ES2351756B1 - Nanopartículas lipídicas para terapia génica. - Google Patents
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Abstract
Nanopartículas lipídicas para terapia
génica.
La presente invención se relaciona con un
sistema de nanopartículas lipídicas que comprenden un componente
lipídico, un tensioactivo catiónico, un tensioactivo no iónico, un
polisacárido y, opcionalmente, un péptido de carga positiva, útil
para la liberación de moléculas farmacológicamente activas, y
especialmente para transfectar material genético en células y/o
tejidos. Asimismo, se dirige a procedimientos para la obtención de
nanopartículas, a composiciones farmacéuticas que lo comprenden, así
como a su uso en terapia génica.
Description
Nanopartículas lipídicas para terapia
génica.
La presente invención se refiere a un sistema de
nanopartículas lipídicas útil para la liberación de moléculas
farmacológicamente activas, y especialmente para transfectar
material genético en células y/o tejidos, así como a procedimientos
para su obtención y composiciones farmacéuticas que lo
comprenden.
En las últimas décadas se han desarrollado una
gran variedad de reactivos y técnicas para transferir material
genético al interior de las células con el objeto de modular la
expresión génica tanto in vitro como in vivo. Los
mayores esfuerzos en este campo están enfocados en la búsqueda de
sistemas con mayor eficiencia y en nuevas aplicaciones. Estos
esfuerzos están permitiendo obtener sofisticados reactivos y
tecnologías útiles para la producción de proteínas con aplicaciones
clínicas y de investigación, para la adición de marcadores genéticos
a una línea celular y para la modificación de la expresión de
proteínas de una célula para evaluar el efecto de un gen
(sobreexpresión o disminución de la expresión).
La terapia génica constituye una herramienta
terapéutica muy prometedora para el tratamiento de una gran variedad
de enfermedades hereditarias o adquiridas. Los recientes avances en
biología molecular y el conocimiento del genoma humano han permitido
disponer de una valiosa información sobre los procesos celulares y
la patogenia de muchas enfermedades. En los últimos años se han
identificado numerosos genes implicados en procesos patológicos;
además, se está investigando mucho con sistemas de expresión de esos
genes para ser utilizados con fines terapéuticos. Sin embargo, el
desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas usando este material
biológico depende de la capacidad de manipular la expresión de estos
genes en las células adecuadas.
El número de enfermedades que pueden ser
potencialmente tratadas mediante terapia génica es muy amplio, y se
incluyen, entre otras, enfermedades autosómicas recesivas debidas al
defecto de un único gen (fibrosis quística, hemofilia, enfermedad de
Fabry, etc.), enfermedades autosómicas dominantes, algunos cánceres,
VIH y otras enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias,
etc.
La terapia génica consiste en la introducción de
material genético (ADN, ARN o secuencias antisentido) en células
diana con el fin de modular la expresión de determinadas proteínas
que se encuentran alteradas, revirtiendo así el trastorno biológico
que provoca la alteración de las mismas. Se pueden administrar genes
desnudos de forma local en determinados órganos como el músculo o el
hígado mediante medios físicos, como la electroporación o la
inyección hidrodinámica. Sin embargo, estos métodos no son útiles
para la administración sistémica o son inviables desde el punto de
vista de su comercialización como medicamentos. Para desarrollar un
producto para terapia génica hay que tener en cuenta, no sólo la
enfermedad que se quiere tratar y el gen terapéutico a administrar,
si no que es muy importante el sistema de administración de ese gen.
Es necesario que el sistema de administración sea capaz de proteger
el material genético frente a la degradación enzimática y que
facilite la captación celular y posterior liberación en el
citoplasma celular. Además, debe permitir controlar la localización
del gen en el organismo así como la duración de la expresión génica.
Los sistemas de administración de genes pueden clasificarse en
vectores virales o no virales. Los vectores virales son los más
efectivos, pero presentan grandes problemas de inmunogenicidad y
oncogenicidad. Otro inconveniente es que sólo pueden incluir genes
de pequeño tamaño.
Debido a los inconvenientes que presentan estos
sistemas de transfección viral, existe una importante necesidad de
desarrollar sistemas de transfección no viral con una adecuada
eficacia de transfección que supongan una mejor alternativa a la
utilización de los vectores virales. Los vectores no virales son, de
hecho, mucho más seguros, su producción es más sencilla y más barata
y no presentan una limitación en cuanto al tamaño del material
genético a incluir. En este sentido, los sistemas basados en
nanopartículas han mostrado ser útiles como sistemas de
transfección. Así, la solicitud US2008/0160096 describe la obtención
de nanopartículas basadas en un policatión complejado con uno o más
ácidos nucleicos, estando dicho complejo recubierto con un
polianión. Por su parte, la solicitud WO2007/135164 hace referencia
a la preparación de nanopartículas basadas en quitosano y
hialuronano para la asociación de material genético, habiéndose
demostrado su particular utilidad para transfectar tejido
ocular.
Existen además en la literatura varios
documentos que describen la obtención y empleo de nanopartículas
lipídicas como vectores para el transporte de material genético a
las células (WO2005/120469, WO2006/087752, WO2004/096140 y
US2008/0213350). En particular, el documento de Del
Pozo-Rodríguez et al. (J. Control. Rel.,
2009, 133, 52-59) hace referencia a un sistema de
nanopartículas lipídicas que incorpora además tensioactivos iónicos,
donde dichas nanopartículas se ponen en contacto con un complejo
constituido por un plásmido y un péptido para recubrir a éstas.
Nanopartículas lipídicas en las que también se incorpora un péptido,
se encuentran descritas en WO00/06120. Por su parte, la solicitud
US2006/0189554 describe una vacuna que incorpora un sistema de
nanopartículas lipídicas sobre las que se deposita en su superficie
un adyuvante, adsorbiéndose posteriormente un plásmido de ADN. No
obstante, la mayoría de estos sistemas presentan como principal
desventaja una baja eficacia de transfección.
\newpage
A la vista de estos datos, existe, por tanto,
una necesidad de desarrollar medicamentos para terapia génica
basados en vectores no virales seguros y con una adecuada eficacia
de transfección.
Los autores de la presente invención han
encontrado que un sistema de nanopartículas lipídicas que incorpora
un polisacárido en su composición, permite conseguir un eficaz nivel
de transfección de material genético en las células, así como una
elevada viabilidad celular, como así demuestran los ejemplos
realizados in vitro en células eucariotas de mamíferos
ARPE-19.
Asimismo, estudios in vivo han demostrado
la capacidad de este sistema de nanopartículas para alcanzar las
células de bazo e hígado, permitiendo la expresión de plásmidos de
ADN como pCMS-EGPF de forma efectiva, lo que hace a
este sistema ser potencialmente útil en terapia génica.
Este sistema ha sido capaz además de proteger el
material genético de la acción de enzimas, en particular, de
nucleasas, que están presentes en los fluidos biológicos, lo que
evita su degradación o ruptura en este medio biológico, evitando así
que el material genético se libere de las nanopartículas antes de
alcanzar su objetivo final.
Así, en un primer aspecto la invención se dirige
a un sistema para la liberación de moléculas biológicamente activas,
que comprende nanopartículas con un tamaño promedio de partícula
igual o inferior a 1 micra, donde las nanopartículas comprenden:
- -
- al menos un lípido sólido a temperatura ambiente;
- -
- al menos un tensioactivo catiónico;
- -
- al menos un tensioactivo no iónico; y
- -
- al menos un polisacárido, donde dicho polisacárido comprende la unión de al menos tres monosacáridos, con la condición de que dicho polisacárido no sea un lipopolisacárido, y donde dicho polisacárido se encuentra incorporado dentro de la estructura de las nanopartículas o bien adsorbido sobre la superficie de las mismas.
Por otra parte, se ha observado que la
incorporación del polisacárido junto con un péptido de carga
positiva, permite aumentar de forma sinérgica los niveles de
transfección cuando se compara con un sistema de nanopartículas que
incluye únicamente el mencionado péptido o el polisacárido, así como
mejorar la viabilidad celular tal como se recoge en los ejemplos
aportados en esta solicitud. En consecuencia, un aspecto adicional
de la presente invención lo constituye un sistema como el mencionado
anteriormente que comprende además un péptido de carga positiva,
donde dicho péptido se encuentra incorporado dentro de la estructura
de las nanopartículas o bien adsorbido sobre la superficie de las
mismas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un procedimiento para la preparación de un sistema como se ha
definido anteriormente, que comprende:
- (i)
- preparar una disolución que comprende el lípido sólido a temperatura ambiente, en un disolvente orgánico,
- (ii)
- preparar una disolución acuosa que comprende el tensioactivo catiónico y el tensioactivo no iónico,
- (iii)
- añadir la fase acuosa (ii) sobre la fase oleosa (i), sometiendo la mezcla resultante a agitación hasta obtener una emulsión,
- (iv)
- evaporar el disolvente orgánico,
donde el polisacárido, y opcionalmente el
péptido, se adicionan a la disolución (ii) o bien forman parte de
una disolución acuosa que se pone en contacto con las nanopartículas
lipídicas previamente formadas tras la consecución de las etapas (i)
a (iv).
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un procedimiento para la preparación de un sistema como se ha
definido anteriormente, que comprende:
- (i)
- fundir el lípido sólido a temperatura ambiente,
- (ii)
- preparar un disolución acuosa que comprende el tensioactivo catiónico y el tensioactivo no iónico,
- (iii)
- añadir la fase acuosa (ii) sobre el lípido fundido (i), sometiendo la mezcla resultante a agitación hasta obtener una emulsión,
- (iv)
- someter la emulsión (iii) a un proceso de homogeneización con una presión de al menos 30 psi y con al menos 1 ciclo,
donde el polisacárido, y opcionalmente el
péptido, se adiciona a la disolución (ii) o bien forman parte de una
disolución acuosa que se pone en contacto con las nanopartículas
lipídicas previamente formadas tras la consecución de las etapas (i)
a (iv).
\vskip1.000000\baselineskip
Asimismo, la invención se dirige a una
composición farmacéutica o cosmética que comprende el sistema de
nanopartículas como se ha definido previamente.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un sistema de nanopartículas como se ha definido anteriormente, para
su uso como medicamento.
Un aspecto adicional lo constituye un sistema de
nanopartículas como se ha definido anteriormente, para su uso en la
preparación de un medicamento para terapia génica.
Un último aspecto de la invención se relaciona
con un kit para la inmovilización, transporte y/o liberación
controlada de sustancias activas que comprende un sistema de
nanopartículas como se ha definido anteriormente.
Figura 1. Fotografía de fuerza atómica.
Nanopartículas lipídicas sin ningún componente biológicamente activo
(1A) y formulación 1 (1B).
Figura 2. Fotografía de las formulaciones 1, 2 y
3 obtenidas mediante microscopía a 100x.
Figura 3. Gel de electroforesis obtenido con la
formulación 2 en el que se muestra la capacidad de condensación del
material genético de las nanopartículas (1), su capacidad de
protección frente a DNAsas (2) y su liberación en presencia de SDS
(3).
Figura 4. Gel de electroforesis obtenido con la
formulación 3 en el que se muestra la capacidad de condensación del
material genético de las nanopartículas (1), su capacidad de
protección frente a DNAsas (2) y su liberación en presencia de SDS
(3).
Figura 5. Gel de electroforesis obtenido con la
formulación 4 en el que se muestra la capacidad de condensación del
material genético de las nanopartículas (1), su capacidad de
protección frente a DNAsas (2) y su liberación en presencia de SDS
(3).
Figura 6. Gel de electroforesis obtenido con la
formulación 5 en el que se muestra la capacidad de condensación del
material genético de las nanopartículas (1), su capacidad de
protección frente a DNAsas (2) y su liberación en presencia de SDS
(3).
Figura 7. Gel de electroforesis obtenido con la
formulación 6 en el que se muestra la capacidad de condensación del
material genético de las nanopartículas (1), su capacidad de
protección frente a DNAsas (2) y su liberación en presencia de SDS
(3).
Figura 8. Nivel de transfección y viabilidad
celular in vitro de las formulaciones 1, 2, 3 y DOTAP
liposomal en células ARPE-19.
Figura 9. Fotografía de microscopía de
fluorescencia que muestra el nivel de transfección y viabilidad
celular in vitro de las formulaciones 1, 2, 3.
Figura 10. Fotografía de microscopía de
fluorescencia de muestras de bazo, hígado y pulmón de ratón en el
que se muestra la expresión de pCMS-EGFP tras la
administración de la formulación 3 a ratones por vía endovenosa.
El sistema de la presente invención comprende
nanopartículas, las cuales presentan una estructura que comprende
una fase lipofílica y una fase hidrofílica, en la que puede
incorporarse una molécula biológicamente activa. Dichas
nanopartículas se encuentran en un medio acuoso aunque,
opcionalmente, pueden presentarse como productos liofilizados o
desecados.
En el contexto de la presente invención, el
término "nanopartícula" se refiere a una estructura que
comprende un núcleo de naturaleza lipofílica rodeado por una fase
hidrofílica que encapsula el núcleo. La interacción iónica
resultante entre los distintos componentes lipofílicos e
hidrofílicos de la nanopartícula genera entidades físicas
características, independientes y observables, cuyo tamaño medio es
igual o inferior a 1 \mum, es decir, un tamaño medio comprendido
entre 1 y 1000 nm.
Por "tamaño promedio" se entiende el
diámetro promedio de la población de nanopartículas, que comprenden
la fase lipofílica y la fase hidrofílica. El tamaño medio de estos
sistemas se puede medir por procedimientos estándar conocidos del
experto en la materia, y que se describen, por ejemplo, en la parte
experimental más adelante.
Las nanopartículas del sistema de la invención
se caracterizan por presentar un tamaño medio de partícula igual o
inferior a 1 \mum, preferentemente tienen un tamaño medio
comprendido entre 1 y 1000 nm, más preferentemente entre 100 y 350
nm. Este tamaño permite a las nanopartículas penetrar en las células
y administrar la molécula biológicamente activa. El tamaño medio de
las cápsulas se ve influenciado principalmente por la cantidad del
componente lipídico (a cantidades mayores, el tamaño resultante es
igual o mayor), por la cantidad de tensioactivos (a mayor cantidad o
peso molecular el tamaño es igual o inferior), y por parámetros del
procedimiento de preparación, tal como la velocidad y tipo de
agitación, la temperatura de ambas fases o la duración de la fase de
mezclado.
Por otra parte, las nanopartículas pueden
presentar una carga superficial (medida mediante el potencial Z),
cuya magnitud puede variar desde -50 mV hasta +80 mV.
La formulación de nanopartículas de la presente
invención comprende al menos un lípido sólido a temperatura ambiente
que forma parte del núcleo de la nanopartícula.
En el contexto de la presente invención, se
entiende por "lípido sólido a temperatura ambiente" aquel
lípido que se mantienen en forma sólida por debajo de 45ºC,
pudiendo ser saturado o insaturado. En dicha definición, se incluyen
triglicéridos (por ejemplo triestearina), mono o diglicéricos (por
ejemplo Imwitor®), ácidos grasos (por ejemplo ácido esteárico),
esteroides (por ejemplo colesterol) y ceras (por ejemplo cetil
palmitoato).
En una realización particular, el lípido sólido
a temperatura ambiente se selecciona entre acilglicéridos, ácidos
grasos saturados con una cadena de al menos 10 átomos de carbono o
derivados de los mismos y mezclas de los mismos.
Los acilglicéridos incluyen tanto
monoglicéridos, diacilglicéridos, triacilglicéridos como mezclas de
los mismos. En una realización preferente los acilglicéridos se
seleccionan entre palmitoestearato de glicerilo (Precirol® ATO5),
monoestearato de glicerilo (Imwitor®900), behenato de glicerilo
(Compritol® 888ATO).
En una realización particular, los ácidos grasos
son saturados y presentan una cadena de al menos 10 átomos de
carbono. Asimismo, pueden emplearse derivados de estos ácidos
grasos, entendiéndose como tales aquellos compuestos producidos como
consecuencia de la reacción del grupo ácido con alcoholes o aminas,
tales como por ejemplo los ésteres o amidas de dichos ácidos grasos.
De la misma forma, se incluyen en la definición de derivados de
ácidos grasos aquellos ácidos grasos, sus ésteres o sus amidas que
presentan grupos hidroxilo como sustituyentes de la cadena
hidrocarbonada.
En una realización preferente, se emplea como
derivado de ácido graso el palmitoestearato de glicerilo (Precirol®
ATO5).
En otra realización particular, las
nanopartículas comprenden además otro componente lipídico, en
concreto un lípido líquido a temperatura inferior a 45ºC, pudiendo
ser saturado o insaturado. El lípido líquido a temperatura ambiente
se selecciona entre aceites, ácidos grasos, triglicéridos y ésteres
de ácidos grasos insaturados, o saturados que presentan una cadena
de menos de 10 átomos de carbono, y sus mezclas (por ejemplo
Miglyol®, aceite de soja, miristato de isopropilo, aceite de
ricino). En una realización preferente, se emplea como lípido
líquido Mygliol 212.
La fase hidrofílica de las nanopartículas que
rodea al núcleo lipofílico comprende un tensioactivo catiónico. La
función de este componente es principalmente la de dotar a la
nanopartícula de una carga positiva que permita su absorción a
través de entornos biológicos de carácter catiónico o su adsorción
sobre ellos.
Por el término "tensioactivo catiónico" se
entiende aquél compuesto que presenta una parte hidrófoba y una
parte hidrofílica, que en solución forma iones cargados
positivamente y que permite conseguir una emulsión.
En una realización particular de la invención,
el tensioactivo catiónico se selecciona entre sales de amonio
primario, secundario, terciario y cuaternario, ya sean de estructura
lineal o cíclica, y mezclas de las mismas, como por ejemplo sales de
piridina, piperizina.
Asimismo, se pueden emplear derivados de estas
sales de amonio. Como derivados de sales de amonio se entiende
aquellas sales que incorporan en la misma estructura al menos dos
grupos amino ya sean primario, secundario, terciario y/o
cuaternario, tales como por ejemplo las sales de guanidina,
piperazina e imidazol. En esta definición, estarían también
comprendidas las sales de aminoácidos, tales como por ejemplo las
sales de lisina, arginina, ornitina o triptófano. Asimismo, se
encontrarían englobadas en esta definición aquellas sales de amonio
en las cuales la carga positiva se encuentra sobre un átomo de
fósforo, como por ejemplo Ditetradecyl (trimethylethylphosphonio)
methylphosphonate iodide, Ditetradecyl (butyldimethylphosphonio)
methylphosphonate iodide, Ditetradecyl (dimethylisopropylphosphonio)
methylphosphonate iodide) o arsénico (Ditetradecyl
(Trimethylarsonio) methylphosphonate Iodide, Dioleyl
(trimethylphosphonio) methylphosphonate iodide), en lugar de sobre
el átomo de nitrógeno.
En una realización preferente de la presente
invención, las sales de amonio son sales de tetraalquilamonio, sales
de alquilbencil dimetil amonio o sales de amonio heterocíclicas, más
preferentemente son bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), cloruro
de
N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio
(DOTAP), o DOTMA (cloruro de
N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonio
chloride).
Las nanopartículas comprenden adicionalmente un
tensioactivo no iónico cuyas funciones principales son controlar el
tamaño de partícula y conferir estabilidad, evitando la ruptura de
éstas y la formación de agregados.
Por el término "tensioactivo no iónico" se
entiende aquél compuesto que presenta una parte hidrófoba y una
parte hidrofílica que permite conseguir una emulsión.
En una realización particular de la presente
invención el tensioactivo no iónico se selecciona entre
polisorbatos, copolímeros de polietilenglicol y copolímeros de
polipropilenglicol, como por ejemplo Tween, Span, Poloxamer.
El sistema de nanopartículas de la presente
invención comprende adicionalmente un polisacárido cuyas funciones
principales son facilitar la interacción de las nanopartículas con
la superficie celular y modificar la carga superficial de la
nanopartícula.
Este componente puede formar parte de la
estructura de las nanopartículas o bien puede quedar adsorbido sobre
la superficie de las mismas. Cuando el polisacárido forma parte de
la estructura de las nanopartículas, éste se encuentra en la fase
hidrofílica que rodea el núcleo lipofílico junto con el tensioactivo
catiónico y el tensioactivo no iónico.
Alternativamente, el polisacárido puede formar
un complejo junto con el ingrediente activo a incorporar en la
formulación de nanopartículas mediante interacción iónica. Dicho
complejo se pone en contacto con las nanopartículas previamente
formadas, de manera que el complejo formado por el polisacárido y el
ingrediente activo queda adsorbido sobre la superficie de dichas
nanopartículas.
En una realización particular, el polisacárido
se selecciona entre quitosanos, dextranos, ácido hialurónico,
carragenano, condroitina, keratano, ácido colomínico, xantano,
ciclodextrinas, sales, derivados y mezclas de los mismos. En una
realización preferente, el polisacárido se selecciona entre dextrano
y ácido hialurónico.
El sistema de nanopartículas de la invención
puede comprender además un péptido de carga positiva, entendiéndose
como tal aquel péptido que en disolución se ionizan dando lugar a
carga neta positiva.
Los autores de la presente invención han
observado que la combinación del polisacárido con el mencionado
péptido de carga positiva permite aumentar de forma sinérgica los
niveles de transfección así como mejorar la viabilidad celular, tal
como se ha puesto de manifiesto en la transfección del plásmido
pCMS-EGFP en la línea celular
ARPE-19 de pigmento retinal humano.
Al igual que el polisacárido, el péptido de
carga positiva puede formar parte de la estructura de las
nanopartículas o bien puede quedar adsorbido sobre la superficie de
las mismas. Cuando el péptido de carga positiva forma parte de la
estructura de las nanopartículas, éste se encuentra en la fase
hidrofílica que rodea el núcleo lipofílico junto con el tensioactivo
catiónico, el tensioactivo no iónico y el polisacárido.
Alternativamente, el péptido de carga positiva
puede formar un complejo junto con el polisacárido y el ingrediente
activo a incorporar en la formulación de nanopartículas. Dicho
complejo se pone en contacto con las nanopartículas previamente
formadas, de manera que el complejo formado por el polisacárido, el
péptido de carga positiva y el ingrediente activo queda adsorbido
sobre la superficie de dichas nanopartículas.
En una realización particular de la presente
invención, el péptido de carga positiva se selecciona entre péptidos
de señalización nuclear (péptidos que dirigen hacia el núcleo) y
péptidos de señalización mitocondrial (péptidos que dirigen hacia
las mitocondrias), péptidos RGD (péptidos de reconocimiento de la
superficie celular, que contienen la secuencia
arginina-glicina-ácido aspártico y variantes de la
misma) y CPP (péptidos de penetración celular). Preferiblemente
dicho péptido se selecciona entre protaminas e histonas.
En una variante de la invención, el sistema
tiene una proporción de componente lipídico que está comprendida
entre 0.1% y 20% en peso respecto al peso total del sistema
incluyendo el agua, preferentemente entre 0.5% y 5%. En otra
variante de la invención, cuando se incorpora un lípido líquido a
temperatura ambiente en la formulación de las nanopartículas, éste
se encuentra en una proporción comprendida entre 0.1 y 5% en peso
respecto al peso total del sistema incluyendo el agua,
preferentemente entre 0.5 y 2%.
Por otro lado, en otra variante de la invención
la proporción de tensioactivo catiónico oscila entre 0.05% y 5% en
peso respecto al peso total del sistema incluyendo el agua,
preferentemente entre 0.1% y 2%.
En otra variante de la invención, la proporción
de tensioactivo no iónico está comprendida preferentemente entre
0.01 y 10% en peso respecto al peso total del sistema incluyendo el
agua, preferentemente entre 0.1 y 3%.
En otra variante de la invención, la proporción
de polisacárido se encuentra comprendida entre 0.01 y 10% en peso
respecto al peso total del sistema incluyendo el agua,
preferentemente entre 0.1 y 3%.
Por su parte, la proporción del péptido de carga
positiva, cuando éste se encuentra presente en la formulación, está
preferentemente comprendida entre 0.01% y 10% en peso respecto al
peso total del sistema incluyendo el agua, más preferentemente entre
0.1% y 3% en peso.
En todos los casos la proporción restante
corresponde mayoritariamente a agua purificada donde se encuentran
dispersas las nanopartículas. Esto no significa que otros
ingredientes no puedan estar presentes tales como moduladores de la
viscosidad, conservantes, solubilizantes, antifloculantes,
estabilizantes, especialmente estéricos o iónicos o tensoactivos,
bien en las nanopartículas, bien en el medio acuoso donde están
dispersas o bien adsorbidos sobre ellas.
Las nanopartículas de la presente invención
proporcionan sistemas que tienen una elevada capacidad para asociar
moléculas biológicamente activas, bien dentro de las nanopartículas
o bien adsorbidas sobre ellas. En concreto, el sistema de
nanopartículas de la invención permite asociar hasta el 100% de la
molécula activa cuando ésta es un plásmido. Por lo tanto, otro
aspecto de la invención se refiere a un sistema tal como el descrito
anteriormente que comprende además una molécula biológicamente
activa.
El término "molécula biológicamente activa"
se refiere a cualquier sustancia que se utiliza en el tratamiento,
cura, prevención o diagnóstico de una enfermedad o que se utiliza
para mejorar el bienestar físico y mental de seres humanos y
animales. Según la presente invención, las nanopartículas lipídicas
desarrolladas son adecuadas para incorporar moléculas biológicamente
activas independientemente de las características de solubilidad de
las mismas. La capacidad de asociación dependerá de la molécula
incorporada, pero en términos generales será elevada tanto para
moléculas hidrófilas, como para las de marcado carácter hidrófobo.
Estas moléculas pueden incluir polisacáridos, proteínas, péptidos,
lípidos, hormonas, antígenos/alérgenos, según el objetivo sea
generar una respuesta inmune o tolerancia, ácidos nucleicos,
oligonucleótidos, polinucleótidos y mezclas de los mismos.
En una realización preferida de la invención la
molécula biológicamente activa es un plásmido de ADN, tal como
pEGFP, o un ácido nucleico, más preferentemente es ADN, mARN, iARN,
microARN o secuencia antisentido.
Dependiendo de la naturaleza hidrofóbica o
hidrofílica de la molécula biológicamente activa, ésta se incorpora,
respectivamente, a la fase lipofílica o a la fase hidrofílica de las
nanopartículas. No obstante, en una realización particular, la
molécula biológicamente activa puede quedar adsorbida sobre la
superficie de las nanopartículas una vez formadas éstas.
La proporción de principio activo incorporado en
las nanopartículas puede llegar a ser de hasta el 20% en peso con
respecto al peso total del sistema, incluyendo el agua. Sin embargo,
la proporción adecuada dependerá en cada caso del principio activo
que vaya a incorporarse, la indicación para la que se utiliza y la
eficiencia de administración.
En el caso específico de incorporar como
principio activo un oligonucleótido o un ácido nucleico, la
proporción del mismo en dicho sistema estaría entre un 0,00001% y un
20% en peso con respecto al peso total del sistema incluido el
agua.
Otro objeto de la presente invención es una
composición farmacéutica que comprende el sistema de nanopartículas
definido previamente y una molécula biológicamente activa que puede
prevenir, aliviar o curar enfermedades.
Ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen
cualquier composición líquida (es decir, suspensión o dispersión de
la nanopartículas de la invención) para aplicación por vía oral,
bucal, sublingual, tópica, ocular, nasal o vaginal, o cualquier
composición en la forma de gel, pomada, crema o bálsamo para su
administración por vía tópica, ocular, nasal o vaginal.
En un aspecto preferente, la formulación se
administra por vía mucosa. Las nanopartículas proporcionan una buena
absorción de los fármacos sobre la superficie mucosa a través de su
interacción con la mucosa y las superficies de las células.
En otro aspecto preferente, la formulación se
administra por vía intradérmica o transdérmica, entendiéndose como
tal, la administración a través o sobre la piel.
En otro aspecto preferente, la formulación se
administra por vía parenteral.
Debido a sus buenas propiedades para
administración sobre o a través de la piel, los sistemas de la
invención también son muy adecuados para aplicaciones
cosméticas.
Por lo tanto un objeto adicional de la presente
invención lo constituye una composición cosmética que comprende el
sistema de nanopartículas previamente definido. Estas composiciones
cosméticas incluyen cualquier composición líquida (suspensión o
dispersión de nanopartículas) o cualquier composición que comprenda
el sistema de la invención y que esté en forma de gel, crema, pomada
o ungüento para su administración por vía tópica. Dichas
composiciones se caracterizan por presentar propiedades emolientes,
protectoras y cicatrizantes incluso aunque no tengan asociada
ninguna molécula cosmetológicamente activa.
En una variante de la invención, la composición
cosmética también puede incorporar moléculas activas de naturaleza
lipofílica o hidrofílica que, aunque no presenten efecto
terapéutico, tienen propiedades como agente cosmético. Entre las
moléculas activas que pueden incorporarse a las nanopartículas cabe
citar agentes emolientes, conservantes, sustancias aromatizantes,
agentes anti-acné, antifúngicos, antioxidantes,
desodorantes, antitranspirantes, anticaspa, despigmentantes,
antiseborreicos, colorantes, bronceadores, absorbentes de luz UV,
enzimas, sustancias aromatizantes, entre otros.
Las composiciones farmacéuticas y cosméticas
pueden comprender además agentes controladores de pH como por
ejemplo agentes tampón, los cuales evitan que el pH de la
composición disminuya a valores por debajo de 5, agentes
antioxidantes, que inhiben la oxidación del componente lipídico, así
como conservantes que evitan cambios estructurales importantes en la
formulación.
Dependiendo de su función, estos componentes
adicionales pueden estar presentes en las fases que componen las
nanopartículas o bien en el medio acuoso donde éstas se encuentran
dispersas o bien adsorbidos total o parcialmente sobre ellas. El
experto en la materia puede determinar qué componentes adicionales
se pueden utilizar y si son necesarios, siendo muchos de ellos de
uso común en composiciones farmacéuticas y cosméticas.
Un aspecto adicional de la presente invención lo
constituye un procedimiento [de aquí en adelante procedimiento 1]
para la elaboración del sistema de la invención, tal como se ha
definido anteriormente, que comprende las nanopartículas. Dicho
procedimiento 1 comprende una primera etapa de preparación de la
fase lipídica mediante disolución del lípido sólido a temperatura
ambiente en un disolvente orgánico, donde la proporción del
componente lipídico es al menos de un 0,1% en peso con respecto al
peso total de la solución orgánica, preferiblemente se encuentra
comprendido entre 0,1 y 40% en peso.
En una realización particular, cuando la
molécula biológicamente activa a incorporar en las nanopartículas
tiene naturaleza lipofílica y además se quiere incorporar en el
interior de la estructura de las nanopartículas, dicha molécula
activa se disuelve junto con el lípido en el disolvente
orgánico.
La elección del disolvente orgánico depende en
gran medida tanto del componente lipídico como, en su caso, del
ingrediente activo incorporado. No obstante lo anterior, se prefiere
el empleo de disolventes orgánicos farmacéuticamente aceptables y el
empleo de la menor cantidad posible, debido a que tendrá que ser
posteriormente eliminado en la etapa final del procedimiento que
conduce a la obtención de las nanopartículas.
En una realización particular de la invención,
el disolvente orgánico se selecciona entre diclorometano, acetona,
cloroformo, más preferentemente es diclorometano. La proporción del
disolvente orgánico puede oscilar entre 1 y 60% en peso respecto al
peso total del sistema, incluido el agua, más preferentemente oscila
entre 10 y 30% en peso.
En otra realización particular, se puede añadir
a la fase lipofílica un lípido líquido a temperatura ambiente tal
como se ha mencionado previamente.
Una segunda etapa del procedimiento 1 consiste
en disolver el tensioactivo catiónico y el tensioactivo no iónico en
agua. Adicionalmente, el polisacárido puede disolverse en esta fase
acuosa junto con los tensioactivos, así como el péptido de carga
positiva cuando éste se encuentra presente en la formulación de las
nanopartículas.
En una realización particular, cuando la
molécula biológicamente activa a incorporar en las nanopartículas
tiene naturaleza hidrofílica y además se quiere incorporar en el
interior de la estructura de las nanopartículas, dicha molécula
activa se disuelve junto con el resto de componentes de la fase
acuosa en el agua.
Una vez preparadas ambas disoluciones, la fase
acuosa se adiciona sobre la fase lipídica. El orden de adición debe
ser el indicado con el fin de obtener la emulsión de fase externa
acuosa. La mezcla resultante se somete a una fuerte agitación hasta
obtener una emulsión.
Posteriormente, se procede a la evaporación del
disolvente orgánico mediante cualquier método conocido por un
experto en la materia. En una realización particular, la etapa de
evaporación del disolvente orgánico se efectúa manteniendo la
emulsión en agitación mecánica durante al menos cinco minutos,
sometiéndola posteriormente a vacío durante al menos cinco minutos.
Tras la eliminación del disolvente orgánico, la fase lipídica
solidifica, obteniéndose de esta manera una suspensión de
nanopartículas.
En una realización particular, el procedimiento
1 comprende además una etapa de enfriamiento de la suspensión de
nanopartículas a una temperatura comprendida entre 4 y 8ºC y
posterior filtración por centrifugación para, finalmente,
resuspender las nanopartículas en agua purificada.
En otro aspecto adicional, la invención se
refiere a un procedimiento [de aquí en adelante procedimiento 2]
para la elaboración del sistema de la invención, tal como se ha
definido anteriormente, que comprende las nanopartículas. Dicho
procedimiento 2 comprende una primera etapa de preparación de la
fase lipídica en la que el lípido sólido a temperatura ambiente se
funde a una temperatura superior a su punto de fusión.
En una realización particular, cuando la
molécula biológicamente activa a incorporar en las nanopartículas
tiene naturaleza lipofílica y además se quiere incorporar en el
interior de la estructura de las nanopartículas, dicha molécula
activa se disuelve en el lípido fundido.
En otra realización particular, se adiciona al
lípido fundido un lípido líquido a temperatura ambiente.
Una segunda etapa del procedimiento 2 consiste
en disolver el tensioactivo catiónico y el tensioactivo no iónico en
agua. Adicionalmente, el polisacárido puede disolverse en esta fase
acuosa junto con los tensioactivos, así como el péptido de carga
positiva cuando éste se encuentra presente en la formulación de las
nanopartículas.
En una realización particular, cuando la
molécula biológicamente activa a incorporar en las nanopartículas
tiene naturaleza hidrofílica y además se quiere incorporar en el
interior de la estructura de las nanopartículas, dicha molécula
activa se disuelve junto con el resto de componentes de la fase
acuosa en el agua.
Una vez preparadas ambas fases, la fase acuosa
se adiciona sobre la fase lipídica. El orden de adición debe ser el
indicado con el fin de obtener la emulsión de fase externa acuosa.
La mezcla resultante se somete a una fuerte agitación hasta obtener
una emulsión.
Posteriormente, se somete la emulsión resultante
a una etapa de homogenización mediante cualquier método conocido por
un experto en la técnica, con el fin de obtener partículas con un
tamaño comprendido en el intervalo nanométrico, es decir, hasta un
tamaño igual o inferior a 1 \mum.
Por "homogeneización" se entiende cualquier
proceso que permite, por medios mecánicos, reducir el tamaño de los
glóbulos formados en la emulsión que resulta de llevar a cabo las
etapas i) a iii) del procedimiento 2 de la invención. Ejemplos de
procedimientos de homogenización incluyen homogenización a alta
presión, sonicación, mezclado a alta cizalladura o la aplicación de
fuerzas de impacto o tensión mecánica.
En una realización particular, el proceso de
homogeneización se lleva a cabo mediante homogeneización a alta
presión, en caliente con una presión de al menos 30 psi y con al
menos un ciclo.
En una realización particular, el procedimiento
2 comprende además una etapa de enfriamiento de la suspensión de
nanopartículas a una temperatura comprendida entre 4 y 8ºC y
posterior filtración por centrifugación para, finalmente,
resuspender las nanopartículas en agua purificada.
En una realización particular, la molécula
biológicamente activa no se incorpora dentro de la estructura de la
nanopartícula sino que se encuentra adsorbida sobre la superficie de
las nanopartículas lipídicas. Para ello, dicha molécula activa se
disuelve en una solución acuosa que, posteriormente, se pone en
contacto con las nanopartículas lipídicas previamente obtenidas
según cualquiera de los dos procedimientos descritos previamente.
Preferentemente, la puesta en contacto se efectúa a temperatura
ambiente durante al menos cinco minutos con el fin de obtener un
vector no viral
que comprende las nanopartículas lipídicas sobre cuya superficie queda adsorbida la molécula biológicamente activa.
que comprende las nanopartículas lipídicas sobre cuya superficie queda adsorbida la molécula biológicamente activa.
En otra realización particular, el polisacárido
y, opcionalmente, el péptido de carga positiva cuando éste se
encuentra presente en la formulación, quedan adsorbidos sobre la
superficie de las nanopartículas junto con la molécula
biológicamente activa. Para ello, una vez obtenidas las
nanopartículas lipídicas por cualquiera de los dos procedimientos
descritos anteriormente, se prepara un complejo que comprende el
polisacárido, el ingrediente activo y, opcionalmente el péptido de
carga positiva, mediante la puesta en contacto de soluciones acuosas
que comprenden, cada una de ellas, los tres componentes mencionados.
Una vez obtenido dicho complejo, éste se pone en contacto con las
nanopartículas lipídicas previamente obtenidas para obtener
finalmente el vector no viral que comprende las nanopartículas
lipídicas sobre cuya superficie quedan adsorbidos el polisacárido,
la molécula biológicamente activa y, en su caso, el péptido de carga
positiva.
Adicionalmente, se pueden añadir al sistema de
nanopartículas otros ingredientes como se han descrito más arriba
tales como moduladores de la viscosidad, conservantes,
solubilizantes, antifloculantes, estabilizantes, especialmente
estéticos o iónicos o tensoactivos. Estos componentes serán
adicionados a la fase lipofílica o hidrofílica dependiendo de la
naturaleza de los mismos.
A continuación, se describen algunos ejemplos
ilustrativos que ponen de manifiesto las características y ventajas
de la invención, no obstante, no se deben interpretar como
limitativos del objeto de la invención tal como está definido en las
reivindicaciones.
Las nanopartículas obtenidas se han
caracterizado mediante su tamaño promedio, su carga superficial y su
capacidad para incorporar material genético. Se detallan a
continuación los procedimientos comunes utilizados para dicha
caracterización:
Las diferentes formulaciones se observaron por
microscopía de fluorescencia utilizando un equipo Nikon Eclipse TE
2000-S. Las nanopartículas sin sustancia
biológicamente activa y la formulación 1 se observaron por
microscopía de fuerza atómica (AFM) utilizando el modo MultimodeTM
(Digital Instruments). Las imágenes se capturaron en Tapping ModeTM
utilizando un cantilever de silicona (RTESP, rotated tapping etched
silicon probé type) con una frecuencia de resonancia de
aproximadamente 300 kHz.
Se midió el tamaño de partícula de todas las
formulaciones mediante espectroscopia de correlación fotónica. La
carga superficial se midió mediante velocimetría láser doppler.
Ambos parámetros se midieron con un Zetasizer 3000.
La capacidad de condensación del ADN a las
nanopartículas se determinó mediante electroforesis en gel de
azarosa con un 1% de bromuro de eitido durante 30 minutos a 120 V.
Las bandas se observaron en un transiluminador
TFX-20 M (Vilber-Lourmat). Las
imágenes se captaron utilizando una cámara digital
(Bio-Rad, DigicDoc, model).
Se prepara una disolución de precirol al 5% en
diclorometano (2 mL). Por otro lado, se prepara una disolución
acuosa (10 mL) de DOTAP al 0,4% y Tween 80 al 0,1%. Se añade la fase
acuosa sobre la fase oleosa, sometiendo la mezcla a una fuerte
agitación hasta obtener una emulsión. A continuación se procede a la
evaporación del solvente orgánico, manteniendo la emulsión durante
al menos 5 minutos en agitación mecánica, sometiéndola
posteriormente a vacío durante al menos 5 minutos. De este modo, el
lípido precipita, obteniéndose una suspensión de nanopartículas.
Tras enfriar a temperatura entre 4 y 8ºC, se filtran por
centrifugación y se resuspenden en agua purificada.
Para elaborar los complejos con el material
genético se prepara una disolución del plásmido
(pCMS-EGFP) de 1 \mug/\muL en agua destilada.
Posteriormente, se pone en contacto la suspensión de nanopartículas
con la disolución que contiene el material genético, en una
proporción 5:1 (expresado como la relación peso/peso entre el DOTAP
y el ADN) y se mantiene en agitación durante 15 minutos a
temperatura ambiente.
La figura 1 muestra una fotografía de fuerza
atómica de las nanopartículas lipídicas sin componente
biológicamente activo y de la formulación 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara una disolución de precirol al 5% en
diclorometano. Por otro lado, se prepara una disolución acuosa de
DOTAP al 0,4% y Tween 80 al 0,1%. Se añade la fase acuosa sobre la
fase oleosa en una relación 1:5 y se somete la mezcla a sonicación
(Branson Sonifier 250, Danbury) durante 30 s a 50 W. A continuación
se procede a la evaporación del solvente orgánico, manteniendo la
emulsión durante 5 minutos en agitación mecánica, sometiéndola
posteriormente a vacío durante 15 minutos. Tras enfriar en nevera
(4-8ºC) durante 15 minutos, la nanopartículas
obtenidas se lavan centrifugando 3 veces a 3000 rpm durante 20
minutos utilizando filtros Amicon® Ultra (Millipore).
Se prepara una solución acuosa mediante
disolución del plásmido pCMS-EGFP (1 \mug/\muL)
en agua destilada. Por otra parte, se prepara otra solución acuosa
mediante disolución de dextrano (1 \mug/\muL) en agua
destilada.
Se ponen en contacto las dos disoluciones con
una proporción dextrano:pCMS-EGFP de 5:1 y se
mantiene en agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, se pone en contacto la
suspensión de nanopartículas con la disolución que contiene el
complejo formado con el material genético, en una proporción 5:1
(expresado como la relación peso/peso entre el DOTAP y el ADN) y se
mantiene en agitación durante 15 minutos a temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara una disolución de precirol al 5% en
diclorometano. Por otro lado, se prepara una disolución acuosa de
DOTAP al 0,4% y Tween 80 al 0,1%. Se añade la fase acuosa sobre la
fase oleosa en una relación 1:5 y se somete la mezcla a sonicación
(Branson Sonifier 250, Danbury) during 30 s a 50 W. A continuación
se procede a la evaporación del solvente orgánico, manteniendo la
emulsión durante 5 minutos en agitación mecánica, sometiéndola
posteriormente a vacío durante 15 minutos. Tras enfriar en nevera
(4-8ºC) durante 15 minutos, la nanopartículas
obtenidas se lavan centrifugando 3 veces a 3000 rpm durante 20
minutos utilizando filtros Amicon® Ultra (Millipore).
Se prepara una solución acuosa mediante
disolución del plásmido pCMS-EGFP (1 \mug/\muL)
en agua destilada. Por otra parte, se prepara otra solución acuosa
mediante disolución de dextrano (1 \mug/\muL) en agua destilada.
Adicionalmente, se prepara otra solución acuosa mediante disolución
de protamina (1 \mug/\muL) en agua destilada.
Se ponen en contacto las tres disoluciones con
una proporción dextrano:protamina:pCMS-EGFP de 1:2:1
y se mantiene en agitación durante 30 minutos a temperatura
ambiente.
A continuación, se pone en contacto la
suspensión de nanopartículas con la disolución que contiene el
complejo formado con el material genético, en una proporción 5:1
(expresado como la relación peso/peso entre el DOTAP y el ADN) y se
mantiene en agitación durante 15 minutos a temperatura ambiente.
La figura 2 recoge las fotografías
correspondientes a las formulaciones 1, 2 y 3 obtenidas mediante
microscopía a 100x. En todos los casos, puede observarse la forma
esférica de las partículas y su tamaño homogéneo, no apreciándose
diferencias aparentes entre las tres formulaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se funden 100 mg de precirol calentando a 70ºC.
Por otro lado, se prepara una disolución acuosa de DOTAP al 0,4% y
Tween 80 al 0,1%. Se prepara una pre-emulsión
añadiendo la fase acuosa (10 mL) sobre el lípido fundido, sometiendo
la mezcla a una fuerte agitación hasta obtener una emulsión. A
continuación se somete la mezcla a homogenización a alta presión en
caliente con una presión de al menos 30 psi y con al menos 1 ciclo.
Tras enfriar en nevera (4-8ºC) durante 15 minutos,
la nanopartículas obtenidas se lavan centrifugando 3 veces a 3000
rpm durante 20 minutos utilizando filtros Amicon® Ultra
(Millipore).
\vskip1.000000\baselineskip
Se funden 100 mg de precirol calentando a 70ºC.
Por otro lado, se prepara una disolución acuosa de DOTAP al 0,4% y
Tween 80 al 0,1%. Se prepara una pre-emulsión
añadiendo la fase acuosa (10 mL) sobre el lípido fundido, sometiendo
la mezcla a una fuerte agitación hasta obtener una emulsión. A
continuación se somete la mezcla a homogenización a alta presión en
caliente con una presión de al menos 30 psi y con al menos 1 ciclo.
Tras enfriar en nevera (4-8ºC) durante 15 minutos,
la nanopartículas obtenidas se lavan centrifugando 3 veces a 3000
rpm durante 20 minutos utilizando filtros Amicon® Ultra
(Millipore).
Se prepara una solución acuosa mediante
disolución del plásmido pCMS-EGFP (1 \mug/\muL)
en agua destilada. Por otra parte, se prepara otra solución acuosa
mediante disolución de dextrano (1 \mug/\muL) en agua
destilada.
Se ponen en contacto las dos disoluciones con
una proporción dextrano:pCMS-EGFP: de 5:1 y se
mantiene en agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, se pone en contacto la
suspensión de nanopartículas con la disolución que contiene el
complejo formado con el material genético, en una proporción 5:1
(expresado como la relación peso/peso entre el DOTAP y el ADN) y se
mantiene en agitación durante 15 minutos a temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se funden 100 mg de precirol calentando a 70ºC.
Por otro lado, se prepara una disolución acuosa de DOTAP al 0,4% y
Tween 80 al 0,1%. Se prepara una preemulsión añadiendo la fase
acuosa (10 mL) sobre el lípido fundido, sometiendo la mezcla a una
fuerte agitación hasta obtener una emulsión. A continuación se
somete la mezcla a homogenización a alta presión en caliente con una
presión de al menos 30 psi y con al 3 menos 1 ciclo. Tras enfriar en
nevera (4-8ºC) durante 15 minutos, la nanopartículas
obtenidas se lavan centrifugando 3 veces a 3000 rpm durante 20
minutos utilizando filtros Amicon® Ultra (Millipore).
Se prepara una solución acuosa mediante
disolución del plásmido pCMS-EGFP (1 5
\mug/\muL) en agua destilada. Por otra parte, se prepara otra
solución acuosa mediante disolución de dextrano (1 \mug/\muL)
en agua destilada. Adicionalmente, se prepara otra solución acuosa
mediante disolución de protamina (1 \mug/\muL) en agua
destilada.
Se ponen en contacto las tres disoluciones con
una proporción dextrano:protamina:pCMS-EGFP de 1:2:1
y se mantiene en agitación durante 30 3 minutos a temperatura
ambiente.
A continuación, se pone en contacto la
suspensión de nanopartículas con la disolución que contiene el
complejo formado con el material genético, en una proporción 5:1
(expresado como la relación peso/peso entre el DOTAP y el ADN) y se
mantiene en agitación durante 15 minutos a temperatura ambiente.
La tabla I recoge el tamaño de partícula y la
carga superficial de todas las formulaciones:
\vskip1.000000\baselineskip
Para conocer la capacidad de protección de las
formulaciones sobre el ADN, se utilizó la enzima desoxirribonucleasa
I (DNsa I) que es capaz de hidrolizar las moléculas de ADN. Las
formulaciones se pusieron en contacto con DNAsa durante 30 minutos a
37ºC. Se utilizó 1 U de DNAsa por cada 2,5 \mug de ADN. Pasados
los 30 minutos, se añadió lauril sulfato sódico (SDS) hasta una
concentración final del 1%, para detener la acción de la enzima y
liberar el ADN de las muestras. Las muestras se analizan
posteriormente en un gel de azarosa como se ha definido previamente
en los procedimientos comunes.
En las figuras 3 a 7 se recogen los geles de
electroforesis que muestran la capacidad de condensación del ADN, la
capacidad de protección frente a DNAsas y la liberación inducida por
SDS.
Se puede comprobar que tanto las nanopartículas
que contienen el polisacárido, como las que contienen la combinación
polisacárido-péptido, son capaces de condensar el
ADN, de protegerlo frente a la DNAsa y además, el ADN es capaz de
liberarse del complejo.
\vskip1.000000\baselineskip
La evaluación in vitro de las
formulaciones se llevó a cabo en la línea celular
ARPE-19 (Human Embrionary Kidney). Estas células se
mantuvieron en cultivo en medio Dulbecco's MEM: Ham's Nutrient
Mixture F-12, 1:1 Mix (DMEM: F-12)
con suero de bovino fetal al 10%, antibiótico Normocin al 0.2% y
penicilina. Los cultivos celulares se mantienen a 37ºC en atmósfera
de aire con un 5% de CO_{2}, realizando cambios del medio cada 2 ó
3 días. Los estudios de transfección se realizaron en placas de 24
pocillos con densidades de 30.000 células por pocillo y se dejaron
incubar hasta que alcanzaron un 80-90% de
confluencia. Entonces se retiró parte del medio, dejando el volumen
necesario para cubrir todo el pocillo, añadiendo a continuación la
formulación a estudiar. Se dejaron incubar durante 4 horas y
entonces se añadió más volumen de medio. La cantidad de vectores que
se añadió a cada pocillo fue la equivalente a 2,5 \mug de ADN.
Se evaluó la transfección y la viabilidad
celular mediante citometría de flujo (FACSCaliburTM, Becton
Dickinson Biosciences, San Jose, USA). La fluorescencia debido a la
EGFP se midió a 525 nm (FL1). Para cada muestra, se utilizaron
10.000 eventos. La viabilidad celular se analizó utilizando el kit
BD Via-ProbeTM. Este kit contiene el reactivo
7-amino-actinomicina
(7-AAD) utilizado para la exclusión de células no
viables, que produce fluorescencia en contacto con las células
muertas. La fluorescencia debido al 7-AAD,
correspondiente a las células no viables, se midió a 650 nm (FL3),
tomándose 10.000 eventos por muestra. Se utilizaron como control
células sometidas a las condiciones de cultivo habituales. Con todas
las formulaciones se obtuvieron viabilidades superiores al 80%, un
valor similar al obtenido con los controles (células sin
transfectar); esto indica una ausencia aparente de toxicidad. Por
otro lado, la inclusión del polisacárido (formulación 2) y la
combinación de péptido + polisacárido (formulación 3), incrementa la
viabilidad con respecto a la formulación que no incluye esos
componentes (formulación 1). Las diferencias son más notables para
la formulación 3.
Los estudios de transfección se llevaron a cabo
en células ARPE-19. Se midió, mediante citometría de
flujo, el porcentaje de células transfectadas (% células EGFP
positivas) y la viabilidad celular. La figuras 8 y 9 muestran los
resultados correspondientes a los estudios de transfección y
viabilidad celular en las células ARPE-19. Se hizo
un estudio con DOTAP liposomal como control.
Como puede comprobarse, la incorporación en la
formulación de un polisacárido incrementa la transfección con
respecto al grupo control (nanopartículas sin polisacárido ni
péptido). No obstante, la incorporación en la formulación de un
polisacárido y un péptido permite aumentar de forma sinérgica los
niveles de transfección cuando se compara con un sistema de
nanopartículas que incluye únicamente el mencionado polisacárido,
así como mejorar la viabilidad celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Para conocer la capacidad de transfección de las
nanopartículas, se llevó a cabo un estudio in vivo que
consistió en la administración intravenosa de las formulaciones a
ratones Balb/c.
Se administró la formulación 1 y la formulación
3. La administración se hizo a través de la vena de cola,
inyectándose la formulación en un volumen de 100 \muL,
correspondiente a una dosis del plásmido pCMS-EGFP
de 60 \mug. Como grupos control, se utilizaron ratones a los que
se les administró el plásmido libre y nanopartículas libres de
plásmido. A los 3 y 7 días después de la administración, los
animales se sacrificaron y se extrajeron el pulmón, hígado y bazo.
Los órganos se colocaron en medio de congelación (Jung, Leica), se
congelaron con nitrógeno líquido y posteriormente se seccionaron
mediante un criostato (Cryocut 3.000, Leica). Cada grupo lo formaban
3 animales. De cada órgano, se obtuvieron 12 secciones.
Las secciones (7-10 \mum) se
fijaron con paraformaldehido al 4% durante 10 minutos a temperatura
ambiente. Después de lavarlos en PBS, las secciones se trataron con
Tritón® X-10 y suero de cabra (NGS) al 2% en PBS, 1M
durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, las secciones
se incubaron con un anticuerpo primario (anticuerpo policlonal
anti-GFP) durante 2 horas a temperatura ambiente.
Tras una fase de lavado con PBS, se incubaron con el anticuerpo
secundario (Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG)
durante 45 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, las secciones
se lavaron de nuevo con PBS y se cubrieron con Fluoromount G.
La figura 10 se recogen fotografías de
microscopía de fluorescencia de muestras de bazo, hígado y pulmón de
ratón obtenidas mediante un microscopio de fluorescencia invertido
(eclipse TE2000-S, Nikon) en el que se muestra la
expresión de pCMS-EGFP tras la administración de la
formulación 3 a ratones por vía endovenosa.
\newpage
La siguiente tabla recoge la transfección
obtenida con las diferentes formulaciones:
Estos resultados indican que las formulaciones
son capaces de transfectar in vivo, células de hígado, bazo y
pulmón. Dependiendo de la composición, se obtienen diferentes
niveles de transfección en los diferentes tejidos estudiados. La
inclusión de la combinación péptido + polisacárido hace incrementar
significativamente los niveles de transfección y la duración de la
misma, respecto a la formulación libre de estos componentes.
Claims (18)
1. Sistema para la liberación de moléculas
biológicamente activas que comprende nanopartículas con un tamaño
promedio de partícula igual o inferior a 1 micra, donde 1 as
nanopartículas comprenden:
- -
- al menos un lípido sólido a temperatura ambiente;
- -
- al menos un tensioactivo catiónico;
- -
- al menos un tensioactivo no iónico; y
- -
- al menos un polisacárido, donde dicho polisacárido comprende la unión de al menos tres monosacáridos, con la condición de que dicho polisacárido no sea un lipopolisacárido, y donde dicho polisacárido se encuentra incorporado dentro de la estructura de las nanopartículas o bien adsorbido sobre la superficie de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Sistema según la reivindicación 1, que además
comprende al menos un péptido de carga neta positiva.
3. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, que además comprende una molécula
biológicamente activa.
4. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde el lípido sólido a temperatura
ambiente se selecciona entre monoglicéridos, diacilglicéridos,
triacilglicéridos y mezclas de los mismos.
5. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde el tensioactivo catiónico se
selecciona entre sales de amonio primario, secundario, terciario y
cuaternario, de estructura lineal o cíclica, mezclas de las mismas y
derivados de las mismas.
6. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, donde el tensioactivo no iónico se
selecciona entre polisorbatos, copolímeros de polietilenglicol,
copolímeros de polipropilen glicol y mezclas de los mismos.
7. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde el polisacárido se selecciona entre
quitosanos, dextranos, ácido hialurónico, carragenano, condroitina,
keratano, ácido colomínico, xantano, ciclodextrinas, sales,
derivados y mezclas de los mismos.
8. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 7, donde el péptido de carga neta positiva se
selecciona entre péptidos de señalización nuclear, péptidos de
señalización mitocondrial, péptidos de reconocimiento de la
superficie celular que comprenden la secuencia
arginina-glicina-ácido aspártico y péptidos de
penetración celular.
9. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 8, donde la molécula biológicamente activa se
selecciona entre ácidos nucleicos, péptidos, proteínas,
polisacáridos, lípidos y mezclas de los mismos.
10. Sistema según la reivindicación 9, donde la
molécula biológicamente activa se selecciona entre ADN, mARN, iARN,
microRNA, oligonucleótidos y secuencia antisentido.
11. Procedimiento para la preparación de un
sistema como se define en cualquiera de las reivindicaciones
1-10, que comprende:
- (i)
- preparar una disolución que comprende el lípido sólido a temperatura ambiente, en un disolvente orgánico,
- (ii)
- preparar una disolución acuosa que comprende el tensioactivo catiónico y el tensioactivo no iónico,
- (iii)
- añadir la fase acuosa (ii) sobre la fase oleosa (i), sometiendo la mezcla resultante a agitación hasta obtener una emulsión,
- (iv)
- evaporar el disolvente orgánico,
donde el polisacárido, y opcionalmente el
péptido, pueden formar parte de la disolución (ii) o pueden formar
parte de una disolución acuosa que se pone en contacto con las
nanopartículas lipídicas previamente formadas tras la consecución de
las etapas (i) a (iv).
\vskip1.000000\baselineskip
12. Procedimiento para la preparación de un
sistema como se define en cualquiera de las reivindicaciones
1-10, que comprende:
- (i)
- fundir el lípido sólido a temperatura ambiente,
- (ii)
- preparar un disolución acuosa que comprende el tensioactivo catiónico y el tensioactivo no iónico,
- (iii)
- añadir la fase acuosa (ii) sobre el lípido fundido (i), sometiendo la mezcla resultante a agitación hasta obtener una emulsión,
- (iv)
- someter la emulsión (iii) a un proceso de homogeneización con una presión de al menos 30 psi y con al menos 1 ciclo,
donde el polisacárido, y opcionalmente el
péptido, pueden formar parte de la disolución (ii) o pueden formar
parte de una disolución acuosa que se pone en contacto con las
nanopartículas lipídicas previamente formadas tras la consecución de
las etapas (i) a (iv).
\vskip1.000000\baselineskip
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 11-12, en el que las nanopartículas
lipídicas obtenidas tras la consecución de las etapas i) a iv) se
ponen en contacto con una disolución que comprende una molécula
biológicamente activa.
14. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 11-12, en el que la molécula
biológicamente activa se incorpora en la etapa (i) de preparación de
la solución que comprende el lípido o en el lípido fundido, o bien
en la etapa (ii) (ii)de preparación de la disolución acuosa
que comprende el tensioactivo catiónico y el tensioactivo no
iónico.
15. Sistema de nanopartículas obtenible según el
procedimiento definido en cualquiera de las reivindicaciones
11-14.
16. Composición farmacéutica o cosmética que
comprende el sistema de nanopartículas como se define en cualquiera
de las reivindicaciones 1-10 ó 15.
17. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 1-10 ó 15, para su uso como
medicamento.
18. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 1-10 ó 15, para su uso en la
preparación de un medicamento para terapia génica.
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| PT106445B (pt) * | 2012-07-15 | 2014-10-13 | Univ Lisboa | Sistema transportador de poliplexes peguilado, seu processo de preparação, intermediários e composições farmacêuticas |
| ES2481940B1 (es) * | 2012-12-17 | 2015-05-06 | Universidade De Santiago De Compostela | Nanocápsulas de protamina |
| EP3103485A1 (en) * | 2015-06-11 | 2016-12-14 | Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives | Material comprising a polymer capable of forming a hydrogel and nanoparticles |
| CA3017931C (fr) * | 2016-03-25 | 2024-01-09 | Adisseo France S.A.S. | Nanocapsules de principe actif liposoluble, fabrication et utilisations |
| EP4081196A1 (en) | 2019-12-23 | 2022-11-02 | Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea | Golden lipid nanoparticles for gene therapy |
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| JP2002521423A (ja) * | 1998-07-31 | 2002-07-16 | コリア インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロージ | 遺伝子又は薬物運搬体としての脂質エマルジョン及び固形脂質微粒子 |
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| DE50303213D1 (de) * | 2002-06-11 | 2006-06-08 | Basf Ag | (meth)acrylester von polyalkoxyliertem glycerin |
| WO2004053056A2 (en) | 2002-09-24 | 2004-06-24 | University Of Kentucky Research Foundation | Nanoparticle-based vaccine delivery system containing adjuvant |
| KR20060015534A (ko) * | 2003-04-25 | 2006-02-17 | 더 펜 스테이트 리서치 파운데이션 | 성장 억제, 지질 유래된 생활성 화합물의 전신 전달을 위한방법 및 시스템 |
| KR20060097020A (ko) * | 2003-10-31 | 2006-09-13 | 테바 파마슈티컬 인더스트리즈 리미티드 | 약물 전달용 나노입자 |
| ITMI20041151A1 (it) | 2004-06-09 | 2004-09-09 | Maria Rosa Gasco | Nanoparticelle lipidiche come agenti veicolanti per acidi nucleici procedimento per la loro preparazione e loro uso |
| WO2006044660A2 (en) | 2004-10-14 | 2006-04-27 | Vanderbilt University | Functionalized solid lipid nanoparticles and methods of making and using same |
| ITMI20050222A1 (it) | 2005-02-15 | 2006-08-16 | Milano Politecnico | Lipidi cationici per la trasfezione di acidi nucleici |
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| US20070237826A1 (en) * | 2006-04-05 | 2007-10-11 | Rao Kollipara K | Polymerized solid lipid nanoparticles for oral or mucosal delivery of therapeutic proteins and peptides |
| WO2007135164A1 (en) * | 2006-05-24 | 2007-11-29 | Advanced In Vitro Cell Technologies, S.A. | Nanoparticles of chitosan and hyaluronan for the administration of active molecules |
| US20080160096A1 (en) | 2006-07-27 | 2008-07-03 | Janos Berbely | Polymeric nanoparticles by ion-ion interactions |
| WO2008105852A2 (en) * | 2006-10-26 | 2008-09-04 | Creighton University | Mucoadhesive nanoparticles for cancer treatment |
| US20080213350A1 (en) | 2007-02-20 | 2008-09-04 | Texas Tech University System | Encapsulation of nucleic acids in liposomes |
| CN101167706A (zh) * | 2007-10-26 | 2008-04-30 | 东南大学 | 壳聚糖纳米微胶囊的合成方法 |
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-
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012085318A1 (es) * | 2010-12-21 | 2012-06-28 | Universidad Del País Vasco | Nanopartículas lipídicas para el tratamiento de enfermedades oculares |
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