BR112012033751B1 - Composição de vacina e processo para produzir a composição de vacina - Google Patents
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Abstract
composição de vacina, célula, adjuvante, método de vacinar um paciente contra e. canis e processos para produzir a composição de vacina e o antígeno de e. canis. vacina e/ou composições imunogênicas que compreendem uma quantidade de imunização efetiva de um antígeno de e. canis são descritos. além disso, os métodos de imunização ao paciente contra e. canis fornecendo uma vacina e/ou composições imunogênicas também são divulgadas.
Description
[0001] Este pedido reivindica a prioridade da 35 U.S.C. £ 119(e) do pedido condicional US série N° 61/360,969 depositado em 2 de julho de 2010 cujos conteúdos são deste modo incorporados por referência em sua totalidade.
[0002] A presente invenção diz repeito às composições imunogênicas e as vacinas contra Ehrlichiose Monocítica Canina (CME) causada pela bactéria Ehrlichia canis e métodos associados.
[0003] Ehrlichiose Monocítica Canina (CME) é uma doença rickettsial grave em cães causada pela bactéria Ehrlichia canis (E. canis). E. canis é disseminada de cão a cão por intermédio de um Carrapato canino marrom (Rhipicephalus sanguineus). Seguindo um período de incubação de 2 a 3 semanas pós-infecção, cães podem progredir através das fases crônicas, subclínicas e agudas da doença. Na fase aguda, faixa de sinal clínica a partir da trombocitopenia branda e grave, leucopenia, anemia, letargia e perda de peso. Após dois meses, mais cães entrarão de uma fase subclínica permanecem meses ou anos, durante o qual os valores sanguíneos baixos podem persistir, mas os sinais clínicos são mínimos. Uma porcentagem menor de cães infectados pode desenvolver uma forma grave da doença conhecida como pancitopenia canina tropical (TCP). A depressão de medula óssea persistente, hemorragias, perturbações neurológicas, edema periférico e perda de peso grave são características de TCP. O choque hipotensivo pode desenvolver, levando a morte. Apesar dos relatórios das composições imunogênicas contra E. canis [ver, por exemplo, Mahan et al., Onderstepoort J. Vet. Res. 72(2): 119-128 (2005); U.S. 2006/0188524A1] antes, não houve demonstração de uma vacina efetiva contra E. canis. Portanto, existe uma necessidade para as vacinas que protegem contra CME e/ou TCP.
[0004] A citação de qualquer referência neste não deve ser construída como uma admissão que tal referência é disponível como "técnica anterior" à aplicação presente.
[0005] A presente invenção fornece as vacinas e/ou composições imunogênicas para promover uma resposta imune protetora contra uma causa de ehrlichiose. Em certas formas de realização, uma composição de vacina e/ou uma composição imunogênica compreende um agente que quando administrado como uma vacina primária em um paciente evoca a resposta imune humoral mínima, se houver, no paciente. Nas formas de realização particulares, a composição imunogênica compreende um agente que quando administrado como uma vacina primária resposta imune humoral mínima, se houver, no paciente, mas ainda evoca uma resposta imune protetora. Uma tal forma de realização é uma vacina que compreende um E. canis inativado desenvolvido em uma linhagem celular de medula óssea de cães. Nas formas de realização particulares deste tipo, a vacina ainda pode compreender um adjuvante. Em certas formas de realização deste tipo, o adjuvante é fator cord. Nas formas de realização mais particulares, um adjuvante de fator cord é dissolvido em um sistema de solvente de clorofórmio.
[0006] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma composição de vacina e/ou uma composição imunogênica que compreende um antígeno de E. canis que em uma administração inicial em um paciente (por exemplo, como uma vacina primária) não evoca a produção de anticorpo significante contra o antígeno. Consequentemente, certas formas de realização da presente invenção incluem as composições imunogênicas e/ou composição de vacinas que compreendem uma quantidade de imunização efetiva de antígeno de E. canis em que uma administração inicial/vacina primária da composição em um paciente evoca uma resposta humoral mínima. Nas formas de realização particulares a presente invenção fornece uma composição imunogênica e/ou vacina que após a administração inicial/vacinação primária não evoca uma resposta humoral mensurável, enquanto evocar uma resposta imune protetora em um paciente. Em certas formas de realização a vacina e/ou composição imunogênica da presente invenção em uma vacinação primária/administração inicial evoca uma resposta imune celular, enquanto evoca uma resposta humoral mínima e/ou não mensurável (por exemplo, não detectável).
[0007] Portanto em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece uma composição de vacina que compreende uma quantidade de imunização efetiva de um antígeno de E. canis. Em certas formas de realização deste tipo, o antígeno evoca uma resposta imune protetora, mas evoca uma resposta humoral mínima em um paciente quando a vacina é administrada como uma vacina primária. As vacinas e/ou composições imunogênicas da presente invenção podem compreender um antígeno que é gerado do desenvolvimento E. canis e/ou passado em uma célula como divulgado neste. Em certas formas de realização, o E. canis é desenvolvido e/ou passado em uma linhagem celular canina. Nas formas de realização mais particulares a linhagem celular pode ser uma linhagem celular de medula óssea de cães. Nas formas de realização mais particulares a célula tem o número de acesso ATCC N°. PTA-10545 e/ou um tendo um ou mais e/ou todas das características de identificação da célula que tem número de acesso ATCC N°. PTA-10545. Em uma forma de realização particular, o antígeno E. canis é uma E. canis associada a uma célula, com o número de acesso ATCC N°. PTA-10546 e/ou um tendo um ou mais e/ou todas das características de identificação da E. canis associada a célula que tem o número de acesso ATCC N°. PTA-10546.
[0008] A presente invenção ainda fornece uma E. canis associada a célula que tem o número de acesso ATCC N°. PTA-10546. A presente invenção também fornece uma E.canis associada a célula que tem um ou mais e/ou todas das características de identificação da E. canis associada a célula que tem o número de acesso ATCC N°. PTA-10546. Além disso, a presente invenção fornece uma célula que tem o número de acesso ATCC N°. PTA- 10545. A presente invenção ainda fornece uma célula que tem um ou mais e/ou todas das características de identificação da célula que tem o número de acesso ATCC N°. PTA-10545.
[0009] Além disso, os antígenos de E. canis das vacinas e/ou composições imunogênicas da presente invenção podem ser inativadas. Em certas formas de realização o antígeno E. canis inativado é inativado com formalina.
[00010] Em outro aspecto, a presente invenção fornece vacinas e/ou composições imunogênicas que compreendem um adjuvante. Em certas formas de realização deste tipo, o adjuvante é um adjuvante lipofílico. Em certas formas de realização, o adjuvante lipofílico está dentro de um solvente não polar. Nas formas de realização particulares uma composição imunogênica e/ou vacina da presente invenção compreende um antígeno que pode ser combinado com um adjuvante hidrofóbico e é feito miscível com um sistema de solvente polar compreendido pela vacina e/ou uma composição imunogênica. Nas formas de realização mais particulares o adjuvante compreende um Fator cord tal como uma trealose 6,6‘-dimicolato. Nas formas de realização particulares, trealose 6,6‘-dimicolato está dentro de um solvente não polar. Nas formas de realização mais particulares o adjuvante compreende trealose 6,6‘-dimicolato dissolvido em um sistema de solvente de clorofórmio. Nas formas de realização particulares o sistema de solvente de clorofórmio compreende cerca de 65 a 95% de volume de clorofórmio/volume. Nas formas de realização mais particulares o sistema de solvente de clorofórmio compreende cerca de 80 a 95% de volume de clorofórmio/volume. Nas formas de realização particulares o sistema de solvente de clorofórmio compreende cerca de 5,0 a 30% de volume de metanol/volume. Nas formas de realização mais particulares o sistema de solvente de clorofórmio compreende cerca de 7,5 a 15% de volume de metanol/volume. Nas formas de realização particulares o sistema de solvente de clorofórmio compreende cerca de 0,5 a 5,0% de volume de água/volume. Nas formas de realização mais particulares o sistema de solvente de clorofórmio compreende cerca de 0,75 a 2,5% de volume de água/volume. Em certas formas de realização, o sistema de solvente de clorofórmio compreende cerca de 90% de clorofórmio: 10% de metanol: 1,0% de volume de água a volume, respectivamente. Nas formas de realização particulares a vacina e/ou composição imunogênica compreende uma célula inativada por formalina associada ao E. canis desenvolvido nas células depositadas tendo o número de acesso ATCC N°. PTA-10545 e um adjuvante compreende trealose 6,6-dimicolato dissolvido em 90:10:1 clorofórmio:metanol:água. Uma composição compreende um Fator cord, tal como trealose 6,6‘-dimicolato, dissolvido em um sistema de solvente de clorofórmio também é parte da presente invenção, como é o uso como um adjuvante.
[00011] Além disso, a presente invenção fornece desenvolvimento da bactéria de E. canis nas células e/ou linhas celulares que são particularmente adequados para seu desenvolvimento. A presente invenção ainda fornece os processos para a produção de um antígeno para uma vacina e/ou composição imunogênica da presente invenção. Deste modo, a presente invenção fornece processos para a produção de antígenos de E. canis. Nas formas de realização particulares o E. canis é desenvolvido em um macrófago. Em certas formas de realização a bactéria E. canis são desenvolvidas em uma linhagem celular semelhante ao macrófago. Em certas formas de realização E. canis é desenvolvida nas células de medula óssea de cães (DBM) para produzir um antígeno de E. canis associado a célula. Nas formas de realização particulares as bactérias de E. canis são desenvolvidas em uma linhagem celular DBM. Nas formas de realização particulares que a linhagem celular DBM é DBM (WCS) MCS+12, número de acesso ATCC N°. PTA-10545. Nas formas de realização particulares a E. canis é associada a célula, WS MS+3, 19517-001, número de acesso ATCC N°. PTA 10546. Nas formas de realização alternativas, E. canis é desenvolvido em uma linhagem celular DH-82.
[00012] Um antígeno de E. canis da presente invenção pode ser um E. canis inativado. Nas formas de realização particulares o antígeno E. canis é uma bacteriana. Em certas formas de realização, o antígeno E. canis inativado é a célula associada.
[00013] A presente invenção também fornece métodos de imunização de um paciente contra E. canis. Tais métodos podem incluir a administração de um paciente a composição de vacina e/ou uma composição imunogênica da presente invenção. Certas formas de realização compreende administrar uma vacina e/ou composição imunogênica de acordo com a invenção ao paciente intradermalmente. Outro tal método compreende administrar uma vacina e/ou composição imunogênica de acordo com a invenção ao paciente subcutaneamente. Ainda outro tal método compreende administrar uma vacina e/ou composição imunogênica de acordo com a invenção ao paciente oralmente. Nas formas de realização particulares deste tipo, o paciente animal é um canino. Em outra forma de realização, o paciente animal é um felino (por exemplo, um gato doméstico). Nas formas de realização particulares a segunda dosagem de uma composição de vacina e/ou composição imunogênica é fornecida como um intensificador. Em certas formas de realização o intensificador é administrado cerca de 21 dias após a dosagem inicial de uma composição de vacina.
[00014] A presente invenção ainda fornece um método de mascarar as composições de vacina e/ou composições imunogênicas da presente invenção. Em certas formas de realização a presente invenção fornece um processo para a produção de um antígeno E. canis como descrito neste. As composições de vacina e/ou composições imunogênicas são preparadas pela mistura de um antígeno da presente invenção com um excipiente veterinariamente adequado. Em certas formas de realização deste tipo o antígeno é uma célula associada à bacteriana de E. canis. Nas formas de realização particulares, o excipiente veterinariamente adequado é um adjuvante de fator cord dissolvido em um sistema de solvente de clorofórmio.
[00015] Estes e outros aspectos da presente invenção serão melhores apreciados por referência aos desenhos, descrição detalhada e exemplos.
[00016] FIG. 1 é uma representação gráfica de contagens de célula sanguínea branca pós-desafio médio no tempo dos animais de controle (triângulos) e animais vacinados (quadrados). A linha em negrito indica o nível mínimo das contagens de célula sanguínea considerada normal de acordo com o manual Merck.
[00017] FIG. 2 é uma representação gráfica das contagens de célula sanguínea vermelha pós-desafio médio no tempo dos animais de controle (triângulos) e animais vacinados (quadrados). A linha em negrito indica o nível mínimo das contagens da célula sanguínea vermelha considerada normal de acordo com o manual Merck.
[00018] FIG. 3 é uma representação gráfica dos valores de hemoglobina pós-desafio médio no tempo dos animais de controle (triângulos) e animais vacinados (quadrados). A linha em negrito indica o nível mínimo de contagem de hemoglobina considerada normal de acordo com o manual Merck.
[00019] FIG. 4 é uma representação gráfica dos valores de hematócrito pós-desafio médio no tempo dos animais de controle (triângulos) e animais vacinados (quadrados). A linha em negrito indica o nível mínimo da contagem de hematócrito considerada normal de acordo com o manual Merck.
[00020] FIG. 5 é uma representação gráfica das contagens de plaqueta pós-desafio médio no tempo dos animais de controle (triângulos) e animais vacinados (quadrados). A linha em negrito indica o nível mínimo de contagens de plaqueta considerada normal de acordo com o manual Merck.
[00021] A presente invenção fornece as composições imunogênicas e vacinas que podem reduzir a incidência da trombocitopenia, leucopenia, anemia e perda de peso seguindo um desafio com uma cepa virulenta de E. canis. Os presentes resultados são inconsistentes com relatórios previamente publicados com relação aos cães infectados, que foram curados pelo tratamento antibiótico, mas foram susceptíveis à doença subsequente [ver, por exemplo, Breitschwerdt et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 42(2) 362-368 (1998)]. Estes relatórios anteriores sugerem que a imunidade protetora não desenvolvem após a exposição ao organismo. No contraste direto, a presente invenção fornece os métodos para o melhoramento e/ou prevenção de Ehrlichiose Monocítica Canina (CME) e/ou pancitopenia canina trópica (TCP), em um paciente pela administração ao paciente uma composição imunogênica e/ou a composição de vacina da presente invenção. Deste modo, em um aspecto a presente invenção fornece uma vacina eficaz contra E. canis.
[00022] Como divulgado neste, durante o desenvolvimento de um modelo de desafio E. canis, cães rapidamente desenvolvem uma resposta de anticorpo humoral a E. canis. Correlacionado com a aparência do anticorpo anti-E. canis é uma gota rápida na contagem de plaqueta, ou trombocitopenia e a iniciação de grave outras indicações clínicas. Entretanto, as vacinas que induzem as respostas de anticorpo fortes humorais em cães falham em protegê-los os sinais clínicos da doença. De fato, os cães vacinados que produzem uma resposta de anticorpo forte ao E. canis pode ter resultados clínicos piores do que contrapartes não vacinadas seguindo o desafio. Sem ser a ligação em qualquer teoria particular, os resultados divulgados neste parecem consistente com E. canis usando os anticorpos produzidos contra o ganho do acesso ao interior das células através do processo da opsonização.
[00023] A presente invenção ainda fornece processos para a produção um antígeno para uma composição imunogênica e/ou vacina por si só. Nas formas de realização particulares o processo compreende o desenvolvimento E. canis em uma linhagem celular particular para produzir o antígeno. Em algumas formas de realização o antígeno é misturado com um excipiente veterinariamente adequado. Nas formas de realização mais particulares a presente invenção inclui uma composição que compreende um E. canis desenvolvido inativado em uma linhagem celular de medula óssea de cães. As composições imunogênicas e/ou vacinas da presente invenção ainda podem incluir um adjuvante.
[00024] Embora o mecanismo seletivo pelo qual E. canis discrimine quais células são infectadas seja deficientemente entendido, as células adequadas pela infecção comumente expressam os receptores de antígeno de classe II de complexo de histocompatibilidade maior (MHC). Harris et al. [Vet. Immunol. Immunopathol., 96:239-243 (2003)] tem demonstrado que E. canis possui um mecanismo para a sub-regulação da expressão de receptores de classe II MHC na superfície das células que infectam como um mecanismo possível para a anulação da vigilância imune. Enquanto é claro que as linhas celulares derivadas as espécies de carrapatos não expressam os receptores de classe II de mamífero MHC, Singu et al. [Cellular Microbiology, 8(9), 1475-1487 (2006)] tem demonstrado que E. canis altera sua expressão de proteína de superfície dependendo se este infecta um hospedeiro de vertebrado ou invertebrado. Consequentemente, em outro aspecto, a presente invenção fornece as células e/ou linhas celulares que acomodam o desenvolvimento de E. canis, enquanto no mesmo tempo produziu um antígeno de E. canis que tem otimizado pelo uso de vacina.
[00025] Como usado neste, “paciente” refere-se a qualquer espécie que pode ser infectada por E. canis. Em certas formas de realização o paciente é um paciente animal não humano. Nas formas de realização particulares o paciente é um canino ou felino. Em certas formas de realização o paciente animal é um canino. Em outras formas de realização o paciente animal é um felino.
[00026] Como usado neste o termo, "canino" inclui todos os cães domésticos, Canis lupus familiaris ou Canis familiaris, a não ser de outra maneira indicada.
[00027] Uma “quantidade de imunização efetiva,” como usado neste, pode variar dependendo da cepa ou cepas de E. canis usado para gerar uma vacina e pode ser qualquer quantidade suficiente para evocar uma resposta imune protetora.
[00028] Embora como usado neste, a “resposta imune protetora” pode ser uma resposta imune em um paciente que leva à proteção contra uma ou mais indicações da infecção, a “resposta imune protetora” não requer a proteção completa de qualquer indicação da infecção. Antes da “resposta imune protetora” pode ser uma resposta imune que é suficiente tal que, após o desafio, sintomas da infecção subjacente são pelo menos reduzido e/ou que um ou mais das causas celular, fisiológicas ou bioquímicas subjacentes causam ou mecanismos que causam os sintomas são reduzidos e/ou eliminados. É entendido que “reduzido”, como usado no contexto, significa relativo ao estado da infecção, incluindo o estado molecular da infecção, não apenas o estado fisiológico da infecção. As vacinas da presente invenção são pretendidas para fornecer a resposta imune protetora.
[00029] Como usado neste, "evocar uma resposta humoral mínima" significa que administrar uma composição de vacina compreende E. canis na vacinação primária em um paciente (por exemplo, um canino) não resulta na detecção de anticorpos a E. canis no soro testado obtido do paciente 21 dias após a primeira exposição em uma composição de vacina, quando aquela detecção é realizada pelo seguinte procedimento: exposição de uma diluição 1:40 do soro testado ao E. Canis fixo, lavagem suficientemente para remover todos os materiais não ligados, adicionar um anticorpo anti-IgG rotulado apropriado às espécies do paciente, lavagem suficientemente para remover todos os materiais não ligados e então visualmente inspecionar para fluorescência devido aos anticorpos anti-IgG fluorescentemente rotulados ligados aos E.canis fixos por intermédio dos anticorpos específicos por E.canis. Nas formas de realização particulares administrar ao paciente uma vacinação intensificadora subsequente simples de uma vacina ainda não evoca uma resposta humoral significante contra E. canis e requer uma diluição de 1:160 ou menos do soro testado obtido do paciente animal após a exposição ao composição intensificadora de vacina para detectar os anticorpos ao E. canis no soro testado, se estes são detectáveis em todos, quando administrado pelo método realizado pela vacina primária acima.
[00030] Como usado neste, o termo linhagem celular “estavelmente infectada” refere-se a uma linhagem celular que permanece infectado em toda parte de pelo menos 10 passagens da cultura celular.
[00031] Os antígenos de E. canis da presente invenção podem ser isolados de qualquer número de fontes ou cepas de E. canis. Exemplos de tais cepas de E. canis incluem, mas não são limitados a, Ebony, Broadfoot, Florida, Israel 611, Kogashima 1, Louisiana, Oklahoma, Venzuela, North Carolina State University (NCSU) strain Jake e NCSU isolates Demon, D J e Fuzzy. Em certas formas de realização, o antígeno pode ser uma bacteriana E. canis. Nas formas de realização adicionais, o antígeno pode ser isolado ou derivado da bactéria de E. canis que foi inativada por qualquer método adequado disponível. Exemplos de tais métodos incluem, mas não são limitados a, calor, formaldeído, formalina, bi-etileno amina, radiação e tratamento de beta-propiolactona. Nas formas de realização particulares, a bactéria E. canis pode ser inativada pelo tratamento com formalina.
[00032] Nas formas de realização particulares, o antígeno E. canis pode compreender um ou mais antígenos que não serão reconhecidos como estranho por um paciente quando um ou mais antígenos são fornecidos em um paciente, isto é, o paciente não aumentará uma resposta humoral ou aumentará uma resposta humoral mínima a um ou mais antígenos. Em algumas formas de realização um ou mais antígenos de E. canis não evocarão a produção de anticorpos, ou alternativamente, evocarão a produção mínima de anticorpos contra um ou mais antígenos de E. canis. Além disso, tais antígenos E. canis evocarão uma resposta imune protetora contra um ou mais antígenos de E. canis. A presente invenção inclui uma composição imunogênica para a vacinação de um canino contra ehrlichiose do tipo que compreende um agente que leva a uma resposta imune no canino, utilizando, como um agente, um que evoca pouco ou nenhuma resposta imune humoral no canino, ainda já evocando uma resposta imune protetora no canino. Nas formas de realização particulares esta resposta imune protetora é devido pelo menos em parte em uma resposta imune mediada por célula.Células
[00033] A bactéria de E. canis da presente invenção pode ser desenvolvida em uma célula apropriada e/ou na linhagem celular. Consequentemente, um antígeno de E. canis pode ser produzido a partir do desenvolvimento da bactéria de E. canis ou propagado em uma linhagem celular. Exemplos de tais células e linhas celulares incluem células primárias (por exemplo, macrófago) e/ou linhagens celulares/ linhagens celulares contínuas tal como aqueles listados abaixo:Linhagens celulares primárias:• macrófagos de sangue canino, ver, por exemplo, [Nyindo, et. al. Am. J. Vet. Res. 32:1651-1658 (1971)].• macrófagos peritoneais, ver, por exemplo, [Stephenson and Osterman, Am. J. Vet. Res. 38:1815-1819 (1977)].Linhagens celulares contínuas:• Linhagem celular híbrida de humano/cães, [ver, por exemplo, Stephenson and Osterman, Am. J. Vet. Res. 41:234-240 (1980)].• Linhagem celular de macrófago canino (DH-82), [ver, por exemplo, Dawson, et. al., J. Infect. Dis. 163:564-567 (1991)].• Macrófago peritoneal de camundongo; linhagem celular híbrida de camundongo/cães (MDH-SP), [ver, por exemplo, Holland and Ristic, Abstr 55, p. 89, em Program and Abstracts of the IV° International Symposium on Rickettsiae and Rickettsial Diseases, Piestany Spa, Czech and Slovak Federal Republics].• Linhagem celular de macrófago de camundongo, [ver, por exemplo, Keysary, et. Al., J VEt Diagn Invest 13:521-523 (2001)].• Linhagem celular de medula óssea de cães (células DBM), [ver, por exemplo, Gaunt et. al. J. Clin Micro. 34 (6):1429-1432 (1996)].• Linhagem celular de fibroblasto embriônico felino (FEF), [ver, por exemplo, Battles et. al., WO 2009/036177 A1]. • Linhagem celulares de carrapatos (IDE8 e ISE6), [ver, por exemplo, Munderloh, et. al. U. S. 5.869.335].
[00034] Em um aspecto da invenção a Linhagem celular é uma Linhagem celular semelhante ao macrófago, que expressa os receptores de superfície similares aqueles expressados por macrófagos caninos. Nas formas de realização relacionadas a linhagem celular é uma linhagem celular de macrófago. Nas formas de realização particulares deste tipo, a linhagem celular utilizada é a linhagem celular DH-82, que tem o número de acesso ATCC N°. CRL-10389.
[00035] A presente invenção inclui E. canis desenvolveu em uma linhagem celular de mamífero semelhante ao macrófago ou monócito. Em certos exemplos estas linhas celulares foram imortalizadas de modo que fornecem um substrato de desenvolvimento contínuo ou confiável para a fabricação de vacinas. As células imortalizadas podem ser criadas a partir das células progenitoras neoplásticas tal como a linhagem celular DH-82 descrita por Wellman et al. [In Vitro Cell Develop Biol 24:223-228, (1988)]. As células podem ser imortalizadas pelo uso dos genes virais. O antígeno do vírus símio 40 (SV40) T foi mostrado ser uma maneira muito confiável para criar as células imortalizadas e híbridos de célula somática de macrófagos peritoneais caninos hibridizados com células humanas transformadas SV40 foram usadas para desenvolver E. canis em uma maneira contínua por Stephenson et al. [Am J Vet Res 41(2):234-40, (1980)]. Uma faixa ampla de agentes pode ser usada para imortalizar as células incluindo vírus diferentes, raios X, solventes orgânicos, compostos metálicos e ácidos nucléicos. Estes métodos foram extensivamente resumidos por Rhim [Annals NY Acad of Sci. 919:16-25 (2000)]. Em certas formas de realização da presente invenção E. canis é desenvolvido em tais linhas celulares e então inativados para formar um antígeno de bacteriana E. canis.
[00036] Em certas formas de realização, a linhagem celular é uma Linhagem celular de medula óssea de cães (DBM). Nas formas de realização particulares, a linhagem celular DBM é um descrito por Gaunt et al. [J. Clin. Microbio. 34 (6): 1429-1432, (1996)]. Nas formas de realização particulares a linhagem celular DBM é a cepa depositada de Acessão ATCC N°. PTA- 10545. Em certas formas de realização que a linhagem celular é a linhagem celular DBM que é estavelmente infectada com E. canis. Em uma forma de realização particular deste tipo de E. canis associada a célula é depositado e tem o número de acesso ATCC N°. PTA-10546. Nas formas de realização alternativas, a linhagem celular é uma linhagem celular de inseto. Nas formas de realização particulares deste tipo, a linhagem celular de inseto é uma linhagem celular de carrapato. Em uma forma de realização particular, aquela da linhagem celular de inseto é a linhagem celular de carrapato IDE8, isolado de Ixodes scapularis, que é depositado com o ATCC e tem o número de acesso ATCC N°. CRL-11973.
[00037] Uma cultura celular infectada com E. canis pode ser desenvolvida em frascos e subsequentemente passada em frascos maiores para obter os volumes maiores de material requerido para fazer as composições imunogênicas e/ou vacinas. Alternativamente, a cultura celular infectada pode ser passada a partir dos frascos nas garrafas rolantes subsequentes, frascos giratórios, cubos celulares, biorreatores ou qualquer aparelho capaz de desenvolver a cultura celular em ampla escala a fim de produzir uma quantidade adequada de material requerido para misturar uma composição imunogênica e/ou vacina. As culturas infectadas podem ser congeladas em um meio adequado e usado para a infecção da cultura celular posterior.
[00038] As células podem ser aderentes e ligadas ao frasco de desenvolvimento ou aparelho, incluindo ligado aos microcarregadores, ou alternativamente, flutuante na suspensão. Os métodos para a remoção das células aderentes incluem, mas não são limitados a, raspagem manual do frasco usando-se raspadores de célula mecânicos ou tratamento com uma solução de tripsina para remover a partir dos frascos e subsequentemente neutralizar a tripsina não usada com uma solução de proteína. As células podem então ser centrifugadas para concentrar e recolocar em suspensão em um meio de congelamento adequado. Os meios de congelamento incluem, mas não são limitados a, média contendo 10 a 90% de soro bovino fetal e 1 a 20% de sulfóxido de dimetila (DMSO). Outros criopreservantes adequados podem ser usados que podem ser mais adequados para as linhas celulares diferentes e resultam em um nível alto de viabilidade no descongelamento e reinício da cultura.
[00039] A fim de iniciar uma cultura infectada, as células não infectadas podem ser removidas a partir do congelamento e cultivado em um meio adequado., por exemplo, a 1 ml de frasco contendo 1 x 105 de células DBM é rapidamente descongelado e colocado em um frasco de cultura de tecido T-75 (75 cm2 de área de superfície) contendo um meio adequado para o desenvolvimento das células DBM. Em uma forma de realização particular, o meio é meio de desenvolvimento completo de Fischer. Um litro do meio de desenvolvimento completo de Fischer para as células DBM, por exemplo, é feito pela adição de 200 ml de soro de cavalo de a 770 mls de meio de Fischer. O meio é completamente adicionado 10 mls de uma solução de hidrocortisona de 2 mg/ml, 10 mls de uma solução de glutamina de 200 mM e 10 mls de uma solução de 1M de HEPES.
[00040] Uma vez que a cultura DBM atinja um nível adequado de confluência (10 a 90%), a cultura é prontamente infectada. Um frasco de cultura infectada é removida a partir do congelador, rapidamente descongelado e dispensado no desenvolvimento a cultura. A cultura é desenvolvida a 36 ± 2° C nos frascos ventilados ou revestidos com ou sem a suplementação de CO2. A cultura é mantida de acordo com os métodos comuns para uma pessoa habilitada na técnica pela passagem de uma célula no meio fresco como requerido. Após diversas semanas, a cultura pode ser checada pelo nível de infecção da microscopia de fluorescência direta usando anticorpos anti-E. canis ou outros métodos adequados. As culturas podem atingir um nível de infecção de 90% ou mais. Um nível maior de infecção é mais desejável como este resultado em um rendimento maior do material antigênico por volume de cultura. A cultura infectada pode ser passada em volumes maiores de cultura pelo movimento da cultura nos frascos maiores, frascos rolantes, ou outros recipientes de cultura adequados.
[00041] A infecção da cultura celular por E. canis pode ser determinada pelos diversos métodos incluindo, mas não limitado a, análise microcópica das células tingidas com os pigmentos tal como pigmento Giemsa, pigmento Camco Difquick ou laranja de acridina. Além disso, os anticorpos específicos para E. canis podem ser diretamente ou indiretamente rotulados com os marcadores fluorescentes e resumidos com um microscópio de luz fluorescente e em uma microonda adequada para o marcador fluorescente particular. Outras técnicas podem ser usadas para determinar o nível de infecção de uma cultura incluindo, mas não limitado a, reação de cadeia de polimerase quantitativa (qPCR) ou PCR.
[00042] As células não infectadas podem ser adicionadas em uma cultura como necessária a fim de manter um certo nível de infecção em uma cultura. Quando um volume adequado de cultura infectada é atingida, a cultura pode ser inativada por uma variedade de métodos incluindo, mas não limitado a, métodos de calor ou química. Antes da inativação, a cultura pode ser titulada para determinar a quantidade das partículas infectadas em uma cultura como um método de determinar como a cultura pós inativada adiciona à mistura. Um método para titulação e cultura infectada é fornecida nos exemplos abaixo. Em certas formas de realização, formalina é adicionada em uma cultura em uma concentração final de 0,05% e a cultura é misturada por três dias a 36 ± 2° C. Outros tais inativadores que podem ser usados incluem, mas não são limitados a: etilenoiminas (EI, BEI), beta propiolactona e fenol. Os antibióticos também podem ser usados para inativar uma cultura tal como desoxicilina ou qualquer outro antibiótico que é sensível ao E. canis.
[00043] A cultura pode ser testada por qualquer número de métodos para determinar a viabilidade. Tais métodos incluem, mas não são limitados a, retro-titulação na cultura celular, integridade da membrana para os pigmentos não permeáveis contrários e injeção em cães e monitoramento para os sinais típicos de infecção.
[00044] Uma vez inativado, a cultura pode ser concentrada por qualquer número de métodos., por exemplo, a concentração de E. canis não viável é feita pela centrifugação, ultra-filtração ou evaporação. Em uma forma de realização particular, as células DBM que são infectadas com E. canis são inativadas e então centrifugadas a 1400 x g por 15 minutos para granular as células totais. O sobrenadante é descartado e o grânulo é recolocado em suspensão mo meio de Fischer sem o soro. A gentamicina, ou um preservante similar, pode ser adicionado pós-inativação para evitar os problemas de contaminação. A cultura é recolocada em suspensão no meio de Fischer sem o soro a um décimo ao volume original a fim de concentrar a cultura inativada e fazer mais o manuseio. A quantidade do antígeno disponível no concentrado inativado pode ser determinado por qualquer número de métodos incluindo cromatografia, espectroscopia, ou vários tipos de imunoensaios específicos. O volume do antígeno pode ser misturado com diluentes e um adjuvante para fazer uma vacina aceitável.
[00045] Como indicado acima, as composições imunogênicas e/ou vacinas compreendem um antígeno da presente invenção (por exemplo, uma bacteriana de E. canis) pode, mas não necessariamente incluem um ou mais adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica, ver, por exemplo REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18° Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa.) e GOODMAN AND GILMAN'S, THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (10° ed. 2001). Nas formas de realização particulares, o adjuvante pode ser um que estimula uma resposta imune mediada por célula, mas não estimula uma resposta imune humoral.
[00046] As composições imunogênicas e/ou vacinas da presente invenção que ainda podem compreender um adjuvante pode compreender um ou mais elementos não geralmente solúvel em água. Nas formas de realização particulares o adjuvante é um soluto não polar dissolvido em um solvente não polar. Exemplos de solventes não polares incluem, mas não são limitados a, hexano, benzeno, tolueno, éter dietílico, clorofórmio e acetato de etila. Em uma tal forma de realização, o solvente é um sistema de solvente de clorofórmio. O clorofórmio pode ser preferido em alguns exemplos como não é inflamável e mais adequados para a fabricação dos biológicos veterinários. Um adjuvante exemplificada neste é trealose 6,6‘-dimicolato em um sistema de solvente de clorofórmio.
[00047] Os solventes são polares tipicamente não solúveis em água e portanto, o uso de solvente polar com uma constante dielétrica relativamente baixa, mas com boa solubilidade em água pode ser usado no sistema de solvente para aumentar a solubilidade da mistura de adjuvante em uma solução aquosa. Os exemplos de solventes polares incluem, mas não são limitados a, metanol, etanol, isopropanol, sulfóxido de dimetila e dimetilformamida. Em certas formas de realização, o adjuvante não polar é fator cord [por exemplo, trealose 6,6‘-dimicolato]. Outros adjuvantes não polares podem ser úteis na imunidade celular mediada incluindo, mas não limitado a, frações hidrofóbicas de saponinas purificadas, lipopeptídeo bacteriano (Pam3CSK4) e monofosforil lipídeo A. Nas formas de realização particulares, o fator cord é dissolvido em um sistema de solvente de clorofórmio. Nas formas de realização particulares o sistema de solvente de clorofórmio compreende cerca de 65-95% de volume de clorofórmio/volume.
[00048] Consequentemente, certas formas de realização sistemas de solvente de clorofórmio incluem, mas não são limitados a, sistemas de solvente que compreendem clorofórmio e metanol. Em um exemplo não limitante, o sistema de solvente de clorofórmio pode compreender cerca de 70% a 95% de clorofórmio e/ou cerca de 5% a 30% de volume de metanol/volume. Em certas formas de realização deste tipo, o sistema de solvente de clorofórmio ainda compreende de 0,5 a 5,0% de água volume/volume. Em um exemplo não limitante, o sistema de solvente de clorofórmio pode compreender noventa partes de clorofórmio em volume, dez partes de metanol em volume e uma parte de água em volume [isto é, cerca de 90% de clorofórmio: 10% metanol: 1,0% de água volume/volume, respectivamente]. Nas formas de realização particulares, o adjuvante pode compreender fator cord e/ou ouros adjuvantes dissolvidos em um sistema de solvente de clorofórmio. Em uma tal forma de realização, o adjuvante é trealose 6,6‘-dimicolato, que é dissolvido no sistema de solvente de clorofórmio: 90 ml de Clorofórmio: 10 ml de Metanol: 1 ml de água.
[00049] Nas formas de realização particulares, a composição de vacina pode compreender um ou mais carregador ou diluente farmacêutica ou veterinariamente aceitável. Os exemplos não limitantes de carregadores ou diluentes que podem ser usados nas formulações de composição de vacina incluem água, soluções de glicose, dextrose/solução salina, solução salina, solução salina tamponada por fosfato (PBS), tampão de HEPES, meios de Fischer, solução de Hank e solução Ringer. Tais formulações podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis para intensificar a estabilidade, capacidade de liberação ou solubilidade, tal como agentes de tamponação, agentes ajustadores de tonicidade, agentes umectantes, detergentes e outros. Os aditivos também podem incluir os ingredientes ativos adicionais tal como agentes bacterianos ou estabilizadores., por exemplo, a solução pode conter timerosal, gentamicina, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, monolaurato de sorbitano, ou oleato de trietanolamina. As composições podem ser esterilizadas pelas técnicas de esterilização conhecidas, convencionais.
[00050] Em certas formas de realização, é considerado uma composição de vacina ainda pode compreender outros componentes ativos tal como, mas não limitado a, um componente antipatogênico direcionado novamente, ou um componente antigenóico e/ou atenuado e/ou isolado morto de: vírus de raiva, doença de Lyme (Borrelia burgdorferi), vírus da indisposição canina, bordetela canina, parvovírus canino, adenovírus canino, coronavírus canino, Babesia canis, Anaplasma phagocytophilum, Giardia; leptospira interrogans tal como serovars canicola, icterohaemorrhagiae, pomona, grippotyphosa ou bratislava ou outros, ou qualquer combinação deste.
[00051] Em algumas formas de realização, a vacina e/ou composição imunogênica pode ser formulada em uma forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e garantir a uniformidade da dosagem. Visto que, uma unidade de dosagem como este pertence a uma composição de vacina que refere-se às unidades fisicamente discretas como dosagens unitárias por um paciente, cada unidade contendo uma quantidade pré-determinada do antígeno E. canis calculado para produzir o efeito imunogênico desejado em associação com um adjuvante, carregador e/ou veículo. Em certas formas de realização, a composição imunogênica e/ou vacina é liofilizada.
[00052] Em certas formas de realização a vacina e/ou composição imunogênica pode ser administrada parenteralmente, por exemplo, intramuscularmente, subcutaneamente, intraperitonealmente,intradermalmente ou outros, ou uma composição imunogênica e/ou vacina pode ser administrada oralmente ou intranasalmente nas quantidades efetivas de acordo com uma lista determinada pelo tempo da exposição potencial como um carregador de E. canis. Nesta maneira, o paciente tratado pode ter tempo para construir a imunidade antes da exposição natural., por exemplo, um tratamento típico pode incluir a injeção subcutânea pelo menos 42 dias antes da exposição potencial. Nas formas de realização, mais do que uma administração de uma composição de vacina pode ser fornecida em um paciente. Por meio do exemplo não limitante, uma primeira administração a cerca de 42 dias e uma segunda a cerca de 21 dias antes da exposição potencial do paciente. Entretanto, o início da imunidade deve ocorrer em um curso de tempo mais rápido.
[00053] As vacinas da presente invenção podem ser administradas como um líquido, emulsão, pó seco, incluindo como um pó liofilizado e/ou em uma mistura através de qualquer via parenteral, intravenosamente, intraperitonealmente, intradermalmente, pela sacarificação, subcutaneamente, intramuscularmente, ou inoculada por uma via mucosal, por exemplo, oralmente, intranasalmente, como um aerossol, pela gota no olho, pela administração em ovo, ou implantado como um pó seco gelado.
[00054] Um cultura do seguinte material biológico foi depositado com o seguinte depósito internacional por:Board of Supervisors,Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College and LSU Agricultural Center, 104 Efferson Hall,Baton Rouge, Louisiana, 70803American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, U.S.A., under conditions that satisfy the requirements of the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure.Organismo Acessão ATCC Data do depósitoN°.Célula de medula óssea PTA-10545 22 de Dezembro dede cães 2009E. canis associado a PTA-10546 22 de Dezembro decélula
[00055] A presente invenção pode ser melhora entendido pela referência aos seguintes exemplos não limitantes, que são fornecidos como exemplares da invenção. Os seguintes exemplos são apresentados a fim de ilustrar mais totalmente as formas de realização da invenção preferidas. Este não deve ser de maneira construída, entretanto, como limitante no amplo escopo da invenção.
[00056] Aclimatização/condicionamento: os animais foram levados a partir do grupo pré-existente e deste modo nenhum tratamento ou condicionamento foram necessários. Os animais foram aclimatados por pelo menos 7 dias antes do início do estudo. Todos os animais foram submetidos às boas práticas de criação normal através do estudo e procedimento de rotina foram padronizados cruzando todos os animais.
[00057] Alojamento: os cães estavam em grupos alojados aleatoriamente em cercados (4-5 cães por cercado) sem considerar os grupos de tratamento.
[00058] Dieta: água foi fornecida ad libitum em todos os animais. A alimentação encontra-se os requerimentos nutricionais mínimos para os animais desta idade e está de acordo com os procedimentos padrões.
[00059] Aleatorização: os cães foram classificados pela geração de um número aleatório dentro do bloco e então sortido com o grupo ID ligado. Os números aleatórios inferiores dentro dos blocos foram projetados ao grupo 1 e os números aleatórios maiores foram indicados ao grupo 2. Como perda de peso é um dos sinais clínicos associados com a infecção de E. canis, os cães foram também bloqueados pelo peso durante a aleatorização.
[00060] Tornando o estudo cego: as amostras laboratoriais de teste pessoal, realizando as observações animais diárias, as avaliações clínicas e realização das observações de necrópsia foram inconscientes das indicações do grupo de tratamento até a finalização do estudo.
[00061] Amostras: as amostras sanguíneas foram coletadas nos tubos de separação de soro no dia de estudo 0 antes da primeira vacinação para a análise tituladora de anticorpo.
[00062] Exame físico: todos os animais receberam um exame físico no dia -3 na facilidade do teste pelo atendente veterinário e foram observados ser saudáveis e adequados para o estudo.
[00063] Observações diárias: durante o período de aclimatização, todos os animais foram observados cada dia pelo pessoal de cuidado animal.
[00064] Observações clínicas: os sinais clínicos e temperaturas retais foram registradas no dia 0 e 21 antes da vacinação.
[00065] A administração do produto biológico: A vacina foi administrada subcutaneamente, em uma dosagem de 1,0 ml, em cada animal nos dias 0 e 21 usando uma seringa de 3 ml e agulha de calibre 23 x 1 polegada (2,54 cm). Todas as vacinas foram mantidas em gelo úmido durante o transporte na facilidade animal e durante a administração da vacina. A vacina subcutânea foi realizada na região suprascapular direita para a primeira dosagem e a região suprascapular esquerda para a segunda dosagem.
[00066] Reações de local de injeção: observações do local de injeção foram registrados por 7 dias seguindo cada vacinação.
[00067] Observações diárias: todos os animais foram observados diariamente durante o período de pós-vacinação pelo pessoal de cuidado animal.
[00068] Sorologia: No dia de estudo 21 amostras de sangue foram coletadas nos tubos de separação de soro para a análise tituladora de anticorpo.
[00069] Observações clínicas: Sinais clínicos e temperaturas retais foram tomados nos dias de estudo 35, 39 e 42 (antes do desafio) para estabelecer os valores de linha de base.
[00070] Amostras sanguíneas: no dia de estudo 42 amostras sanguíneas (antes do desafio) foram coletadas nos tubos de separação de soro para a análise tituladora de anticorpo. Nos dias de estudo 35, 39 e 42 amostras sanguíneas (antes do desafio) foram coletadas nos tubos EDTA para as linhas de base CBC. No dia de estudo 42 (antes do desafio) sangue foi coletado nos tubos de PAX Gene para a análise PCR.
[00071] Os pesos corporais foram resgistrados no dia de estudo 42 (antes do desafio) para os valores de linha de base.
[00072] Material de desafio: Dois frascos do material de desafio de E. canis (cultura congelada de passagem baixa passada em cães) foram removidos a partir do nitrogênio líquido, descongelado rapidamente e diluído 1:100 (1 ml + 99 ml) no meio de Fischer. O material de desafio diluído foi interrompido, invertido para misturar e então l ml foi removido pela titulação. O frasco foi selado com um revestimento de alumínio, rotulado e colocado em gelo em um recipiente secundário à prova de derramamento para transporte à unidade animal.
[00073] Administração de desafio: No dia 42 todos os cães foram desafiados subcutaneamente com 2,0 ml de material desafiado diluído.
[00074] Confirmação/retrotitulação do desafio: Uma amostra a partir do material de desafio diluído foi coletada e usada pela titulação imediata no dia do desafio nas placas de cultura de tecido de 24 reservatórios.
[00075] Pesos corporais: Os pesos corporais foram registrados semanalmente seguindo o desafio.
[00076] Observações diárias: As observações de animais foram registradas diariamente seguindo o desafio, exceto nos dias quando as observações clínicas e temperaturas foram realizadas, até o dia do estudo 49.
[00077] Observações clínicas: A partir do dia de estudo 49 até o final do estudo, sinais clínicos (depressão, desidratação, epistaxe e descarga nasal/ocular) foram diariamente registradas e temperaturas retais foram registradas duas vezes por semana.
[00078] Reações do local de injeção: Observações do local de injeção foram feitas por 7 dias seguindo o desafio.
[00079] Sangues por CBC: Amostras sanguíneas (EDTA) foram coletadas duas vezes por semana após o desafio pelo monitoramento dos perfis CBC.
[00080] Sangue para o teste PGR: O sangue foi coletado semanalmente nos tubos PAX Gene para a análise PCR.
[00081] Sangue para soro: Os cães foram sangrados uma vez a cada duas semanas seguindo o desafio para sorologia.
[00082] Necropsia/Disposição: Todos os animais testados foram manamente submetidos à eutanásia pela injeção intravenosa de Beuthanasia antes da necropsia.
[00083] Sangue EDTA por CBCs: O sangue foi coletado pela venipuntura da veia jugular usando os tubos evacuados contendo tripotássio- EDTA. O sangue foi embalado nos pacotes de gele e processado no mesmo dia para a análise de perfil sanguíneo.
[00084] Sangue SST para a análise de anticorpo: O sangue foi coletado pela venipuntura da veia jugular usando os tubos evacuados. O sangue foi centrifugado a 2500 RPM por 10 minutos e o soro foi rotulado e armazenado a -10° C ou mais frio.
[00085] Sangue para o teste PCR: O sangue foi coletado pela venipuntura da veia jugular usando os tubos PAX Gene evacuados e análise PCR realizada.
[00086] Contagens de plaqueta: As contagens comuns foram determinadas como pelos procedimentos bem estabelecidos na técnica.
[00087] Titulação E. canis: Uma amostra de retenção do material desafiado diluído foi testada. Brevemente, as células DBM foram preparadas nas placas de 24 reservatórios em uma concentração de 1,0 x 105 células por ml e incubadas a 36 ± 2 graus Celsius por 1 dia antes de conduzir o ensaio. O meio foi assepticamente removido a partir do dia 1 de idade das culturas DBM e diluições seriais dez vezes do material desafiado foram adicionados, 1ml por reservatório, em 4 reservatórios copiados da placa de 24 reservatórios. As placas foram incubadas a 36 ± 2 graus Celsius por 7 dias. Após 7 dias, as placas foram alimentadas novamente com o meio de desenvolvimento de Fischer fresco, 1 ml por reservatório e retornado a 36 ± 2 graus Celsius por 7 dias. Em 14 dias de incubação, as placas foram centrifugadas por 10 minutos a 2000 RPM, o meio foi aspirado e as culturas foram fixas com 100% de metanol (0,5 ml por reservatório) por 10 minutos. Uma vez as placas foram secas, 0,5 ml por reservatório de anticorpo monoclonal de anti-E. canis de camundongo (diluído 1:1000 em 0,01M PBS) foi adicionado e incubado por 30 minutos a 36 ± 2 graus Celsius. As placas foram lavadas 3 vezes em 0,01M de PBS com uma lavagem final de água. Então 0,5 ml por reservatório de um IgG anti-camundongo de cabra rotulado por FITC (diluído 1:100 em 0,01M de PBS) foi adicionado e incubado por 30 minutos a 36° C ± 2° C. As placas foram lavadas novamente e observadas sob um microscópio fluorescente. Os tituladores foram calculados a 50% de pontos finais usando um método Spearman-Karber.
[00088] Sorologia: Um ensaio de anticorpo de imunofluorescente indireta (IFA) foi usado para a detecção de anticorpo de anti-E. canis no soro de cães. Brevemente, as diluições 1:20 iniciais de soro foram preparadas no tampão de diluição de soro. As amostras simples foram diluídas a 1:40, 1:80, 1:160 e 1:320 e então adicionadas (10 μL por diluição) as lâminas de 12 reservatórios contendo as células infectadas DBM E. Canis fixas e incubadas em uma câmara umidificada por 30 minutos a 36 ± 2 graus Celsius. As lâminas foram lavadas em 0,01M de PBS por 10 minutos e 10 μL de IgG anti- cães de cabra rotulado por FITC (diluído 1:100 em 0,01 M de PBS) foi adicionado em cada reservatório na lâmina. As lâminas foram então colocadas em uma câmara umidificada por 30 minutos a 36 ± 2 graus Celsius, lavada em 0,01 M de PBS por 10 minutos e lido pela microscopia fluorescente. O titulador é determinado pela maior diluição onde a fluorescência é visível.
[00089] PCR: o PCR foi realizado nas amostras de sangue assim como pelos procedimentos bem estabelecidos na técnica.
[00090] Teste de Inativação: o antígeno inativado por formalina foi testado para a verificação quanto à inativação completa. Resumidamente, as células DBM foram preparadas em frascos de 150 cm2 um dia antes da inoculação em 1,0 x 105 células por ml e 60 ml por frasco. 1,0 ml de cada amostra de teste (incluindo controles positivos e negativos) foi inoculado nos frascos e incubados por 8 dias a 36 ± 2 graus Celsius. Duas passagens cegas foram realizadas, com cada passagem recebendo 10 ml do inóculo de passagem prévia. Na passagem 2 pós-blindagem de 8 dias 2, cada material de frasco foi tingido por imunofluorescência específica. A perda de fluorescência nas culturas é uma indicação de inativação completa.
[00091] Variáveis de resposta: A variável primária para a determinação de eficácia de uma formulação de vacina foram fundamentadas na prevenção de trombocitopenia severa em vacinados em comparação com os controles. A perda de peso percentual, registro de necrópsia total, valores de sangue e sinais clínicos foram considerados suportar evidência de proteção.
[00092] Registro de Observações clínicas: os sinais clínicos para cada cão foram registrados e classificados diariamente para o período pós-desafio de 12 semanas.
[00093] Guia de Estimativa Clínica: Na entrada da sala de isolamento, andar até estimar a atitude dos animais. O registro para depressão pode ser determinado em muitos animais durante esta primeira caminhada. A seguir proceder com as observações clínicas. então, medir a temperatura corporal obtendo-se as amostras sanguíneas requeridas.
[00094] Morte: 100 pontos (nenhum sinal vital, incluindo cães que estão moribundos ou que foram submetidos à eutanásia).
[00095] Depressão: Ausente (atividade e comportamento normais). Presente: Letárgico, deitado enquanto você está no ambiente e relutante em levantar.
[00096] Descarga nasal: Normal (ausente); Séria (Moderada a severa): O fluido claro, frequentemente aquoso, todos de maneira descendente ou abaixo da boca - ao longo das laterais do nariz ou abaixo do filtro nasal; Mucopurulento (moderado a severo): Mucopurulento, não claro, frequentemente descarga colorida de maneira descendente ou abaixo da boca - ao longo das laterais do nariz ou abaixo do filtro nasal.
[00097] Descarga ocular: Normal (ausente); Séria (moderada a severa): Fluido claro, frequentemente aquoso, a meio caminho do nariz ou olhos contornados mais pelos unidos ou encharcados na córnea interna ou externa do olho; Mucopurulento (moderado a grave): Mucopurulento, não claro, descarga frequentemente colorida a meio caminho do nariz ou olhos contornados mais pelos unidos ou encharcados na córnea interna ou externa do olho.
[00098] Epistaxia: (Sangramento das narinas) - Normal (Ausente);Presente: sangramento das narinas.
[00099] Desidratação: Normal (Ausente); Presente: dobras na pele entre os ombros ou demoram mais do que 3 segundos para retrair.
[000100] Cálculo da perda de peso percentual: Cada cão foi pesado antes do desafio para determinar um peso de base. A perda de peso para cada cão foi calculada semanalmente após o desafio usando-se a seguinte fórmula: ((peso de base - peso corrente) / peso de base) x 100 = perda de peso%.
[000101] Doença concorrente: um cão (JWQ5, um controle) teve que ser tratado durante o estudo. O cão desenvolveu uma úlcera em seu olho esquerdo e a pálpebra fechou inchada. Antibióticos foram evitados a fim de não afetar o estudo. A condição foi descoberta em 13 de setembro. Naquele período, o olho foi pulverizado com solução salina isotônica. Em 15 de setembro, o cão recebeu uma injeção subcutânea de atropina localmente. No dia 18 de setembro, o cão foi observado pelo veterinário estar totalmente curado. Provavelmente, a condição foi causada por trauma (arranhão de um outro cão) e não como um resultado do produto de teste do estudo ou do desafio.
[000102] Teste de pré-vacinação: Os cães foram avaliados quanto à presença de anticorpos contra E. canis antes da vacinação. Todos os cães foram observados ter um titulador de <40 quando testado por ensaio de anticorpo imunofluorescente específico de E. canis (IFA) (Ver as Tabelas 5 e 19; Dia 42 é o dia do desafio). As observações clínicas e as temperaturas retais também foram tiradas antes da vacinação. Todos os cães foram observados estarem clinicamente normais.
[000103] Nenhum dos cães vacinados foram observados ter reações do local de injeção pós-vacinação. Todos os cães foram observados diariamente quanto aos efeitos adversos associados com uma vacina após ambas as vacinações. Nenhum dos cães apresentou quaisquer sinais clínicos adversos pós-vacinação.
[000104] As amostras de sangue foram retiradas para sorologia no dia 21 pós-vacinação, imediatamente antes da segunda vacinação. Os tituladores foram medidos usando-se diluições duplas de soro em lâminas de 12 reservatórios revestidos com células infectadas com E. canis DBM. As diluições começaram de 1:40. Nenhum dos cães no grupo vacinado apresentou um titulador na base 1:40 após uma dose simples de vacina (ver Tabela 5).
[000105] No dia 42, imediatamente antes do desafio, a quebra de tituladores de anticorpo de E. canis vacinados foi como segue (Tabela 5):
[000106] Tituladores < 40: 0 cães
[000107] Tituladores = 80: 4 cães
[000108] Tituladores = 160: 3 cães
[000109] Tituladores > 320: 1 cães
[000110] Todos os cães de controle não vacinados permaneceram soronegativos (<1:40) antes do desafio.
[000111] Desafio: Todos os cães foram desafiados no dia 42 do estudo pela dissolução do material de desafio descongelado 1:100 em meios de Fischer e administração 2 ml de desafio subcutaneamente a cada cão. O material de desafio foi titulado no período de administração aos cães e observados ter um titulador de 103.2 TCID50 por 2 ml de dose.
[000112] Perda de peso associado com desafio: os pesos corporais foram registradas semanalmente seguindo o desafio. Os resultados são resumidos na Tabela 6.
[000113] A perda de peso percentual mais alta foi vista nos cães de controle com uma média de 16,97% de redução no peso corporal em 7 semanas após o desafio. Este também foi o ponto onde existe diferença maior entre os grupos de tratamento quando os vacinados apenas experimentaram uma queda de 7,85% no peso corporal. A Perda de peso foi examinada estatisticamente. Perda de peso severa foi definida como > 15% do peso corporal do cão. Setenta e oito por cento (7/8) dos cães de controle tiveram perda de peso > 15% de seu peso corporal, em comparação com 12% (1/8) dos vacinados. Esta diferença é extremamente significante (p = 0,0042).
[000114] Mortalidade: Dois de oito (25%) cães no grupo de controle foram submetidos à eutanásia devido à gravidade de sinais clínicos. Nenhum dos vacinados morreu durante o ensaio. A eutanásia foi uma solicitação do julgamento do veterinário com base nos sinais clínicos, perda de peso e célula sanguínea e valores de eletrólito. O veterinário atendente foi cegado quanto à denominação do grupo. A diferença foi sustentadora, mas não significante quanto ao número baixo de cães no estudo (p = 0,2118).
[000115] Avaliação de Contagem Sanguínea Completa: As amostras de sangue também foram retiradas nos dias de estudo 35, 39 e 42 para fixar valores de linha de base para células sanguíneas brancas e vermelhas (WBC e RBC), hematócrito (HCT), hemoglobina (Hgb) e plaquetas. Todos os cães estiveram nas faixas normais para estas medições antes do desafio de acordo com a Merck Veterinary Manual, Oitava Edição [Merck and Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA, (1998)].
[000116] As amostras de sangue coletadas duas vezes uma semana após o desafio. Os resultados de CBC incluíram Células sanguíneas Brancas (WBC's), Células Sanguíneas Vermelhas, (RBC's), Hemoglobina (Hgb), Hematócrito (Hct ou volume celular empacotado) e plaquetas. Por causa do E. canis ter um tal efeito dramático nos valores sanguíneos, um sistema de registro foi desenvolvido devendo classificar a incidência como “normal, anormal ou clinicamente significante (ou severa). A Tabela 7 resume os valores usados neste estudo.
[000117] Valores clinicamente significantes (ou severos) são calculados como preliminarmente 75% da extremidade baixa das faixas normais para dias múltiplos. Os cães neste faixa foram frequentemente observados como tendo sinais clínicos que podem estar diretamente correlacionados com a deficiência das células sanguíneas relacionadas. Os valores anormais são qualquer valor sob o nível mínimo para normal.
[000118] Plaquetas: as contagens de plaqueta baixas são o sinal clínico primário associado com infecções rickettsiais. Para este estudo, esta foi a variável primária. E. canis é particularmente bom em causar quedas muito severas nos números de plaqueta em cães afetados. Todos os 8 (100%) cães de controle e 5/8 (63%) de vacinados desenvolveram trombocitopenia (contagens de plaqueta < 200,000/μL). A Figura 5 mostra as contagens de plaqueta médias (controles vs. vacinados) após o desafio e a Tabela 8 fornece um sumário dos dados. Os cães que tiveram contagens de plaqueta menor do que 150.000 plaquetas/μL de sangue para duas ou mais leituras foram considerados na categoria severa e estão em um risco alto de sangramento no dano. Os trabalhadores com cuidado animal podem identificar facilmente estes caso como o dano associado com sangramentos de venipuntura que persiste por uma quantidade considerável de tempo após a amostra ser retirada. Para os cães de controle, 6 de 8 (75%) tiveram contagens de plaqueta na categoria severa. Apenas 2/8 (25%) dos vacinados tiveram contagens na categoria severa. Estatisticamente, esta diferença não foi significante (p = 0,0768). Entretanto, mortalidade em pelo menos um cão de controle censurou os dados porque o cão morreu precocemente no estudo quando este apresentou trombocitopenia grave. O cão não morreu, o estudo concluiu que pelo menos 7/8 dos controles apresentou trombocitopenia severa. Por causa da mortalidade ser um sinal clínico muito mais grave do que a trombocitopenia, a variável primária foi analisada novamente como trombocitopenia ou mortalidade. Levando-se a mortalidade em conta, a diferença entre os controles e os vacinados tornou-se significante (p = 0,0213)
[000119] Células Sanguíneas Vermelhas: A Figura 2 mostra ascontagens de eritrócito médias para o período pós-desafio. A Figura 2 mostra que a média dos cães de controle foi abaixo do normal para a maioria do período de ensaio, onde a média dos vacinados ficou na faixa normal pela maioria do período de ensaio. A Tabela 9 ilustra a gravidade do desafio quando 100% dos cães de controle satisfazem a definição do manual Merck's de anêmico e 63% progrediu para a categoria grave. Nenhum dos cães vacinados progrediu para a categoria severa de anemia. Esta diferença é muito significante (p = 0,0081).
[000120] Células sanguíneas brancas: A Figura 1 sumariza os resultados das contagens de leucócito para o período pós-desafio. A Figura 1 mostra uma diminuição severa na contagem de célula branca que foi observada nos controles. Os dados são melhor resumidos na Tabela 10 onde uma diferença marcada tanto para leucopenia branda quanto severa é observada nos cães. 38% dos cães no grupo de controle progrediram para a categoria “severa” de leucopenia quando nenhum dos vacinados progrediu. Esta diferença não é significante (p = 0,0822). A Tabela 10 e a Figura 1 ilustram uma diferença entre as médias para os vacinados e controles. A média dos controles caiu abaixo do nível mínimo para normal quando a média dos vacinados não. Esta tendência sugere que com mais animais em cada grupo de estudo, a diferença é provável ser significante.
[000121] Valores de Hemoglobina: A Figura 3 sumariza os resultados das medições de hemoglobina após o desafio. Consistente com outros parâmetros sanguíneos, a Figura 3 mostra que a média dos cai abaixo dos valores mínimos para muito do período pós-desafio. A média do grupo vacinado nunca ficou abaixo do normal. A tabela 11 mostra que 100% dos cães de controle tiveram valores de hemoglobina baixos, onde apenas 50% dos vacinados caíram para este nível. Nenhum dos vacinados progrediu para a categoria severa quanto a níveis de hemoglobina. Entretanto, apenas 25% dos controles progrediram para a categoria severa e esta diferença não foi significante (p = 0,2118).
[000122] Porcentagens de Hematócrito: A Figura 4 resume os resultadosdos valores de hematócrito pós-desafio. Como com as outras medidas deanemia, A Figura 4 mostra que a média do controle caiu bem abaixo donormal para a última metade do período de desafio, onde a média do cãovacinado nunca caiu abaixo do normal. A Tabela 12 mostra que a vacinaçãode cães com o produto de teste caiu, incidência of anemia, como medido pelacontagem de hematócritos, pela metade. Sessenta e três por cento (5/8) doscães de controle progrediram para a categoria severa quanto a hematócritoonde apenas 1/8 dos cães no grupo vacinado (13%) tiveram um valor severo.Esta diferença foi muito próxima da significância (p = 0,0534).
[000123] Sinais clínicos: Cada cão foi observado diariamente quanto a sinais clínicos indicativos de uma infecção séria. Os resultados são sumarizados na Tabela 13. O registro de sinal clínico foi fundamentado nas observações feitas por pessoal cego observando os cães quanto aos sinais de depressão, descarga nasal, descarga ocular, epistaxia, desidratação e morte. Um registro foi designado a cada observação com relação à gravidade do sinal clínico. O registro total para o grupo de controle foi de 254 versus 28 para os vacinados. O registro médio para controles versus vacinados foi de 32 e 4, respectivamente. A despeito de aparecimento muito indicativo de proteção, a diferença entre os grupos não foi significante (p = 0,4364).
[000124] Temperaturas retais: As temperaturas retais foram tiradas e registradas duas vezes por semana. Os cães foram considerados febris se a temperatura retal foi de >39,5 graus Celsius. Isto é consistente com o Merck Veterinary Manual, que lista a faixa de temperatura normal como 38,9 ± 0,5 graus Celsius. E. canis é conhecido por causar picos de temperatura em cães afetados. As observações deste estudo são consistentes com este e são resumidos na Tabela 14. 87,5% (7/8) dos controles tiveram picos de febre em comparação com 50% (4/8) dos vacinados. Os picos de febre foram comparados estatisticamente quanto às diferenças. Vinte e cinco por cento (2/8) dos controles tiveram febres por dois ou mais dias onde apenas 12,5% (1/8) dos vacinados tiveram. Esta diferença não foi significante (p = 0,6709).
[000125] Reatividade do Local de Injeção de Desafio: Os cães foram observados quanto à reatividade no local de desafio. Nenhum dos 16 cães no grupo vacinado ou grupo de controle apresentaram qualquer sinal de reatividade no local de administração de desafio.
[000126] Resultados da Detecção de PCR de E. canis no Sangue: As amostras de sangue foram retiradas para a análise de PCR para determinar a infecção por E. canis imediatamente antes do desafio. Os resultados de PCR são mostrados na Tabela 20. Como esperado, todos os cães permaneceram negativos quanto à infecção por E. canis antes do desafio. Os resultados para a análise de PCR semanal do sangue quanto à infecção por E. canis pós desafio estão na Tabela 20. Todos os cães de controle foram positivos quanto a E. canis no sangue em mais do que um ponto de tempo. O PCR nunca detectou E. canis e três dos vacinados. Estes resultados igualam exatamente os resultados das plaquetas quando estes mesmos cães falham em desenvolver trombocitopenia após o desafio.
[000127] A diferença entre os controles e os vacinados quanto a um resultado positivo não foi significante (p = 0,0822).
[000128] Sorologia Pós-Desafio: A sorologia foi realizada a cada duas semanas após o desafio. A resposta anti-E. canis dos resultados IFA são mostrados na Tabela 19. Os resultados de sorologia para os cães vacinados responde a questão de se os cães neste grupo foram negativos por PCR e falharam em desenvolver sinais clínicos incluindo trombocitopenia após o desafio foram realmente expostos a E. canis. Em algum ponto passado no dia 42 (dia do desafio) todos os três destes cães tiveram um enxágue rápido com titulador, indicando a exposição ao material de desafio. Um sumário dos meios para a sorologia é mostrado na Tabela 5. A relevância do titulador de anticorpo para a proteção não está claro a partir deste estudo. A sorologia não parece ser um indicador bom de exposição a E. Canis virulento.
[000129] Registros de Necrópsia: As necrópsias foram realizadas em todos os cães no período da eutanásia e as pessoas que realizam as necrópsias foram cegas. Para a maioria dos cães, estes estavam em oito semanas após o desafio. Para os cães que não foram submetidos à eutanásia precoce, devido a sinais clínicos severos, As necrópsias foram realizadas no período de morte. Os cães foram submetidos à necrópsia e registrados imediatamente após a eutanásia. A esplenomegalia é a única observação que pode estar claramente associada com a infecção por E. canis. O estado da vacinação pareceu ter um efeito nas observações de esplenomegalia (Tabela 16). Nenhum dos cães vacinados teve esplenomegalia em comparação com 38% (3/8) para os controles. Esta diferença não foi significante (0,0822). Em cães que devem ser submetidos à eutanásia antes do final do ensaio de 8 semanas, o veterinário atendente divulgou que houve uma descoberta consistente de acúmulo de fluido abdominal. Visto que os níveis baixos de albumina no soro levaram a um desequilíbrio osmótico entre a circulação e os tecidos, pode resultar no acúmulo de fluido na cavidade abdominal. Para o remanescente do período de ensaio, os painéis químicos foram ordenados serem realizados nas amostras de sangue bissemanais sendo enviadas para teste. Os resultados destes testes quanto aos níveis de albumina são são resumidos na Tabela 17. Metade dos controles (4/8) tiveram acúmulo significante de fluido na cavidade abdominal observado na necropsia. Dos controles que tiveram acúmulo de fluido, 50% destes tiveram uma classificação grave de mais do que 200 ml de fluido recuperado. Nenhum dos vacinados tiveram qualquer acúmulo de fluido (Tabela 23). Esta diferença não foi significante (p = 0,2118). Houve uma correlação interessante com os níveis de albumina do soro e contagens de plaqueta. Todos os cães que desenvolveram trombocitopenia tiveram valores de albumina abaixo do normal. O estado de vacinação pareceu afetar claramente os níveis de albumina no soro com 6/8 dos controles 75%) estando abaixo de 75% do valor mínimo para a concentração de albumina no soro onde apenas 3/8 (25%) dos vacinados caíram a este nível (Tabela 17).
[000130] Legenda da figura: classificação - anormal - clinicamente significante - cães percentuais com albumina de soro - cães percentuais com albumina de soro, 1,9 mais do que um dia - * como definido pelo Manual Merck como o limite inferior - **“clinicamente significante” é definido como 75% do valor mínimo para mais do que um dia.
[000131] Tabela de Sumário de Todos os Resultados: para testar e capturar a gravidade de todos estes resultados de complexo, uma tabela de sumário foi criada (Tabela 18). Nesta tabela, apenas os registros clinicamente significantes (graves) são examinados para cada parâmetro medido neste ensaio. O registro de gravidade médio para os controles é de 14,6 em comparação com 3,5 para as vacinas. Esta diferença dramática destaca a eficácia do produto de teste em todos os vacinados vs. controles.
[000132] O desafio foi eficaz e mais potente do que planejado quando 100% dos controles desenvolveram trombocitopenia, tituladores altos para E. canis, sinais clínicos graves, perda de peso e dois dos cães tiveram que ser submetidos à eutanásia.
[000133] Quando leva-se em conta a censura quanto à mortalidade, a incidência de trombocitopenia grave, a variável primária, foi mostrada ser menor nos vacinados do que nos controles e que a diferença foi significante (p = 0,0213).
[000134] A vacinação pareceu ter um efeito na mortalidade como 25% dos controles e nenhum dos vacinados teve que ser submetido à eutanásia para pós-desafios de razões humanas.
[000135] Perda de peso severa foi experimentada pelos cães no grupo de controle com alguns cães perdendo quase 25% de seu peso corporal durante as oito semanas pós-desafio. A incidência de perda de peso severa foi menor em vacinados do que os controles e que a diferença foi extremamente significante (p = 0,0042).
[000136] A diferença entre os vacinados e os controles para outros parâmetros sanguíneos que atingiram níveis graves são foram muito significantes embora alguns estiveram muito próximos. Aqueles incluíram WBCs (p = 0,08221), hematócrito (p = 0,0534) e hemoglobina (p = 0,2118).
[000137] A detecção de PCR de E. canis no sangue equiparou precisamente os resultados atingidos quanto à incidência de trombocitopenia.
[000138] Três dos cães no grupo vacinado nunca mostraram quaisquer sinais clínicos de infecção ou tiveram um nível detectável de E. canis no sangue por PCR. Entretanto, a sorologia indicou que estes três cães pareceram ter uma resposta anamnéstica a E. canis pós-desafio, indicando que estes foram expostos ao material de desafio virulento.
[000139] O acúmulo de fluido no abdômen como um resultado de deficiências de albumina no sangue foi apenas visto nos cães de controle e não nos vacinados.
[000140] Sinais clínicos incluindo depressão, descarga nasal, descarga ocular, epistaxia, desidratação e morte foram o mais severo nos cães de controle em comparação com os vacinados, entretanto, as diferenças não foram significantemente diferentes entre os grupos (p = 0,4364).
[000141] Picos de temperatura retal pós-desafio foram mais comuns nos cães de controle.
[000142] A vacinação ou injeções de desafio produziram qualquer reação observável nos cães.
[000143] Na necrópsia, a observação de esplenomegalia foi visto apenas nos controles.
[000146] Deve ser entendido que esta invenção não está limitada às configurações particulares, etapas de processo e materiais divulgados neste como tais configurações, etapas de processo e materiais podem variar um pouco. Também deve ser entendido que a terminologia utilizada é usada para o propósito de descrever formas de realização particulares apenas e não é pretendido ser limitante, visto que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações anexas e seus equivalentes.
Claims (5)
1. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende(a) uma E.CANIS associada a célula, inativada por formalina, que foi desenvolvida em uma célula canina;(b) um adjuvante compreendendo trealose 6,6‘-dimicolato; e(c) um sistema de solvente compreendendo 90:10:1 clorofórmio:metanol:água.
2. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a célula canina é uma célula de medula óssea canina.
3. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a célula canina tem o número de acesso ATCC PTA-10545.
4. Processo para produzir a composição de vacina, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de:(a) desenvolver E. CANIS em uma célula canina;(b) inativar a E. CANIS com formalina;(c) concentrar a E. CANIS inativada; e(d) misturar a E. CANIS inativada com um adjuvante compreendendo trealose 6,6’-dimicolato e um sistema de solvente não polar que compreende um adjuvante lipofílico.
5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a célula canina tem o número de acesso ATCC PTA-10545.
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