ES2652489T3 - Nanopartículas lipídicas para terapia génica - Google Patents
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Abstract
La presente invención se relaciona con un sistema de nanopartículas lipídicas que comprenden un componente lipídico, un tensioactivo catiónico, un tensioactivo no iónico, un polisacárido y, opcionalmente, un péptido de carga positiva, útil para la liberación de moléculas farmacológicamente activas, y especialmente para transfectar material genéticoen célulasy/o tejidos. Asimismo, se dirige a procedimientos para la obtención de nanopartículas, a composiciones farmacéuticas que lo comprenden, así como a su uso en terapia génica.
Description
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Al igual que el polisacárido, el péptido de carga positiva puede formar parte de la estructura de las nanopartículas o bien puede quedar adsorbido sobre la superficie de las mismas. Cuando el péptido de carga positiva forma parte de la estructura de las nanopartículas, éste se encuentra en la fase hidrofílica que rodea el núcleo lipofílico junto con el tensioactivo catiónico, el tensioactivo no iónico y el polisacárido.
Alternativamente, el péptido de carga positiva puede formar un complejo junto con el polisacárido y el ingrediente activo a incorporar en la formulación de nanopartículas. Dicho complejo se pone en contacto con las nanopartículas previamente formadas, de manera que el complejo formado por el polisacárido, el péptido de carga positiva y el ingrediente activo queda adsorbido sobre la superficie de dichas nanopartículas.
En una realización particular de la presente invención, el péptido de carga positiva se selecciona entre péptidos de señalización nuclear (péptidos que dirigen hacia el núcleo) y péptidos de señalización mitocondrial (péptidos que dirigen hacia las mitocondrias), péptidos RGD (péptidos de reconocimiento de la superficie celular, que contienen la secuencia arginina-glicina-ácido aspártico y variantes de la misma) y CPP (péptidos de penetración celular). Preferiblemente dicho péptido se selecciona entre protaminas e histonas.
En una variante de la invención, el sistema tiene una proporción de componente lipídico que está comprendida entre 0,1 % y 20 % en peso respecto al peso total del sistema incluyendo el agua, preferentemente entre 0,5 % y 5 %. En otra variante de la invención, cuando se incorpora un lípido líquido a temperatura ambiente en la formulación de las nanopartículas, éste se encuentra en una proporción comprendida entre 0,1 y 5 % en peso respecto al peso total del sistema incluyendo el agua, preferentemente entre 0,5 y 2 %.
Por otro lado, en otra variante de la invención la proporción de tensioactivo catiónico oscila entre 0,05 % y 5 % en peso respecto al peso total del sistema incluyendo el agua, preferentemente entre 0,1 % y 2 %.
En otra variante de la invención, la proporción de tensioactivo no iónico está comprendida preferentemente entre 0,01 y 10 % en peso respecto al peso total del sistema incluyendo el agua, preferentemente entre 0,1 y 3 %.
En otra variante de la invención, la proporción de polisacárido se encuentra comprendida entre 0,01 y 10 % en peso respecto al peso total del sistema incluyendo el agua, preferentemente entre 0,1 y 3 %.
Por su parte, la proporción del péptido de carga positiva, cuando éste se encuentra presente en la formulación, está preferentemente comprendida entre 0,01 % y 10 % en peso respecto al peso total del sistema incluyendo el agua, más preferentemente entre 0,1 % y 3 % en peso.
En todos los casos la proporción restante corresponde mayoritariamente a agua purificada donde se encuentran dispersas las nanopartículas. Esto no significa que otros ingredientes no puedan estar presentes tales como moduladores de la viscosidad, conservantes, solubilizantes, antifloculantes, estabilizantes, especialmente estéricos o iónicos o tensoactivos, bien en las nanopartículas, bien en el medio acuoso donde están dispersas o bien adsorbidos sobre ellas.
Las nanopartículas de la presente invención proporcionan sistemas que tienen una elevada capacidad para asociar moléculas biológicamente activas, bien dentro de las nanopartículas o bien adsorbidas sobre ellas. En concreto, el sistema de nanopartículas de la invención permite asociar hasta el 100 % de la molécula activa cuando ésta es un plásmido. Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un sistema tal como el descrito anteriormente que comprende además una molécula biológicamente activa.
El término “molécula biológicamente activa” se refiere a cualquier sustancia que se utiliza en el tratamiento, cura, prevención o diagnóstico de una enfermedad o que se utiliza para mejorar el bienestar físico y mental de seres humanos y animales. Según la presente invención, las nanopartículas lipídicas desarrolladas son adecuadas para incorporar moléculas biológicamente activas independientemente de las características de solubilidad de las mismas. La capacidad de asociación dependerá de la molécula incorporada, pero en términos generales será elevada tanto para moléculas hidrófilas, como para las de marcado carácter hidrófobo. Estas moléculas pueden incluir polisacáridos, proteínas, péptidos, lípidos, hormonas, antígenos/alérgenos, según el objetivo sea generar una respuesta inmune o tolerancia, ácidos nucleicos, oligonucleótidos, polinucleótidos y mezclas de los mismos.
En una realización preferida de la invención la molécula biológicamente activa es un plásmido de ADN, tal como pEGFP, o un ácido nucleico, más preferentemente es ADN, mARN, iARN, microARN o secuencia antisentido.
Dependiendo de la naturaleza hidrofóbica o hidrofílica de la molécula biológicamente activa, ésta se incorpora, respectivamente, a la fase lipofílica o a la fase hidrofílica de las nanopartículas. No obstante, en una realización particular, la molécula biológicamente activa puede quedar adsorbida sobre la superficie de las nanopartículas una vez formadas éstas.
La proporción de principio activo incorporado en las nanopartículas puede llegar a ser de hasta el 20 % en peso con respecto al peso total del sistema, incluyendo el agua. Sin embargo, la proporción adecuada dependerá en cada caso del principio activo que vaya a incorporarse, la indicación para la que se utiliza y la eficiencia de administración.
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En el caso específico de incorporar como principio activo un oligonucleótido o un ácido nucleico, la proporción del mismo en dicho sistema estaría entre un 0,00001 % y un 20 % en peso con respecto al peso total del sistema incluido el agua.
Otro objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende el sistema de nanopartículas definido previamente y una molécula biológicamente activa que puede prevenir, aliviar o curar enfermedades.
Ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen una composición líquida (es decir, suspensión o dispersión de las nanopartículas de la invención) para aplicación por vía oral, bucal, sublingual, tópica, ocular, nasal o vaginal, o cualquier composición en la forma de gel, pomada, crema o bálsamo para su administración por vía tópica, ocular, nasal o vaginal.
En un aspecto preferente, la formulación se administra por vía mucosa. Las nanopartículas proporcionan una buena absorción de los fármacos sobre la superficie mucosa a través de su interacción con la mucosa y las superficies de las células.
En otro aspecto preferente, la formulación se administra por vía intradérmica o transdérmica, entendiéndose como tal, la administración a través o sobre la piel.
En otro aspecto preferente, la formulación se administra por vía parenteral.
Debido a sus buenas propiedades para administración sobre o a través de la piel, los sistemas de la invención también son muy adecuados para aplicaciones cosméticas.
Por lo tanto un objeto adicional de la presente invención lo constituye una composición cosmética que comprende el sistema de nanopartículas previamente definido. Estas composiciones cosméticas incluyen cualquier composición líquida (suspensión o dispersión de nanopartículas) o cualquier composición que comprenda el sistema de la invención y que esté en forma de gel, crema, pomada o ungüento para su administración por vía tópica. Dichas composiciones se caracterizan por presentar propiedades emolientes, protectoras y cicatrizantes incluso aunque no tengan asociada ninguna molécula cosmetológicamente activa.
En una variante de la invención, la composición cosmética también puede incorporar moléculas activas de naturaleza lipofílica o hidrofílica que, aunque no presenten efecto terapéutico, tienen propiedades como agente cosmético. Entre las moléculas activas que pueden incorporarse a las nanopartículas cabe citar agentes emolientes, conservantes, sustancias aromatizantes, agentes anti-acné, antifúngicos, antioxidantes, desodorantes, antitranspirantes, anticaspa, despigmentantes, antiseborreicos, colorantes, bronceadores, absorbentes de luz UV, enzimas, sustancias aromatizantes, entre otros.
Las composiciones farmacéuticas y cosméticas pueden comprender además agentes controladores de pH como por ejemplo agentes tampón, los cuales evitan que el pH de la composición disminuya a valores por debajo de 5, agentes antioxidantes, que inhiben la oxidación del componente lipídico, así como conservantes que evitan cambios estructurales importantes en la formulación.
Dependiendo de su función, estos componentes adicionales pueden estar presentes en las fases que componen las nanopartículas o bien en el medio acuoso donde éstas se encuentran dispersas o bien adsorbidos total o parcialmente sobre ellas. El experto en la materia puede determinar qué componentes adicionales se pueden utilizar y si son necesarios, siendo muchos de ellos de uso común en composiciones farmacéuticas y cosméticas.
Un aspecto adicional de la presente invención lo constituye un procedimiento [de aquí en adelante procedimiento 1] para la elaboración del sistema de la invención, tal como se ha definido anteriormente, que comprende las nanopartículas. Dicho procedimiento 1 comprende una primera etapa de preparación de la fase lipídica mediante disolución del lípido sólido a temperatura ambiente en un disolvente orgánico, donde la proporción del componente lipídico es al menos de un 0,1 % en peso con respecto al peso total de la solución orgánica, preferiblemente se encuentra comprendido entre 0,1 y 40 % en peso.
En una realización particular, cuando la molécula biológicamente activa a incorporar en las nanopartículas tiene naturaleza lipofílica y además se quiere incorporar en el interior de la estructura de las nanopartículas, dicha molécula activa se disuelve junto con el lípido en el disolvente orgánico.
La elección del disolvente orgánico depende en gran medida tanto del componente lipídico como, en su caso, del ingrediente activo incorporado. No obstante lo anterior, se prefiere el empleo de disolventes orgánicos farmacéuticamente aceptables y el empleo de la menor cantidad posible, debido a que tendrá que ser posteriormente eliminado en la etapa final del procedimiento que conduce a la obtención de las nanopartículas.
En una realización particular de la invención, el disolvente orgánico se selecciona entre diclorometano, acetona, cloroformo, más preferentemente es diclorometano. La proporción del disolvente orgánico puede oscilar entre 1 y 60 % en peso respecto al peso total del sistema, incluido el agua, más preferentemente oscila entre 10 y 30 % en peso.
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En otra realización particular, se puede añadir a la fase lipofílica un lípido líquido a temperatura ambiente tal como se ha mencionado previamente.
Una segunda etapa del procedimiento 1 consiste en disolver el tensioactivo catiónico y el tensioactivo no iónico en agua. Adicionalmente, el polisacárido puede disolverse en esta fase acuosa junto con los tensioactivos, así como el péptido de carga positiva cuando éste se encuentra presente en la formulación de las nanopartículas.
En una realización particular, cuando la molécula biológicamente activa a incorporar en las nanopartículas tiene naturaleza hidrofílica y además se quiere incorporar en el interior de la estructura de las nanopartículas, dicha molécula activa se disuelve junto con el resto de componentes de la fase acuosa en el agua.
Una vez preparadas ambas disoluciones, la fase acuosa se adiciona sobre la fase lipídica. El orden de adición debe ser el indicado con el fin de obtener la emulsión de fase externa acuosa. La mezcla resultante se somete a una fuerte agitación hasta obtener una emulsión.
Posteriormente, se procede a la evaporación del disolvente orgánico mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. En una realización particular, la etapa de evaporación del disolvente orgánico se efectúa manteniendo la emulsión en agitación mecánica durante al menos cinco minutos, sometiéndola posteriormente a vacío durante al menos cinco minutos. Tras la eliminación del disolvente orgánico, la fase lipídica solidifica, obteniéndose de esta manera una suspensión de nanopartículas.
En una realización particular, el procedimiento 1 comprende además una etapa de enfriamiento de la suspensión de nanopartículas a una temperatura comprendida entre 4 y 8ºC y posterior filtración por centrifugación para, finalmente, resuspender las nanopartículas en agua purificada.
En otro aspecto adicional, la invención se refiere a un procedimiento [de aquí en adelante procedimiento 2] para la elaboración del sistema de la invención, tal como se ha definido anteriormente, que comprende las nanopartículas. Dicho procedimiento 2 comprende una primera etapa de preparación de la fase lipídica en la que el lípido sólido a temperatura ambiente se funde a una temperatura superior a su punto de fusión.
En una realización particular, cuando la molécula biológicamente activa a incorporar en las nanopartículas tiene naturaleza lipofílica y además se quiere incorporar en el interior de la estructura de las nanopartículas, dicha molécula activa se disuelve en el lípido fundido.
En otra realización particular, se adiciona al lípido fundido un lípido líquido a temperatura ambiente.
Una segunda etapa del procedimiento 2 consiste en disolver el tensioactivo catiónico y el tensioactivo no iónico en agua. Adicionalmente, el polisacárido puede disolverse en esta fase acuosa junto con los tensioactivos, así como el péptido de carga positiva cuando éste se encuentra presente en la formulación de las nanopartículas.
En una realización particular, cuando la molécula biológicamente activa a incorporar en las nanopartículas tiene naturaleza hidrofílica y además se quiere incorporar en el interior de la estructura de las nanopartículas, dicha molécula activa se disuelve junto con el resto de componentes de la fase acuosa en el agua.
Una vez preparadas ambas fases, la fase acuosa se adiciona sobre la fase lipídica. El orden de adición debe ser el indicado con el fin de obtener la emulsión de fase externa acuosa. La mezcla resultante se somete a una fuerte agitación hasta obtener una emulsión.
Posteriormente, se somete la emulsión resultante a una etapa de homogeneización mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica, con el fin de obtener partículas con un tamaño comprendido en el intervalo nanométrico, es decir, hasta un tamaño igual o inferior a 1 m.
Por “homogeneización” se entiende cualquier proceso que permite, por medios mecánicos, reducir el tamaño de los glóbulos formados en la emulsión que resulta de llevar a cabo las etapas i) a iii) del procedimiento 2 de la invención. Ejemplos de procedimientos de homogeneización incluyen homogeneización a alta presión, sonicación, mezclado a alta cizalladura o la aplicación de fuerzas de impacto o tensión mecánica.
En una realización particular, el proceso de homogeneización se lleva a cabo mediante homogeneización a alta presión, en caliente con una presión de al menos 30 psi y con al menos un ciclo.
En una realización particular, el procedimiento 2 comprende además una etapa de enfriamiento de la suspensión de nanopartículas a una temperatura comprendida entre 4 y 8ºC y posterior filtración por centrifugación para, finalmente, resuspender las nanopartículas en agua purificada.
En una realización particular, la molécula biológicamente activa no se incorpora dentro de la estructura de la nanopartícula sino que se encuentra adsorbida sobre la superficie de las nanopartículas lipídicas. Para ello, dicha molécula activa se disuelve en una solución acuosa que, posteriormente, se pone en contacto con las nanopartículas lipídicas previamente obtenidas según cualquiera de los dos procedimientos descritos previamente. Preferentemente, la puesta en contacto se efectúa a temperatura ambiente durante al menos cinco minutos con el
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fin de obtener un vector no viral que comprende las nanopartículas lipídicas sobre cuya superficie queda adsorbida la molécula biológicamente activa.
En otra realización particular, el polisacárido y, opcionalmente, el péptido de carga positiva cuando éste se encuentra presente en la formulación, quedan adsorbidos sobre la superficie de las nanopartículas junto con la molécula biológicamente activa. Para ello, una vez obtenidas las nanopartículas lipídicas por cualquiera de los dos procedimientos descritos anteriormente, se prepara un complejo que comprende el polisacárido, el ingrediente activo y, opcionalmente el péptido de carga positiva, mediante la puesta en contacto de soluciones acuosas que comprenden, cada una de ellas, los tres componentes mencionados. Una vez obtenido dicho complejo, éste se pone en contacto con las nanopartículas lipídicas previamente obtenidas para obtener finalmente el vector no viral que comprende las nanopartículas lipídicas sobre cuya superficie quedan adsorbidos el polisacárido, la molécula biológicamente activa y, en su caso, el péptido de carga positiva.
Adicionalmente, se pueden añadir al sistema de nanopartículas otros ingredientes como se han descrito más arriba tales como moduladores de la viscosidad, conservantes, solubilizantes, antifloculantes, estabilizantes, especialmente estéricos o iónicos o tensoactivos. Estos componentes serán adicionados a la fase lipofílica o hidrofílica dependiendo de la naturaleza de los mismos.
A continuación, se describen algunos ejemplos ilustrativos que ponen de manifiesto las características y ventajas de la invención, no obstante, no se deben interpretar como limitativos del objeto de la invención tal como está definido en las reivindicaciones.
Ejemplos
Las nanopartículas obtenidas se han caracterizado mediante su tamaño promedio, su carga superficial y su capacidad para incorporar material genético. Se detallan a continuación los procedimientos comunes utilizados para dicha caracterización:
- 1.
- Morfología.
Las diferentes formulaciones se observaron por microscopía de fluorescencia utilizando un equipo Nikon Eclipse TE 2000-S. Las nanopartículas sin sustancia biológicamente activa y la formulación 1 se observaron por microscopía de fuerza atómica (AFM) utilizando el modo MultimodeTM (Digital Instruments). Las imágenes se capturaron en Tapping ModeTM utilizando un cantilever de silicona (RTESP, rotated tapping etched silicon probe type) con una frecuencia de resonancia de aproximadamente 300 kHz.
- 2.
- Tamaño de partícula y carga superficial.
Se midió el tamaño de partícula de todas las formulaciones mediante espectroscopia de correlación fotónica. La carga superficial se midió mediante velocimetría láser doppler. Ambos parámetros se midieron con un Zetasizer 3000.
- 3.
- Capacidad de unión del material genético a las nanopartículas.
La capacidad de condensación del ADN a las nanopartículas se determinó mediante electroforesis en gel de azarosa con un 1 % de bromuro de etidio durante 30 minutos a 120 V. Las bandas se observaron en un transiluminador TFX20 M (Vilber-Lourmat). Las imágenes se captaron utilizando una cámara digital (Bio-Rad, DigicDoc, model).
Ejemplo 1. Preparación de nanopartículas sin polisacárido ni péptido mediante la técnica de emulsificación/evaporación del solvente (Formulación 1).
Se prepara una disolución de precirol al 5 % en diclorometano (2 ml). Por otro lado, se prepara una disolución acuosa (10 ml) de DOTAP al 0,4 % y Tween 80 al 0,1 %. Se añade la fase acuosa sobre la fase oleosa, sometiendo la mezcla a una fuerte agitación hasta obtener una emulsión. A continuación se procede a la evaporación del solvente orgánico, manteniendo la emulsión durante al menos 5 minutos en agitación mecánica, sometiéndola posteriormente a vacío durante al menos 5 minutos. De este modo, el lípido precipita, obteniéndose una suspensión de nanopartículas. Tras enfriar a temperatura entre 4 y 8 °C, se filtran por centrifugación y se resuspenden en agua purificada.
Para elaborar los complejos con el material genético se prepara una disolución del plásmido (pCMS-EGFP) de 1 µg/µl en agua destilada. Posteriormente, se pone en contacto la suspensión de nanopartículas con la disolución que contiene el material genético, en una proporción 5:1 (expresado como la relación peso/peso entre el DOTAP y el ADN) y se mantiene en agitación durante 15 minutos a temperatura ambiente.
La figura 1 muestra una fotografía de fuerza atómica de las nanopartículas lipídicas sin componente biológicamente activo y de la formulación 1.
Ejemplo 2. Preparación de nanopartículas con polisacárido y sin péptido mediante la técnica de emulsificación/evaporación del solvente (Formulación 2).
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Nanopartículas lipídicas:
Se prepara una disolución de precirol al 5 % en diclorometano. Por otro lado, se prepara una disolución acuosa de DOTAP al 0,4 % y Tween 80 al 0,1 %. Se añade la fase acuosa sobre la fase oleosa en una relación 1:5 y se somete la mezcla a sonicación (Branson Sonifier 250, Danbury) durante 30 s at 50W. A continuación se procede a la evaporación del solvente orgánico, manteniendo la emulsión durante 5 minutos en agitación mecánica, sometiéndola posteriormente a vacío durante 15 minutos. Tras enfriar en nevera (4-8 °C) durante 15 minutos, las nanopartículas obtenidas se lavan centrifugando 3 veces a 3000 rpm durante 20 minutos utilizando filtros Amicon® Ultra (Millipore).
Complejos dextrano:pCMS-EGFP:
Se prepara una solución acuosa mediante disolución del plásmido pCMS-EGFP (1 µg/µl) en agua destilada. Por otra parte, se prepara otra solución acuosa mediante disolución de dextrano (1 µg/µl) con un peso molecular de aproximadamente 3200 (suministrado por Sigma) en agua destilada.
Se ponen en contacto las dos disoluciones con una proporción dextrano:pCMS-EGFP de 5:1 y se mantiene en agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, se pone en contacto la suspensión de nanopartículas con la disolución que contiene el complejo formado con el material genético, en una proporción 5:1 (expresado como la relación peso/peso entre el DOTAP y el ADN) y se mantiene en agitación durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Ejemplo 3. Preparación de nanopartículas con polisacárido y con péptido mediante la técnica de emulsificación/evaporación del solvente (Formulación 3).
Nanopartículas lipídicas:
Se prepara una disolución de precirol al 5 % en diclorometano. Por otro lado, se prepara una disolución acuosa de DOTAP al 0,4 % y Tween 80 al 0,1 %. Se añade la fase acuosa sobre la fase oleosa en una relación 1:5 y se somete la mezcla a sonicación (Branson Sonifier 250, Danbury) durante 30 s a 50W. A continuación se procede a la evaporación del solvente orgánico, manteniendo la emulsión durante 5 minutos en agitación mecánica, sometiéndola posteriormente a vacío durante 15 minutos. Tras enfriar en nevera (4-8 °C) durante 15 minutos, las nanopartículas obtenidas se lavan centrifugando 3 veces a 3000 rpm durante 20 minutos utilizando filtros Amicon® Ultra (Millipore).
Complejos dextrano:protamina:pCMS-EGFP:
Se prepara una solución acuosa mediante disolución del plásmido pCMS-EGFP (1 µg/µl) en agua destilada. Por otra parte, se prepara otra solución acuosa mediante disolución de dextrano (1 µg/µl) con un peso molecular de aproximadamente 3200 (suministrado por Sigma) en agua destilada. Adicionalmente, se prepara otra solución acuosa mediante disolución de protamina (1 µg/µl) en agua destilada.
Se ponen en contacto las tres disoluciones con una proporción dextrano:protamina:pCMS-EGFP de 1:2:1 y se mantiene en agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, se pone en contacto la suspensión de nanopartículas con la disolución que contiene el complejo formado con el material genético, en una proporción 5:1 (expresado como la relación peso/peso entre el DOTAP y el ADN) y se mantiene en agitación durante 15 minutos a temperatura ambiente.
La figura 2 muestra las fotografías correspondientes a las formulaciones 1, 2 y 3 obtenidas mediante microscopía a 100x. En todos los casos, puede observarse la forma esférica de las partículas y su tamaño homogéneo, no apreciándose diferencias aparentes entre las tres formulaciones.
Ejemplo 4. Preparación de nanopartículas sin polisacárido ni péptido mediante la técnica de homogeneización a alta presión (Formulación 4).
Se funden 100 mg de precirol calentando a 70 °C. Por otro lado, se prepara una disolución acuosa de DOTAP al 0,4 % y Tween 80 al 0,1 %. Se prepara una pre-emulsión añadiendo la fase acuosa (10 ml) sobre el lípido fundido, sometiendo la mezcla a una fuerte agitación hasta obtener una emulsión. A continuación se somete la mezcla a homogeneización a alta presión en caliente con una presión de al menos 30 psi y con al menos 1 ciclo. Tras enfriar en nevera (4-8 °C) durante 15 minutos, las nanopartículas obtenidas se lavan centrifugando 3 veces a 3000 rpm durante 20 minutos utilizando filtros Amicon® Ultra (Millipore).
Ejemplo 5. Preparación de nanopartículas con polisacárido y sin péptido mediante la técnica de homogeneización a alta presión (Formulación 5).
Nanopartículas lipídicas:
Se funden 100 mg de precirol calentando a 70 °C. Por otro lado, se prepara una disolución acuosa de DOTAP al 0,4 % y Tween 80 al 0,1 %. Se prepara una pre-emulsión añadiendo la fase acuosa (10mL) sobre el lípido fundido,
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sometiendo la mezcla a una fuerte agitación hasta obtener una emulsión. A continuación se somete la mezcla a homogeneización a alta presión en caliente con una presión de al menos 30 psi y con al menos 1 ciclo. Tras enfriar en nevera (4-8 °C) durante 15 minutos, las nanopartículas obtenidas se lavan centrifugando 3 veces a 3000 rpm durante 20 minutos utilizando filtros Amicon® Ultra (Millipore).
Complejos dextrano:pCMS-EGFP
Se prepara una solución acuosa mediante disolución del plásmido pCMS-EGFP (1 µg/µl) en agua destilada. Por otra parte, se prepara otra solución acuosa mediante disolución de dextrano (1 µg/µl) de aproximadamente 3200 (suministrado por Sigma) en agua destilada.
Se ponen en contacto las dos disoluciones con una proporción dextrano:pCMS-EGFP: de 5:1 y se mantiene en agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, se pone en contacto la suspensión de nanopartículas con la disolución que contiene el complejo formado con el material genético, en una proporción 5:1 (expresado como la relación peso/peso entre el DOTAP y el ADN) y se mantiene en agitación durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Ejemplo 6. Preparación de nanopartículas con polisacárido y con péptido mediante la técnica de homogeneización a alta presión (Formulación 6).
Nanopartículas lipídicas
Se funden 100 mg de precirol calentando a 70 °C. Por otro lado, se prepara una disolución acuosa de DOTAP al 0,4 % y Tween 80 al 0,1 %. Se prepara una preemulsión añadiendo la fase acuosa (10ml) sobre el lípido fundido, sometiendo la mezcla a una fuerte agitación hasta obtener una emulsión. A continuación se somete la mezcla a homogeneización a alta presión en caliente con una presión de al menos 30 psi y con al menos 1 ciclo. Tras enfriar en nevera (4-8 °C) durante 15 minutos, las nanopartículas obtenidas se lavan centrifugando 3 veces a 3000 rpm durante 20 minutos utilizando filtros Amicon® Ultra (Millipore).
Complejos dextrano:protamina:pCMS-EGFP
Se prepara una solución acuosa mediante disolución del plásmido pCMS-EGFP (1 µg/µl) en agua destilada. Por otra parte, se prepara otra solución acuosa mediante disolución de dextrano de aproximadamente 3200 (suministrado por Sigma) (1 µg/µl) en agua destilada. Adicionalmente, se prepara otra solución acuosa mediante disolución de protamina (1 µg/µl) en agua destilada.
Se ponen en contacto las tres disoluciones con una proporción dextrano:protamina:pCMS-EGFP de 1:2:1 y se mantiene en agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, se pone en contacto la suspensión de nanopartículas con la disolución que contiene el complejo formado con el material genético, en una proporción 5:1 (expresado como la relación peso/peso entre el DOTAP y el ADN) y se mantiene en agitación durante 15 minutos a temperatura ambiente.
La tabla I muestra el tamaño de partícula y la carga superficial de las 6 formulaciones anteriores:
- Formulación
- Tamaño de partícula (nm) Carga superficial (mV)
- Formulación 1
- 308 ± 6,8 +32,4 ± 0,5
- Formulación 2
- 311 ± 20,1 +32 ± 1,8
- Formulación 3
- 248,5 ± 7,87 +38 ± 1,0
- Formulación 4
- 224,7 ± 2,61 +31,2 ± 4,2
- Formulación 5
- 226,3±3,04 +29,8±2,3
- Formulación 6
- 210±3,62 +34,2±2,8
Ejemplo 7. Preparación de nanopartículas con polisacárido y con péptido mediante la técnica de emulsificación/evaporación del solvente (Formulación 7).
Nanopartículas lipídicas:
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Se prepara una solución acuosa mediante disolución del plásmido pCMS-EGFP (1 µg/µl) en agua destilada. Por otra parte, se prepara otra solución acuosa mediante disolución de heparina (1 µg/µl) en agua destilada. Adicionalmente, se prepara otra solución acuosa mediante disolución de protamina (1 µg/µl) en agua destilada.
Se ponen en contacto las tres disoluciones con una proporción heparina:protamina:pCMS-EGFP de 0,1:2:1 y se mantiene en agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, se pone en contacto la suspensión de nanopartículas con la disolución que contiene el complejo formado con el material genético, en una proporción 5:1 (expresado como la relación peso/peso entre el DOTAP y el ADN) y se mantiene en agitación durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Ejemplo 13. Preparación de nanopartículas con polisacárido y sin péptido mediante la técnica de emulsificación/evaporación del solvente (Formulación 13).
Nanopartículas lipídicas:
Se prepara una disolución de precirol al 5 % en diclorometano. Por otro lado, se prepara una disolución acuosa de DOTAP al 0,4 % y Tween 80 al 0,1 %. Se añade la fase acuosa sobre la fase oleosa en una relación 1:5 y se somete la mezcla a sonicación (Branson Sonifier 250, Danbury) durante 30 s a 50W. A continuación se procede a la evaporación del solvente orgánico, manteniendo la emulsión durante 5 minutos en agitación mecánica, sometiéndola posteriormente a vacío durante 15 minutos. Tras enfriar en nevera (4-8 °C) durante 15 minutos, las nanopartículas obtenidas se lavan centrifugando 3 veces a 3000 rpm durante 20 minutos utilizando filtros Amicon® Ultra (Millipore).
Complejos ácido hialurónico:pCMS-EGFP
Se prepara una solución acuosa mediante disolución del plásmido pCMS-EGFP (1 µg/µl) en agua destilada. Por otra parte, se prepara otra solución acuosa mediante disolución de ácido hialurónico (1 µg/µl) en agua destilada.
Se ponen en contacto las dos disoluciones con una proporción ácido hialurónico:pCMS-EGFP de 0,1:1 y se mantiene en agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, se pone en contacto la suspensión de nanopartículas con la disolución que contiene el complejo formado con el material genético, en una proporción 5:1 (expresado como la relación peso/peso entre el DOTAP y el ADN) y se mantiene en agitación durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Ejemplo 14. Preparación de nanopartículas con polisacárido y sin péptido mediante la técnica de emulsificación/evaporación del solvente (Formulación 14).
Nanopartículas lipídicas:
Se prepara una disolución de precirol al 5 % en diclorometano. Por otro lado, se prepara una disolución acuosa de DOTAP al 0,4 % y Tween 80 al 0,1 %. Se añade la fase acuosa sobre la fase oleosa en una relación 1:5 y se somete la mezcla a sonicación (Branson Sonifier 250, Danbury) durante 30 s a 50W. A continuación se procede a la evaporación del solvente orgánico, manteniendo la emulsión durante 5 minutos en agitación mecánica, sometiéndola posteriormente a vacío durante 15 minutos. Tras enfriar en nevera (4-8 °C) durante 15 minutos, las nanopartículas obtenidas se lavan centrifugando 3 veces a 3000 rpm durante 20 minutos utilizando filtros Amicon® Ultra (Millipore).
Complejos heparina de bajo peso molecular:pCMS-EGFP
Se prepara una solución acuosa mediante disolución del plásmido pCMS-EGFP (1 µg/µl) en agua destilada. Por otra parte, se prepara otra solución acuosa mediante disolución de heparina de bajo peso molecular (1 µg/µl) en agua destilada.
Se ponen en contacto las dos disoluciones con una proporción heparina de bajo peso molecular:pCMS-EGFP de 0,1:1 y se mantiene en agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, se pone en contacto la suspensión de nanopartículas con la disolución que contiene el complejo formado con el material genético, en una proporción 5:1 (expresado como la relación peso/peso entre el DOTAP y el ADN) y se mantiene en agitación durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Ejemplo 15. Capacidad de protección del ADN frente a DNAsa I y liberación inducida con SDS.
Para conocer la capacidad de protección de las formulaciones sobre el ADN, se utilizó la enzima desoxirribonucleasa I (DNsa I) que es capaz de hidrolizar las moléculas de ADN. Las formulaciones 1-6 se pusieron en contacto con DNAsa durante 30 minutos a 37 °C. Se utilizó 1 U de DNAsa por cada 2,5 µg de ADN. Pasados los 30 minutos, se añadió lauril sulfato sódico (SDS) hasta una concentración final del 1 %, para detener la acción de la enzima y liberar el ADN de las muestras. Las muestras se analizan posteriormente en un gel de agarosa como se ha definido anteriormente en los procedimientos comunes.
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