NO972219L - Immunogenpreparater - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår immunogenpreparater som omfatter et immunogen oppløst i et hydrofobt løsnings-middel som det vanligvis ikke ville være oppløselig i, frem-gangsmåter for fremstilling av disse preparater og deres anvendelse, behandling eller profylakse av sykdommer, eller anvendelse ved fremstilling av midler for en slik bruk. Nærmere bestemt angår foreliggende oppfinnelse immunogenpreparater anvendelige som orale vaksiner.

På mange områder, f.eks. i den farmasøytiske viten-skap, matvareteknologien eller den kosmetiske industri, gir arbeid med proteiner og lignende makromolekyler problemer, fordi deres hydrofilitet og høye grad av polaritet begrenser i hvilken grad de kan reagere med, eller inkorporeres i, lipid-faser. Mange naturlige systemer benytter lipidbarrierer (f.eks. hud, cellemembraner) for å forhindre adgang av hydrofile molekyler til indre rom; evnen til å dispergere proteiner i lipidvehikler ville åpne en ny vei til å innføre disse makromolekyler i biologiske systemer, hvorved lipidmediet inneholdende proteinet kan integreres med de hydrofobe be-standdeler av barrierer, i stedet for å ekskluderes av disse.

Et annet område hvor oppløsning av hydrofile makromolekyler i hydrofobe oppløsningsmidler ville være anvendelig, er området for preparater utformet for å utløse en immunrespons, f.eks. vaksiner, og spesielt orale vaksiner. Vaksiner er for deres effektivitet avhengige av dannelse av en immunrespons i en vert mot spesifikt antigen eller en gruppe av antigener. Meget ofte omfatter den antigene komponent eller komponenter av en vaksine et eller flere proteiner, f.eks. viruskappeproteiner. Administrering av vaksinen til et individ induserer antistoffproduksjon i individet og fører til beskyttelse mot infeksjon av det spesielle middel som antigenet eller antigenene ble avledet fra.

Vaksiner for oral administrering som omfatter proteiner vil imidlertid være beheftet med problemer av de ovenfor angitte årsaker. Det foreligger således et kontinuerlig behov for orale vaksiner som er i stand til å indusere den passende immunrespons når de administreres til et individ, men som ikke er beheftet med disse problemer.

Det er nå funnet at slike immunresponser kan indu-seres ved anvendelse av preparater hvor et immunogen er opp-løst i et hydrofobt løsningsmiddel, slik som en olje. Nærmere bestemt kan proteiner eller peptider oppløst i oljer anvendes for å danne immunrespons, og de er derfor anvendelige ved fremstilling av vaksiner, spesielt orale vaksiner.

Dispersjon av hydrofile materialer i en oljefase i stedet for et vandig medium gir andre fordeler uttrykt ved økning av deres stabilitet med hensyn til temperaturformidlet denaturering, hydrolyse, lyssensitivitet etc. Det kan velges oljer som forblir flytende i et bredere temperaturområde enn vandige løsninger, eller som har en høyere viskositet, hvilket fører til bedre beskyttelse mot fysisk skade. I blandingsfase-systemer kan sekvestering av proteiner i olje begrense gjensi-dig skadelige interaksjoner, f.eks. oksidasjon eller hydrolyse, med vannoppløselige forbindelser.

Det finnes eksempler på formuleringer som inneholder både makromolekyler og olje, og et slikt eksempel er beskrevet i EP-A-0366277. Formuleringen beskrevet i dette dokument er en emulsjon som både har en hydrofob og en hydrofil fase, hvori den hydrofobe fase inneholder chylomikra eller chylomikron-dannende lipider. Makromolekylet er imidlertid oppløst i den hydrofile fase og ikke i den hydrofobe fase.

EP-A-0521994 angår også et preparat egnet for oral utlevering av makromolekyler, omfattende et biologisk aktivt materiale i forbindelse med lecitin eller en forbindelse som er i stand til å virke som en forløper som lecitin in vivo. Alle de eksemplifiserte preparater er formuleringer som omfatter en hydrofil og en lipofil fase. Ifølge denne kjente publikasjon er også her makromolekylet oppløst i den hydrofile fase i stedet for den lipofile fase.

Selv om formuleringene nevnt ovenfor inneholder både makromolekyler og oljer, er det signifikant at makromolekylet i alle tilfeller er oppløst i den hydrofile i stedet for den lipofile fase. Forsøk på å danne ekte oppløsninger av makromolekyler i oljer har hatt begrenset suksess, og det er ikke kjent noen eksempler på slike oppløsninger for anvendelse i vaksiner.

US-A-5340588 beskriver vaksinepreparater basert på liposfærer som er faste ved romtemperatur. De har et lag av fosfolipid innleiret på overflaten av en liposfærekjerne, og antigenet eller immunogenet er enten beliggende i kjernen, kan være festet til eller i fosfolipidet eller begge.

UK patentsøknad nr. 9323588.5 beskriver en prosess ved hvilken et hydrofilt materiale kan oppløses i et hydrofobt løsningsmiddel som det vanligvis ikke ville være oppløselig i. Prosessen er grunnet på den overraskende oppdagelse at dersom et hydrofilt materiale blandes med et amfifilt materiale under visse betingelser, vil det resulterende preparat være lett oppløselig i lipofile løsningsmidler, slik som oljer.

Foreliggende oppfinnelse angår den overraskende oppdagelse at immunogen oppløst i et lipofilt løsningsmiddel, slik som en olje, kan indusere en immunogen respons i et individ som det administreres til. Nærmere bestemt blir oral administrering gjort lettere.

Denne lipidvehikkel kan også virke som et mer effektivt partikkelformet utleveringssystem, idet det lett opptas ved fagocyttose.

I et første aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes derfor et immunogenpreparat som omfatter et immunogen oppløst, eller på annen måte fordelt, i et hydrofobt løsningsmiddel i fravær av en hydrofil fase. I en foretrukket utførelsesform er immunogenet et antigen og preparatet er en vaksine, f.eks. en oral vaksine.

Som anvendt heri, angår betegnelsen "immunogen" et materiale som er i stand til å frembringe en immunreaksjon. Denne reaksjon kan være en typisk immunrespons, f.eks. produk-sjon av antistoffer, eller utløsning av differensiering eller ekspansjon av spesifikke populasjoner av T-celler, og kan være systemisk eller lokal, f.eks. begrenset til en slimhinne-respons. Alternativt kan immunreaksjonen f.eks. være immun-toleranse, hvori det naturlige immunsystem gjøres ureaktivt overfor utfordring av et spesifikt antigen. En annen alternativ reaksjon kan være desensibilisering, hvori en forhånds-eksisterende tendens til en autoimmun eller allergisk respons (IgE) mot et spesifikt antigen reduseres.

Eksempler på egnede immunogener inkluderer difteriatoksoid, tetanustoksoid, botulintoksoid, slangevenomantigener, hepatitt B-antigener, kikhostesubenhet, influensa a og/eller b (hele drepte virus eller proteinsubenheter), koleraantigener, H-pylori-antigener, hele bakterier eller ekstrakter derav, f.eks. P. aeruginosa, chlamydia-arter, neisseria-arter, yersiJiia-arter, salmonella-arter, sopp eller soppantigener, f.eks. fra candida, rabiesvirus, poliovirus, rotavirus, meslingvirus, rubella, respiratorisk syncytiumvirus, HIV, BCG, andre mycobakterielle antigener, protozoantigener, f.eks. malaria, leishmania, toksoplasma, trypanosoma, trematodeantigener, f.eks. schistosoma, cestodeantigener, f.eks. fra cysticerca, echinococcus, nematodeantigener, f.eks. toksocara, bendelorm og filaria, spirochetantigener, f.eks. borrelia-arter, overflatemembranepitoper spesifikke for cancerceller, og cellereseptormålrettede antiinflammatoriske immunmodulatorer (for behandling av inflammatoriske sykdommer) slik som Chrohns sykdom og rheumatoid arthritt), f.eks. anti-TNF-R og anti-IL-lR.

Ikke-protein antigener kan anvendes, slik som f.eks. polysakkarider eller polymerkonjugater av steroider.

En fordel ved foreliggende oppfinnelse er at for-skjellige antigener (f.eks. proteiner og polysakkarider) kan presenteres sammen i den samme vehikkel for å utløse en for-høyet immunrespons, i kraft av at en komponent virker som en bærer for den andre uten behov for noen kovalent binding.

Eksempler på antigener som kan anvendes for å reduse-re eller eliminere en immunrespons mot disse, inkluderer HLA-antigener og polynukleotider slik som RNA og DNA, inkludert plasmid-DNA.

Eksempler på antigener som kan anvendes for å utløse en desensibiliserende immunrespons inkluderer pollen, støv-middantigener, bistikk og matallergener.

Når immunogenet er et peptid, polysakkarid eller et annet antigen, er det også mulig å konjugere dette med minst en middels- eller langkjedet hydrokarbonhale.

I en annen utførelsesform er immunogenet oppløst sammen med ett eller flere cytokiner for å forhøye responsen. Eksempler på egnede cytokiner inkluderer IL-4, IL-10, IL-12 og y-interferoner. Andre immunstimulerende midler kan også inkorporeres, f.eks. monofosforyl-lipid A, hydrobakterieekstrakter, muramyldipeptid og analoger, tuftsin og kolerasubenhet B og varmelabilt toksin fra E. colt.

I et andre aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av immunogenpreparat som omfatter trinnene med oppløsning, eller på annen måte fordeling, av et immunogen i et hydrofobt løsningsmiddel som det vanligvis ikke ville være oppløselig i. Fortrinnsvis er preparatet en oral vaksine.

Prosessene beskrevet i UK patentsøknad nr. 9323588.5 er spesielt egnede for oppløsning av immunogener i hydrofobe løsningsmidler for anvendelse ved fremstilling av preparatene ifølge oppfinnelsen.

I en foretrukket utførelsesform av dette aspekt av oppfinnelsen omfatter således fremgangsmåten for oppløsning av de hydrofile komponenter de følgende trinn: (i) assosiasjon av immunogenet med et amfifilt materiale i et flytende medium; (ii) fjerning av det flytende medium for å etterlate en rekke av amfifile molekyler med deres hydrofile hodegrupper orientert mot immunogenet, og hvori det ikke forekommer noen kjemisk interaksjon mellom det amfifile materialet og immunogenet ; og (iii) tilveiebringelse av et hydrofilt løsningsmiddel rundt immunogen/amfifil-rekken.

Det foreligger et stort antall amfifile materialer som kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse, og zwitterioniske amfifile materialer, slik som fosfolipider, er blant de som er funnet å være spesielt egnede. Fosfolipider med en fosfatidylcholinhodegruppe er blitt anvendt med spesielt vel-lykket resultat, og eksempler på slike fosfolipider inkluderer selve fosfatidylcholinet (PC), lyso-fosfatidylcholin (lyso-PC), sphingomyelin, derivater av enhver av disse, f.eks. heksadesylfosfocholin, eller amfifile polymerer inneholdende fosforylcholin og halogenerte amfifile komponenter, f.eks. fluorerte fosfolipider. Ved foreliggende oppfinnelse anvendes betegnelsene fosfatidylcholin (PC) og lecitin om hverandre. Egnede naturlige lecitiner kan være avledet fra enhver egnet kilde, f.eks. egg, og spesielt soya. I de fleste tilfeller er det foretrukket å utvelge et amfifilt materiale som er kjemisk lignende det valgte hydrofobe løsningsmiddel, og dette er diskutert i nærmere detalj nedenfor. Oktylglukosider, a-tokoferol eller estere derav, eller også blandinger av enhver av de ovennevnte, kan også anvendes.

Det faktum at de foreliggende oppfinnere har funnet at zwitterioniske amfifile forbindelser, slik som fosfolipider, er spesielt egnet for anvendelse ved fremgangsmåten, er en ytterligere indikasjon på de betydelige forskjeller mellom foreliggende oppfinnelse og metoden ifølge Okahata et al. Det er betegnende at forfatterne av denne kjente publikasjon konkluderte med at anioniske og zwitterioniske lipider var fullstendig uegnede for anvendelse i deres metode, og de anga at de ikke oppnådde noe utbytte av deres kompleks ved anvendelse av disse lipider.

Valget av det hydrofobe løsningsmiddel vil avhenge av hvilken type materiale som skal oppløse og det amfifile materiale. Egnede løsningsmidler inkluderer hydrokarboner, f.eks. upolare oljer, slik som mineralolje, squalan og squalen, langkjedede fettsyrer, med umettede fettsyrer som oljesyre og linolsyre som foretrukne, alkoholer, spesielt middelskjedede alkoholer, slik som oktanol, og forgrenede langkjedede alkoholer, slik som fytol, isoprenoider, f.eks. nerol og geraniol, andre alkoholer som t-butanol, terpineol, monoglyserider som glyserolmonooleat (GMO), andre estere, f.eks. etylacetat, amylacetat og bornylacetat, middels- eller langkjedede mono-, di- eller triglyserider og blandinger derav, halogen-er te analoger av enhver av de ovennevnte, inkludert halogenerte oljer, f.eks. langkjedede fluorkarboner og ioderte triglyserider, f.eks. lipidiol.

Optimale resultater erholdes generelt når det hydrofobe løsningsmiddel og det amfifile materiale er korrekt til-passet til hverandre. Med et løsningsmiddel som oljesyre, er f.eks. lyso-PC et mer egnet valg av amfifilt materiale enn PC, mens det motsatte er tilfelle når det hydrofobe løsningsmiddel er et triglyserid.

I noen tilfeller er det dessuten funnet fordelaktig å tilsette en mengde av det amfifile materiale til det hydrofobe løsningsmiddel før det bringes i kontakt med immunogen/amfi-filrekken. Dette sikrer at de amfifile molekyler ikke fjernes 5 fra deres posisjoner rundt de hydrofile materialer på grunn av disses høye affinitet for det hydrofobe løsningsmiddel.

Orienteringen av amfifile molekyler i en rekke med deres hydrofile hodegrupper vendt mot komponentene av et

immunogen, kan oppnås på flere måter og eksempler på spesielt o egnede metoder er diskutert i nærmere detalj nedenfor.

Ved en første metode, som har et lignende startpunkt som metoden som beskrevet av Kirby et al, Bio/Technology, november 1984, 979-984 og i Liposome Technology, volum I,

sidene 19-27, Gregoriadis, red., CRC Press, Inc., Boca Raton, s Florida, USA, blandes et immunogen med en dispersjon av et amfifilt materiale i et hydrofilt løsningsmiddel, slik at de amfifile molekyler danner en samling hvori de hydrofile hodegrupper er vendt utover mot den hydrofile fase som inneholder

immunogenet. Det hydrofile løsningsmiddel fjernes deretter for o å etterlate et tørt preparat hvori de hydrofile hodegrupper i de amfifile molekyler er orientert mot immunogenet.

Ved denne første metode er det foretrukket at det hydrofile løsningsmiddel er vann, selv om andre polare løs-ningsmidler kan benyttes.

s Formen som inntas av den amfifile samling kan være miceller, unilamellære vesikler, fortrinnsvis små unilamellære vesikler som generelt er underforstått å ha en diameter på ca. 25 mn, multilamellære vesikler eller rørformede strukturer,

f.eks. snegleformede sylindere, heksagonale, kubiske eller o myelintype strukturer. Den valgte form vil avhenge av det amfifile materiale som benyttes, og amfifile forbindelser som fosfatidylcholin (PC) har f.eks. en tendens til å danne små unilamellære vesikler, mens lyso-fosfatidylcholin danner

miceller. I alle disse strukturer vender imidlertid de hydro-s fobe haler i de amfifile molekyler innover mot sentrum av strukturen, mens de hydrofile hodegrupper vender utover mot løsningsmidler som immunogenet er dispergert i.

Vektforholdet amfifil:immunogen vil vanligvis være i området fra 1:1 til 100:1, fortrinnsvis fra 2:1 til 20:1 og

mest foretrukket ca. 8:1 for PC og 4:1 for lyso-PC.

Disse forhold er kun foretrukne forhold, og det skal spesielt påpekes at den øvre grense er fastsatt etter økono-miske vurderinger, hvilket betyr at det er foretrukket å anvende den minst mulige mengde amfifilt materiale. Den lavere grense er noe mer kritisk, og det er sannsynlig at forhold på 2:1 eller lavere kun vil bli anvendt i tilfeller hvor immunogenet har en betydelig hydrofob del eller er eksepsjonelt stort.

Det oppnås god ytelse når løsningsmidlet fjernes hurtig, og en egnet metode for fjerning av løsningsmidlet er lyofilisering, selv om andre metoder også kan anvendes.

I noen tilfeller kan det være nyttig å inkludere salter i den hydrofile oppløsning, spesielt dersom immunogenet er en makromolekylær forbindelse, slik som et stort protein. Fordi tilstedeværelsen av store mengder uorganiske salter har en tendens til å forårsake dannelse av krystaller, og således gi en tåket oppløsning, er det imidlertid foretrukket at organiske salter anvendes i stedet for uorganiske salter som natriumklorid. Ammoniumacetat er spesielt egnet for dette for-mål fordi det har den ytterligere fordel at den lett fjernes ved frysetørking.

En andre metode for fremstilling av et preparat som inneholder en rekke amfifile forbindelser hvor deres hodegrupper peker mot immunkomponentene, er å oppløse immunogenet og den amfifile forbindelse sammen i et felles oppløsnings-middel, etterfulgt av fjerning av oppløsningsmidlet.

I en annen foretrukket utførelsesform av det andre aspekt av oppfinnelsen, tilveiebringes derfor en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine som omfatter samtidig oppløs-ning av et immunogen og et amfifilt materiale i et felles opp-løsningsmiddel, og deretter fjerning av det felles oppløs-ningsmiddel for derved å danne en immunogen/amfifilrekke, hvori de hydrofile hodegrupper i amfifilmolekylene er orientert mot immunogenet.

Når denne fremgangsmåte anvendes, er det foretrukket at vektforholdet amfifil:immunogen er fra ca. 1:1 til 50:1, fortrinnsvis fra 2:1 til 10:1, og helst ca. 4:1.

Det felles løsningsmiddel må selvsagt oppløse både det amfifile materiale og immunogenet, og vil fortrinnsvis være et polart organisk oppløsningsmiddel, slik som dimetyl-formamid, dimetylsulfoksid, eller mest egnet, iseddik.

I motsetning til den første metode er det usannsynlig at det ved denne metode vil dannes en oppstillingsrekke før det felles oppløsningsmiddel fjernes.

Det synes sannsynlig at, ved fjerning av oppløsnings-midlet, har de amfifile molekyler en tendens til å ordne seg selv i lag med deres hodegrupper mot immunogenet og deres lipofile halegrupper vendt fra immunogenet. Effektiviteten av foreliggende oppfinnelse er imidlertid ikke avhengig av obser-vasjonens nøyaktighet etc.

Det er blitt observert at gode resultater oppnås når oppløsningsmidlet fjernes langsomt, f.eks. ved tørking under en nitrogenstrøm, antagelig fordi dette gir de amfifile molekyler mer tid til å ordne seg.

Et hydrofobt oppløsningsmiddel for det amfifile materiale kan anvendes, men for de foretrukne vann-i-olje-emulsjoner for anvendelse med små immunogener, er et oppløs-ningsmiddel med lavt kokepunkt, slik som dietyleter, foretrukket fordi det er funnet at de beste resultater oppnås når det hydrofobe oppløsningsmiddel fjernes langsomt ved skånsomme metoder, slik som fordamping, og dette er klart mer effektivt ved anvendelse av et lavtkokende oppløsningsmiddel. Lavtkokende oppløsningsmidler er også foretrukne for vann-i-olje-emulsjoner, selv om lyofilsiering er en mer egnet metode for disse for å fjerne oppløsningsmiddel. Det hydrofile oppløs-ningsmiddel er fortrinnsvis vandig.

Vektforholdet amfifil:immunogen kan være fra ca. 1:1 til 50:1, fortrinnsvis fra 2:1 til 10:1 og mest foretrukket ca. 4:1.

Forholdet mellom hydrofil oppløsning og hydrofob opp-løsning er ikke kritisk, men dersom små immunogener anvendes, er dette forhold fortrinnsvis slik at det sikrer dannelse av en vann-i-olje-emulsjon i stedet for en olje-i-vann-emulsjon.

En alternativ metode for dannelse av ordningsrekken som kan være spesielt egnet for anvendelse med små immunogener, er å omslutte immunogenet i lukkede lipidvesikler, slik som små unilamellære vesikler (SUV) dispergert i et hydrofilt løsningsmiddel, og deretter å fjerne løsningsmidlet.

Et eksempel på et amfifilt materiale som ikke er i stand til å danne liposomer er lysolecitin. I de fleste vandige miljøer danner denne amfifile forbindelse miceller i stedet for små unilammellære vesikler, og den er derfor uegnet for anvendelse ved fremstillingen av liposomer. Den er imidlertid ytterst nyttig ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, spesielt når den anvendes i forbindelse med et forenlig hydrofobt løsningsmiddel, slik som oljesyre.

I et tredje aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et enkeltfaset hydrofobt preparat av et immunogen i et hydrofobt løsningsmiddel, hvilket kan oppnås ved anvendelse av frem-gangsmåtene beskrevet heri.

I et fjerde aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et tofasepreparat omfattende en hydrofil fase og en hydrofob fase, hvori den hydrofile fase omfatter et immunogenpreparat ifølge oppfinnelsen. Nærmere bestemt dispergeres den hydrofobe fase i en kontinuerlig hydrofil fase, og er fortrinnsvis en emulsjon.

I et femte aspekt tilveiebringer oppfinnelsen anvendelse av et immunogen oppløst i et hydrofobt løsningsmiddel som det vanligvis ikke ville være oppløselig i, ved fremstilling av et immunogenpreparat, spesielt en oral vaksine.

I et sjette aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en enteralt belagt kapsel inneholdende et immunogenpreparat, eller et enkeltfaset hydrofobt preparat ifølge foreliggende oppfinnelse.

En fordel med enkeltfasepreparatene beskrevet ovenfor er at de er vesentlig vannfrie og derfor stabile overfor hydrolyse. De er også stabile overfor frysing-tining og har høyere stabilitet ved temperaturer, antagelig fordi vann må være til stede for at proteinet skal utfoldes og bli denaturert. Dette betyr at preparatene kan forventes å ha en mye bedre holdbarhet enn vandige preparater av immunogenene.

Foreliggende oppfinnelse vil nå beskrives ytterligere med referanse til de følgende eksempler, som ikke bør opp-fattes som begrensende for oppfinnelsen.

Eksemplene refererer til figurene, hvori

FIGUR 1: viser respons mot tetanustoksoid etter oral administrering av en formulering ifølge oppfinnelsen; og FIGUR 2: viser respons mot tetanustoksoid etter subkutan administrering av en formulering ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 1

1 ml tetanustoksoid, i en konsentrasjon på 3000 Lf/ml (6 mg/ml), ble dialysert over natten mot 1 liter destillert vann. Soya-fosfatidylcholin ble dispergert i destillert vann ved probesonikering i 10 minutter under avkjøling, ved en konsentrasjon på 100 mg/ml. En ml av denne oppløsning ble dispergert i en 2 ml glassampulle med skrukork, og 40 ul tetanustoksoid (5 mg/ml etter fortynning) ble tilsatt under omrøring. Blandingen ble lyofilisert over natten og 1 ml oljesyre ble tilsatt. Det ble erholdt en krystallklar oppløsning som ble lagret nedfrosset inntil bruk.

100 pl av dette preparat (referert til som formulering 'A') ble administrert enten subkutant eller gjennom en magesonde til innavlede, unge voksne sveitiske mus (20 ug tetanustoksoid pr. dyr, 3-4 mus pr. gruppe) oppbevart tre og tre i et bur under kontrollerte betingelser, og tilført mat og vann ad 112?. Plasmaprøver ble uttatt fra halevenen to uker etter administrering, og antistoff-IgG-nivåene mot tetanus-antigen ble målt ved sandwich ELISA ved en 1:100 fortynning. Resultatene uttrykt som optisk tetthet ved 450 nm er vist i fig.l og 2.

Eksempel 2

Soya-fosfatidylcholin ble dispergert i destillert vann ved probesonikering i 10 minutter under avkjøling, ved en konsentrasjon på 100 mg/ml. 1 ml av denne oppløsning ble over-ført til en 2 ml glassampulle med skrukort og 40 ul tetanustoksoid, som i eksempel<*>A', ble tilsatt under omrøring. Blandingen ble lyofilisert over natten og 1 ml Miglyol 818 ble tilsatt. Det ble erholdt en krystallklar oppløsning som ble lagret nedfrosset inntil bruk.

100 pl av dette preparat (referert til som formulering 'B') ble administrert enten subkutant eller gjennom en

nagesonde til innavlede, unge voksne sveitiske mus (20 ug tetanustoksoid pr. dyr, 3-4 mus pr. gruppe) oppbevart tre og tre i et bur under kontrollerte betingelser og foret med mat og vann ad lib. Plasmaprøver ble uttatt fra halevenen to uker2tter administrerig og antistoff-(IgG)-nivåene ble målt ved sandwich ELISA ved en 1:100 fortynning. Resultatene, uttrykt som optisk tetthet ved 450 nm, er vist i fig.l og 2.

Eksempel 3

Soya-fosfatidylcholin ble dispergert i destillert/ann ved probesonikering i 10 minutter under avkjøling, ved en

<onsentrasjon på 100 mg/ml. 1 ml av denne oppløsning ble over-ført til en 2 ml glassampulle med skrukort, og 40 ul tetanustoksoid, som i eksempel 'A', ble tilsatt under omrøring. 31andingen ble lyofilisert over natten og 1 ml av en kommer-siell solsikkeolje ble tilsatt. Det ble erholdt en krystall-clar oppløsning som ble lagret nedfrosset inntil bruk.

100 ul av dette preparat (referert til som formulering 'B') ble enten administrert subkutant eller gjennom en nagesonde til innavlede, unge voksne sveitiske mus (20 ug :etanustoksoid pr. dyr, 3-4 mus pr. gruppe) oppbevart tre og :re i et bur under kontrollerte betingelser og foret med mat

>g vann ad lib. Plasmaprøver ble uttatt fra halevenen to uker itter administrering og antistoff-(IgG)-nivåene ble målt ved sandwich ELISA ved 1:100-fortynning. Resultetene, uttrykt som

>ptisk tetthet ved 450 nm, er vist i fig.l og 2.

eksempel 4

Heksadecylfosforylcholin ble oppløst i destillert rann ved en konsentrasjon på 100 mg/ml. 500 pl av denne opp-.øsning ble overført til en 2 ml glassampulle med skrukork og JO pl tetanustoksoid, som i eksempel 'A', (5 mg/ml etter for-:ynning) ble tilsatt under omrøring. Blandingen ble lyofilisert over natten og 500 pl oljesyre ble tilsatt. Det ble irholdt en krystallklar oppløsning som ble lagret nedfrosset

.nntil bruk.

100 pg av dette preparat (referert til som formulering 'D') ble administrert gjennom en magesonde til innavlede,

unge voksne sveitsiske mus (20 ug tetanustoksoid pr. dyr, 3-4 mus pr. gruppe) oppbevart tre og tre i et bur under kontrollerte betingelser og foret med mat og vann ad lib. Plasma-prøver ble uttatt fra halevenen to uker etter administrering og antistoff-(IgG)-nivåene ble målt ved sandwich ELISA ved 1:100 fortynning. Resultatene, uttrykt som optisk tetthet ved 450 nm, er vist i fig.l.

Eksempel 5

p-oktylglukosid ble oppløst i destillert vann ved en konsentrasjon på 100 mg/ml. 500 pl av denne oppløsning ble overført til en 2 ml glassampulle med skrukork og 20 pl tetanustoksoid, som i eksempel 'A', (5 mg/ml etter fortynning) ble tilsatt under omrøring. Blandingen ble lyofilisert over natten og 500 pl glyserolmonooleat ble tilsatt. Det ble erholdt en krystallklar oppløsning som ble lagret nedfrosset inntil bruk.

100 pl av dette preparat (referert til som formulering 'E') ble administrert subkutant til innavlede, unge voksne sveitsiske mus (20 pg tetanustoksoid pr. dyr, 3-4 mus pr. gruppe) oppbevart tre og tre i et bur under kontrollerte betingelser og foret med mat og vann ad lib. Plasmaprøver ble uttatt fra halevenen to uker etter administrering, og anti-stof f-( IgG)-nivåene ble målt ved sandwich ELISA ved 1:100-fortynning. Resultatene, uttrykt som optisk tetthet ved 450 nm, er vist i fig.2.

Eksempel 6

Det amfifile p-oktylglukosid ble oppløst i destillert vann i en konsentrasjon på 100 mg/ml. 500 pl av denne oppløs-ning ble overført til en 2 ml glassampulle med skrukork, og 20 pl tetanustoksoid, som i eksempel 'A', (5 mg/ml etter fortynning) ble tilsatt under omrøring. Blandingen ble lyofilisert over natten og 500 pl fytol ble tilsatt. Det ble erholdt en krystallklar oppløsning som ble lagret nedfrosset inntil bruk.

100 pl av dette preparat (referert til som formulering 'F') ble administrert subkutant til innavlede, unge voksne sveitsiske mus (20 pg tetanustoksoid pr. dyr, 3-4 mus

pr. gruppe) oppbevart tre og tre i et bur under kontrollerte betingelser og foret med mat og vann ad lii». Plasmaprøver ble uttatt fra halevenen to uker etter administrering og anti-stof f-(IgG)-nivåene ble målt ved sandwich ELISA ved l:100-fortynning. Resultatene, uttrykt som optisk tetthet ved 450 nm, er vist i fig.2.

Claims (36)

1. Immunogenpreparat hvori et immunogen er oppløst eller på annen måte fordelt i et hydrofobt oppløsningsmiddel i fravær av en hydrofil fase, karakterisert ved at det omfatter: (i) en ordningsrekke av amfifile molekyler med deres hydrofile hodegrupper orientert mot immunogenet og hvori det ikke foreligger noen kjemisk interaksjon mellom de amfifile molekyler og immunogenet; og (ii) et hydrofobt oppløsningsmiddel rundt amfifil/- immunogenordningsrekken.

2. Immunogenpreparat ifølge krav 1, karakterisert ved at immunogenet er oppløst i det hydrofobe opplø sningsmiddel for å danne en enkel fase.

3. Immunogenpreparat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at immunogenet er et antigen.

4. Immunogenpreparat ifølge ethvert av kravene 1 til 3, karakterisert ved at det er en vaksine eller kan anvendes ved fremstilling av en vaksine.

5. Immunogenpreparat ifølge krav 4, karakterisert ved at vaksinen er en oral vaksine.

6. Immunogenpreparat ifølge ethvert av kravene 1 til 5, karakterisert ved at immunogenet er utvalgt fra difteriatoksoid, tetanustoksoid, botulintoksoid, slangevenomantigener, hepatitt B-antigener, kikhostesubenhet, influensa a og/eller b (eller hele drepte virus eller proteinsubenheter), koleraantigener, H. pylori-antigener, hele bakterier eller ekstrakter derav, f.eks. P. aeruginosa, chlamydia-arter, neisseria-arter, yersiiiia-arter, salmonella- arter, sopp eller soppantigener, f.eks. fra candida, rabiesvirus, poliovirus, rotavirus, meslingvirus, rubella, respiratorisk syncytiumvirus, HIV, BCG, andre mycobakterielle antigener, H. influenza A eller B (med eller uten bærerprotein), protozoantigener, f.eks. malaria, leishmania, toksoplasma, trypanosoma, trematodeantigener, f.eks. schistosoma, cestodeantigener, f.eks. fra cysticerca, echinococcus, nematodeantigener, f.eks. toxocara, bendelorm og filaria, spirochetantigener, f.eks. borre!ia-arter, overflatemembranepitoper spesifikke for cancerceller og cellereseptormålrettede antiinflammatoriske immunmodulatorer (for behandling av inflammatoriske sykdommer som Crohns sykdom og rheumatoid arthritt, f.eks. anti-TNF-R og anti-IL-lR, polysakkarider eller polymerkonjugater av steroider.

7. Immunogenpreparat ifølge ethvert av kravene 1-6, karakterisert ved at to eller flere antigener presenteres sammen i preparatet.

8. Immunogenpreparat ifølge krav 7, karakterisert ved at et proteinantigen og et polysakkaridantigen er presentert sammen.

9. Immunogenpreparat ifølge ethvert av kravene 1-8, karakterisert ved at immunogenet er et peptid, polysakkarid eller et annet antigen konjugert med minst en middels- eller langkjedet hydrokarbonhale.

10. Immunogenpreparat ifølge ethvert av kravene 1-9, karakterisert ved at en eller flere ytterligere immunstimulanter er til stede.

11. Immunogenpreparat ifølge krav 10, karakterisert ved at den ytterligere immun-stimulant (stimulanter) er utvalgt fra IL-4, IL-10, IL-12, y-interferoner, monofosforyl-lipid A, mycobakterielle ekstrakter, muramyldipeptid og analoger derav, tuftsin og kolerasubenhet B, og varmelabilt toksin fra E. colt.

12. Immunogenpreparat ifølge ethvert av kravene 1-3, karakterisert ved at det vil forårsake en reduksjon eller eliminering av immunrespons mot antigenet.

13. Immunogenpreparat ifølge krav 12, karakterisert ved at antigenet er et HLA-antigen eller DNA.

14. Immunogenpreparat ifølge ethvert av kravene 1-3, karakterisert ved at det vil desensibilisere immunresponsen.

15. Immunogenpreparat ifølge krav 14, karakterisert ved at antigenet er utvalgt fra pollen, støvmiddantigener eller matallergener.

16. Fremgangsmåte for fremstilling av et immunogenpreparat, karakterisert ved at: (i) immunogenet forbindes med et amfifilt materiale i et flytende medium; (ii) det flytende medium fjernes for å etterlate en ordningsrekke av amfifile molekyler med deres hydrofile hodegrupper orientert mot immunogenet, og hvori det ikke foregår noen kjemisk interaksjon mellom det amfifile materialet og immunogenet; og (iii) et hydrofobt løsningsmiddel tilveiebringes rundt immunogen/amf i f i1-ordningsrekken.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at den modifiseres med en eller flere av trekkene ifølge krav 3-15.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 16 eller 17, karakterisert ved at det amfifile materiale er et fosfolipid, oktylglukosid, a-tokoferol eller estere derav, eller et gallesalt, eller blandinger derav.

19.F remgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at fosfolipidet har en fosfatidylcholin-hodegruppe.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at fosfolipidet er fosfatidylcholin (PC), lyso-fosfatidylcholin (lyso-PCD), sphingomelcin, et derivat av en av de ovennevnte, slik som heksadecylfosfocholin eller en amfifil polymer inneholdende fosforylcholin.

21. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 16-20, karakterisert ved at det hydrofobe løsnings-middel omfatter et hydrokarbon, f.eks. mineralolje eller squalen, en langkjedet fettsyre, en middelskjedet alkohol, en polyol, f.eks. a-tokoferol, et middels- eller langkjedet mono-, di- eller triglyserid, eller blandinger derav.

22. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 16-20, karakterisert ved at det amfifile materiale omfatter PC og det hydrofobe løsningsmiddel er et triglyserid, eller at det amfifile materiale omfatter lyso-PC og det hydrofobe løsningsmiddel er oljesyre.

23. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 16-20, karakterisert ved at immunogen/amfifil-ordningsrekken dannes ved å blande immunogenet med en dispersjon av et amfifilt materiale i et hydrofilt løsningsmiddel, etterfulgt av fjerning av det hydrofile løsningsmiddel.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at det hydrofile løsnings-middel er vann.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 23 eller 24, karakterisert ved at den amfifile sammenset-ning omfatter miceller, unilamellære vesikler, multilamellære vesikler eller en rørformet struktur, slik som sneglehusform-ede sylindere, heksagonale, kubiske eller myelintype strukturer.

26. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 23-25, karakterisert ved at det hydrofile løsnings-middel fjernes ved lyofilisering.

27. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 16-23, karakterisert ved at immunogen/amfifil-ordningsrekken dannes ved samtidig oppløsning av immunogenet og det amfifile materiale i et felles løsningsmiddel og deretter fjerning av det felles løsningsmiddel.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 27, karakterisert ved at vektforholdet mellom amfifilt materiale og immunogen er fra ca. 1:1 til 50:1.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at det hydrofobe løsnings-middel er et lavtkokende organisk løsningsmiddel, slik som dietyleter.

30. Enfaset hydrofobt preparat av et immunogen i et hydrofobt løsningsmiddel, karakterisert ved at det kan erholdes ved en fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 16-29.

31. Tofasepreparat, karakterisert ved at det omfatter en hydrofil fase og en hydrofob fase hvori den hydrofobe fase omfatter et preparat ifølge ethvert av kravene 1-15, eller et preparat ifølge krav 30.

32. Preparat ifølge krav 31, karakterisert ved at den hydrofobe fase er dispergert i en kontinuerlig hydrofil fase.

33. Preparat ifølge krav 31 eller 32, karakterisert ved at det er en emulsjon.

34. Anvendelse av et immunogen oppløst i et hydrofobt løsningsmiddel som det vanligvis ikke ville være oppløselig i, ved fremstilling av et immunogenpreparat.

35. Anvendelse ifølge krav 34, hvori immunogenpreparatet er en oral vaksine.

36. Enteralt overtrukket kapsel, karakterisert ved at den inneholder et immunogenpreparat ifølge ethvert av kravene 1-15, eller et enfaset hydrofobt preparat ifølge krav 30.