KR101857938B1 - 에를리키아 카니스에 대한 백신 - Google Patents
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Abstract
면역화 유효량의 이. 카니스(E. canis) 박테린을 포함하는 백신 및/또는 면역원성 조성물이 기술된다. 또한, 이러한 백신 및/또는 면역원성 조성물을 제공함으로써 이. 카니스에 대해 대상체를 면역화하는 방법이 또한 개시된다.
Description
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 미국 가출원 일련 번호 61/360,969 (2010년 7월 2일 출원)를 우선권으로 청구하고, 이의 내용은 이에 의해 전문이 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 에를리키아 카니스(Ehrlichia canis) 박테리아에 의해 야기되는 개 단핵구성 에를리히아증 (CME: Canine Monocytic Ehrlichiosis)에 대한 면역원성 조성물 및 백신, 및 관련 방법에 관한 것이다.
배경
개 단핵구성 에를리히아증 (CME)은 에를리키아 카니스 (이. 카니스(E. canis)) 박테리아에 의해 야기되는 개의 중증 리케치아성(rickettsial) 질환이다. 이. 카니스는 갈색 개 진드기(Brown Dog Tick) (리피세팔루스 산구이네우스(Rhipicephalus sanguineus))를 통해 개에서 개로 확산된다. 감염 후 2 내지 3주의 인큐베이션 기간 후, 개가 이러한 질환의 급성기, 무증상기 및 만성기로 진행될 수 있다. 급성기에서, 임상 징후는 경도 내지 중증 혈소판감소증, 백혈구감소증, 빈혈, 졸음증, 및 체중 감소에 이를 수 있다. 2개월 후, 대부분의 개는 수개월 또는 수년 지속되는 무증상기에 진입할 것이고, 이러한 기 동안 낮은 혈액 값이 지속될 수 있지만, 임상 징후는 최소이다. 감염된 개들 중 적은 비율은 열대성 개 범혈구감소증 (TCP: Tropical Canine Pancytopenia)으로 공지된, 이러한 질환의 중증 형태가 발달될 수 있다. 지속적인 골수 억제, 출혈, 신경 장애, 말초 부종 및 중증 체중 감소가 TCP의 특성이다. 저혈압성 쇼크가 발달되어, 사망에 이를 수 있다. 지금까지의 이. 카니스에 대한 면역원성 조성물의 보고서 [예를 들어, 문헌 [Mahan et al., Onderstepoort J. Vet. Res. 72(2):119-128 (2005)]; 미국 2006/0188524A1 참조]에도 불구하고, 이. 카니스에 대한 효과적인 백신이 실연되지 않았다. 따라서, CME 및/또는 TCP에 대해 보호하는 백신이 요구된다.
본원에서의 임의의 참고문헌의 인용은 이같은 참고문헌이 본 출원에 대한 "선행 기술"로서 이용가능하다고 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
발명의 개요
본 발명은 에를리히아증의 원인에 대한 방어 면역 반응을 촉진하기 위한 백신 및/또는 면역원성 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 백신 조성물 및/또는 면역원성 조성물은 1차 백신으로서 대상체에 투여되는 경우에 대상체에서 최소 (존재하는 경우)의 체액성 면역 반응을 유발하는 작용제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 1차 백신으로서 투여되는 경우에 대상체에서 최소 (존재하는 경우)의 체액성 면역 반응을 유발하지만 여전히 방어 면역 반응을 유발하는 작용제를 포함한다. 한 이같은 실시양태는 개 골수 세포주에서 성장된 불활성화된 이. 카니스를 포함하는 백신이다. 이러한 유형의 특정 실시양태에서, 백신은 아주반트(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 유형의 몇몇 실시양태에서, 아주반트는 코드 팩터(Cord Factor)이다. 더욱 특정한 실시양태에서, 코드 팩터 아주반트는 클로로포름 용매 시스템에 용해된다.
한 측면에서, 본 발명은 대상체에게의 최초 투여 (예를 들어, 1차 백신으로서의 투여) 시 항원에 대한 유의한 항체의 생산을 유발하지 않는 이. 카니스로부터의 항원을 포함하는 백신 조성물 및/또는 면역원성 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명의 몇몇 실시양태는 대상체에 대한 조성물의 최초 투여/1차 백신이 최소의 체액성 반응을 유발하는, 면역화 유효량의 이. 카니스로부터의 항원을 포함하는 면역원성 조성물 및/또는 백신 조성물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 최초 투여/1차 예방접종 후 측정가능한 체액성 반응을 유발하지 않는 한편 대상체에서 방어 면역 반응을 유발하는 면역원성 조성물 및/또는 백신을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 1차 예방접종/최초 투여에서의 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 세포성 면역 반응을 유발하는 한편, 최소의 및/또는 측정불가능한 (예를 들어, 검출불가능한) 체액성 반응을 유발한다.
따라서, 관련 측면에서, 본 발명은 면역화 유효량의 이. 카니스로부터의 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 이러한 유형의 몇몇 실시양태에서, 백신이 1차 백신으로서 투여되는 경우에 항원은 대상체에서 방어 면역 반응을 유발하지만, 최소의 체액성 반응을 유발한다. 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 세포 상에서 성장 및/또는 계대된 이. 카니스로부터 생성된 항원을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이. 카니스는 개과 동물 세포주 상에서 성장 및/또는 계대된다. 더욱 특정한 실시양태에서, 세포주는 개 골수 세포주일 수 있다. 더욱 특정한 실시양태에서, 이러한 세포는 ATCC 등록 번호가 PTA-10545이고/이거나, ATCC 등록 번호가 PTA-10545인 세포의 식별 특성 중 하나 이상 및/또는 이러한 특성 모두를 지니는 것이다. 특정 실시양태에서, 이. 카니스 항원은 ATCC 등록 번호가 PTA-10546인 세포-회합된 이. 카니스이고/이거나, ATCC 등록 번호가 PTA-10546인 세포-회합된 이. 카니스의 식별 특성 중 하나 이상 및/또는 이러한 특성 모두를 지니는 것이다.
본 발명은 ATCC 등록 번호가 PTA-10546인 세포-회합된 이. 카니스를 추가로 제공한다. 본 발명은 ATCC 등록 번호가 PTA-10546인 세포-회합된 이. 카니스의 식별 특성 중 하나 이상 및/또는 이러한 특성 모두를 지니는 세포-회합된 이. 카니스를 또한 제공한다. 또한, 본 발명은 ATCC 등록 번호가 PTA-10545인 세포를 제공한다. 본 발명은 ATCC 등록 번호가 PTA-10545인 세포의 식별 특성 중 하나 이상 및/또는 이러한 특성 모두를 지니는 세포를 추가로 제공한다.
또한, 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물의 이. 카니스 항원은 불활성화될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 불활성화된 이. 카니스 항원은 포르말린으로 불활성화된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 아주반트를 포함하는 백신 및/또는 면역원성 조성물을 제공한다. 이러한 유형의 몇몇 실시양태에서, 아주반트는 친유성 아주반트이다. 몇몇 실시양태에서, 친유성 아주반트는 비-극성 용매 내에 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물 및/또는 백신은 소수성 아주반트와 조합될 수 있고 백신 및/또는 면역원성 조성물에 포함된 극성 용매 시스템과 혼화성이게 만들어진 항원을 포함한다. 더욱 특정한 실시양태에서, 아주반트는 트레할로스 6,6'-디미콜레이트와 같은 코드 팩터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 트레할로스 6,6'-디미콜레이트는 비-극성 용매 내에 있다. 더욱 특정한 실시양태에서, 아주반트는 클로로포름 용매 시스템에 용해된 트레할로스 6,6'-디미콜레이트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 클로로포름 용매 시스템은 약 65-95％ 클로로포름 (부피/부피)을 포함한다. 더욱 특정한 실시양태에서, 클로로포름 용매 시스템은 약 80-95％ 클로로포름 (부피/부피)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 클로로포름 용매 시스템은 약 5.0-30％ 메탄올 (부피/부피)을 포함한다. 더욱 특정한 실시양태에서, 클로로포름 용매 시스템은 약 7.5-15％ 메탄올 (부피/부피)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 클로로포름 용매 시스템은 약 0.5-5.0％ 물 (부피/부피)을 포함한다. 더욱 특정한 실시양태에서, 클로로포름 용매 시스템은 약 0.75-2.5％ 물 (부피/부피)을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 클로로포름 용매 시스템은 약 90％ 클로로포름:10％ 메탄올:1.0％ 물 (각각 부피 대 부피)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 백신 및/또는 면역원성 조성물은 ATCC 등록 번호가 PTA-10545인 기탁 세포에서 성장된 포르말린-불활성화 세포-회합된 이. 카니스, 및 90:10:1 클로로포름:메탄올:물에 용해된 트레할로스 6,6'-디미콜레이트를 포함하는 아주반트를 포함한다. 클로로포름 용매 시스템에 용해된 코드 팩터, 예컨대 트레할로스 6,6'-디미콜레이트를 포함하는 조성물 또한 본 발명의 일부이고, 아주반트로서의 이의 용도 또한 그러하다.
추가적으로, 본 발명은 이. 카니스 박테리아의 성장에 특히 적절한 세포 및/또는 세포주 상에서 성장된 이. 카니스 박테리아를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물용 항원을 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 따라서, 본 발명은 이. 카니스 항원을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 이. 카니스는 대식세포 상에서 성장된다. 몇몇 실시양태에서, 이. 카니스 박테리아는 대식세포-유사 세포주 상에서 성장된다. 몇몇 실시양태에서, 이. 카니스는 세포-회합된 이. 카니스 항원이 생산되도록 개 골수 (DBM: Dog Bone Marrow) 세포 상에서 성장된다. 특정 실시양태에서, 이. 카니스 박테리아는 DBM 세포주 상에서 성장된다. 특정 실시양태에서, 이러한 DBM 세포주는 DBM (WCS) MCS+12, ATCC 등록 번호 PTA-10545이다. 특정 실시양태에서, 이. 카니스는 세포-회합형, WS MS+3, 19517-001, ATCC 등록 번호 PTA 10546이다. 별법적인 실시양태에서, 이. 카니스는 DH-82 세포주 상에서 성장된다.
본 발명의 이. 카니스 항원은 불활성화된 이. 카니스일 수 있다. 특정 실시양태에서, 이. 카니스 항원은 박테린(bacterin)이다. 몇몇 실시양태에서, 불활성화된 이. 카니스 항원은 세포-회합형이다.
본 발명은 이. 카니스에 대해 대상체를 면역화하는 방법을 또한 제공한다. 이같은 방법은 대상체에게 본 발명의 백신 조성물 및/또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태는 본 발명에 따른 백신 및/또는 면역원성 조성물을 대상체에게 피내 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 이같은 방법은 본 발명에 따른 백신 및/또는 면역원성 조성물을 대상체에게 피하 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 이같은 방법은 본 발명에 따른 백신 및/또는 면역원성 조성물을 대상체에게 경구 투여하는 것을 포함한다. 이러한 유형의 특정 실시양태에서, 동물 대상체는 개과 동물이다. 또 다른 실시양태에서, 동물 대상체는 고양잇과 동물 (예를 들어, 집고양이)이다. 특정 실시양태에서, 제2 용량의 백신 조성물 및/또는 면역원성 조성물이 부스터(booster)로서 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 부스터는 최초 용량의 백신 조성물로부터 약 21일 후에 투여된다.
본 발명은 본 발명의 백신 조성물 및/또는 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 이. 카니스 항원을 생산하는 방법을 제공한다. 백신 조성물 및/또는 면역원성 조성물은 본 발명의 항원을 수의학상 적절한 부형제와 혼합함으로써 제조된다. 이러한 유형의 몇몇 실시양태에서, 항원은 세포-회합된 이. 카니스 박테린이다. 특정 실시양태에서, 수의학상 적절한 부형제는 클로로포름 용매 시스템에 용해된 코드 팩터 아주반트이다.
본 발명의 이러한 측면 및 기타 측면이 도면, 상세한 설명 및 실시예를 참조로 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 대조군 동물 (삼각형) 및 예방접종 동물 (사각형)의 경시적인 평균 챌린지(challenge)-후 백혈구 카운트의 그래프식 표현이다. 진한 선은 문헌 [Merck Manual]에 따라 정상인 것으로 간주되는 백혈구 카운트의 최소 수준을 가리킨다.
도 2는 대조군 동물 (삼각형) 및 예방접종 동물 (사각형)의 경시적인 평균 챌린지-후 적혈구 카운트의 그래프식 표현이다. 진한 선은 문헌 [Merck Manual]에 따라 정상인 것으로 간주되는 적혈구 카운트의 최소 수준을 가리킨다.
도 3은 대조군 동물 (삼각형) 및 예방접종 동물 (사각형)의 경시적인 평균 챌린지-후 헤모글로빈 값의 그래프식 표현이다. 진한 선은 문헌 [Merck Manual]에 따라 정상인 것으로 간주되는 헤모글로빈 카운트의 최소 수준을 가리킨다.
도 4는 대조군 동물 (삼각형) 및 예방접종 동물 (사각형)의 경시적인 평균 챌린지-후 적혈구용적률 값의 그래프식 표현이다. 진한 선은 문헌 [Merck Manual]에 따라 정상인 것으로 간주되는 적혈구용적률 카운트의 최소 수준을 가리킨다.
도 5는 대조군 동물 (삼각형) 및 예방접종 동물 (사각형)의 경시적인 평균 챌린지-후 혈소판 카운트의 그래프식 표현이다. 진한 선은 문헌 [Merck Manual]에 따라 정상인 것으로 간주되는 혈소판 카운트의 최소 수준을 가리킨다.
도 2는 대조군 동물 (삼각형) 및 예방접종 동물 (사각형)의 경시적인 평균 챌린지-후 적혈구 카운트의 그래프식 표현이다. 진한 선은 문헌 [Merck Manual]에 따라 정상인 것으로 간주되는 적혈구 카운트의 최소 수준을 가리킨다.
도 3은 대조군 동물 (삼각형) 및 예방접종 동물 (사각형)의 경시적인 평균 챌린지-후 헤모글로빈 값의 그래프식 표현이다. 진한 선은 문헌 [Merck Manual]에 따라 정상인 것으로 간주되는 헤모글로빈 카운트의 최소 수준을 가리킨다.
도 4는 대조군 동물 (삼각형) 및 예방접종 동물 (사각형)의 경시적인 평균 챌린지-후 적혈구용적률 값의 그래프식 표현이다. 진한 선은 문헌 [Merck Manual]에 따라 정상인 것으로 간주되는 적혈구용적률 카운트의 최소 수준을 가리킨다.
도 5는 대조군 동물 (삼각형) 및 예방접종 동물 (사각형)의 경시적인 평균 챌린지-후 혈소판 카운트의 그래프식 표현이다. 진한 선은 문헌 [Merck Manual]에 따라 정상인 것으로 간주되는 혈소판 카운트의 최소 수준을 가리킨다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 이. 카니스의 병독성 균주의 챌린지 후 혈소판감소증, 백혈구감소증, 빈혈, 및 체중 감소의 발생률을 감소시킬 수 있는 면역원성 조성물 및 백신을 제공한다. 본 발명의 결과는 감염된 개에 관한 기존에 공개된 보고서들과 불일치하는데, 이러한 개는 항생제 치료에 의해 치유되었지만 후속 질환에 걸리기 쉬웠다 (예를 들어, 문헌 [Breitschwerdt et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 42(2) 362-368 (1998)] 참조). 이러한 종래의 보고서들은 유기체에 대한 노출 후 방어 면역이 발달되지 않는다는 것을 시사한다. 정면으로 대조적으로, 본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물 및/또는 백신 조성물을 대상체에게 투여하는 것에 의해 대상체에서 개 단핵구성 에를리히아증 (CME) 및/또는 열대성 개 범혈구감소증 (TCP)을 호전시키고/시키거나 예방하는 방법을 제공한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 이. 카니스에 대한 효과적인 백신을 제공한다
본원에서 개시된 바와 같이, 이. 카니스 챌린지 모델의 발달 동안, 개에서 이. 카니스에 대한 체액성 항체 반응이 급속하게 발달된다. 항-이. 카니스 항체의 출현은 혈소판 카운트의 급속한 강하, 또는 혈소판감소증, 및 여러 기타 임상 적응증의 개시와 상관된다. 그러나, 개에서 강력한 체액성 항체 반응을 유도하는 백신은 질환의 임상 징후로부터 개를 보호하지 못한다. 실제로, 이. 카니스에 대한 강력한 항체 반응을 일으키는 예방접종된 개는 챌린지 후에 예방접종되지 않은 대응물보다 임상 결과가 더 나쁠 수 있다. 어떠한 특정 이론에도 한정되지 않으면서, 본원에 개시된 결과는 옵소닌화 프로세스를 통해 세포의 내부에 접근하기 위해 이. 카니스에 대해 생산된 항체를 사용하여 이. 카니스와 일관되는 것으로 보인다.
본 발명은 면역원성 조성물 및/또는 백신을 위한 항원 자체를 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 이러한 방법은 이. 카니스를 특정 세포주 상에서 성장시켜 항원을 생산하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 수의학상 적절한 부형제와 부가혼합된다. 더욱 특정한 실시양태에서, 본 발명은 개 골수 세포주 상에서 성장된 불활성화된 이. 카니스를 포함하는 조성물을 포함한다. 본 발명의 면역원성 조성물 및/또는 백신은 아주반트를 추가로 포함할 수 있다.
이. 카니스가 어떤 세포를 감염시킬지를 구별하는 선별 메카니즘은 빈약하게 이해되지만, 감염에 적절한 세포는 통상적으로 주요 조직적합성 복합체 (MHC: Major Histocompatibility Complex) 클래스 II 항원 수용체를 발현한다. 문헌 [Harris et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 96:239-243 (2003)]에서, 이. 카니스가 자신이 감염시키는 세포의 표면 상의 MHC 클래스 II 수용체의 발현을 하향 조절하는 메카니즘을 면역 감시를 피하기 위한 가능한 메카니즘으로서 보유한다는 것이 입증되었다. 진드기 종으로부터 유래된 세포주가 포유동물 MHC 클래스 II 수용체를 발현하지 않는다는 것이 명백한 한편, 문헌 [Singu et al., Cellular Microbiology, 8(9), 1475-1487 (2006)]에서 이. 카니스가 자신이 척추동물 숙주를 감염시키는지 또는 무척추동물 숙주를 감염시키는지 여부에 따라 자신의 표면 단백질 발현을 변경시킨다는 것이 입증되었다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 백신 용도에 최적화된 이. 카니스 항원을 산출하는 것과 동시에 이. 카니스의 성장을 수용하는 세포 및/또는 세포주를 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "대상체"는 이. 카니스에 의해 감염될 수 있는 임의의 종을 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 대상체는 비-인간 동물 대상체이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 개과 동물 또는 고양잇과 동물이다. 몇몇 실시양태에서, 동물 대상체는 개과 동물이다. 다른 실시양태에서, 동물 대상체는 고양잇과 동물이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "개과 동물"은 달리 지시되지 않는 한 모든 집개, 카니스 루푸스 파밀리아리스(Canis lupus familiaris) 또는 카니스 파밀리아리스(Canis familiaris)를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "면역화 유효량"은 백신을 생성시키는데 사용된 이. 카니스의 균주 또는 균주들에 따라 다를 수 있고, 방어 면역 반응을 일으키는데 충분한 임의의 양일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "방어 면역 반응"은 감염의 하나 이상의 적응증에 대한 보호를 산출하는 대상체에서의 면역 반응일 수 있지만, "방어 면역 반응"은 임의의 감염 적응증으로부터의 완전한 보호를 필요로 하지 않는다. 그보다는, "방어 면역 반응"은 챌린지 후 기저 감염의 증상들이 적어도 감소되기에, 및/또는 증상을 야기하는 세포성, 생리학적 또는 생화학적 기저 원인 또는 메카니즘 중 하나 이상이 감소 및/또는 제거되기에 충분한 면역 반응일 수 있다. 이러한 문맥에서 사용된 바와 같은 "감소된"은 감염의 생리학적 상태만이 아니라 감염의 분자성 상태가 포함되는 감염 상태에 비교했을 때를 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명의 백신은 방어 면역 반응을 제공하도록 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "최소의 체액성 반응을 유발함"은 대상체 (예를 들어, 개과 동물)에게 1차 예방접종에서 이. 카니스를 포함하는 백신 조성물을 투여하는 것이 백신 조성물에 대한 1차 노출로부터 21일 후에 대상체로부터 수득된 시험 혈청 내에서의 이. 카니스에 대한 항체의 검출을 초래하지 않는다는 것을 의미하고, 이때 이러한 검출은 시험 혈청의 1:40 희석물을 고정된 이. 카니스에 노출시키고, 모든 미결합 물질을 제거하도록 충분히 세척하고, 대상체의 종에 적합한 형광-표지 항-IgG 항체를 부가하고, 모든 미결합 물질을 제거하도록 충분히 세척한 후, 고정된 이. 카니스에 이. 카니스에 대해 특이적인 항체를 통해 결합된 형광-표지 항-IgG 항체로 인한 형광에 대해 시각적으로 검사하는 절차에 의해 수행된다. 특정 실시양태에서, 백신의 단일 후속 부스터 예방접종을 대상체에게 투여하는 것은 이. 카니스에 대한 유의한 체액성 반응을 여전히 유발하지 않고, 상기 1차 백신에 대해 수행된 방법에 의해 결정되는 경우에 시험 혈청 내의 이. 카니스에 대한 항체 (조금이라도 검출가능하다면)를 검출하기 위해 부스터 백신 조성물에의 노출 후 동물 대상체로부터 수득된 시험 혈청의 1:160 이하의 희석을 필요로 한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "안정적으로 감염된" 세포주는 세포 배양물의 10회 이상의 계대에 걸쳐 계속 감염되어 있는 세포주를 지칭한다.
항원
본 발명의 이. 카니스 항원은 이. 카니스의 다수의 공급원 또는 균주로부터 단리될 수 있다. 이. 카니스의 이같은 균주의 예로는 에보니(Ebony), 브로드풋(Broadfoot), 플로리다(Florida), 이스라엘(Israel) 611, 고가시마(Kogashima) 1, 루이지애나(Louisiana), 오클라호마(Oklahoma), 베네주엘라(Venzuela), 노쓰 캐롤라이나 주립 대학 (NCSU: North Carolina State University) 균주 제이크 (Jake), 및 NCSU 단리물인 데몬(Demon), D J, 및 퍼지(Fuzzy)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 몇몇 실시양태에서, 항원은 이. 카니스 박테린일 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 항원은 이용가능한 임의의 적절한 방법에 의해 불활성화된 이. 카니스 박테리아로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 이같은 방법의 예로는 열, 포름알데히드, 포르말린, 비-에틸렌 아민, 방사선 조사, 및 베타-프로피오락톤 처리가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 이. 카니스 박테리아는 포르말린 처리에 의해 불활성화될 수 있다.
특정 실시양태에서, 이. 카니스 항원은 하나 이상의 항원이 대상체에게 제공될 때 대상체가 외래물로 인식하지 않을, 즉 대상체가 하나 이상의 항원에 대한 체액성 반응을 개시하지 않거나 또는 이에 대한 최소의 체액성 반응을 개시할 하나 이상의 항원을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 하나 이상의 이. 카니스 항원은 항체의 생산을 유발하지 않을 것이거나, 또는 별법적으로, 이러한 하나 이상의 이. 카니스 항원에 대한 최소의 항체 생산을 유발할 것이다. 또한, 이같은 이. 카니스 항원은 이러한 하나 이상의 이. 카니스 항원에 대한 방어 면역 반응을 유발할 것이다. 본 발명은 개과 동물에서 체액성 면역 반응을 거의 유발하지 않거나 유발하지 않지만 여전히 개과 동물에서 방어 면역 반응을 유발하는 것을 작용제로서 이용하는, 개과 동물에서 면역 반응에 이르는 작용제를 포함하는 유형의 에를리히아증에 대해 개과 동물에 예방접종하기 위한 면역원성 조성물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이러한 방어 면역 반응은 적어도 부분적으로 세포-매개 면역 반응에 기인한다.
세포
적합한 세포 및/또는 세포주 상에서 본 발명의 이. 카니스 박테리아가 성장될 수 있다. 따라서, 세포주 상에서 성장 또는 증식된 이. 카니스 박테리아로부터 이. 카니스로부터의 항원이 생산될 수 있다. 이같은 세포 및 세포주의 예로는 1차 세포 (예를 들어, 대식세포) 및/또는 세포주/연속 세포주 예컨대 하기에 열거된 것들이 포함된다:
1차 세포주:
연속 세포주:
본 발명의 한 측면에서, 세포주는 개과 동물 대식세포에 의해 발현되는 것과 유사한 표면 수용체를 발현하는 대식세포-유사 세포주이다. 관련 실시양태에서, 세포주는 대식세포 세포주이다. 이러한 유형의 특정 실시양태에서, 사용된 세포주는 ATCC 등록 번호가 CRL-10389인 DH-82 세포주이다.
본 발명은 단핵구 또는 대식세포-유사 포유동물 세포주 상에서 성장된 이. 카니스를 포함한다. 몇몇 예에서, 백신 제작을 위해 연속적이고 신뢰할 수 있는 성장 기판을 제공하도록 이러한 세포주가 불멸화되었다. 문헌 [Wellman et al., In Vitro Cell Develop Biol 24:223-228, (1988)]에 기술된 DH-82 세포주와 같은 신생물성 전구 세포로부터 불멸화된 세포가 생성될 수 있다. 바이러스 유전자의 사용에 의해 세포를 불멸화시킬 수 있다. 원숭이 바이러스 40 (SV40) T 항원이 불멸화된 세포를 생성시키기 위한 매우 신뢰할 수 있는 방식인 것으로 나타났고, SV40으로 형질전환된 인간 세포와 혼성화된 개과 동물 복막 대식세포의 체세포 하이브리드가 문헌 [Stephenson et al., Am J Vet Res 41 (2):234-40, (1980)]에 의해 연속 방식으로 이. 카니스를 성장시키는데 사용되었다. 여러 바이러스, x선, 유기 용매, 금속 화합물 및 핵산이 포함되는 광범위한 작용제가 세포를 불멸화시키는데 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 문헌 [Rhim, Annals NY Acad of Sci. 919:16-25 (2000)]에서 광범위하게 고찰되었다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 이. 카니스는 이같은 세포주에서 성장된 후, 이. 카니스 박테린 항원을 형성하도록 불활성화되었다.
몇몇 실시양태에서, 세포주는 개 골수 (DBM) 세포주이다. 특정 실시양태에서, DBM 세포주는 문헌 [Gaunt et al., J. Clin. Microbio. 34 (6):1429-1432, (1996)]에 기술된 것이다. 특정 실시양태에서, DBM 세포주는 ATCC 등록 번호 PTA-10545의 기탁된 균주이다. 몇몇 실시양태에서, 이러한 세포주는 이. 카니스로 안정적으로 감염된 DBM 세포주이다. 이러한 유형의 특정 실시양태에서, 세포-회합된 이. 카니스가 기탁되었고, 이의 ATCC 등록 번호는 PTA-10546이다. 별법적인 실시양태에서, 세포주는 곤충 세포주이다. 이러한 유형의 특정 실시양태에서, 곤충 세포주는 진드기 세포주이다. 한 특정 실시양태에서, 이러한 곤충 세포주는 익소데스 스카풀라리스(Ixodes scapularis)로부터 단리된 IDE8 진드기 세포주이고, 이는 ATCC에 기탁되었고 ATCC 등록 번호는 CRL-11973이다.
이. 카니스의 증식
이. 카니스로 감염된 세포 배양물을 플라스크에서 성장시킬 수 있고, 이어서 더 큰 플라스크로 보내 면역원성 조성물 및/또는 백신을 제조하는데 필요한 더 큰 부피의 물질을 수득할 수 있다. 별법적으로, 감염된 세포 배양물을 플라스크로부터 후속 롤러(roller) 병, 스피너(spinner) 플라스크, 세포 큐브, 생물반응기, 또는 면역원성 조성물 및/또는 백신을 블렌딩하는데 필요한 적절한 양의 물질을 수득하기 위해 대규모로 세포 배양물을 성장시킬 수 있는 임의의 기구로 보낼 수 있다. 감염된 배양물을 적절한 배지에서 동결시키고, 추후에 세포 배양물의 배양에 사용할 수 있다.
세포는 부착성일 수 있고, 미세담체에 부착되는 것을 포함하여 성장 플라스크 또는 기구에 부착될 수 있거나, 또는 별법적으로 현탁액에서 부유할 수 있다. 부착성 세포를 제거하는 방법은 기계적인 세포 긁개를 사용하여 플라스크로부터 수동으로 긁어내는 것, 또는 트립신 용액으로 처리하여 세포를 플라스크로부터 제거하고, 이어서 사용되지 않은 트립신을 단백질 용액으로 중화하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 그 후, 세포를 원심분리하여 농축하고, 적절한 동결 배지 내에 재현탁시킬 수 있다. 동결 배지는 10-90％ 소 태아 혈청 및 1-20％ 디메틸 술폭시드 (DMSO)를 함유하는 배지를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 상이한 세포주들에 대해 더욱 적절할 수 있고 해동 및 배양 재개 시 높은 수준의 생존력을 초래할 수 있는 기타 적절한 냉동보존제를 사용할 수 있다.
감염된 배양물을 재개시키기 위해, 감염되지 않은 세포를 동결기로부터 제거하여 적절한 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 1×105개의 DBM 세포를 함유하는 1 ㎖ 바이알을 신속하게 해동시키고, DBM 세포의 성장을 위한 적절한 배지를 함유하는 T-75 조직 배양 플라스크 (75 ㎠ 표면적) 내에 놓는다. 한 특정 실시양태에서, 배지는 피셔(Fischer) 완전 성장 배지이다. 예를 들어, 200 ㎖의 말 혈청을 770 ㎖의 피셔 배지에 첨가하는 것에 의해 1 리터의 DBM 세포용 피셔 완전 성장 배지가 제조된다. 10 ㎖의 2 ㎎/㎖ 히드로코르티손 용액, 10 ㎖의 200 mM 글루타민 용액 및 10 ㎖의 1M HEPES 용액을 첨가하는 것에 의해 이러한 배지가 완성된다.
일단 DBM 배양물이 적절한 수준의 조밀도 (10-90％)에 도달하면, 배양물이 감염될 준비가 된 것이다. 감염된 배양물의 바이알을 동결기로부터 제거하고, 신속하게 해동시키고, 성장 중인 배양물 상에 분배한다. CO2를 보충하면서 또는 보충하지 않으면서 뚜껑이 있는 플라스크 또는 통기 플라스크에서 배양물을 36±2℃에서 성장시킨다. 필요하다면 세포를 신선한 배지로 보내는 것에 의해 당업자에게 통상적인 방법에 따라 배양물을 유지시킨다. 몇 주 후, 배양물을 항-이. 카니스 항체를 사용하는 간접 형광 현미경에 의해 또는 기타 적절한 방법에 의해 감염 수준에 대해 점검할 수 있다. 배양물은 90％ 이상의 감염 수준에 도달할 수 있다. 더 높은 감염 수준이 더욱 바람직한데, 배양물 부피 당 더 높은 수율의 항원 물질을 초래하기 때문이다. 더 큰 플라스크, 롤러 병 또는 기타 적절한 배양 용기로의 배양물 이동에 의해, 감염된 배양물을 더 큰 부피의 배양물로 보낼 수 있다.
이. 카니스에 의한 세포 배양물의 감염을 김자(Giemsa) 염색, 캠코 디프퀵(Camco Difquick) 염색 또는 아크리딘 오렌지와 같은 염료로 염색된 세포의 현미경 분석을 포함하지만 이에 한정되지 않는 여러 방법에 의해 결정할 수 있다. 또한, 이. 카니스에 대해 특이적인 항체를 직접적으로 또는 간접적으로 형광 마커로 표지할 수 있고, 특정 형광 마커에 대한 적절한 파장에서 형광 광 현미경으로 관찰할 수 있다. 정량적 중합효소 연쇄 반응 (qPCR) 또는 PCR을 포함하지만 이에 한정되지 않는 기타 방법이 배양물의 감염 수준을 결정하는데 사용될 수 있다.
배양물에서 특정 감염 수준을 유지하기 위해 필요하다면 감염되지 않은 세포를 배양물에 첨가할 수 있다. 감염된 배양물의 적절한 부피에 도달했을 때, 배양물을 열 또는 화학적 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 불활성화시킬 수 있다. 불활성화 전에, 얼마나 많은 불활성화-후 배양물을 블렌드에 첨가할지를 결정하는 방법으로서 배양물 내의 감염성 입자의 양을 결정하기 위해 배양물을 적정할 수 있다. 감염된 배양물을 적정하는 방법이 하기 실시예에서 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 포르말린을 0.05％의 최종 농도로 배양물에 첨가하고, 배양물을 3일 동안 36±2℃에서 혼합시킨다. 사용될 수 있는 기타 이같은 불활성화제에는 에틸렌이민 (EI, BEI), 베타 프로피오락톤 및 페놀이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 항생제 예컨대 데옥시시클린, 또는 이. 카니스가 감수성인 임의의 기타 항생제를 배양물을 불활성화시키는데 또한 사용할 수 있다.
생존력을 결정하기 위해 다수의 방법에 의해 배양물을 시험할 수 있다. 이같은 방법에는 세포 배양물 상에서의 역 적정, 비-투과성 염료를 견디는 것에 대한 막 통합성, 및 개에 주사하여 전형적인 감염 징후를 모니터링하는 것이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
일단 불활성화되면, 배양물을 다수의 방법에 의해 농축할 수 있다. 예를 들어, 비-생존성 이. 카니스의 농축을 원심분리, 한외여과, 또는 증발에 의해 수행할 수 있다. 한 특정 실시양태에서, 이. 카니스로 감염된 DBM 세포를 불활성화시킨 후, 1400×g에서 15분 동안 원심분리하여 전체 세포를 펠릿화시킨다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 혈청이 없는 피셔 배지에 재현탁시킨다. 겐타미신 또는 유사한 보존제를 오염 문제를 피하기 위해 불활성화 후에 첨가할 수 있다. 불활성화된 배양물을 농축하고 이를 취급하기 더 쉽게 만들기 위해 배양물을 혈청이 없는 피셔 배지에 원래 부피의 1/10로 재현탁시킨다. 불활성화된 농축물 내의 이용가능한 항원의 양을 크로마토그래피, 분광학 또는 다양한 유형의 특이적 면역검정이 포함되는 다수의 방법에 의해 결정할 수 있다. 대량의 항원을 희석제 및 아주반트와 블렌딩하여 허용가능한 백신을 제조할 수 있다.
면역원성 조성물 및 백신
상기 지시된 바와 같이, 본 발명의 항원 (예를 들어, 이. 카니스 박테린)을 포함하는 면역원성 조성물 및/또는 백신은 하나 이상의 제약상 허용되는 아주반트를 추가로 포함할 수 있지만, 필수적으로 그렇지는 않다. 제약상 허용되는 아주반트의 예는 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa.)] 및 [GOODMAN AND GILMAN'S, THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (10th ed. 2001)]을 참조한다. 특정 실시양태에서, 아주반트는 세포-매개 면역 반응을 자극할 수 있지만 체액성 면역은 자극하지 않는 것일 수 있다.
아주반트를 추가로 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물 및/또는 백신은 일반적으로 수용성이 아닌 하나 이상의 요소를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 아주반트는 비-극성 용매에 용해된 비-극성 용질이다. 비-극성 용매의 예로는 헥산, 벤젠, 톨루엔, 디에틸 에테르, 클로로포름 및 에틸 아세테이트가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 한 이같은 실시양태에서, 용매는 클로로포름 용매 시스템이다. 불연성이고 수의학용 생물 제제를 제작하는데 더욱 적절하기 때문에클로로포름이 일부 경우에 선호될 수 있다. 본원에서 예시된 아주반트는 클로로포름 용매 시스템 내의 트레할로스 6,6'-디미콜레이트이다.
비-극성 용매는 전형적으로 수용성이지 않고, 따라서 유전 상수가 비교적 낮지만 수용성이 양호한 극성 용매의 사용이 수용액 내의 아주반트 혼합물의 용해도를 증가시키기 위해 용매 시스템에서 사용될 수 있다. 극성 용매의 예로는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 디메틸 술폭시드 및 디메틸포름아미드가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 몇몇 실시양태에서, 비-극성 아주반트는 코드 팩터 [예를 들어, 트레할로스 6,6'-디미콜레이트]이다. 정제된 사포닌의 소수성 분획, 박테리아 지질펩티드 (Pam3CSK4) 및 모노포스포릴 지질 A를 포함하지만 이에 한정되지 않는 기타 비-극성 아주반트가 세포-매개 면역을 자극하는데 유용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 코드 팩터는 클로로포름 용매 시스템에 용해된다. 특정 실시양태에서, 클로로포름 용매 시스템은 약 65-95％ 클로로포름 (부피/부피)을 포함한다.
따라서, 클로로포름 용매 시스템의 특정 실시양태는 클로로포름 및 메탄올을 포함하는 용매 시스템을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 비-제한적인 예에서, 클로로포름 용매 시스템은 약 70％ 내지 95％ 클로로포름 및/또는 약 5％ 내지 30％ 메탄올 (부피/부피)을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 몇몇 실시양태에서, 클로로포름 용매 시스템은 0.5 -5.0 ％ 물 (부피/부피)을 추가로 포함한다. 한 비-제한적인 예에서, 클로로포름 용매 시스템은 90 부피부의 클로로포름, 10 부피부의 메탄올, 및 1 부피부의 물 [즉, 약 90％ 클로로포름:10％ 메탄올:1.0％ 물 (각각 부피 대 부피)]을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 아주반트는 클로로포름 용매 시스템에 용해된 코드 팩터 및/또는 기타 아주반트를 포함할 수 있다. 한 이같은 실시양태에서, 아주반트는 클로로포름 90 ㎖:메탄올 10 ㎖:물 1 ㎖의 클로로포름 용매 시스템에 용해된 트레할로스 6,6'-디미콜레이트이다.
특정 실시양태에서, 백신 조성물은 하나 이상의 제약상 또는 수의학상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 백신 조성물 제형에서 사용될 수 있는 담체 또는 희석제의 비-제한적인 예로는 물, 글루코스 용액, 덱스트로스/염수, 염수, 포스페이트 완충 염수 (PBS), HEPES 완충제, 피셔 배지, 행크(Hank) 용액, 및 링거(Ringer) 용액이 포함된다. 이같은 제형은 안정성, 전달성 또는 용해도를 강화하기 위한 제약상 허용되는 보조 물질, 예컨대 완충제, 장성 조정제, 습윤화제, 세제 등을 함유할 수 있다. 추가적인 활성 성분 예컨대 살박테리아제 또는 안정화제가 첨가제에 또한 포함될 수 있다. 예를 들어, 용액은 티메로살, 겐타미신, 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 또는 트리에탄올아민 올레에이트를 함유할 수 있다. 통상적인 공지된 멸균 기술에 의해 조성물을 멸균할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 백신 조성물이 광견병 바이러스, 라임병 (보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 개 디스템퍼 바이러스, 개 보르데텔라(bordetella), 개 파르보바이러스, 개 아데노바이러스, 개 코로나바이러스, 바베시아 카니스(Babesia canis), 아나플라즈마 파고사이토필룸(Anaplasma phagocytophilum), 지아디아(Giardia), 렙토스피라 인터로간스(leptospira interrogans) 예컨대 캐니콜라(canicola), 익테로헤모라지아에(icterohaemorrhagiae), 포모나(pomona), 그리포타이포사(grippotyphosa) 또는 브라티슬라바(bratislava) 혈청형 등, 또는 이들의 임의의 조합에 대한 항-병원체 성분, 또는 이들의 항원성 성분 및/또는 약독화 및/또는 사멸 단리물과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 기타 활성 성분을 추가로 포함할 수 있는 것으로 구상된다.
일부 실시양태에서, 백신 및/또는 면역원성 조성물은 투여를 용이하게 하고 투여량의 균일성을 확실히 하기 위해 투여량 단위 형태로 제형화될 수 있다. 본원에서, 백신 조성물에 관련된 바와 같은 투여량 단위는 대상체에게의 단위 투여량으로서 적절한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고, 이때 각각의 단위는 아주반트, 담체 및/또는 비히클과 함께 원하는 면역원성 효과를 일으키도록 계산된 미리 정해진 양의 이. 카니스 항원을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 및/또는 백신은 동결 건조된다.
몇몇 실시양태에서, 이. 카니스의 보균자에 대한 잠재적인 노출 시간에 의해 결정되는 일정에 따라 유효량으로 백신 및/또는 면역원성 조성물이 비경구적으로, 예를 들어, 근육내 투여, 피하 투여, 복막내 투여, 피내 투여 등으로 투여될 수 있거나 또는 면역원성 조성물 및/또는 백신이 경구적으로 또는 비내로 투여될 수 있다. 이러한 방식으로, 처치된 대상체는 천연 노출에 앞서 면역을 확립하는 시간을 가질 수 있다. 예를 들어, 전형적인 치료 일정은 잠재적인 노출로부터 적어도 42일 전의 피하 주사를 포함할 수 있다. 실시양태에서, 백신 조성물의 1회를 초과하는 투여를 대상체에게 제공할 수 있다. 비-제한적인 예로서, 대상체의 잠재적인 노출로부터 1차 투여는 약 42일 전이고, 2차 투여는 약 21일 전이다. 그러나, 면역 개시가 더 빠른 시간 과정에서 발생할 수 있다.
백신 투여
본 발명의 백신은 액체, 에멀젼, 건조 분말 (동결 건조 분말 포함)로서 및/또는 분무제에서 임의의 비경구 경로를 통해, 정맥 내로, 복막 내로, 피부 내로, 난절에 의해, 피하로, 근육 내로 투여될 수 있거나, 또는 점막 경로에 의해, 예를 들어, 경구적으로, 비내로, 에어로졸로서, 점안에 의해, 난내(in ovo) 투여에 의해 접종될 수 있거나, 또는 동결 건조 분말로서 이식될 수 있다.
ATCC 기탁
하기의 생물학적 물질의 배양물이 특허 절차 상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 요건을 충족시키는 조건 하에 루이지애나 주립 대학교 농기계 대학, LSU 농학 센터(Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College and LSU Agricultural Center) (70803 루이지애나주 배턴 루지 에퍼슨 홀 104)의 감리 위원회(Board of Supervisors)에 의해 국제 기탁 기관인 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC: American Type Culture Collection) (미국 20110-2209 버지니아주 매너서스 유니버시티 불레바드 10801)에 기탁되었다.
유기체 ATCC 등록 번호 기탁일
개 골수 세포 PTA-10545 2009년 12월 22일
세포-회합된 이. 카니스 PTA-10546 2009년 12월 22일
본 발명의 대표적인 것으로서 제공되는 하기의 비-제한적인 실시예들을 참조로 본 발명이 더 잘 이해될 수 있다. 하기의 실시예들은 본 발명의 선호되는 실시양태를 더욱 충분히 설명하기 위해 제시된다. 그러나, 이들은 어떠한 방식으로도 본 발명의 광범위한 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1
실시예 2
연구 디자인 및 결과:
| 시험 동물 설명 | |
| 종 | 개과 |
| 초기 연령 | 9-11개월 |
| 성별 | 암컷 |
| 품종 | 실험용 비글 |
| 초기 체중 범위 | 챌린지한 날에 9.0-16.6 ㎏ |
| 동물수 | 16 |
| 식별 방법 | 귀 문신 |
| 포함 기준 | 연구 전에 수의사가 신체 검사를 실시하였고, 건강하고 사용하기에 적절한 것으로 결정하였음. 1차 예방접종 전에 이. 카니스에 대한 항체에 대해 혈청학적으로 음성 (≤1:40)이고, 챌린지 전에 혈소판 카운트 값이 정상임 (≥200,000/㎕) |
| 배제 기준 | 포함 기준에 맞지 않은 임의의 동물 |
하우징 및 동물 사양 :
순응/컨디셔닝: 기존의 풀(pool)로부터 동물들을 취하였고, 따라서 처치 또는 컨디셔닝이 필요하지 않았다. 연구 개시 전에 적어도 7일 동안 동물들을 순응시켰다. 연구 전반에 걸쳐 모든 동물에 일반적인 우수 사양 기준(good husbandry practice)을 적용하였고, 일상적인 절차를 모든 동물에 걸쳐 표준화하였다.
하우징: 개들을 처치 군과 관계 없이 무작위로 우리 내에 군으로 하우징하였다 (우리 당 개 4-5마리).
식이: 모든 동물에게 물이 자유롭게 공급되었다. 먹이는 이러한 연령의 동물에 대한 최소 영양 요구량을 만족시켰고, 표준 절차를 따랐다.
무작위화: 블록 내의 무작위 번호를 생성시켜 개들의 순위를 매긴 후, 군 ID를 연결하여 분류하였다. 블록 내의 가장 낮은 무작위 번호들을 군 1에 할당하였고, 가장 높은 무작위 번호들을 군 2에 할당하였다. 체중 감소가 이. 카니스 감염과 연관된 임상 징후 중 하나이기 때문에, 개들을 무작위화 동안 체중에 의해 또한 블록화하였다.
연구 맹검: 실험실 샘플을 시험하고, 매일의 동물 관찰, 임상 평가를 수행하며, 부검 관찰을 수행하는 직원들은 연구를 완료할 때까지 처치 군 할당을 몰랐다.
실험 절차:
예방접종-전 모니터링/순응:
샘플: 항체 역가 분석을 위해 1차 예방접종 전에 제0일 연구일에 혈액 샘플을 혈청 분리 튜브 내에 수집하였다.
신체 검사: 모든 동물이 주치 수의사에 의해 시험 시설에서 제-3일에 신체 검사를 받았고, 건강하고 연구에 적절한 것으로 확인되었다.
일일 관찰: 순응 기간 동안, 모든 동물을 동물 관리 스태프가 매일 관찰하였다.
임상 관찰: 임상 징후 및 직장 온도를 예방접종 전에 제0일 및 제21일에 기록하였다.
예방접종:
생물학적 제품의 투여: 3 ㎖ 주사기 및 23 게이지 × 1 인치 바늘을 사용하여 1.0 ㎖ 용량으로 각각의 동물에게 제0일 및 제21일에 백신을 피하 투여하였다. 동물 시설로의 수송 및 백신 투여 동안 모든 백신을 젖은 얼음 상에서 유지시켰다. 피하 예방접종을 제1 용량에 대해서는 오른쪽 어깨위 영역에서, 제2 용량에 대해서는 왼쪽 어깨위 영역에서 수행하였다.
예방접종-후 절차:
주사 부위 반응: 주사 부위 관찰을 각각의 예방접종 후 7일 동안 기록하였다.
일일 관찰: 모든 동물을 동물 관리 스태프가 예방접종 후 기간 동안 매일 관찰하였다.
혈청학: 제21일 연구일에, 항체 역가 분석을 위해 혈액 샘플을 혈청 분리 튜브 내에 수집하였다.
챌린지-전 절차:
임상 관찰: 기준선 값을 확립하기 위해 임상 징후 및 직장 온도를 제35일 연구일, 제39일 연구일 및 제42일 연구일 (챌린지 전)에 취하였다.
혈액 샘플: 제42일 연구일 (챌린지 전)에, 항체 역가 분석을 위해 혈액 샘플을 혈청 분리 튜브 내에 수집하였다. 제35일 연구일, 제39일 연구일 및 제42일 연구일 (챌린지 전)에, 기준선 CBC를 위해 EDTA 튜브 내에 혈액 샘플을 수집하였다. 제42일 연구일 (챌린지 전)에, PCR 분석을 위해 팍스 진(PAX Gene) 튜브 내에 혈액을 수집하였다.
기준선 값을 위해 제42일 연구일 (챌린지 전)에 체중을 기록하였다.
챌린지:
챌린지 물질: 이. 카니스 챌린지 물질 (개에서 계대된 낮은 계대수의 동결 배양물)의 바이알 2개를 액체 질소로부터 제거하고, 신속하게 해동시키고, 피셔 배지에 1:100 (1 ㎖ + 99 ㎖)으로 희석하였다. 희석된 챌린지 물질을 마개로 막고, 뒤집어서 혼합시킨 후, 적정을 위해 1 ㎖를 제거하였다. 바이알을 알루미늄 뚜껑으로 밀봉하고, 표지하고, 동물 유닛으로의 수송을 위해 엎지름 방지(spill proof) 2차 용기 내에서 얼음 상에 놓았다.
챌린지 투여: 제42일에, 모든 개에 2.0 ㎖의 희석된 챌린지 물질을 챌린지하였다.
챌린지 확인/역적정: 희석된 챌린지 물질로부터의 샘플을 수집하고, 24웰 조직 배양 플레이트에서의 챌린지한 날의 즉각적인 적정에 사용하였다.
챌린지-후 모니터링:
체중: 챌린지 후에 매주 체중을 기록하였다.
일일 관찰: 제49일 연구일까지, 임상 관찰 및 온도가 수행된 날을 제외하고는 챌린지 후에 매일 동물 관찰을 기록하였다.
임상 관찰: 제49일 연구일부터 연구 끝까지, 임상 징후 (우울증, 탈수, 비출혈, 및 코/눈 배출물)를 매일 기록하였고, 직장 온도를 1주일에 2번 기록하였다.
주사 부위 반응: 챌린지 후 7일 동안 주사 부위를 관찰하였다.
혈액 샘플:
CBC용 혈액: CBC 프로파일을 모니터링하기 위해 챌린지 후 1주일 당 2회 혈액 샘플 (EDTA)을 수집하였다.
PCR 시험용 혈액: PCR 분석을 위해 팍스 진 튜브 내에 매주 혈액을 수집하였다.
혈청용 혈액: 혈청학을 위해 챌린지 후 2주마다 1회 개에서 채혈하였다.
부검/처분: 모든 시험 동물을 뷰써네이저(Beuthanasia)의 정맥내 주사에 의해 인도적으로 안락사시킨 후 부검하였다.
샘플 수집 및 취급:
CBC용 EDTA 혈액: 삼칼륨-EDTA를 함유하는 진공 튜브를 사용하여 목 정맥의 정맥 천자에 의해 혈액을 수집하였다. 혈액을 얼음 팩 상에 포장하고, 같은 날에 혈액 프로파일 분석을 위해 프로세싱하였다.
항체 분석용 SST 혈액: 진공 튜브를 사용하여 목 정맥의 정맥 천자에 의해 혈액을 수집하였다. 혈액을 2500 RPM에서 10분 동안 원심분리하고, 혈청을 표지하고, -10℃ 이하에서 보관하였다.
PCR 시험용 혈액: 진공 팍스 진 튜브를 사용하여 목 정맥의 정맥 천자에 의해 혈액을 수집하고, PCR 분석을 수행하였다.
분석 방법:
혈소판 카운트: 당업계에 잘 확립된 절차대로 혈소판 카운트를 결정하였다.
이. 카니스 적정: 희석된 챌린지 물질의 보유 샘플을 시험하였다. 간략하게, DBM 세포를 1.0×105개의 세포/㎖의 농도로 24웰 플레이트에 준비시키고, 36±2℃에서 1일 동안 인큐베이션한 후, 검정을 수행하였다. 배지를 무균 상태로 1일령 DBM 배양물로부터 제거하고, 챌린지 물질의 10배 단계 희석물을 24웰 플레이트의 4개의 복제 웰 내로 1 ㎖/웰로 첨가하였다. 플레이트를 36±2℃에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 7일 후, 플레이트에 신선한 피셔 성장 배지를 1 ㎖/웰로 다시 공급하고, 7일 동안 36±2℃로 되돌렸다. 14일 인큐베이션 시, 플레이트를 10분 동안 2000 RPM에서 원심분리하고, 배지를 흡인하고, 배양물을 100％ 메탄올 (0.5 ㎖/웰)로 10분 동안 고정시켰다. 플레이트가 건조되면, 0.5 ㎖/웰의 마우스 항-이. 카니스 모노클로날 항체 (0.01 M PBS에서 1:1000 희석됨)를 첨가하고, 30분 동안 36±2℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.01 M PBS에서 3회 세척하고, 마지막으로 물에서 세척하였다. 그 후, 0.5 ㎖/웰의 FITC로 표지된 염소 항-마우스 IgG (0.01 M PBS에서 1:100 희석됨)를 첨가하고, 30분 동안 36℃±2℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 형광 현미경 하에 관찰하였다. 스피어만-카버(Spearman-Karber) 방법을 사용하여 50％ 종점에서 역가가 계산되었다.
혈청학: 간접적 면역형광 항체 (IFA) 검정을 개 혈청 내의 항-이. 카니스 항체의 검출에 사용하였다. 간략하게, 혈청의 초기 1:20 희석물을 혈청 희석 완충제에서 제조하였다. 단일 샘플을 1:40, 1:80, 1:160 및 1:320으로 희석한 후, 고정된 이. 카니스-감염 DBM 세포를 함유하는 12웰 슬라이드에 첨가하고 (희석물 당 10 ㎕), 습식 챔버에서 30분 동안 36℃±2℃에서 인큐베이션하였다. 슬라이드를 0.01 M PBS에서 10분 동안 세척하고, 10 ㎕의 FITC로 표지된 염소 항-개 IgG (0.01 M PBS에서 1:100 희석됨)를 슬라이드 상의 각각의 웰에 첨가하였다. 그 후, 슬라이드를 습식 챔버 내에 30분 동안 36±2℃에 놓고, 0.01 M PBS에서 10분 동안 세척하고, 형광 현미경에 의해 판독하였다. 형광이 가시적인 최고 희석물에 의해 역가가 결정되었다.
PCR: 당업계에 잘 확립된 절차대로 혈액 샘플 상에서 PCR을 수행하였다.
불활성화 시험: 포르말린-불활성화 항원을 완전한 불활성화에 대해 점검하기 위해 시험하였다. 간략하게, DBM 세포를 접종 1일 전에 1.0×105개의 세포/㎖ 및 60 ㎖/플라스크로 150 ㎠ 플라스크에서 준비시켰다. 1.0 ㎖의 각각의 시험 샘플 (양성 대조군 및 음성 대조군 포함)을 플라스크 내로 접종하고, 8일 동안 36±2℃에서 인큐베이션하였다. 2회의 맹검 계대를 수행하였고, 이때 각각의 계대에 10 ㎖의 선행 계대 접종물을 제공하였다. 맹검 계대 2로부터 8일 후에, 각각의 플라스크 물질을 특이적 면역형광에 의해 염색하였다. 배양물 내의 형광 결여는 완전한 불활성화를 지시한다.
데이터 분석:
결과 변수: 백신 제형의 효능의 결정을 위한 1차 변수는 대조군에 비교된 예방접종군에서의 중증 혈소판감소증의 예방을 기초로 하였다. 체중 감소율(％), 총 부검 점수, 혈액 값 및 임상 징후는 보호의 방증으로 간주되었다.
임상 관찰의 채점: 챌린지 후의 12주 기간 동안 매일 각각의 개에 대한 임상 징후를 기록하고 채점하였다.
임상 평가 지침: 단리실에 들어갈 때, 걸어다니면서 동물의 태도를 평가한다. 이렇게 처음에 걷는 동안 다수의 동물에서 우울증 점수를 결정할 수 있다. 다음으로, 임상 관찰을 진행한다. 그 후, 체온을 측정하고 나서, 필요한 혈액 샘플을 수득한다
사망: 100점 (빈사 상태인 개 및 안락사된 개를 포함하여, 활력 징후가 없음)
우울증: 부재 (정상 활동 및 거동). 존재: 무기력하고, 관찰자가 방에 있을 때 누워 있으며, 일어나기를 꺼림.
코 배출물: 정상 (부재); 심각함 (중등도 내지 중증): 맑은 유체이고, 종종 물기가 많으며, 코의 측면을 따라 또는 코 인중 아래로, 입까지 또는 입 아래로 흘러내림; 점액 농성 (중등도 내지 중증): 점액 농성이고, 맑지 않으며, 종종 유색 배출물이고, 코의 측면을 따라 또는 코 인중 아래로, 입까지 또는 입 아래로 흘러내림.
눈 배출물: 정상 (부재); 심각함 (중등도 내지 중증): 맑은 유체이고, 종종 물기가 많으며, 코까지의 절반 아래로 흐름 또는 눈의 테두리를 두름 + 눈의 안쪽 또는 바깥쪽 가장자리의 모발을 잡아당기거나 적심; 점액 농성 (중등도 내지 중증): 점액 농성이고, 맑지 않으며, 종종 유색 배출물이고, 코까지의 절반 아래로 흐름 또는 눈의 테두리를 두름 + 눈의 안쪽 또는 바깥쪽 가장자리의 모발을 잡아당기거나 적심.
비출혈: (콧구멍으로부터의 출혈) - 정상 (부재); 존재: 콧구멍으로부터의 출혈
탈수: 정상 (부재); 존재: 어깨 사이의 피부 주름이 서로 들러붙거나, 또는 수축하는데 3초 초과가 걸림.
체중 감소율(％) 계산: 챌린지 전에 각각의 개의 체중을 재어, 기준선 체중을 결정하였다. 각각의 개에 대한 체중 감소를 챌린지 후 매주 하기 식을 사용하여 계산하였다: ((기준선 체중 - 현재 체중) / 기준선 체중) × 100 = 체중 감소 ％.
결과 및 토의 :
동반 질환: 대조군 개 1마리가 연구 동안 치료되어야 했다. 이러한 개의 왼쪽 눈에서 궤양이 발달되었고, 눈꺼풀이 부풀어 닫혔다. 연구에 영향을 미치지 않도록 항생제를 자제하였다. 이러한 상태는 특정일에 발견되었다. 이러한 시점에, 눈을 등장성 염수로 씻어 내렸다. 2일 후, 이러한 개에게 아트로핀을 국소적으로 피하 주사하였다. 이러한 상태가 발견되고 나서 5일 후, 개가 완전히 회복된 것으로 수의사에 의해 관찰되었다. 이러한 상태는 연구 시험 제품 또는 챌린지의 결과로서가 아니라 외상 (다른 개로부터의 긁힘)에 의해 야기된 것 같았다.
예방접종-전 시험: 예방접종 전에 이. 카니스에 대한 항체의 존재에 대해 개들을 스크리닝하였다. 이. 카니스 특이적 면역형광 항체 (IFA) 검정에 의해 시험했을 때 모든 개가 역가가 <40인 것으로 확인되었다 (표 5 참조; 제42일은 챌린지한 날이다). 예방접종 전에 임상 관찰 및 직장 온도를 또한 측정하였다. 모든 개가 임상적으로 정상인 것으로 확인되었다.
예방접종-후 시험:
예방접종된 개에서, 예방접종 후 주사 부위 반응이 있는 것으로 관찰되지 않았다. 모든 개를 양쪽 예방접종 후 백신과 연관된 부작용에 대해 매일 관찰하였다. 개들이 예방접종 후 어떠한 불리한 임상 징후도 나타내지 않았다.
예방접종 후 제21일에, 2차 예방접종 직전에, 혈청학을 위해 혈액 샘플을 취했다. 이. 카니스-감염 DBM 세포가 코팅된 12웰 슬라이드 상의 혈청의 배가 희석물을 사용하여 역가를 측정하였다. 희석은 1:40에서 시작되었다. 예방접종군의 개는 단일 용량의 백신 후 1:40 배경값보다 높은 역가를 나타내지 않았다 (표 5 참조).
제42일에, 챌린지 직전에, 예방접종군 이. 카니스 항체 역가의 파괴는 하기와 같았다 (표 5를 또한 참조한다):
역가 < 40: 개 0마리
역가 = 80: 개 4마리
역가 = 160: 개 3마리
역가 > 320: 개 1마리
모든 예방접종되지 않은 대조군 개는 챌린지 전에 여전히 혈청음성이었다 (<1:40).
챌린지: 연구 제42일에, 해동된 챌린지 물질을 피셔 배지에 1:100으로 희석하고 2 ㎖의 챌린지를 각각의 개에 피하 투여함으로써 모든 개에 챌린지하였다. 개에게 투여하는 시점에 챌린지 물질을 적정하였고, 역가가 2 ㎖ 용량 당 103.2 TCID50인 것으로 확인되었다.
챌린지-후 임상 평가:
챌린지와 연관된 체중 감소: 챌린지 후 매주 체중을 기록하였다. 결과가 표 6에서 요약된다.
가장 높은 체중 감소율(％)이 대조군 개에서 나타났고, 이때 챌린지 후 7주에 체중이 평균 16.97％ 감소되었다. 또한 이는 처치 군들 사이에 차이가 가장 컸던 시점이었는데, 예방접종군은 체중에서 7.85％ 저하만을 겪었기 때문이다. 체중 감소를 통계적으로 검토하였다. 중증 체중 감소는 개 체중의 ≥15％로 정의되었다. 예방접종군의 12％ (1/8)에 비교하여, 대조군 개의 87％ (7/8)가 체중의 ≥15％가 감소되었다. 이러한 차이는 매우 유의하다 (p = 0.0042).
사망률: 대조군의 8마리의 개 중 2마리 (25％)를 임상 징후의 중증도로 인해 안락사시켰다. 예방접종군은 시험 동안 사망하지 않았다. 안락사는 임상 징후, 체중 감소 및 혈핵 세포 및 전해질 값을 기초로 하는 수의사의 판단이었다. 주치 수의사는 군 지정에 대해 맹검이었다. 이러한 차이는 지지적이었지만, 연구 내의 개 마릿수가 적기 때문에 유의하지 않았다 (p = 0.2118).
전혈구 카운트 평가: 백혈구 및 적혈구 (WBC 및 RBC), 적혈구용적률 (HCT), 헤모글로빈 (Hgb) 및 혈소판에 대한 기준선 값을 설정하기 위해 연구일 제35일, 제39일 및 제42일에 혈액 샘플을 또한 채취하였다. 모든 개가 문헌 [Merck Veterinary Manual, Eighth Edition, Merck and Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA, (1998)]에 따라 챌린지 전에 이러한 측정치들이 정상 범위 내였다.
혈액 샘플을 챌린지 후 1주일에 2회 수집하였다. CBC 결과는 백혈구 (WBC), 적혈구 (RBC), 헤모글로빈 (Hgb), 적혈구용적률 (Hct 또는 농축 세포 용적) 및 혈소판을 포함하였다. 이. 카니스는 혈액 값들에 대한 효과가 매우 극적이기 때문에, 발생률을 "정상, 비정상, 또는 임상적으로 유의함 (또는 중증)"으로 평가할 채점 시스템이 개발되었다. 표 7은 이러한 연구에서 사용된 값들을 요약한다.
임상적으로 유의한 (또는 중증) 값은 여러 날 동안 정상 범위의 하한의 약 75％로 계산된다. 이러한 범위 내의 개는 관련된 혈액 세포의 결핍에 직접적으로 상관될 수 있는 임상 징후가 있는 것으로 종종 관찰되었다. 비정상 값은 정상에 대한 최소 수준 미만의 임의의 값이다.
혈소판: 낮은 혈소판 카운트는 리케치아 감염과 연관된 주요 임상 징후이다. 이러한 연구를 위해, 이것이 1차 변수였다. 이. 카니스는 감염된 개에서 혈소판 수의 매우 중증인 저하를 야기하는 것을 특히 잘한다. 8마리 모두 (100％)의 대조군 개 및 5/8 (63％)의 예방접종 군에서 혈소판감소증 (혈소판 카운트 < 200,000개/㎕)이 발달되었다. 도 5는 챌린지 후의 평균 혈소판 카운트 (대조군 대 예방접종군)를 나타내고, 표 8은 데이터 요약을 제공한다. 2개 이상의 판독값에 대해 혈소판 카운트가 혈액 1 ㎕ 당 150,000개의 혈소판 미만인 개가 중증 카테고리인 것으로 간주되었고, 손상 시 출혈 위험이 높다. 동물 관리 작업자는 이러한 개들을 쉽게 식별할 수 있는데, 정맥 천자 출혈과 연관된 손상이 샘플을 취한 후 상당한 시간 동안 지속되기 때문이다. 대조군 개에 대해, 8마리 중 6마리 (75％)의 혈소판 카운트가 중증 카테고리에 있었다. 예방접종군의 2/8 (25％)만이 카운트가 중증 카테고리에 있었다. 통계적으로, 이러한 차이는 유의하지 않았다 (p = 0.0768). 그러나, 적어도 1마리의 대조군 개에서의 사망률로 데이터가 중도절단(censoring)되었데, 이러한 개가 중증 혈소판감소증을 나타내면서 연구 중 조기에 사망하였기 때문이다. 이러한 개가 사망하지 않았으면, 적어도 7/8의 대조군이 중증 혈소판감소증을 나타낸 것으로 연구가 결론지어졌을 것이다. 사망률은 혈소판감소증보다 훨씬 더 중증인 임상 징후이기 때문에, 1차 변수를 혈소판감소증 또는 사망률로서 재분석하였다. 사망률을 고려하면, 대조군과 예방접종군 사이의 차이가 유의해진다 (p = 0.0213).
적혈구: 도 2는 챌린지 후의 기간 동안의 평균 적혈구 카운트를 나타낸다. 도 2는 대조군 개의 평균이 대부분의 시험 기간 동안 정상 미만인 반면, 예방접종군의 평균은 대부분의 시험 기간 동안 정상 범위에서 유지되었음을 나타낸다. 표 9는 대조군 개의 100％가 문헌 [Merck Manual]의 빈혈 정의를 만족시켰고, 63％가 중증 카테고리로 진행된 바와 같이 챌린지의 중증도를 설명한다. 예방접종 개는 빈혈의 중증 카테고리로 진행되지 않았다. 이러한 차이는 매우 유의하다 (p = 0.0081).
백혈구: 도 1은 챌린지 후의 기간 동안의 백혈구 카운트의 결과를 요약한다. 도 1은 백혈구 카운트의 중증 감소가 대조군에서 관찰되었음을 나타낸다. 데이터가 표 10에서 최상으로 요약되고, 이때 경도 및 중증 백혈구감소증 양쪽 모두에 대한 현저한 차이가 개들에서 관찰된다. 대조군 개의 38％가 백혈구감소증의 "중증" 카테고리로 진행된 반면, 예방접종군은 그렇지 않았다. 이러한 차이는 유의하지 않다 (p = 0.0822). 표 10 및 도 1은 예방접종군에 대한 평균과 대조군에 대한 평균 사이의 차를 설명한다. 대조군의 평균은 정상에 대한 최소 수준 미만으로 떨어진 한편, 예방접종군의 평균은 그렇지 않았다. 이러한 경향은 각각의 연구 군 내에 더 많은 동물이 있으면 차이가 유의할 것 같다는 것을 시사한다.
헤모글로빈 값: 도 3은 챌린지 후의 헤모글로빈 측정치의 결과를 요약한다. 다른 혈액 파라미터들과 일관되게, 도 3은 대조군의 평균이 많은 챌린지 후 기간 동안 최소값의 한참 아래로 떨어졌음을 나타낸다. 예방접종군 평균은 전혀 정상 미만으로 가지 않았다. 표 11은 대조군 개 100％의 헤모글로빈 값이 낮은 반면, 방접종군의 50％만이 이러한 수준으로 떨어졌음을 나타낸다. 예방접종군은 헤모글로빈 수준에 대한 중증 카테고리로 진행되지 않았다. 그러나, 대조군의 25％만 중증 카테고리로 진행되었고, 이러한 차이는 유의하지 않았다 (p = 0.2118).
적혈구용적률 백분율: 도 4는 챌린지 후의 적혈구용적률 값의 결과를 요약한다. 다른 빈혈 측정과 같이, 도 4는 대조군 평균이 챌린지 기간의 후반부 동안 정상보다 꽤 아래로 내려간 반면, 예방접종 개 평균은 전혀 정상 아래로 가지 않는다는 것을 나타낸다. 표 12는 시험 제품으로의 개의 예방접종이 적혈구용적률 카운트에 의해 측정된 바와 같이 빈혈 발생률을 절반으로 저하시켰음을 나타낸다. 대조군 개의 63％ (5/8)가 적혈구용적률에 대한 중증 카테고리로 진행된 반면, 예방접종군의 개의 1/8 (13％)만 중증 값이었다. 이러한 차이는 유의성에 매우 근접하였다 (p = 0.0534).
임상 징후: 각각의 개를 심각한 감염을 가리키는 임상 징후에 대해 매일 관찰하였다. 결과가 표 13에 요약된다. 임상 징후 채점은 우울증, 코 배출물, 눈 배출물, 비출혈, 탈수 및 사망의 징후에 대해 개를 관찰하는 맹검 직원에 의해 이루어진 관찰을 기초로 하였다. 임상 징후의 중증도에 관하여 각각의 관찰에 점수를 할당하였다. 총점은 대조군에 대한 254점 대 예방접종군에 대한 28점이었다. 대조군 대 예방접종군에 대한 평균 점수는 각각 32점 및 4점이었다. 보호를 매우 가리키는 듯함에도 불구하고, 군들 사이의 차이가 유의하지 않았다 (p = 0.4364).
직장 온도: 1주일에 2회 직장 온도를 측정하여 기록하였다. 직장 온도가 >39.5℃이면 개가 열이 나는 것으로 간주되었다. 이는 정상 온도 범위가 38.9±0.5℃로 기입된 문헌 [Merck Veterinary Manual]과 일관된다. 이. 카니스는 감염된 개에서 온도 스파이크(spike)를 야기하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 연구로부터의 관찰이 이와 일관되고, 표 14에 요약된다. 예방접종군의 50％ (4/8)에 비교하여 대조군의 87.5％ (7/8)에서 열 스파이크가 있었다. 열 스파이크들을 차이에 대해 통계적으로 비교하였다. 대조군의 25％ (2/8)가 2일 이상 동안 열이 난 반면, 예방접종군의 12.5％ (1/8)만 그러하였다. 이러한 차이는 유의하지 않았다 (p=0.6709).
챌린지 주사 부위 반응성: 챌린지 부위에서의 반응성에 대해 개들을 관찰하였다. 예방접종군 또는 대조군 내의 16마리의 개들이 챌린지 투여 부위에서의 반응성의 어떠한 징후도 나타내지 않았다.
혈액 내의 이. 카니스의 PCR 검출의 결과: 챌린지 직전에 이. 카니스 감염을 결정하기 위한 PCR 분석을 위해 혈액 샘플을 취했다. PCR 결과가 표 15에서 제시된다. 예상대로, 모든 개가 챌린지 전에 이. 카니스 감염에 대해 여전히 음성이었다. 챌린지 후의 이. 카니스 감염에 대한 혈액의 매주 PCR 분석에 대한 결과가 표 15에 있다. 모든 대조군 개는 1회 초과의 시점에 혈액 내의 이. 카니스에 대해 양성이었다. PCR에서, 예방접종군 중 3마리에서 이. 카니스가 전혀 검출되지 않았다. 이와 동일한 개들에서 챌린지 후 혈소판감소증이 발달되지 못한 바와 같이, 이러한 결과들은 혈소판의 결과와 정확하게 부합한다. 양성 결과에 대한 대조군과 예방접종군 사이의 차이는 유의하지 않았다 (p = 0.0822).
챌린지-후 혈청학: 챌린지 후 2주마다 혈청학을 수행하였다. 예방접종된 개에 대한 혈청학 결과는 챌린지 후 PCR에 의해 음성이었고 혈소판감소증이 포함되는 임상 징후가 발달되지 못한 이러한 군의 개가 실제로 이. 카니스에 노출되었는지 여부의 질문에 답한다. 제42일 (챌린지한 날) 이후의 일부 시점에, 이러한 개 세마리 모두에서 역가가 급속히 상승하였고, 이는 챌린지 물질에 대한 노출을 지시한다. 혈청학에 대한 평균의 요약이 표 5에서 제시된다. 보호에 대한 항체 역가의 관련성은 이러한 연구로부터 명확하지 않다. 혈청학은 병독성 이. 카니스에 대한 노출의 양호한 지시물인 것으로 보인다.
부검 점수: 안락사 시점에 모든 개에 부검을 실행하였고, 부검을 실행하는 사람은 맹검이었다. 대부분의 개에 대해, 이는 챌린지하고 나서 8주 후였다. 중증 임상 징후로 인해 조기에 안락사시켜야 하는 개에 대해서는, 사망 시점에 부검을 실행하였다. 안락사 직후에 개들을 부검하고 채점하였다. 비장비대는 이. 카니스 감염과 명확하게 연관될 수 있는 한 관찰이다. 예방접종 상태가 비장비대의 관찰에 대한 효과가 있는 것으로 보였다 (표 16). 대조군에 대한 38％ (3/8)와 비교하여 예방접종된 개는 비장비대가 없었다. 이러한 차의는 유의하지 않았다 (0.0822). 8주 시험의 종료 전에 안락사시켜야 했던 개에서, 주치 수의사는 복강액의 축적이 일관되게 발견되었음을 인지하였다. 낮은 혈청 알부민 수준은 혈행과 조직 사이의 삼투 불균형에 이르기 때문에, 복강 내의 체액 축적이 초래될 수 있다. 나머지 시험 기간에 대해, 시험을 위해 보내지는 격주 혈액 샘플 상에서 수행되도록 화학 패널을 주문하였다. 알부민 수준에 대한 이러한 시험의 결과가 표 17에서 요약된다. 대조군의 절반 (4/8)에서, 부검 시 복강 내의 유의한 체액 축적이 관찰되었다. 체액이 축적된 대조군 중에서, 이들의 50％는 200 ㎖를 초과하는 체액이 회수되는 중증 등급이었다. 예방접종군은 어떠한 체액 축적도 없었다 (표 16). 이러한 차의는 유의하지 않았다 (p = 0.2118). 혈청 알부민 수준과 혈소판 카운트의 흥미로운 상관관계가 있었다. 혈소판감소증이 발달된 개 모두가 알부민 값이 정상 미만이었다. 대조군의 6/8 (75％)은 혈청 내의 알부민 농도에 대한 최소값의 75％ 미만으로 떨어진 반면 예방접종군의 3/8 (25％)만 이러한 수준으로 저하되어, 예방접종 상태가 명확하게 혈청 알부민 수준에 영향을 미치는 것으로 보였다 (표 17).
모든 결과의 요약 표: 이러한 복합적인 결과들 모두의 중증도를 시험하고 포착하기 위해, 요약 표가 생성되었다 (표 18). 이러한 표에서, 임상적으로 유의한 (중증인) 점수만 이러한 시험에서 측정된 각각의 파라미터에 대해 검토된다. 백신접종군에 대한 3.5점에 비교하여 대조군에 대한 평균 중증도 점수는 14.6점이다. 이러한 극적인 차이는 모든 예방접종군 대 대조군에서 시험 제품의 효능을 강조한다.
결론:
대조군의 100％에서 혈소판감소증, 이. 카니스에 대한 높은 역가, 중증 임상 징후, 체중 감소가 발달되었고 개 2마리를 안락사시켜야 했던 바와 같이, 챌린지가 유효하였고 예상보다 더욱 강력하였다.
사망률로 인한 중도절단을 고려할 때, 1차 변수인 중증 혈소판감소증의 발생률은 대조군에서보다 예방접종군에서 덜한 것으로 나타났고, 이러한 차이는 유의하였다 (p = 0.0213).
대조군의 25％가 챌린지 후 인도적인 이유로 안락사되었어야 하고 예방접종군은 그렇지 않은 바와 같이, 예방접종이 사망률에 대한 효과가 있는 것으로 보였다.
대조군의 개들은 중증 체중 감소를 겪었고, 이때 일부 개는 챌린지 후 8주 동안 체중의 거의 25％가 감소되었다. 중증 체중 감소의 발생률은 대조군보다 예방접종군에서 덜하였고, 이러한 차이는 매우 유의하였다 (p = 0.0042).
중증 수준에 도달한 기타 혈액 파라미터에 대한 예방접종군과 대조군 사이의 차이는 전적으로 유의하지는 않았지만, 일부는 매우 근접하였다. WBC (p = 0.08221), 적혈구용적률 (p = 0.0534), 및 헤모글로빈 (p = 0.2118)이 이에 포함되었다.
혈액 내의 이. 카니스의 PCR 검출은 혈소판감소증의 발생률에 대해 달성된 결과와 정확하게 부합하였다.
예방접종군 내의 개 3마리는 감염의 어떠한 임상 징후도 전혀 나타내지 않았거나 또는 PCR에 의한 혈액 내의 이. 카니스의 수준이 검출가능하지 않았다. 그러나, 혈청학은 이러한 개 3마리에서 챌린지 후의 이. 카니스에 대한 면역기억 반응이 있는 것으로 보였음을 가리켰고, 이는 이들이 병독성 챌린지 물질에 노출되었음을 가리킨다.
혈액 내의 중증 알부민 결핍의 결과로서의 복강 내의 체액 축적은 대조군 개에서만 나타났고, 예방접종군에서는 그렇지 않았다.
우울증, 코 배출물, 눈 배출물, 비출혈, 탈수 및 사망이 포함되는 임상 징후는 예방접종군에 비교하여 대조군 개에서 가장 중증이었지만, 차이가 군들 간에 유의하게 상이히지 않았다 (p = 0.4364).
챌린지 후의 직장 온도 스파이크는 대조군 개에서 더욱 통상적이었다.
예방접종 또는 챌린지 주사는 개에서 어떠한 관찰가능한 반응도 일으키지 않았다.
부검 시, 대조군에서만 비장비대 관찰이 보였다.
이러한 결과들은 본 발명의 백신의 효능을 지지한다.
본원에 개시된 특정 구성, 공정 단계 및 물질이 다소 변할 수 있기 때문이 본 발명이 이같은 구성, 공정 단계 및 물질에 한정되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명의 범주는 첨부된 청구항 및 이의 등가물에 의해서만 한정될 것이기 때문에, 본원에서 사용된 술어학이 특정 실시양태를 기술하기 위한 목적으로만 사용되고 제한적인 것으로 의도되지 않는다는 것을 또한 이해하여야 한다.
Claims (3)
- PTA-10546의 ATCC 등록 번호를 갖는, 세포-회합된 이. 카니스.
- PTA-10545의 ATCC 등록 번호를 갖는 세포.
- 제2항의 세포 상에서 이. 카니스를 성장시켜 항원을 생산하는 것을 포함하는, 이. 카니스 항원을 생산하는 방법.
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