CN106075424A - 一种禽流感病毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明的目的提供一种禽流感病毒疫苗，其中抗原为灭活的H9亚型禽流感病毒，其保藏编号为CCTCC No.V201617。本发明的疫苗所使用的H9亚型禽流感病毒FJ11株新毒株的HA及EID₅₀效价高、免疫原性好并能抵御H9亚型禽流感病毒各地方流行分离毒的攻击。本发明制备的疫苗的安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，结果与同类产品相比较，各项指标均稳定有效；效力试验结果证明，H9亚型禽流感灭活疫苗抗体均比同类产品产生抗体快，重要的是免疫后能够抵御流行株的保护。

Description

一种禽流感病毒疫苗

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽流感病毒疫苗。

背景技术

禽流感是禽类烈性传染病之一，由A型流感病毒引起的，家禽在感染H9亚型禽流感病毒，特别当伴有混合感染时，可导致并引起高死亡率及产蛋率严重下降。而且是主要流行于动物和人类中的一种传染性、死亡率高的急性、高度传染性疾病，广泛发生于世界各地，对人类和养禽业危害很大。

禽流感病毒在禽类疫病病毒中的变异是相对最频繁的，使得虽然推出的多种选择的疫苗，但仍然出现控制不住疫情发展的局面，所以需要筛选获得新的流行毒株来应对变异所造成的新的危害。

发明内容

本发明的目的是提供一种禽流感病毒疫苗，从而弥补现有技术的不足。

本发明还提供一种灭活疫苗，其中抗原为灭活的H9亚型禽流感病毒；

其中禽流感病毒H9C2亚型FJ11株，于2016年3月31日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.V201617。

上述的灭活疫苗，其中病毒的灭活采用甲醛灭活；

本发明的灭活疫苗的制备方法如下：

1)油相制备：

取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加5份司本80(Span-80)，至温度达到115℃时维持40分钟，冷却后完成油相制备；

2)水相制备：

取灭活的H9亚型禽流感抗原液95份，灭菌的5份吐温80，充分混匀；

3)乳化

取油相2份放入乳化罐中，加入水相1份后，再以3500r/min搅拌30～40分钟完成乳化制备。

本发明的疫苗所使用的H9亚型禽流感病毒FJ11株新毒株的HA及EID₅₀效价高、免疫原性好并能抵御H9亚型禽流感病毒各地方流行分离毒的攻击。本发明制备的疫苗的安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，结果与同类产品 相比较，各项指标均稳定有效；效力试验结果证明，H9亚型禽流感灭活疫苗抗体均比同类产品产生抗体快，重要的是免疫后能够抵御流行株的保护。

具体实施方式

申请人筛选获得了一株新型变异的H9亚型禽流感病毒，将该病毒制备成灭活疫苗，从而促成了本发明。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：H9亚型禽流感毒株的筛选

1.流行病学调查 自1998年我国北方地区发现H9亚型禽流感以来，我们就一直对H9亚型禽流感的流行情况及病毒变异情况进行跟踪研究，近几年来，好多地区出现了禽流感症状的发病或死亡鸡，经过大量的流行病学调查研究，2015年我们成功从福建某养鸡场的鸡群中分离出一株H9亚型禽流感病毒。

2.病毒分离 根据文献报道的方法作AIV的分离。将病料按1:5(w/v)比例加入到含双抗的生理盐水中,研磨制成悬液,1000r/min离心5分钟,取上清尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚,每胚0.2ml,36℃～37℃孵化3～4日,每日照胚2次,取24小时后死亡的鸡胚,置2～8℃冷却8～16小时,收获鸡胚液，进行HA及HI试验。

3.HA和HI试验 按现行《中国兽药典》进行。

4.病毒继代和病毒含量测定 病毒在10～11日龄SPF鸡胚中继代,收获尿囊液。病毒含量测定采用下列方法:将病毒尿囊液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释,每个稀释度经尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚各5个,每胚0.1ml,观察120小时,计算EID₅₀。

5.亚型的鉴定 将分离的FJ11株和其他毒株的鸡胚尿囊液用0.05％甲醛溶液灭活后,送国家流感中心,做HI和NI试验,确定病毒的亚型。

6.对鸡胚的毒力 将FJ11株E0代尿囊液毒,用灭菌生理盐水作10^-4稀释,接种10～11日龄SPF鸡胚20个,每胚尿囊腔接种0.1ml(约含1000EID₅₀),36～37℃孵育至120小时,弃去60小时前死亡的鸡胚，以后每日观察两次，记录死亡胚数。

7.对雏鸡的毒力 按“OIE”标准用4周龄SPF鸡和按“欧盟指令”标准用6周龄SPF鸡进行对雏鸡的毒力试验。

8.免疫原性试验 用7～10日龄SPF鸡20只,其中10只鸡每只皮下接种10倍稀释的YBF003株尿囊液，另10只皮下接种生理盐水作对照,分别隔离饲 养,21日后采血分离血清,对标准H9抗原作HI试验。

9.抗原特异性试验

9.1 对H9亚型特异性抗血清的HI试验 将毒种分别与禽流感(H5、H7、H9亚型)、ND、EDS抗血清做HI试验。

9.2 将FJ11株尿囊液用灭菌生理盐水作1000倍稀释,与等量抗AIV H9亚型特异抗血清混合,置室温中和1小时后,尿囊腔接种SPF鸡胚10个,每胚0.2ml,同时设H9亚型特异抗血清中和NDV的对照和FJ11株尿囊液作1000稀释未经中和的对照各10个(接种0.1ml)。观察并记录结果。

实施例2：H9亚型禽流感抗原的制备

1 接种 取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-3或10^-4)，按《全自动接种机使用说明》要求，接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

2 孵育和观察 鸡胚接种后，每日照胚1次，将48小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡鸡胚随时取出，直至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时。

3 收获 将冷却的鸡胚取出，按《全自动收获机使用说明》要求，收获鸡胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价。凝集价低于1:256(微量法)者应弃去。同时按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

4 灭活 将H9亚型禽流感病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

5 半成品检验

5.1 无菌检验 取灭活的胚液按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

5.2 灭活检验 取10日龄SPF鸡胚6个，尿囊腔内接种灭活浓缩胚液，每个0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均应不出现凝集，将胚液收获再盲传一代，仍无凝集价 时，认为灭活完全。

5.3 红细胞凝集价测定 将灭活前的胚液测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:256(微量法)者，方可用于制苗。

5.4 病毒含量测定 将灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-8 3个稀释度，各尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1m1，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:16(微量法)者，判为感染，计算EID₅₀，每0.1ml病毒含量≥10^7.3EID₅₀时,方可用于制苗。

实施例3：疫苗的制备

1 油相制备 取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加司本－80 5份，至温度达到115℃时维持40分钟，冷却后备用。

2 水相制备 将灭活的H9亚型禽流感病毒毒液以1:2比例混合。取混合抗原液95份，灭菌的吐温－80 5份，充分混匀，使吐温－80完全溶解。

3 乳化 取油相2份放入乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份后，再以3500r/min搅拌30～40分钟。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

4 分装 定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。

5 成品检验

5.1 性状

外观 乳白色乳剂。

剂型 油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不多于0.5ml。

黏度 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

5.2 装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。

5.3 无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

5.4 安全检验用7～14日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下分点注射疫苗1.0ml，观察14日，应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

5.5 效力检验

5.5.1 血清学方法 用30～60日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另5只不免疫作对照。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于1:180(微量法)，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应不高于1:4(微量法)。

5.5.2 免疫攻毒法 用30～60日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另5只不免疫作对照。接种后21～28日，每只鸡翅静脉注射10倍稀释的YBF003株毒液，每只0.2ml，于攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚5个，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的凝集价不低于1:16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。免疫组应至少9只鸡病毒分离为阴性；对照组应至少4只鸡病毒分离为阳性。

实施例4：免疫交叉保护试验(能抵御流行的各地方分离株)

用FJ11株制备的灭活疫苗，免疫21日龄SPF鸡，每只0.2ml。免疫后21日，分别用10倍稀释的FJ11株及各地方分离毒株翅静脉注射，每个毒株各攻击10只免疫鸡及5只同条件的未免疫对照鸡。攻毒后，免疫组鸡均未出现AI的典型临床症状；用棉拭子进行病毒分离，阳性率均不超过10％(1/10)；而未免疫对照组，也无典型临床症状，但病毒分离均为阳性。表明FJ11株所制备的H9亚型禽流感灭活疫苗能抵御FJ11株及各地方分离株的攻击而起到保护作用。详细结果见表1。

而且，对比实验表明，用目前市场上出售的H9亚型禽流感灭活疫苗对SPF鸡进行免疫，再用本发明筛选的FJ11株进行攻毒实验；结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于本发明的FJ11株制备的灭活疫苗的免疫效果；推测是由于FJ11株发生变异导致目前疫苗的免疫效果不好。

表1：FJ11株疫苗对不同毒株的免疫交叉保护试验结果

Claims (4)

1.一种灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗，其中抗原为灭活的H9亚型禽流感病毒；其中禽流感病毒的保藏编号为CCTCC No.V201617。

2.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的禽流感病毒为H9C2亚型FJ11株。

3.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的病毒的灭活采用甲醛灭活。

4.权利要求1所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)油相制备：

取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加5份司本80，至温度达到115℃时维持40分钟，冷却后完成油相制备；

2)水相制备：

取灭活的H9亚型禽流感抗原液95份，灭菌的5份吐温80，充分混匀；

3)乳化

取油相2份放入乳化罐中，加入水相1份后，再以3500r/min搅拌30～40分钟完成乳化制备。