免疫刺激オリゴヌクレオチドの適切な非限定例を、以下の示す（配列番号１〜１０では、「^＊」は、ホスホロチオエート結合を指し、「＿」は、ホスホジエステル結合を指す）。配列番号１１〜１４では、結合は全て、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合である。

配列番号１ ５’Ｔ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ａ＊Ｔ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ３’
配列番号２ ５’Ｔ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ３’
配列番号３ ５’Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ３’
配列番号４ ５’ＪＵ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ３’
配列番号５ ５’ＪＵ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ３’
配列番号６ ５’ＪＵ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ３’
配列番号７ ５’ＥＵ＊Ｃ＿Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ３’
配列番号８ ５’ＪＵ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ３’
配列番号９ ５’ＪＵ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ３’
配列番号１０ ５’Ｔ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ３’
配列番号１１ ５’−ＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵ−３’
配列番号１２ ５’−ＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵ−３’
配列番号１３ ５’−ＡＡＡＣＧＣＵＣＡＧＣＣＡＡＡＧＣＡＧ−３’
配列番号１４ ５’−ｄＴｄＣｄＧｄＴｄＣｄＧｄＴｄＴｄＴｄＴｒＧｒＵｒＵｒＧｒＵｒＧｒＵｄＴｄＴｄＴｄＴ−３’
[００６７]
アジュバント組成物中で使用される免疫刺激オリゴヌクレオチドの用量は、意図した種に最終的に依存する。

[００６８]
例えば、ウシ、ヒツジまたは成体のブタに適したある特定の実施形態では、本発明のアジュバント組成物の１つの用量は、約５０〜４００μｇ（例えば、５０〜３００もしくは１００〜２５０μｇ、または成体のブタでは約５０〜約１００μｇ、ウシでは約１００〜約２５０μｇ）の免疫刺激オリゴヌクレオチドを含む。

[００６９]
コンパニオンアニマルまたは子ブタに適したある特定の実施形態では、本発明のアジュバント組成物の１つの用量は、約５〜１００μｇ（例えば、１０〜８０μｇ、または２０〜５０μｇ）の免疫刺激オリゴヌクレオチドを含む。

[００７０]
家禽に適したある特定の実施形態では、本発明のアジュバント組成物の１つの用量は、免疫刺激オリゴヌクレオチドの約０．１〜約５μｇ（例えば、０．５〜３μｇ、または０．９〜１．１μｇ）である。

[００７１]
リポソームの作製方法は、当該技術分野で周知である。簡単に言えば、リポソームの成分を有機溶媒、例えば、塩化メチレン中に溶解し、混合した後、溶媒を乾燥させて除去し、フィルムを得る。その後、リポソームの内部区画内に組み込まれる化合物を任意に含有する水性培地（例えば、水または緩衝液）を用いて、フィルムを再水和させる。異なる実施形態では、化合物は、免疫刺激オリゴヌクレオチド、他の免疫調節剤、及び／または抗原成分を含み得る。

[００７２]
再水和工程後に、超音波処理及び／または押出しを行って、再水和工程中に形成された小胞のサイズを減少させる。

[００７３]
２つの主要な超音波処理技術：プローブ／チップ超音波処理及びバス超音波処理がある。プローブ／チップ超音波処理は、著しい発熱を引き起こす高エネルギー入力を有するため、脂質分解を防止するためにリポソーム分散の温度を維持する氷浴を使用することが必要である。あるいは、超音波エネルギーは、超音波洗浄器を用いてリポソーム懸濁液に間接的に付与することができ、ここで、温度は制御しやすいが、エネルギー損失は比較的高い。超音波処理は、一般的に、高い膜曲率のストレスを緩和するために経時的に自発的に融合する小さな小胞（〜１０ｎｍ）を生じる。

[００７４]
押出し法は、細孔サイズを定義した膜を介してリポソーム懸濁液を通過させることを含む。脂質転移温度を下回る押出しは膜剛性のために困難になり得るが、定義された細孔サイズは、リポソーム集団内で粒径の均質性を向上させるため、この方法は有利である。リポソーム懸濁液は、最終生成物中の低多分散性を達成するために複数回押出すことが多い。

[００７５]
リポソームの貯蔵安定性調製物を調製することが望ましい場合がある。ある特定の実施形態では、リポソームのそのような貯蔵安定性調製物は、凍結乾燥によって作成される。簡単に言えば、上述の乾燥フィルムは、スクロース、トレハロース、またはそれらの組み合わせなどの凍結防止剤及び凍結乾燥保護剤を含有する水性緩衝液で再水和される。他の実施形態では、凍結防止剤及び凍結乾燥保護剤は、再水和工程後に添加される。その後、当該技術分野で周知の技術を用いて、再水和調製物を凍結乾燥する。得られた凍結乾燥調製物は、貯蔵安定的である。所望の時間で、適切な緩衝液で再水和することができる。

[００７６]
限定されないが、免疫刺激オリゴヌクレオチド及び抗原（複数可）をはじめとする追加の免疫調節剤は、凍結乾燥前または最終調製物の時点のいずれかで添加してもよい。

[００７７]
ある特定の実施形態では、本発明のリポソームを再構成した後に、抗原をリポソーム製剤と混合する。他の実施形態では、リポソーム、追加の免疫調節剤、及び抗原成分を一緒に調製し、乾燥させる。

[００７８]
ある特定の実施形態では、追加の免疫刺激化合物は、本発明の組成物中に存在する。そのような追加の免疫刺激化合物は、本発明のアジュバント組成物中で、リポソームの内部区画内に存在してもよく、及び／またはリポソームの外表面と会合してもよく、及び／またはリポソームと独立していてもよい。

[００７９]
そのような追加の免疫刺激化合物の適切な非限定例としては、無機質塩、例えば、ミョウバン、水酸化アルミニウム、アルミニウムリン酸塩、及びリン酸カルシウム；界面活性剤及びマイクロ粒子、例えば、非イオン性ブロックポリマー界面活性剤、ビロソーム、サポニン（例えば、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ−２１、及びＧＰＩ−０１００）、プロテオソーム、免疫刺激性複合体、コクレエート、ピリジン、ビタミンＡ、ビタミンＥ；ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．）、チモテ菌の細胞壁骨格（Ｄｅｔｏｘ（登録商標））、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）及びトリペプチド（ＭＴＰ）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、熱不安定性大腸菌エンテロトキシン、コレラトキシン、トレハローズジミコレートなどの細菌産物；サイトカイン及びホルモン、例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、デヒドロエピアンドロステロン、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３；ポリアニオン、例えば、デキストラン；ポリアクリル酸（例えば、ポリメタクリル酸メチル、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９３４Ｐ）；担体、例えば、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、コレラトキシンＢサブユニット、エンテロトキシン産生大腸菌の変異体熱不安定性エンテロトキシン（ｒｍＬＴ）、熱ショックタンパク質；水中油型乳剤、例えば、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）（Ｈｙｄｒｏｎｉｃｓ、ＵＳＡ）；ポリカチオン担体（例えば、ＤＥＡＥデキストランまたはＱＡＥデキストラン）、並びに、例えば、フロイント完全及び不完全アジュバントなどの油中水型乳剤など、いくつかのアジュバントクラスが挙げられるが、これらに限定されない。

[００８０]
他の適切な免疫調節剤としては、α−Ｇａｌ−Ｃｅｒ、ＬＰＳ、リポテイコ酸、ポリＩ：Ｃ、フラジェリン、ザイモサン、キチン及び修飾キチン形態、β−グルカン、アブリジン、イヌリン及び修飾イヌリン形態、エチレン無水マレイン酸、Ｌ１２１及びＬ１４１のようなプルロニック、ＣＤ４０アゴニスト、ＴＬＲ５アゴニスト、並びに任意のＴＬＲアゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。
抗原及び疾患
[００８１]
ある特定の実施形態では、本発明のリポソームアジュバント組成物を抗原成分と組み合わせることで、本発明のワクチン組成物を形成し得る。本発明のワクチン抗原成分は、リポソームの内部区画内に存在してもよく、及び／またはリポソームの外表面と会合してもよく、及び／またはリポソームと独立していてもよい。

[００８２]
ある特定の実施形態では、ワクチン組成物は、実質的にサポニンを含まない。さらなる実施形態では、ワクチン組成物は、ＣｐＧデオキシリボヌクレオチドを本質的に含まない。

[００８３]
ワクチン中の抗原が、ＴＬＲ７／８の標的化を介して免疫刺激する全ｓｓＲＮＡウイルス（（＋）ｓｓＲＮＡまたは（−）ｓｓＲＮＡウイルスのいずれか）配列を含有する場合には、ワクチン組成物がＣｐＧデオキシリボヌクレオチドを本質的に含まない実施形態が好ましい。そのようなＴＬＲ７／８刺激配列としては、ポリＵまたはＧＵが豊富なｓｓＲＮＡ 配列が挙げられる（Ｈｅｉｌ Ｆ，Ｈｅｍｍｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，２００４．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３（５６６３）：１５２６−９．Ｄｉｅｂｏｌｄ ＳＳ．，Ｋａｉｓｈｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，２００４．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３（５６６３）：１５２９−３１）。

[００８４]
そのような配列を含有するウイルスとしては、異なるインフルエンザウイルス（例えば、ウシインフルエンザウイルス、イヌインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルスなど）が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい実施形態では、ＣｐＧＯＤＮを本質的に含まないワクチンの抗原成分は、インフルエンザウイルスを含有する。

[００８５]
抗原成分は、異なる例示的実施形態では、ウシ抗原、ヤギ抗原、ブタ抗原、家禽抗原、ウマ抗原、イヌ抗原、ウマ抗原及びネコ抗原を含み得る。

[００８６]
抗原は、非限定的に１つ以上のウイルス（不活化、弱毒化、及び変性生ウイルス）、細菌、寄生虫、ヌクレオチド（非限定的に核酸を基にした抗原、例えば、ＤＮＡワクチンｍＲＮワクチンを含む）、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、合成ペプチド、タンパク質抽出物、細胞（腫瘍細胞を含む）、組織、多糖、炭水化物、脂肪酸、タイコ酸、ペプチドグリカン、脂質、または糖脂質をはじめとする、対象における所望の免疫応答を生じることが可能な幅広い種類の物質のいずれかの個別または任意の組み合わせであり得る。

[００８７]
本発明のアジュバントと共に用いられる抗原としては、本明細書で参照された生物体から単離され得る、または化学的または生物学的に製造され得るヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチドの免疫原性断片も挙げられる。

[００８８]
対象において疾患を引き起こさない生ウイルス株、変性生ウイルス株、及び弱毒化ウイルス株は、適切な細胞株での継代培養または紫外線もしくは化学的突然変異原への暴露など、当該技術分野で周知の方法を利用して、非猛毒性の形態で単離されているか、または弱毒化されている。不活化または死滅したウイルス株は、ホルマリン、βプロプリオラクトン（ＢＰＬ）、過酸化物、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）での処理、放射線滅菌、加熱、または他のそのような方法をはじめとし、当業者に公知の方法により不活化されたものである。

[００８９]
２つ以上の抗原を組み合わせて、病原菌により引き起こされる幅広い種類の疾患に対して対象を防御し得る多価組成物を生成することができる。現在、ワクチンの商業的製造業者及びエンドユーザーは、多価ワクチン製品を好む。従来のアジュバントは、多くの場合、効果的に用いられ得る（一価または多価のいずれか）種々の抗原中に限られるが、本明細書に記載されたアジュバントは、一価または多価の両方で広範囲の抗原と共に効果的に用いることができる。従って、本明細書に記載された抗原は、本明細書に記載されたアジュバントを含む１つの組成物に混和することができる。

[００９０]
本明細書に記載されたアジュバント組成物と共に、抗原として用いることができる細菌の例としては、Ａｃｅｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｅｒｕｉａｎｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ａｒｈａｅｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ属、Ｃｈｒｏｍｏ細菌 ｖｉｓｃｏｓｕｍ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉｅａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｉｓ、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｏｒａｘｅｌｌｓａ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏ血漿ｍｙｃｏｉｄｅｓの亜種、ｍｙｃｏｉｄｅｓ ＬＣ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ （Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ） ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｉｖｏｓａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｃ９、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＳＩＫＷ１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｕｔｅｏｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属Ｂ１１−１、Ａｌｃａｌｉｇｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｍｍｏｂｉｌｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ全血清型（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｂｏｎｇｏｒｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｄｕｂｌｉｎ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｃｈｏｌｅｒａｓｅｕｉｓ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｎｅｗｐｏｒｔなど）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｐｉｒｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｌｙｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｘｆｏｌｉａｔｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｓｙｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｍｉｎｕｔｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｒｅｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｕｅｐｅｒｅｌｌａ ｐｙｏｇｅｎｅｓ並びにＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ属、例えば、公知の病原菌体Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈａｒｄｊｏ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ ｈａｒｄｊｏ−ｂｏｖｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ ｈａｒｄｊｏ−ｐｒａｊｉｔｎｏ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｐｏｍｏｎａ、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

[００９１]
不活化ウイルス及び弱毒化生ウイルスの両方が、アジュバント組成物中で用いられ得る。抗原として用いられ得るウイルスのいくつかの例としては、トリヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、イヌヘルペスウイルス、ウマヘルペスウイルス、ネコウイルス性鼻気管炎ウイルス、マレック病ウイルス、ヒツジヘルペスウイルス、ブタヘルペスウイルス、ブタ流行性下痢症ウイルス（ＰＥＤｖ）、仮性狂犬病ウイルス、トリパラミキソウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、イヌディステンパーウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３、ヒツジパラインフルエンザ３、牛疫ウイルス、ボーダー病ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ＢＶＤＶ Ｉ型、ＢＶＤＶ ＩＩ型、豚コレラウイルス、トリ白血病ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ウシ結核ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ニューカッスル病ウイルス、ヒツジ進行性肺炎ウイルス、ヒツジ肺腺癌ウイルス、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、汎親和性ＣＣＶ、イヌ呼吸器コロナウイルス、ウシコロナウイルス、ネコカリシウイルス、ネコ腸コロナウイルス、ネコ伝染性腹膜炎、ウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ブタパルボウイルス、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）Ｉ型、ＰＣＶ ＩＩ型、ブタ生殖器・呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、シチメンチョウコロナウイルス、ウシ流行熱ウイルス、狂犬病、ロトウイルス、水疱性口炎ウイルス、レンチウイルス、トリインフルエンザ、リノウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、イヌインフルエンザウイルス、ネコインフルエンザウイルス、ヒトインフルエンザウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、及び麻疹ウイルス、並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

[００９２]
ペプチド抗原の例としては、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）ｐ６８、ＧｎＲＨ、ＩｇＥペプチド、Ｆｅｌ ｄ１、及び癌抗原、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。他の抗原に例としては、ヌクレオチド、炭水化物、脂質、糖脂質、ペプチド、脂肪酸、リポタイコ酸、タイコ酸及びペプチドグリカン、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。

[００９３]
本明細書に記載されたアジュバント組成物と共に抗原として用いられ得る寄生虫の例としては、Ａｎａｐｌａｓｍａ、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ（肝臓吸虫）、Ｃｏｃｃｉｄｉａ、Ｅｉｍｅｒｉａ属、Ｎｅｏｓｐｏｒａ ｃａｎｉｎｕｍ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ、Ｇｉａｒｄｉａ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ（ハートワーム）、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ（フックワーム）、Ｃｏｏｐｅｒｉａ、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ（バーバーポールワーム）Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ ｏｓｔｅｒｔａｇｉ（胃虫）、Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ ｖｉｖｉｐａｒｏｕｓ（肺線虫）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ属、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ属、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｂａｂｅｓｉａ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ、Ｔａｅｎｉａ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ、Ａｓｃａｒｉｓ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ、Ｈａｍｍｏｎｄｉａ、及びＩｓｏｐｓｏｒａ、並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。同じく企図されるのは、非限定的にＩｘｏｄｅｓ属、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ属、Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ属、Ａｍｂｌｙｏｍｍａ属、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｈｙａｌｏｍｍａ属、及びＨａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓ属をはじめとするダニ、並びにそれらの組み合わせなどの外部寄生虫である。

[００９４]
免疫応答を誘導するのに用いられる抗原の量は、用いられる抗原、対象、及び所望の応答レベルに応じてかなり変動し、当業者により決定され得る。変性生ウイルスまたは弱毒化ウイルスを含むワクチンの場合、抗原の治療有効量は、一般に約１０^２組織培養感染用量（ＴＣＩＤ）_５０〜約１０^１０ＴＣＩＤ_５０（いずれの数値も含む）の範囲内である。多くのそのようなウイルスでは、治療有効用量は、一般に、約１０^２ＴＣＩＤ_５０〜約１０^８ＴＣＩＤ_５０（いずれの数値も含む）の範囲内である。いくつかの実施形態では、治療有効用量の範囲は、約１０^３ＴＣＩＤ_５０〜約１０^６ＴＣＩＤ_５０（いずれの数値も含む）である。いくつかの他の実施形態では、治療有効用量の範囲は、約１０^４ＴＣＩＤ_５０〜約１０^５ＴＣＩＤ_５０（いずれの数値も含む）である。

[００９５]
不活化ウイルス含有ワクチンの場合、抗原の治療有効量は、一般に、少なくとも約１００相対単位／用量であり、多くの場合、約１，０００〜約４，５００相対単位／用量（いずれの数値も含む）の範囲内である。他の実施形態では、抗原の治療有効量は、約２５０〜約４，０００相対単位／用量（いずれの数値も含む）、約５００〜約３，０００相対単位／用量（いずれの数値も含む）、約７５０〜約２，０００相対単位／用量（いずれの数値も含む）、または約１，０００〜約１，５００相対単位／用量（いずれの数値も含む）の範囲内である。

[００９６]
不活化ウイルス含有ワクチン中の抗原の治療有効量はまた、１ｍＬあたりの相対効力（ＲＰ）に関して測定することができる。治療有効量は、多くの場合、約０．１〜約５０ＲＰ／ｍＬ（いずれの数値も含む）の範囲内である。他の実施形態では、抗原の治療有効量は、約０．５〜約３０ＲＰ／ｍＬ（いずれの数値も含む）、約１〜約２５ＲＰ／ｍＬ（いずれの数値も含む）、約２〜約２０ＲＰ／ｍＬ（いずれの数値も含む）、約３〜約１５ＲＰ／ｍＬ（いずれの数値も含む）、または約５〜約１０ＲＰ／ｍＬ（いずれの数値も含む）の範囲内である。

[００９７]
ワクチン中で投与される細菌抗原についての細胞数は、約１×１０^６〜約５×１０^１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）／用量（いずれの数値も含む）の範囲内である。他の実施形態では、細胞数は、約１×１０^７〜約５×１０^１０ＣＦＵ／用量（いずれの数値も含む）、または約１×１０^８〜約５×１０^１０ＣＦＵ／用量（いずれの数値も含む）の範囲内である。さらに他の実施形態では、細胞数は、約１×１０^２〜約５×１０^１０ＣＦＵ／用量（いずれの数値も含む）、または約１×１０^４〜約５×１０^９ＣＦＵ／用量（いずれの数値も含む）、または約１×１０^５〜約５×１０^９ＣＦＵ／用量（いずれの数値も含む）、または約１×１０^６〜約５×１０^９ＣＦＵ／用量（いずれの数値も含む）、または約１×１０^６〜約５×１０^８ＣＦＵ／用量（いずれの数値も含む）、または約１×１０^７〜約５×１０^９ＣＦＵ／用量（いずれの数値も含む）の範囲内である。

[００９８]
ワクチン中で投与される寄生虫抗原についての細胞数は、約１×１０^２〜約１×１０^１０／用量（いずれの数値も含む）の範囲内である。別の実施形態では、細胞数は、約１×１０^３〜約１×１０^９／用量（いずれの数値も含む）、または約１×１０^４〜約１×１０^８／用量（いずれの数値も含む）、または約１×１０^５〜約１×１０^７／用量（いずれの数値も含む）、または約１×１０^６〜約１×１０^８／用量（いずれの数値も含む）の範囲内である。
賦形剤
[００９９]
アジュバント製剤及び／またはワクチン組成物は、薬学的に許容できる担体を含み得る。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる担体」には、あらゆる、及び全ての溶剤、分散媒、被覆剤、安定剤、希釈剤、保存剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤などが含まれる。担体（複数可）は、組成物の他の成分と適合可能であり、かつ対象に対して有害ではないという意味で「許容できる」ものでなくてはならない。典型的には、担体は、無菌であり発熱物質を有しておらず、かつ、用いられる投与様式に基づいて選択される。組成物を含む薬学的に許容できる担体の好ましい製剤が、米国（ＵＳ）農務省または米国食品医薬品局または米国以外の国における同等の政府機関により公表された適用規制において認可される薬学的担体であることは、当業者に周知である。したがって、組成物を商業的に製造するための薬学的に許容できる担体は、米国または外国における適切な政府機関により既に認可されているかまたは認可されるであろう担体である。
組成物の投与
[０１００]
組成物の用量サイズは、典型的には、対象及び抗原に応じて約１ｍＬ〜約５ｍＬ（いずれの数値も含む）の範囲内である。例えば、イヌまたはネコの場合、典型的には約１ｍＬの用量が使用されるが、ウシの場合、典型的には約２〜５ｍＬの用量が使用される。しかしながら、これらのアジュバントは、マイクロドーズで配合することもでき、その場合、約１００μＬの用量が用いられ得る。

[０１０１]
アジュバント組成物の投与経路としては、非経口、経口、口鼻腔、鼻内、気管内、外用、皮下、筋肉内、経皮、皮内、腹腔内、眼内、静脈内投与または卵への投与が挙げられる。シリンジ、点滴器、無針注射器、パッチなどの任意の適切なデバイスを用いて、組成物を投与し得る。使用に選択される経路及びデバイスは、アジュバントの組成、抗原、及び対象に依存し、そのようなことは、当業者に周知されている。
組成物の使用
[０１０２]
本明細書に記載されたアジュバント製剤は、製造が容易で、少なくとも１８ヶ月間安定しているアジュバント製剤である。製剤は、例えば、４℃で約１８ヶ月または約１８〜約２４ヶ月間安定し得る。別の実施形態では、製剤は、４℃で少なくとも約２４ヶ月間安定している。加速試験手順もまた、本明細書に記載された製剤が３７℃で少なくとも２週間安定していることを示しており、これは、４℃で約２４ヶ月に対応する。

[０１０３]
本明細書に記載されたアジュバント組成物は、広範な対象に安全かつ効果的に投与することができる。驚くべきことに、本明細書に記載されたアジュバント組成物は、他のアジュバント組成物と比較した場合に安全性の向上を示すことが分かった。

[０１０４]
以下の実施例は、例示的な実施形態として示されており、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。本発明の多くの変更、改変、修正、並びに他の使用及び適用が、当業者に明白となろう。

実施例１−リポソームの特徴付け
[０１０５]
（ＤＤＡ、コレステロール、Ｂａｙ（登録商標）Ｒ１００５、及びレシチンを含有する）ＤＣＲＬリポソームを、ＤＤＡ、コレステロール、Ｒ１００５及び大豆レシチンがそれぞれ５０、５０、１００及び１００μｇ／ｍＬの最終濃度に調整した。

[０１０６]
化合物を２５０ｍＬ丸底フラスコに添加し、１ｍＬのＳｏｌｖｅｎｔ Ｓａｆｅ（商標）ピペット先端（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、無水グレードのクロロホルム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）を有する５ｍＬの最終容量に充填した。真空下で１時間５５℃（ＫＮＦ Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｗｉｔｎｅｙ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ）でロータリーエバポレーター（Ｂｕｃｈｉ、Ｆｌａｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、溶媒を除去し、乾燥した白色脂質フィルムを形成した。超高純度用の逆浸透を含む自社改変されたオプション３浄水器（ＥＬＧＡ ＬａｂＷａｔｅｒ、Ｗｙｃｏｍｂｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ）からの再蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）、またはタブレットからｄｄＨ_２Ｏで再構成したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のいずれかでリポソームを再水和させた。

[０１０７]
再水和後、リポソームを１ｍＬワイドオリフィスピペット先端（ＶＷＲ、Ｌｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で処理し、剪断を減少させた。その後、リポソーム懸濁液をバス（Ｓａｒｏｓｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐｅｒｉｖａｌｅ、Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ、ＵＫ）で１時間超音波処理し、及び／または２つの１ｍＬシリンジを装備したミニ押出機セルを用いて、１００ｎｍポリカーボネートＷｈａｔｍａｎ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ Ｔｒａｃｋ−Ｅｔｃｈｅｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を介して最大３回押出した。ポリカーボネート膜は、１０ｍｍフィルターサポートにより挟まれた。

[０１０８]
超音波処理されたＤＣＲＬリポソーム（１．１４μｍ平均直径）は、押出されたリポソームよりも有意に大きかった（５．４４倍）。押出し後の超音波処理は、押出された試料（２０９．６ｎｍ）と比較して、小胞サイズに著しい影響を及ぼさなかった。押出されたリポソームの多分散性は、超音波処理されたリポソームよりも２．１０倍低かった。超音波処理と押出しの組み合わせは、押出されたリポソームと比較して、ＤＣＲＬの多分散性を１．４２倍に著しく増加された。

[０１０９]
水性溶液中のリポソームのコロイド安定性を評価するため、ｄｄＨ_２Ｏ中で水和されたＤＣＲＬリポソームを４週間にわたって評価した。とりわけ、４℃で２年間のおおよそ熱力学的同等物を３７℃で４週間保管することで、４℃及び３７℃の両方で生成物安定性の評価が動機付けられる。例示的な免疫刺激オリゴヌクレオチドＣｐＧＯＤＮ（「＋ＯＤＮ」）と共にロードされた空の（「−ＯＤＮ」）ＤＣＲＬリポソーム及びＤＣＲＬリポソームの両方を評価して、カチオン性リポソームコロイド安定性に対するアニオン性核酸の効果を決定した。ここで、脂質フィルムをｄｄＨ_２Ｏ及びＯＤＮの溶液で再水和することによって、ＯＤＮをロードした。ｄｄＨ_２Ｏ中で水和されたＤＣＲＬリポソームのサイズ及び多分散性（１７７ｎｍ、０．２４）は、ＰＢＳ中で水和されたもの（２１０ｎｍ、０．１７）と統計的に同様であった。

[０１１０]
４℃で、＋／−ＯＤＮ ＤＣＲＬリポソームは、２８日後に直径がそれぞれ１．１０倍及び１．０１倍にわずかに増加した。ＯＤＮを含有するリポソーム（＋ＯＤＮリポソーム）（４１７ｎｍ）は、ＯＤＮを欠いたリポソーム（−ＯＤＮリポソーム）（１７７ｎｍ）よりも有意に大きかった。同様に、多分散性は、２８日後にそれぞれ＋／−ＯＤＮリポソームの１．０８倍及び１．０３倍に緩やかに減少したが、２８日目の多分散性は、−ＯＤＮ対応物と比較して、＋ＯＤＮリポソームで有意に高かった（１．２３倍）。

[０１１１]
逆に、３７℃で保管した場合に、リポソームの凝集挙動を２８日後に観察した。＋／−ＯＤＮリポソームは、２８日後に直径がそれぞれ３．２４倍及び２．００倍に有意に増加したが、２１日後に安定化した。＋ＯＤＮリポソームは、ＯＤＮ媒介電荷補償及びコロイド安定性の損失により、−ＯＤＮリポソームよりも大きかった（２８日目で１．４６倍）が、経時的な安定性トレンドは、定性的に同様であった。しかしながら、＋ＯＤＮリポソームの不安定化は７日後に生じたが、−ＯＤＮリポソームでは、安定性は１４日後まで維持された。加えて、＋／−ＯＤＮリポソームの多分散性は、２８日後に統計的に同様であり、０日目で小胞と比較して、多分散性がそれぞれ１．９２倍及び１．５０倍に有意に減少した。

[０１１２]
これらの結果により、リポソームの保存用の技術を開発する必要性が示唆され、最初により小さいリポソームサイズをもたらすより強力な超音波処理及び／または押出し技術がリポソームの初期凝集を補償し得ることが示唆される。

[０１１３]
マイクロ流動化（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｄｅｌ １１０ＥＨ）及び超音波処理を用いて調製されたリポソームのサイズを比較した。超音波処理の工程をマイクロ流動化と置き換えた場合、製剤は、約５９ｎｍの平均直径を有するリポソームを得た。

[０１１４]
マイクロ流動化を用いて調製されたリポソームが、ＯＤＮまたはＯＲＮの添加により引き起こされ得る可能性があるリポソームの凝集を最小限にすることができることが、これらの結果により示される。
実施例２−凍結乾燥リポソームの安定性
[０１１５]
Ｄｕｒａ−Ｓｔｏｐ凍結乾燥機（ＳＰ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｓｕｆｆｏｌｋ、ＵＫ）を用いて、凍結乾燥を行った。凍結乾燥前に、１０ｍＬ管状のＩ型ガラス凍結乾燥バイアル（Ｓｃｈｏｔｔ、Ｓｔａｆｆｏｒｄ、Ｓｔａｆｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ）に試料を充填した。凍結乾燥サイクルパラメーターは、以下の通りであった。試料は、全て１．００℃／分のランプ速度で、５℃で３０分間、−５℃で３０分間、及び−４０℃で６０分間凍結した。一次乾燥は、全て０．５０℃／分のランプ速度で、−３７℃で５９分間、−２８℃で５９分間、−２３℃で５９分間、及び−２１℃で５５２分間行った。二次乾燥は、０．１０℃／分のランプ速度で、２０℃で３６０分間行った。全ての乾燥は、５７ｍＴｏｒｒのチャンバー圧力で行った。別の一次乾燥サイクルは、全て０．５０℃／分のランプ速度で、５７ｍＴｏｒｒにて−３８℃で５９分間、−３８℃で５９分間、−３７℃で５９分間、及び−３５℃で５５２分間行った。凍結乾燥試料を１４ｍｍ薬学的グレードのブチルゴム凍結乾燥ストッパー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）及びパラフィルムＭ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で封止した。

[０１１６]
凍結乾燥保護剤Ｄ−マンニトール、Ｄ−（＋）−グルコース、Ｄ−（−）−フルクトース、スクロース、Ｄ−（＋）−トレハロース二水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）またはＤ（＋）−マンノース（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）をｄｄＨ_２ＯまたはＰＢＳ中に可溶化し、リポソーム懸濁液に添加し、示される凍結乾燥前に２〜４％ｗ／ｖの最終濃度にした。

[０１１７]
糖が無い場合には、ｄｄＨ_２Ｏ−及びＰＢＳ−再水和リポソームは、凍結乾燥前に〜２１０ｎｍであった。凍結乾燥保護剤無しで、凍結乾燥は、ｄｄＨ_２Ｏ−及びＰＢＳ−再水和試料中のリポソームサイズをそれぞれ３．５５倍及び６．０５倍に増加させた。ｄｄＨ_２ＯまたはＰＢＳ中で再水和されたＤＣＲＬリポソームは、３％スクロース、４％マンニトールまたはその組み合わせの添加後にサイズが著しく変化せず、凍結乾燥後に観察された凝集が、凍結乾燥保護剤（複数可）の添加によって直接引き起こされなかったことが示された。

[０１１８]
ＰＢＳ中で再水和されたリポソームの場合、リポソームサイズは、凍結サイクル後の凍結乾燥保護剤無しの試料中でのみ著しく増加された（２．００倍）。しかしながら、完全な凍結乾燥サイクル後、リポソームサイズは、３％スクロース、４％マンニトール、及びそれらの組み合わせで、凍結乾燥保護剤無しの試料で、それぞれ、６．０５倍、３．０３倍、５．１５倍、及び４．１３倍に著しく増加された。同様に、多分散性は、前凍結乾燥対照と比較して、リポソームサイズは、３％スクロース、４％マンニトール、及びそれらの組み合わせで、凍結乾燥保護剤無しのＤＣＲＬで、それぞれ、２．６１倍、２．６１倍、２．８５倍、及び２．７９倍に著しく増加された。

[０１１９]
ｄｄＨ_２Ｏで再水和されたリポソームの場合、凍結サイクル後の小胞サイズは、凍結乾燥保護剤無しのリポソーム、及び４％マンニトールを有するリポソームで、それぞれ、前凍結乾燥対照を１７．９０倍及び１１．４５倍上回って著しく増加されたが、３％スクロースまたは３％スクロースと４％マンニトールの組み合わせを有するリポソームは、無視できるほどしか変化しなかった。完全な凍結乾燥サイクル後、リポソームサイズは、凍結乾燥保護剤無し、３％スクロースを有する、４％マンニトールを有する、及びそれらの組み合わせを有する試料で、それぞれ、３．５５倍、０．８８倍、３．４８倍、及び１．４７倍に穏やかに変化した。

[０１２０]
ｄｄＨ_２Ｏ中で再水和されたリポソームは、凍結乾燥後の小胞サイズが変化しなかったことで示したように、ＰＢＳ中で再水和されたものと比較してより良いコロイド安定性を有し、３％スクロースは、良好なコロイド安定性を付与するためにより理想的な凍結乾燥保護剤であり得ることが、これらの所見により示される。

[０１２１]
ｄｄＨ_２Ｏ再水和されたＤＣＲＬリポソームに対する凍結乾燥スキームの最適化に向けて、小胞サイズ及び多分散性に対する２％ｗ／ｖでの６つの公知の糖凍結乾燥保護剤（個々に、及び組み合わせて）の効果を評価した。

[０１２２]
スクロース、グルコース、マンニトール、トレハロース、フルクトース及びマンノースを凍結乾燥保護剤として試験した。凍結乾燥保護剤として２％マンニトールのみが、小胞サイズ（３９．６６倍）及び多分散性（２．９５倍）を著しく増加させた。しかしながら、全ての他の糖による凍結乾燥は、かなりのサイズ変化をもたらさず、グルコース、フルクトース、及び／またはマンノースで凍結乾燥保護された生成物は、糖とリポソームの不透過性の緻密層に崩壊し、再水和するのが困難であった。文献と一致して、スクロースまたはトレハロースで凍結乾燥保護されたリポソームは、粒径変化を防止し、良好なコロイド安定性でリポソーム分散に再構成され得るケーキが得られた。

[０１２３]
ＤＣＲＬは、糖の組み合わせでも凍結乾燥された。２％スクロースのみ、２％トレハロース、及び２％スクロース／２％トレハロースが、凍結乾燥後に良好なコロイド安定性を支持し、薬学的に洗練されたケーキ構造が達成されたことが、この試験により明らかになった。しかしながら、２％スクロース／２％トレハロースの組み合わせは、２％スクロースまたは２％トレハロースのみによる凍結乾燥保護を上回るリポソームサイズ安定性及び多分散性において有利であるようには思われなかった。
実施例３−ＩＢＲ／ＢＶＤＶワクチン
[０１２４]
Ｑｕｉｌ Ａアジュバントは、一過性の発熱を伴うことが多い全身免疫応答を引き起こすことが報告されている。そのような発熱は、泌乳牛における乳量の低下と関連していると考えられる。この試験の目的は、リポソームにより誘発された免疫応答、及びアジュバントにより引き起こされる潜在的な副作用に対する、サポニンを含まないリポソームの効果を評価することであった。

[０１２５]
８ヵ月齢のホルスタインオスの子牛をこの試験で使用した。潜在的な試験動物を血清学的にスクリーニングし、ＢＶＤＶ−１及びＢＶＤＶ−２に対する血清中和（ＳＮ）力価＜１：２のものが、試験の登録に対する資格があった。加えて、動物は、耳パンチ生検及び免疫組織化学によって決定されたように、ＢＶＤＶに持続感染（ＰＩ）されなかった。動物は、温度及び湿度が制御された環境で飼育し、商用行為及び都市システムの水を自由裁量で受けた。

[０１２６]
順応は、試験０日目の約１週間前に始めた。子牛は、出荷前にＤＲＡＸＸＩＮ（登録商標）及びＤＥＣＴＯＭＡＸ（登録商標）を受けた。

[０１２７]
調査に無関係な条件により瀕死、負傷、または死亡した試験動物は、試験及び関連データ分析から除外した。瀕死の動物は安楽死させた。

[０１２８]
動物には、表１にまとめるように２ｍｌのワクチンの皮下投与によって０日目及び２８日目にワクチン接種した。

[０１２９]
４９日目に、動物を非細胞変性牛ウイルス性下痢ウイルス２型（株２４５１５）でチャレンジした。各動物は、圧縮ガスアトマイザーを用いて、鼻腔内に投与された５ｍｌ（２．５ｍｌ／鼻孔）でおおよそ４．８８Ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／用量を受けた。

[０１３０]
Ｔ０２〜Ｔ０６群では、抗原成分は、４５００ＲＵ／ウイルスの予め不活性化された改変ＢＶＤＶ１／２及び改変ＩＢＲ（８．０ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０）を含有した。

[０１３１]
動物には、圧縮ガスアトマイザーを用いて、４８日目に鼻腔内（２．５ｍｌ／鼻孔）に５ｍｌのＢＶＤＶ−２株２４５１５（４．８８Ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／用量）でチャレンジした。

[０１３２]
直腸温度の最小二乗平均、及び１回目及び２回目のワクチン接種後の範囲を表２に示す。

[０１３３]
数頭のＴ０２及びＴ０７対象の直腸温度は、１回目及び２回目の両方のワクチン接種の翌日に一過性増加を示した。Ｔ０２群における動物の直腸温度の増加は、１回目のワクチン接種の１日後に他の群（Ｔ０１、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５、Ｔ０６、及びＴ０７）よりも有意に高かった（Ｐ≦０．１０）。

[０１３４]
１回目のワクチン接種後、Ｔ０２群における９匹の動物のうちの４匹は、華氏１０３．５を超える温度を有した（３匹は、華氏１０４．０を上回る温度を有した）。これに対し、群Ｔ０５における動物は、１回目のワクチン接種の１日後に華氏１０２．５を上回る温度を有さなかった（データ不図示）。

[０１３５]
２回目のワクチン接種後、Ｔ０２及びＴ０７の直腸温度の増加は、対照及びワクチン接種（Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５、及びＴ０６）よりも有意に（Ｐ≦０．１０）高かった、しかしながら、上昇した直腸温度は短命であった（表２）。Ｔ０２群における個々の応答は、華氏１０１．１〜１０４．５の範囲内であった。群Ｔ０２における９匹の動物のうちの５匹は、２回目のワクチン接種後に華氏１０３．５を上回る温度を有した（別の動物は、華氏１０３．５の温度を有した）。Ｔ０２群における９匹の動物のうちのたった３匹は、２回目のワクチン接種の翌日に華氏１０３．５を下回る温度を有した。これに対し、ＤＣＲＬ製剤のどれも、華氏１０３．７を超える直腸温度の上昇を誘発しなかった。Ｔ０５群における個々の応答は、華氏１０１．４及び１０２．６の範囲内であった（データ不図示）。

[０１３６]
熱性反応は、チャレンジ後のＴ０１群において８匹の動物のうちの８匹で観察され（＞華氏１０４．５）；これは、チャレンジの成功に対する結果基準を満たした。全てのワクチン接種群の直腸温度は、（チャレンジの４日後）対照と比較して、試験の５３日目に有意に低く（Ｐ≦０．１０）、翌日にはある程度の差があった（データ不図示）。対照群では、チャレンジに応じて、直腸温度の典型的な二相性上昇が観察された。

[０１３７]
チャレンジ後の臨床ＢＶＤＶ疾患の存在（動物は、≧２の臨床スコアを有する必要があった）は、以下のスコアリングシステムに従って決定された：
０−臨床徴候無し
１−全体としての臨床徴候は、急性ＢＶＤ感染に特異的ではない。臨床徴候には、鼻汁、異常な呼吸、及び軽度の倦怠感を含み得る。

２−全体としての臨床徴候は、程度が緩やかなであり、急性ＢＶＤ感染に特異的である。臨床徴候には、鼻汁、異常な呼吸、倦怠感、極端な痩せ細り、眼漏、過流涎、下痢、脱水、跛行及び／または動きたがらないことを含み得る。

３−全体としての臨床徴候は、程度が重篤であり、急性ＢＶＤ感染による特徴である。臨床徴候には、鼻汁、異常な呼吸、倦怠感、極端な痩せ細り、眼漏、過流涎、下痢、過度のあざ、脱水、横臥、跛行及び／または動きたがらないことを含み得る。

[０１３８]
対照群とワクチン接種群の間に有意差はなかった。
[０１３９]
白血球減少症
[０１４０]
試験結果は、Ｔ０１（対照）の１００％が、使用した場合に白血球減少症が≧４０％減少し、対照の７５％が＜４０００細胞／μＬである場合に、有効試験の基準を満たした。ワクチン接種された処置群Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５、Ｔ０６、及びＴ０７（Ｐ≦０．１０）と比較して、Ｔ０１におけるバックグラウンドチャレンジ後から白血細胞が≧４０％減少する白血球減少症を発症した動物の数には有意差はなかった。しかしながら、より関連する定義である臨床白血球減少症（＜４０００細胞／μＬ）は、Ｔ０１、Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５、Ｔ０６、及びＴ０７において、それぞれ、８匹のうちの６匹（７５％）、９匹のうちの２匹（２２．２％）、８匹のうちの１匹（１２．５％）、９匹のうちの３匹（３３．３％）、９匹のうちの４匹（４４．４％）、９匹のうちの４匹（４４．４％）、及び６匹のうちの０匹で検出された（表３）。白血球減少症の持続期間は、全てのワクチン接種と比較して、≧４０％減少を使用した場合にＴ０１群において有意に長く（Ｐ≦０．１０）、ワクチン接種群Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０５、Ｔ０６、及びＴ０７と比較して、＜４０００μｌを使用した場合に有意に長かった（Ｐ≦０．１０）（表４）。

[０１４１]
ウイルス血症
[０１４２]
全ての実験ワクチンは、ウイルス血症に対して防御した。いくつかの群では、完全に防御があり（ＣｐＧを含有するＴ０２及びＴ０５の両方）、他のものでは、部分的であった（Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０６、及びＴ０７）。Ｔ０１におけるウイルス血症動物の数は、Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５、Ｔ０６及びＴ０７における数よりも有意に高かった（Ｐ≦０．１０）（表５）。Ｔ０２及びＴ０５群ではウイルス血症が見られなかった。しかしながら、対照と比較した場合に、ＯＲＮを含有しない、低用量のＯＲＮを含有する、及び高用量のＯＲＮを含有するＴ０３、Ｔ０４、及びＴ０６群におけるウイルス血症動物の数に差があった。

[０１４３]
Ｔ０１群に対するウイルス血症の持続期間は、全てのワクチン接種群（Ｔ０２〜Ｔ０７）よりも有意に長かった（Ｐ≦０．１）（表６）。Ｔ０７における子牛は、アジュバント＋ＢＶＤＶ−１ウイルスの組換えｇｐ５３抗原を含有するＱｕｉｌ Ａ含有ワクチンを受け、部分的に防御され、Ｔ０１と比較してウイルス血症の持続期間が有意に短かった。これらの子牛の場合、異なるバイオタイプのＢＶＤＶ（２型）ウイルスによるチャレンジは、ＢＶＤＶ−１ ｇｐ５３抗原とチャレンジ株の間の部分交差防御があったことを反映している。

[０１４４]
ＳＮ力価
[０１４５]
４９日目に、チャレンジ前に、Ｔ０２乃至Ｔ０７全ての群の動物は、ＢＶＤＶ−１、ＢＶＤＶ−２に対するＳＮ力価を有し、Ｔ０２乃至Ｔ０６のみが、ＩＢＲ抗原に対する抗体（≧１：８）を有した。全てのワクチンは、≧１：８の要件を満たす場合に十分な効力を有すると考えた。ＢＶＤＶ−１及び２に対するＳＮ力価の１回目及び２回目の過去のワクチン接種（２８日目及び４９日目）の最小二乗平均を表７に示す。全てのワクチン接種された動物は、対照群よりも有意に高いＳＮ力価を有し、ワクチン接種群のＳＮ力価間には有意差があった。リポソームワクチン（Ｔ０３乃至Ｔ０６）は、Ｑｕｉｌ Ａを含有する組成物でアジュバントされたワクチン（Ｔ０２）よりもＢＶＤＶ−１及び２に対して有意に低いＳＮ力価を誘発した。これらの製剤へのＯＲＮＳまたはＣｐＧの添加は、これらの応答を強化しなかった。また、Ｑｕｉｌ Ａを含有する組成物でアジュバントされたｇｐ５３ワクチンは、４９日目までＢＶＤＶ−１抗原に対して高いＳＮ力価を誘発したが、ＢＶＤＶ−２抗原に対して低かった。Ｔ０７群のＢＶＤＶ−１ ＳＮ力価は、Ｔ０２の力価から有意に異ならなかったが、ＢＶＤＶ−２力価は、Ｔ０２の力価から有意に異なった。ＢＶＤＶ−２のチャレンジ後、全てのワクチン接種群のＳＮ力価はブーストされたが、Ｔ０１群子牛は、一次抗体応答を発生した（６３日目）。

[０１４６]
注射部位反応
[０１４７]
左及び右の両方の首への最小二乗平均の注射部位反応（ＩＳＲ）を表９及び１０に示す。１日目に、全ての６つのワクチン接種群において小さな反応が生じたが、後退した。Ｔ０２及びＴ０７において最も大きな反応部位は、それぞれ、２９日目、４１．８日目及び１６．３日目に生じた。ある特定の日において注射部位反応間には有意差があった。全てのワクチンは、急速に解決した注射部位反応として安全であった。

[０１４８]
細胞媒介免疫
[０１４９]
ＢＶＤＶ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、チャレンジ前にＴ０１群において高バックグラウンドを有したため、これらのワクチンによるこの抗原へのＣＭＩ応答の誘発を実証するための信頼性が低いと考えられる（データ不図示）。しかしながら、ＩＢＲ抗原に対するアッセイは、それぞれのワクチンによるＣＭＩの誘発を反映していた（殺傷されたＩＢＲ抗原への応答、Ｔ０２乃至Ｔ０６のＩＢＲ ｇＢ及びｇＤペプチドリコール応答について、表１１〜１３を参照されたい）。一般的に、最も高い応答は、製剤中にＣｐＧを有したＴ０２ワクチン群及びＴ０５群中であった。チャレンジ後の応答は、チャレンジがＢＶＤＶウイルスチャレンジであった場合には強化されなかった。おそらく、同様のＣＭＩ応答は、ＢＶＤＶ抗原に対するワクチンにより誘発された。

[０１５０]
ワクチン効果は、ウイルス血症の発症及び持続期間において観察された。全ての実験ワクチンは、ウイルス血症に対して防御した。完全防御は、いくつかの群（ＣｐＧを含有するＴ０２及びＴ０５）で観察されたが、部分防御は、他の群（Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０６、及びＴ０７）で観察された。直腸温度プロファイルは、Ｔ０１対照と比較して、Ｔ０２及びＴ０７処置群に対する１回目及び２回目の両方のワクチン接種の１日後に一過性増加を示した。リポソームワクチンは、Ｑｕｉｌ Ａ含有アジュバントを有したＴ０２及びＴ０７と比較して、直腸温度において低い上昇を誘発した。このＱｕｉｌ Ａ含有アジュバントは、典型的には、ワクチン接種の直後に１日の温度上昇を誘発する。ワクチン接種に伴う発熱は、許容できない乳量の低下をもたらすことが多いため、後者は、乳牛には特に重要である。リポソーム製剤（追加の免疫調節剤無しのリポソームさえも）は、堅牢な抗体並びにＴ細胞応答を誘発した。到達したレベルは、これらのそれぞれの疾患の保護範囲で考えられる（１：２５６〜５１２のＢＶＤＶ−１ ＳＮ力価；ＢＶＤＶ−２±２５６以上；１：３２のＩＢＲ ＳＮ力価）が、リポソームワクチンは、Ｑｕｉｌ Ａ含有ワクチンと比較して、ＢＶＤＶ−１及び２及びＩＢＲ抗原に対して有意に低いＳＮ力価を誘発した。

[０１５１]
結論として、リポソーム製剤は、防御のために抗体だけでなくＣＭＩもまた必要とする疾患の殺傷された抗原を送達するための安全かつ新しいオプションを提供する。製剤は、有効性においてＱｕｉｌ−Ａ含有ワクチンと同程度であった。有効性に対するＣｐＧ効果は、再現性があったが、ＯＲＮは、ＢＶＤＶチャレンジに対する免疫の強化に効果的ではなかった。

[０１５２]
実施例４−ブタインフルエンザウイルス
この試験の目的は、新規のアジュバント製剤及び免疫調節剤を含有するいくつかのＳＩＶ−ワクチン（殺傷ウイルス、ｐＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２）の免疫応答及び有効性を評価することであった。免疫学的パラメーター（体液性及び細胞性）、並びに臨床徴候、ウイルス血症、ウイルス出芽及び肺病変を含む有効性評価項目の両方によって、有効性を決定した。

[０１５３]
[０１５４] 動物
［０１５５］
両方の性別の３週齢（２１＋／−３日）のブタをこの試験に使用した。動物は、ＰＲＲＳＶ、マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対する暴露の既往歴がなかった。動物またはそれらの母獣は、任意のＳＩＶ血清型に対するワクチン接種または任意のＳＩＶ血清型への暴露の既往歴がなかった。動物は、ワクチン接種の４〜７日前に現場に到着し、水と共に標準試料を自由裁量で与えた。

[０１５６]
ブタには、０日目（左の首）及び２１日目（右の首）に表１４の組成物をワクチン接種し、３５日目にＨ３Ｎ２ウイルスＩＮ／１２でチャレンジさせた。

[０１５７]
３５日目及び４０日目に赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）分析用に血清を回収し、２８日目、３５日目、及び４０日目にＥＬＩＳＰＯＴ（ＩＦＮγ）分析用に全血を回収した。ブタを４０日目（チャレンジ５日後）に犠牲にし、葉（左頭蓋、左中、左の尾、右頭蓋、右中、右の尾及び副）ごとの圧密百分率をスコアリングし、０〜１００％の百分率として記録した。

[０１５８]
ワクチン接種のどれも全身副作用または許容できない注射副反応をもたらさなかった（データ不図示）。

[０１５９]
ＨＡＩ力価を表１５に示す。

[０１６０]
肺病変スコアを表１６に示す。

[０１６１]
Ｔ０４群は、ワクチン株（Ｈ１Ｎ１）の１つに対して最も高いＨＡＩ力価を有した一方、Ｔ０２〜Ｔ０８群の力価はＴ０１対照群よりも有意に高かったものの、Ｔ０７は、他の株（Ｈ３Ｈ２）に対して最も高い力価を有した。

[０１６２]
（Ｔ０８を除く）全てのワクチンは、チャレンジ５日後にＬＬＳを減少させる傾向があった。Ｔ０６群（ＴＸＯ）は、最も低い肺病変スコアを有する傾向があった。

[０１６３]
インフルエンザＮＰタンパク質ペプチド特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞及び全インフルエンザウイルス特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞（両方ともＥＬＩＳＰＯＴにより決定）を、それぞれ、表１９及び２０に提供する。プールにおけるペプチドは、１２アミノ酸重複をもつ１６マーである。４つのプールは、Ｎ末端（プール１）からＣ末端（プール４）のＮＰペプチドの配列を含有する。ペプチドの配列を表１７及び１８に提供する。

[０１６３]

[０１６５]
ＮＰタンパク質は、一般的に、ＳＩＶ株間で高度に保存されるため、効率的なＣＭＩ応答は、より良い交差防御電位に変換されることが多い。

[０１６６]
Ｔ０７群（ＤＣＲＬリポソーム）は、試験した４つのＮＰタンパク質ペプチドプールのうちの３つ及び３つの全ウイルスのうちの２つに対して最も高いＩＦＮγ応答をもたらした。ワクチン接種後（チャレンジ前）ＩＦＮ−γ応答が観察された唯一の群は、Ｔ０６（ＴＸＯ）であった（データ不図示）。

[０１６７]
ＣＤ４０アゴニスト及びＣｐＧを添加することは、特にリポソーム製剤の文脈において、力価を減少される、並びにＬＬＳを増加させる傾向が一様にあった。

[０１６８]
全体として、これらの結果は、ＤＣＲＬリポソームでアジュバントされたワクチンが、肺病変スコアを減少させる製剤Ｔ０２（市販のワクチンと同様の実験製剤）と同様に有効であることを示している。同時に、ＤＣＲＬリポソームは、試験した他のワクチンよりもＣＭＩ応答の活性化にはるかに効果的であるため、市販の製品よりも広範な交差防御電位及び免疫持続期間の改善をもたらし得る。
実施例５．プロフィリンワクチン接種後のアイメリアマキシマに対する免疫の発生
[０１６９]
本試験の目的は、プロフィリンワクチン接種後のアイメリアマキシマに対する免疫の発生における種々のアジュバント（Ｚｏｅｔｉｓの所有権）の効果を評価することであった。

[０１７０]
孵化したばかりのひよこは、Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒ’ｓ ｈａｔｃｈｅｒｙ、Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｔｏｗｎ、ＰＡから購入した。ひよこには、飼料及び水を自由裁量で与えた。鳥は、アイメリアを含まない施設内で、より広範な囲いに保ち、別の場所で吊り下げるケージに移し、そこで、感染させて、実験期間の最後まで保った。

[０１７１]
表２１に提供するように、精製されたプロフィリン（５０μｇ／用量）を異なるアジュバントと混合した。

[０１７２]
鳥には、１日齢、その後７日齢にプロフィリン＋アジュバントを２回皮下注射（０．５ｍＬ／用量）して免疫化した。２回目の免疫化の７日後（１４日齢）、鳥（Ｔ０１群を除く）には、アイメリアマキシマの１×１０^４胞子形成オーシストでチャレンジさせた。

[０１７３]
体重増加は、チャレンジ後の６日目及び１５日目に決定した。チャレンジ後の６〜９日目に糞便中に排泄されたオーシストも決定した。プロフィリンに対する血清抗体は、ＥＬＩＳＡによって評価した。

[０１７４]
対照群：ＰＢＳ注射及びチャレンジ無し（ワクチン無接種の無チャレンジ対照）、１４日目にＰＢＳ注射及びチャレンジ（ワクチン無接種のチャレンジ対照）、１４日目にプロフィリン／アジュバント無及びチャレンジ（抗原対照）。

[０１７５]
病変スコアを評価するため、６匹の鳥／群をチャレンジの６日後に殺した。憩室の１０ｃｍ前部と後部に延びるおおよそ２０ｃｍの腸部分を得て、縦に切断した。腸の内容物を穏やかに取り除いた。０〜４の範囲のスコアが、病変の重篤度に応じて与えられた。

[０１７６]
糞便のオーシスト産生を評価するため、各群（８匹の鳥／群；２匹の鳥／ケージで４つのケージ）からの糞便をチャレンジ後の６〜９日目に別々に回収した。チャレンジ後の６日目から開始して、回収ケージを準備し、動物飼育者には、糞便を清掃しないように指示した。１ケージ当たり２匹の鳥を保持する各オーシスト回収ケージから糞（Ｆｅｃａｌ ｄｒｏｐｐｉｎｇｓ）を回収した。６日目から開始して３日間、回収皿を各ケージの下に載置し、糞便物質をプラスチック瓶に回収した。各瓶の糞を水と一緒にブレンダーですり潰し、３５ｍｌの無作為試料を各試料から採取した。コクシジウムオーシストをカウントするために、種々の希釈液を最初に作製し、各飼料のオーシストを列挙するための最適な希釈液を決定した。オーシストを微視的にカウントした。鶏ことに排泄されたオーシストの総数は、式を用いて算出した：総オーシスト／鳥＝（オーシストカウント×希釈係数×糞便の飼料容量／計算板容量）／ケージ当たりの鳥の数。

[０１７７]
血液試料（４匹の鳥／群）は、抗体応答を測定するためのアイメリアチャレンジ後の９日目に回収した。血液試料を４℃で４時間凝固させ、血清を分離した。ＥＬＩＳＡを用いて、アイメリアに対する抗体について血清試料を試験した。簡単に言えば、マイクロタイタープレートを２００ｎｇ／ウェルの組換えコクシジウム抗原で一晩被覆し、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡでブロックした。血清希釈液を添加し、連続的な穏やかに振盪でインキュベートし、洗浄し、結合したＡｂをペルオキシダーゼ複合ウサギ抗鶏ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）及びペルオキシダーゼ特異的基質で検出した。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）で４５０ｎｍにて光学密度（ＯＤ）を測定した。

[０１７８]
全ての値を平均±ＳＥＭとして表す。平均間の差は、ｐ＜０．０５で有意である考慮した。

[０１７９]
陰性対照及びチャレンジ対照は、６日目で有意に異なったが、感染１５日後では有意に異ならなかった。チャレンジ６日後、陰性対照と比較したチャレンジ対照の体重減は、約１５％であった。処置無しは、アジュバント無しまたはチャレンジ対照とは異なったが、処置Ｔ０５、Ｔ０６、及びＴ０８は、いずれも陰性対照とは異ならなかった。

[０１８０]
鳥の６０％弱が、２以上の病変スコアを有した。チャレンジ対照から有意に異なる製剤はなかった。Ｔ０９群は、最貧パフォーマーであった。Ｔ０４は、最良パフォーマーであった。

[０１８１]
一般的に言って、出力における＜１ログの減少は、生物学的に関連するとは見なされないが、活性免疫の指標とまだなり得る。チャレンジ対照よりも有意低い製剤は、Ｔ０５及びＴ０９のみであった。

[０１８２]
抗体応答は、コクシジウム症に対する免疫に関連すると一般的に考えられていないため、他の基準と相関しない場合がある。上の実験では、Ｔ０７群は、陰性（ワクチン未接種、非感染鳥）、陽性対照（ワクチン未接種、感染鳥）、または抗原のみをワクチン接種した鳥のいずれかによって誘発された応答よりも高い抗体応答を誘発した。Ｔ０５、Ｔ０６、及びＴ０８〜Ｔ１０群は、陰性対照（ワクチン未接種、非感染鳥）よりも高い抗体応答を誘発した。

[０１８３]
結果を表２２にまとめる。１日齢及び７日齢でプロフィリン＋種々のアジュバントの２回の皮下注射、及び１４日齢でアイメリアマキシマの１×１０^４オーシストで次にチャレンジして鳥を免疫化した後の体重増加、血清抗体レベル（非感染対照の％として表す）、及び病変スコア、オーシスト産生（感染対照の％として表す）。

実施例６−ＤＣＲＬ＋ＣｐＧでアジュバントされたＢＶＤＶ／ＩＢＲワクチン
[０１８４]
この実施例では、ＣｐＧ（ＯＲＮ無し）によるＤＣＲＬリポソームのアジュバント電位を評価した。加えて、リポソームをロードする異なる方法を比較した。

[０１８５]
実験準備は、以下の通りであった（表２１）：

[０１８６]
また、Ｔ０３〜Ｔ０６群のワクチンは、ｍＢＶＤ１（４，５００ＲＵ／ｄｓ）＋ＢＶＤＶ１（４５００ＲＵ）、ＢＶＤＶ２（４５００ＲＵ）、ｍＩＢＲ １０^８ｌｏｇ_１０ ＴＣＩＤ_５０（不活化前用量）を含有した。

[０１８７]
健康なホルスタイン子牛（６〜７ヶ月齢、ＢＶＤＶ１、ＢＶＤＶ２及びＩＢＲに対する血清反応陰性）をこの試験に登録した（ｎ＝９／処置群）。子牛には、０日目及び２８日目に、割り当てられたワクチン２ｍＬを皮下に投与した。毒性ＢＶＤＶ２チャレンジ（４ｍＬ（５．１４Ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／用量）鼻腔内）を４９日目に投与した。臨床観察を行い、注射部位及び直腸温度を各ワクチン接種周りで測定した。白血細胞のカウント、ウイルス血症、及び血清学的検査のために血液試料を６３日目に回収した。

[０１８８]
Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４及びＴ０６における全ての子牛は、Ｔ０５における子牛の２２．１及び１１．１％と比較して、チャレンジ前にＢＶＤＶ−１ａ及びＢＶＤＶ２に対して１：８力価を達成した。Ｔ５で使用した能動負荷により、大部分の抗原は、ワクチン調製物から除去されたと考えられる。このように、Ｔ０５群の動物は、Ｔ０３、Ｔ０４、及びＴ０６群の動物よりも少ない抗原を受けた。したがって、Ｔ０５群からの所見の解釈は、慎重に解釈すべきである。

[０１８９]
それはそれとして、Ｔ０５に対するＢＶＤＶ−１ａ及びＢＶＤＶ２力価は、２８日目、４９日目及び６３日目において他のワクチン接種群よりも有意に低かった。Ｔ０２またはＴ０５の子牛はどれも、チャレンジ前にＢＨＶに対して１：８力価を達成しなかったが、これらの群は、２８日目、４９日目及び６３日目において他のワクチン接種群と比較して有意に低い力価を有した。ｇｐ５３−１ ＳＦＣの最小二乗平均は、０日目、３５日目及び５６日目において全ての他の処置群と比較して、Ｔ０２の場合に有意により高く、ｇｐ５３−２ ＳＦＣの最小二乗平均は、３５日目及び５６日目においてＴ０２の場合に有意により高かった。

[０１９０]
ウイルス血症は、Ｔ０１及びＴ０５の全ての子牛で観察された。Ｔ０２の子牛は、チャレンジ後にウイルス血症を発症しなかった。Ｔ０３、Ｔ０４及びＴ０６群では、２２．２％、３３．３％及び３３．３％の子牛がウイルス血症を発症し；これらの群は、Ｔ０２とは有意に異ならなかった。ウイルス血症の持続期間は、全ての他の処置群と比較して、Ｔ０１及びＴ０５において有意に長かった。白血球減少症がベースラインからＷＢＣの４０％減少によって決定された場合、Ｔ０２の子牛の２２．２％は、チャレンジ後に白血球減少症であったが、全ての群の全ての子牛が白血球減少症であった。Ｔ０１及びＴ０５の子牛は、全ての他の群と比較して、白血球減少症の持続期間が有意に長かった（Ｔ０１〜Ｔ０６の群で、それぞれ、８．６日目、０日目、０．２日目、０．７日目、６．７日目、及び０．８日目）。この試験におけるチャレンジ後には臨床疾患の軽度の兆候しか観察されなかった。Ｔ０１対照群では、子牛の２２．２％が、チャレンジ後に≧２の臨床スコアを有したが、Ｔ０５の子牛の１１．１％が、チャレンジ後に≧２の臨床スコアを有した。いずれの他の処置群の子牛もチャレンジ後に≧２の臨床スコアを有さなかった。

[０１９１]
一過性の発熱が、１日目及び２９日目にＴ０２で観察された。全ての他の子牛の温度は、試験を通じて正常であった。

[０１９２]
個々の動物の分析により、（Ｑｕｉｌ Ａ含有アジュバントでアジュバントされた）Ｔ０２群では、４匹の動物が１回目の注射後に華氏１０３．５を上回る温度を有し、２匹の動物が２回目の注射後に華氏１０３．５を上回る温度を有したことが明らかになった。加えて、１匹の動物は、１日目（１回目のワクチン接種の１日後）に華氏１０３．２の温度を有し、５匹は、２９日目（２回目のワクチン接種の１日後）に華氏１０３．０〜１０３．４の範囲の温度を有した。これに対し、Ｑｕｉｌ Ａを欠いたアジュバントでワクチン接種された動物は、１回目または２回目のワクチン接種後のいずれでも華氏１０３．５を上回る温度を有さなかった。２匹は、華氏１０３．０〜１０３．４の範囲の温度を有した。

[０１９３]
注射部位反応＞２００ｃｍ^３は、この試験で観察されなかった。（Ｑｕｉｌ Ａ含有アジュバントでアジュバントされた）Ｔ０２群は、全ての他の処置群と比較して、２日目、７日目及び２９日目に注射部位反応が有意に大きかった。測定可能な注射部位反応は、Ｔ０２（２回目の注射）及びＴ０６（１回目の注射）において４９日目にまだ存在していた。

[０１９４]
要するに、ワクチン候補Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４及びＴ０６は、全ての子牛においてＢＶＤＶ２力価＞１をもたらす結果基準を満たした。また、ワクチン候補Ｔ０２は、ウイルス血症に対して１００％防御をもたらし、（ＷＢＣの４０％減少によって測定されたように）白血球減少症に対して完全な防御をもたらした。この群の子牛は、一過性の発熱及び注射部位反応を経験した。

[０１９５]
本明細書に引用された全ての発行物は、特許及び非特許の両方の発行物において、本発明が属する当業者のレベルを示している。これらの発行物は、個々の発行物が具体的かつ個別に参照により組み込まれるものとして示されているのと同程度に、全てが参照により本明細書に完全に組み込まれる。

[０１９６]
本明細書の発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、これらの実施形態が本発明の原理及び適用例を示しているに過ぎないことが理解されなければならない。それゆえ、以下の特許請求の範囲に定義された本発明の主旨及び範囲を逸脱することなく、数多くの改良を例示的実施形態に施し得ること、及び他の配列を考案し得ることが、理解されなければならない。

Claims (23)

1. 外部脂質二重膜及び内部区画を含むリポソームであって、
   前記外部膜は、
   ａ）第四級アンモニウム化合物；
   ｂ）ステロール；
   ｃ）リン脂質；及び
   ｄ）式Ｉの糖脂質：
   

   

   式中、Ｒ^１及びＲ^２は、独立して、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキルラジカルであり；Ｘは、−ＣＨ_２−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり；Ｒ^２は、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和もしくは不飽和アルキルラジカルであり；Ｒ^３、Ｒ^４、及びＲ^５は、独立して、水素、−ＳＯ_４ ^２−、−ＰＯ_４ ^２−、−ＣＯＣ_１−１０アルキルであり；Ｒ^６は、Ｌ−アラニル、Ｌ−α−アミノブチル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパルギニル、Ｌ−アスパルチル、Ｌ−システイニル、Ｌ−グルタミル、Ｌ−グリシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−ヒドロキシプロリル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシル、Ｌ−リシル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチニル、Ｌ−フェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ−トレオニル、Ｌ−チロシル、Ｌ−トリプトファニル、及びＬ−バリルまたはそれらのＤ型異性体である
   を含む、前記リポソーム。
2. 前記リポソームが、本質的にサポニンを含まない、請求項１に記載のリポソーム。
3. 前記第四級アンモニウム化合物が、ＤＤＡであり、前記ステロールが、コレステロールであり、前記糖脂質が、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドまたはその塩である、請求項１または２に記載のリポソーム。
4. 前記内部区画において、免疫刺激リボヌクレオチド、ＣｐＧオリゴデオキシリボヌクレオチド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される免疫刺激オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のリポソーム。
5. 前記免疫刺激オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜１４のいずれか１つを含む、請求項４に記載のリポソーム。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のリポソームを含む、アジュバント製剤。
7. 前記アジュバント製剤が、本質的にサポニンを含まない、請求項６に記載のアジュバント組成物。
8. 有効量の抗原成分及び請求項６または７に記載のアジュバント製剤を含む、ワクチン組成物。
9. 前記ワクチン組成物が、本質的にサポニンを含まない、請求項８に記載のワクチン組成物。
10. 前記抗原成分が、前記内部区画内である、請求項８または９に記載のワクチン組成物。
11. 前記抗原成分が、ウシ抗原、ヤギ抗原、ブタ抗原、家禽抗原、ウマ抗原、イヌ抗原、ウマ抗原及びネコ抗原からなる群から選択される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
12. 前記免疫刺激オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧオリゴデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
13. 前記抗原成分が、ＩＢＲ、ＢＶＤＶ−１、及びＢＶＤＶ−２を含み、前記ワクチン組成物が、本質的にサポニンを含まない、請求項９に記載のワクチン組成物。
14. 請求項１３に記載のワクチン組成物をウシに投与することを含む、前記ウシ中のＢＶＤＶに対する免疫応答の誘発方法。
15. 前記免疫応答が、随伴発熱なく誘発される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記抗原が、家禽抗原を含む、請求項１２に記載のワクチン組成物。
17. 前記抗原が、プロフィリンである、請求項１６に記載のワクチン組成物。
18. 前記感染前に請求項１８に記載のワクチン組成物を家禽動物に投与することを含む、Ｅｉｍｅｒｉａに感染した前記動物が排泄するＥｉｍｅｒｉａ ｏｏｃｙｓｔの予防方法。
19. 前記抗原成分が、ｓｓＲＮＡウイルスを含み、前記ワクチン組成物が、ＣｐＧオリゴデオキシリボヌクレオチドを実質的に含まない、請求項１１に記載のワクチン組成物。
20. 前記ｓｓＲＮＡウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項１９に記載のワクチン。
21. 前記インフルエンザウイルスが、不活性化されたブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）である、請求項２０に記載のワクチン。
22. 請求項１に記載のリポソームの調製方法であって、
    ａ）有機溶媒中に前記第四級アンモニウム化合物、前記ステロール、前記リン脂質、及び式Ｉの前記糖脂質を溶解すること：
    

    

    式中、Ｒ^１及びＲ^２は、独立して、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキルラジカルであり；Ｘは、−ＣＨ_２−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり；Ｒ^２は、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和もしくは不飽和アルキルラジカルであり；Ｒ^３、Ｒ^４、及びＲ^５は、独立して、水素、−ＳＯ_４ ^２−、−ＰＯ_４ ^２−、−ＣＯＣ_１−１０アルキルであり；Ｒ^６は、Ｌ−アラニル、Ｌ−α−アミノブチル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパルギニル、Ｌ−アスパルチル、Ｌ−システイニル、Ｌ−グルタミル、Ｌ−グリシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−ヒドロキシプロリル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシル、Ｌ−リシル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチニル、Ｌ−フェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ−トレオニル、Ｌ−チロシル、Ｌ−トリプトファニル、及びＬ−バリルまたはそれらのＤ型異性体である；
    ｂ）前記有機溶媒を除去して、フィルムを形成すること；
    ｃ）水性溶媒中の前記フィルムを再水和して、再水和組成物を形成すること；
    ｄ）前記再水和組成物を微細流動化すること
    を含む、前記方法。
23. 前記水性溶媒が、免疫刺激オリゴヌクレオチドを含む、請求項２２に記載の方法。