DE69418334T2

DE69418334T2 - Verfahren zur hohen beladung von vesikeln mit biopolymeren substanzen

Info

Publication number: DE69418334T2
Application number: DE69418334T
Authority: DE
Inventors: Yechezkel Barenholz; Israel Nur
Original assignee: Opperbas Holding BV
Current assignee: Opperbas Holding BV
Priority date: 1993-08-06
Filing date: 1994-07-08
Publication date: 2000-01-27
Anticipated expiration: 2014-07-09
Also published as: DE69418334D1; ATE179599T1; CA2168671A1; WO1995004524A1; EP0713388B1; JPH09501169A; ES2131206T3; CA2168671C; AU7384994A; EP0815852A1; IL110305A; EP0713388A1; IL110305A0

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine hohe Beladung von Vesikeln mit biopolymeren Substanzen, die Funktionen in humanen biochemischen oder physiologischen Systemen erfüllen und die von einer beliebigen Quelle stammen, wobei die Substanzen vorzugsweise Enzyme, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Proenzyme, Cofaktoren, Submikronteilchen, wie Virionen, Ribosomen, Hepatitis-B- Oberflächenantigen, Vakzinen, Oligo- und Polynucleotide, Antikörper und/oder Antigene sind, wobei die Vesikel aus amphipathischen Substanzen gebildet sind, auf eine Zubereitung von Substanzen, die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhältlich sind und eine verbesserte Menge an in die Vesikel geladenen Wirkstoffen aufweisen, auf ein Medikament, das die Zubereitung der Erfindung umfaßt, sowie auf ein Verfahren zur Behandlung von Krankheiten durch Verabreuchen einer wirksamen Menge des Medikaments der Erfindung.
Mehrere Versuche wurden unternommen, um aus natürlichen oder synthetischen Phospholipiden gebildete Lipidvesikel als Träger für die Verabreichung von Wirkstoffen zu verwenden.
A. Grey und J. Morgan berichten, daß Liposomen erstmals vor fast einem Vierteljahrhundert beschrieben wurden und nützliche Modelle sind, um die physikalische Chemie von Lipiddoppelschichten und die Biologie der Zellmembran zu studieren. Es wurde auch erkannt, daß sie als Träger für die Verabreichung von Wirkstoffen verwendet werden könnten, aber klinische Anwendungen wurden nur langsam gefunden. Zu den vorgeschlagenen klinischen Verwendungen gehören die Impfstoffadjuvanz, Genübertragung und diagnostische Bildgebung, aber die größten Anstrengungen richteten sich auf die Entwicklung von Liposomen als zielsteuerbare Wirkstoffträger bei der Behandlung maligner Tumore. Obwohl sie auf guten in-vitro-Daten und Tierversuchen beruhten, waren die Strategien wegen der vorherrschenden, aber unerwünschten Aufnahme durch das reticuloendotheliale System und dem begrenzten Ausmaß der Extravasation meistens praktisch nicht durchführbar. Dieselben Merkmale gereichten dennoch im Falle von Amphoterin B zum Vorteil, das seit kurzem das erste liposomal zubereitete Mittel ist, daß für die parenterale Verwendung lizensiert wurde. Liposomales Doxorubicin wird zur Zeit ebenfalls in klinischen Versuchen bewertet. Das bisherige Beweismaterial läßt vermuten, daß die liposomale Einkapselung zwar die Wirkung vielleicht nicht besonders erhöht, die Toxizität dieser Mittel aber stark gedämpft wird (A. Gray, J. Morgan, "Liposomes in Haematology" in Blood Reviews, 1991, 5, 258-271).
Liposomen werden in biologischen Systemen wie dem Plasmaextravaskularraum, zum Beispiel dem reticuloendothelialen System, verwendet, um einen größeren Zugang zur Aufnahme von Liposomen in Zellen zu erhalten. Liposomen wurden mit Amphotericin beladen, einem wirksamen, aber toxischen Fungizid. Tumormedikamente, wie Adriamycin, wurden ebenfalls in Liposomen eingebaut. Impfstoffe und Adjuvantien sowie Modifikatoren der biologischen Reaktion, wie Lymphokine usw., wurden in eingekapselter Form untersucht. Liposomen werden auf dem Gebiet der Genübertragung als Träger diskutiert.
N. Sakuragawa et al. berichten in Thrombosis Research 38, 681- 685, 1985, 1988, Clinical Hematology 29(5), 655-661, daß Liposomen, die Faktor VIII enthalten, für die orale Verabreichung an Patienten hergestellt wurden, die an der von-Willebrand- Krankheit leiden. Die Einkapselung erfolgte durch Auflösen der Protein-Faktor-VIII-Konzentrate in einer aprotininhaltigen Lösung und Überführung in lecithinbeschichtete Kolben. Nach dem Trocknen der Kolben durch Rotation während 30 min unter negativem Druck entstanden Liposomen, die Faktor-VIII-Konzentrate einschlossen. Die Liposomenlösung wurde zentrifugiert, was 40% in Liposomen eingeschlossenen Faktor VIII ergab.
Ein weiteres Verfahren zum Einschluß von Wirkstoffen in Liposomen beruht auf der Dehydratisierung/Rehydratisierung und wurde beschrieben von C. Kirby und G. Gregoriadis in Bio/Technology, November 1984, Seite 979-984. Bei dieser Herstellung können die eingeschlossenen Mengen erhöht werden, indem man zusätzliches Lipid verwendet. Offenbart ist die Verwendung von Cholesterol, das einen positiven Einfluß auf den Wirkstoffeinschluß habe. Da Cholesterol an der Pathobiochemie einiger Störungen beteiligt ist, ist die Verabreichung cholesterolhaltiger Vesikel überhaupt nicht harmsol.
Im Journal of Pharmaceutical Sciences, 79, 1990, S. 1045-1052, ist ein Verfahren offenbart, das in einem Alkohol-Vormischungsschritt t-Butanol verwendet, um ein Lipid-DXR-Gemisch herzustellen. DXR ist die Verbindung Doxorubicin, bei der es sich um eine organische Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht handelt.
EP-A-0 119 020 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Liposomen und die dadurch erzeugten Produkte. Das Verfahren wird bereitgestellt, um eine stabile Liposomenvorstufe in Form eines teilchenförmigen Trägermaterials bereitzustellen, das mit dünnen Schichten von Liposomenkomponenten beschichtet ist, wobei das Verfahren die Schritte des. Auflösens wenigstens eines liposombildenden amphipathischen Lipids, gegebenenfalls wenigstens eines biologischen Wirkstoffs sowie gegebenenfalls wenigstens eines Hilfsstoffes in einem geeigneten Lösungsmittel und des Verwendens der resultierenden Lösung zum Beschichten eines geeigneten teilchenförmigen Trägermaterials, der in dem oben genannten Lösungsmittel im wesentlichen unlöslich ist, so daß dünne Schichten von Liposomenkomponenten darauf entstehen, umfaßt. Bei der Einwirkung von Wasser auf das beschichtete Trägermaterial werden die dünnen Schichten von Liposomenkomponenten hydratisiert. Wenn das Trägermaterial in Wasser unlöslich ist, wird es dann abgetrennt, z. B. durch Filtration oder Zentrifugation.
DE 33 35 701 A1 offenbart ein verbessertes Verfahren zur Herstellung großer multilamellarer Lipidvesikel (LMV). Solche Liposomen können für die Einkapselung biologischer Wirkstoffe in besonderen lipophilen Substanzen verwendet werden.
Gemäß DE 33 35 701 wird ein Lipidfilm auf inerten festen Kontaktmassen innerhalb eines Kolbens gebildet, indem man ein organisches Lösungsmittel verdampft. Durch anschließende Bewegung in Gegenwart einer wäßrigen Flüssigkeit, worauf eine Zeit folgt, in der der Kolben ohne jede Bewegung bleibt, werden die multilamellaren Vesikel gebildet. Das Verfahren eignet sich zur Einkapselung sowohl hydrophiler als auch lipophiler Stoffe.
EP-A1-0 317 803 offenbart Verfahren zur Erzeugung wäßrige Flüssigkeit einkapselnder multilamellarer Lipidvesikel (Liposomen), wobei ein oder mehrere Lipide oder Lipidkonjugate und eine einzukapselnde wäßrige Flüssigkeit in einem Gefäß in Gegenwart sphärischer Kontaktmassen mit einem mittleren Durchmesser von weniger als 3000 um, wobei der bevorzugte Größenbereich 50 bis 100 um Durchmesser ist, gerührt werden, was zu einer im wesentlichen homogenen Population von Vesikeln mit. Durchmessern im Bereich von etwa 150 bis etwa 3000 Nanometer führt. Die Verfahren ermöglichen die Verwendung kleiner Mengen Marker und Lipid, hinterlassen keine Lösungsmittelreste, ermöglichen einen ausschließlichen Kontakt mit Glasoberflächen und beinhalten keine Übertragung von Liposompräparaten aus Lipidschicht-Trocknungsgefäßen in eine Dimensionierungsapparatur.
WO 80/01456 offenbart pharmazeutische Zusammensetzungen, die Liposomen enthalten, die aus Phospholipiden in Gegenwart von Blutgerinnungsfaktor VIII (Antihämophiliefaktor) gebildet wurden; sie erwiesen sich als wirksam bei oraler Verabreichung, indem sie den Blutplasmaspiegel an Faktor VIII erhöhen. Das Dokument offenbart solche pharmazeutischen Zusammensetzungen und Verfahren zu ihrer Herstellung.
US-A-4,348,384 offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung, die für die Behandlung und Prophylaxe von Hämophilie A oder B geeignet ist und die den Gerinnungsfaktor VIII oder IX sowie einen Protease-Inhibitor (insbesondere Aprotinin) umfaßt, die in Liposomen eingebaut und gegebenenfalls lyophilisiert und/ oder in Darmkapseln eingekapselt werden. Die Zusammensetzung kann eine hohe Resorption des erforderlichen Gerinnungsfaktors aus dem Darmtrakt aufweisen, ohne in Magen-Darm-Trakt zersetzt zu werden, selbst bei oraler Verabreichung.
Ein Nachteil des Liposomenpräparats des Stands der Technik ist zum Beispiel die geringe Einkapselungseffizienz der Substanzen, die weniger als 50% beträgt.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein verbessertes Verfahren zur Beladung von Vesikeln (Liposomen) mit biopolymeren Substanzen, wie pharmazeutischen Wirkstoffen, zum Beispiel Enzymen, Proenzymen, Cofaktoren, Antikörpern oder Antigenen, bereitzustellen. Ein weiteres Ziel besteht darin, eine Zubereitung mit Vesikeln (Liposomen), die mit einem hohen Gehalt an Wirkstoffen beladen sind, bereitzustellen. Ein weiteres Ziel besteht darin, die Verwendung der Zubereitung der Erfindung zur Behandlung und Prävention von Krankheiten aufzuzeigen. Es ist wünschenswert, eine Verbesserung zu erreichen, indem man schädliche Lipide in den Liposomenstrukturen vermeidet.
Überraschenderweise läßt sich mit einem Verfahren, das im folgenden ausführlicher beschrieben ist, die Beladung der Vesikel (Liposomen) verbessern. Der Ausdruck "Vesikel" ist ein Synonym für "Liposom" oder "Liposomenvesikel".
Liposomen können nach verschiedenen Parametern klassifiziert werden. Wenn zum Beispiel die Größe und die Anzahl der Lamellen (strukturelle Parameter) verwendet werden, wurden drei Haupttypen von Liposomen beschrieben: multilamellare Vesikel (MLV), kleine unilamellare Vesikel (SUV) und große unilamellare Vesikel (LUV). MLV sind die Spezies, die sich bei der Hydratisierung getrockneter Phospholipide oberhalb ihrer Temperatur des Übergangs vom Gel zur flüssigkristallinen Phase (Tm) spontan bilden. Ihre Größe ist heterogen, und ihre Struktur ähnelt einer Zwiebelhaut aus abwechselnden konzentrischen wäßrigen und Lipidschichten.
SUV werden durch Ultraschallbehandlung aus MLV gebildet und sind einschichtig. Sie sind die kleinsten Spezies mit einem großen. Verhältnis von Oberfläche zu Volumen und haben somit das kleinste Einschlußvolumen an wäßrigem Raum im Verhältnis zum Gewicht des Lipids.
Ein dritter Liposomentyp, LUV, hat ein großes wäßriges Kompartiment und eine einzige (unilamellar) oder nur wenige (oligolamellar) Lipidschichten.
Weitere Einzelheiten sind offenbart in D. Lichtenberg und Y. Barenholz, Liposomes: Preparation, Characterization, and Preservation, in Methods of Biochemical Analysis, Vol. 33, S. 337-462.
Der hier verwendete Ausdruck "Beladung" bedeutet jede Art von Wechselwirkung der biopolymeren Substanzen, mit denen beladen werden soll, zum Beispiel eine Wechselwirkung wie Einkapselung, Haftung (an der inneren oder äußeren Wand des Vesikels) oder Einbettung in die Wand mit oder ohne Extrusion der biopolymeren Substanzen.
Der hier verwendete Ausdruck "Liposom" soll alle Sphären oder Vesikel irgendwelcher amphipathischen Verbindungen umfassen, die spontan oder nicht-spontan Vesikel bilden können, zum Beispiel von Phospholipiden, bei denen wenigstens eine Acylgruppe durch einen komplexen Phosphorsäureester ersetzt ist. Die meisten Triacylglycerine sind geeignet, und die häufigsten Phospholipide für die vorliegende Erfindung sind die Lecithine (die auch als Phosphatidylcholine (PC) bezeichnet werden), bei denen es sich um Gemische der Diglyceride von Stearin-, Palmitin- und Oleinsäure handelt, die mit dem Cholinester von Phosphorsäure verknüpft sind. Lecithine findet man in allen Tieren und Pflanzen, wie Eiern, Sojabohnen und Tiergeweben (Hirn, Herz und dergleichen), und sie können auch synthetisch hergestellt werden. Die Quelle des Phospholipids oder sein Syntheseverfahren sind nicht entscheidend; jedes natürlich vorkommende oder symnthetische Phosphatid kann verwendet werden.
Beispiele für spezielle Phosphatide sind L-α-(Distearoyl)lecithin, L-α-(Dipalmitoyl)lecithin, L-α-Phosphatidsäure, L-α-(Dilauroyl)phosphatidinsäure, L-α-(Dimyristoyl)phosphatidinsäure, L-α-(Dioleoyl)phosphatidinsäure, DL-α-(Dipalmitoyl)phosphatidinsäure, L-α-(Distearoyl)phosphatidinsäure und die verschiedenen Typen von L-α-Phosphatidylcholinen, die aus Hirn, Leber, Eidotter, Herz, Sojabohnen und dergleichen oder synthetisch hergestellt werden, sowie Salze davon. Zu den weiteren geeigneten Modifikationen gehören die kontrollierte Peroxidierung der Fettsäureacylrest-Vernetzer in den Phosphatidylcholinen (PC) und die zwitterionischen Amphipaten, die von selbst oder beim Mischen mit den PCs Micellen bilden, wie Alkylanaloga von PC.
Die Phospholipide können in der Reinheit variieren und können auch entweder vollständig oder partiell hydriert sein. Die Hydrierung reduziert das Ausmaß der unerwünschten Peroxidierung und modifiziert und steuert die Temperatur des Übergangs vom Gel zur flüssigkristallinen Phase (Tm), die die Packung und das Austreten von Stoffen beeinflußt.
Die Liposomen können auf die Anforderungen jedes speziellen Reservoirs einschließlich verschiedener biologischer Flüssigkeiten "maßgeschneidert" werden, behalten ihre Stabilität ohne Aggregation oder chromatographische Trennung und bleiben in der injizierten Flüssigkeit gut dispergiert und suspendiert. Die Flißefähigkeit in situ ändert sich je nach Zusammensetzung, Temperatur, Salzgehalt, zweiwertigen Ionen und Gegenwart von Proteinen. Das Liposom kann mit oder ohne ein beliebiges weiteres Lösungsmittel oder Tensid verwendet werden.
Eine weiterer wichtiger Aspekt bei der Auswahl des Phospholipids ist dessen Acylkettenzusammensetzung. Zur Zeit hat es vorzugsweise eine Acylkettenzusammensetzung, die wenigstens in bezug auf die Übergangstemperatur (Tm) für die Acylkettenkomponenten in Ei- oder Sojabohnen-PC charakteristisch ist, d. h. eine Kette gesättigt und eine ungesättigt oder beide ungesättigt. Die Möglichkeit der Verwendung von zwei gesättigten Ketten ist jedoch nicht ausgeschlossen.
Die Liposomen können noch andere Lipidkomponenetn enthalten, solange sie keine Instabilität und/oder Aggregation und/oder chromatographische Trennung induzieren. Dies kann mit Routineversuchen bestimmt werden.
Eine Vielzahl von Verfahren zur Herstellung der modifizierten Liposomen, die unilamellar oder multilamellar sind, sind bekannt und verfügbar:
1. Eine dünne Schicht des Phospholipids wird mit einem wäßrigen Medium hydratisiert, und dann wird mechanisch geschüttelt und/oder mit Ultraschall bestrahlt und/oder durch ein geeignetes Filter extrudiert;
2. Auflösen des Phospholipids in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, Mischen mit einem wäßrigen Medium und dann Entfernung des Lösungsmittels;
3. Verwendung von Gas oberhalb seines kritischen Punkts (d. h. Freone und andere Gase, wie CO&sub2;, oder Gemische von CO&sub2; und anderen gasförmigen Kohlenwasserstoffen); oder
4. Herstellen von Lipid-Detergens-Mischmicellen, dann Senken der Konzentration der Detergentien auf ein Niveau unterhalb der kritischen Konzentration, bei der sich Liposomen bilden (Lichtenberg, Barenholz, 1988).
Im allgemeinen erzeugen sie Liposomen mit heterogenen Größen von etwa 0,02 bis 10 um oder darüber. Da Liposomen, die relativ klein sind und eine wohldefinierte Größe haben, für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind, dient ein zweiter Verarbeitungsschritt, der als "Liposomenverkleinerung" definiert ist, zur Reduktion der Größe und Größenheterogenität von Liposomensuspensionen.
Die Liposomensuspension kann so dimensioniert werden, daß man eine selektive Größenverteilung von Vesikeln in einem Größenbereich von weniger als etwa 5 um und vorzugsweise ≤ 0,4 um erreicht. Liposomen in diesem Bereich können leicht sterilisiert werden, indem man sie durch ein geeignetes Filter filtriert. Kleinere Vesikel zeigen auch eine geringere Neigung zum Verklumpen bei der Lagerung, so daß potentiell schwerwiegende Blockierungs- oder Verstopfungsprobleme beim intravenösen Injizieren des Liposoms reduziert werden. Schließlich zeigen Liposomen, deren Größe in den Submikroribereich reduziert wurde, eine gleichmäßigere Verteilung.
Mehrere Techniken stehen zur Verfügung, um die Größen und die Größenheterogenität von Liposomen in einer für die vorliegende Erfindung geeigneten Weise zu reduzieren. Die Ultraschallbe strahlung einer Liposomensuspension entweder durch Standard- Bad- oder Sondenultraschallbehandlung erzeugt eine immer stärkere Größenreduktion bis hinunter zu kleinen unilamellaren Vesikeln (SUVs) mit einer Größe zwischen 0,02 und 0,08 um. Die Homogenisierung ist ein weiteres Verfahren, das auf der Scherenergie beruht, um große Liposomen zu kleineren zu fragmentieren. In einem typischen Homogenisierungsvorgang wird die Liposomensuspension immer wieder durch einen Standard-Emulsionshomogenisator geleitet, bis ausgewählte Liposomengrößen von typischerweise zwischen etwa 0,1 und 0,5 um beobachtet werden. Bei beiden Verfahren kann die Teilchengrößeverteilung durch herkömmliche Laserstrahl-Teilchengrößebestimmung überwacht werden.
Die Extrusion von Liposomen durch ein kleinporiges Polycarbonatfilter oder eine äquivalente Membran ist ebenfalls ein effektives Verfahren zur Reduktion von Liposomengrößen bis zu einer relativ wohldefinierten Größenverteilung, deren Mittelwert im Bereich zwischen etwa 0,02 und 5 um liegt, je nach der Porengröße der Membran. Typischerweise wird die Suspension mehrmals durch eine oder zwei Membranen im Stapel geleitet, bis die gewünschte Größenverteilung der Liposomen erreicht ist. Die Liposomen können durch Membranen mit immer kleineren Poren extrudiert werden, um eine allmähliche Reduktion der Liposomengröße zu erreichen.
Zentrifugation und Molekularsiebohromatographie sind weitere verfügbare Verfahren zur Herstellung einer Liposomensuspension mit Teilchengrößen unterhalb einer gewählten Schwelle von weniger als 1 um. Diese beiden Verfahren beinhalten jeweils die präferentielle Entfernung großer Liposomen und nicht die Umwandlung von größeren Teilchen in kleinere, Die Liposomenausbeuten sind dementsprechend reduziert.
Die größenregulierte Liposomensuspension kann leicht sterilisiert werden, indem man sie durch eine Sterilisationsmembran mit einer Teilchendiskriminierungsgröße von etwa 0,4 um leitet, wie ein herkömmliches Membranfilter mit einer Tiefe von 0,45 um. Die Liposomen sind in lyophilisierter Form stabil und können kurz vor der Verwendung durch Aufnahme in Wasser rekonstituiert werden.
Gemäß dem Verfahren der Erfindung werden die Vesikel mit biopolymeren Substanzen beladen, bei denen es sich um Virionen, Enzyme, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Proenzyme, Cofaktoren, Submikronteilchen, wie Ribosomen, Hepatitis-B-Oberflächenantigen, Vakzinen, Oligo- und Polynucleotide, Antikörper oder antigene Substanzen handelt. Insbesondere Enzyme oder Proenzyme sowie Cofaktoren sind diejenigen, die natürlicherweise im Blutstrom vorkommen. Diese Substanzen sind zum Beispiel solche, die Funktionen in der Blutgerinnungskaskade erfüllen, wie Faktor VII, VIII, IX, X, XIII, Fibrinogen, Prothrombin und/oder Thrombin. Die Liposomen können gemäß dem Verfahren der Erfindung auch mit Substanzen, die fibrinolytische Wirkung haben, wie Plasmin, Plasminogen, oder im Komplementsystem aktiv sind und/oder mit anderen Funktionen im Immunsystem (humoral oder gewebsgebunden) zusammenhängen, beladen werden. Die biopolymeren Substanzen können von einer beliebigen Quelle stammen, wie Tier- oder Humangewebekultur, Mikroorganismen oder transformierten Mikroorganismen, Blut, Blutplasma oder anderen Körperflüssigkeiten.
Geeignete Lipide für die Bildung von Liposomen sind oben beschrieben; besonders bevorzugt sind jedoch Phospholipide, wie Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) und/oder Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG), aus Eiern oder Sojabohnen stammende Phospholipide, wie man sie nach partieller oder vollständiger Reinigung direkt oder nach partieller oder vollständiger Hydrierung erhält.
Im allgemeinen umfaßt das Verfahren der vorliegenden Erfindung (Fig. 1) die folgenden Schritte:
a) Mischen von amphipathischen Substanzen, wie Lipiden, die zur Bildung von Vesikeln geeignet sind, in mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmitteln;
b) Entfernen des Lösungsmittels in Gegenwart eines festen Trägers;
wobei alternativ auch getrocknete amphipathische Substanzen oder Gemische davon in beliebiger Form (Pulver, Granulat usw.) direkt verwendet werden können;
c) Aufnehmen des Produkts von Schritt b) in eine Lösung der biopolymeren Substanzen in einer physiologisch verträglichen Lösung;
d) Hinzufügen eines organischen Lösungsmittels mit solubilisierenden oder dispergierenden Eigenschaften; sowie
e) Trocknen der in Schritt d) erhaltenen Fraktion unter Bedingungen, die die Funktion der biopolymeren Substanzen erhalten.
Dieses Verfahren wird im folgenden als Verfahren A bezeichnet.
Gemäß Schritt a) des Verfahrens der Erfindung werden amphipathische Substanzen, die zur Bildung von Vesikeln, wie sie oben erwähnt sind, geeignet sind, in einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel gemischt. Vorzugsweise ist das mit Wasser unmischbare organische Lösungsmittel ein polar-aprotisches Lösungsmittel, wie fluorierte Kohlenwasserstoffe, chlorierte Kohlenwasserstoffe und dergleichen.
In Schritt b) des Verfahrens der Erfindung wird das Lösungsmittel in Gegenwart eines festen Trägers entfernt. Vorzugsweise ist der feste Träger ein inertes organisches oder anorganisches Material mit einer perlenartigen Struktur. Vorzugsweise ist das Material des anorganischen Trägermaterials Glas, und bei dem organischen Material kann es sich um Teflon oder andere ähnliche Polymere handeln.
Schritt c) des Verfahrens der Erfindung dient der Aufnahme des Produkts von Schritt b) in eine Lösung der einzukapselnden Substanzen in einer physiologisch verträglichen Lösung. Vorzugsweise ist die physiologisch verträgliche Lösung einer Natriumchloridlösung von bis zu etwa 1,5 Gew.-% äquivalent. Es ist auch möglich, andere Salze zu verwenden, solange sie physiologisch verträglich sind, z. B. als Kryoschutzmittel, z. B. Zucker und/oder Aminosäuren. Vorzugsweise wird Lactose, Sucrose oder Trehalose als Kryoschutzmittel verwendet.
Gegebenenfalls kann zwischen Schritt a) und b) ein Schritt der Virusinaktivierung, Sterilisation, Depyrogenierung, Filtration der Fraktion von Schritt a) oder dergleichen vorgesehen sein. Dies könnte vorteilhaft sein, um in einem frühen Stadium der Herstellung eine pharmazeutisch annehmbare Lösung zu haben.
Schritt d) des Verfahrens der Erfindung besteht im Hinzufügen eines organischen Lösungsmittels mit solubilisierenden oder dispergierenden Eigenschaften. Vorzugsweise ist dieses organische Lösungsmittel ein mit Wasser mischbares organisches polarprotisches Lösungsmittel. Vorzugsweise können niedere aliphatische Alkohole mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette verwendet werden. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von tert.-Butanol. Wie der Fachmann weiß, hängt die Menge des mit Wasser mischbaren organischen polar-protischen Lösungsmittels stark von seiner Interferenz mit der Substanz ab, mit der die Liposomen beladen werden sollen. Wenn sie zum Beispiel mit einem Protein beladen werden sollen, wird die Obergrenze durch die Menge an Lösungsmittel bestimmt, durch die die Wirksamkeit des Protein beeinträchtigt wird. Dies kann stark mit der Natur der Substanz, mit der beladen werden soll, variieren. Wenn zum Beispiel mit Faktor IX, einem Gerinnungsfaktor, beladen werden soll, ist eine Menge von etwa 30% tert.-Butanol tolerierbar, während Faktor VIII viel empfindlicher gegenüber dem Einfluß von tert.-Butanol ist. In diesem Fall ist eine Menge von weniger als 10% tert.-Butanol bevorzugt. Der Prozentsatz an tert.- Butanol in diesen Beispielen beruht auf Volumenprozenten, die für die endgültige Konzentration berechnet sind.
Gegebenenfalls kann nach Schritt d) eine Virusinaktivierung, Sterilisierung und/oder Portionierung der nach Schritt d) erhaltenen Fraktion durchgeführt werden.
Schritt e) der vorliegenden Erfindung besteht im Trocknen der in Schritt d) erhaltenen Fraktion unter Bedingungen, die die Funktion der Substanz, mit der beladen werden soll, erhalten. Ein bevorzugtes Verfahren zum Trocknen des Gemischs ist die Lyophilisierung. Die Lyophilisierung kann in Gegenwart eines Kryoschutzmittels, zum Beispiel Lactose oder anderer Saccharide oder Aminosäuren, durchgeführt werden. Alternativ dazu kann eine Verdampfung oder Sprühtrocknung verwendet werden.
Der getrocknete Rückstand kann dann vor der Verwendung in einem wäßrigen Medium aufgenommen werden. Nach der Aufnahme des Feststoffs bildet er eine Dispersion der betreffenden Liposomen. Das wäßrige Medium enthältvorzugsweise eine Kochsalzlösung, und die gebildete Dispersion kann gegebenenfalls durch ein geeignetes Filter geleitet werden, um die Größe der Liposomen zu reduzieren, falls erforderlich. Vorzugsweise haben die Liposomen eine Größe von 0,02 bis 5 um, besonders bevorzugt im Bereich von 0,4 um.
Die nach dem Verfahren der Erfindung erhältlichen Liposomen zeigen eine hohe Beladung mit den biopolymeren Substanzen.
Gemäß der Erfindung wird eine nach dem Verfahren der Erfindung erhältliche Zubereitung beansprucht, die biopolymere Substanzen umfaßt, wie Enzyme, Proenzyme, Cofaktoren, Antigene und/oder Antikörper, die. Funktionen in humanen biochemischen oder physiologischen Systemen erfüllen. Die Zubereitung umfaßt Liposomen, die mit den oben genannten Substanzen beladen sind, die zum Beispiel natürlicherweise im Blutstrom vorkommen, wie solche, die Funktionen in der Blutgerinnungskaskade erfüllen, wie Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Fibrinogen, Prothrombin und/oder Thrombin, oder die fibrinolytische Wirkung haben, wie Plasminogen, Plasmin, oder im Komplementsystem aktiv sind und/oder mit anderen Funktionen im Immunsystem (humoral oder gewebsgebunden) zusammenhängen. Letzteres können Antigene oder Antikörper sein. Die Zubereitung der Erfindung kann auch ein Zwischenprodukt sein, das durch Isolierung einer der Fraktionen von Schritt c) oder d) des Verfahrens der Erfindung erhältlich ist. Gemäß der Erfindung umfaßt die Zubereitung der Erfindung auch eine wäßrige Dispersion, die nach dem Aufnehmen des Produkts von Schritt e) des Verfahrens der Erfindung in Wasser in Form einer Dispersion (Liposomen in wäßrigem Medium) erhältlich ist.
Die Zubereitung der Erfindung kann verwendet werden, um ein Medikament herzustellen, das die Zubereitung und/oder zusätzlich noch andere pharmazeutische Wirkstoffe sowie Träger und/oder Hilfsstoffe und Vakzinen umfaßt.
Das Verfahren der Erfindung zeigt in vorteilhafter Weise eine hohe Beladung mit den jeweiligen Substanzen. Insbesondere ist das Verfahren der Erfindung geeignet, um Enzyme, Proenzyme und/oder Cofaktoren einzubauen, die natürlicherweise im Blutstrom vorkommen, wie Faktor VII, VIII, IX, XIII, die eine wichtige Rolle in der Blutgerinnungskaskade erfüllen.
Die Zubereitung der vorliegenden Erfindung in Form eines Medikaments hat einen vorteilhaften Anwendungsbereich, da die z. B. mit Gerinnungsfaktoren beladenen Liposomen überraschenderweise nicht nur eine verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs zeigen, sondern auch eine sehr geringe Immunreaktivität sowie ein unerwartetes pharmakokinetisches Verhalten. Dies kann auf eine Anhäufung der Liposomen in einem Organ, wahrscheinlich der Leber, zurückzuführen sein, wobei der betreffende Gerinnungsfaktor während einer unerwartet langen Zeitspanne und in einer unerwarteten Menge aus dem Organ freigesetzt wird. Die geringe Antigenität und Erkennung durch Inhibitoren bei den proteinartigen Substanzen, mit denen die gemäß dem Verfahren der Erfindung erhältlichen Liposomen beladen sind, kann auf die "Maskierung" dieser Substanzen in den Liposomen zurückzuführen sein. Die unerwartete Pharmakokinetik ist in den Fig. 4 und 6 gezeigt, in denen die zweiphasige Freisetzung der aktiven Faktoren gezeigt ist.
Somit wird auch die Verwendung der nach dem Verfahren der Erfindung erhältlichen Liposomen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten durch Verabreichung einer wirksamen Menge des Medikaments beansprucht. Die Zubereitungen sind oral, bukkal, intravenös, topisch, intraperitoneal, pulmonal oder rektal. Wenn zum Beispiel Blutungsstörungen behandelt werden müssen, sollen mit den betreffenden Faktoren beladene Liposomen gebildet und dem Patienten verabreicht werden. Vorzugsweise erfolgt dies intravenös.
Wie der Fachmann weiß, hängt die Dosierung des Medikaments der Erfindung von der Konzentration der biopolymeren Wirkstoffe sowie ihrer Effizienz ab.
Vorzugsweise wird den Patienten eine Dosierung von bis zu 2000 mg Liposomenlipid pro kg Körpergewicht verabreicht, wobei die aktiven Faktoren in den Liposomen mit einer Effizienz von mehr als 50% beladen werden, bezogen auf die zur Herstellung der beladenen Liposomen verwendeten Gesamtaktivität.
Die genaue Dosis kann dramatisch variieren. Die Variation hängt jedoch z. B. vom Typ und der Wirksamkeit der in den Liposomen eingekapselten Substanz, der Effizienz der Einkapselungsreakti on selbst (die bei dem Verfahren der Erfindung hoch ist), der Art der Verabreichung und dergleichen ab. Die jeweiligen Parameter können vom Fachmann leicht optimiert werden, was man als Routineversuche ansehen kann.
Die folgenden spezielleren Ausführungsformen erläutern die Erfindung näher:
Es gibt zwei Haupttypen von Vakzinen gegen das Hepatitis-B- Virus (HBV), wobei es sich bei beiden um wäßrige Dispersionen auf der Basis von 22 nm großen Teilchen von Hepatitis-B-Virus- Oberflächenantigen (HBsAg) als Immunogen auf Aluminiumhydroxid (Alum) als Adjuvans handelt. Eine erste Vakzine beruht auf HBsAg-Teilchen, die aus Human-Plasma chronischer HBV-Träger erhalten wurden. Eine zweite Vakzine beruht auf HBsAg-Teilchen, die unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechnik durch Hefe erzeugt wurden. Die Vakzine verhindert die Krankheit bei den meisten Menschen sicher und wirksam, ausgenommen bestimmte Gruppen von Low-Respondern und Non-Respondern. Die Vakzine verliert jedoch ihre Immunogenität bei nichtoptimalen Lagerungsbedingungen, wie Einfrieren und Erhitzen auf über 8ºC: Tatsächlich sind diese Vakzine auf Aluminiumhydroxidbasis mit Warnungen beschriftet wie "nicht einfrieren, da dies die Wirksamkeit zerstört" und "bei 2-8ºC aufbewahren" und "die Lagerung oberhalb oder unterhalb der empfohlenen Temperatur kann die Wirksamkeit reduzieren" (Recombivax HB®, MSD). Diese Instabilität hängt mit dem Aluminiumhydroxid zusammen, das als Adjuvans dient.
Diese Erfindung betrifft auch die Entwicklung einer liposomalen Anti-HBV-Vakzine, die unter einem weiten Bereich von Lagerungsbedingungen stabil ist, einschließlich Einfrieren, Gefriertrocknen und Erwärmen auf Raumtemperatur. Die Vakzine beruht auf einem rekombinanten HBsAg als Antigen und auf Liposomen als Adjuvans und Stabilisator. Zwei bevorzugte Verfahren zur Herstellung dieser liposomalen Vakzine werden beschrieben.
Die Serokonversion bei Mäusen zeigte eindeutig, daß die liposomalen Vakzinen der vorliegenden Erfindung wirksam gegen HBV sind und einen schützenden Titer von HBs-Antikörpern erzeugen, der wenigstens einen äquivalenten oder höheren Serumspiegel an Anti-HBsAg-Antikörpern ergibt als bei denen, die man unter Verwendung frischer Vakzine auf der Basis von Alaun als Adjuvans erhält. Es ist klar, daß die liposomalen Vakzinen der Anmelderin ihre immunogene Wirkung unter suboptimalen Bedingungen behalten.

Verfahren zur Herstellung einer liposomalen Anti-HBV-Vakzine auf der Basis von vorgebildeten multilamellaren Vesikeln (Verfahren A)

Fig. 1 skizziert schematisch die Herstellung von Anti-HBV- Vakzine unter Verwendung von Verfahren A. Bei diesem Verfahren werden die Liposomen während des Hydratisierungsvorgangs erzeugt.
Es war wünschenswert, eine Vakzine gegen HBV in Form eines trockenen Pulvers zu entwickeln, das wenigstens so wirksam wie zur Zeit erhältliche Vakzinen sein sollte und dessen Stabilität höher als die von derzeitigen Vakzinen sein sollte, insbesondere unter extremen Lagerungsbedingungen.
Die Vakzine, die erzeugt wurde, beruht auf Liposomen als Adjuvans und enthält HBsAg-Teilchen als immunogenes Antigen. Jedes HBsAg kann als immunogenes Antigen verwendet werden, um eine liposomale Anti-HBV-Vakzine unter Verwendung der in dieser Anmeldung beschriebenen Verfahren herzustellen, und entweder können die intakten HBsAg-Teilchen oder Komponenten davon eingesetzt werden. Das hier verwendete HBsAg wird mit rekombinanten Methoden in CHO-Zellen erzeugt, wie es in WO 90/10058 beschrieben ist. Es besteht aus drei Polypeptiden: S, PreS1, PreS2 (in Gewichtsverhältnissen von 78 : 8 : 14). Ungefähr 30% seines Gewichts sind Phospholipide und ungefähr 10% sind Cholesterol (siehe Fig. 1). Phosphatidylcholin ist das hauptsächliche Phospholipid; wegen der genauen Zusammensetzung, siehe Tabelle 1. Tabelle 1 Phospholipidzusammensetzung (%) des verwendeten Hepatitis-B- Virus-Antigens

Abkürzungen

PI Phosphatidylinosit
PC Phosphatidylcholin
SPM Sphingomyelin
PE Phosphatidylethanolamin
Lyso-PC lyso-Phosphatidylcholin
PS Phosphatidylserin
Die Auswahl von Phospholipiden für die Herstellung der liposomalen Vakzine beruht auf zwei Hauptparametern: (i) chemischer Stabilität; (ii) Aufnahme durch Makrophagen. Überraschenderweise war die Auswahl von Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) und Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG) als Rohstoff für die Liposomenherstellung vorteilhaft. Diese zweifach gesättigten Phospholipide sind für verschiedene Oxidationsvorgänge nicht anfällig. Ihre Temperatur des Übergangs vom Gel zur flüssigkristallinen Phase (Tm) beträgt 24ºC, und daher sind die Lipide bei 37ºC im flüssigkristallinen Zustand, der für die Aufnahme durch Makrophagen bevorzugt ist. Die durch das DMPG eingeführte negative Ladung erhöht ebenfalls die Liposomenaufnahme durch Makrophagen, die als antigenpräsentierende Zellen dienen. Große Liposomen (multilamellare große Vesikel) sind aufgrund ihrer bevorzugten Aufnahme durch Makrophagen vorteilhaft.
Der allgemeine Vorteil von Liposomen als Adjuvantien ist im Stand der Technik bekannt; dazu gehört G. Gregoriadis (1990), Immunology Today 11: 89-97, und C. Alving in "Liposomes: Biophysics to Therapeutics" (1987), Marcel Dekker, N. Y. (M. Ostra, Hrsg.), 195-218.
Verfahren zur Herstellung von Liposomen einschließlich multilamellarer großer Vesikel sind in der Technik bekannt und in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben, zum Beispiel in den folgenden größeren Übersichtsartikeln, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird: F.R.C. New (Hrsg.) (1990) in "Liposomes", IRL, New York; D. Lichtenberg und Y. Barenholz (1988) in "Methods in Biochemical Analysis", 33 : 337-462 (D. Glick, Hrsg.).
Fünf Verfahren A bis E (Verfahren A ist das Verfahren der Erfindung) zur Herstellung der liposomalen Vakzinen auf der Basis von multilamellaren großen Vesikeln (MLVs) wurden eingesetzt; sie sind im Einzelnen in den folgenden Beispielen und in den Fig. 1, 2 und 3 beschrieben. Zu den Parametern, die getestet und miteinander verglichen wurden, gehören die Auswirkung des Lipid-Antigen-Verhältnisses, der Menge des auf der Liposomenoberfläche dargebotenen Antigens, der chemischen und physikalischen Stabilität der liposomalen Vakzine, eines Vergleichs zwischen verschiedenen Verfahren zur Herstellung der Liposomen auf die obigen Parameter, die Auswirkungen auf das Frieren und Tauen, die Lyophilisierung (Gefriertrocknen) in An- und Abwesenheit von Kryoschutzmittel (Lactose) sowie die Auswirkung eines Immunmodulators. Die Wirksamkeit der Vakzine wurde durch Serokonversion bei Balb/c-Mäusen 35 Tage nach der intraperitonealen Injektion der Vakzine bestimmt.
Eine Zusammenfassung der Ergebnisse ist in Tabelle 2 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigten, daß Verfahren A bevorzugt ist.
R. L. Richards et al. (1989), Vaccine 7 : 506-512, offenbarten ein Verfahren zur Herstellung von liposomalem Malaria- Sporocyten-Antigen, das DMPC und DMPG, jedoch nicht ausschließlich, verwendet; die Liposomen bestanden aus DMPC, DMPG und Cholesterol in Stoffmengenverhältnissen von 9 : 1 : 7,5. Lipid A und Aluminiumhydroxid waren ebenfalls vorhanden, und in Abwesenheit dieser beiden Verbindungen ergab sich eine geringe Immunogenität.
Die von Richards et al. 1989 beschriebenen liposomalen Vakzinen wurden nicht als trockenes Pulver, sondern als wäßrige Dispersion hergestellt. Tabelle 2: Zusammenfassung der Anti-HBs-Titer (mIE/ml) bei Verwendung der in den Beispielen 1-5 beschriebenen liposomalen Vakzineproben
Anmerkungen: 1) Ein Anti-HBsAg-Titer von 10 mIE/ml wird als eine schützende Dosis gegen HBV-Infektion angesehen.
2) Die verwendete Vakzine auf Aluminiumhydroxidbasis war dieselbe CHO-Vakzine, die in einer Lösung von Aluminiumhydroxid hergestellt wurde.

Beispiel 1

Herstellung von Proben von liposomaler Anti-HBV-Vakzine unter Verwendung von Verfahren A

Die folgenden Vakzineproben, die als (5), (6) und (7) bezeichnet werden, wurden unter Verwendung von Verfahren A (siehe Fig. 1) hergestellt, das so abgeändert war, wie es unten beschrieben ist.
Probe (5): Liposomen, die HBsAg enthielten, und "leere Liposomen" wurden so hergestellt, wie es für Probe (1) beschrieben ist. Es wurde tert.-Butanol hinzugefügt (1 : 1 v/v), und das Präparat wurde lyophilisiert. Das resultierende trockene Pulver wurde vor der Verwendung mit sterilem pyrogenfreiem doppelt destilliertem Wasser rekonstituiert. Die Beladung an Antigen betrug im Mittel 97%. Die Menge des auf der Liposomenoberfläche dargebotenen HBsAg wurde durch ELISA bestimmt und lag unterhalb der Nachweisgrenze. Die Größe der Liposomen wurde zu 4,5 um gemessen, ähnlich der Größe von Liposomen in anderen Proben.
Immunisierung: Balb/c-Mäuse, sechs Wochen alt, wurden in vier Gruppen eingeteilt und mit Dosen geimpft, wie sie für Probe (2) beschrieben sind. Den Mäusen wurde nach 35 Tagen Blut entnommen, und der Anti-HBs-Titer wurde bestimmt und erwies sich als mehr als ausreichend zum Schutz gegen HBV-Infektion. Dieser Titer war fast identisch mit demjenigen, der nach der Impfung mit dem gleichen HBsAg unter Verwendung einer Vakzine auf Aluminiumhydroxidbasis erhalten wurde.
Probe (6): Liposomen, die HBsAg enthielten, und "leere Liposomen" wurden so hergestellt, wie es für Probe (5) beschrieben ist. Eine Gruppe Von sieben Balb/c-Mäusen, sechs Wochen alt, wurde mit 0,09 ug HBsAg immunisiert, das in Liposomen eingeschlossen war, die mit "leeren Liposomen" und 0,9% NaCl ver dünnt wurden. Zu dem Injektionsvolumen, d. h. 0,5 ml 1- Palmitoyl-2-oleylphosphatidylcholin (POPC) und Dioleylphosphatidylserin (DOPS) in einem Stoffmengenverhältnis von 7 : 3, wurden Liposomen gegeben, die den Immunmodulator Muranyltripeptidphosphatidylethanolamin (MTP-PE) in einer Menge von 1 mg MTP-PE pro kg Mäuse enthielten. Nach 35 Tagen wurde das Anti- HBs gemessen. Es gab keine Verbesserung über den Antikörpertiter hinaus, der mit derselben Dosis liposomaler Vakzine erhalten wurde, die kein MTP-PE enthielt. (Die Verwendung von MTP- PE als Immunmodulator ist von Sanchez-Piscador et al. (1988), J. Immuno., 141 : 1720-1727, für Herpes-simplex-Virus-Glycoprotein-Vakzine beschrieben.
Probe (7): Liposomen, die HBsAg enthielten, und "leere Liposomen" wurden so hergestellt, wie es für Probe (5) beschrieben ist, außer daß die Lösung für die Lipidhydratisierung außerdem 5% Lactose als Kryoschutzmittel enthielt. Die Liposomen wurden gefroren und getrocknet. Das erhaltene trockene Pulver wurde vor der Verwendung mit sterilem pyrogenfreiem doppelt destilliertem Wasser rekonstituiert. Die Beladungseffizienz von HBsAg bei der Herstellung, die Größe der Liposomen und die Menge des auf den Liposomen dargebotenen HBsAg wurden so bestimmt, wie es für Probe (1) beschrieben ist. Ähnliche Ergebnisse wie bei Probe (5) wurden erhalten. Die Immunisierungseffizienz der liposomalen Vakzine wurde an Balb/c-Mäusen überprüft, wie es für Probe (2) beschrieben ist, und Anti-HBs wurde 35 Tage nach der Impfung gemessen. In allen Fällen wurde ein hoher Titer an Antikörpern erhalten, der gegen Infektion durch HBC zu schützen vermag. Ein Vergleich mit der lactosehaltigen gefriergetrockneten Vakzine (Probe (5)) zeigt eindeutig, daß die lactosehaltige Vakzine für alle verwendeten Antigendosen vorzuziehen war, außer für die hohe Dosis (2,5 ug Protein).

Bezugsbeispiel 1

Herstellung von liposomaler Anti-HBV-Vakzine unter Verwendung von Verfahren B

Die folgenden Vakzineproben, die als Probe (1) und (2) bezeichnet werden, wurden unter Verwendung von Verfahren B (siehe Fig. 1) hergestellt, das so abgeändert war, wie es beschrieben ist.
Probe (1): Ein Gemisch der Phospholipide Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) und Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG) in einem Stoffmengenverhältnis von 9 : 1 wurde in Chloroform gelöst. Die Lösungsmittel wurden durch Flash-Verdampfung unter reduziertem Druck bis zur absoluten Trockne entfernt. Die getrockneten Lipide wurden in 0,9%iger NaCl-Lösung, die HBsAg enthielt, suspendiert. Das Verhältnis von HBsAg : Lipid (w/w) während der Liposomenherstellung betrug 0,0015. In dieser Probe wurden Liposomen erhalten, deren Beladung etwa 73% des während der Lipidhydratisierung verwendeten Antigens betrug; in ähnlichen Proben, die unter Verwendung von Verfahren B hergestellt wurden, wurde nur eine Beladung von 50-60% erreicht. Das freie (nicht-Liposom-assiziierte) Antigen wurde durch 60 Minuten Ultrazentrifugation der Liposomenlösung mit 180000 · g entfernt. Das Sediment wurde in sterilem pyrogenfreien 0,9%igen NaCl dispergiert und für die Impfung verwendet. Liposomen, die kein Antigen enthielten (als "leere Liposomen" bezeichnet), wurden nach demselben Verfahren hergestellt, um die Lipidkonzentration der Proben identisch zu halten.
Stabilität des Präparats: Die physikalische Stabilität der Liposomen wurde getestet, indem man die Liposomengröße während der Lagerung mit Hilfe eines Coulter-Zählers Modell PCA-1 maß. Der mittlere Durchmesser frischer Liposomen betrug 4,5 um. Die Anwesenheit von Antigen in den Liposomen und ihr Alter von bis zu 18 Monaten hatte keine wesentliche Auswirkung auf die Lipo somengröße. Die Stabilität der Liposomenkomponenten wurde nach einem bis drei Waschvorgängen ebenfalls untersucht. Das Waschen erfolgte mittels Ultrazentrifugation mit 180000 · g während 60 Minuten. Nach jedem Waschvorgang wurde das Verhältnis von Lipid : HBsAg (w/w) im Liposomensediment bestimmt. Es wurde gefunden, daß dieses Verhältnis während der gesamten Waschvorgänge konstant blieb und dasselbe war wie das Verhältnis, das unmittelbar nach der Liposomenherstellung erhalten wurde; das heißt, es gab kein "Austreten" von Antigen aus den Liposomen. Die Menge des auf der Liposomenoberfläche dargebotenen HBsAg wurde durch ELISA bestimmt, wobei ein kommerzieller (DuPont) Standard-Kit verwendet wurde, und betrug weniger als 5%.
Immunogenitätstest: Balb/c-Mäuse, sechs Wochen alt, wurden verwendet. Die Mäuse wurden in zwei Gruppen zu 8 Mäusen eingeteilt. Die erste Gruppe wurde mit 0,27 ug Probe (1) immunisiert. Das Volumen der intraperitonealen (i. p.) Injektion betrug 0,5 ml/Maus und umfaßte in Liposomen eingeschlossenes HBsAg sowie "leere Liposomen" in 0,9% NaCl; beide wurden vor der Injektion in einer solchen Weise gemischt, daß dieselbe Menge an Lipiden in alle Mäuse injiziert wurde. 35 Tage nach der Immunisierung wurde den Mäusen Blut entnommen, und der Antikörpertiter wurde gemessen. Es wurde gefunden, daß alle Mäuse, die durch Probe (1) immunisiert worden waren, einen so hohen schützenden Antikörpertiter entwickelten, daß sie vor einer Infektion mit HBV geschützt sein sollten. Diese Ergebnisse waren in ihren Werten ähnlich den Ergebnissen, die in der Kontrollgruppe erhalten wurden; zu dieser gehörten Mäuse, die mit demselben freien Antigen (HBsAg) und Aluminiumhydroxid als Adjuvans immunisiert worden waren.
Probe (2): Ein Gemisch der Phospholipide DMPC und DMPG in einem Stoffmengenverhältnis von 9 : 1 wurde in Chloroform gelöst. Die Lösungsmittel wurden durch Flash-Verdampfung unter reduziertem Druck bis zur absoluten Trockne entfernt. Die getrockneten Lipide wurden in 0,9%iger NaCl-Lösung, die HBsAg und 5 Gew.-% Lactose enthielt, suspendiert. Liposomen (MLV) wurden durch mechanisches Schütteln erzeugt und dann lyophilisiert. Das getrocknete Pulver wurde vor der Verwendung mit doppelt destilliertem sterilem pyrogenfreiem Wasser rekonstituiert. 75% des eingesetzten HBsAg wurden eingebaut. "Leere Liposomen" wurden unter denselben Bedingungen hergestellt. Die Größe der Liposomen (gemessen, wie es für Probe (1) beschrieben ist) war mit der von Probe (1) identisch. Der Vorgang des Gefriertrocknens beeinträchtigte nicht die Liposomengröße. Die Menge des auf der Liposomenoberfläche dargebotenen HBsAg wurde gemessen und lag unterhalb der Nachweisgrenze.
Immunisierung: Balb/c-Mäuse, sechs Wochen alt, wurden in vier Gruppen zu 8 Mäusen eingeteilt. Die Mäuse wurden mit dem Liposomenpräparat geimpft, das für Probe (1) beschrieben wurde. Die folgenden Antigendosen (als Proteingewicht) wurden injiziert: 0,09 ug, 0,27 ug, 0,81 ug, 2,5 ug. Den Mäusen wurden 35 Tage nach der Impfung Blut entnommen, und der Titer des Anti-HBs für diese Probe wurde bestimmt. Alle Mäuse entwickelten einen schützenden Antikörpertiter.

Bezugsbeispiel 2

Herstellung von liposomaler Anti-HBV-Vakzine unter Verwendung von Verfahren C

Die folgenden Vakzineproben, die als Probe (3) und (4) bzeichnet werden, wurden unter Verwendung von Verfahren C (siehe Fig. 1) hergestellt, das so abgeändert war, wie es unten beschrieben ist.
Probe (3): Liposomen, die HBsAg enthielten, und "leere Liposomen" wurden so hergestellt, wie es für Probe (1) beschrieben ist, und dann wurden sie zehn Cyclen des Frierens auf -180ºC und Tauens bei 37ºC unterworfen. Der Prozentsatz der Antigenbeladung in den Liposomen betrug im Durchschnitt 81%. Das freie Antigen, das nicht eingebaut war, wurde durch Ultrazentrifugation (180000 · g während 60 Minuten) entfernt. Nur das Sediment wurde als Vakzine verwendet. Die Stabilität der Liposomen wurde überprüft, wie es für Probe (1) beschrieben ist, und die Ergebnisse der Untersuchung waren ähnlich wie bei Probe (1).
Immunisierung: Balb/c-Mäuse, sechs Wochen alt, wurden mit der liposomalen Vakzine gegen HBV geimpft. Die Testgruppen und das experimentelle Verfahren in vivo waren identisch mit den für Probe (1) beschriebenen. Der HBs-Antikörpertiter, der nach der Impfung mit der liposomalen Vakzine entwickelt worden war, lag stets oberhalb des schützenden Niveaus. Der Antikörpertiter, der mit dieser Vakzine erhalten wurde, war der höchste unter den verschiedenen liposomalen Präparaten, die wir testeten. Der Titer war sogar höher als in der Kontrollgruppe nach der Impfung mit einer Vakzine auf Aluminiumhydroxidbasis, die denselben HBsAg enthielt.
Probe (4): Liposomen, die HBsAg enthielten, und "leere Liposomen" wurden so hergestellt, wie es für Probe (3) beschrieben ist, mit dem einen Unterschied, daß die Hydratisierung der Lipide in 5% Lactose erfolgte. Die gebildeten multilamellaren Liposomen wurden gefroren und durch Lyophilisierung getrocknet. Das trockene Pulver wurde bis zur Verwendung bei -21ºC aufbewahrt. Die Größe der Liposomen und die Menge des auf der Liposomenoberfläche dargebotenen HBsAg wurden so getestet, wie es für Probe (1) beschrieben ist, und die Ergebnisse waren mit den für Probe (2) erhaltenen identisch.
Der Prozentsatz der Antigenbeladung in Liposomen betrug im Mittel 82%.
Die Immunisierungseffizienz dieses Präparats wurde an Balb/c- Mäusen getestet: Die Testgruppen und das experimentelle Verfahren waren identisch mit den für Probe (2) beschriebenen. Die Ergebnisse dieses Tests zeigen, daß die Herstellung von Anti-HBs-Antikörpern bei allen untersuchten Antigendosen oberhalb des schützenden Niveaus lag.
Ein Vergleich der Wirksamkeit des trockenen liposomalen Präparats mit dem Präparat, das als Dispersion aufbewahrt worden war (Probe (3)), zeigt die Überlegenheit der gefriergetrockneten Vakzine in niedriger Dosis und der als Dispersion aufbewahrten Vakzine bei hoher Dosis.

Vergleich von Verfahren A mit Verfahren C

Verfahren A ergibt ein hohes Maß an Beladungseffizienz (Einschluß) der Liposomen (etwa 97%) ohne die Notwendigkeit der bei Verfahren C durchgeführten Frier- und Taucyclen. Da Frieren und Tauen teuer und im technischen Maßstab ineffizient ist, ist Verfahren A für die industrielle Anwendung das bevorzugte Verfahren. Verfahren A (das die Verwendung verschiedener Gemische von tert.-Butanol und wäßriger Phase beinhaltet) ist für die Herstellung einer immunologisch aktiven lyophilisierten Anti-Hepatitis-B-Virus-Vakzine ein bevorzugtes Verfahren.

Vergleich der Verfahren B und C

Verfahren C unterscheidet sich dadurch von Verfahren B, daß Verfahren C zehn Cyclen des Frierens und Tauens umfaßt, einen in der Technik bekannten Vorgang zur Erhöhung der Einkapselungseffizienz (des Antigeneinschlusses) der Liposomen (D. Lichtenberg und Y. Barenholz, 1988). Das Frieren und Tauen kann jedoch teuer und für ein großtechnisches Verfahren nicht kosteneffizient sein.

Beispiel 2

Stabilität liposomaler HBsAg-Vakzine nach Lagerung bei verschiedenen Temperaturen

Wie oben beschrieben, wird bei in der Technik bekannten Hepatitis-Vakzinen Aluminiumhydroxid als Adjuvans und Stabilisator verwendet. Der Nachteil der Vakzinen auf Aluminiumhydroxidbasis besteht darin, daß sie weder eingefroren noch oberhalb 8ºC aufbewahrt werden können. Diese Vakzinen müssen also zwischen 2 und 8ºC aufbewahrt werden, um ihre Wirksamkeit zu behalten.
Es gibt drei Parameter, um die Stabilität einer Vakzine unter unterschiedlichen Bedingungen aufzuzeigen:
1. Effizienz (Immunogenität messen).
2. Chemische Stabilität (Hydrolyse von Lipiden messen; Verhältnis von Protein zu Lipid messen).
3. Physikalische Stabilität (Teilchengröße messen).
Die Stabilität der neuen Vakzine wurde nach Lagerung bei drei Temperaturen gemessen: (a) -20ºC, (b) 2 bis 6ºC und (c) Raumtemperatur.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
(a) Die bei -20ºC gelagerte Vakzine war nach 1 Monat oder länger effektiv und nach 1,5 Jahren oder länger chemisch und physikalisch stabil.
(b) Die bei 2 bis 6ºC gelagerte Vakzine war nach 1 Monat oder länger effektiv und nach 1,5 Jahren oder länger chemisch und physikalisch stabil.
(c) Die bei Raumtemperatur gelagerte Vakzine war nach 1,5 Jahren oder länger chemisch und physikalisch stabil.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Vakzine der Erfindung in Form von Liposomen über einen großen Temperaturbereich hinweg stabil ist.
Da die derzeitigen Hepatitis-Vakzinen beim Einfrieren ihre Immunogenität verlieren, kommt es unerwartet, daß die liposomale Vakzine der Erfindung ihre Aktivität sowohl während des Gefrierschrittes des Gefriertrocknungsverfahrens als auch während der Lagerung der Vakzine unterhalb 0ºC behält.
Der Vorteil der HBV-Vakzine der Erfindung liegt also auf der Hand. Sie braucht nicht in einem Kühlschrank gelagert zu werden und ist nicht empfindlich gegen Einfrieren. Die Verteilung einer solchen Vakzine ist insbesondere in Ländern der Dritten Welt stark vereinfacht, wo das Bedürfnis nach einer Vakzine gegen Hepatitis B am größten ist; außerdem fördert eine Vakzine, die eingefroren werden kann, die Verteilung in Ländern wie Rußland und China, wo die Umgebungstemperatur häufig unterhalb des Gefrierpunkts liegt.
Die Anmelder haben also eine neue HBsAg-Vakzine auf Liposomenbasis erzeugt, die sowohl unter 0ºC als auch bei Raumtemperatur stabil ist, d. h. die Vakzine kann auch unter suboptimalen Bedingungen gelagert werden.

Beispiel 3

Beladung mit Faktor VIII

Stabilitätstest: Um Proteine unter Bildung von "Zellen" in eine Phospholipidmembran einzubauen, muß das Innere dieses Kompartiments isotonisch mit der Lösung außerhalb sein.
Ein kommerziell erhältliches Faktor-VIII-Präparat (Octa VI 250) wurde in 5 ml Wasser gelöst (so daß man 50 Einheiten/ml erhielt) und dann 6 Stunden bei 4ºC gegen verschiedene Konzen trationen von Aminosäuren dialysiert. Dann wurde der dialysierte Faktor 20 Stunden lang lyophilisiert. Die Proben wurden zuerst in Wasser und dann mit Kochsalzlösung rekonstituiert, so daß man eine Verdünnung von 1 : 500 erhielt.

Beladungsexperimente

A. Beladung nach Verfahren E (gemäß der Erfindung)

Bei diesem Präparat wird in tert.-Butanol solubilisiertes Lipid mit einer wäßrigen Lösung des Faktors gemischt, so daß man eine homogene Lösung erhielt. Die Lösung wird gefroren, und das Lösungsmittel wird durch Lyophilisierung entfernt. Mit Faktor IX beladene multilamellare Vesikel werden durch Hydratisierung des trockenen Gemischs erhalten, zuerst in einem kleinen Volumen bidestillierten Wassers, dann schrittweise mit Kochsalzlösung, bis die endgültige Liposomenkonzentration erreicht ist. Dann können die multilamellaren Vesikel durch Extrusion dimensioniert werden, so daß man oligolamellare oder kleine unilamellare Vesikel erhält.

Bestimmung der Faktor-IX-Aktivität

Die Faktor-IX-Aktivität wurde durch ein Gerinnungsassay gemessen. In diesem Assay kann die prozentuale Faktor-IX-Aktivität anhand des Ausmaßes der erhaltenen Korrektur bestimmt werden, wenn eine Verdünnung der getesteten Probe zu Factor IX Deficient Plasma (an Faktor IX abgereichertes Plasma, bezogen von Baxter Diagnostics Inc.) gegeben wird. Das Meßinstrument heißt ACL-Automated Coagulation Laboratory von Instrumentation Laboratory (Italien).
Zuerst wurde eine Eichkurve für den Gerinnungsassay von Faktor IX erstellt, wobei man geeignete Verdünnungen einer Stammlösung von ca. 50 E/ml verwendete. Fig. 2 zeigt eine gute Anpassung an eine lineare Regression (R² = 0,989) Liposomen, die Faktor IX enthielten, wurden durch Zentrifugation in einer Eppendorf-Zentrifuge bei 12000 · g während 10 min sedimentiert, und die Faktor-IX-Aktivität wurde in den Überständen und im Sediment bestimmt. Das Sediment wurde vor der Analyse mit Triton X-100 in Lösung gebracht. Eine Abhängigkeit der Faktor-IX-Aktivität von der Konzentration von Triton X100 wurde gefunden. 1% Triton X100 (Endkonzentration) verursachte einen 50%igen Aktivitätsverlust, während bei 0,2% kein Verlust beobachtet wurde. Im allgemeinen wurde die gesamte Aktivität des Faktors zurückgewonnen, denn die Aktivitäten der Überstände und des Sediments waren stets ähnlich oder sogar höher als die Anfangsaktivität des Präparats. Die Beladungseffizienz war größer als 80%. B. Beladung nach Verfahren D (Bezugsbeispiel) Tabelle 4: Beladung mit FVITI nach Verfahren D
Kaninchenexperiment: Um die Freisetzung von Faktor VIII aus Liposomen im Blutstrom zu testen, wurden Kaninchen als Modellsystem verwendet.
Das Experiment wurde mit in 2 Gruppen eingeteilten Kaninchen mit einem Gewicht von 3 bis 3,5 kg durchgeführt. Einer Gruppe von Kaninchen wurden 330 Einheiten Octa VI injiziert, und der anderen Gruppe von Kaninchen wurden 330 Einheiten der mit Faktor VIII beladenen Liposomen injiziert. Die Liposomen wurden aus Ei-Phosphatidylcholin (EPC) hergestellt und nach dem SUV-Verfahren präpariert. Die prozentuale Einkapselung betrug etwa 70%.
Vor der Injektion und zu den folgenden Zeitpunkten nach der Injektion wurden 4-ml-Blutproben aus den Kaninchenohren entnommen: nach 30 Minuten, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 21 h, 30 h, 45 h, 54 h, 72 h und 144 h. Aus den Blutproben wurde Plasma hergestellt und dann eingefroren. Am Ende des Experiments wurde die Faktor-VIII-Aktivität durch einen Ein-Phasen-Gerinnungsassay überprüft.
Die durchschnittlichen Ergebnisse und die Standardabweichung der Faktor-VIII-Gerinnungsaktivität der Kaninchen am Ende des Experiments sind in Fig. 4 angegeben.
Man erkennt, daß die Aktivität nach der Injektion von 330 Einheiten freiem Faktor VIII von einem Grundniveau von 4 Einheiten/ml nach 30 Minuten bis auf 7 Einheiten/ml anstieg und dann wieder abnahm und nach 45 Stunden das Grundniveau erreichte. Bei der Injektion von in Liposomen eingekapseltem Faktor VIII stieg die Faktor-VIII-Aktivität zuerst nach 30 Minuten an und fiel dann schnell wieder auf das Grundniveau ab. Eine zweite Zunahme begann 9 Stunden nach der Injektion, erreichte den Spitzenwert 54 Stunden nach der Injektion und fiel nach 144 Stunden wieder auf das Grundniveau ab.
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse hat es den Anschein, daß die Einkapselung von Faktor VIII in Liposomen seine Halbwertszeit in Kaninchen erhöht.

Bezugsbeispiel 3

Zubereitung mit Phospholipid und FVIII (Verfahren D)

A. Einkapselung von Monoclate® durch Ei-PC

Monoclate® ist eine Armour-Zubereitung für FVIII, der durch monoklonalen Antikörper gereinigt ist. Die Zubereitungen enthalten FVIII:C, das nur durch eine große Menge Albumin st abilisiert ist. Die spezifische Aktivität ist sehr gering, 5 Einheiten/mg Protein. Die Einkapselung erfolgte nach dem DRV- Verfahren unter Verwendung eines Gewichtsverhältnisses von 107 bzw.. 214 mg Phospholipid zu 1 mg Protein. B. Octa VI mit PL, ergänzt durch Cholesterol:
* Triton X100 löste die cholesterolhaltige Membran nur teilweise auf. Die Berechnung beruhte also zum Teil auf der für die Beladung theoretisch eingesetzten Menge an FVIII.

Ergebnisse

Ein Verhältnis von Lipid : Protein von 400 : 1 (w/w) ist für die Einkapselung von Octa VI in Liposomen am besten.
Eine gute Einkapselung kann auch bei Verwendung von mit Cholesterol ergänztem Ei-PC erreicht werden. Dies kann jedoch bei chronischen Patienten, wie bei Hämophilie A, nicht empfohlen werden, kann aber bei akuten Patienten verwendet werden.

Beispiel 4

Die maskierende Wirkung von mit FVIII (Octa VI) beladenen Liposomen wird aufgezeigt, indem ein Inhibitortest in vitro an Patientenplasma, das eine große Menge an Inhibitoren enthält, durchgeführt wird.
Inhibitoren, die im Plasma von Hämophilen vorkommen, lassen sich durch den Bethesda Inhibitors Test nachweisen, bei dem gleiche Volumina Patientenplasma (unter der Annahme, daß kein FVIII vorhanden ist) und normales Plasma (1 Einheit FVIII) bei 37ºC inkubiert werden. Man nimmt an, daß Inhibitoren vorhanden sind, wenn die Koagulationszeit im Vergleich zu der von Gemischen von normalem Plasma und Kochsalzlösung erheblich verlängert ist.
Im folgenden Experiment wurde solches Patientenplasma zum Beispiel in verschiedenen Verdünnungen mit Standard-Poolplasma (das 100% = 1 Einheit/ml Faktor VIII enthielt) inkubiert. Eine. Verdünnung, die eine 50%ige Abnahme der Faktor-VIII-Aktivität (ausgedrückt als Restkonzentration) des inkubierten Plasmas ergab, wird quantitativ in Bethesda Inhibitor Units (BIU) eines gegebenen Plasmas ausgedrückt.
Fig. 7 zeigt das Verhältnis von Faktor VIII: C-Restkonzentration in den Gemischen von Patientenplasma und normalem Plasma im Vergleich zu mit Kochsalzlösung gemischtem normalem Plasma. Die Ergebnisse wurden als Prozentwerte halblogarithmisch gegen die getestete Plasmaverdünnung aufgetragen. Eine Verdünnung, die sich auf 50% des ursprünglichen Plasmas bezieht, ist als BIU pro ml eines gegebenen Plasmas definiert. In Fig. 1 weist das getestete Plasma 160 BIU/ml auf. Es wurde keine Hemmung gefunden (Fig. 1), wenn mit Faktor VIII:C beladene Liposomen mit getestetem Plasma inkubiert wurden. Bei diesem Experiment wurde in Liposomen eingebauter Faktor VIII (Octa VI) zwei Stunden bei 37ºC mit einer gegebenen Patientenplasmaverdünnung inkubiert. Die Restaktivität, die sich aus einer Inkubation mit Kochsalzlösung anstatt Patientenplasma ergab, wurde als 100% angesehen.

Beispiel 5

Vergleich zwischen Monoclate® und Octa VI als in Liposomen eingekapselter FVIII hinsichtlich der Pharmakokinetik

Zwei Beagle-Hunden, einem Weibchen und einem Männchen, wurden 900 Einheiten in Liposomen eingebauter FVIII injiziert. Der männliche Hund erhielt in Liposomen eingebautes Octa VI (Octapharma AG), während das Weibchen eingekapseltes MonoClate-P (Armour, USA) erhielt. Nach dem Zeitpunkt der Injektion wurden 16 Tage lang Blutproben entnommen. Die Aktivität des Faktors VIII wurde durch einen chromogenen Assay überwacht.
Wie man in Fig. 8 und Fig. 9 erkennt, wurde die FVIII-Aktivität fast 3 Wochen lang aufrechterhalten; der Faktor hatte also eine ganz andere Pharmakokinetik, als man sie aufgrund von der des freien FVIII (Halbwertszeit etwa 10-14 Stunden) annehmen würde.

Beispiel 6

Messung der Menge der Inhibitoren

Kaninchen neigen dazu, schnell Inhibitoren von Faktor VIII zu bilden.
Verschiedene Verdünnungen von Kaninchenplasma wurden eine Stunde bei 37ºC mit 5 Einheiten/ml Octa VI inkubiert. Dann wurde die Aktivität durch einen Gerinnungsassay getestet. Tabelle 5: Inhibitionseinheiten wurden aus 1/5 und 1/10 Verdünnung des Kaninchenplasmas in Gerinnungsassaypuffer berechnet.
Die geringe Immunogenität der Phospholipidzubereitung kann auf einen der folgenden Mechanismen oder beide zurückzuführen sein:
a) Octa VI, das in einer Phospholipid-Doppelschicht eingekapselt oder besser eingebettet war, wurde zu einem Organ (vermutlich der Leber) zielgesteuert, wo es sich anhäufte; dann wurde es in den Blutstrom freigesetzt und entging so der Erkennung durch das Immunsystem.
oder
b) Die Ergebnisse lassen vielleicht vermuten, daß liposomaler FVIII dem Immunsystem ein kleineres Ziel bietet. Mit anderen Worten, das Liposom "maskiert" einen Teil der Antigenität des Faktors.

Beispiel 7

Herstellung von Liposomen, die Antihämophiliefaktor VIII enthalten

Liposomenherstellung:

Dasselbe Verfahren wie bei Probe 3 wurde verwendet, um Liposomen herzustellen, die Faktor VIII (Octa VI®, Octapharma) enthalten. Eine Behadungseffizienz von 60 bis 90% wurde erreicht.

Beispiel 8

Faktor IX: Hundeversuch unter Verwendung von Verfahren E

Zwei Beagle-Hunden wurden 750 Einheiten OctaNyne, eines kommerziellen Faktor-IX-Präparats (Octapharma), injiziert. Dem ersten Hund wurde zum vierten Mal freies OctaNyne injiziert, während der zweite Hund eingekapselten FIX erhielt; dieser Hund erhielt den Faktor zum ersten Mal (ein "jungfräulicher" Hund). Die OctaNyne-Zubereitung mit Liposomen erfolget nach Verfahren E, und die Einkapselung betrug fast 100%; die Menge an freiem Faktor war vernachlässigbar.
In den beiliegenden Figuren (Fig. 5 und 6) ist zu erkennen, daß freier Faktor zwei Halbwertszeiten hat. Etwa 20% des Bolus haben eine Halbwertszeit von etwa 1,8 Tagen, während mit 80% der größte Teil des Bolus eine Halbwertszeit von 0,15 Tagen hat.
Andererseits zeigt die Liposomenzubereitung eine völlig andere Art von Verhalten. Eine Analyse der aus dem Gerinnungsassay erhaltenen Ergebnisse zeigt, daß es zwei Peaks gibt: einen nach 0,25 Tagen und einen weiteren nach fünf Tagen. Die durch einen ELISA getestete Anwesenheit von Faktor IX im Blut zeigt bei beiden Verfahren eine relativ geringe Antigenaktivität, 1/5 bis 1/10 der beim Gerinnungsassay aufgezeichneten Aktivität. Die Aktivitätspeaks traten jedoch zur selben Zeit auf.
Die beim Immungssay aufgezeichneten geringen Aktivitäten können auf einen durch das Liposom erzeugten "maskierenden" Effekt zurückzuführen sein, wobei während seiner Zirkulation im Blutstrom ständig zusätzliches Blutprotein in die Phospholipid-Doppelschicht eingebettet wurde. Ein Hinweis auf diese Phänomene ist im folgenden Experiment zu sehen.
Der späte Peak, der in dieser Pharmakokinetikkurve auftritt, läßt vermuten, daß der Faktor IX vielleicht in einem Organ (vermutlich der Leber) angehäuft und nach einem Zeitraum von ein paar Tagen wieder freigesetzt wird.

Beispiel 9

Der Immunogenitäts-maskierende Effekt von Liposomen (in-vitro- Experiment)

Zubereitung von FVIII durch Lecithin in großem Maßstab 3000 Einheiten Faktor VIII wurden nach Verfahren D eingekapselt. Die gesamte Zubereitung erfolgte unter aseptischen Bedingungen in einem Reinraum der Klasse 100.
Die Ergebnisse nach der Rekonstitution des Liposoms waren wie folgt: Tabelle 6
Beladungseffizienz etwa 64%.

Trennung von freiem Faktor VIII und in Liposomen eingekapseltem Faktor VIII

1. Liposomenlösung durch ein Blutfilter fließen lassen.
2. 1 ml in ein 1,5-ml-Röhrchen überführen.
3. Röhrchen 5 Minuten zentrifugieren, 14000 · g, bei Raumtemperatur.
4. Überstand in ein neues Röhrchen mit der Aufschrift "Überstand" überführen.
5. Das gleiche Volumen, wie es dem Überstand entspricht, zu dem Liposomensediment geben und vorsichtig resuspendieren (vortexen vermeiden).
6. Wiederum wie in Schritt 4 zentrifugieren, den Überstand in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen mit der Aufschrift "Waschlösung I" überführen.
7. Das gleiche Volumen, wie es der Waschlösung I entspricht, zu dem Liposomensediment geben und vorsichtig resuspendieren.

Messung der Faktor-VIII-Aktivität

1. Extraktion und Aktivitätsmessung der gesamten Liposomenlösung (die den freien Faktor VIII und den in Liposomen eingebauten Faktor VIII enthält): die Liposomenlösung mit Assaypuffer, der 1% Humanserumalbumin (HSA) enthält, auf das 40fache verdünnen. Triton X-100 hinzufügen bis auf 0,5%. 10 Minuten warten, bis die Lösung klar geworden ist. Liposomenextrakt mit Assaypuffer, der 1% HSA enthält, auf wenigstens das Sfache verdünnen und Faktor VIII mit einem Ein-Phasen-Gerinnungsassay messen.
2. Extraktion und Aktivitätsmessung der gewaschenen Liposomen: wie in Schritt 1 beschrieben.
3. Aktivität der Fraktionen Überstand und Waschlösung I in einem Ein-Phasen-Gerinnungsassay messen (Verdünnung 50- bis 100fach im Assaypuffer, der 1% HSA enthält).
4. Prozentuale Beladung = Aktivität der Extrakte der gewaschenen Liposomen/Aktivität der gesamten Liposomenlösung
Die prozentuale Beladung betrug 85%.
Immunoassay für den Nachweis von Faktor VIII in Hundeplasma
Ein quantitativer Immunoassay in Hundeplasma ist wichtig für den Nachweis von freiem Faktor VIII bei normalen Hunden, und das Verhältnis des Gerinnungsassays und des Faktor-VIIIAg kann widerspiegeln, wie FVIII-Antigen dem Immunsystem von Hunden präsentiert wird.

ELISA-Assayverfahren

Mikrotitrationsplatten wurden durch Inkubation bei 20ºC mit 1/500 Verdünnung (in PBS) von monoklonalem Anti-FVIIIAg (York) beschichtet. Die Blockierung erfolgte bei Raumtemperatur während 2 Stunden mit 1/5 Hundeplasma in PBS/Tween 20 (0,05%). Die FVIII-Eichkurve wurde durch Verdünnen von Octa VI in Hundeplasma erstellt. Die Proben wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Ziegen-Anti-FVIII-verwandtes Antigen (ATAB) wurde als zweiter Antikörper verwendet. Eine Verdünnung von 1/500 in PBS wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde nach der Zugabe des Konjugats und des Substrats 5 min lang entwickelt.

Ergebnis:

Ein quantitativer ELISA kann FVIIIAG mit 2-70% Gerinnungsaktivität in Hundeplasma nachweisen, d. h. etwa 0,02 bis 0,7 Einheiten Human-FVIII pro ml (Empfindlichkeit wenige Nanogramm).

Bestimmung des Verhältnisses von FVIII:C/FVIIIAg in Liposomen in Hundeserum

Assayverfahren: Liposomen, die nach Verfahren D mit verschiedenen Phospholipidanteilen (Protein/Lecithin 1/1000, 1/400, 1/100) hergestellt worden waren, wurden von freiem, nicht eingebautem FVIII reingewaschen, um die Aktivität des in Membran eingebetteten FVIII zu messen. Die Gerinnungsaktivität wurde durch einen Ein-Phasen-Gerinnungstest getestet, und die Immunreaktivität wurde durch ELISA getestet. Dann wurde das Liposom mit Triton-100 lysiert, um die kombinierte Aktivität des eingebauten (eingebetteten + eingekapselten) FVIII zu messen. Tabelle 7 Auswirkung des Phospholipids auf die Einkapselung und Maskierung der FVIII-Immunreaktivität in Hundeplasma.
Ergebnis: Die beste Beladung und Antigenmaskierung wurde bei einem Verhältnis von Protein zu Phospholipid von 1/400 erreicht.

Claims

1. Verfahren zur hohen Beladung von Vesikeln mit biopolymeren Substanzen, die Funktionen in humanen biochemischen oder physiologischen Systemen erfüllen und die von einer beliebigen Quelle stammen, wobei die Substanzen vorzugsweise Enzyme, Proenzyme, Cofaktoren, Submikronteilchen, wie Virionen, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Ribosomen, Hepatitis- B-Oberflächenantigen, Oligo- und Polynucleotide, Antikörper und/oder Antigene sind, wobei die Vesikel aus amphipathischen Substanzen gebildet sind, umfassend die Schritte:

a) Mischen von Lipiden, die zur Bildung von Lipidvesikeln geeignet sind, in mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmitteln;

wobei alternativ getrocknete Lipide oder Lipidgemische in beliebiger Form (Pulver, Granulat usw.) direkt verwendet werden können;

b) Entfernen des Lösungsmittels in Gegenwart eines festen Trägers;

c) Aufnehmen des Produkts von Schritt b) in eine Lösung der einzukapselnden Substanzen in einer physiologisch verträglichen Lösung;

d) Hinzufügen eines organischen Lösungsmittels mit solubilisierenden oder dispergierenden Eigenschaften; sowie

e) Trocknen der in Schritt d) erhaltenen Fraktion unter Bedingungen, die die Funktion der einzukapselnden Substanzen erhalten.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, das einen weiteren Schritt zwischen Schritt a) und b) umfaßt, wobei es sich bei dem Schritt um das Sterilisieren, Depyrogenieren, Virusinaktivieren und/oder Filtrieren der Fraktion von Schritt a) handelt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und/oder 2, das einen zusätzlichen Schritt zwischen Schritt d) und e) umfaßt, wobei es sich bei dem Schritt um das Sterilisieren, Virusinaktivieren und/oder Portionieren der Fraktion von Schritt d) handelt.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die biopolymeren Substanzen natürlicherweise im Blutstrom vorkommende Antikörper, Enzyme, Proenzyme und/oder Cofaktoren sind.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Enzyme, Proenzyme und/oder Cofaktoren Funktionen in der Blutgerinnungskaskade erfüllen, wie Faktor VII, VIII, IX, X, XIII, Fibrinogen, Prothrombin und/oder Thrombin.

6. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Enzyme, Proenzyme und/oder Cofaktoren Proteine mit fibrinolytischer Wirkung sind, wie Plasmin, Plasminogen, oder im Komplementsystem aktiv sind und/oder mit anderen Funktionen im Immunsystem (humoral oder gewebsgebunden) zusammenhängen.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei es sich bei der Quelle für die Antikörper, Enzyme, Proenzyme und/oder Cofaktoren um eine Tier- oder Humangewebekultur, einen Mikroorganismus oder transformierten Mikroorganis mus, Blut, Blutplasma oder andere Körperflüssigkeiten handelt.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die amphipathischen Substanzen, die Vesikel zu bilden vermögen, Lipide sind, wie Phospholipide, wie Ei- und Soja- Phospholipide, Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) und/ oder Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG) oder Ei-Phosphatidylcholin (PC).

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei es sich bei dem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel um ein polar-aprotisches Lösungsmittel, wie fluorierte Kohlenwasserstoffe, chlorierte Kohlenwasserstoffe, handelt.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der feste Träger ein inertes anorganisches oder organisches Material mit einer Kügelchenstruktur ist.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die physiologisch verträgliche Lösung einer etwa 1,5-Gew.-%- igen Natriumchloridlösung entspricht.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das organische Lösungsmittel mit den solubilisierenden oder dispergierenden Eigenschaften ein mit Wasser mischbares polarprotisches Lösungsmittel ist, wie tert.-Butanol.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Trocknen der Fraktion durch Verdampfen, Lyophilisieren oder Sprühtrocknen der Fraktion von Schritt d) von Anspruch 1 erreicht wird.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die trockene Fraktion von Schritt e) von Anspruch 1 in einem wäßrigen Medium aufgenommen wird und eine Dispersion oder Paste bildet.

15. Zubereitung biopolymerer Substanzen, wie Enzyme, Proenzyme, Cofaktoren, Submikronteilchen, wie Virionen, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Ribosomen, Hepatitis-B-Oberflächenantigen, Oligo- und Polynucleotide, Antikörper und/oder Antigene, die Funktionen in humanen biochemischen oder physiologischen Systemen erfüllen, erhältlich nach einem Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 14.

16. Zubereitung gemäß Anspruch 15 in Form einer wäßrigen Dispersion oder Paste, die nach dem Verfahren gemäß Anspruch 14 gebildet ist.

17. Medikament, das eine Zubereitung gemäß Anspruch 15 umfaßt.

18. Medikament gemäß Anspruch 17, das zusätzlich noch weitere pharmazeutische Wirkstoffe und Träger und/oder Hilfsstoffe umfaßt.

19. Verwendung einer Zubereitung gemäß Anspruch 15 zur Herstellung eines Medikaments, das in einer wirksamen Menge topisch, oral, buccal, intraperitoneal, pulmonal, intravenös, subcutan, intramuskulär, intranasal oder intraokulär verabreicht werden soll.

20. Verwendung gemäß Anspruch 19, wobei dem Patienten eine Dosis von bis zu 2 g liposomalem Phospholipid pro kg Körpergewicht verabreicht wird.

24. Verwendung einer Zubereitung gemäß Anspruch 15 zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention der Bildung von F-VIII- und/oder F-IX-Inhibitoren und zur Behandlung, wenn solche bereits vorhanden sind, bei Patienten mit Krankhei ten, die mit fehlendem F VIII und F IX zusammenhängen, durch Vesikel, die mit F VIII und/oder F IX, gegebenenfalls in Kombination mit weiteren pharmazeutischen Substanzen, beladen sind.