BR112018001318B1 - Lipossoma livre de saponina, formulação adjuvante, composição de vacina, uso terapêutico de um componente antigênico e da formulação adjuvante e método para preparar o referido lipossoma - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES ADJUVANTES LIPOSSOMAIS. A invenção provê uma composição adjuvante lipossomal compreendendo uma membrana externa e um compartimento interno, a membrana externa compreendendo: um composto de amônio quaternário; um esterol; um fosfolipídeo; e um glicolipídio. Composições de vacina compreendendo o adjuvante lipossomal da presente invenção também são providas.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001]Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Norte-Americano No. 62/194.355, depositado em 20 de julho de 2015, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] Esta invenção está no campo de adjuvantes de vacina.

ANTECEDENTE

[003]Na área da vacinação, os antígenos são introduzidos em um hospedeiro em uma maneira de modo a estimular uma resposta imune ao antígeno e, portanto, para o patógeno potencial. A indução de uma resposta imune depende de muitos fatores entre os quais acredita-se que sejam a composição química, características e configuração do antígeno, a saúde e a competência imune do hospedeiro, e a maneira de distribuição e administração do antígeno.

[004] Uma resposta imune tem muitas facetas, algumas das quais são exibidas pelas células do sistema imune (por exemplo, células dendríticas, linfócitos B, linfócitos T, macrófagos e células plasmáticas). As células do sistema imune participam da resposta imune através da interação com antígenos ou outras células do sistema imune, a liberação de citocinas e reatividade a essas citocinas. Resposta imune adaptativa (adquirida) é convenientemente (mas arbitrariamente) dividida em duas categorias principais - humoral e mediada por células. O componente humoral da resposta imune inclui a produção de anticorpos específicos para o antígeno. O componente mediado por célula inclui a geração de hipersensibilidade do tipo tardia e células T citotóxicas efetoras específicas para o antígeno.

[005] Adjuvantes são substâncias usadas para potencializar uma resposta imune quando usados em conjunto com o antígeno. O uso de um adjuvante em um protocolo de vacinação pode, por exemplo, elicitar uma resposta imune que é mais rápida ou maior do que seria elicitada com antígeno sozinho. Além disso, adjuvantes podem ser usados para direcionar a resposta imune para vias imunológicas específicas e para servir como um veículo de distribuição para o antígeno.

[006] Lipossomas e formulações lipossomais são exemplos de adjuvantes. Tipicamente, os lipossomas podem ser carregados com o (s) antígeno (s) e/ou outros compostos imunomodulatórios, ou os próprios lipossomas podem servir como adjuvantes independentes. Os antígenos e/ou outros compostos imunoestimuladores podem ser encapsulados no interior do lipossoma, e/ou podem ser ligados ao lipossoma ou incorporadas na bicamada lipídica.

[007] Os fatores influenciando a adequabilidade de um dado lipossoma como um veículo de distribuição em um dado sistema de apresentação permanecem pouco claros. Então, ainda existe uma necessidade de veículos de distribuição, que proporcionem uma eficácia melhorada. Tal distribuição melhorada é particular para a administração de moléculas que estimulam e/ou eliciam uma resposta imune, por exemplo, antígenos e imunomoduladores.

RESUMO DA INVENÇÃO

[008] A presente invenção é direcionada a adjuvantes para melhorar o desempenho de uma vacina.

[009] Em certos aspectos, a invenção provê um lipossoma que compreende uma membrana de bicamada de lipídeo externa e um compartimento interno, a membrana de bicamadas de lipídeo externa compreendendo: um composto de amônio quaternário; um esterol; um fosfolipídio; e um glicolipídio de Fórmula I:

[010]em que, R1 e R2 são independentemente hidrogênio, ou um radical alquila saturado tendo até 20 átomos de carbono; X é -CH2 -,-O- ou -NH-; R2 é hidrogênio, ou um radical alquila saturado ou insaturado tendo até 20 átomos de carbono; R3, R4 e R5 são independentemente hidrogênio,-SO42,-PO42,-COC1- alquila 10; R6 é L-alanila, L-alfa-aminobutila, L-arginila, L-asparginila, L-aspartila, L-cisteinila, L-glutamila, L-glicila, L-histidila, L-hidroxiprolila, L-isoleucila, L-leucila, L-lisila, L- metionila, L-ornitinila, L-fenialani, L-prolila, L-serila, L-treonila, L-tirosila, L-triptofanila, e L-valila ou seus D-isômeros.

[011] Em certas modalidades, o composto amônio quaternário é DDA, o esterol é colesterol, o fosfolipídio é lecitina, e o glicolipídio é N-(2-Deóxi-2-L- leucilamino-β-D-glicopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida ou um acetato dos mesmos.

[012] Em certas modalidades, o lipossoma é essencialmente livre de saponina.

[013] Em certas modalidades, o lipossoma ainda compreende um oligonucleotídeo imunoestimulatório selecionado a partir do grupo consistindo em um ribonucleotídeo imunoestimulante, um CpG oligodeoxirribonucleotídeo, e uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o lipossoma é livre de CpG oligodeoxirribonucleotídeo.

[014] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo imunoestimulador é incorporado dentro do compartimento interno do lipossoma. Em outras modalidades, o oligonucleotídeo imunoestimulador é associado com a superfície externa do lipossoma.

[015] Em algumas modalidades, o referido oligonucleotídeo imunoestimulador compreende qualquer uma das SEQ ID NOs 1-14.

[016] Em certos aspectos, a invenção provê uma formulação adjuvante compreendendo os lipossomas como aqui descrito.

[017] Em certas modalidades, a formulação adjuvante é essencialmente livre de saponina. Em certas modalidades, a formulação adjuvante é essencialmente livre de CpG oligodeoxirribonucleotídeo.

[018] Em certos aspectos, a invenção provê uma composição de vacina que compreende uma quantidade efetiva de um componente antigênico e uma formulação adjuvante como aqui descrita.

[019] Em certas modalidades, a composição de vacina é essencialmente livre de saponina.

[020] Em certas modalidades, a composição de vacina é essencialmente livre de CpG. Em certas modalidades, o componente antigênico da composição de vacina essencialmente livre de CpG contém um vírus (-) ssRNA.

[021] Em certas modalidades, o vírus (-) ssRNA é um vírus da influenza. Em algumas modalidades, o vírus influenza é um vírus de Influenza Suíno.

[022] Em certas modalidades, o componente antigênico é incorporado dentro do compartimento interno do lipossoma.

[023] O componente antigênico, em modalidades selecionadas adequadas para gado, pode incluir vírus inativado por BVDV-1 e/ou BVDV -2 (e BHV-1). Em outras modalidades, particularmente adequadas para animais de aves domésticas, o componente antigênico inclui profilina.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições:

[024] Os termos "cerca" ou “aproximadamente”, quando usados em conexão com uma variável numérica mensurável, refere-se ao valor indicado da variável e a todos os valores da variável que estão dentro do erro experimental do valor indicado (por exemplo , dentro do intervalo de confiança de 95% para a média) ou dentro de 10 por cento do valor indicado, qualquer que seja maior, a menos que “cerca de” seja usado em referência a intervalos de tempo em semanas onde "cerca de 3 semanas," é de 17 a 25 dias, e de cerca de 2 a cerca de 4 semanas é de 10 a 40 dias.

[025] O termo "febre acompanhante" refere-se à elevação na temperatura do animal vacinado dentro de um dia de vacinação. No caso de bovinos, o termo refere- se à temperatura retal acima de 39,7° F (103,5° F).

[026] O termo "antígeno" em combinação com as espécies refere-se a patógenos que causam doença infecciosa na referida espécie, ou aos componentes destes patógenos. Então, por exemplo, os “antígenos bovinos” referem-se a patógenos capazes de causar infecções por doença em bovinos ou aos componentes destes patógenos.

[027] O termo “consistindo essencialmente de” e semelhantes quando aplicado aos lipossomas e às formulações adjuvantes da presente invenção refere-se a composições que não contêm agentes adjuvantes ou imunomoduladores adicionais nas quantidades nas quais o referido agente exerce efeitos adjuvantes ou imunomoduladores mensuráveis.

[028] Os termos "essencialmente livres de saponina", “substancialmente livre de saponina” e semelhantes referem-se a uma composição que não contém saponina nas quantidades nas quais a saponina exerce efeitos adjuvantes ou imunomoduladores mensuráveis. Em certas modalidades, as composições essencialmente livres de saponina contêm saponina na quantidade insuficiente para causar resposta imune sistêmica, tal como febre. Em certas modalidades, as composições essencialmente livres de saponina não contêm nenhuma saponina ou contêm saponina em ou abaixo do limite de detecção.

[029] Similarmente, os termos “essencialmente livre de CpG deoxirribonucleotídeo”, “substancialmente livre de CpG deoxirribonucleotídeo” e semelhantes referem-se a uma composição que não contém CpG deoxirribonucleotídeo nas quantidades nas quais o CpG deoxirribonucleotídeo exerce efeitos adjuvantes ou imunomoduladores mensuráveis. Em certas modalidades, as composições essencialmente livres de CpG deoxirribonucleotídeo não contêm nenhum CpG deoxirribonucleotídeo ou contêm CpG deoxirribonucleotídeo em ou abaixo do limite de detecção. Os termos “essencialmente livre de CpG deoxirribonucleotídeo”, “substancialmente livre de CpG deoxirribonucleotídeo” e semelhantes especificamente excluem as vacinas onde o CpG deoxirribonucleotídeo está naturalmente presente no antígeno.

[030]O termo "molécula imunoestimuladora" refere-se a uma molécula que melhora uma resposta imunológica.

[031] O termo "lipossoma" refere-se a uma partícula esférica microscópica formada por uma bicamada lipídica que encerra um compartimento aquoso.

[032]O termo "administração parenteral" refere-se à introdução de uma substância, tal como uma vacina, dentro do corpo do paciente através ou por meio de uma via que não inclui o trato digestivo. A administração parenteral inclui administração subcutânea, intramuscular, transcutânea, intradérmica, intraperitoneal, intraocular e intravenosa.

[033] Os termos "quantidade terapeuticamente efetiva" e "quantidade efetiva" referem-se a uma quantidade de um antígeno ou vacina que pode induzir uma resposta imunológica em um paciente que recebe o antígeno ou vacina que é adequado para prevenir ou reduzir sinais ou sintomas de doença, incluindo efeitos adversos para a saúde ou complicações da mesma, causados por infecção com um patógeno, tal como um vírus ou uma bactéria. Imunidade humoral ou imunidade mediada por célula ou ambas, imunidades humoral e mediada por célula podem ser induzidas. A imunogenicidade e eficácia de uma vacina em um animal podem ser avaliadas, por exemplo, indiretamente através da medida de títulos de anticorpos, ensaios de proliferação de linfócitos, ensaios de IFN gama ELISPOT, ensaios de células T citotóxicas ou diretamente através de monitoramento de sinais e sintomas após o desafio com a cepa do tipo selvagem. A imunidade protetora conferida por uma vacina pode ser avaliada medindo, por exemplo, redução em sinais clínicos tais como mortalidade, morbidez, febre, viremia, impacto sobre patologia clínica, condição física geral, e saúde geral e desempenho do paciente. A quantidade de uma vacina que é terapeuticamente efetiva pode variar dependendo do adjuvante particular usado, do antígeno particular usado, ou a condição do paciente, e pode ser determinada por um versado na técnica.

[034] A invenção provê, em parte, lipossomas contendo um compartimento interno e uma membrana externa. Lipossomas podem ter um tamanho médio de partícula entre 50 e 500 nm. Em certas modalidades não limitantes, o tamanho médio de partícula dos lipossomas é de 100-500 nm, ou 150-450 nm, ou 150-250 nm, ou 300-400 nm, ou 250-300 nm. Em certas modalidades, a membrana compreende um composto de amina quaternária, um fosfolipídio, um esterol e um glicolipídio. Em certas modalidades, o lipossoma é essencialmente livre de saponina.

[035] Em certas modalidades, a membrana externa consiste essencialmente ou consiste do composto de amina quaternária, o fosfolipídio, o esterol e o glicolipídio. Em outras modalidades, o compartimento externo do lipossoma não contém quaisquer oligonucleotídeos imunoestimulatórios e/ou outros compostos imunomodulatórios. Então, em tais modalidades, o lipossoma consiste essencialmente de, ou consiste do compartimento interno consistindo essencialmente de ou consistindo de um veículo aquoso imunologicamente inerte, o referido compartimento interno circundado pela membrana externa que consiste essencialmente de, ou consiste do composto de amina quaternária, do fosfolipídio, do esterol e do glicolipídio.

[036]Compostos de amina quaternária são compostos à base de amônio com quatro grupos hidrocarboneto. Na prática, grupos hidrocarboneto são geralmente limitados a grupos alquila ou arila. Em um conjunto de modalidades, os compostos de amina quaternária são compostos de quatro cadeias alquila, duas dos quais são alquilas C10-C20 e as duas restantes são alquilas C1-C4. Em certas modalidades, a amina quaternária é brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA), cloreto ou outro contraíon farmaceuticamente aceitável.

[037] Esteróis compartilham um núcleo químico comum, que é(são) uma(s) estrutura(s) de anel(s) esteroide(s), tendo um grupo hidroxila (OH), usualmente ligado ao carbono -3. A cadeia de hidrocarboneto do substituinte de ácido graxo varia em comprimento, usualmente de 16 a 20 átomos de carbono, e pode ser saturada ou insaturada. Os esteróis contêm comumente uma ou mais ligações duplas na estrutura do anel e também uma variedade de substituintes ligados aos anéis. Esteróis e seus ésteres de ácido graxo são essencialmente insolúveis em água. Em vista destas similaridades químicas, é assim provável que os esteróis compartilhando este núcleo químico teria propriedades similares quando usados nas composições de vacina da presente invenção. Os esteróis são bem conhecidos na técnica e podem ser adquiridos comercialmente. Por exemplo, o colesterol é revelado no Índice Merck, 12a Ed, p 369. Esteróis adequados incluem, sem limitações, β-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol e colesterol.

[038] Glicolipídios adequados são geralmente aqueles que ativam a resposta Th2. Os glicolipídios incluem, sem limitações, aqueles compreendidos pela Fórmula I e que são geralmente descritos na Publicação de Patente Norte-Americana 20070196384 (Ramasamy e colaboradores).

[039]Na estrutura da Fórmula I, R1 e R2 são independentemente hidrogênio, ou um radical alquila saturado tendo até 20 átomos de carbono; X é-CH2,-O- ou -NH- ; R2 é hidrogênio, ou um radical alquila saturado ou insaturado tendo até 20 átomos de carbono; R3, R4, e R5 são independentemente hidrogênio, -SO42-, -PO42-, - COalquilaC1-10; R6 é L-alanila, L-alfa-aminobutila, L-arginila, L-asparginila, L-aspartila, L-cisteinila, L-glutamila, L-glicila, L-histidila, L-hidroxiprolila, L-isoleucila, L-leucila, L- lisila, L-metionila, L-ornitinila, L-fenialani, L-prolila, L-serila, L-treonila, L-tirosila, L- triptofanila, e L-valila ou seus D-isômeros.

[040] Exemplos de um glicolipídio são, sem limitação, N-(2-Deóxi-2-L- leucilamino-β-D-glicopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida (BayR® 1005, ou R1005) ou um sal (por exemplo, um acetato) da mesma.

[041] Lecitina pode ser obtida como uma mistura de fosfatídeos e triglicerídeos por lavagem com água de óleos vegetais brutos, e separando e secando as gomas hidratadas resultantes. Um produto refinado pode ser obtido por fracionamento da mistura para fosfolipídios insolúveis em acetona e glicolipídeos remanescentes após a remoção dos triglicerídeos e óleo vegetal por lavagem com acetona. Alternativamente, lecitina pode ser obtida a partir de várias fontes comerciais.

[042] Outros fosfolipídeos adequados incluem fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, acilfosfatidiletanolamina, difosfatidilglicerol, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilcolina, ácido fosfatídico, cardiolipina e fosfatidiletanolamina. Os fosfolipídeos podem ser isolados de fontes naturais ou sintetizados convencionalmente.

[043] Os lipossomas conforme aqui descrito permitem proporções flexíveis dos elementos da membrana externa. Em certas modalidades, as proporções em peso do composto de amônio quaternário: o esterol: o fosfolipídio: o glicolipídeo é 1: 0,75-1,25: 1,5-2,5: 1,5-2,5, respectivamente. Em certas modalidades, as proporções em peso do composto de amônio quaternário: o esterol: o fosfolipídio: o glicolipídeo é de 1: 1: 2: 2.

[044] Em outras modalidades, o peso total do composto de amônio quaternário e do esterol é cerca da metade (por exemplo, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%) do peso total do glicolipídeo e do fosfolipídeo, provido que o composto de amônio quaternário compreende pelo menos cerca de 5% p/p do peso total destes quatro compostos (o composto de amônio quaternário, o esterol, o fosfolipídeo, e o glicolipídeo), e o glicolipídeo é pelo menos cerca de 20% p/p do peso total destes quatro compostos.

[045] Em certas modalidades, o peso total do composto de amônio quaternário e do composto esterol é cerca de 10-40% (por exemplo, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 33,3%, cerca de 35%, cerca de 40%) do peso total do glicolipídeo e do fosfolipídeo, provido que o composto de amônio quaternário compreenda pelo menos cerca de 5% p/p do peso total destes quatro compostos (o composto de amônio quaternário, o esterol, o fosfolipídeo, e o glicolipídeo), e o glicolipídeo é pelo menos cerca de 20% p/p do peso total destes quatro compostos.

[046] Em certas modalidades, uma quantidade imunologicamente efetiva dos lipossomas da presente invenção pode ser administrada como um adjuvante. Em algumas modalidades, a invenção provê uma combinação de vacina que compreende a quantidade imunologicamente efetiva da composição adjuvante, e o componente antigênico, como ainda descrito abaixo.

[047] O peso da espécie de cliente por fim dita a dose da composição adjuvante da presente invenção.

[048] Em certas modalidades, adequadas para gado bovino, cavalos e porcos adultos, uma dose contém o equivalente de 1000 a 3000 μg de componente de membrana externa (isto é, o peso total do composto de amônio quaternário, o esterol, o fosfolipídeo e o glicolipídeo), ou o equivalente de 1000-2000 μg, ou o equivalente de 1000-1500 μg, ou o equivalente de 1300-1800 μg ou o equivalente de 1500-2000 μg.

[049] O peso da composição de lipossomo pode não ser igual ao peso do componente de membrana devido à presença do compartimento interno que pode conter o oligonucleotídeo imunoestimulador, o componente de antígeno, outros imunomoduladores etc. O uso de equivalentes ao componente de membrana lipossomal permite a dosagem uniforme. O regime de dosagem mencionado na mesma garante que o animal de gado receba pelo menos 200 μg do glicolipídeo e cerca de 50 μg do composto de amônio quaternário.

[050] Em certas modalidades adequadas para ovelhas e cabras, uma dose contém o equivalente de 300-1000 μg de componente de membrana externa, por exemplo, os equivalentes de 300-500 μg, ou os equivalentes de 400-500 μg, ou os equivalentes de 400-1000 μg, ou os equivalentes de 500-1000 μg, ou os equivalentes de 600-1000 μg, ou os equivalentes de 600-800 μg.

[051] Em certas modalidades adequadas para leitões, cães e gatos, uma dose contém o equivalente de 100-400 μg de componente de membrana externa, ou o equivalente de 100-200 μg, ou o equivalente de 100-150 μg, ou o equivalente de 130180 μg, ou o equivalente de 150-200 μg.

[052] Em certas modalidades adequadas para aves domésticas, uma dose contém o equivalente de 50-200 μg de componente de membrana externa, ou o equivalente de 50-100 μg, ou o equivalente de 50-75μ g, ou o equivalente de 65-90 μg ou o equivalente de 75-100 μg, ou o equivalente de 75-150 μg.

[053] O composto interno do lipossoma pode conter antígenos ou outras moléculas imunomoduladoras. Em certas modalidades, tais moléculas imunomoduladoras adequadas para o compartimento interno incluem, sem limitação, extratos de antígenos, subunidades, sintéticos, células inteiras ou vírus.

[054] Em certas modalidades, produtos farmacêuticos ativos podem ser embalados dentro de um lipossoma.

[055] Imunomoduladores que poderiam ser embalados também incluem, sem limitações, rmLT, MPLA, Alfa-Gal-Cer. Toxina do cólera, LPS, ácidos lipoteicóicos, poli l: C, flagelina, zimozan, quitina e formas de quitina modificadas, beta-glucanos, avidina, inulina e formas de inulina modificadas, anidrido málico de etileno, plurônicos como L121 e L141, agonista CD40, agonista TLR5, bem como qualquer agonista de TLR, GM-CSF.

[056] Em certas modalidades, lipossomas podem conter várias moléculas que poderiam ser usadas como marcadores, incluindo sem limitações, OspA, OspC, pertactina e outros.

[057] Em certas modalidades, a composição adjuvante da presente invenção ainda compreende oligonucleotídeos imunoestimulatórios, tais como, por exemplo, CpG oligodeoxirribonucleotídeos ou oligonucleotídeos imunoestimuladores (ORNs), ou quimeras dos mesmos. Exemplos não limitantes adequados de CpG oligodeoxirribonucleotídeos são ilustrados nas SEQ ID NOs 1-10, exemplos não limitantes adequados de ORNs são providos nas SEQ ID NOs 11-13, e um exemplo não limitante adequado de um oligonucleotídeo imunoestimulador quimérico é provido na SEQ ID NO: 14.

[058] Estes oligonucleotídeos imunoestimulatórios são, em algumas modalidades, presentes no compartimento interno do lipossoma.

[059] Em certas modalidades, os oligonucleotídeos imunomodulatórios são associados com a superfície externa do lipossoma. A associação pode ser devido a ligações de hidrogênio, ligações eletrostáticas, ligações lipofílicas, forças de Van Der Waals e semelhantes.

[060] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo imunoestimulador carregado negativamente é associado com a superfície externa do lipossoma devido à interação com o átomo de nitrogênio quaternário positivamente carregado no composto de amônio quaternário.

[061] CpG oligodeoxirribonucleotídeos (também referidos como CpG deoxirribonucleotídeos ou CpG ODN) são uma classe recentemente descrita de agentes farmacoterapêuticos que são caracterizados pela presença de um dinucleotídeo CG não-metilado em contextos específicos de sequência base (motivo CpG) (Hanel TT, Barnes PJ (eds): New Drugs for Asthma, Allergy and COPD. Prog Respir Res. Basel, Karger, 2001, vol 31, pp 229-232, que é incorporado aqui por referência). Estes motivos CpG não são vistos em DNA eucariótico, no qual os dinucleotídeos CG são suprimidos e, quando presentes, usualmente metilados, mas são presentes em DNA bacteriano ao qual conferem propriedades imunoestimuladoras.

[062] Em certas modalidades, os adjuvantes da presente invenção utilizam um assim chamado oligonucleotídeo imunoestimulador de classe P, mais preferivelmente, oligonucleotídeos imunoestimuladores de classe P modificados, ainda mais preferivelmente, oligonucleotídeos de classe P E-modificados. Os oligonucleotídeos imunoestimuladores de classe P são CpG oligodeoxirribonucleotídeos caracterizados pela presença de palíndromes, geralmente de 6-20 nucleotídeos de comprimento. Os oligonucleotídeos de classe P têm a habilidade de se auto reunir espontaneamente em concatâmeros ou in vitro e/ou in vivo. Estes oligonucleotídeos são, em um sentido rigoroso, de fita simples, mas a presença de palíndromes permite a formação de concatâmeros ou possivelmente estruturas de haste e laço. O comprimento geral de oligonucleotídeos imunoestimuladores de classe P está entre 19 e 100 nucleotídeos, por exemplo, 1930 nucleotídeos, 30-40 nucleotídeos, 40-50 nucleotídeos, 50-60 nucleotídeos, 60-70 nucleotídeos, 70-80 nucleotídeos, 80-90 nucleotídeos, 90-100 nucleotídeos.

[063] Em um aspecto da invenção, o oligonucleotídeo imunoestimulador contém um domínio de ativação de 5' TLR e pelo menos duas regiões palindrômicas, uma região palindrômica sendo uma região palindrômica 5' de pelo menos 6 nucleotídeos no comprimento e conectada a uma região palindrômica 3'de pelo menos 8 nucleotídeos no comprimento ou diretamente ou através de um espaçador.

[064] Os oligonucleotídeos imunoestimuladores de classe P podem ser modificados de acordo com técnicas conhecidas na arte. Por exemplo, a modificação J refere-se a nucleotídeos modificados com iodo. A modificação E refere-se ao(s) nucleotídeo(s) modificado(s) com etila. Então, os oligonucleotídeos imunoestimuladores de classe P E-modificados são oligonucleotídeos imunoestimulatórios de classe P, em que pelo menos um nucleotídeo (preferivelmente nucleotídeo 5') é etilado. Modificações adicionais incluem a fixação de 6-nitro- benzimidazol, O-Metilação, modificação com proinil-dU, modificação de inosina, ligação de 2-bromovinila (prefererivelmente a uridina).

[065] Os oligonucleotídeos imunoestimuladores de classe P também podem conter uma ligação internucleotídica modificada incluindo, sem limitações, ligações fosfodiéster e ligações fosforotioato. Os oligonucleotídeos da presente invenção podem ser sintetizados ou obtidos a partir de fontes comerciais.

[066] Oligonucleotídeos de classe P e oligonucleotídeos de classe P são ainda revelados no pedido PCT publicado n° WO2008/068638, publicado em 12 de Junho de 2008. Exemplos não limitantes adequados de oligonucleotídeos imunoestimuladores de classe P modificados são providos abaixo (nas SEQ ID NOs 1-10, "*" refere-se a uma ligação de fosforotioato e "_" refere-se a uma ligação de fosfodiéster). Nas SEQ ID NOs. 11-14, todas as ligações são ou ligações fosfodiéster ou fosforotioato. SEQ ID NO: 15' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' SEQ ID NO: 25' T*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3' SEQ ID NO: 3 5' T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3' SEQ ID NO: 4 5' JU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3' SEQ ID NO: 5 5' JU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C* G*T 3' SEQ ID NO: 6 5' JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C* G*T 3' SEQ ID NO: 7 5' EU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3' SEQ ID NO: 8 5' JU*C_G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C* G*T 3' SEQ ID NO: 9 5' JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C* G*T 3' SEQ ID NO: 10 5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' SEQ ID NO: 115'-UUGUUGUUGUUGUUGUUGUU-3' SEQ ID NO: 125'-UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU-3' SEQ ID NO: 135'-AAACGCUCAGCCAAAGCAG-3' SEQ ID NO: 145’-dTdCdGdTdCdGdTdTdTdTrGrUrUrGrUrGrUdTdTdTdT-3'

[067] A dose do oligonucleotídeo imunoestimulador para uso nas composições adjuvantes depende finalmente da espécie tencionada.

[068] Por exemplo, em certas modalidades adequadas para gado bovino, ovelha ou suíno adulto, uma dose da composição adjuvante da presente invenção compreenderia entre cerca de 50 e 400 μg (por exemplo, 50-300, ou 100-250 μg, ou cerca de 50 a cerca de 100 μg para porcos adultos e cerca de 100 a cerca de 250 μg para gado) do oligonucleotídeo imunoestimulador.

[069] Em certas modalidades adequadas para animais de estimação ou leitões, uma dose da composição adjuvante da presente invenção compreenderia entre cerca de 5 e 100 μg (por exemplo, 10-80 μg, ou 20-50 μg) do oligonucleotídeo imunoestimulador.

[070] Em certas modalidades adequadas para as aves domésticas, uma dose da composição adjuvante da presente invenção varia entre cerca de 0,1 e cerca de 5 μg (por exemplo, 0,5-3 μg, ou 0,9-1,1 μg) de oligonucleotídeo imunoestimulador.

[071] Métodos de produção de lipossomas são bem conhecidos na técnica. Brevemente, os componentes do lipossoma são dissolvidos e misturados em um solvente orgânico, por exemplo, cloreto de metileno, e então o solvente é removido por secagem para produzir um filme. O filme é posteriormente reidratado usando um meio aquoso (por exemplo, água ou um tampão) que opcionalmente contém compostos que devem ser incorporados dentro do compartimento interno dos lipossomas. Em diferentes modalidades, os compostos podem incluir os oligonucleotídeos imunomoduladores, outros imunomoduladores e/ou o componente antigênico.

[072] O passo de reidratação é seguido por sonicação e/ou extrusão para reduzir o tamanho das vesículas formadas durante a etapa de reidratação.

[073] Existem duas técnicas principais de sonicação: sonicação de sonda/de ponta e sonicação de banho. A sonicação de donda/ponta tem uma alta entrada de energia que causa uma geração significativa de calor, assim necessitando o uso de um banho de gelo para manter a temperatura da dispersão lipossomal a fim de prevenir a degradação de lipídeo. Alternativamente, a energia ultrassônica pode ser aplicada indiretamente à suspensão de lipossomo utilizando um sonicador de banho, onde a temperatura é mais fácil de controlar, mas a perda de energia é comparativamente alta. A sonicação geralmente produz pequenas vesículas (~10 nm) que se fundem espontaneamente ao longo do tempo para aliviar a tensão de alta curvatura de membrana.

[074] O método de extrusão envolve a passagem da suspensão de lipossoma através de uma membrana com tamanho de poro definido. Este método é vantajoso porque o tamanho de poro definido encoraja a homogeneidade do tamanho de partícula dentro da população de lipossoma, embora a extrusão abaixo da temperatura de transição de lipídeo possa ser difícil devido à rigidez da membrana. As suspensões de lipossomo são frequentemente extruídas múltiplas vezes para obter baixa polidispersividade no produto final.

[075] Pode ser desejável preparar a preparação estável ao armazenamento de lipossomas. Em certas modalidades, tal preparação estável ao armazenamento de lipossomas é criada por liofilização. Brevemente, o filme seco descrito acima é reidratado em um tampão aquoso contendo um crioprotetor e lioprotetor tal como sacarose, trealose, ou uma combinação dos mesmos. Em outras modalidades, o crioprotetor e lioprotetor são adicionados após a etapa de reidratação. A preparação reidratada é então liofilizada usando técnicas bem conhecidas na arte. A preparação liofilizada resultante é estável ao armazenamento. No momento desejado, ela pode ser reidratada com tampão adequado.

[076] Imunomoduladores adicionais, incluindo, sem limitações, os oligonucleotídeos imunoestimulantes e o(s) antígeno (s) pode(m) ser adicionado(s) antes da liofilização ou no momento da preparação final.

[077] Em certas modalidades, os antígenos são misturados com a formulação lipossomal após os lipossomas da presente invenção serem reconstituídos. Em outras modalidades, os lipossomas, os imunomoduladores adicionais, e o componente antigênico são preparados e secos juntos.

[078] Em certas modalidades, compostos imunoestimulatórios adicionais estão presentes nas composições da presente invenção. Tais compostos imunoestimulatórios adicionais podem estar presentes dentro do compartimento interno dos lipossomas, e/ou associados com a superfície externa dos lipossomos, e/ou independentemente dos lipossomas, nas composições adjuvantes da presente invenção.

[079] Exemplos não limitantes adequados de tais compostos imunoestimulatórios adicionais incluem, mas não limitados a várias classes adjuvantes tais como sais minerais, por exemplo, Alume, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e fosfato de cálcio; agentes ativos de superfície e micropartículas, por exemplo, tensoativos de polímero em bloco não iônicos, virossomas, saponinas (por exemplo , Quil A, QS-21 e GPI-0100), proteossomas, complexos estimulantes imunes, cocleatos, piridina, vitamina A, vitamina E; produtos bacterianos tais como o sistema adjuvante RIBI (Ribi Inc.), esqueleto de parede celular de Mycobacterium phlei (Detox®), dipeptídeos de muramila (MDP) e tripeptídeos (MTP), monofosforil lipídeo A (MPLA), Bacilo Calmete-Guerin (BCG), enterotoxinas de E. coli lábeis ao aquecimento, toxina de cólera, dimicolato de trealose, citocinas e hormônios, por exemplo , interleucinas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18), fator estimulante de colônia granulócito-macrófago, desidroepiandrosterona, 1,25-diidroxivitamina D3; poliânions, por exemplo, dextrano; poliacrílicos (por exemplo, polimetilmetacrilato, CARBOPOL®934P); veículos, por exemplo, toxóide tetânico, toxóide diftérico, subunidade B da toxina cólerica, enterotoxina lábil ao calor mutante de E. coli enterotoxigênica (rmLT), proteínas de choque térmico; emulsões óleo-em-água, por exemplo, AMPHIGEN® (Hydronics, EUA); veículos policatiônicos (por exemplo, DEAE dextrano ou QAE dextrano), e emulsões água-em-óleo, tais como, por exemplo, adjuvantes completo e incompleto de Freund.

[080] Outros imunomoduladores adequados incluem Alfa-Gal-Cer. LPS, ácidos lipoteicóicos, poli l:C, flagelina, zimozan, quitina e formas de quitina modificadas, beta-glucanos, avidina, inulina e formas de inulina modificadas, anidrido málico de etileno, plurônicos como L121 e L141, agonista CD40, agonista de TLR5 bem como qualquer agonista TLR.

Antígenos e Doenças

[081] Em certas modalidades, a composição adjuvante lipossomal da presente invenção pode ser combinada com um componente antigênico assim formando a composição de vacina da presente invenção. O componente antigênico das vacinas da presente invenção pode estar presente dentro do compartimento interno dos lipossomas, e/ou associados com a superfície externa dos lipossomas e/ou independentemente dos lipossomas.

[082] Em certas modalidades, a composição de vacina é substancialmente livre de saponina. Em modalidades adicionais, a composição de vacina é essencialmente livre de CpG deoxirribonucleotídeo.

[083]As modalidades em que a composição de vacina é essencialmente livre de CpG deoxirribonucleotídeo são preferidas se o antígeno na vacina contém uma sequência de vírus ssRNA inteiro (ou um vírus (+) ssRNA ou um (-) ssRNA) que é imunoestimuladora através do direcionamento de TLR7/8. Tais sequências estimuladoras TLR 7/8 incluem sequências de ssRNA ricas em poliU ou GU. Heil F, Hemmi H. et al., 2004. Science 303(5663):1526-9. Diebold SS., Kaisho T. et al., 2004. Science 303(5663):1529-31.

[084] Os vírus contendo tais sequências incluem, sem limitações, diferentes vírus influenza (por exemplo, vírus da influenza bovina, vírus da influenza canina, vírus da influenza equina, vírus de influenza suína e semelhantes). Em modalidades particularmente preferidas, o componente antigênico da vacina essencialmente livre de CpG ODN contém vírus influenza.

[085] Um componente antigênico pode incluir, em modalidades exemplares diferentes, antígenos bovinos, antígenos caprinos, antígenos porcinos, antígenos de aves, antígenos equinos, antígenos caninos, antígenos equinos e antígenos de felinos.

[086] Antígenos podem ser de qualquer de uma ampla variedade de substâncias capazes de produzir uma resposta imune desejada em um paciente, incluindo, sem limitações, um ou mais dos vírus (inativado, atenuado e vivo modificado), bactérias, parasitas, nucleotídeos (incluindo, sem limitação, antígenos baseados em ácido nucleico, por exemplo, vacinas de DNA ou vacinas de mRNA), polinucleotídeos, peptídeos, polipeptídios, proteínas recombinantes, peptídeos sintéticos, extrato de proteína, células (incluindo células tumorais), tecidos, polissacarídeos, carboidratos, ácidos graxos, ácido lipoteicoico, peptidoglicanos, lipídeos, ou glicolipídeos, individualmente ou em qualquer combinação dos mesmos.

[087] Antígenos usados com os adjuvantes da invenção também incluem fragmentos imunogênicos de nucleotídeos, polinucleotídeos, peptídeos, polipeptídeos, que podem ser isolados dos organismos referidos aqui, ou quimicamente ou biologicamente fabricados.

[088] Cepas virais vivas, vivas modificadas e atenuadas que não causam doença em um paciente foram isoladas na forma não-virulenta ou foram atenuadas usando métodos bem conhecidos na técnica, incluindo passagem serial em uma linha de célula adequada ou exposição à luz ultravioleta ou um mitógeno químico. Cepas virais inativadas ou mortas são aquelas que foram inativadas por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo tratamento com formalina, beta- propriolactona (BPL), peróxidos, etilenoimina binária (BEI), radiação de esterilização, calor, ou outros tais métodos.

[089] Dois ou mais antígenos podem ser combinados para produzir uma composição polivalente que pode proteger um paciente contra uma ampla variedade de doenças causadas pelos patógenos. Atualmente, fabricantes comerciais de vacinas, bem como usuários finais, preferem produtos de vacina polivalente. Embora os adjuvantes convencionais sejam frequentemente limitados na variedade de antígenos com os quais eles podem ser usados efetivamente (ou monovalentemente ou polivalentemente), os adjuvantes aqui descritos podem ser usados efetivamente com uma ampla variedade de antígenos, ambos monovalentemente e polivalentemente. Então, os antígenos descritos aqui podem ser combinados em uma única composição compreendendo os adjuvantes aqui descritos.

[090]Exemplos de bactérias que podem ser usadas como antígenos com as composições adjuvantes descritas aqui incluem, mas não são limitadas a, Acinetobacter calcoaceticus, Acetobacter paseruianus, Actinobacillus pleuropneumoniae, Aeromonas hydrophila, Alicyclobacillus acidocaldarius, Arhaeglobus fulgidus, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophillus, Bacillus subtilis, Bacillus thermocatenulatus, Bordetella bronchiseptica, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Campylobacter hyointestinalis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila spp., Chromobacterium viscosum, Erysipelothrix rhusiopathieae, Listeria monocytogenes, Ehrlichia canis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, Helicobacter suis, Lawsonia intracellularis, Legionella pneumophilia, Moraxellsa sp., Mycobactrium bovis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC, Clostridium perfringens, Odoribacter denticanis, Pasteurella (Mannheimia) haemolytica, Pasteurella multocida, Photorhabdus luminescens, Porphyromonas gulae, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas salivosa, Propionibacterium acnes, Proteus vulgaris, Pseudomonas wisconsinensis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens C9, Pseudomonas fluorescens SIKW1, Pseudomonas fragi, Pseudomonas luteola, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp B11-1, Alcaliges eutrophus, Psychrobacter immobilis, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Salmonella enterica all serovars, including for example: Salmonella enterica Typhimurium, Salmonella enterica Bongori, Salmonella enterica Dublin, , Salmonella enterica Choleraesuis, and Salmonella enterica Newport, Serratia marcescens, Spirluina platensis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hyicus, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamoneus, Streptococcus uberis, Streptococcus suis, Streptomyces exfoliates, Streptomyces scabies, Sulfolobus acidocaldarius, Syechocystis sp., Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi, Treponema denticola, Treponema minutum, Treponema phagedenis, Treponema refringens, Treponema vincentii, Treponema palladium, Trueperella pyogenes and Leptospira species, such as the known pathogens Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno, Leptospira interrogans, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, e Leptospira bratislava, e combinações das mesmas.

[091] Ambos, vírus inativados e vírus vivos atenuados podem ser usados nas composições adjuvantes. Alguns exemplos de vírus que podem ser usados como antígenos incluem, mas não estão limitados a, herpesvírus aviários, herpesvírus bovino, herpesvírus canino, herpesvírus equino, vírus de rinotraqueíte viral felino, vírus da doença de Marek, herpesvírus de ovino, herpesvírus porcino, vírus da diarreia epidêmica suína (PEDv), vírus da pseudoraiva, vírus Paramixovírus aviário, vírus sincicial respiratório bovino, vírus cinomose canino, vírus parainfluenza canina, adenovírus canino, parvovírus canino, vírus parainfluenza bovino 3, Parainfluenza ovino 3, vírus Rinderpest, Vírus da doença Border, Vírus da diarreia viral bovina (BVDV), BVDV Tipo I, BVDV Tipo II, Vírus de febre suína clássica, Vírus da Leucose aviária, vírus da imunodeficiência Bovina, vírus da leucemia Bovina, tuberculose Bovina, vírus da anemia infecciosa Equina, vírus da imunodeficiência Felina , vírus da leucemia Felina (FeLV), vírus da doença de Newcastle, vírus da pneumonia progressiva ovina, vírus do adenocarcinoma pulmonar de ovino. coronavírus canino (CCV), CCV pantrópico, Coronavírus respiratório canino, coronavírus bovino, Calicivírus felino, Coronavírus Entérico felino, peritonite infecciosa felina, vírus, vírus da diarreia epidêmica Porcina, Vírus da encefalomiletite hemaglutinante porcina, Parvovírus porcino, Circovírus porcino (PCV) Tipo I, PCV Tipo II , vírus da Síndrome Reprodutiva e respiratória Porcina (PRRS), Vírus de gastroenterite transmissível, coronavírus de peru, Vírus da febre efêmera bovina, Raiva, Rotovírus, Vírus da estomatite Vesicular, lentivírus, Influenza aviária, rinovírus, vírus da influenza equina, vírus da influenza Suína, vírus da influenza Canina, vírus da influenza Felina, vírus da influenza humana, vírus da encefalite equina oriental (EEE), vírus da encefalite Equina Venezuelano, Vírus do Nilo Ocidental, vírus da encefalite equina ocidental , vírus da imunodeficiência humana, vírus do papiloma humano, vírus de varicella zoster, vírus da hepatite B, rinovírus e vírus do sarampo, e combinações dos mesmos.

[092] Exemplos de antígenos peptídicos incluem Bordetella bronchiseptica p68, GnRH, Peptídeos IgE, Fel d1, e antígenos cancerígenos, e suas combinações. Exemplos de outros antígenos incluem nucleotídeos, carboidratos, lipídeos, glicolipídeos, peptídeos, ácidos graxos, ácido lipoteicoico e teicoico, e peptidoglicanos, e combinações dos mesmos.

[093] Exemplos de parasitas que podem ser usados como antígenos com as composições adjuvantes aqui descritas incluem, mas não são limitadas a, Anaplasma, Fasciola hepatica (fasciolose hepática), Coccidia, Eimeria Spp. Neospora caninum, Toxoplasma gondii, Giardia, Dirofilaria (dirofilariose), Ancylostoma (ancislóstomo), Cooperia, Haemonchus contortus (“bastão do barbeiro”, “Barber Pole worm”), Ostertagia ostertagi (verme de estômago), Dictyocaulus viviparous (vermes pulmonares), Trypanosoma spp. Leishmania spp. Trichomonas spp., Cryptosporidium parvum, Babesia, Schistosoma, Taenia, Strongyloides, Ascaris, Trichinella, Sarcocystis, Hammondia, e Isopsora, e combinações dos mesmos. Também são contemplados parasitos externos incluindo, mas não limitados a carrapatos, incluindo espécies Ixodes, Rhipicephalus, Dermacentor, Amblyomma, Boophilus, Hyalomma, e Haemaphysalis, e combinações dos mesmos.

[094] A quantidade de antígeno usada para induzir uma resposta imune variará consideravelmente dependendo do antígeno usado, o paciente, e o nível de resposta desejado, e pode ser determinada por um versado na técnica. Para vacinas contendo vírus vivo modificado ou vírus atenuado, uma quantidade terapeuticamente efetiva do antígeno geralmente varia de cerca de 102 Dose Infectiva de Cultura de Tecido (TCID)50 a cerca de 1010 TCID50, inclusive. Para muitos desses vírus, uma dose terapeuticamente efetiva está geralmente na variação de cerca de 102 TCID50 a cerca de 108 TCID50, inclusive. Em algumas modalidades, as variações de doses terapeuticamente efetivas são de cerca de 103 TCID50 a cerca de 106 TCID50, inclusive. Em algumas outras modalidades, as variações de doses terapeuticamente efetivas são de cerca de 104 TCID50 a cerca de 105 TCID50, inclusive.

[095] Para vacinas contendo vírus inativados, uma quantidade terapeuticamente efetiva do antígeno é geralmente pelo menos cerca de 100 unidades relativas por dose, e frequentemente na variação de cerca de 1.000 a cerca de 4.500 unidades relativas por dose, inclusive. Em outras modalidades, a quantidade terapeuticamente efetiva do antígeno está em uma faixa de cerca de 250 a cerca de 4.000 unidades relativas por dose, inclusive, de cerca de 500 a cerca de 3.000 unidades relativas por dose, inclusive, de cerca de 750 a cerca de 2.000 unidades relativas por dose, inclusive, ou de cerca de 1.000 a cerca de 1.500 unidades relativas por dose, inclusive.

[096] Uma quantidade terapeuticamente efetiva de antígeno em vacinas contendo vírus inativado pode também ser medida em termos de Potência Relativa (RP) por mL. Uma quantidade terapeuticamente efetiva está frequentemente na variação de cerca de 0,1 a cerca de 50 RP por mL, inclusive. Em outras modalidades, a quantidade terapeuticamente efetiva do antígeno está em uma variação de cerca de 0,5 a cerca de 30 RP por mL, inclusive, de cerca de 1 a cerca de 25 RP por mL, inclusive, de cerca de 2 a cerca de 20 RP por mL, inclusive, de cerca de 3 a cerca de 15 RP por mL, inclusive, ou de cerca de 5 a cerca de 10 RP por mL, inclusive.

[097] O número de células para um antígeno bacteriano administrado em uma vacina varia de cerca de 1x106 a cerca de 5x1010 unidades formadoras de colônias (CFU) por dose, inclusive. Em outras modalidades, o número de células varia de cerca de 1x107 a 5x1010 CFU/dose, inclusive, ou de cerca de 1x108 a 5x1010 CFU/dose, inclusive. Em ainda outras modalidades, o número de células varia de cerca de 1x102 a 5x1010 CFU/dose, inclusive, ou de cerca de 1x104 a 5x109 CFU/dose, inclusive, ou de cerca de 1x105 a 5x109 CFU/dose, inclusive, ou de cerca de 1x106 a 5x109 CFU/dose, inclusive, ou de cerca de 1x106 a 5x108 CFU/dose, inclusive, ou de cerca de 1x107 a 5x109 CFU/dose, inclusive.

[098] O número de células para um antígeno de parasita administrado em uma vacina varia de cerca de 1x102 a cerca de 1x1010 por dose, inclusive. Em outras modalidades, o número de células varia de cerca de 1x103 a cerca de 1x109 por dose, inclusive, ou de cerca de 1x104 a cerca de 1x108 por dose, inclusive, ou de cerca de 1x105 a cerca de 1x107 por dose, inclusive, ou de cerca de 1x106 a cerca de 1x108 por dose, inclusive.

Excipientes

[099] Formulação adjuvante e/ou composições de vacina podem incluir um veículo farmaceuticamente aceitável. Como aqui utilizado, "um veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes estabilizantes, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos, agentes de retardo de adsorção, e semelhantes. O(s) veículo(s) deve(m) ser "aceitável(s)" no sentido de ser compatíveis com os outros componentes das composições e não prejudiciais ao paciente. Tipicamente, os veículos serão estéreis e livres de pirogênio, e selecionados com base no modo de administração a ser usado. É bem conhecido por aqueles versados na técnica que as formulações preferidas para o veículo farmaceuticamente aceitável que compreendem as composições são aqueles veículos farmacêuticos aprovados nos regulamentos aplicáveis promulgados pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (EUA) ou Food and Drug Administration Norte-Americano, ou agência governamental equivalente em um país não-americano. Portanto, o veículo farmaceuticamente aceito para a produção comercial das composições é um veículo que já é aprovado ou será aprovado pela agência governamental apropriada nos EUA ou país estrangeiro.

Administração das Composições

[0100] Tamanhos de doses de composições tipicamente variam de cerca de 1 mL a cerca de 5 mL, inclusive, dependendo do paciente e do antígeno. Por exemplo, para um canino ou felino, uma dose de cerca de 1 mL é tipicamente usada, enquanto em gado, uma dose de cerca de 2-5 mL é tipicamente usada. Entretanto, esses adjuvantes também podem ser formulados em microdoses, em que doses de cerca de 100 μL podem ser usadas.

[0101]Vias de administração para composições adjuvantes incluem parenteral, oral, oronasal, intranasal, intratraqueal, subcutânea, intramuscular, transcutânea, intradérmica, intraperitoneal, intraocular, intravenosa e em ova. Qualquer dispositivo adequado pode ser usado para administrar as composições, incluindo seringas, conta-gotas, dispositivos de injeção sem agulha, adesivos e semelhantes. A via e dispositivo selecionados para uso dependerão da composição do adjuvante, o antígeno, e o paciente e tais são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.

Uso das Composições

[0102] As formulações adjuvantes aqui descritas são fáceis de fabricar e estáveis por pelo menos 18 meses a 4° C. as formulações podem ser estáveis, por exemplo, por cerca de 18 meses, ou cerca de 18 a cerca de 24 meses a 4° C. Em outra modalidade, as formulações são estáveis durante pelo menos cerca de 24 meses a 4° C. Os procedimentos de teste acelerados também indicam que as formulações aqui descritas são estáveis por pelo menos duas semanas a 37° C que corresponde a cerca de 24 meses a 4° C.

[0103] As composições adjuvantes descritas aqui podem ser seguramente e efetivamente administradas a uma ampla variedade de pacientes. Descobriu-se, surpreendentemente, que as composições adjuvantes aqui descritas demonstram melhorias de segurança quando comparadas com outras composições adjuvantes.

[0104] Os seguintes exemplos são apresentados como modalidades ilustrativas, mas não devem ser tomados como limitando o objetivo da invenção. Muitas mudanças, variações, modificações e outros usos e aplicações desta invenção serão aparentes para aqueles versados na técnica.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Caracterização dos Lipossomas

[0105]Lipossomas DCRL (contendo DDA, Colesterol, Bay®R1005 e Lecitina) foram ajustados para uma concentração final de 50, 50, 100 e 100 μg/mL de DDA, colesterol, R1005 e lecitina de soja, respectivamente.

[0106] Os compostos foram adicionados a um frasco de fundo redondo de 250 mL e enchidos a um volume final de 5 mL com clorofórmio de grau anidro (Sigma- Aldrich, Poole, Dorset, Reino unido) usando ponteiras de pipetagem de 1 mL Solvent Safe ® (Sigma-Aldrich). Solvente foi removido usando um evaporador rotativo (Buchi, Flawil, Suíça) a 55° C sob vácuo (KNF Neuberger, Witney, Oxfordshire, Reino Unido) por 1 hora até que um filme de lipídeo branco, seco seja formado. Lipossomas foram reidratados com água destilada dupla (ddH2O) a partir de um purificador de água Option 3 modificado internamente incluindo osmose reversa para pureza ultra-elevada (ELGA LabWater, Wycombbe, Buckinghameshire, Reino unido) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS; Sigma-Aldrich) reconstituída a partir de comprimidos com ddH2O.

[0107]Após a reidratação, os lipossomas foram manipulados com ponta de pipeta de 1 mL de orifício largo (VWR, Lutterworth, Leicestershire, Reino Unido) para reduzir o cisalhamento. Então, a suspensão de lipossomo foi sonicada em um banho (Sarose Scientific Instruments, Perivale, Middleex, Reino Unido) por 1 hora e/ou extruída até 3 vezes através de uma membrana de 100 nm de policarbonato Whatman® Nucleopore Track-Etched (Sigma-Aldrich) usando uma célula mini- extrusora equipada com duas seringas de 1 mL. Membrana de policarbonato foi flanqueada por suportes de filtro de 10 mm.

[0108]Lipossomas DCRL sonicados (1,14 μm de diâmetro médio) foram significativamente maiores (5,44 vezes) do que os lipossomas extruídos. A sonicação seguida por extrusão não afetou significativamente o tamanho da vesícula comparado com amostras extruídas (209,6 nm). Polidispersividade de lipossomas extruídos foi de 2,10 vezes menor do que os lipossomas sonicados. Uma combinação de sonicação e extrusão aumentou significativamente a polidispersividade DCRL em 1,42 vezes comparada aos lipossomas extruídos.

[0109] Para avaliar a estabilidade coloidal de lipossomas em solução aquosa, lipossomas DCRL hidratados em ddH2O foram avaliados durante 4 semanas. Notavelmente, um equivalente termodinâmico aproximado de 2 anos a 4° C é armazenado por 4 semanas a 37° C, então motivando a avaliação da estabilidade do produto em ambos 4 e 37° C. Ambos, lipossomas DCRL vazio ("-ODN") e lipossomas DCRL carregados com um oligonucleotídeo CpG ODN imunoestimulador exemplar ("+ ODN") foram avaliados para determinar o efeito de ácidos nucléicos aniônicos sobre a estabilidade coloidal lipossomal catiônica. Aqui, ODN foi carregado pela reidratação de filme lipídico com uma solução de ddH2O e ODN. Tamanho e polidispersividade de lipossomas DCRL hidratados em ddH2O (177 nm, 0,24) foram estatisticamente similares àqueles hidratados em PBS (210 nm, 0,17).

[0110] A 4° C, os lipossomas +/- ODN DCRL sofreram aumentos insignificantes de 1,10 e 1,01 vezes em diâmetro após 28 dias, respectivamente. Os lipossomas contendo ODN (lipossomas + ODN) (417 nm) foram significativamente maiores do que os lipossomas sem ODN (lipossomas -ODN) (177 nm). Similarmente, a polidispersividade diminuiu modestamente 1,08 e 1,03 vezes para os lipossomas +/- ODN após 28 dias, respectivamente, embora a polidispersividade no dia 28 fosse significativamente mais alta em + ODN lipossomas (1,23 vezes) em comparação com as contrapartes ODN.

[0111] Por outro lado, o comportamento de agregação dos lipossomas foi observado após 28 dias, quando armazenado a 37° C. Lipossomas +/- ODN sofreram aumentos significativos de 3,24 e 2,00 vezes em diâmetro após 28 dias, respectivamente, mas estabilizaram após o dia 21. Enquanto que os lipossomas +ODN foram maiores (1,46 vezes no dia 28) que os lipossomas -ODN devido à compensação de carga mediada por ODN e perda de estabilidade coloidal, tendências de estabilidade ao longo do tempo foram qualitativamente similares. No entanto, a desestabilização dos lipossomas +ODN ocorreu após o dia 7, enquanto que nos lipossomas -ODN, a estabilidade foi mantida até após o dia 14. Adicionalmente, a polidispersividade de lipossomas +/- ODN foi estatisticamente similar após 28 dias, tendo reduções significativas de 1,92 e 1,50 vezes, respectivamente, em polidispersividade comparada com vesículas no dia 0.

[0112]Estes resultados sugerem a necessidade de desenvolvimento de tecnologias para conservação do lipossoma e também sugerem que técnicas de sonicação e/ou extrusão mais poderosas, resultando em um tamanho de lipossoma inicialmente menor, podem compensar para agregação inicial de lipossomas.

[0113] Tamanhos de lipossomas preparados usando microfluidização (Microfluidics Corp., Modelo 110 EH) e sonicação foram comparados. Quando a etapa de sonicação foi substituída por microfluidização, a formulação produziu lipossomas com diâmetro médio de cerca de 59 nm.

[0114] Estes resultados demonstram que os lipossomas preparados utilizando microfluidização podem minimizar a agregação dos lipossomas que podem potencialmente ser causados pela adição de ODN ou ORN.

Exemplo 2 - Estabilidade de Lipossomas liofilizados

[0115]Liofilização foi realizada utilizando-se um liofilizador Dura-Stop (SP Scientific, Ipswich, Suffolk, Reino Unido). As Amostras foram enchidas em frascos de liofilização de vidro tipo I tubular de 10 mL (Schott, Stafford, Staffordshire, Reino Unido) antes da liofilização. Os parâmetros do ciclo de liofilização foram como segue. As amostras foram congeladas por 30 minutos a 5° C, 30 minutos a -5° C e 60 minutos a -40° C, tudo a uma taxa de rampa de 1,00° C/minuto. A secagem primária foi realizada por 59 minutos a -37° C, 59 minutos a -28° C, 59 minutos a -23° C e 552 minutos a -21° C, tudo em uma taxa de rampa de 0,50° C/min. A secagem secundária foi realizada a 20° C por 360 minutos a uma taxa de rampa de 0,10° C/min. Toda a secagem foi realizada com uma pressão de câmara de 57 mTorr. Um ciclo de secagem primário alternativo foi realizado a 57 mTorr por 59 minutos a -38° C, 59 minutos a -38° C, 59 minutos a -37° C e 552 minutos a -35° C, tudo a uma taxa de rampa de 0,50° C/minuto. Amostras liofilizadas foram vedadas com tampões liofilizados de borracha de butila de grau farmacêutico de 14 mm (Fisher Scientific, Loughborough, Leicestershire, Reino Unido) e Parafilm M® (Sigma-Aldrich).

[0116] Lioprotetores D-manitol, D-(+)-glicose, D-(-)-frutose, sacarose, diidrato de D-(+)-trealose (Sigma-Aldrich) ou D(+)-manose (Acros Organics) foram solubilizados em ddH2O ou PBS e adicionados à suspensão de lipossomo a uma concentração final de 2-4% p/v antes dos liofilizados conforme indicado.

[0117] Na ausência de açúcares, os lipossomas reidratados com ddH2O e PBS foram ~210 nm antes da liofilização. Sem lioprotetores, liofilização aumentou o tamanho de lipossoma em 3,55 e 6,05 vezes em amostras reidratadas de ddH2O e PBS, respectivamente. Os lipossomas DCRL reidratados em ddH2O ou PBS não sofreram mudanças significativas de tamanho após a adição de 3% de sacarose, 4% de manitol ou uma combinação, demonstrando que a agregação observada pós- liofilização não foi causada diretamente pela adição do(s) lioprotetor(s).

[0118] Para lipossomas reidratados em PBS, o tamanho de lipossoma foi significativamente aumentado (2,00 vezes) somente em amostras sem lioprotetor após o ciclo de congelamento. Entretanto, após o ciclo de liofilização completo, o tamanho de lipossoma foi significativamente aumentado 6,05, 3,03, 5,15 e 4,13 vezes para amostras sem lioprotetor, com 3% de sacarose, com 4% de manitol e com uma combinação, respectivamente. Similarmente, polidispersividade foi significativamente aumentada por 2,61, 2,61, 2,85 e 2,79 vezes para DCRL sem lioprotetor, com 3% de sacarose, com 4% de manitol e com uma combinação, respectivamente, em comparação com controles pré-liofilizados.

[0119] Para lipossomas reidratados em ddH20, o tamanho da vesícula após o ciclo de congelamento foi aumentado significativamente com o tempo de pré- liofilização controle por 17,90 e 11.45 vezes para lipossomas sem lioprotetores e com 4% de manitol, respectivamente, enquanto os lipossomas com 3% de sacarose ou uma combinação de 3% de sacarose e 4% de manitol sofreram mudanças negligenciáveis. Após o ciclo de liofilização total, tamanhos de lipossoma modestamente alterados 3,55, 0,88, 3,48 e 1,47 vezes para amostras sem lioprotetor, com 3% de sacarose, com 4% de manitol e com uma combinação, respectivamente.

[0120] Estes descobrimentos demonstram que os lipossomas reidratados em ddH2O têm melhor estabilidade coloidal em comparação com aqueles reidratados em PBS como ilustrado por tamanho de vesícula não alterado pós-liofilização o e que 3% de sacarose pode ser um lioprotetor mais ideal para conferir boa estabilidade coloidal.

[0121]Processo para a otimização de um esquema de liofilização para os lipossomas DCRL reidratados com ddH2O, o efeito de 6 lioprotetores de açúcar conhecidos (individualmente e em combinação), a 2% p/v no tamanho da vesícula e polidispersividade foram avaliados.

[0122] Sacarose, glicose, manitol, trealose, frutose e manose foram testados como lioprotetores. Somente 2% de manitol como lioprotetores aumentou significativamente o tamanho da vesícula (39,66 vezes) e polidispersividade (2,95 vezes) Entretanto, embora a liofilização com todos os outros açúcares não resulta em mudança de tamanho apreciável, os produtos lioprotegidos com glicose, frutose e/ou manose colapsaram em camadas impermeáveis, compactas de açúcar e lipossomas, que foram difíceis de reidratar. Consistente com a literatura, lipossomas lioprotegidos com sacarose ou trealose prveniram a mudança de tamanho de partícula e resultaram em uma massa que poderia ser reconstituída em uma dispersão lipossomal com boa estabilidade coloidal.

[0123] DCRL também foi liofilizado com combinações de açúcares. Este estudo revelou que somente 2% de sacarose, 2% de trealose e 2% de sacarose/2% de trealose suportou boa estabilidade coloidal após a liofilização e alcançaram uma estrutura de massa farmaceuticamente elegante. Entretanto, a combinação de 2% de sacarose/2% de trealose não pareceu ser vantajosa em termos de estabilidade de tamanho de lipossoma e polidispersividade sobre a lioproteção com 2% de sacarose ou 2% de trealose sozinhas.

Exemplo 3 - Vacina IBR/BVDV

[0124] Um adjuvante Quil A tem sido reportado causar uma resposta imune sistêmica, frequentemente acompanhada por uma febre transitória. Acredita-se que tal febre esteja associada com a queda de produção de leite em vacas lactantes. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos de lipossomas livre de saponina na resposta imune elicitados pelos lipossomas e efeitos colaterais potenciais causados pelos adjuvantes.

[0125] Bezerros masculinos Holstein de oito meses de idade foram usados para este estudo. Animais de teste potenciais foram sorologicamente selecionados e aqueles com títulos de neutralização de soro (SN) < 1:2 para BVDV-1 e BVDV-2 foram elegíveis para inscrição no estudo. Além disso, os animais não foram persistentemente infectados (PI) com BVDV como determinado por biópsia de punção de orelha e imunoistoquímica. Os animais foram alojados em ambiente controlado para temperatura e umidade e receberam ração comercial e água do sistema hídrico da cidade à vontade.

[0126] Aclimatação começou cerca de uma semana antes do dia 0 do estudo. Bezerros receberam DRAXXIN® e DECTOMAX® antes da remessa.

[0127] Animais de teste que se tornam moribundos, feridos, ou morreram devido às condições não relacionadas com a investigação foram excluídos do estudo e da análise de dados relevante. Animais moribundos foram eutanasiados.

[0128] Animais foram vacinados nos dias zero e 28 por administração subcutânea de 2 mL da vacina como resumido na Tabela 1. Tabela 1

[0129] No dia 49, os animais foram desafiados com vírus de Diarreia Viral Bovina Não Citopático Tipo 2 (Cepa 24515). Cada animal recebeu aproximadamente 4,88 Log10TID50 por dose em 5 mL administrados intranasalmente (2,5 mL por narina) usando um atomizador de gás comprimido.

[0130] Nos grupos T02-T06, o componente antigênico continha 4500 RUs/vírus pré-inativado modificado BVDV1/2 e IBR modificado (8,0 log10 TCID50).

[0131] Animais foram desafiados no dia 48 com 5 mL de cepa BVDV-2 24515 (4,88 log10TCID50 por dose) intranasalmente (2,5 mL por narina) usando um atomizador de gás comprimido.

[0132] Média quadrada mínima da temperatura retal e variações pós-primeira e segunda vacinações são mostradas na Tabela 2. Tabela 2 Valores com sobrescritos diferentes são significativamente diferentes (p<0,10)

[0133] As temperaturas retais para alguns pacientes T02 e T07 mostraram um aumento transiente no dia após a primeira e a segunda vacinação. O aumento nas temperaturas retais dos animais no grupo T02 foi significativamente mais alto (P < 0,10) do que nos outros grupos (T01, T03, T04, T05, T06 e T07) durante 1 dia após a primeira vacinação.

[0134] Após a primeira vacinação, quatro de 9 animais no grupo T02 tinha temperaturas maiores do que 39,7o C (103,5o F) (três tiveram temperaturas acima de 40o C (104,0o F)). Em contraste, nenhum animal no grupo T05 teve temperaturas acima de 39,1o C (102,5o F) um dia após a primeira vacinação (dados não mostrados).

[0135] Após da segunda vacinação o aumento em temperaturas retais de T02 e T07 foi significativamente maior (P < 0,10) do que os controles e vacinados (T03, T04, T05 e T06), entretanto, as temperaturas retais elevadas eram de vida curta (Tabela 2). As respostas individuais no grupo T02 variaram entre 38,38 e 40,27o C (101,1 e 104,5° F). Cinco de nove animais no grupo T02 tinha temperaturas acima de 39,7o C (103,5° F) (e outro animal tinha temperatura 39,7o C (103,5o F)) após a segunda vacinação. Apenas três de nove animais no grupo T02 tiveram uma temperatura abaixo de 39,7o C (103,5° F) um dia após a segunda vacinação. Em contraste, nenhuma das formulações DCRL induziu uma elevação de temperaturas retais maiores do que 39,8° C (103,7° F). Respostas individuais no grupo T05 variaram entre 38,5 e 39,2o C (101,4 e 102,6° F) (dados não mostrados).

[0136]Uma reação febril foi observada >40,27o C (> 104,5o F) em 8 de 8 animais no Grupo T01 pós-desafio; isto satisfez os critérios de resultado para um desafio bem-sucedido. As temperaturas retais de todos os grupos vacinados foram significativamente menores (P < 0,10) no dia 53 do estudo comparado com os controles (4 dias pós-desafio) e houve algumas diferenças nos dias subsequentes (dados não mostrados). No grupo de controle, em resposta ao desafio, uma elevação bifásica típica da temperatura retal foi observada.

[0137] A presença de doença de BVDV clínica (um animal tem que ter uma pontuação clínica de > 2) o pós-desafio foi determinado de acordo com o seguinte sistema de pontuação: 0 - sem sinais clínicos 1 - Sinais Clínicos como um todo não são específicos para infecção por BVD aguda. Os sinais clínicos podem incluir descarga nasal, respiração anormal e letargia brando. 2 - Sinais Clínicos como um todo são moderados em grau e específicos para infecção por BVD aguda. Os sinais clínicos podem incluir descarga nasal, respiração anormal, letargia, rigidez, a descarga ocular, a hipersalivação, a diarreia, desidratação, a manqueira e/ou a relutância a se mover. 3 - Sinais Clínicos como um todo são graves em grau e características para infecção por BVD aguda. Os sinais clínicos podem incluir descarga nasal, respiração anormal, letargia, rigidez, descarga ocular, hipersalivação, diarreia, contusão excessiva, desidratação, reclinação, manqueira e/ou relutância para e mover.

[0138] Não houve diferenças significativas entre o grupo de controle e os grupos vacinados.

Leucopenia

[0139]O resultado do estudo satisfez os critérios para um estudo válido como 100% de T01 (controles) tiveram leucopenia quando usando > 40% de queda e 75% dos controles tiveram <40/ μL. Não houve diferenças significantes entre o número de animais que desenvolveram leucopenia > 40% de diminuição de células brancas sanguíneas a partir de pós-desafio de fundo em T01 comparado com os grupos de tratamento vacinados T02, T03, T04, T05, T04 e T07 (P<0,10). Entretanto, a leucopenia clínica (< 4000 células^L) que é uma definição mais relevante foi detectada em 6 de 8 (75%), 2 de 9 (22,2%), 1 de 8 (12,5%), 3 de 9 (33,3%), 4 de 9 (44,4%), 4 de 9 (44,4%), e 0 de 6 em T01, T02, T03, T04, T05, T06 e T07, respectivamente (Tabela 3). A duração da leucopenia foi significativamente mais longa (P<0,10) no grupo T01 quando usando > 40% de queda comparado aos vacinados e significativamente mais longa (P<0,10) quando usando <4000 μL comparado aos grupos vacinados T02, T03, T05, T06 e T07 (Tabela 4). Tabela 3 Resumo da Fase de Desafio de Leucopenia Tabela 4, Duração da Leucopenia

Valores com diferentes sobrescritos são significativamente diferentes (p<0,10) Viremia

[0140] Todas as vacinas experimentais protegeram contra viremia. Em alguns grupos houve proteção completa (T02 & T05 ambos contendo CpG) e em outros parciais (T03, T04, T06 e T07). O número de animais virêmicos em T01 foi significativamente mais alto do que o número em T02, T03, T04, T05, T06 e T07 (P < 0,10) (Tabela 5). Nenhuma viremia foi vista nos grupos T02 e T05. Entretanto, houve uma diferença entre o número de animais virêmicos nos grupos T03, T04, e T06 que não continham ORN, baixa dose de ORN e alta dose de ORN quando comparado aos controles. Tabela 5. Resumo da Fase de Desafio de Isolamento Viral Valores com diferentes sobrescritos são significativamente diferentes (p<0,10)

[0141]A duração da viremia para o grupo T01 foi significativamente maior do que todos os grupos vacinados (T02 até T07) (P < 0,1) (Tabela 6). Bezerros em T07 receberam uma vacina contendo um Quil A contendo adjuvante + antígeno gp53 recombinante do vírus BVDV-1 e também foram parcialmente protegidos e tiveram uma duração significativamente mais curta de viremia comparada com T01. Para estes bezerros o desafio foi com um biotipo diferente de vírus BVDV (tipo 2) que reflete que houve uma proteção cruzada parcial entre o antígeno gp53 BVDV-1 e a cepa do desafio. Tabela 6. Dias com disseminação positiva de virus

Valores com sobrescritos diferentes são significativamente diferentes (p<0,10) Títulos de SN

[0142] No Dia 49, antes do desafio todos os animais de grupo T02 a T07 tinham um título SN para BVDV-1, BVDV-2 e somente T02 a T06 tiveram anticorpos para o antígeno IBR de > 1:8. Todas as vacinas foram consideradas terem potência adequada à medida que satisfizeram o requisito de > 1:8. As médias quadradas mínimas após a primeira e a segunda vacinação de títulos SN para BVDV-1 e 2 (Dia 28 e 49) são mostradas na Tabela 7. Todos os animais vacinados tiveram títulos SN significativamente mais altos do que o grupo controle e houve diferenças significativas entre títulos SN dos grupos vacinados. As vacinas lipossomais (T03 a T06) induziram títulos SN significativamente mais baixos para BVDV-1 e 2 que a vacina com adjuvante com uma composição contendo Quil A (T02). Adição de ORNS ou CpG para essas formulações não aumentou estas respostas. A vacina gp53 adjuvante com uma composição contendo Quil A também induziu títulos SN elevados pelo dia 49 ao antígeno BVDV-1 mas inferior ao antígeno BVDV-2. Os títulos SN BVDV- do grupo T07 não foram significativamente diferentes dos títulos de T02, mas os títulos de BVDV-2 foram. Após o desafio BVDV-2, os títulos de SN de todos os grupos vacinados foram desafiados enquanto que os bezerros do grupo T01 desenvolveram respostas de anticorpos primários (dia 63). Tabela 7. Média quadrada mínima do Título SN BVDV-1a e BVDV2 Valores com sobrescritos diferentes são significativamente diferentes (p<0,10) Tabela 8. Média Quadrada Mínima do Título SN IBR

Valores com diferentes sobrescritos são significativamente diferentes (p<0,10) Reações no Local de Injeção

[0143]Média quadrada mínima significa sítios de reações de injeção (ISR) para ambos, o pescoço esquerdo e direito são mostrados nas Tabelas 9 e 10. No Dia 1, pequenas reações ocorreram em todos os seis grupos de vacinação, mas retrocederam. Os maiores sítios de reação ocorreram em T02 e T07 no dia 29, 41,8 e 16,3, respectivamente. Houve diferenças significativas entre os sítios de reações de injeção em certos dias. Todas as vacinas foram seguras como reações de sítio de injeção resolveram rapidamente. Tabela 9. Média quadrada mínima para sítios de reações de injeção (Pescoço Esquerdo) Valores com diferentes sobrescritos são significativamente diferentes (p<0,10) Tabela 10. Médias Quadradas Mínimas para Sítios de Reações de Injeção (Pescoço Direito)

Valores com diferentes sobrescritos são significativamente diferentes (p<0,10) Imunidade Mediada por Células

[0144] O ensaio ELISPOT BVDV IFN gama teve um alto background no grupo T01 antes do desafio e assim, é considerado não confiável para demonstração de indução de respostas de CMI por essas vacinas para este antígeno (dados não mostrados). Entretanto, os ensaios para os antígenos de IBR foram refletivos de indução de uma CMI pelas respectivas vacinas (ver Tabelas 11-13, respostas para o antígeno IBR inativo, o peptídeo IBR gB e gD reitera as respostas de T02 a T06). Em geral, as respostas mais altas estavam no grupo de vacina T02 e grupo T05 que tinham CpG na formulação. Respostas pós-desafio não foram aumentadas à medida que o desafio foi um desafio de vírus BVDV. Presumivelmente, respostas de CMI similares foram induzidas pelas vacinas ao antígeno BVDV. Tabela 11 Valores com diferentes sobrescritos são significativamente diferentes (p<0,10) Tabela 12 Valores com diferentes sobrescritos são significativamente diferentes (p<0,10) Tabela 13 Valores com diferentes sobrescritos são significativamente diferentes (p<0,10)

[0145]Um efeito de vacina foi observado no desenvolvimento e duração da viremia. Todas as vacinas experimentais protegidas contra viremia. Proteção completa foi observada em alguns grupos (T02 & T05 contendo CpG) enquanto uma proteção parcial foi observada nos outros grupos (T03, T04, T06 e T07). Os perfis de temperatura retal mostraram um aumento transiente um dia após a primeira e a segunda vacinação para os grupos de tratamento T02 e T07 comparados com controles T01. Vacinas lipossomais induziram elevações inferiores em temperatura retal comparadas com T02 e T07 que continham adjuvante Quil A. Este adjuvante contendo Quil A tipicamente induz uma elevação de dia único de temperatura imediatamente após a vacinação. O último é particularmente importante para vacas leiteiras porque a febre que acompanha a vacinação frequentemente resulta em uma queda inaceitável de rendimento de leite. Formulações lipossomais induzidas com anticorpo robusto bem como respostas de células T (mesmo lipossomas sem imunomoduladores adicionais). As vacinas lipossomais induziram títulos de SN significativamente menores para o antígeno BVDV-1 e 2 e IBR em comparação com as vacinas contendo Quil A, embora os níveis alcançados foram considerados na faixa protetora para essas respectivas doenças (títulos SN BVDV-1 de 1: 256-512; BVDV- 2 ± 256 ou maior; IBR SN título de 1:32).

[0146]Em conclusão, as formulações lipossomais oferecem uma opção segura e nova para a distribuição de antígenos inativados para doenças que requerem não somente anticorpo, mas CMI, bem como, proteção. As formulações foram comparáveis às vacinas contendo Quil-A na eficácia. O efeito de CpG na eficácia foi reproduzível, entretanto, o ORN não foi eficaz na melhoria da imunidade contra o desafio de BVDV.

Exemplo 4 - Vírus de Influenza Suína

[0147] O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta imune e a eficácia de várias vacinas SIV (Killed Virus, pH1N1 & H3N2) contendo novas formulações adjuvantes e imunomoduladores. Eficácia foi determinada por ambos os parâmetros imunológicos (humoral e celular) e por pontos finais de eficácia incluindo sinais clínicos, viremia, eliminação viral e lesões pulmonares.

Animais

[0148]3 Porcos de três semanas de idade (21 +/- 3 dias) de ambos os sexos foram usados para este estudo. Animais não tiveram história de exposição a PRRSV, Mycoplasma hyopneumoniae. Animais ou seus reservatórios não tiveram história de vacinação contra ou exposição a qualquer sorotipo SIV. Os animais chegaram no local quatro a sete dias antes da vacinação e foram alimentados com ração padrão com água livremente.

[0149]Os porcos foram vacinados com composições da Tabela 14 nos dias zero (pescoço esquerdo) e 21 (pescoço direito) e desafiados com o vírus H3N2 IN/12 no dia 35. Tabe a 14. Definições Experimentais *4% de subsolução a base de esqualeno diluída 10x para o produto final (0,4% de óleo)

[0150]Soro sanguíneo foi coletado para análise de inibição de hemaglutinação (HAI) nos dias 35 e 40, e o sangue total coletado para análise ELISPOT (IFNy) nos dias 28, 35 e 40. Os porcos foram sacrificados no dia 40 (5 dias pós-desafio) e a percentagem de consolidação para cada lóbulo (esquerdo craniano, esquerdo médio, caudal esquerdo, craniano direito, direito médio, caudal direito e acessório) foram pontuados e registrados como uma porcentagem entre 0 e 100%.

[0151] Nenhuma das vacinas resultou em efeitos colaterais sistêmicos ou reações secundárias de injeção inaceitáveis (dados não mostrados).

[0152]Os títulos de HAI são mostrados na Tabela 15. Tabela 15. Títulos HI (Dia 35 Pré-desafio, Dia 40 pós-desafio) aValores com sobrescritos diferentes são significativamente diferentes a partir de T01 (p^0,10); Teste T não pareado com correção de Welch (GraphPad Prisma, Ver. 6.04). nd, não detectável; na, não aplicável. Tabela 16. Resumo de pontuações de lesão de pulmão (Dia 40) aValores com sobrescritos diferentes são significativamente diferentes a partir de T01 (p^0,10); Teste T não pareado com correção de Welch (GraphPad Prisma, Ver. 6.04). NTX é um grupo de porcos não vacinados, não desafiados.

[0153] O grupo T04 teve o título HAI mais alto para uma das cepas de vacina (H1N1), enquanto T07 teve o título mais alto para a outra cepa (H3H2), mesmo que os títulos nos grupos T02-T08 fossem significativamente mais altos que no grupo controle T01.

[0154] Todas as vacinas (exceto T08) tendam a reduzir LLS em 5 dias pós- desafio. O grupo T06 (TXO) tendeu a ter as contagens de lesões pulmonares mais baixas.

[0155]Células secretoras de IFN-gama específicas de peptídeo de proteína NP de Influenza e células secretoras de IFN-gama específicas de vírus de Influenza total (ambas determinadas por ELISPOT) são providas nas Tabelas 19 e 20, respectivamente. Os peptídeos nos grupos são 16-mers com uma sobreposição de 12 aminoácidos. Os quatro grupos contêm sequência de peptídeo NP a partir do N- terminal (Grupo1) para C-terminal (Grupo 4). As sequências dos peptídeos são providas nas tabelas 17 e 18. Tabela 17. Grupos de peptídeos NP usados para ELISPOT IFN- Y (grupos 1 e 2) Tabela 18. Grupos de peptídeo NP usados para ELISPOT IFN- Y (grupos 3 e 4) Tabela 19. Grupos de peptídeo NP ELISPOT IFN- y (Dia 40) aValores com sobrescritos diferentes são significativamente diferentes a partir de T01 (p^0,10); Teste T não pareado com correção de Welch (GraphPad Prisma, Ver. 6.04).

[0156]A proteína de NP é geralmente altamente conservada entre cepas SIV, e, portanto, uma eficiente resposta CMI provavelmente traduz em melhor potencial de proteção cruzada. Tabela 20. Antígeno viral de memória IFN-Y ELISPOT (Dia 40) aValores com sobrescritos diferentes são significativamente diferentes a partir de T01 (p^0,10); Teste T não pareado com correção de Welch (GraphPad Prisma, Ver. 6.04).

[0157] Lipossomas de Grupo T07 (DCRL)) forneceu as respostas de IFN gama mais altas a três de quatro grupos de peptídeos de proteína NP e dois dos três vírus inteiros testados. O único grupo com pós-vacinação observada (pré-desafio) a resposta de IFN-y foi T06 (TXO) (dados não mostrados).

[0158] Adição de agonista de CD40 e CpG uniformemente tendeu a diminuir os títulos, bem como para aumentar LLS, especialmente no contexto da formulação lipossomal.

[0159] Tomado como um todo, estes resultados indicam que a vacina mais adjuvante com os lipossomas DCRL é tão eficaz como formulação T02 (formulação experimental similar a uma vacina comercial) para reduzir pontuações de lesões pulmonares. Ao mesmo tempo, os lipossomas DCRL são muito mais efetivos na ativação da resposta CMI do que as outras vacinas testadas, assim possivelmente provendo um potencial de proteção cruzada mais amplo e maior duração de imunidade do que o produto comercial.

Exemplo 5. Desenvolvimento de Imunidade a Eimeria máxima seguindo vacinação com profilina

[0160] Objetivo do estudo foi avaliar os efeitos de vários adjuvantes (proprietário Zoetis) no desenvolvimento de imunidade a Eimeria máxima seguindo vacinação com profilina.

[0161] Frangos recém-incubados foram adquiridos da incubadora Longenecker, Elizabethtown, PA. Frangos foram providos com alimento e água livremente. As aves foram mantidas em criadeiras em instalações livres de Eimeria e transferidas em grandes gaiolas penduradas em um local separado onde elas foram infectadas e mantidas até o final do período experimental.

[0162] Profilina purificada (50 μg/dose) foi misturada com diferentes adjuvantes como provido na Tabela 21. Tabela 21

[0163]As aves foram imunizadas com duas injeções subcutâneas (0,5 mL por dose) de profilina mais adjuvante no dia 1 e dia 7 de idade subsequentemente. Sete dias após a segunda imunização (14 dias de idade), aves (exceto no grupo T01) foram desafiadas com 1 x 104 oocistos esporulados de Eimeria maxima.

[0164] Ganho de peso corporal foi determinado no dia 6 e dia 15 após o desafio. Oocistos eliminados nas fezes do dia 6-9 seguindo o desafio foram também determinados. Anticorpos séricos contra profilina foram avaliados por ELISA.

[0165] Grupos de controle: injeções de PBS e nenhum desafio (controle não- vacinado não-desafiado), injeções de PBS e desafio no dia 14 (controle não-vacinado não-desafiado), profilina/nenhum adjuvante e desafio no dia 14 (controle de antígeno).

[0166] Para avaliar as pontuações de lesões, seis aves/grupo foram mortos 6 dias pós-desafio. Aproximadamente 20 cm de segmentos intestinais que se estendem em 10 cm anterior e posterior ao divertículo foram obtidos e cortados longitudinalmente. Os conteúdos intestinais foram removidos suavemente. Uma pontuação variando de 0-4 foi dada dependendo da severidade de lesões.

[0167] Para avaliar a produção de oocistos fecais, fezes de cada grupo (8 aves/grupo; 4 gaiolas com 2 aves/gaiola) foram coletadas separadamente de 6 a 9 dias pós-desafio. Partindo de 6 dias pós-desafio, as gaiolas de coleta foram estabelecidas e os cuidadores de animais foram instruídos a não limpar as fezes. Os gotejamentos fecais foram coletados a partir de cada gaiola coletando oocisto que contém 2 aves por gaiola. Os recipientes coletores foram colocados sob cada gaiola por 3 dias iniciando a partir de 6 dias pi, e material fecal foi coletado em jarras de plástico grandes. Os gotejamentos fecais em cada jarro foram moídos em um misturador com água, e duas amostras aleatórias de 35 mL foram tomadas a partir de cada amostra. A fim de contar os oocistos de coccídea, várias diluições foram feitas inicialmente para determinar as diluições ótimas para enumeração de oocistos para cada amostra. Oocistos foram contados microscopicamente O número total de oocistos eliminados por frango foi calculado utilizando a fórmula: total de oocistos/ave = (contagem de oocisto x fator de diluição x volume de amostra fecal/volume da câmara de contagem) / número de aves por gaiola.

[0168] Amostras de sangue (4 aves/grupo) foram coletadas no dia 9 após o desafio de Eimeria para medidas de resposta de anticorpos. Amostras de sangue foram deixadas coagular a 4° C por 4 horas, e os soros separados. As amostras de soro foram testadas quanto a anticorpos contra Eimeria usando ELISA. Brevemente, placas de microtitulação foram revestidas durante a noite com 200 ng/poço do antígeno coccidial recombinante, lavado com PBS-0,05% de Tween, e bloqueado com PBS-1% de BSA. Diluições de soro foram adicionadas, incubado com agitação suave contínua, lavado, e Ab ligado detectado com IgG anti-frango de coelho conjugado com peroxidase (Sigma) e substrato específico com peroxidase. A densidade ótica (OD) foi medida a 450 nm com um leitor de microplaca (Bio-Rad, Richmond, CA).

[0169]Todos os valores são expressos como média ± SEM. Diferenças entre as médias foram consideradas significativas em p < 0,05.

[0170]O controle negativo e controle de desafio foram significativamente diferentes em 6 dias, mas não quinze dias após a infecção. Perda de peso no dia 6 pós-desafio em controles de desafio como comparado a controles negativos foi de cerca de 15%. Nenhum tratamento diferiu de nenhum controle adjuvante ou de desafio, mas tratamentos T05, T06, e T08 não diferiram do controle negativo também.

[0171] Logo abaixo de 60% das aves tinham contagens de lesões de 2 ou mais. Nenhuma formulação foi significativamente diferente do controle de desafio. O grupo T09 foi o com desempenho mais fraco. T04 foi o de melhor desempenho.

[0172] De um modo geral, uma diminuição de < 1 log em saída não é considerada biologicamente relevante, mas pode ainda ser indicativa de imunidade ativa. Somente formulações que foram significativamente menores do que o controle de desafio foram T05 e T09.

[0173] A resposta de anticorpos não é geralmente considerada relevante para a imunidade à coccidiose, de modo a não se correlacionar a outros critérios. Nas experiências acima, grupo T07 elicitou resposta de anticorpo que foi mais alta do que as respostas causadas por aves negativas (aves não-vacinadas, não-infectadas), o controle positivo (aves infectadas não-vacinadas), ou as aves vacinadas com o antígeno somente. Grupos T05, T06 e T08-T10 eliciaram respostas de anticorpos mais altas do que o controle negativo (aves não-vacinadas, não-infectadas).

[0174] Os resultados são resumidos na Tabela 22. Ganho de peso, níveis de anticorpos séricos (expressos como uma % de controle não infectado) e contagens de lesões, produção de oocisto (expressa como % de controle infectado) após a imunização de aves com duas injeções subcutâneas de profilina mais vários adjuvantes no dia 1 e dia 7 de idade e subsequente desafio com 1 X 104 oocistos de Eimeria maxima em 14 dias de idade. Tabela 22

Exemplo 6 - Vacina BVDV/IBR mais adjuvante com DCRL + CpG

[0175]Neste exemplo, potencial adjuvante de lipossomas DCRL com CpG (sem ORN) foi avaliado. Em adição, métodos diferentes de carregamento de lipossomas foram comparados.

[0176]A organização experimen tal foi como segue (Tabela 21):

[0177] Vacinas em grupos T03-T06 também continham mBVD1 (4.500 RU/ds) + BVDV1 (4500 RUs), BVDV 2 (4500 RUs), mlBR 108log10 TCID50 (dose de pré- inativação).

[0178] Bezerros Holstein saudáveis (6-7 meses de idade, soronegativos para BVDV1, BVDV2 e IBR) foram admitidos neste estudo (n = 9/grupo de tratamento). Foram administrados 2 mL da vacina subcutaneamente aos bezerros nos Dias 0 e 28. Um desafio BVDV2 virulento (4 mL (5,14 Log10TCID50 por dose) intranasalmente) foi administrado no Dia 49. Observações clínicas foram realizadas e os sítios de injeção e as temperaturas retais foram medidas em torno de cada vacinação. Amostras de sangue foram coletadas para contagens de células brancas sanguíneas, viremia e sorologia através do Dia 63.

[0179] Todos os bezerros em T02, T03, T04 e T06 alcançaram títulos 1:8 contra BVDV-1a e BVDV2 antes do desafio, em comparação com 22,1 e 11,1% dos bezerros em T05. Acredita-se que, devido ao carregamento ativo usado em T5, a maioria do antígeno foi removida da preparação de vacina. Como tal, os animais no grupo T05 receberam menos antígeno do que os animais nos grupos T03, T04 e T06. Portanto, a interpretação das descobertas do grupo T05 deve ser interpretada cuidadosamente.

[0180]Isto sendo dito, os títulos de BVDV-1a e BVDV2 para T05 foram significativamente menores do que os outros grupos vacinados nos Dias 28, 49 e 63. Nenhum bezerro em T02 ou T05 alcançou títulos 1:8 contra BHV antes do desafio, e estes grupos também tiveram títulos significativamente mais baixos comparados com os outros grupos vacinados nos Dias 28, 49 e 63. A Média Quadrada Mínima para gp53-1 SFC foi significativamente maior para T02 comparada a todos os outros grupos de tratamento nos Dias 0, 35 e 56, e a Média Quadrada Mínima para SFC gp53-2 foi significativamente mais alta para T02 nos Dias 35 e 56.

[0181] Viremia foi observada em todos os bezerros em T01 e T05. Nenhum bezerro em T02 desenvolveu viremia seguindo o desafio. Nos grupos T03, T04 e T06, 22,2, 33,3 e 33,3% dos bezerros desenvolveram viremia; estes grupos não foram significativamente diferentes de T02. A duração da viremia foi significativamente mais longa em T01 e T05 comparada a todos outros grupos de tratamento. Quando a leucopenia foi determinada por uma redução de 40% em CBS da linha de base, 22,2% dos bezerros em T02 foram leucopênicas após o desafio, enquanto todos os bezerros em todos os grupos foram leucopênicos. Os bezerros em T01 e T05 tiveram uma duração significativamente mais longa de leucopenia comparada a todos os outros grupos (8,6 dias, zero dias, 0,2 dias, 0,7 dias, 6,7 dias, e 0,8 dias para grupos T01- T06, respectivamente). Somente sinais suaves de doença clínica foram observados seguindo o desafio neste estudo. No grupo de controle T01, 22,2% dos bezerros tiveram pontuações clínicas de > 2 após o desafio, enquanto que 11,1 % dos bezerros em T05 tiveram pontuações clínicas de > 2 após o desafio. Nenhum bezerro em qualquer outro grupo de tratamento tinha pontuações clínicas de > 2 após o desafio.

[0182] Febres transitórias foram observadas em T02 nos Dias 1 e 29. As temperaturas de todos os outros bezerros foram normais por todo o estudo. Tabela 22. Média Quadrada Mínima para Temperatura Retal para Fase de Vacinação, oC (oF) Valores com diferentes sobrescritos são significativamente diferentes (p<0,10). Tabela 23. Média Quadrada Mínima para Temperatura Retal para Fase de Vacinação, oC (oF) Valores com diferentes sobrescritos são significativamente diferentes (p<0,10).

[0183]Análise de animais individuais revelou que no grupo T02 (adjuvante com um adjuvante contendo Quil A), quatro animais tinham temperatura acima de 39,7o C (103, 5° F) após a primeira injeção e dois animais tinham temperatura acima de 39,7o C (103, 5° F) após a segunda injeção. Em adição, um animal tinha uma temperatura de 39,5o C (103,2° F) no dia 1 (um dia após a primeira vacinação) e cinco tiveram temperaturas na variação de 39,4o C (103,0o F) - 39,6o C (103,4o F) no dia 29 (um dia após a segunda vacinação). Em contraste, nenhum dos animais vacinados com os adjuvantes sem de Quil A tiveram temperaturas acima de 39,7o C (103,5o F) ou após a primeira vacinação ou após a segunda vacinação. Dois tiveram temperaturas na variação de 39,4o C (103,0o F) - 39,6o C (103,4o F).

[0184] Nenhuma reação no sítio de injeção > 200 cm3 foi observada neste estudo. Grupo T02 (adjuvante com um adjuvante contendo Quil A) teve reações de sítio de injeção significativamente maiores nos Dias 2, 7 e 29 comparados a todos os outros grupos de tratamento. As reações de sítio de injeção mensuráveis ainda estavam presentes no Dia 49 em T02 (segunda injeção) e T06 (primeira injeção). Tabela 24. Média Quadrada Mínima para Reações do Sítio de Injeção seguindo a Primeira Vacinação (cm3) Valores com diferentes sobrescritos são significativamente diferentes (p<0,10). Tabela 25. Média Quadrada Mínima para Reações do Sítio de Injeção seguindo a Segunda Vacinação (cm3) Valores com diferentes sobrescritos são significativamente diferentes (p<0,10).

[0185]Em resumo, os candidatos de vacina T02, T03, T04 e T06 satisfizeram os critérios de resultado para prover títulos BVDV2 > 1:8 em todos os bezerros. O candidato de vacina T02 também proveu uma proteção de 100% contra a viremia e proteção completa contra leucopenia (conforme medido por redução de 40% em CBS). Bezerros neste grupo experimentaram febre transitória e as reações de sítio de injeção.

[0186] Todas as publicações citadas na especificação, ambas, publicações de patente e publicações de não-patente, são indicativas do nível de habilidade daqueles versados na técnica à qual esta invenção pertence. Todas estas publicações são aqui totalmente incorporadas por referência na mesma extensão como se cada publicação individual fosse especificamente e individualmente indicada como sendo incorporada por referência.

[0187] Embora a invenção tenha sido descrita com referência a modalidades particulares, deve ser entendido que estas modalidades são meramente ilustrativas dos princípios e aplicações da presente invenção. Portanto, deve ser entendido que numerosas modificações podem ser feitas nas modalidades ilustrativas e que outras disposições podem ser desenvolvidas sem se sair do espírito e objetivo da presente invenção como definido pelas seguintes reivindicações.

Claims (21)

1. Lipossoma livre de saponina CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma membrana de bicamada lipídica externa e um compartimento interno, a membrana externa compreendendo: a) brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA); b) colesterol; c) lecitina; e d)N-(2-De0xi-2-L-leucilamino-β-D-glicopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida ou um sal do mesmo.

2. Lipossoma, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda, no compartimento interno, um oligonucleotídeo imunoestimulador selecionado a partir do grupo consistindo em um ribonucleotídeo imunoestimulante, um CpG oligodeoxirribonucleotídeo, e uma combinação dos mesmos.

3. Lipossoma, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido oligonucleotídeo imunoestimulador compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 14.

4. Formulação adjuvante CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o lipossoma como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Formulação adjuvante, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida formulação adjuvante é livre de saponina.

6. Composição de vacina CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de um componente antigênico e a formulação adjuvante como definida na reivindicação 4 ou 5.

7. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida composição de vacina é livre de saponina.

8. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o componente antigênico está dentro do compartimento interno.

9. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o componente antigênico é selecionado a partir do grupo consistindo em antígenos bovinos, antígenos caprinos, antígenos suínos, antígenos de aves, antígenos equinos, antígenos caninos, antígenos equinos e antígenos de felinos.

10. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o oligonucleotídeo imunoestimulador compreende um CpG oligodeoxirribonucleotídeo.

11. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o componente antigênico compreende IBR, BVDV-1 e BVDV-2, e em que a composição de vacina é livre de saponina.

12. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o antígeno compreende um antígeno de ave.

13. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que o antígeno é profilina.

14. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o componente antigênico compreende um vírus ssRNA, e em que a composição de vacina é substancialmente livre de CpG oligodeoxirribonucleotídeo.

15. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que o vírus ssRNA é um vírus Influenza.

16. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADA pelo fato de que o vírus Influenza é um vírus Influenza Suíno inativado (SIV).

17. Uso de um componente antigênico e da formulação adjuvante como definida na reivindicação 4 ou 5, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de uma composição de vacina para induzir uma resposta imune contra BVDV em um bovino, em que a referida composição de vacina é livre de saponina, e em que o componente antigênico compreende IBR, BVDV-1 e BVDV-2.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida resposta imune é induzida sem uma febre associada.

19. Uso de um componente antigênico e da formulação adjuvante como definida na reivindicação 4 ou 5, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de uma composição de vacina para prevenir a eliminação de oocistos de Eimeria em um animal ave infectado com Eimeria, em que a composição de vacina é formulada para ser administrada antes da referida infecção.

20. Método para preparar o lipossoma como definido na reivindicação 1, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) dissolver em um solvente orgânico brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA), colesterol, lecitina e N-(2-De0xi-2-L-leucilamino-β-D-glicopiranosil)-N- octadecildodecanoilamida ou um sal do mesmo; b) remover o solvente orgânico e formar um filme; c) reidratar o filme em um solvente aquoso formando, assim, uma composição reidratada; d) microfluidizar a composição reidratada.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o solvente aquoso compreende um oligonucleotídeo imunoestimulador.