CN1665487A - 脂质体疫苗 - Google Patents

脂质体疫苗 Download PDF

Info

Publication number
CN1665487A
CN1665487A CN038159171A CN03815917A CN1665487A CN 1665487 A CN1665487 A CN 1665487A CN 038159171 A CN038159171 A CN 038159171A CN 03815917 A CN03815917 A CN 03815917A CN 1665487 A CN1665487 A CN 1665487A
Authority
CN
China
Prior art keywords
liposome
compositions
lipid
g17dt
immunogen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN038159171A
Other languages
English (en)
Inventor
D·麦克尔
S·格里姆斯
Y·巴里赫尔兹
S·伊文一辰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Aphton Corp
Original Assignee
Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Aphton Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem, Aphton Corp filed Critical Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Publication of CN1665487A publication Critical patent/CN1665487A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/24—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A61K38/09—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH], i.e. Gonadotropin-releasing hormone [GnRH]; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/2207—Gastrins; Cholecystokinins [CCK]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供一种脂质体载体，其包裹有较高水平的含针对胃泌素和促性腺素释放激素免疫原的水溶性物质。可将包裹大量免疫原的该脂质体经胃肠外途径注射来诱导有效的免疫应答反应，而不会显示明显的不良组织反应原性。

Description

脂质体疫苗
相关申请的交互参考
本申请要求2002年7月3日提交的美国临时专利申请No 60/394,179编号35U.S.C.§119(e)的权利。
发明领域
本发明涉及含有重量比水平较高的脂类物质包裹的水溶性化合物的脂质体组合物。具体说，本发明涉及可注射的脂质体疫苗，该疫苗的多层脂质体载体中有效而稳定地包裹了大量亲水性免疫原，因而具有有效的免疫原性及很低的组织反应原性。本发明也涉及制造该脂质体疫苗组合物的方法。
发明背景
可通过抗激素或抗激素受体的疫苗，利用其对激素和它们生理效应的免疫中和作用或抑制作用，来治疗激素依赖性疾病和疾患。例如已为大家所接受的是，生殖性激素和其它激素可起着生长因子作用，刺激肿瘤包括乳腺、胰腺、肺、胃和直结肠系统癌的生长。已发现某些正常时不表达的且在健康器官中无功能的激素是促发恶变的活跃参与者。
虽然这些激素作为自身抗原不显示固有的免疫原性，但可通过给这类患者或动物免疫接种缀合了自身最小免疫原性靶肽的免疫原性载体，来诱导免疫应答，产生抗激素或抗激素受体的抗体，实现对这类疾病或疾患的治疗。例如美国专利5,023,077；5,468,494；5,688,506和6,132,720公开了用于中和胃泌素或促性腺素释放激素活性的免疫原和免疫原性组合物。
仍需要增强这类缀合物的免疫原性以使它们可用于临床。一种方法是将它们与油性载体一起配制形成缓释乳液。水溶性疫苗包含抗激素或抗激素受体的靶免疫原。可注射性免疫原通常以油包水乳液形式输送。这些疫苗乳液由于其固有的、引起免疫接种后注射部位炎症的组织反应原性，受到可给予剂量的限制。因此这种引起局部反应的倾向导致某些病例只能给予亚适水平的免疫原。
油包水乳液由分散在连续油相(矿物油、鲨烯或鲨烷)中的细小水滴组成。可代谢性油如鲨烯或鲨烷具有理想的安全性，它们比人类治疗不可接受的弗氏佐剂更为患者乐意接受。将上述免疫原组合物，即胃泌素或促性腺素释放激素(GnRH)配制成油包水乳液显著增强了免疫应答反应。然而采用乳液疫苗制剂可能引起注射部位反应，这在治疗威胁生命的疾病时可能被接受，但在其它疾病中引起的不适是不利的或甚至不能接受。因此，探索了输送抗原的其它方式。例如，授于Kedar等的美国专利5,919,480中公开了脂质体流感疫苗，其采用脂质体包裹流感亚单位抗原，作为小泡类型输送载体。
虽然脂质体具有良好的靶向潜能，为加入亲水性和亲脂性免疫调节剂提供了基础剂型，但它们配制困难不能充分包裹大量免疫原，常需要可溶性免疫调节剂的帮助才有效。J.C.Cox等，“佐剂-分类和它们的作用模式综述”Vaccine.1997.15(13)：248-256。
脂质体制剂的蛋白运载能力有一定限制。例如，脂质体小室中的蛋白比率越大，脂质体制剂的粘性越高。此种粘性可升高到防碍其用作可注射疫苗的屏障水平。事实上脂质体作为可注射制剂迄今可达到的最高包裹水平为大约30％。G.GregoriadisX编著Liposome Technology，第一卷第二版CRC Press，Boca Raton，FL.1993，527-616。然而，由于脂质体中亲水性分子的包裹水平特别低，因而脂质体制剂通常更适合于两性免疫原。
还发现脂质体作为低免疫原性亲水抗原的疫苗输送载体时，要求较大量的疫苗剂量才有效。迄今沿不能达到所需的脂质体包裹的免疫原剂量，这部分是由于可注射体积有限。
发明概述
本发明涉及可输送大量水溶性物质的可注射的脂质体组合物。该组合物含有脂质与包裹的水溶性物质重量高比率(分布在众多脂质载体中)的众多脂质体载体。脂质与包裹物质的重量比范围约为50比1000。此种安排的优点是能达到高效包裹，例如50％以上，某些实施例中达到80％以上。
该脂质体载体可以是多室载体(MLV)。该脂质体含有的形成脂质体的脂质具有一亲水性尾，和一极性或化学反应部分，该部分含有酸、醇、醛、胺或酯。该脂质体的另一特征是具有烃链或类固醇尾基团和一极性头部基团。形成脂质体的脂包括磷脂。合适的磷脂例子包括但不限于：磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和鞘磷脂。
水溶性物质广义包括蛋白质、蛋白聚糖和碳水化合物。一些实施例中，水溶性物质包括一种以上的化合物。
待包裹的水溶性物质也可以是疫苗，包括但不限于抗激素或激素相关受体的疫苗。本发明的具体实施例中，该疫苗包含缀合于一种亲水性免疫原性载体蛋白的至少一种激素-免疫模拟肽(immunomimic peptide)、或激素受体-免疫模拟肽。例如，所述免疫模拟肽选自以下的合成序列：胃泌素G-17、胃泌素G-34、GnRH和hcG。具体说，合成的胃泌素G-17序列是SEQ NO：1或其片段(SEQ ID NO：3-8)。合成的G34肽序列是SEQ ID NO：12。合成的GnRH免疫模拟肽是SEQ ID NO：15。合成的hCG免疫原性肽序列是SEQ ID NO：16。接头肽是SEQ NO：9，10T和11。
本发明的某些实施例中，脂质体分开包裹或一起包裹水溶性免疫原和水溶性高分子量免疫调节物质或低分子量免疫调节物质。高分子量免疫调节物质可以包括细胞因子。低分子量免疫调节物质的例子包括但不限于：MDP、苏氨酰MDP、莫拉丁酯，N-乙酰葡糖胺酰-MDP和murametide。
本发明还涉及含本文和权利要求书所述的低粘度脂质体组合物及药学上可接受载体的药物制剂。本发明的药物制剂可给予需要的患者作为治疗疾病或疾患治疗方案的组成部分。
这种药物制剂的一个例子是含有本文和权利要求书所述的低粘度脂质体组合物的可注射水性悬浮液的灭菌组合物。由于脂质体中包裹了大量蛋白质，输送大量蛋白质可提供更高的免疫原剂量，同时保持了适合于注射的粘度和维持了可接受的剂量体积。这样，本发明提供了有效的免疫接种，而无须加入有潜在毒性的佐剂和免疫调节添加剂。因此，组织反应原性得以有效降低。
本发明还涉及制备脂质体疫苗的方法，该方法包括制备磷脂多室载体和包裹水溶性免疫原和/或免疫调节物质的步骤，从而使脂质体含有高的脂质∶蛋白质比例。
附图简述
图1是脂质体DMPC+G17DT缀合组合物的电镜图，其中脂质∶蛋白质比例为500∶1。
图2是脂质体DMPC+G17DT缀合组合物和非-MDP添加剂的电镜图，其中脂质∶蛋白质比例为500∶1。
图3是脂质体DMPC/DMPG+G17DT缀合组合物的电镜图，其中脂质/蛋白质比例为500∶1。
图4是脂质体DMPC/DMPG+G17DT+非-MDP的电镜图，其中脂质/蛋白质比例为500∶1。
图5是比较以下疫苗接种所诱导的抗胃泌素抗体平均滴度随时间变化图：对照单用100μg G17DT；或脂质体包裹的100μg G17DT注射用乳剂和1.5mg或3mg G17DT(0cu IL-12)；和溶于PBS中的1.5mg或3mg G17DT；脂质体包裹的1.5mg或3mg G17DT加1000cu IL-12-100,000cu IL-12。
图6是用上述组合物疫苗接种所诱导的抗胃泌素抗体滴度中位数随时间变化图。
图7是用以下疫苗接种所诱导的抗-GnRH抗体平均滴度随时间变化图：对照为100μg GnRHDT缀合物或乳剂和脂质体包裹的1.5mg或3mg GnRH-DT(0cu IL-12)；和溶于PBS溶液中的1.5mg或3mg GnRHDY；与脂质体包裹的1.5mg或3mg GnRHDT加1000cu IL-12-100,000cu IL-12。
图8是用上述免疫原疫苗接种所诱导的抗-GnRH抗体滴度中位数随时间变化图。
图9是对高剂量含5％EtOH或水的G17DT脂质体反应时产生的抗-G17兔抗体平均滴度图。
图10是对高剂量含5％EtOH或水的G17DT脂质体反应时产生的抗-G17兔抗体滴度中位数图。
发明详述
描述以下术语的含义并用于本说明书中。
能形成脂质体的脂质或形成小泡的脂质，指以具有疏水性极性头部基团为特征的两亲性脂质，其可自发形成含水双层小泡。具体说，将形成脂质体的脂质稳定掺入脂质双层中，使其疏水部分与囊膜的内部区域接触，而其极性头部基团朝向囊膜的外部极性表面。
专用术语“分开包裹”指脂质体包裹的成分，例如抗原和细胞因子分开被包裹在不同的脂质体制剂中。
相反，“共同包裹的”成分，应理解为脂质体制剂含有一种以上抗原或产品，如抗原和免疫刺激剂的组合。
如上所述，本发明的脂质体适合包裹水溶性物质，如亲水性蛋白质和低分子量化合物，从而使大量物质分散在众多脂质载体中，其大小范围0.1-10μm。
更具体说，脂质体包裹的水溶性化合物可以是含有最小免疫原性分子的疫苗构建物。该构建物可含有免疫原性载体蛋白与作为靶子的免疫模拟肽的缀合物。该载体蛋白可包括其免疫原性片段作为载体。
术语“可注射组合物”定义为粘度足够低而得以通过例如皮下针头作胃肠外注射的脂质体组合物。
脂质体制剂一般认为最适合包裹两亲性物质。出乎意料的是本发明制备的脂质体具有高的脂质∶蛋白质重量比，能包裹大量，例如可将至少50％的水溶性物质分布在众多的脂质载体中。因此，本发明脂质体的高脂质∶蛋白质比例能显著降低或甚至消除反应原性，同时通过大大提高脂质体包裹的免疫原剂量提高其免疫原性到临床有效水平。本发明的脂质体比常规油包水乳剂的耐受性好得多，同时仍能在体内获得有效的免疫应答反应。
脂质体制剂的高脂质∶蛋白质比例降低了抗激素疫苗的反应原性，而当脂质体与常用低剂量乳化免疫原一起配制时，抗自身激素的多室脂质体疫苗不会诱导足够的抗体滴度。事实上，其他人曾经试图提高脂质体中亲水性免疫原的含量但未能成功，因为脂质体包裹亲水分子的效果通常很差。
本发明的脂质体小泡含有脂质的疏水性尾部基团和极性头部基团排成阵列，与水形成脂质双层膜。疏水的尾部包含饱和的烃链和类固醇基团，而极性头部基团含有化学反应性基团，如酸、醇、醛、胺和酯基团。本发明所用的磷脂包括但不限于：磷脂酸(PA)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)和鞘磷脂(SM)。
已知包裹的水溶性免疫原含有连接于免疫原性水溶性载体蛋白的靶抗原-免疫模拟肽。由于免疫原性水溶性载体蛋白的亲水部分占优势，它实质性影响到整个免疫原性构建物的总体水溶性特征。
本发明另一实施例所含的亲水性免疫原性载体蛋白，包括白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、马蹄形蟹血兰蛋白、匙孔戚血兰蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或多糖葡聚糖；及这些载体各自的免疫活性组分。
本发明的脂质体疫苗组合物含有稳定包裹在众多脂质体中的大量水溶性疫苗，脂质体则悬浮在水性载体中，各脂质体颗粒有免疫原性，能引起持久的有临床意义的免疫应答反应。
该脂质体疫苗悬浮液含有针对自身抗原的免疫原和/或免疫调节物质，适合给予患者治疗自身靶抗原相关疾病或疾患。
该脂质体免疫原可通过胃肠外、鼻内、直肠内或阴道内途径给予患者进行治疗。胃肠外给药包括静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内注射。
例如，可注射针对生殖性激素的脂质体疫苗进行免疫，以中断妊娠。另一个例子是用抗-GnRH或抗-hCG脂质体疫苗免疫接种，可诱导免疫应答防止妊娠。
脂质∶蛋白质重量高比例小泡(HLPR)的可注射悬浮液的优选实施例，在大量大小适当的脂质小泡中提供了高剂量的包裹有白喉类毒素蛋白质(DT)的免疫原性缀合物，其能安全地注射进行抗自身抗原的免疫接种。这种自身免疫靶抗原包括正常的激素和类似因子，及它们有关的参与直接或间接刺激各种胃肠或生殖系统中肿瘤生长的，或促进直结肠癌、乳腺癌或前列腺癌转移的受体。
因此，本发明包括包裹有抗胃泌素免疫原构建物的脂质体小泡可注射水性悬浮液。本发明的另一实施例包括包裹有抗GnRH免疫原构建物的脂质体小泡可注射水性悬浮液。本发明还提供包裹在HLPR脂质体中的人绒毛膜促性腺激素(hCG)免疫避孕疫苗。因此，一实施例提供的抗-hCG脂质体疫苗适合作为避孕所需要的、能降低组织反应原性，同时提供临床上有效的免疫原剂量。
此外，某些激素或生长因子只是部分不成熟形式癌症所具有的，发现它们在肿瘤中显示出自分泌和/或旁分泌活性。例如，已知胃泌素激素中，双酰胺化的胃泌-17(G17)，pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2(在序列表中是SEQ ID NO：1)和前体形式的甘氨酸-延伸的胃泌素-17(GlyG17)，pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly(SEQ ID NO：2)都能刺激胃肠道(GI)肿瘤和非GI相关肿瘤如甲状腺和肺癌的生长。
本发明抗胃泌素实施例包括由大量脂质-蛋白质高比率的脂质体小小泡包裹的大量亲水性抗胃泌素G17免疫原性构建物组成的可注射水性悬浮液，其中的免疫原性构建物含有各种长度的G17-氨基端免疫模拟肽表位，长度范围为1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、或1-10个氨基酸(分别为SEQID NO：3、4、5、6、7、或8)，其C-未端通过6个残基的接头肽(SEQ ID NO：9)，或7个残基的接头肽(SEQ ID NO：10)，或8个残基的接头肽(SEQ ID NO：11)与载体蛋白质相连。
本发明另一实施例提供针对胃泌素G34(SEQ ID NO：12)N-端1-22肽序列的脂质体免疫原，其可用于免疫控制或或抑制胃泌素分泌。
本文中，一实施例提供最小的免疫原性合成肽：pGlu-Leu-Gly-Pro-Glu-Gly-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-Cys或Cys-Pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Glu-Leu-Gly-Pro-Glu-Gly(分别为SEQ ID NO：13和14)，使G34(1-6aa)片段，在其C-端或N-端与接头肽如Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：11)相连接，从而使该免疫模拟肽的Cys与适合的免疫原性载体蛋白相缀合。
此外，已知哺乳动物生殖激素，促性腺素释放激素(GnRH)，pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(SEQ ID NO：15)涉及雄性和雌性生殖系统中癌细胞的生长。
含有脂质/蛋白质高比例、包裹有免疫原的小泡型脂质体可注射悬浮液的实施例中，提供的接头肽将免疫原性载体与模拟激素的免疫原性合成肽连接在一起，例如白喉类毒素与胃泌素-17的肽类似物，或促性腺素释放激素最小免疫原性类似物或其片段缀合在一起。
按照美国专利4,767,842(描述了hCG的结构II，其内容纳入本文作参考)所述方法，选择适合的序列与白喉类毒素或破伤风类毒素缀合。对于hCG-免疫原性构建物，可将模拟hCG的免疫原性合成肽连接于免疫原性载体DT。如上所述的其它免疫原性蛋白质也是hCG肽构建物的有用载体。
一实施例中，包含相应于hCG的β亚基111-145氨基酸序列(序列表中的SEQ IDNO：16)(引自美国专利4,767,842的“结构II”)部分的hCG片段，不是与LH(黄体生成素)的共同片段，因此它不会产生LH交叉反应性抗体。本发明另一实施例提供的hCG最小免疫原性合成肽在hCG-β亚基的N-端含有一个8间隔肽(SEQ ID NO：11)，在hCG的C-未端138-145位(SEQ ID NO：17)连接于DT。其它接头肽(SEQID NO：8或9)也可用于抗-hCG免疫原构建物。
本发明的药物实例中，提供以脂质/蛋白质重量高比例的脂质体小泡，包裹抗-hCG免疫原性构建物和药学上可按受载体的可注射悬浮液。
本发明一实施例提供制备在大量脂质颗粒中包裹有相对大量疫苗的大量可注射的脂质体制品的方法。该方法可包括包裹有针对癌细胞生长促进激素及其相关受体的免疫原的化学稳定的脂质体。
本发明另一实施例提供制备众多负载有大量水溶性免疫原达到脂质/蛋白质重量高比例的脂质小泡的方法。该方法可包裹和吸附与亲水性免疫原性载体蛋白或其片段相缀合的激素如G17或GnRH的免疫模拟肽。
本发明脂质体小泡的大小范围是0.1μm-10μm。此外，脂质体悬液提供的包裹疫苗，载有大约0.5mg-5mg蛋白质，脂质-蛋白质比例约为50∶1-1000∶1。
本发明的脂质体可通过共同包裹或分别包裹至少一种高分子量或低分子量免疫凋节剂来制备。高分子量免疫调节剂包括但不限于：分离的细胞因子，包括白介素如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15或IFN-γ、胞壁酰二肽(MDP)或其亲水性衍生物，如去甲MDP、苏氨酰MDP、莫拉丁酯、N-乙酰葡糖胺-MDP和murametide，以及脂质A衍生物4’-单磷酰脂质A(MPL)、三萜皂苷混合物Q521或ISCOPREPTM703(定义见皂苷)、CpG-寡核苷酸和番茄苷(一种葡糖生物碱皂苷，C50H3NO21；Sigma)。脂质体体制品共同包裹或分别包裹的免疫调节物质可包括10c.u-100,000c.u的IL-2。该脂质体组合物也提供能增强免疫原性的添加剂组合，如IL-2和非离子嵌段聚合物的组合。
本发明的组织低反应原性免疫方法，包括给予以脂质/蛋白质重量高比例包裹水溶性化合物的脂质体悬浮液。包裹蛋白质的脂质小泡，含有抗激素免疫原或抗激素受体的免疫原及免疫调节性化合物，分别包裹或共同包裹在相同的制品中，可经肌肉内、皮下、鼻内或直肠途径给药。
不受理论不恰当推测的束缚，目前相信本发明提供的转载体中包裹的蛋白质位于脂质小泡中，因而有二种输送方式。具体说，其输送方式包括通过释放小泡外表面吸附的抗原快速输送，以及通过各脂质小泡的膜系统缓释完全包裹的抗原组分两种方式。
本发明另一方面提供通过有效的缓慢释放输送脂质体内部的免疫原，而无须多次加强免疫接种来延长免疫避孕的方法。
本发明还提供含脂质/蛋白质高比例能包裹较大量水溶性抗原的脂质体的生产方法。
按照共属于美国专利5,023,077；5,468,494；5,688,506；5,698,201和6,359,114中所述的方法制备免疫原构建物。原理上，将免疫原性载体蛋白或其免疫原性片段，通过一合适的无免疫原性间隔肽，与适当长度的能模拟靶激素或其受体分子的免疫原性肽相缀合，以诱生特异性的能中和或抑制该激素生理作用的、抗激素或激素受体的抗体。模拟免疫原的肽与免疫原性载体蛋白的常用摩尔浓度比是1-40摩尔，其中载体单位是105MW。
以下实施例阐述本发明的优选方面，然而不是限于所述的水溶性化合物，应包括肽激素或激素受体作为免疫接种的靶子。美国专利5,023,077和5,468,494说明了用于中和胃泌素的免疫原，美国专利5,688,506说明了GnRH在人和其它哺乳动物中均有活性，此二专利内容纳入本文作参考。美国专利5,698,201说明了人绒毛膜促性腺激素(hCG)免疫原的生产方法，其内容纳入本文作参考。然而已有人选择抗-胃泌素免疫原性缀合物作为免疫治疗胃肠道恶性肿瘤的候选药物。(见Watson等，ExpOpin Biol Ther 2001，1(2)：309-17).
各种免疫原性脂质体包含合成的模拟激素免疫原性的肽，如胃泌素G-17(SEQ IDNO：7)或人GnRH(SEQ ID NO：15)。
模拟胃泌素免疫原性的肽可含有长度5个氨基酸或更长的序列，如C-未端结合有SSPPPPC臂的各种G-17(SEQ ID NO：3，4，5，6，7或8)激素免疫原性构建物的N-端的1-5、1-6、1-7、1-8或1-9个氨基酸序列。
用实施例1和2所述方法包裹的G17DT构建物，是一种由G17最小免疫原性9肽组成的胃泌素免疫原，该9肽衍生自人G17的氨基未端部分(1-9)，在其C-端通过一含有另外7个氨基酸的接头而延长。将产生的16肽pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-Pro-Pro-pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：18)通过其未端半胱氨酸残其上的巯基与异质双功能接头分子反应，共价连接于运载分子白喉类毒素(DT)(连接于该载体蛋白赖氨酸的ε氨基)。
GnRH免疫原选用GnRH的氨基酸序列1-10。该免疫原也可含有接头肽，可将载体与免疫模拟肽，如国际氨基酸专门名词中的RPPPPC(SEQ ID NO：9)、SSPPPPC(SEQ IDNO：10)相连接，但不限于这些。另一合适的接头是SPPPPPPC(SEQ ID NO：11)。可将GnRH免疫原性模拟肽通过与接头肽未端半胱氨酸(C)反应形成二硫键共价连接于载体。
实施例4中所述脂质体包裹的GnRH缀合物也称为“D17DT”，是17肽，Cys-Pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(SEQ ID NO：19)，含有氨基端GnRH模拟免疫原序列，其C-未端延伸的接头肽通过异质双功能试剂连接于载体蛋白即DT中的赖氨酸残基的ε氨基。
构建了G17-白喉毒素(G17DT)缀合免疫原来诱导能特异性中和人胃泌素G17(hG17)的抗体。该免疫原可包含携带hG17表位的肽，共价连接于亲水性免疫原性载体如白喉类毒素。G17免疫模拟肽含有的片段是G17的N-未端5-12个氨基酸。可将这些G17肽片段任选地连接一接头肽如SSPPPPC，再经其连接于免疫原性亲水性载体如DT。类似地，可用G17或G1y-延伸G17的C-未端序列部分的免疫模拟物，构建免疫原。设计用可溶于水相的该免疫原性缀合物来诱导体内产生抗胃泌素抗体。然而，用实用的免疫方案来诱导有效水平的抗hG17抗体需要加入免疫增强佐剂以提高该缀合物的免疫原性。
合成的hCG免疫原可包含Cys-Pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln(138-145位氨基酸C-未端肽序列；SEQ ID NO：20)。
本发明提供生产含有大量免疫原性蛋白质的可注射的脂质体包裹的疫苗，其能诱导高滴度的抗血清而在脂质体注射部位没有组织反应，获得了高抗体滴度与低的或可忽略的反应原性的良好比率。以下的详细描述和实施例，公开了本发明的多室性脂质体小泡的组成，特别是适合包裹亲水性免疫原的脂质体组合物的生产方法。
如以下实施例所显示，已发现多室性脂质体中包裹的免疫原剂量高至1.5或3mg，但其对局部组织的刺激作用，低于例如油包水乳剂中剂量少得多的100μg免疫原。
可按照本领域熟知的方法用各种脂质体小泡形成脂质，来制备脂质体组合物。脂质体小泡制备的有关方法和材料见美国专利5,919,480中所述，其内容纳入本文作参考，下面将作进一步描述。本发明的脂质或油性小泡形成物质可长期保存脂质体包裹的抗原与佐剂，并在给药后有效释放这些成分。代表性的脂质包括但不限于：双十四烷酰磷脂酰胆碱(DMPC)、双十四烷酰磷脂酰甘油(DMPG)、胆固醇、1，2-二硬脂酰-3-三甲基胺丙烷(DSTAP)、1，2-双十四烷酰-3-三甲基胺丙烷(DMTAP)和它们的组合，如DMPC/胆固醇、DMPC/DMPG、DMPC/DMPG/胆固醇、DMPC/DMTAP和DMPG/DMTAP/胆固醇。本发明的脂质体组合物含有10-100摩尔百分比的DMPC。具体用的组合物是9∶1(摩尔/摩尔)DMPC/DMPG的混合物和单用DMPC。
本发明的脂质体也可包含大的脂质小泡，如以下所述，具有约0.25μm-5.0μm的平均直径。
本发明提供的免疫反应增强化合物可与靶向免疫原性肽共同包裹在脂质体中，或者单独包裹在适当构建的多室脂质体中，与免疫原分开注射，或注射在非常接近免疫原的同一部位。
该脂质体免疫原性组合物也可含有免疫刺激性细胞因子如白介素。细胞因子添加剂包括选自白介素的例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IFN-γ和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，或它们的组合。例如可联用免疫调节剂IL-2和GM-CSF通过脂质体输送进行免疫治疗。
细胞因子可作为高分子量佐剂，以约20KD(KD＝千道尔顿)的糖蛋白加入。细胞因子具有不同的靶向能力而增强免疫应答反应，IL-1能促进T和B细胞成熟，IL-2能促进T和B淋巴细胞及巨噬细胞上调，IL-4能促进B细胞上调，IFN-能促进B细胞和巨噬细胞上调增加MHC表达，GM-CSF可向树突状细胞(DCs)提供协同迁移信号。
本发明的脂质体疫苗可包含包裹在脂质体内的佐剂，其可单独给予或与免疫原性缀合物一起给予。例如，免疫调节佐剂包括低分子量化合物如去甲胞壁酰二肽(去甲MDP)，剂量应是有效和可接受的量，每剂可为1-50μm去甲MDP。
去甲MDP是N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-异谷氨酰胺的一种几乎无毒的亲水衍生物，是分枝杆菌肽聚糖提取物中的佐剂活性组分。其它亲水性衍生物包括苏氨酰MDP、莫拉丁酯、N-乙酰葡糖胺-MDP和murametide。去甲MDP有激活Th2淋巴细胞的倾向。亲脂性衍生物MTP-E有激活Th-1淋巴细胞的倾向。
脂质体制剂中可加入各种低分子量免疫调节剂的组合，包括MPL、亲脂性MDP或亲水性去甲MDP、已知的皂苷Q521、ISCOPREPTM703、或QuilA和CpG寡核苷酸。适合于人类疫苗的脂质体佐剂还可包括衍生自脂质A的4’-单磷脂脂质A(MPL)。番茄苷，一种皂苷，是具有免疫增强活性的天然产生的葡糖生物碱(Sigma)。
其它强的免疫刺激佐剂可包括置于标准的油包水乳剂水相中的非离子嵌段聚合物，已发现它能诱导显著水平的持续至少4个月的免疫力而不会引起注射部位不可接受水平的局部刺激反应。可将合成的聚合物如聚交酯共聚乙交酯(PLG)、钙盐、胶原、透明质酸钙或钠、聚乙二醇(PEG)或其它凝胶形成物质以微球形式加入，其降解可产生免疫原和免疫刺激佐剂的脉冲式输送。这类控释方法可延长免疫效果几个月。
脂质体和脂质体组合物的制备
以下叙述制备本发明含有水溶性包裹制剂的脂质体悬浮液的方法，和在脂质体中掺入附加组合的方法。
可用各种技术制备脂质体。为了形成多室性小泡(MLV)，将小泡形成脂质的混合物溶于合适的有机溶剂(或溶剂混合物)中，在容器中蒸发形成薄膜，然后用水性介质水合，形成脂质小泡，通常大小为0.1-10μm，然后冻干。叔丁醇(TB)是该方法的一种特别适合的溶剂(用其制备的MLV称为TB-MLV)。可将冻干的MLV制品重新溶解成为水性悬浮液。然后可挤压该水性悬液通过具有选择的均一大小孔径(通常为0.05-1.0微米)的聚碳酸酯膜，选择性减小MLV悬液的粒子大小到所需的1微米或不到1微米的小泡。
本发明的小泡形成脂质含有疏水链和极性头部基团，能在水中形成双层小泡。例如，磷脂在水性环境中能自发形成小泡或稳定掺入脂质双层中向内的脂分子疏水部分中，脂质分子的亲水性极性头部基团朝向双层小泡的外表面。设计脂质体的脂质双层膜能将亲水免疫原保持在内，被脂膜小泡所包裹。
小泡形成脂质可含有烃链、类固醇基团或化学活性基团，如酸、醇、醛、胺或酯，极性头部基团。磷脂包括磷脂酸(PA)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)和鞘磷脂(SM)，它们通常含有二条约14-22个碳原子组成的饱和程度不同的烃链，由它们组合而形成小泡。加入脂类聚合物可稳定小泡的脂质成分。另外，糖脂，包括脑苷脂和节苷脂以及类固醇(如胆固醇)可形成小泡。也可购得(Calbiochem)合成性膜形成磷脂酰衍生化合物，包括双十六烷酰、二油酰、二月桂酰、双十四烷酰或二棕榈酰化合物，包括双十四烷酰磷脂酰胆碱或双十四烷酰磷脂酰甘油，可采用其与的和脂质膜稳定添加剂的混合物。
虽然免疫原性脂质体组合物常规采用少量的抗原性高的病毒颗粒，但生物本身的，即自身激素或激素受体的抗原性非常低或可忽略不计，它们不需要免疫原性高的载体蛋白如白喉类毒素和破伤风类毒素，而且已发现激素免疫原脂质体需要相对大量的自身抗原分布在众多的包裹脂质体中，来维持其化学稳定性和有利的输送状态，同时防止不利的反应原性。除上述免疫原外，本发明的脂质体也适合输送其它水溶性物质，包括经修饰可提高免疫原性的激素、生长因子、辅因子或佐剂。
已有各种方法在脂质体中包裹其它或额外的制剂。例如，在反相蒸发方法中(Szoka的美国专利4,235,871)，采用少量水性介质分散小泡形成脂质的非水性溶液，形成油包水乳液。因此，就亲脂制剂而言，可将活性成分溶在脂溶液中，就水溶性制剂而言，可溶在水溶液中。除去脂溶剂后，剩下的胶即转变成脂质体。这类反向蒸发小泡(REV)具有典型的约2-4微米平均大小，主要是寡室型，含有一个以上或至少多个脂质双层壳。如需要可通过挤压使REV的大小成为最大尺寸0.05-1.5微米的寡室小泡。可进一步通过挤压、超声或高压匀浆处理大的多室小泡(LMLV)或REV产生小的单室小泡(SUV)，其特征是不小为0.03-0.1微米。或者，可通过脂质的水性分散液匀浆化直接形成SUV。
在脂质体组合物中加入添加组分的其它方法，包括将水性脂质体分散液与其它组分共同冻干，将产生的固体重新分散形成MLV。另一方法(A.Adler，CancerBiother.10：293，1995)是将待包裹的制剂水溶液加到脂质的叔丁醇溶液中。超声该混合物并冻干，得到的粉末重新复水。
如需要，在最后确定大小后可再处理含有包裹制剂的脂质体组合物，以除去游离的(未包裹的)制剂。常规分离技术如离心、透析和超滤适合此目的。该组合物也可通过常规的0.45微米滤膜过滤除菌。为了形成本发明的组合物，可选择脂质体中的免疫原缀合物的浓度，在过滤后得到蛋白质/脂质分子量比为1∶100-1∶1000的、100％包裹的组合物。
发现本发明的脂质体制品可长时间稳定。4℃贮存时，该脂质体载体一年后仍相当稳定，包裹的免疫原性物质可保留其初始活性的75-95％至少3-6个月。含IL-2的脂质体特别稳定。加有IL-2和抗原的脂质体显示6个月以上活性损失不超过10％。
该脂质体组合物中也可加入稳定剂。例如，当在冻干介质中加入铁螯合剂如100μm浓度的DesferalTM或二亚乙基三胺戊基乙酸(DTPA)时，可进一步减少IL-2生物活性的损失。为了贮存得更久，可将该组合物转变成冻干粉末而稳定一年以上，用前按需要加入水形成水悬浮液。
对于人，抗原的有效剂量为50微克至5毫克。
可通过胃肠道外注射给药，如腹膜内(i.p)、皮下(s.c)、静脉内(i.v)、肌肉内(i.m)或透皮给药。也可通过粘膜如鼻内、直肠内、阴道内或口腔给予该疫苗。
发现本发明的多室性小泡能包裹大量的亲水性蛋白质，产生含有例如抗胃泌素缀合物G17DT，或抗GnRH缀合物GnRHDT(也称为D17DT)的疫苗制剂。一种包裹方法见实施例1中所述，虽然该方法不限于实施例中的颗粒性脂质体免疫原。
按照共签署的美国专利5,023,077和5,468,494(G17DT)及5,688,506(GnRHDT)和6,132,720(其内容纳入本文作参考)中所述方法制备这些缀合物。上面已描述了这些缀合物的序列同类物。
此外，上述的CCK-2/胃泌素受体免疫原(共签署的待批申请S/N09/076,372公开内容纳入本文作参考)和hCG免疫原是适合包裹在上述脂质体中的物质。采用人胃泌素同类物或片段的实施例并不意味在实施本发明中包括其它动物的胃泌素激素。
实施例1：脂质体包裹
可用于产生多室性脂质体(MLV)的双层形成的组分，包括双十四烷酰磷脂酰胆碱(DMPC)或双十四烷酰磷脂酰甘油(DMPG)(Lipoid，Genzyme或Avanti Polar Lipid)。
冻干G17DT或GnRHDT免疫原加或不加去甲MDP佐剂的水溶液和脂质(或单用中性DMPC或DMPC∶DMPG重量比9∶1溶于)叔丁醇溶液的混合液过夜，制备MLV。为将冻干脂质体制备成可注射的悬浮液，水合和悬浮方法对脂质体的蛋白质包裹有着主要作用。当以小的递增量加入水进行水合时获得了最佳结果。
在评估脂质/蛋白质比例(w/w)对蛋白质包裹的影响中，发现增加脂质量达到DMPC/蛋白质比为1000∶1时不能导致比500∶1更好的蛋白质包裹。因此，本发明的大多数工作实施例采用500∶1的脂/-蛋白质或DMPC/蛋白质比率，或者300∶1的脂质/蛋白质比例(见表1和实施例6)。
脂质体包裹GnRHDT和G17DT(以下也称为“蛋白质”)的效果，可通过离心后定量测定脂质体沉淀组分中的蛋白质和水相上清液中的未包裹游离蛋白质来计算。蛋白质定量采用改进的Lowry法。Peterson G.L.1983.“总蛋白质测定”Methods Enzymol.91：95-119。为评估脂质体水相中的污染物，用改进的Bartlett法定量有机磷来测定磷脂的量：Bartlett，G.R.1959.，和“柱层析中的磷测试”，J Biol Chem.234：446-68；Y.Barenholz等，“脂质体制备和相关技术”，1993，LysosomeTechnology，第一卷，第二版(Gregoriadis，G.ED)CRC Press，BOCA RATON，FL，pp.526-616。
表1脂质/蛋白质重量比对蛋白质包裹百分率的影响
    脂质体制剂 脂质/蛋白质比例(w/w) 蛋白质包裹百分率(％)
    DMPC/G17DT     500∶1     89.4±7.86
    DMPC/G17DT     300∶1     90
    DMPC/DMPG/G17DT     500∶1     86.0±2.5
    DMPC/GnRHDT     500∶1     97.05±2.5
    DMPC/GnRHDT     300∶1     86
由90％DMPC和10％DMPG以500∶1的脂质/蛋白质比率组成的阴电荷DMPC/DMPG脂质体制剂的蛋白质包裹效率，与100％DMPC脂质体制剂大约相同。
加入采用Waterpro Ps HPLC/Ultrafilter Hybrid提供的低水平总有机碳和无机离子的无菌无热原质纯水(pH5.4)，制备冻干样品的水合悬浮液。测定水合当天该溶液的pH值。虽然不同测试制品的确切pH值范围在5.2-6.7，但其对制品的效能没有明显影响。制备脂质/蛋白质重量比为500∶1的脂质体制剂如DMPC/蛋白质、DMPC/蛋白质/佐剂、DMPC/DMPG/蛋白质、DMPC/DMPG与蛋白质和佐剂的混合物。
如Y.Barenholz等(ibid)所述，在25℃用Coulter model N4 SD或用Coulter计数器(Coulter Multisizer Accucomp)进行动力学光散射(DLS)测定了脂质体分散液中的粒子大小分布。污染物或未负载的脂质体为0.2-0.8μm。
用动力学光散射(DLS)测定80-100％粒子，证实脂质体大小分布的范围是1.3-1.8μm.
用Coulter计数器测定所得脂质体的大小一致证实其平均体积为3.7-5.0(标准差±3)。
电镜观察含GnRHDT(即D17DT)的脂质体样品并用负染色测定。图1-图4是电镜图，表明有二种不同脂质体疫苗被磷钨酸钠负染(脂质/蛋白质重量比500∶1)。多次电镜观察所得颗粒直径显示，每种脂质体制剂平均每50个颗粒平均直径为1-2.5μm。
也进行了实验来确定脂质/蛋白质高比例脂质体制备方法对包裹亲水性蛋白质成分，如上述缀合物的效果。具体说，发现速制的多室性小泡保持了高浓度或数量级的DT或其它水溶性蛋白质，部分位于脂质双层膜中，部分完全包裹在膜内或壳内。
以下实施例显示疫苗剂量的增加对组织反应原性的影响。
实施例2低剂量G17DT脂质体与G17DT乳液的比较
脂质体水悬液中的G17DT缀合物的剂量是100μg或200μg蛋白质。在雌兔(3组)中于0、28和56天分别注射测试了脂质体G17DT疫苗，与现有技术的对照G17DT乳液100μg剂量作比较。
在48天研究中间隔14天收集血清样品，用ELISA测定抗胃沁素抗体滴度。发现100μg/0.2ml体积的脂质体制品经3次注射第70天诱导的反应峰值平均滴度为10,370。其它所有脂质体样品的滴度为5,000或更低，表明诱导10,000以上的滴度至少需要注射3次，并且这些滴度不能持续长时间。加倍给予200μg/0.4ml剂量导致第3次注射后14天收集的血清平均滴度为11,162。增加剂量有时更有效，因为第2次注射后14天获得了9,335(接近约10,000)的平均滴度，表明测到了比100μg剂量方案更高的促进。然而，这些反应时间短，因为其它采血日(0-14-26-56-84天)收集的血清平均滴度都低于5,000。虽然脂质体制剂输送的缀合物剂量加倍而获得了加强，但反应短暂。因此不认为这些脂质体是可用于临床的疫苗，而采用100μg G17DT剂量含ISA 703的乳液(第13组)以相同方案产生的兔血清抗胃泌素抗体平均滴度在第42天超过10,000。
显然，脂质体免疫原的这种结果比以下的结果(实施例3)明显要差。
然而，脂质体制剂在注射部位能非常好地耐受，不产生可见的组织反应。因为这较油包水乳剂免疫有所改进，故以较高抗加载量测试了脂质体对包裹抗原的明显保护作用。如下述实施例所证实，给予较大量的水溶性免疫原(1-3mg/每剂)获得了临床上有效的免疫应答反应而无明显的组织反应。
实施例3：G17DT脂质体
如以上实施例2所示，当以MontanideISA 703(“ISA 703”)修饰的乳剂给予时通常相当有效的缀合物剂量，当包裹在脂质体中时就不够有效。然而，给予数量级更高剂量的脂质体包裹的G17DT(分布在大量颗粒中)提供了效果。如下所述。不论剂量的多少，只见到极低的组织反应原性。此外，发现分开注射给予的细胞因子IL-2的免疫调节作用明显增强了抗体应答。
因此，用此实施例来评价用上述脂质体配制的高剂量hG17DT(1.5mg或3mg)和或不和IL-2(脂质体中的剂量为0、1,000、10,000或100,000cu)在一系列分开的注射中的免疫原性和局部耐受性。将此制剂的效果与作为对照的含G17DT的缓冲盐水(PBS)制剂(1.5或3.0mg每剂)，以及含G17DT缀合物的MontanideISA 703乳剂(0.2ml乳液中含100μg，每剂)作比较。
具体说，用包裹在脂质体中的G17DT免疫原和IL-2添加剂免疫13组家兔(n＝4，每组)。肌肉内(i.m)注射1.0ml体积(1-11组)或皮下(s.c)注射2.0ml体积(12组)。第1组动物第1次注射100μg G17DT含ISA 703，第2和3次注射1.5mg G17DT脂质体(无IL-2)。第1和13组i.m注射0.2ml体积的ISA 703乳剂，各只家兔i.m注射0.1ml体积的IL-2制剂(除1、10、11和13组外的所有组)。在0、28和56天给予一系列3次注射。处理的84天中每隔14天收集血清样品时，所有的家兔进行麻醉并对注射部位的反应打分。每组取2只家兔作活组织检查显微镜观察。
用ELISA直接结合试验方法测定了抗G17抗体反应，其中结合于包被了胃泌素靶抗原孔的抗体，用抗-抗体酶标复合物加酶底物直接检测。
实验程序
G17DT免疫原制剂
从以下组分制备由G17DT免疫原和IL-2的不同配方组成的测试物质：
1.hG17DT：hG17(1-9)pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys缀合于免疫原性载体(序列表中的SEQ ID NO：18)；
2.磷酸缓冲盐水(PBS)：[0.017M Na2HPO4+0.001M KH2PO4+0.14M NaCI，pH7.2]；
3.MontanideISA 703：(Seppic；Paris，France)；
4.DMPC：hG17DT脂质体；
5.DMPC/DMPG：细胞因子脂质体；
6.IL-2∶3×106cu贮存液；和
7.无菌盐水：0.9％NaCI，用双蒸水配，通过0.2μm针筒滤器过滤。
按美国专利5,468,494中所述方法制备hG17DT免疫原，该方法纳入本文作参考。
测试制剂
无菌配制组合的G17DT免疫原和IL-2添加剂见表A。对于所有脂质体和IL-2制剂，将适当体积的灭菌盐水以100微升递增量加入到各小瓶中，加入之间强烈震荡。以70∶30(油∶水相，wt∶wt)比率用标准的手工混合方法制备ISA 703乳剂。用PBS作为稀释液制备水相。将测试物质分装在针筒内冰箱(2-8℃)保存至使用。
体外方法
该研究中采用成年无特定病原体未交配过的雌性新西兰白兔。给家兔分组(n＝4)并如表B所示用G17DT免疫原接种。按所示剂量体积于0、28和56天每只家兔注射3次。按标准方案在后肢作肌肉内(i.m)或皮下(s.c)注射，第一次注射右后腿，第2次注射左后腿，第3次在右后腿比第1次注射部位较高处注射。在注射部位刺花纹便于后面的鉴定。
为了评估免疫原性，从每隔14天直到84天获得麻醉后的各只家兔的血样品，制取血清。用18号针头从耳边缘静脉收集血液(每次15ml)，存放在2-8℃过夜使凝块收缩。然后离心(400g)样品用移液器取出血清，分成单个样品冻存在-10℃至-25℃直到测试。
抗体试验
用ELISA测定血清中的抗胃泌素抗体滴度。测定测试日0、14、28、42、56、70和84天收集血清中的抗体。
粗略病理学检查
所有试验动物于第84天作注射部位的粗略病理学检查。注射部位位于刺花纹处，翻转皮肤完全暴露肌肉，通过各注射部位的肌肉作完全的横切口。肉眼评价组织的粗略病理学变化，评分0-3分，0分表明组织看来正常，3分表明整个组织注射部位存在广泛的炎症反应。1分和2分代表局部反应为水平中等。
显微镜病理学观察
粗略病理学检查评分后，随机选择每个处理组二只家兔作显微镜病理学观察。用手术刀切取2-2.5cm长度的股四头肌并立即将组织标本浸在最小体积25ml的福尔马林缓冲液中。将各样品分置小瓶中用福尔马林固定最少24小时。石蜡包埋后，切成5微米厚切片，固定，苏木精伊红染色，对各小瓶样品作显微镜检查进行活检组织区域的组织病理学评价。表C给出了实施例3的各组织学评分和评分系统。
统计学分析
计算了各抗体滴度和对所选血液样品分组反应的抗胃泌素抗体滴度的平均值和中位数值，用Student T检验作比较。统计学分析结果包括B组(G17DT乳剂)的平均滴度见表D。
计算出粗略病理学观察的注射部位反应的平均评分。计算的平均组织学评分见表D。
免疫学结果
用ELISA测定了84天体内免疫原性试验过程中每组家兔产生的抗hG17抗体应答反应。平均抗体滴度见表E。图5是该平均滴度的图，图6是滴度中位数的图。
如图5和图6所示，用MontanideISA 703配制的输送100μg G17DT/每剂的对照G17DT免疫原性乳剂，诱导的应答反应特征是，在整个研究期间诱导了抗hG17抗体的高峰滴度(84天)和最强的持续性抗体产生。i.m注射脂质体制品的家兔应答反应滴度较低，时间较短，第2和第3次注射后有较高的增强反应。然而，给予测试家兔组2、3、7、9和12的几种脂质体制剂诱导了超过10,000的持久性滴度。组1的峰滴度出现在第3次注射后，统计学上不显著高于i.m注射脂质体的组(组2-8)，例外是组4和6。组4和组6(3.0mg G17DT，OIL-2)的应答反应特征是，峰平均滴度的标准差相对较低，与组1对照相比，有统计学意义。
组2(1.5mg，无IL-2)和组6(3.0mg，无IL-2)反应平均峰值之间无显著差异，表明G17DT剂量从1.5mg增加到3.0mg不能提高免疫原性。其它二个试验组，包括组1(第一次注射乳剂，第二和第三次注射1.5mg G17DT脂质体制品)和组2(s.c.注射脂质体)诱导的应答抗体滴度大约等于组13对照，虽然应答的动力学更接近类似于i，m脂质体组。组12第3次注射后未测得滴度增高；虽然从第56天到研究结束时平均抗体水平较为稳定，这提示第三次剂量可产生持久的抗体。如所预计的那样，组9和10分别对PBS配的抗原高剂量1.5mg和3.0mg G17DT溶液呈低反应。
如表4所显示，在1.5mg G17DT剂量水平时，IL-2不明显影响抗体水平。在3.0mg剂量时，只有组8(10,000cu IL-2)与组6(无IL-2)显著不同；然而缀合物该剂量时，接受二种更高剂量的IL-2的组8和9抗体滴度比IL-2低剂量的组7和无IL-2的组6要高。这些资料提示添加给予10,000-100,000cu的刺激性IL-2增强了3.0mg G17DT的免疫原性。
第84天肉眼观察所有家兔评估注射部位的反应等级。如数据所示，除组13(皮下)和组13(标准乳液制剂)外所有组注射部位反应很小。这二组第3次免疫原原注射部位评分＞1的：组12有2/4只动物，组13有1/4只动物。组1-11中，观察到IL-2注射的14/96处部位(15％)反应评分最低0.5分。这些组中注射免疫原的部位大多数(66％)评分为0.5分(87/132处)，33％为0分(43/132处)。因此观察评估表明，当i.m给予时脂质体制剂能被很好耐受。
显微镜病理学观察
表D显示第84天时的组织病理学评估平均结果。注射部位活检样品的显微镜病理学观察一般按照粗略肉眼观察评价结果而定，最高分是注射ISA 703配制的免疫原处，或皮下给予免疫原处。注射免疫原处比IL-2处评分略高。注射脂质体部位显示有炎症，有几处(6处)为中等到明显钙化和/或肌纤维显著损伤(4处，也有钙化)。组13的肌肉肉反应评分是油包水乳剂的典型评分。然而，组1第124号家兔部位1的2.5分对于给药首次注射部位第84天后的评分有点异常。发现皮下给予脂质体的组12评分较高。应注意肉眼和组织学反应评分系统相互是独立和不相关的。通常组织学反应评分高于肉眼评分。因此脂质体引起的肌肉炎症显著少于油包水乳剂。
结论：
实施例3的实验结果表明，以脂质/蛋白质高比率(500∶1)配制的、在大量MLV中含1.5和3.0mg G17DT的脂质体，经i.m注射诱导的抗hG17抗体水平，大约是含Montanide ISA 703的强乳剂疫苗所诱导的25％，其临床效果已足够高。同时尽管显著提高了疫苗剂量所观察到的组织反应原性极低。1.5和3.0mg剂量的制剂免疫原性相同。添加给予10,000-100,000cu的IL-2与脂质体混合提高了3.0mg剂量的免疫原性，而IL-2对1.5mg剂量的免疫原性无影响。皮下注射3.0mg免疫原剂量显著增强了免疫原性，如同组1中第1次用Montanide乳剂然后用1.5mg脂质体加强那样。免疫原高含量的脂质体制剂i.m注射后反应原性显著低下，但s.c注射则不低。这些结果表明，G17PT的高蛋白质脂质体制剂与免疫原剂量约1/10的montanide ISA703乳剂相当，但反应原性显著降低，同时提供了有效的免疫原性。
表A免疫原制剂
免疫原编号     载体 缀合物(mg)或IL-2(cu) 剂量(体积)
    1A   DMPC/DMPG脂质体     1.5mg     1ml
    1B   DMPC/DMPG脂质体     3.0mg     1ml
    1C   DMPC/DMPG脂质体     3.0mg     2ml
    1D   PBS溶液     1.5mg     1ml
    1E   PBS溶液     3.0mg     1ml
    1F   DMPC/DMPG脂质体     0cu     0.1ml
    1G   DMPC/DMPG脂质体     1,000cu     0.1ml
    1H   DMPC/DMPG脂质体     10,000cu     0.1ml
    1I   DMPC/DMPG脂质体     100,000cu     0.1ml
    1J   Montanide ISA 703乳剂     100μg     0.2ml
表B家兔疫苗剂量分组
组别# 家兔数/每组(n) Hg17DT或IL-2剂量 第1次注射(0天)  第1次注射’(0天) 第2次注射(28天) 第2次注射’(28天)  第3次注射(56天) 第3次注射’(56天)
 1  4 l00μg/1.5mg乳剂(na/0cu)MLV  1J 0.2mli.m  Na  1A1小瓶 Na  1A1小瓶 Na
 2  4 1.5mg(0cu)MLV  1A，1小瓶i.m  1F0.1ml  1A，1小瓶 1F0.1ml  1A，1小瓶 1F0.1ml
 3  4 1.5mg(1,000cu)MLV  1A，1小瓶i.m  1G0.1ml  1A，1小瓶 1G0.1ml  1A，1小瓶 1G0.1ml
 4  4 1.5mg(10,000cu)MLV  1A，1小瓶i.m  1H0.1ml  1A，1小瓶 1H0.1ml  1A，1小瓶 1H0.1ml
 5  4 1.5mg(100,000cu)MLV  1A，1小瓶i.m  1I0.1ml  1A，1小瓶 1I0.1ml  1A，1小瓶 1I0.1ml
 6  4 3.0mg(1ml)(0cu)MLV  1B，1小瓶i.m  1F0.1ml  1B1小瓶 1F0.1ml  1B1小瓶 1F0.1ml
 7  4 3.0mg(1ml)(1,000cu)MLV  1B，1小瓶i.m  1G0.1ml  1B1小瓶 1G0.1ml  1B1小瓶 1G0.1ml
 8  4 3.0mg(1ml)(10,000cu)MLV  1B，1小瓶i.m  1H0.1ml  1B1小瓶 1H0.1ml  1B1小瓶 1H0.1ml
 9  4 3.0mg(1ml)(100,000cu)MLV  1B，1小瓶i.m  1I0.1ml  1B1小瓶 1I0.1ml  1B1小瓶 1I0.1ml
 10  4 1.5mg(PBS)溶液  1D1ml  Na  1D1ml Na  1D1ml Na
 11  4 3.0mg(PBS)溶液  1E1ml  Na  1E1ml Na  1E1ml Na
 12  4 3.0mg(2ml)(100,000cu)s.c  1C2小瓶  1I0.1ml  1C2小瓶 1I0.1ml  1C2小瓶 1I0.1ml
 13  4 100μg(IsA 703)乳剂  J0.2ml  Na  1J0.2ml Na  1J0.2ml na
’＝分开注射IL-2
1小瓶＝1ml
MLV＝脂质体
表C(实施例3)第84天注射部位的反应评分
免疫原 IL-2 免疫原  IL-2  免疫原  IL-2
组别# 部位1 部位2 部位3  部位4  部位5  部位6
1.含703乳剂的100μgD17DT和1.5mgG17DT MLV i.m. 平均值 0.4 n/a 0.4  n/a  0.1  n/a
No.＞1 0 n/a 0  n/a  0  n/a
2.1.5mg G17DT，0cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0.4 0.1 0.5  0.1  0.4  0.0
No.＞1 0 0 0  0  0  0
3.1.5mg G17DT，1000cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0.4 0.1 0.5  0.3  0.5  0.0
No.＞1 0 0 0  0  0  0
4.1.5mg G17DT，10,000cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0.3 0.1 0.5  0.1  0.6  0.0
No.＞1 0 0 0  0  0  0
5.1.5mg G17DT，100,000cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0.4 0.0 0.5  0.0  0.5  0.0
No.＞1 0 0 0  0  0  0
6.3mg G17DT，0cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0.4 0.0 0.5  0.0  0.5  0.0
No.＞1 0 0 0  0  0  0
7.3mg G17DT，1000cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0.5 0.3 0.5  0.3  0.4  0.0
No.＞1 0 0 0  0  0  0
8.3mg G17DT，10,000cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0.3 0.1 0.5  0.3  0.5  0.0
No.＞1 0 0 0  0  0  0
9.3mg G17DT，100,000cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0.3 0.0 0.4  0.0  0.5  0.0
No.＞1 0 0 0  0  0  0
10.1.5mg G17DT，PBS MLV；i.m. 平均值 0.0 n/a 0.0  n/a  0.0  n/a
No.＞1 0.0 n/a 0.0  n/a  0.0  n/a
11.3mg G17DT，PBS MLV；i.m. 平均值 0.0 n/a 0.0  n/a  0.0  n/a
No.＞1 0.0 n/a 0.0  n/a  0.0  n/a
12.3mg G17DT，100,000cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0.1 0.1 0.6  0.0  1.3  0.0
No.＞1 0 0 0  0  0  0
13.100μg G17DTISA 703乳剂 平均值 0.5 n/a 0.6  n/a  1.1  n/a
No.＞1 0 n/a 0  n/a  0  n/a
表D(实施例3)第84天注射部位的组织学平均评分
免疫原  IL-2  免疫原  IL-2  免疫原  IL-2
 组别# 部位1  部位2  部位3  部位4  部位5  部位6
 1.100μg D17DT，703乳剂1.5mg G17DT，MLV；i.m. 1.5  n/a  0.5  n/a  0.8  n/a
 2.1.5mg G17DT0 cu IL-2；MLV；i.m. 0.5  0.3  0.8  0.3  1.3  0.0
 3.1.5mg G17DT，1000cu IL-2 MLV；i.m. 0.5  0.5  1.0  0.8  0.5  0.3
 4.1.5mg G17DT，10,000cu IL-2 MLV；i.m. 0.3  0.5  0.8  0.5  1.0  0.3
 5.1.5mg G1 7DT，100,000cu IL-2 MLV；i.m. 0.5  0.5  0.8  0.5  0.5  0.0
 6.3mg G17DT，0cu IL-2 MLV；i.m. 0.5  0.5  1.0  0.3  1.3  0.3
 7.3mg G17DT，1000cu IL-2 MLV；i.m. 0.5  0.5  1.3  0.5  0.5  0.0
 8.3mg G17DT，10,000cu IL-2 MLV；i.m. 0.5  0.5  1.0  0.8  0.8  0.5
 9.3mg G17DT，100,000cu IL-2 MLV；i.m. 0.3  0.5  1.0  0.3  1.0  0.5
 10.1.5mg G17DT，PBS，i.m. 0.3  n/a  0.3  n/a  0.0  n/a
 11.3mg G17DT，PBS，i.m. 0.3  n/a  0.3  n/a  0.0  n/a
 12.3mg G17DT，2ml MLV100,000cu IL-2s.c.. 0.5  0.5  1.5  1.8  2.0  0.5
 13.100μg G17DT，ISA 703乳剂，i.m. 0.8  n/a  2.0  n/a  2.3  n/a
**有中等至显著的钙化
##鉴定到肌肉纤维的显著损伤
组织病理学评分
0-0.5：无炎症或其它组织病理学异常
1.0-1.5：轻度急性或局部慢性炎症
2.0-2.5：中等急性或慢性炎症
3.0：严重的急慢性炎症
表E(实施例3)家兔血清抗胃泌素抗体应答反应
 组别# 0天  14天  28天  42天  56天  70天  84天
 组1100μg G17DT，7031.5mg G17DT，MLV，i.m. 平均值 0  11,616  19,000  53,450  40,164  36,075  30,025
中位数 0  12,201  15,700  42,100  26,650  23,700  22,600
S.D. 合并  9,023  8,955  38,495  39,218  31,628  21,819
 组21.5mg G17DT，0cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0  2,816  2,530  18,800  10,934  18,700  12,702
中位数 0  2,769  2,168  17,850  7,799  18,650  11,950
S.D. 合并  1,693  1,790  4,001  7,248  3,966  5,416
 组31.5mg G17DT，1000cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0  1,840  3,175  15,134  10,848  26,325  15,801
中位数 0  1,934  1,837  12,950  8,162  17,300  9,542
S.D. 合并  438  3,365  7,483  8,307  22,747  16,063
 组41.5mg G17DT，10,000cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0  2,479  2,227  19,177  6,951  13,514  6,323
中位数 0  2,804  2,529  8,988  6,962  14,550  6,594
S.D. 合并  1,102  1,086  4,540  4,534  4,457  2,058
 组51.5mg G17DT，100,000cu IL-2MLV；i.m. 平均值 0  1,956  2,724  12,465  5,525  12,429  18,297
中位数 0  1,980  2,339  10,375  4,971  8,957  11,151
S.D. 合并  684  2,086  8,093  2,623  8,850  17,814
 组63mg G17DT，0cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0  2,713  3,440  9,818  5,445  12,975  11,561
中位数 0  2,953  2,965  10,250  4,222  13,050  11,150
S.D. 合并  904  1,286  1,201  2,721  866  3,043
 组73mg G17DT，1000cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0  2,497  5,573  15,732  9,200  11,203  11,714
中位数 0  2,336  4,167  13,254  8,219  8,800  9,870
S.D. 合并  1,003  3,854  11,722  6,140  7,646  7,931
 组83mg G17DT，10,000cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0  4,221  7,414  17,550  16,850  28,825  16,425
中位数 0  3,048  5,946  19,050  16,800  28, 650  16,250
S.D. 合并  2,863  4,601  5,231  4,279  4,863  3,154
 组93mg G17DT，100,000cu IL-2MLV；i.m. 平均值 0  3,990  6,519  32,054  14,838  23,098  14,981
中位数 0  3,100  5,716  30,700  13,511  20,900  15,100
S.D. 合并  2,827  4,410  20,123  8,801  15,296  7,098
 组101.5mg G17DT，PBS，i.m. 平均值 0  39  1,342  918  432  1,646  533
中位数 0  18  74  337  177  993  443
S.D. 合并  56  2,586  1,261  557  1,660  302
 组113mg G17DT，PBS，i.m. 平均值 0  122  127  1,537  754  2,776  1,462
中位数 0  121  116  1,559  518  2,806  1,392
S.D. 合并  105  140  1,427  852  1,995  1,130
 组123mg G17DT，s.c.100,000cu IL-2 MLV 平均值 0  3,237  15,518  43,150  25,025  57,225  37,325
中位数 0  3,178  8,578  27,150  14,150  32,550  26,450
S.D. 合并  1,850  17,797  32,990  24,874  59,367  29,297
 组13100μg G17DT，ISA 703乳剂 平均值 0  1,574  9,860  45,269  41,025  46,450  63,175
中位数 0  1,495  10,913  48,550  38,150  42,300  60,650
S.D. 合并  752  5,900  31,551  25,306  37,223  43,159
实施例4：低剂量GnRH与无乳剂GnRH的比较
初步实验比较了脂质体GnRHDT疫苗和油包水乳剂GnRH疫苗的原性和免疫原性。GnRHDT缀合物(即D17DT)包裹在脂质体水悬液中，缀合物剂量为100-1000μg蛋白质。分别在0、14和42天i.m.注射雌兔测试GnRH疫苗，与包有相同剂量的GnRHDT乳剂疫苗作比较。
从0-70天每隔14天收集家兔血清，用ELISA测定抗-GnRH抗体滴度。发现i.m.注射脂质体输送100μg/0.2ml体积在3次注射后第70天诱导了2,004的平均峰值滴度。观察的所有其它血清样品显示582的平均峰值滴度，表明诱导2,000滴度至少需要需要注射3次。然而此抗体滴度不能持久，在达到峰值后不久即显著降低。
免疫原缀合物的剂量倍增到200μg/0.4ml脂质体维持平均滴度2,005到第70天。已发现提高剂量在第2次注射后14天评估时，能更有效地诱导平均768的滴度，而100μg/0.2ml剂量仅诱导了166的低滴度。进一步提高剂量，如500μg/1.0ml和1000μg/1.0ml抗原分别在第56天诱导了2,962和3,494的平均滴度，第70天分别下降至2,133和2,889。因此这些应答反应持续时间短，对脂质体免疫的抗体应答从28天-42天-56天-79天显著下降。然而看来提供缀合物剂量可导致抗-GnRH抗体应答的增强。
虽然提高GnRHDT缀合物脂质体的剂量到1mg/ml显示了所需的低反应原性，但免疫应答仍达不到充分中和GnRH活性(免疫灭活)所需的诱导5000以上滴度抗体的域值。
实施例5：GnRHDT(即D17DT)
如以下所述，进行了一实验来评估在脂质体中加入较高剂量D17DT形式的GnRHDT时，对其免疫原性和反应原性的影响。此项研究也调查了与脂质体分开注射给予IL-2的免疫调节作用。如实施例4中所述的研究已证明脂质体疫苗制品能克服用提高的乳剂疫苗剂量免疫动物时发现的反应原性增加(料施例4)的问题。
含剂量100μg和200μg GnRHDT用Montanide ISA 703配制的乳剂在大多数情况下对于临床上有效的免疫是足够的，虽然一般会引起较重的组织反应。然而，有时需要提高乳剂剂量到500μg-1000μg/0.2ml-0.5ml注射体积。发现提高剂量也增加了受治疗患者发生更严重的组织反应。因此，对于反应原性设立了200μg/0.2ml的剂量限制，需要更加改进的方法。
发现采用脂质/蛋白质高比率时，脂质体能包裹大量的免疫原，其水溶性蛋白质分布在大量小小泡中。本实验评价了用高脂质比率配制的大剂量(1.5mg或3.0mg)GnRHDT(即D17DT)，当与和不与IL-2(0、1,000；10,000或100,000cu量)分开注射的免疫效果。这些制剂按实施例1中抽述方法制备，与含有GnRHDT的PBS水溶液制剂(1.5或3.0mg缀合物，0.2ml体积)以及含GnRHDT(100μg/0.2ml)的MontanideISA 703乳剂相比较(见表1小结)。13组，每组4只家兔用GnRHDT免疫原和IL-2添加剂免疫(见表2)。组1-9肌肉内注射(i.m.)1.0ml体积的脂质体，组12皮下注射(s.c.)0.2ml体积。组1第1次注射接受100μg能力GnRHDT，ISA 703，第2和第3次注射1.5mg GnRHDT的MLV脂质体(无IL-2)。对照组1和13i.m.注射0.2ml体积的ISA 703乳剂疫苗。组2-9和12在其接受免疫原的同一天i.m.注射0.1ml体积的IL-2制剂。组10和11分别注射PBS水溶液配制的1.5和3.0mg GnRHDT缀合物。第0、28和56天进行注射。84天中每隔14天收集血清样品，对注射部位的反应作肉眼观察评分，每组取二只动物的活检组织作显微镜检查。用ELISA测定抗-GnRH抗体应答G(表3)。
此实施例的实验显示，脂质/蛋白质高比率的脂质体制剂作为载体，在i.m.或.s.c.(只是3.0mg)注射家兔后输送1.5mg和3.0mg GnRHDT，可诱导抗-GnRH抗体应答(见图7和图8)。剂量反应显示3.0mg缀合物的免疫原性比1.5mg高。然而，3.0mg剂量不加IL-2诱导了比对照Monitanide ISA 703免疫原乳剂更高的抗-GnRH抗体滴度。令人惊奇的是，脂质体的免疫原性不因添加注射IL-2而增强；事实上，在3.0mg剂量时，IL-2甚至降低了应答反应。
与i.m.给予脂质体制剂相比，组12中s.c.给予3.0mg剂量显著增强了免疫原性，而初次免疫家兔用Montanide制剂(组1)后用1.5mg脂质体(GnRH，MLV)加强只显示略微提高的滴度。注射脂质体制剂的局部肌肉组织反应原性，与对照montanide ISA703免疫原乳剂相比，显著下降。抗体应答类似于乳剂对照，包括3.0mg i.m.不加IL-2T和3.0mg s.c.注射组，同时组织学评分均较低，观察平分较差。相反，采用GnRHDT的高蛋白PBS溶液治疗在肌肉中不引起组织强反应，而抗-GnRH抗体滴度低至无效。
以上结果证明，配制的含数量级较高剂量GnRHDT的多室性脂质体制剂，就免疫原性和反应原而言，比Montanide ISA 703 GnRHD免疫原乳剂为优。
实验程序
GnRHDT免疫原配制
测试物质由不同的GnRHDT免疫原制剂和IL-2组成，它们由以下组分配制：
1.GnRHDT：GnRH(1-10)Ser-1-DT，也称为D17DT；
2.磷酸缓冲盐水(PBS)：[0.017M Na2HPO4+0.001M KH2PO4+0.14M NaCI，pH7.2]；
3.MontanideISA 703：(Seppic；Paris，France)；
4.DMPC：GnRHDT脂质体；
5.IL-2或其它细胞因子的DMPC/DMPG脂质体；
6.IL-2∶3×106cu；和
7.无菌盐水：0.9％NaCI，用双蒸水配，通过0.2μm针筒滤器过滤。
测试制剂
在清洁条件下配制GnRHDT免疫原和IL-2I添加剂的不同组合，见表1。为了悬浮脂质体将适当体积的灭菌盐水以100微升递增量加入到各小瓶中，加入之间强烈震荡。将调节剂IL-2溶于无菌盐水与DMPC/DMPG脂质体混合至适当浓度的IL-2。以70∶30(油∶水相，wt∶wt)比率用标准的手工混合方法制备ISA 703乳剂。用PBS作为稀释液制备水相。将测试物质分装在针筒内冰箱(2-8℃)保存至使用。
体外方法
该研究中采用52只成年无特定病原体未交配过的雌性新西兰白兔。给家兔分组(n＝4)并用GnRHDT-免疫原接种。按ge 2所示剂量体积于0、28和56天每只家兔注射3次。按标准方案在后肢作肌肉内或皮下注射，第一次注射右后腿，第2次注射左后腿，第3次在右后腿比第1次注射部位较高处注射。在注射部位剌花纹便于后面的鉴定。
为了评估免疫原性，每隔14天直到84天从麻醉后的各只家兔获得血样品，制取血清。用18号针头从耳边缘静脉收集血液(每次15ml)，存放在2-8℃过夜使凝块收缩。然后离心(400g)样品用移液器取出血清，分成单个样品冻存在-10℃至-25℃直到测试。
抗体试验
用ELISA测定血清中的抗-GnRH抗体滴度。测定测试日0、14、28、42、56、70和84天收集血清中的抗体。
粗略病理学检查
如实施例3中所述，评估所有家兔第84天时注射部位的粗略病理学变化。
显微镜病理学检查
粗略病理学评分后，随机选择每组二只家兔作显微镜病理学观察。用手术刀切取2-2.5cm长度的股四头肌并立即将组织标本浸在最小体积25ml的HistochoiceTM中。将各样品分置小瓶中在该溶液中固定最少24小时，作组织病理学评价。
结果
统计学分析
计算了各组(表3)和报选血样的抗GnRH抗体滴度的平均值和中位数值及及反应，用Student T检验作比较。计算了第84天粗略病理学观察的注射部位反应平均评分，结果见表4。计算的平均组织学评分见表5。
免疫学结果
用ELISA测定了84天体内试验过程中每组家兔产生的抗GnRH抗体应答反应。抗体滴度的中位数和平均值见表3。图7是该平均滴度的图，图8是滴度中位数的图。
如图7和图8所示，用MontanideISA 703配制的输送100μg GnRHDT/每剂的对照GnRHDT免疫原性制剂，在第70天诱导了抗-GnRH抗体的高峰滴度。i.m注射脂质体制品的家兔(组2-9)应答反应滴度一般低于乳剂对照所诱导的；然而，但该滴度在临床上有效，足够降低或中和免疫动物中的GnRH。对于此总体结果的一个例外是组6(3.0mg GnRHDT，无IL-2)其平均/中位数滴度超过对照组13。所有组的应答反应在每次注射后均有相应增强。事实上，第3次注射后平均峰滴度值的统计学比较表明，i.m注射二种剂量缀合物的脂质体所诱导的应答反应，不显著低于对照Montanide/免疫原乳剂(组13)的反应。
通常输送3.0mg剂量GnRHDT的脂质体免疫原性比1.5mg剂量的高(图2)。当考虑到中和GnRH生物活性从而导致不生育或抑制类固醇性腺激素的合成，需要的应答反应抗体滴度时，这特别有关。先前Aphton的研究表明5,000滑翔度可使家兔不能生育。如图2所示，用3.0mg GnRHDT剂量i.m.免疫家兔(组2-9)看来比用1.5mg剂量免疫有家兔诱导了更快更持久的有效抗体滴度。这种差异有统计学意义。其余二试验组1和12产生的抗-GnRH应答超过所有其它脂质体组，除组6外。组12(3mg GnRHDT，s.c.)是本研究中应答最高的组，提示皮下注射途径对于脂质体制剂是更可行的诱导抗体高滑翔度的途径。如预期的那样，分别注射1.5mg和3.0mg G17DT的PBS溶液的第9组只诱导了低反应。
细胞因子IL-2与1.5mg GnRHDT组合不显著影响抗体水平。3.0mg剂量而无IL-2的组6产生的滴度显著高于其它i.m.注射3.0mg脂质体制剂的组7、8和9。然而，组7-9之间的反应无显著差异。这些资料提示家兔起鹘落中脂质体输送的免疫原性不因加入IL-2而增强。
如表4提供的数据所示，所有组注射部位的反应均很小，评分不超过1.0。虽然组13动物(对照乳剂)在第3次免疫原注射部位的评分均为1.0分，但脂质体组1、7、9和12各只有一只家兔第3次注射部位为1.0分。i.m.脂质体注射部位大多数(74％)为0.5分，23％为0.1分。此外，免疫原性佐剂能被很好耐受，88％为0分。因此，肉眼评分表明i.m.注射脂质体制剂能被很好耐受。
显微镜病理学观察(表5)
注射部位活检样品的显微镜病理学观察一般按照粗略肉眼观察评价结果而定，最高分是注射ISA 703配制的免疫原部位。组13中所见到的肌肉反应评分与采用MontanideISA 703制剂通常观察到的相一致。当免疫原经s.c.给予时(组12)获得的评分略低于乳剂所引起的。家兔起鹘落对i.m.注射(组6)。几乎氖其它i.m.注射脂质体的部位炎症反应都最小。注射免疫原的部位倾向于评分略高于注射IL-2的部位，后者通常显示几乎没有炎症迹象除组6和9有一处外。应注意肉眼和组织学反应评分系统相互是独立和不相关的。通常组织学反应评分高于肉眼评分。总之这些评价表明，尽管增加了注射体积，脂质体看来引起的肌肉炎症显著少于油包水乳剂。
结论：
实施例5的实验结果表明，以脂质/蛋白质重量比率500∶1配制的、SK在大量较小脂类颗粒中输送1.5和3.0mg GnRHDT的脂质体，经i.m或s.c.(3.0mg)注射家兔后诱导了抗GnRH抗体应答。剂量反应证明3.0mg缀合物比1.5mg诱导了更高的免疫力。令人奇怪的是3.0mg剂量不添加IL-2诱导了比Montanide ISA 703gjq y，rrym3-GnRH滴度。因此，添加注射IL-2不能增强免疫原性；事实上，在3.0mg剂量时，IL-2甚至会降低应答反应。与脂质蛋白质高比第的脂质体制剂相比，不论它们是通过i.m还是s.c.给予3.0mg剂量都能显著增强免疫原性，而用montanide制剂初免疫，然后用1.5mg脂质体加强，只略为提供了滴度。尽管增加了疫苗的剂量体积，脂质体制剂的反应原性比剂量低得多的GnRHDT：Montanide ISA 703乳剂对照显著要低。因此，注射部位的组织学评分较低，它们的肉眼观察评分比乳剂对照要好，虽然抗体应答反应与乳剂对照相当。这些结果表明，剂量高达3.0mg GnRHD、以脂质/蛋白质高比率配制的脂质体制剂比用montanide ISA 703乳剂配制的免疫原要好，基反应原性显著降低甚至消失，仍能产生有效的抗-GnRH抗体滴度。另外，本研究证明，细胞因子刺激患者免疫系统的潜在毒性作用可通过采用从该组合物或治疗中删去细胞因子或类似制剂的本发明脂质体疫苗得以避免。
表1免疫制剂(实施例5)
  免疫原     载体 缀合物(mg)或IL-2组分   剂量(体积)
    2A     DMPC/DMPG(MLV)     1.5mg GnRHDT     1ml
    2B     DMPC/DMPG(MLV)     3.0mg GnRHDT     1ml
    2C     DMPC/DMPG(MLV)     3.0mg GnRHDT     2ml
    2D     PBS溶液     1.5mg GnRHDT     1ml
    2E     PBS溶液     3.0mg GnRHDT     1ml
    2F     DMPC/DMPG(MLV)     0cuIL-2     0.1ml
    2G     DMPC/DMPG(MLV)     1,000cuIL-2     0.1ml
    2H     DMPC/DMPG(MLV)     10,000cuIL-2     0.1ml
    2I     DMPC/DMPG(MLV)     100,000cuIL-2     0.1ml
    2J     Montanide ISA 703乳剂     100μg GnRHDT     0.2ml
表2家兔剂量分组(实施例5)
 组别# 家兔数/每组(n) GnRHDT剂量IL-2剂量 第1次注射(0天) 第1次注射’(0天) 第2次注射(28天) 第2次注射’(28天) 第3次注射(56天) 第3次注射’(56天)
 1  4 100μg/1.5mg(na/0cu)MLV  2J 0.2ml  NA  2A1小瓶 NA  2A1小瓶 NA
 2  4 1.5mg(0cu)MLV  2A，1小瓶  2F0.1ml  21A，1小瓶 2F0.1ml  2A，1小瓶 2F0.1ml
 3  4 1.5mg(1,000cu)MLV  2A，1小瓶  2G0.1ml  2A，1小瓶 2G0.1ml  2A，1小瓶 2G0.1ml
 4  4 1.5mg(10,000cu)MLV  2A，1小瓶  2H0.1ml  2A，1小瓶 2H0.1ml  2A，1小瓶 2H0.1ml
5 4 1.5mg(100,000cu)MLV 2A，1小瓶 2I0.1ml 2A，1小瓶 2I0.1ml 2A，1小瓶 2I0.1ml
 6  4 3.0mg(1ml)(0cu)MLV  2B，1小瓶  2F0.1ml  2B1小瓶 2F0.1ml  2B1小瓶 2F0.1ml
 7  4 3.0mg(1ml)(1,000cu)MLV  2B，1小瓶  2G0.1ml  2B1小瓶 2G0.1ml  2B1小瓶 2G0.1ml
 8  4 3.0mg(1ml)(10,000cu)MLV  2B，1小瓶  2H0.1ml  2B1小瓶 2H0.1ml  2B1小瓶 2H0.1ml
 9  4 3.0mg(1ml)(100,000cu)MLV  2B，1小瓶  2I0.1ml  2B1小瓶 2I0.1ml  2B1小瓶 2I0.1ml
 10  4 1.5mg(PBS)溶液  2D1ml  NA  2D1ml NA  2D1ml NA
 11  4 3.0mg(PBS)溶液  2E1ml  NA  2E1ml NA  2E1ml NA
 12  4 3.0mg(2ml)(100,000cu)s.c  2C2小瓶  2I0.1ml  2C2小瓶 2I0.1ml  2C2小瓶 2I0.1ml
 13  4 100μg(ISA 703)乳剂  2J0.2ml  NA  2J0.2ml NA  2J0.2ml NA
1小瓶＝1ml
’＝分开注射
表3家兔抗GnRH抗体应答反应(实施例5)
组别# 0天  14天  28天  42天  56天  70天  84天
组1.100μg GnRHDT，ISA703乳剂(注射1)1.5mg GnRHDT，MLV，(注射2和3)i.m. 平均值 0  557  2,255  10,115  6,735  11,651  6,643
中位数 0  547  1,866  8,405  5,216  8,062  4,269
S.D. 合并  126  1,406  7,016  4,037  8,126  5,116
组21.5mg GnRHDT，0cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0  702  1,211  6,682  4,001  5,305  2,600
中位数 0  524  1,046  6,549  3,590  4,936  2,555
S.D. 合并  504  660  586  1,388  3,289  1,788
组31.5mg GnRHDT，1000cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0  803  1,232  6,430  6,569  8,835  4,835
中位数 0  823  995  6,820  6,311  8,135  4,132
S.D. 合并  382  950  3,263  3,630  2,083  2,075
组41.5mg GnRHDT，10,000cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0  899  940  3,674  4,184  6,753  4,346
中位数 0  677  790  3,599  3,229  6,570  4,055
S.D. 0  926  790  2,686  3,910  4,058  2,049
组51.5mg GnRHDT，100,000cu IL-2MLV；i.m. 平均值 0  672  717  5,715  4,637  7,300  4,126
中位数 0  395  308  4,415  2,546  7,694  3,814
S.D. 合并  647  897  3,963  5,018  1,704  1,160
组63mg GnRHDT，0cu IL-2MLV；i.m. 平均值 0  777  2,047  9,949  16,375  18,350  13,065
中位数 0  650  1,297  9,651  15,600  17,300  13,450
S.D. 合并  502  1,911  4,404  5,110  5,149  3,739
组73mg GnRHDT，1000cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0  1,645  3,156  8,219  6,729  8,486  6,233
中位数 0  1,015  2,463  8,453  7,092  7,642  5,643
S.D. 合并  1,668  2,610  2,001  2,136  2,171  2,494
组83mg GnRHDT，10,000cu IL-2 MLV；i.m. 平均值 0  936  2,481  8,110  8,148  9,742  6,502
中位数 0  810  1,923  8,637  6,814  9,596  6,410
S.D. 合并  572  1,732  1,901  3,855  2,909  1,819
组93mg GnRHDT，100,000cu IL-2MLV；i.m. 平均值 0  907  3,077  5,953  4,820  9,156  5,388
中位数 0  750  1,512  5,209  4,799  8,169  4,684
S.D. 合并  405  3,610  4,020  2,045  2,754  2,430
组101.5mg GnRHDT，PBS，i.m. 平均值 0  0  0  154  97  811  369
中位数 0  0  0  129  90  767  358
S.D. 合并  1  1  61  29  225  145
组113mg GnRHDT，PBS，i.m. 平均值 0  16  28  807  407  2,582  967
中位数 0  14  8  641  287  2,646  988
S.D. 合并  14  43  496  289  958  444
组123mg GnRHDT，2ml100,000cu IL-2 MLV s.c 平均值 0  748  2,200  8,714  8,615  20,450  11,449
中位数 0  541  2,435  8,047  8,234  19,900  10,038
S.D. 合并  445  715  3,342  2,981  5,510  3,660
组13100μg GnRHDT，ISA 703乳剂 平均值 0  1,494  3,070  7,612  7,688  15,166  11,869
中位数 0  951  2,602  7,744  7,402  13,600  11,550
S.D. 合并  1,643  2,173  2,492  2,984  9,040  5,302
表4第84天注射部位的平均反应评分(实施例5)
 免疫原  IL-2  免疫原  IL-2  免疫原  IL-2
组别#  部位1  部位2  部位3  部位4  部位5  部位6
1.含ISA703乳剂的100μgDnRHDT(注射1)和1.5mgGnRHDT(注射2和3)MLV i.m.  平均值  0.5  N/A  0.3  N/A  0.5  N/A
 No.＞1  0  N/A  0  N/A  0  N/A
2.1.5mg GnRHDT，0cu IL-2 MLV；i.m.  平均值  0.3  0.0  0.5  0.0  0.3  0.0
 No.＞1  0  0  0  0  0  0
3.1.5mg GnRHDT，1000cu IL-2 MLV；i.m.  平均值  0.4  0.0  0.1  0.0  0.5  0.0
 No.＞1  0  0  0  0  0  0
4.1.5mg GnRHDT，10,000cu IL-2 MLV；i.m.  平均值  0.3  0.0  0.4  0.0  0.5  0.1
 No.＞1  0  0  0  0  0  0
5.1.5mg GnRHDT，100,000cu IL-2 MLV；i.m.  平均值  0.0  0.0  0.5  0.1  0.5  0.1
 No.＞1  0  0  0  0  0  0
6.3mg GnRHDT，0cu IL-2 MLV i.m.  平均值  0.3  0.3  0.5  0.0  0.5  0.0
 No.＞1  0  0  0  0  0  0
7.3mg GnRHDT，1000cu IL-2 MLV；i.m.  平均值  0.4  0.1  0.5  0.1  0.6  0.0
 No.＞1  0  0  0  0  0  0
8.3mg GnRHDT，10,000cu IL-2 MLV；i.m.  平均值  0.4  0.1  0.5  0.3  0.4  0.0
 No.＞1  0  0  0  0  0  0
9.3mg GnRHDT，100,000cu IL-2 MLV；i.m.  平均值  0.4  0.3  0.5  0.1  0.6  0.0
 No.＞1  0  0  0  0  0  0
10.1.5mg GnRHDT，PBS溶液；i.m.  平均值  0.0  N/A  0.0  N/A  0.0  N/A
 No.＞1  0.0  N/A  0.0  N/A  0.0  N/A
11.3mg GnRHDT，PBS溶液；i.m.  平均值  0.0  N/A  0.0  N/A  0.0  N/A
 No.＞1  0.0  N/A  0.0  N/A  0.0  N/A
12.3mg GnRHDT,100,000cu IL-2 MLV；i.m.  平均值  0.1  0.4  0.4  0.3  0.6  0.3
 No.＞1  0  0  0  0  0  0
13.100μg GnRHDTISA 703乳剂  平均值  0.4  N/A  0.6  N/A  1.0  N/A
 No.＞1  0  N/A  0  N/A  0  N/A
表5第84天天注射部位的组织学平均评分(实施例5)
免疫原  IL-2  免疫原  IL-2  免疫原  IL-2
组别# 部位1  部位2  部位3  部位4  部位5  部位6
 1.100μg DnRHDT，ISA703(注射1)乳剂1.5mg GnRHDT，(注射2和3)MLV. 1.0  N/A  0.3  N/A  0.5  N/A
 2.1.5mg GnRHDT 0cu IL-2；MLV；i.m. 0.5  0.0  0.5  0.5  0.3  0.0
 3.1.5mg GnRHDT，1000cu IL-2 MLV；i.m. 0.3  0.5  0.3  0.5  1.0  0.3
 4.1.5mg GnRHDT，10,000cu IL-2 MLV；i.m. 0.5  0.5  1.0  0.3  0.5  0.3
 5.1.5mg GnRHDT，100,000cu IL-2 MLV；i.m. 0.5  0.3  0.5  0.3  1.3  0.3
 6.3mg GnRHDT，0cu IL-2 MLV；i.m. 0.3  1.5  0.8  0.5  1.8  0.0
 7.3mg GnRHDT，1000cu IL-2 MLV；i.m. 0.8  0.5  0.5  0.3  0.5  0.0
 8.3mg GnRHDT，10,000cu IL-2 MLV；i.m. 0.0  0.3  0.5  0.0  0.5  0.0
 9.3mg GnRHDT，100,000cu IL-2 MLV；i.m. 0.5  1.3  1.0  0.3  1.0  0.0
 10.1.5mg GnRHDT，PBS溶液，i.m. 0.0  N/A  0.0  N/A  0.0  N/A
 11.3mg GnRHDT，PBS溶液，i.m. 0.0  N/A  0.0  N/A  0.3  N/A
 12.3mg GnRHDT，100,000cu IL-2 s.c.. 1.0  1.0  1.3  1.3  2.0  0.5
 13.100μg GnRHDT，ISA 703乳剂，i.m. 0.8  N/A  1.0  N/A  2.8  N/A
**有中等至显著的钙化
组织病理学评分
0-0.5：无炎症或其它组织病理学异常
1.0-1.5：轻度急性或局部慢性炎症
2.0-2.5：中等急性或慢性炎症
3.0：严重的急慢性炎症
实施例6：G17DT-脂质体的最优脂质∶蛋白质比例和水合溶液
如以上实施例3所示，高访日剂量缀合物当包裹在脂质体中有效。为进一步优化G17DT脂质体的免疫原性，我们进行了此实施例中所述的实验，其中以不同的脂质∶蛋白质比例配制G17DT脂质体以确定最佳脂质∶蛋白质比例。另外，我们测试了二种水合液，包括水和含5％乙醇的水，以测定它们对免疫原性和和注射部位反应原性的影响。
因此，本实施例评价了如上述DMPC脂质体那样配制的但脂质∶蛋白质比例为50∶1、100∶1、150∶1和300∶1的含高剂量hG17DT(1.5、3.0或4.5mg)脂质体疫苗的免疫原性和局部耐受性。将该制剂的效果与作为对照的含G17DT缀合物(100μg/0.2ml)MontanideISA 703乳剂作比较。
脂质体水合是制备可可注射制剂的最后一步。通常将水合液以一系列等份加到冻干脂质中(蛋白质可与脂质一起或以水溶液冻干)，每次加入水合液后旋涡振荡混合。通常采用注射用水(WFI)。我们也尝试了加有5％乙醇的WFI(EtOH)，它有提高脂质体水合的优点。
具体说，用包裹在脂质体中的G17DT免疫原免疫8组家兔(每组n＝6)。肌肉内i.m.注射1.0ml体积的脂质体，每个注射日注射0.5ml二处(组1-7)。组8动物肌内注射100μg G17DT/0.2mlMontanideISA 703。于0、28和56天给予一系列3次注射。84天治疗期间每隔14天麻醉所有家兔收集血清样品并给注射部位的反应打分。显微镜检查每组2动物的活检组织样品。
用ELISA直接结合试验方法测定抗G17抗体应答反应。用抗-抗体酶标复合物和酶底物间接法检测与包被的胃泌素靶抗原结合的抗体。
实验程序
G17DT免疫原制剂
从以下组分制备由G17DT免疫原的不同配方组成的测试物质：
1.hG17DT：hG17(1-9)pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys缀合于免疫原性载体(序列表中的SEQ ID NO：18)；
2.磷酸缓冲盐水(PBS)：[0.017M Na2HPO4+0.001M KH2PO4+0.14M NaCI，pH7.2]；
3.MontanideISA 703：(Seppic；Paris，France)；
4.DMPC：hG17DT脂质体；
7.注射用水(WFI)；
8.含体积5％乙醇的WFI(WFI/5％EtOH)
按美国专利5,468,494中所述方法制备hG17DT免疫原，该方法纳入本文作参考。
测试制剂
无菌配制组合的G17DT免疫原见表I。对于所有脂质体制剂，将适当体积的灭菌WFI或WFI/5％EtOH以100微升递增量加入到各小瓶中，加入之间强烈震荡。以70∶30(油∶水相，wt∶wt)比率用标准的手工混合方法制备ISA 703乳剂。用PBS作为稀释液制备水相。将测试物质分装在针筒内冰箱(2-8℃)保存。
体外方法
该研究中采用成年无特定病原体未交配过的雌性新西兰白兔。给家兔分组(n＝6)并如表I所示用G17DT免疫原接种。3个注射日每次注射，将总剂量1.0ml分成2个0.5ml注射。于0、28和56天给家兔注射3次。按标准方案在后肢(每只后肢0.5ml)作肌肉内(i.m)注射。对照家兔用Montanide ISA 703 G17DT乳化免疫原免疫，在0-28-56天，于后腿，右-左-右交替每次注射免疫原0.2ml。
为了评估免疫原性，从每隔14天直到84麻醉后获得各只家兔的血样品，制取血清。用18号针头从耳边缘静脉收集血液(每次15ml)，存放在2-8℃过夜使凝块收缩。然后离心(400g)样品用移液器取出血清，分成单个样品冻存在-10℃直到试验。
抗体试验
用ELISA测定血清中的抗胃泌素抗体滴度，数据见表II。测定测试日0、14、28、42、56、70和84天收集血清中的抗体。
粗略病理学检查
所有试验动物于第84天作注射部位的粗略病理学检查。注射部位位于剌花纹处，翻转皮肤完全暴露肌肉，通过各注射部位的肌肉作完全的横切口。肉眼评价组织的粗略病理学变化，评分0-3分，0分表明组织看来正常，3分表明整个组织注射部位存在广泛的炎症反应。1分和2分代表局部反应为水平中等。图6和表II给出了各粗略病理学检查的评分。
显微镜病理学观察
粗略病理学检查评分后，随机选择每个治疗组二只家兔作显微镜病理学观察。用手术刀切取i.m.注射部位2-2.5cm长度的股四头肌并立即将组织标本浸在最小体积25ml的福尔马林缓冲液中。将各样品分置小瓶中用福尔马林固定最少24小时。石蜡包埋后，切成5微米厚切片，固定，苏木精伊红染色，对各小瓶样品作显微镜检查进行活检组织区域的组织病理学评价。表IV给出了实施例6的各组织学评分和评分系统。
统计学分析
计算了各抗体滴度和对分组反应的抗胃泌素抗体滴度的平均值和中位数值(表II)，用Student T检验比较各组之间抗体滴度的峰平均值(P＜0.05)。
计算出粗略病理学观察的注射部位反应R平均评分。计算的平均组织学评分别见表、III和IV。
免疫学结果
用ELISA测定了84天体内免疫原性试验过程中每组家兔产生的抗hG17抗体应答反应。单个、平均和中位数抗体滴度见表B。图0是该平均滴度的图，图10是滴度中位数的图。
如图9和图10所示，用MontanideISA 703配制的输送100μg G17DT/每剂的对照G17DT免疫原性乳剂，诱导的应答反应类似于脂质体制剂所诱导的，直到第84天ISA 703的反应升高到脂质体反应的二倍。与之相比较，i.m.注射脂质体制剂的家兔反应滴度较低，倾向于时间更短，第2次和第3次注射后有较高的增强反应。然而所有的脂质体制剂诱导了超过10,000的持久性滴度。组191.5mg G17DT，450mgDMPC，用WFI/5％EtOH水合)的反应特别稳定，从本研究过程中的42天到84天有持久的抗体产生。此制剂是脂质∶蛋白质＝1∶300比例(wt∶wt)，用WFI/5％EtOH水合特别有效。
组8和脂质体各组反应的平均峰值之间无显著差异，但组4例外(p＝0.096)，表明脂质体免疫原有效。用WFIT WFI/5％EtOH水合制备的脂质体特别有效。但注意到用WFI/5％EtOH水合的脂质体粘度升高，这可提高其长效免疫的效果达到所需的抗体产生稳定水平。组1的抗体应答反应提供了这种例子。
第84天肉眼观察所有家兔评估注射部位的反应等级。如数据所示，除组8(标准乳液制剂)外所有组注射部位反应很小。组8的6只动物中有2只第3次免疫原注射部位评分＞1。组1-7在观察的252处部位反应评分无一超过0.5分。因此观察评估表明，当i.m给予时脂质体制剂能被很好耐受。
显微镜病理学观察
表IV显示第84天时的组织病理学评估平均结果。注射部位活检样品的显微镜病理学观察一般按照粗略肉眼观察评价结果而定，最高分是第3次注射ISA 703配制的免疫原部位。几乎所有i.m.注射脂质体部位的炎症反应都最少。组8中所见的肌肉肉反应评分是油包水乳剂的典型评分。应注意肉眼和组织学反应评分系统相互是独立和不相关的。通常组织学反应评分高于肉眼评分。认为评分0.5或不到的部位无病理学变化。因此脂质体引起的肌肉炎症显著少于油包水乳剂。
结论：
实施例6的实验结果表明，以脂质/蛋白质高比率300∶1配制的、以5％EtOH-WFI溶液水合的含1.5 G17DT的脂质体，诱导了可接受滴度的持久抗hG17抗体水平。类似地，其它测试的脂质体制剂也诱导了相当水平的抗-G17抗体，虽然应答水平不太高(无统计学意义)，或不如上述组那样稳定。然而，与Montanide ISA 703乳剂对照相比较，所有的脂质体制剂都观察到极低的组织反应原性。注射部位反应水平低表明增加注射次数有可能被接受，成为提高应答水平同时保持注射部位反应最少的一种方法。这些结果表明，G17DT的高蛋白质脂质体制剂可通过选择有效的脂质∶蛋白质比例以及在脂质体水合液中加入5％乙醇而最优化。
表I(实施例6)免疫原制剂
    免疫原编号     载体   DMPC   G17DT缀合物   蛋白/脂质比(w/w)   水合溶液     家兔分组
    2A   脂质体   450mg   1.5mg   1∶300   5％EtOH     1
    2B   脂质体   225mg   1.5mg   1∶150   5％EtOH     2
    2C   脂质体   150mg   1.5g   1∶100   5％EtOH     3
    2D   脂质体   75mg   1.5mg   1∶50   WFI     4
    2E   脂质体   450mg   3.0mg   1∶150   WFI     5
    2F   脂质体   150mg   3.0mg   1∶50   WFI     6
    2G   脂质体   225mg   4.5mg   1∶50   5％EtOH     7
    2H   MontanideISA 703   --   100μg   --   --     8
表II(实施例6)家兔抗-G17抗体应答应答反应
 组别# 0天  14天  28天  42天  56天  70天  84天
 组1100μg G17DT，450mgDMPC(5％EtOH) 平均值 0  2,751  3,703  40,033  29,333  40,183  35,567
中位数 0  2,497  2,132  35,200  27,500  32,800  33,900
S.D. 合并  1,887  4,195  19,895  11,904  15,547  12,645
 组21.5mg G17DT，225mgDMPC(5％EtOH) 平均值 0  1,421  1,311  17,900  13,097  32,550  18,065
中位数 0  1,123  1,172  19,450  11,892  34,350  18,950
S.D. 合并  1,028  876  5,723  6,307  14,008  7,781
 组31.5mg G17DT，150mgDMPC(5％EtOH) 平均值 0  1,276  764  18,717  13,042  29,000  13,925
中位数 0  1, 228  773  16,350  12,800  28,100  13,600
S.D. 合并  693  240  6,812  4,403  14,221  4,140
 组41.5mg G17DT，75mgDMPC(WFI) 平均值 0  1,933  1,564  24,800  15,222  32,883  16,268
中位数 0  1,168  828  20,900  13,800  36,650  17,500
S.D. 合并  1,655  1,365  12,522  6,826  13,489  7,332
 组51.5mg G17DT 450mg，DMPC(WFI) 平均值 0  5,350  4,943  38,850  27,100  50,183  22,826
中位数 0  5,059  4,162  40,500  28,850  46,050  21,850
S.D. 合并  2,437  2,920  13,942  5,881  26,085  10,494
 组61.5mg G17DT，150mgDMPC(WFI) 平均值 0  1,753  985  26,517  18,457  51,150  14,116
中位数 0  1,694  911  24,450  19,600  40,300  14,150
S.D. 合并  135  338  8,935  7,062  40,314  5,464
 组71.5mg G17DT，225mgDMPC(5％EtOH) 平均值 0  1,514  987  29,867  18,017  37,600  15,344
中位数 0  1,525  729  24,400  15,150  35,250  13,900
S.D. 合并  514  586  15,115  10,057  17,738  6,708
 组81.5mg G17DT，ISA 703 平均值 0  3,205  6,301  20,346  46,267  31,400  81,433
中位数 0  2,813  6,356  21,950  45,350  26,800  73,850
S.D. 合并  2,000  3,550  7,939  23,697  15,253  63,302
表III(实施例6)第84天注射部位的反应
组别#  部位1A  部位1B  部位2A  部位2B  部位3A  部位3B
组1.1.5mgG17DT：450mg DMPC(5％EtOH) 平均值  0.1  0.1  0.3  0.3  0.3  0.3
No.＞1  0  0  0  0  0  0
组2.1.5mg G17DT，225mg DMPC(5％EtOH) 平均值  0.2  0.2  0.3  0.1  0.3  0.3
No.＞1  0.0  0.0  0.0  0.0  0.0  0.0
组3.1.5mg G17DT，150mg DMPC(5％EtOH) 平均值  0.3  0.1  0.1  0.1  0.3  0.4
No.＞1  0.0  0.0  0.0  0.0  0.0  0.0
组4.1.5mg G17DT，75mg DMPC(WFI) 平均值  0.0  0.0  0.0  0.0  0.0  0.0
No.＞1  0.0  0.0  0.0  0.0  0.0  0.0
组5.1.5mg G17DT，450mg DMPC(WFI) 平均值  0.0  0.1  0.4  0.3  0.3  0.3
No.＞1  0.0  0.0  0.0  0.0  0.0  0.0
组6.1.5mg G17DT，150mg DMPC(WFI) 平均值  0.3  0.2  0.1  0.1  0.1  0.2
No.＞1  0.0  0.0  0.0  0.0  0.0  0.0
组7.1.5mg G17DT225mg DMPC(5％EtOH) 平均值  0.0  0.0  0.1  0.1  0.2  0.2
No.＞1  0.0  0.0  0.0  0.0  0.0  0.0
组8.1.5mg G17DT，ISA 703 平均值  0.3  Na  0.7  Na  1.3  Na
No.＞1  0.0  Na  0.0  Na  2.0  Na
表IV(实施例6)第84天天注射部位组织学单个和平均评分
组别# 家兔#     部位1A     部位1B     部位2A     部位2B     部位3A     部位3B
组1.1.5mg G17DT：450mg DMPC(5％EtOH) 平均     0.0     0.3     1.3     0.5     1.0     0.5
组2.1.5mg G17DT：450mg DMPC(5％EtOH) 平均     0.3     0.5     0.8     0.5     0.8     0.5
组3.1.5mg G17DT：450mg DMPC(5％EtOH) 平均     0.5     0.5     0.5     0.5     0.5     0.5
组4.1.5mg G17DT：450mg DMPC(5％EtOH) 平均     0.5     0.5     0.5     0.5     0.5     0.3
组5.1.5mg G17DI：450mg DMPC(5％EtOH) 平均     0.3     0.3     0.5     0.5     0.5     0.5
组6.1.5mg G17DT：450mg DMPC(5％EtOH) 平均     0.3     0.5     0.3     0.5     1.0     1.0
组7.1.5mg G17DT：450mg DMPC(5％EtOH) 平均     0.3     0.5     0.5     0.3     0.5     0.5
组8.1.5mg G17DT：450mg DMPC(5％EtOH) 平均     0.8     Na     1.3     Na     2.5     na
组织病理学评分
0-0.5：无炎症或其它组织病理学异常
1.0-1.5：轻度急性或局部慢性炎症
2.0-2.5：中等急性或慢性炎症
3.0：严重的急慢性炎症
结尾
上述实施例说明了，但不意味限制，本发明具有高脂比例包裹水溶性物质的脂质体输送系统的优点方面。本发明的有经验实施者知道，可将此系统应用于其它有用的物质，如输送水溶性细胞因子、辅因子、激素、其同类物或修饰物，来治疗人类疾病或疾患难。
                       序列表
<110>埃弗顿有限公司(Aphton Corporation)
<120>脂质体疫苗
<130>1102865-0059
<160>14
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>焦谷氨酸或5’-羟脯氨酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(17)..(17)
<223>酰胺化的苯丙氨酸
<400>1
Xaa Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp Xaa
1               5                   10                  15
<210>2
<211>18
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>焦谷氨酸或5’-羟脯氨酸
<400>2
Xaa Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe Gly
1               5                   10                  15
<210>3
<211>5
<212>PRT
<213>人造的
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>焦谷氨酸或5’-羟脯氨酸
<400>3
Xaa Gly Pro Trp Leu
1               5
<210>4
<211>6
<212>PRT
<213>人造的
<400>4
Xaa Gly Pro Trp Leu Glu
1               5
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>人造的
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>焦谷氨酸或5’-羟脯氨酸
<400>5
Xaa Gly Pro Trp Leu Glu Glu
1               5
<210>6
<211>8
<212>PRT
<213>人造的
<220>
<223>人胃泌素17的氨基酸序列1-8的合成肽，连接有一间隔肽并缀合于白喉类毒素
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>焦谷氨酸或5’-羟脯氨酸
<400>6
Xaa Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu
1               5
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>人造的
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>焦谷氨酸或5’-羟脯氨酸
<400>7
Xaa Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu
1               5
<210>8
<211>10
<212>PRT
<213>人造的
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>焦谷氨酸或5’-羟脯氨酸
<400>8
Xaa Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu
1               5                   10
<210>9
<211>6
<212>PRT
<213>人造的，假设的
<220>
<223>合成肽间隔区
<400>9
Arg Pro Pro Pro Pro Cys
1               5
<210>10
<211>7
<212>PRT
<213>人造的，假设的
<220>
<223>合成肽间隔区
<400>10
Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys
1               5
<210>11
<211>8
<212>PRT
<213>人造的，假设的
<220>
<223>合成肽间隔区
<400>11
Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Cys
1               5
<210>12
<211>22
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>焦谷氨酸或5’-羟脯氨酸
<400>12
Xaa Leu Gly Pro Glu Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys Lys Glu
1               5                   10                  15
Gly Pro Trp Leu
    20
<210>13
<211>13
<212>PRT
<213>人造的
<220>
<223>人胃泌素34的氨基酸序列1-6的合成肽，连接有一间隔肽并缀合于白喉类毒素
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>焦谷氨酸或5’-羟脯氨酸
<220>MOD_RES
<221>
<222>(13)..(13)
<223>缀合于白喉类毒素的半胱氨酸
<400>13
Xaa Leu Gly Pro Glu Gly Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys
1               5                   10
<210>14
<211>13
<212>PRT
<213>人造的
<220>
<223>人胃泌素34的氨基酸序列1-6的合成肽，连接有一间隔肽并缀合于白喉类毒素
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>缀合于白喉类毒素的半胱氨酸
<400>14
Cys Pro Pro Pro Pro Ser Ser Glu Leu Gly Pro Glu Gly
1               5                   10
<210>15
<211>10
<212>PRT
<213>人造的
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>焦谷氨酸或5’-羟脯氨酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(10)..(10)
<223>酰胺化的甘氨酸或甘氨酰胺
<400>15
Xaa His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Xaa
1               5                   10
<210>16
<211>35
<212>PRT
<213>人造的
<300>
<301>美国专利4,767,842
<302>对相应于β亚基111-145序列的人绒毛膜促性腺激素C末端片段(结构II)特异的抗-肽抗体
<400>16
Asp Asp Pro Arg Thr Glu Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro
1               5                   10                  15
Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
            20                  25                  30                  35
<210>17
<211>16
<212>PRT
<213>人造的
<220>
<223>人绒毛膜促性腺激素的氨基酸序列138-145的合成肽，连接到一间隔肽并缀合于白喉类毒素
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>5’-羟脯氨酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(16)..(16)
<223>半胱氨酸缀合于白喉类毒素
<400>17
Xaa Ser Asp Thr Pro Ile Pro Gln Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Cys
1               5                   10                  15
<210>18
<211>17
<212>PRT
<213>人造的
<220>
<223>胃泌素17的氨基酸序列的合成肽，连接到一间隔肽并缀合于白喉类毒素
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>焦谷氨酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(17)..(17)
<223>半胱氨酸缀合于白喉类毒素
<400>18
Xaa Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys
1               5                   10                  15
<210>19
<211>17
<212>PRT
<213>人造的
<220>
<223>GnRH氨基酸序列的合成肽，连接到一间隔肽并缀合于白喉类毒素
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>半胱氨酸缀合于白喉类毒素
<400>19
Cys Pro Pro Pro Pro Ser Ser Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Xaa
1               5                   10                  15
<210>20
<211>15
<212>PRT
<213>人造的
<220>
<223>人绒毛膜促性腺激素的氨基酸序列138-145的合成肽，连接到一间隔肽并缀合于白喉类毒素
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>半胱氨酸缀合于白喉类毒素
<400>20
Cys Pro Pro Pro Pro Ser Ser Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
1               5                   10                  15

Claims (40)

1.一种输送水溶性物质的可注射的脂质体组合物，其特征在于，该组合物包含：
众多脂质与所包裹的水溶性物质呈高重量比例的脂质体小泡，从而实现高效包裹。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述包裹效率为50％以上。
3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述包裹效率为80％以上。
4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述包裹的物质分布在众多脂质体小泡中。
5.如权利要求1或4所述的组合物，其中，所述脂质体小泡是多室性小泡(MLV)。
6.如权利要求1所述的组合物，其中，所述水溶性物质包括一种以上的化合物。
7.如权利要求1所述的组合物，其中，所述水溶性物质选自蛋白质、蛋白聚糖和碳水化合物。
8.如权利要求1所述的组合物，其中，所述水溶性物质包括疫苗。
9.如权利要求8所述的组合物，其中，所述疫苗是针对激素或激素相关受体的疫苗。
10.如权利要求8所述的组合物，其中，所述疫苗包含至少一种与免疫原性亲水载体蛋白缀合的激素-免疫模拟肽或激素受体-免疫模拟肽。
11.如权利要求1所述的组合物，其中，所述脂质与包裹物质的比例为约500-1000。
12.如权利要求1所述的组合物，其中，所述脂质与包裹物质的比例为约300。
13.如权利要求10所述的组合物，其中，所述免疫模拟肽选自胃泌素G-17、胃泌素G-34、GnRH和hCG的合成序列。
14.如权利要求13所述的组合物，其中，所述合成的胃泌素G-17肽序列是SEQ IDNO：1或其片段(SEQ ID NO：3-8)。
15.如权利要求13所述的组合物，其中，所述合成的G-34肽序列是SEQ ID NO：12。
16.如权利要求13所述的组合物，其中，所述合成的GnRH免疫模拟肽序列是SEQID NO：15。
17.如权利要求13所述的组合物，其中，所述合成的hCG免疫模拟肽序列是SEQID NO：16。
18.如权利要求1所述的组合物，其中，所述脂质体含有能形成脂质体的脂质。
19.如权利要求18所述的组合物，其中，所述能形成脂质体的脂质含有一疏水性尾部分和一极性或化学活性部分。
20.如权利要求18所述的组合物，其中，所述能形成脂质体的脂质含有烃链或类固醇尾基团和一极性头部基团。
21.如权利要求19所述的组合物，其中，所述极性头部基团或化学活性部分包括酸、醇、醛、胺或酯。
22.如权利要求18所述的组合物，其中，所述能形成脂质体的脂质包括磷脂。
23.如权利要求22所述的组合物，其中，所述磷脂选自磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和鞘磷脂。
24.如权利要求1所述的组合物，其中，所述脂质体含有至少70％摩尔百分比的双十四烷酰磷脂酰胆碱(DMPC)。
25.如权利要求8所述的组合物，其中，所述包裹的疫苗的剂量至少约为50微克。
26.如权利要求9所述的组合物，其中，所述包裹的抗激素疫苗或抗激素受体疫苗的剂量范围大约为0.3-5毫克。
27.如权利要求10所述的组合物，其中，所述免疫模拟肽通过一间隔肽缀合于免疫原性载体。
28.如权利要求27所述的组合物，其中，所述间隔肽选自SEQ ID NO：9、10和11。
29.如权利要求1所述的组合物，其中，所述脂质体分开包裹或一起包裹一水溶性免疫原和水溶性高分子量免疫调节物质。
30.如权利要求1所述的组合物，其中，所述脂质体分开包裹或一起包裹一水溶性免疫原和水溶性低分子量免疫调节物质。
31.如权利要求29所述的组合物，其中，所述高分子量免疫调节物质包括细胞因子。
32.如权利要求31所述的组合物，其中，所述低分子量物质选自去甲MDP、苏氨酰MDP、莫拉丁酯、N-乙酰葡糖胺-MDP和murametide。
33.一种无菌组合物，其含有如权利要求8-17中任何一项所述组合物的可注射的含水悬液。
34.一种药物制剂，其含有治疗有效量的如权利要求8-17中任何一项所述的组合物和药学上可接受的载体。
35.一种治疗疾病或疾患的方法，其特征在于，所述方法包括给予需要治疗的患者治疗有效量的如权利要求33或34所述的药物制剂。
36.一种生产脂质体疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：制备磷脂多室性小泡并包裹水溶性免疫原和/或免疫调节物质，其中所述脂质体具有高脂质-蛋白质比例。
37.如权利要求35所述的方法，其中，所述比例约为50-1000。
38.如权利要求36所述的方法，其中，所述比例约为300。
39.一种高脂质-蛋白质重量比的脂质体组合物，其特征在于，所述组合物含有与选自SEQ ID NO：17、18、19和20的肽相缀合的免疫原性载体的免疫原性构建物。
40.一种制备含有高剂量免疫原的脂质体疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括用水或乙醇水溶液复水冻干的脂质组合物，在此复水步骤中将免疫原包含在脂质组合物中或乙醇水溶液中。
CN038159171A 2002-07-03 2003-07-03 脂质体疫苗 Pending CN1665487A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39417902P 2002-07-03 2002-07-03
US60/394,179 2002-07-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1665487A true CN1665487A (zh) 2005-09-07

Family

ID=30115686

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN038159171A Pending CN1665487A (zh) 2002-07-03 2003-07-03 脂质体疫苗

Country Status (9)

Country Link
US (2) US20040208920A1 (zh)
EP (1) EP1528915A2 (zh)
JP (1) JP2005535663A (zh)
KR (1) KR20050025306A (zh)
CN (1) CN1665487A (zh)
AU (1) AU2003267984A1 (zh)
CA (1) CA2489919A1 (zh)
IL (1) IL165661A0 (zh)
WO (1) WO2004004687A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101314619B (zh) * 2007-06-01 2010-12-22 齐鲁制药有限公司 肿瘤治疗性疫苗ctp37crm197免疫原及其制备方法与应用
CN108324581A (zh) * 2017-01-17 2018-07-27 株式会社毕加索美化学研究所 脂质体、脂质体液和化妆品、以及制造上述脂质体的方法
CN112641936A (zh) * 2021-01-05 2021-04-13 安徽农业大学 一种鹅星状病毒纤突蛋白脂质体疫苗及其制备方法和应用

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040001842A1 (en) * 1997-05-12 2004-01-01 Dov Michaeli Immunogenic compositions to the CCK-B/gastrin receptor and methods for the treatment of tumors
ES2286883T3 (es) * 1998-05-15 2007-12-01 Receptor Biologix, Inc. Prevencion y tratamiento de la hipergastrinemia.
AU2002252456A1 (en) * 2001-03-23 2002-10-08 Aphton Corporation Combination treatment of pancreatic cancer
US20090191232A1 (en) * 2001-05-04 2009-07-30 Gevas Philip C Combination therapy for the treatment of tumors
US20060029655A1 (en) * 2001-06-25 2006-02-09 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Method for preparation of vesicles loaded with biological material and different uses thereof
WO2003005955A2 (en) * 2001-07-09 2003-01-23 Aphton Corporation Treatment and prevention of cancerous and pre-cancerous conditions of the liver, lung and esophagus
US6810583B2 (en) * 2001-08-07 2004-11-02 International Business Machines Corporation Coupling of conductive vias to complex power-signal substructures
CA2520010C (en) * 2003-03-28 2012-07-10 Aphton Corporation Gastrin hormone immunoassays
US20060020119A1 (en) * 2004-03-29 2006-01-26 Stephen Grimes Monoclonal antibodies to gastrin hormone
ES2400058T3 (es) 2004-09-22 2013-04-05 Cancer Advances, Inc. Anticuerpos monoclonales para progastrina
KR100831627B1 (ko) * 2006-05-11 2008-05-22 (주)아모레퍼시픽 수용성 생리활성 성분을 포집한 역상 다중층 베시클
CN101675994B (zh) * 2008-09-19 2012-07-25 齐鲁制药有限公司 治疗性疫苗制剂
EP3052121B1 (en) 2013-10-02 2023-02-22 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Wnt compositions and methods for purification
KR102069670B1 (ko) * 2017-03-02 2020-01-23 단디바이오사이언스 주식회사 면역활성물질을 포함하는 다중도메인캡슐, 이의 제조방법, 및 이를 포함하는 면역조절 조성물
KR101927949B1 (ko) * 2017-03-03 2019-02-26 연세대학교 산학협력단 다중성분 기반의 다중 베시클, 이의 용도 및 이를 제조하는 방법
EP3624841A4 (en) 2017-06-15 2021-01-27 Cancer Advances, Inc., COMPOSITIONS AND METHODS OF INDUCING HUMORAL AND CELLULAR IMMUNITIES AGAINST TUMORS AND CANCER

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5698201A (en) * 1973-05-07 1997-12-16 The Ohio State University Method for treatment of antigenically modified polypeptides
US4767842A (en) * 1973-05-07 1988-08-30 The Ohio State University Antigenic modification of polypeptides
US4235871A (en) * 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US5916588A (en) * 1984-04-12 1999-06-29 The Liposome Company, Inc. Peptide-containing liposomes, immunogenic liposomes and methods of preparation and use
US6090406A (en) * 1984-04-12 2000-07-18 The Liposome Company, Inc. Potentiation of immune responses with liposomal adjuvants
US5376369A (en) * 1987-11-03 1994-12-27 Syntex (U.S.A.) Inc. Vaccine adjuvant
EP0324455A3 (en) * 1988-01-15 1991-03-27 Hans O. Ribi Novel polymeric immunological adjuvants
US5807572A (en) * 1988-02-18 1998-09-15 Depotech Corporation Multivesicular liposomes having a biologically active substance encapsulated therein in the presence of a hydrochloride
US5023077A (en) * 1989-01-24 1991-06-11 Aphton Corporation Immunogenic compositions and methods for the treatment and prevention of gastric and duodenal ulcer disease
US5100662A (en) * 1989-08-23 1992-03-31 The Liposome Company, Inc. Steroidal liposomes exhibiting enhanced stability
US5225212A (en) * 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5013556A (en) * 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
CA2054228A1 (en) * 1990-10-30 1992-05-01 Masaharu Oki Muramyldipeptide derivatives and influenza vaccine comprising the derivatives
ATE161172T1 (de) * 1990-11-06 1998-01-15 Inst Nacional De Engenharia E Liposomale mittel sowie verfahren zu deren herstellung
US5292524A (en) * 1991-09-06 1994-03-08 California Institute Of Technology Blood platelet loaded with diagnostic or therapeutic-containing liposome or reconstituted Sendai virus
GB9207731D0 (en) * 1992-04-07 1992-05-27 Proteus Molecular Design Improvements in or relating to vaccines
EP0815852A1 (en) * 1993-08-06 1998-01-07 Opperbas Holding B.V. A method for high loading of vesicles with biopolymeric substances
US5468494A (en) * 1993-11-12 1995-11-21 Aphton Corp. Immunogenic compositions against human gastrin 17
RU2160093C2 (ru) * 1993-11-16 2000-12-10 Скайефарма Инк. Везикулы с регулируемым высвобождением активных ингредиентов
US5688506A (en) * 1994-01-27 1997-11-18 Aphton Corp. Immunogens against gonadotropin releasing hormone
US6359114B1 (en) * 1995-06-07 2002-03-19 Aphton Corp. System for method for the modification and purification of proteins
US5919480A (en) * 1996-06-24 1999-07-06 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Liposomal influenza vaccine composition and method
US5891467A (en) * 1997-01-31 1999-04-06 Depotech Corporation Method for utilizing neutral lipids to modify in vivo release from multivesicular liposomes
DK1076561T3 (da) * 1998-05-15 2005-06-06 Aphton Corp Kombinationsterapi til behandlingen af tumorer
AU1478201A (en) * 1999-11-08 2001-06-06 Aphton Corporation Improved method of immunization
AU2002252456A1 (en) * 2001-03-23 2002-10-08 Aphton Corporation Combination treatment of pancreatic cancer

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101314619B (zh) * 2007-06-01 2010-12-22 齐鲁制药有限公司 肿瘤治疗性疫苗ctp37crm197免疫原及其制备方法与应用
CN108324581A (zh) * 2017-01-17 2018-07-27 株式会社毕加索美化学研究所 脂质体、脂质体液和化妆品、以及制造上述脂质体的方法
CN108324581B (zh) * 2017-01-17 2023-09-22 株式会社毕加索美化学研究所 脂质体、脂质体液和化妆品、以及制造上述脂质体的方法
CN112641936A (zh) * 2021-01-05 2021-04-13 安徽农业大学 一种鹅星状病毒纤突蛋白脂质体疫苗及其制备方法和应用
CN112641936B (zh) * 2021-01-05 2022-03-25 安徽农业大学 一种鹅星状病毒纤突蛋白脂质体疫苗及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004004687A2 (en) 2004-01-15
CA2489919A1 (en) 2004-01-15
KR20050025306A (ko) 2005-03-14
US20040208920A1 (en) 2004-10-21
JP2005535663A (ja) 2005-11-24
AU2003267984A1 (en) 2004-01-23
EP1528915A2 (en) 2005-05-11
IL165661A0 (en) 2006-01-15
US20070065454A1 (en) 2007-03-22
WO2004004687A3 (en) 2004-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1665487A (zh) 脂质体疫苗
JP6904959B2 (ja) 結合エピトープを含有する融合タンパク質を封入する粒子
Zeng et al. Highly immunogenic and totally synthetic lipopeptides as self-adjuvanting immunocontraceptive vaccines
AU758133B2 (en) Improved saponin adjuvant composition and methods relating thereto
CN1248736C (zh) 疫苗组合物
US20080152615A1 (en) Composition for Adjuvant Containing Poly-Gamma-Glutamic Acid
CN1233288A (zh) GnRH－白细胞毒素嵌合体
CN1549726A (zh) 先天性免疫系统指导的疫苗
CN86103835A (zh) 口服疫苗
CN1066183A (zh) 可转化的微粒乳化液组合物
CN101052411A (zh) Vlp－抗原偶联物及其作为疫苗的用途
CN1368877A (zh) 含有可水解的亲脂成分的两亲药物－低聚物结合物及其制备和使用方法
CN1543476A (zh) 用于将蛋白定向到胞外体的方法和化合物
CN1572797A (zh) 化学上定义的非聚合价平台分子和其偶联物
CN1541111A (zh) 作为佐剂的霍乱全毒素的突变形式
US10463747B2 (en) Method of developing a vaccine using peptide-poly IC complexes
CN1723041A (zh) 包含抗原性杂络物的稳定的免疫原性产物
CN1723035A (zh) 格瑞林在治疗胃切除个体营养不良中的用途
TW201345928A (zh) 組成物
Beekman et al. Highly immunogenic and fully synthetic peptide-carrier constructs targetting GnRH
CN1264307A (zh) 改善上胃肠道功能的方法
CN1768079A (zh) 多肽
CN1190437A (zh) 骨刺激因子
US11400151B2 (en) Methods for improving immunological response in vaccinated animals
US20140086949A1 (en) Ghrelin Mimetic Polypeptide Hapten Immunoconjugates Having Improved Solubility and Immunogenicity and Methods of Use Thereof

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication