ES2210318T3

ES2210318T3 - Composiciones inmunogenicas.

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Publication number: ES2210318T3
Application number: ES95936690T
Authority: ES
Inventors: Roger Randal Charles New
Original assignee: VAXCINE Ltd
Current assignee: VAXCINE Ltd
Priority date: 1994-11-15
Filing date: 1995-11-14
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2015-11-14
Also published as: CN100346828C; EP0792165B1; ZA959729B; CN1163575A; NZ295238A; AU3853495A; DE69531793D1; NO972219D0; GB9422990D0; KR970706848A; FI972054A; MX9703480A; CA2205083A1; NO972219L; JP4297515B2; WO1996014871A1; EP0792165A1; ATE249841T1; DE69531793T2; AU700910B2

Abstract

COMPOSICION INMUNOGENICA QUE INCLUYE UN SOLUBILIZADO DE INMUNOGENO, O DE OTRA FORMA, DISTRIBUIDO EN UN SOLVENTE HIDROFOBICO EN AUSENCIA DE UNA FASE HIDROFILICA. PREFERIBLEMENTE, LA COMPOSICION INMUNOGENICA SE FACILITA COMO UNA VACUNA ORAL.

Description

Composiciones inmunogénicas.

La presente invención se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden un inmunógeno disuelto en un disolvente hidrófobo en el cual no sería normalmente soluble, a procesos para preparar estas composiciones y a su uso en el tratamiento o profilaxis de una enfermedad, o al uso en la preparación de agentes para tal uso. En particular, la invención se refiere a composiciones inmunogénicas útiles como vacunas orales.

Para muchas aplicaciones, por ejemplo, en las ciencias farmacéuticas, en la tecnología de los alimentos o en la industria cosmética, trabajar con proteínas y macromoléculas similares presenta problemas porque su hidrofobia y alto grado de polaridad limitan el grado en el que pueden interaccionar con fases lipídicas o incorporarse en dichas fases. Muchos sistemas naturales emplean barreras lipídicas (por ejemplo, la piel o las membranas celulares) para impedir el acceso de moléculas hidrófilas a compartimentos internos; la capacidad de dispersar proteínas en vehículos lipídicos abriría una nueva ruta para la introducción de estas macromoléculas en sistemas biológicos, por lo cual, el medio lipídico que contiene la proteína puede integrarse con los constituyentes hidrófobos de las barreras, en lugar de ser excluidos de ellos.

Otro área donde sería útil la solubilización de macromoléculas hidrófilas en disolventes hidrófobos es el área de las composiciones diseñadas para desencadenar una respuesta inmune, por ejemplo vacunas, y en particular vacunas orales. Las vacunas dependen de su eficacia para producir una respuesta inmune en un hospedador contra un antígeno o grupo de antígenos específicos. Muy a menudo, el componente o componentes antigénicos de una vacuna comprenden una o más proteínas, por ejemplo, proteínas de la cubierta viral. La administración de la vacuna a un sujeto induce la producción de anticuerpos en el sujeto que conduce a la protección contra la infección por el agente particular del cual procede el antígeno o antígenos.

Sin embargo, las vacunas para administración oral que comprenden proteínas tendrán problemas asociados por las razones discutidas anteriormente. De esta manera, existe la necesidad irresoluta de vacunas orales que sean capaces de inducir la respuesta inmune apropiada cuando se administren a un sujeto, pero que no estén sujetas a estos problemas.

Ahora se ha descubierto que tales respuestas inmunes pueden inducirse por medio del uso de preparaciones donde un inmunógeno se disuelve en un disolvente hidrófobo, tal como un aceite. En particular, pueden usarse proteínas o péptidos solubilizados en aceites para generar respuestas inmunes y, por lo tanto, son útiles en la preparación de vacunas, particularmente de vacunas orales.

La dispersión de substancias hidrófilas en un fase oleosa en lugar de en medios acuosos, confiere otros beneficios en términos del incremento de su estabilidad con respecto a la desnaturalización mediada por la temperatura, hidrólisis, sensibilidad a la luz, etc. Se pueden elegir aceites que permanezcan fluidos en un intervalo de temperaturas más amplio que las soluciones acuosas, o que tengan una viscosidad más alta, obteniéndose una mayor protección contra el daño físico. En sistemas de fase mixta, el secuestro de proteínas en aceite puede limitar interacciones mutuamente nocivas - por ejemplo, oxidación o hidrólisis - con compuestos hidrosolubles.

Existen ejemplos de formulaciones que contienen macromoléculas y aceite y uno de tales ejemplos se describe en el documento EP-A-0366277. La formulación descrita en este documento es una emulsión que tiene una fase hidrófoba y una fase hidrófila, donde la fase hidrófoba contiene lípidos que forman quilomicras o quilomicrones. Sin embargo, la macromolécula se disuelve en la fase hidrófila, no en la fase hidrófoba.

El documento EP-A-0521994 también se refiere a una composición adecuada para la administración oral de macromoléculas que comprende un material biológicamente activo en asociación con lecitina o un compuesto capaz de actuar como precursor de la lecitina in vivo. Todas las composiciones ilustradas con ejemplos son formulaciones que comprenden una fase hidrófila y una fase lipófila. Una vez más, en este documento de la técnica anterior, la macromolécula se disuelve en la fase hidrófila en lugar de en la fase lipófila.

Aunque las formulaciones mencionadas anteriormente no contienen macromoléculas y aceites, es significativo que en todos los casos la macromolécula se disuelve en la fase hidrófila en lugar de en la lipófila. Los intentos para formar verdaderas soluciones de macromoléculas en aceites se han encontrado con un éxito limitado, y no se conocen ejemplos de tales soluciones para su uso en vacunas.

El documento US-A-5340588 describe preparaciones de vacunas basadas en esferas lipídicas que son sólidas a temperatura ambiente. Tienen una capa de fosfolípidos incluida en la superficie del núcleo de la esfera lipídica y el antígeno o inmunógeno se localiza en el núcleo, puede estar unido al fosfolípido, dentro del fosfolípido o en ambos sitios.

La solicitud de patente del Reino Unido Nº 9323588.5 describe un proceso por el cual una especie hidrófila puede solubilizarse en un disolvente hidrófobo en el cual no sería soluble normalmente. El proceso se basa en el sorprendente descubrimiento de que si una especie hidrófila se mezcla con un anfífilo en ciertas condiciones, la composición resultante será fácilmente soluble en disolventes lipófilos tales como aceites.

El documento WO-A-9504524 se refiere a una composición que comprende vesículas que tienen un interior hidrófobo y cargadas con substancias biopoliméricas tales como antígenos y vacunas.

El documento EP-A-0521562 describe dispersiones de vesículas que tienen un interior no polar en una fase no polar.

El documento US 5.340.588 se refiere a partículas que tienen un núcleo hidrófobo sólido que contiene un antígeno y con un fosfolípido incluido en la superficie.

El documento US 4.578.391 enseña una composición de emulsión de dos fases que comprende lecitina, agua y un fármaco hidrófobo.

La presente invención se refiere al sorprendente descubrimiento de que un inmunógeno solubilizado en un disolvente lipófilo, tal como un aceite, puede inducir una respuesta inmunogénica en el sujeto en el cual se administra. En particular, se facilita la administración oral.

Este vehículo lipídico también podría actuar como un sistema de distribución particulado más eficaz, al captarse fácilmente por fagocitosis.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición inmunogénica de una sola fase esencialmente anhidra en la que un inmunógeno se solubiliza en un disolvente hidrófobo en ausencia de una fase hidrófila, y que comprende:

(i): una matriz de moléculas anfífilas y restos de inmunógeno, donde las moléculas anfífilas están colocadas alrededor de los restos de inmunógeno con sus grupos de cabeza hidrófila orientados hacia los restos de inmunógeno y donde no hay interacciones químicas entre el anfífilo y el inmunógeno; y

(ii): un disolvente hidrófobo alrededor de la matriz de anfífilo/inmunógeno;

donde el inmunógeno se selecciona entre el toxoide diftérico, toxoide tetánico, antígenos de veneno de serpiente, antígenos de la hepatitis B, subunidad de la tos ferina, influenza a y/o b (o virus inactivados completos o subunidades proteicas), antígenos del cólera, antígenos de Helicobacter pylori, bacterias completas o extractos de las mismas, hongos o antígenos fúngicos, virus de la polio, rotavirus, virus del sarampión, rubéola, virus sincitial respiratorio, VIH, BCG, otros antígenos micobacterianos, H. influenzae A o B (con o sin proteína de soporte), antígenos de protozoos, antígenos de trematodos, antígenos de cestodos, antígenos de nematodos, epítopos de la superficie de membrana específicos para células cancerosas y receptores celulares de inmunomoduladores antiinflamatorios, conjugados poliméricos de esteroides; antígenos HLA, pólenes, antígenos de ácaros del polvo, alergenos de picaduras de abeja o de alimentos.

Como se usa en la presente invención, el término "inmunógeno" se refiere a especies capaces de desencadenar una consecuencia inmune. Esta consecuencia puede ser una respuesta inmune típica, por ejemplo, la producción de anticuerpos o el desencadenamiento de la diferenciación o expansión de poblaciones de células T específicas, y puede ser sistémica o local, por ejemplo restringida a una respuesta mucosa. Como alternativa, la consecuencia inmune puede ser, por ejemplo, tolerancia inmune, en la que el sistema inmune virgen se vuelve insensible a la exposición a un antígeno específico.

Otra consecuencia alternativa puede ser la desensibilización, en la cual se reduce una tendencia preexistente a una respuesta autoinmune o alérgica (IgE) contra un antígeno específico.

Los ejemplos de inmunógenos adecuados incluyen toxoide diftérico, toxoide tetánico, toxoide botulínico, antígenos de veneno de serpiente, antígenos de hepatitis B, subunidad de la tos ferina, influenza a y/o b (virus inactivados completos o subunidades proteicas), antígenos del cólera, antígenos de H. pylori, bacterias completas o extractos de las mismas, por ejemplo, P. aeruginosa, especies de Chlamydia, especies de Neisseria, especies de Yersinia, especies de Salmonella, hongos o antígenos fúngicos, por ejemplo, antígenos de Candida, virus de la rabia, virus de la polio, rotavirus, virus del sarampión, rubéola, virus sincitial respiratorio, VIH, BCG, otros antígenos micobacterianos, antígenos de protozoos, por ejemplo, malaria, Leishmania, Toxoplama, Tripanosoma, antígenos de trematodos, por ejemplo, Esquistosoma, antígenos de cestodos, por ejemplo, de cisticerco, equinococos, antígenos de nematodos, por ejemplo, Toxocara, Uncinaria y Filaria, antígenos de espiroquetas, por ejemplo, especies de Borrelia, epítopos de la superficie de membranas específicos de células cancerosas y receptores celulares de inmunomoduladores antiinflamatorios (para el tratamiento de enfermedades antiinflamatorias tales como la enfermedad de Crohn y la artritis reumatoide), por ejemplo, anti-TNF-R y anti-IL-1R.

Se pueden usar antígenos no proteicos, tales como, por ejemplo, polisacáridos o conjugados poliméricos de esteroides.

Una ventaja de la presente invención es que pueden ser copresentados juntos antígenos diferentes (por ejemplo, proteínas y polisacáridos) en el mismo vehículo para desencadenar una respuesta inmune aumentada gracias a que uno de los componentes actúa como vehículo para el otro, sin necesidad de ninguna unión covalente.

Los ejemplos de antígenos que pueden usarse para reducir o eliminar una respuesta inmune contra ellos incluyen antígenos HLA y polinucleótidos tales como ARN y ADN, incluyendo ADN de plásmidos.

Los ejemplos de antígenos que pueden usarse para desencadenar una respuesta inmune desensibilizante incluyen pólenes, antígenos de ácaros del polvo, alergenos de picaduras de abeja y de alimentos.

También es posible, cuando el inmunógeno es un péptido, polisacárido u otro antígeno, conjugarlo con al menos una cola de hidrocarburos de cadena media o larga.

En otra realización, el inmunógeno está cosolubilizado con una o más citoquinas con el fin de aumentar la respuesta. Los ejemplos de citoquinas adecuadas incluyen IL-4, IL-10, IL-12 e interferones-\gamma También pueden incorporarse otros inmunoestimuladores, por ejemplo monofosforil lípido A, extractos hidrobacterianos, muramil dipéptido y análogos, tuftsina y subunidad B del cólera y toxina termolábil de E. coli.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un proceso para la preparación de una composición inmunogénica de una sola fase esencialmente anhidra, que comprende las siguientes etapas:

(i) o

(a): mezclar el inmunógeno con una dispersión de un anfífilo en un disolvente hidrófilo, de modo que las moléculas de anfífilo formen un ensamblaje en el que los grupos de cabeza hidrófila se orientan hacia el exterior, hacia la fase hidrófila que contiene el inmunógeno, donde el ensamblaje anfífilo toma la forma de micelas; o

(b): mezclar el inmunógeno con una dispersión de un anfífilo en un disolvente hidrófilo, de tal modo que las moléculas de anfífilo formen un ensamblaje en el que los grupos de cabeza hidrófila se orientan hacia el exterior, hacia la fase hidrófila que contiene el inmunógeno, donde el ensamblaje anfífilo toma la forma de vesículas unilamelares pequeñas; o

(c): cosolubilizar el inmunógeno y un anfífilo en un disolvente común;

(ii) eliminar el disolvente o disolventes para dejar una matriz de moléculas de anfífilo y restos de inmunógeno, donde las moléculas de anfífilo están colocadas alrededor de los restos de inmunógeno con sus grupos de cabeza hidrófila orientados hacia los restos de inmunógeno y donde no hay interacciones químicas entre el anfífilo y el inmunógeno; y

(iii) proporcionar un disolvente hidrófobo alrededor de la matriz de inmunógeno/anfífilo;

donde el inmunógeno se selecciona entre el toxoide diftérico, toxoide tetánico, antígenos de veneno de serpiente, antígenos de hepatitis B, subunidad de la tos ferina, influenza a y/o b (virus inactivados completos o subunidades proteicas), antígenos del cólera, antígenos de Helicobacter pylori, bacterias completas o extractos de las mismas, hongos o antígenos fúngicos, virus de la polio, rotavirus, virus del sarampión, rubéola, virus sincitial respiratorio, VIH, BCG, otros antígenos micobacterianos, H. influenzae A o B (con o sin proteína de soporte), antígenos de protozoos, antígenos de trematodos, antígenos de cestodos, antígenos de nematodos, epítopos de la superficie de membrana específicos de células cancerosas y receptores celulares de inmunomoduladores antiinflamatorios, conjugados poliméricos de esteroides; antígenos HLA, pólenes, antígenos de ácaros del polvo, alergenos de picaduras de abeja y de alimentos.

Los procesos descritos en la Solicitud de Patente del Reino Unido Nº 9323588.5 son particularmente adecuados para solubilizar inmunógenos en disolventes hidrófobos para el uso en la preparación de las composiciones de la presente invención.

Hay numerosos anfífilos que pueden usarse en la presente invención y los anfífilos zwiteriónicos tales como los fosfolípidos están entre los que se han considerado especialmente adecuados. Los fosfolípidos que tienen un grupo fosfatidilcolina de cabeza se han usado con un éxito particular, y los ejemplos de tales fosfolípidos incluyen la propia fosfatidilcolina (PC), liso-fosfatidilcolina (liso-PC), esfingomielina, derivados de cualquiera de éstos, por ejemplo, hexadecilfosfocolina o polímeros anfífilos que contienen fosforilcolina y anfífilos halogenados, por ejemplo, fosfolípidos fluorados. En la presente solicitud, los términos fosfatidilcolina (PC) y lecitina se usan indistintamente. Las lecitinas naturales adecuadas pueden proceder de cualquier fuente conveniente, por ejemplo, huevo y, en particular, soja. En la mayoría de los casos, es preferible seleccionar un anfífilo que sea químicamente similar al disolvente hidrófobo elegido y esto se discute con mayor detalle más adelante. También se pueden usar octil-glucósidos, \alpha-tocoferol o ésteres de los mismos o, de hecho, mezclas de cualquiera de los anteriores.

El hecho de que los presentes inventores hayan descubierto que anfífilos zwiteriónicos tales como los fosfolípidos sean particularmente adecuados para uso en el proceso, es una indicación más de las diferencias significativas entre la presente invención y el método de Okahata et al. Significativamente, los autores de este documento de la técnica anterior concluían que los lípidos aniónicos y zwiteriónicos eran completamente inadecuados para uso en su método y exponían que obtuvieron un rendimiento cero de su complejo usando estos lípidos.

La elección del disolvente hidrófobo dependerá del tipo de especie a solubilizar y del anfífilo. Los disolventes adecuados incluyen hidrocarburos, por ejemplo, aceites no polares tales como aceites minerales, escualano y escualeno, ácidos grasos de cadena larga, siendo preferidos ácidos grasos insaturados tales como los ácidos oleico y linoleico, alcoholes, particularmente alcoholes de cadena media tales como octanol y alcoholes de cadena larga ramificada tales como fitol, isoprenoides, por ejemplo, nerol y geraniol, otros alcoholes tales como t-butanol, terpineol, monoglicéridos tales como monooleato de glicerol (GMO), otros ésteres, por ejemplo acetato de etilo, acetato de amilo y acetato de bornilo, mono-, di- o triglicéridos de cadena media o larga y mezclas de los mismos, análogos halogenados de cualquiera de los anteriores, incluyendo aceites halogenados, por ejemplo, fluorocarburos de cadena larga y triglicéridos yodados, por ejemplo lipidiol.

Generalmente se obtienen resultados óptimos cuando el disolvente hidrófobo y el anfífilo son apropiadamente compatibles. Por ejemplo, con un disolvente como el ácido oleico, la liso-PC es una elección más adecuada de anfífilo que PC, mientras que ocurre lo contrario cuando el disolvente hidrófobo es un triglicérido.

Además, en algunos casos, se ha descubierto que es ventajosa la adición de una cantidad del anfífilo al disolvente hidrófobo antes de que entre en contacto con la matriz de inmunógeno/anfífilo. Esto asegura que las moléculas de anfífilo no son desplazadas de sus posiciones alrededor de las especies hidrófilas debido a la alta afinidad del anfífilo por el disolvente hidrófobo.

La orientación de las moléculas de anfífilo en una matriz con sus grupos de cabeza hidrófila enfrentados a los restos de un inmunógeno se puede conseguir de varias formas y más adelante se discuten con más detalle ejemplos de métodos particularmente adecuados.

En un primer método, que tiene un punto de inicio similar al método descrito por Kirby et al., en Biol. Technology, Noviembre 1984, 979-984 y en Liposome Technology, Volumen I, páginas 19-27, Gregoriadis, Ed., CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, USA, se mezcla un inmunógeno con una dispersión de un anfífilo en un disolvente hidrófilo, de tal modo que las moléculas de anfífilo forman un ensamblaje en el que los grupos de cabeza hidrófila se dirigen hacia el exterior hacia la fase hidrófila que contiene el inmunógeno. El disolvente hidrófilo después se retira para dejar una composición seca en la que los grupos de cabeza hidrófila de las moléculas de anfífilo se orientan hacia el inmunógeno.

En este primer método, se prefiere que el disolvente hidrófilo sea agua, aunque pueden usarse otros disolventes polares.

La forma que adquiere el ensamblaje del anfífilo puede ser micelas o vesículas unilamelares pequeñas que, como se entiende generalmente, tienen un diámetro de aproximadamente 25 nm.

La relación de peso de anfífilo:inmunógeno estará generalmente en la región de 1:1 a 100:1, preferiblemente de 2:1 a 20:1, y más preferiblemente será de aproximadamente 8:1 para la PC y de 4:1 para la
liso-PC.

Estas relaciones son sólo relaciones preferidas y, en particular, debería señalarse que el límite superior se establece por consideraciones económicas, lo que significa que es preferible usar la mínima cantidad posible de anfífilo. El límite inferior es algo más crítico y es probable que las relaciones de 2:1 o inferiores se usen sólo en los casos en los que el inmunógeno tiene una porción hidrófoba significativa o es excepcionalmente grande.

Se obtiene un buen rendimiento cuando el disolvente se retira rápidamente y un método conveniente para la eliminación del disolvente es la liofilización, aunque se pueden usar otros métodos.

En algunos casos, puede ser útil incluir sales en la solución hidrófila, particularmente si el inmunógeno es un compuesto macromolecular tal como una proteína grande. Sin embargo, puesto que la presencia de grandes cantidades de sales inorgánicas tiende a ocasionar la formación de cristales y, por lo tanto, a producir una solución turbia, es preferible usar sales orgánicas en lugar de sales inorgánicas tales como cloruro sódico. El acetato amónico es especialmente adecuado para este propósito ya que tiene la ventaja añadida de que puede retirarse fácilmente por liofilización.

Un segundo método para la preparación de una composición que contiene una matriz de anfífilos con sus grupos de cabeza apuntando hacia los restos del inmunógeno es cosolubilizar el inmunógeno y el anfífilo en un disolvente común seguido de la eliminación del disolvente.

Por lo tanto, en otra realización preferida del segundo aspecto de la invención se proporciona un proceso para preparar una vacuna que comprende cosolubilizar un inmunógeno y un anfífilo en un disolvente común y posteriormente eliminar el disolvente común, formando de esta manera una matriz de inmunógeno/anfífilo donde los grupos de cabeza hidrófila de las moléculas de anfífilo están orientados hacia el inmunógeno.

Cuando se usa este método, se prefiere que la relación de peso de anfífilo:inmunógeno sea de aproximadamente 1:1 a 50:1, preferiblemente de 2:1 a 10:1 y más preferiblemente de aproximadamente 4:1.

El disolvente común, por supuesto, debe disolver el anfífilo y el inmunógeno y, preferiblemente, será un disolvente orgánico polar tal como dimetilformamida, dimetilsulfóxido o, más convenientemente, ácido acético glacial.

En este método, al contrario que en el primer método, no es probable que se forme la matriz antes de la eliminación del disolvente común.

Parece probable que, tras la eliminación del disolvente, las moléculas de anfífilo tiendan a ordenarse en láminas con sus grupos de cabeza hacia el inmunógeno y sus grupos de cola hidrófila lejos del inmunógeno. Sin embargo, la eficacia de la presente invención no depende de la exactitud o no de esta observación.

Se ha observado que se obtienen buenos resultados cuando el disolvente se elimina lentamente, por ejemplo, por secado bajo una corriente de nitrógeno, probablemente porque las moléculas de anfífilo disponen de más tiempo para reordenarse.

Se puede usar cualquier disolvente hidrófobo para el anfífilo, pero para las emulsiones de agua en aceite preferidas para uso con pequeños inmunógenos, se prefieren disolventes de bajo punto de ebullición tales como dietil éter, ya que se ha descubierto que se obtienen los mejores resultados cuando el disolvente hidrófobo se elimina lentamente mediante métodos suaves tales como evaporación y, claramente, esto es más eficaz usando un disolvente de bajo punto de ebullición. Los disolventes de bajo punto de ebullición también se prefieren para las emulsiones de agua en aceite aunque, para éstas, la liofilización es un método de eliminación de disolvente más adecuado. El disolvente hidrófilo será preferiblemente acuoso.

La relación de peso de anfífilo:inmunógeno puede ser de aproximadamente 1:1 a 50:1, preferiblemente de 2:1 a 10:1, y más preferiblemente de aproximadamente 4:1.

La relación entre la solución hidrófila y la solución hidrófoba no es crítica, pero si se usan inmunógenos pequeños, es preferible una relación que asegure la formación de una emulsión de agua en aceite en lugar de una emulsión de aceite en agua.

Un método alternativo para la formación de la matriz, que puede ser particularmente adecuado para su uso con inmunógenos pequeños, es atrapar al inmunógeno en vesículas lipídicas cerradas tales como vesículas unilamelares pequeñas (SUV) dispersas en un disolvente hidrófilo y después eliminar el disol-
vente.

Un ejemplo de un anfífilo que no es capaz de formar liposomas es la liso-lecitina. En la mayoría de los ambientes acuosos, este anfífilo forma micelas en lugar de vesículas unilamelares pequeñas y, por lo tanto, es inadecuado para uso en la preparación de liposomas. Sin embargo, es extremadamente útil en el proceso de la presente invención, particularmente cuando se usa junto con un disolvente hidrófobo compatible tal como el ácido oleico.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una preparación hidrófoba de una sola fase de un inmunógeno en un disolvente hidrófobo, que se puede obtener usando los métodos descritos en la presente invención.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona una composición de dos fases que comprende una fase hidrófila y una fase hidrófoba, donde la fase hidrófila comprende una composición inmunogénica de la invención. En particular, la fase hidrófoba se dispersa en una fase hidrófila continua, y es preferiblemente una emulsión.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona el uso de un inmunógeno disuelto en un disolvente hidrófobo en el que normalmente no sería soluble, en la preparación de una composición inmunogénica, particularmente una vacuna oral.

En un sexto aspecto, la invención proporciona una cápsula de recubrimiento entérico que contiene una composición inmunogénica o una preparación hidrófoba de una sola fase de la invención.

Una ventaja de las preparaciones de una sola fase descritas anteriormente es que son esencialmente anhidras y, por lo tanto, estables a la hidrólisis. Son estables también a la congelación-descongelación y tienen mayor estabilidad a temperaturas altas, probablemente porque el agua debe estar presente para que la proteína no se plegue y se desnaturalice. Esto significa que se puede esperar que tengan una vida media mucho más larga que las preparaciones acuosas de los inmunógenos.

La invención se describirá a continuación haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que no deben considerarse limitantes de la invención.

Los ejemplos se refieren a las figuras en las que:

la figura 1: muestra la respuesta al toxoide tetánico tras la administración oral de una formulación de la invención; y

la figura 2: muestra la respuesta al toxoide tetánico tras la administración subcutánea de una formulación de la invención.

Ejemplo 1

Se dializó durante una noche 1 ml de toxoide tetánico, a una concentración de 3.000 Lf/ml (6 mg/ml) frente a 1 litro de agua destilada. Se dispersó fosfatidilcolina de soja en agua destilada mediante sonicación de sonda durante 10 minutos con refrigeración a una concentración de 100 mg/ml. Se introdujo 1 ml de esta solución en un vial de vidrio de 2 ml con tapón a rosca, y se añadieron 40 \mul de toxoide tetánico (5 mg/ml después de la dilución) con mezcla. La mezcla se liofilizó durante una noche y se añadió 1 ml de ácido oleico. Se obtuvo una solución transparente cristalina que se almacenó congelada hasta su uso.

Se administraron 100 \mul de esta preparación (denominada formulación "A") por vía subcutánea o a través de un tubo intragástrico a ratones Swiss adultos jóvenes endocriados (20 \mug de toxoide tetánico por animal, 3 a 4 ratones por grupo), manteniendo tres ratones por jaula en condiciones controladas y alimentados con agua y comida ad libitum. Se tomaron muestras de plasma de la vena de la cola dos semanas después de la administración y se midieron por ELISA tipo sándwich los niveles de anticuerpo (IgG) contra el antígeno tetánico a una dilución 1:100. Los resultados, expresados como densidad óptica a 450 nm, se muestran en las figuras 1 y 2.

Ejemplo 2

Se dispersó fosfatidilcolina de soja en agua destilada mediante sonicación de sonda durante 10 minutos, con refrigeración, a una concentración de 100 mg/ml. Se dispensó 1 ml de esta solución en un vial de vidrio de 2 ml con tapón a rosca, y se añadieron con mezcla 40 \mul de toxoide tetánico, como en el ejemplo "A". La mezcla se liofilizó durante una noche y se añadió 1 ml de Miglyol 818. Se obtuvo una solución transparente cristalina que se almacenó congelada hasta su uso.

Se administraron 100 \mul de esta preparación (denominada formulación "B") por vía subcutánea o a través de un tubo intragástrico a ratones Swiss adultos jóvenes endocriados (20 \mug de toxoide tetánico por animal, 3 a 4 ratones por grupo), manteniéndose tres ratones por jaula en condiciones controladas y alimentados con agua y comida ad libitum. Se tomaron muestras de plasma de la vena de la cola dos semanas después de la administración y se midieron por ELISA tipo sándwich los niveles de anticuerpo (IgG) a una dilución 1:100. Los resultados, expresados como densidad óptica a 450 nm, se muestran en las figuras 1 y 2.

Ejemplo 3

Se dispersó fosfatidilcolina de soja en agua destilada por sonicación de sonda durante 10 minutos con refrigeración a una concentración de 100 mg/ml. Se introdujo 1 ml de esta solución en un vial de vidrio de 2 ml con tapón a rosca, y se añadieron con mezcla 40 \mul de toxoide tetánico, como en el ejemplo "A". La mezcla se liofilizó durante una noche y se añadió 1 ml de una fuente comercial de aceite de girasol. Se obtuvo una solución transparente cristalina que se almacenó congelada hasta su uso.

Se administraron 100 \mul de esta preparación (denominada formulación "C") por vía subcutánea o a través de un tubo intragástrico a ratones Swiss adultos jóvenes endocriados (20 \mug de toxoide tetánico por animal, 3 a 4 ratones por grupo), manteniendo tres ratones por jaula en condiciones controladas y alimentados con agua y comida ad libitum. Se tomaron muestras de plasma de la vena de la cola dos semanas después de la administración y se midieron por ELISA tipo sándwich los niveles de anticuerpo (IgG) a una dilución 1:100. Los resultados, expresados como densidad óptica a 450 nm, se muestran en las figuras 1 y 2.

Ejemplo 4

Se disolvió hexadecil fosforil colina en agua destilada a una concentración de 100 mg/ml. Se dispensaron 500 \mul de esta solución en un vial de vidrio de 2 ml con tapón a rosca, y se añadieron con mezcla 20 \mul de toxoide tetánico (5 mg/ml después de la dilución), como en el ejemplo "A". La mezcla se liofilizó durante una noche y se añadieron 500 \mul de ácido oleico. Se obtuvo una solución transparente cristalina que se almacenó congelada hasta su uso.

Se administraron 100 \mul de esta preparación (denominada formulación "D") a través de un tubo intragástrico a ratones Swiss adultos jóvenes endocriados (20 \mug de toxoide tetánico por animal, 3 a 4 ratones por grupo), manteniendo tres ratones por jaula en condiciones controladas y alimentados con agua y comida ad libitum. Se tomaron muestras de plasma de la vena de la cola dos semanas después de la administración y se midieron por ELISA tipo sándwich los niveles de anticuerpo (IgG) a una dilución 1:100. Los resultados, expresados como densidad óptica a 450 nm, se muestran en la figura 1.

Ejemplo 5

Se disolvió \beta-octil glucósido en agua destilada a una concentración de 100 mg/ml. Se dispensaron 500 \mul de esta solución en un vial de vidrio de 2 ml con tapón a rosca, y se añadieron con mezcla 20 \mul de toxoide tetánico (5 mg/ml después de la dilución), como en el ejemplo "A". La mezcla se liofilizó durante toda la noche y se añadieron 500 \mul de monooleato de glicerol. Se obtuvo una solución transparente cristalina que se almacenó congelada hasta su uso.

Se administraron 100 \mul de esta preparación (denominada formulación "E") por vía subcutánea a ratones Swiss adultos jóvenes endocriados (20 \mug de toxoide tetánico por animal, 3 a 4 ratones por grupo), manteniendo tres ratones por jaula en condiciones controladas y alimentados con agua y comida ad libitum. Se tomaron muestras de plasma de la vena de la cola dos semanas después de la administración y se midieron por ELISA tipo sándwich los niveles de anticuerpo (IgG) a una dilución 1:100. Los resultados, expresados como densidad óptica a 450 nm, se muestran en la figura 2.

Ejemplo 6

Se disolvió el anfífilo \beta-octil glucósido en agua destilada a una concentración de 100 mg/ml. Se dispensaron 500 \mul de esta solución en un vial de vidrio de 2 ml con tapón a rosca, y se añadieron con mezcla 20 \mul de toxoide tetánico (5 mg/ml después de la dilución), como en el ejemplo "A". La mezcla se liofilizó durante toda la noche y se añadieron 500 \mul de fitol. Se obtuvo una solución transparente cristalina que se almacenó congelada hasta su uso.

Se administraron 100 \mul de esta preparación (denominada formulación "F") por vía subcutánea a ratones Swiss adultos jóvenes endocriados (20 \mug de toxoide tetánico por animal, 3 a 4 ratones por grupo), manteniendo tres ratones por jaula en condiciones controladas y alimentados con agua y comida ad libitum. Se tomaron muestras de plasma de la vena de la cola dos semanas después de la administración y se midieron por ELISA tipo sándwich los niveles de anticuerpo (IgG) a una dilución 1:100. Los resultados, expresados como densidad óptica a 450 nm, se muestran en la figura 2.

Claims

1. Una composición inmunogénica de una sola fase esencialmente anhidra en la que un inmunógeno se solubiliza en un disolvente hidrófobo en ausencia de una fase hidrófila, que comprende:

(i): una matriz de moléculas anfífilas y restos de inmunógeno, en la que las moléculas anfífilas se sitúan alrededor de los restos de inmunógeno con sus grupos de cabeza hidrófila orientados hacia los restos de inmunógeno y en la que no hay interacciones químicas entre el anfífilo y el inmunógeno; y

en la que el inmunógeno se selecciona entre toxoide diftérico, toxoide tetánico, antígenos de veneno de serpiente, antígenos de la hepatitis B, subunidad de la tos ferina, influenza a y/o b (o virus inactivados completos o subunidades proteicas), antígenos del cólera, antígenos de Helicobacter pylori, bacterias completas o extractos de las mismas, hongos o antígenos fúngicos, virus de la polio, rotavirus, virus del sarampión, rubéola, virus sincitial respiratorio, VIH, BCG, otros antígenos micobacterianos, H. influenzae A o B (con o sin proteína de soporte), antígenos de protozoos, antígenos de trematodos, antígenos de cestodos, antígenos de nematodos, antígenos de la superficie de membrana específicos de células cancerosas y receptores celulares de inmunomoduladores antiinflamatorios, conjugados poliméricos de esteroides; antígenos HLA, pólenes, antígenos de ácaros del polvo, alergenos de picaduras de abeja o de alimentos.

2. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el inmunógeno es un antígeno.

3. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que es una vacuna o se puede usar en la preparación de una vacuna.

4. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la vacuna es una vacuna oral.

5. Una composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que están copresentes en la composición dos o más antígenos.

6. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 5, en la que están copresentes un antígeno proteico y un antígeno polisacárido.

7. Una composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que están presentes uno o más inmunoestimuladores adicionales.

8. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el (los) inmunoestimulador(es) adicional(es) se selecciona(n) entre IL-4, IL-10, IL-12, interferones-\gamma, monofosforil lípido A, muramil dipéptido y análogos de los mismos, tuftsina y la subunidad B del cólera.

9. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1, que causará una reducción o una eliminación de la respuesta inmune contra el antígeno.

10. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 9, en la que el antígeno es un antígeno HLA.

11. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la composición desensibilizará la respuesta inmune.

12. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el antígeno se selecciona de pólenes, antígenos de ácaros del polvo o alergenos de los alimentos.

13. Un proceso para la preparación de una composición inmunogénica de una sola fase esencialmente anhidra, que comprende las siguientes etapas:

(i) bien

(a): mezclar el inmunógeno con una dispersión de un anfífilo en un disolvente hidrófilo, de tal modo que las moléculas de anfífilo formen un ensamblaje en el que los grupos de cabeza hidrófila se orientan hacia fuera, hacia la fase hidrófila que contiene el inmunógeno, donde el ensamblaje del anfífilo toma la forma de micelas; o

(b): mezclar el inmunógeno con una dispersión de un anfífilo en un disolvente hidrófilo, de tal modo que las moléculas de anfífilo formen un ensamblaje en el que los grupos de cabeza hidrófila se orientan hacia fuera, hacia la fase hidrófila que contiene el inmunógeno, donde el ensamblaje del anfífilo toma la forma de vesículas unilamelares pequeñas; o

(c): cosolubilizar el inmunógeno y el anfífilo en un disolvente común;

(ii) eliminar el disolvente o disolventes para dejar una matriz de moléculas de anfífilo y restos de inmunógeno, donde las moléculas de anfífilo se sitúan alrededor de los restos de inmunógeno con sus grupos de cabeza hidrófila orientados hacia los restos de inmunógeno y donde no hay interacciones químicas entre el anfífilo y el inmunógeno; y

donde el inmunógeno se selecciona entre toxoide diftérico, toxoide tetánico, antígenos de veneno de serpiente, antígenos de la hepatitis B, subunidad de la tos ferina, influenza a y/o b (o virus inactivados completos o subunidades proteicas), antígenos del cólera, antígenos de Helicobacter pylori, bacterias completas o extractos de las mismas, hongos o antígenos fúngicos, virus de la polio, rotavirus, virus del sarampión, rubéola, virus sincitial respiratorio, VIH, BCG, otros antígenos micobacterianos, H. influenzae A o B (con o sin proteína de soporte), antígenos de protozoos, antígenos de trematodos, antígenos de cestodos, antígenos de nematodos, antígenos de la superficie de membrana específicos de células cancerosas y receptores celulares de inmunomoduladores antiinflamatorios, conjugados poliméricos de esteroides; antígenos HLA, pólenes, antígenos de ácaros del polvo, alergenos de picaduras de abeja o de alimentos.

14. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 13 para la preparación de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

15. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en el que el anfífilo es un fosfolípido.

16. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el anfífilo es un fosfolípido con un grupo fosfatidilcolina de cabeza.

17. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el fosfolípido es fosfatidil colina (PC), liso-fosfatidil colina (liso-PC), esfingomielina, un derivado de uno de los anteriores tal como hexadecil fosfatidil colina o un polímero anfífilo que contiene fosforil colina.

18. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que el disolvente hidrófobo comprende un hidrocarburo (por ejemplo, aceite mineral o escualeno), un ácido graso de cadena larga, un alcohol o poliol de cadena media, por ejemplo, \alpha-tocoferol, un mono-, di- o triglicérido de cadena media o larga o mezclas de los mismos.

19. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en el que el anfífilo comprende PC y el disolvente hidrófobo es un triglicérido o en el que el anfífilo comprende liso-PC y el disolvente hidrófobo es ácido oleico.

20. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, en el que el proceso incluye la etapa i(a) o i(b) y en el que el disolvente hidrófilo se elimina por liofilización.

21. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, en el que el proceso incluye el paso i(a) o i(b) y en el que el disolvente hidrófilo es agua.

22. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21, en el que el proceso incluye la etapa i(c) y en el que el disolvente común es dimetil formamida, dimetil sulfóxido o ácido acético glacial.

23. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19 ó 22, que incluye la etapa i(c) y en el que la relación de peso entre el anfífilo y la especie hidrófila es de aproximadamente 1:1 a 50:1.

24. Una preparación hidrófoba de una sola fase de un inmunógeno en un disolvente hidrófobo que se puede obtener por un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 23.

25. Una composición de dos fases que comprende una fase hidrófila y una fase hidrófoba, en la que la fase hidrófoba comprende una preparación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 ó 24.

26. Una composición de acuerdo con la reivindicación 25, en la que la fase hidrófoba se dispersa en una fase hidrófila continua.

27. Una composición de acuerdo con la reivindicación 25 o en la reivindicación 26, que es una emulsión.

28. Una cápsula de recubrimiento entérico que contiene una composición inmunogénica como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o una preparación hidrófoba como se define en la reivindicación 24.