BR102021022280A2 - Processo de obtenção de sistemas nanoestruturados, cristais líquidos do tipo lamelar de forma estável, uso dos referidos cristais líquidos, processo de obtenção de nanopartículas de albumina, as referidas nanopartículas de albumina e usos das nanopartículas de albumina - Google Patents

Abstract

A presente invenção propõe o desenvolvimento de dois tipos de sistemas nanoestruturados para a incorporação, veiculação e administração de seriniquinona, uma substância com ação anticâncer e baixa solubilidade em água (0,06 μM). Em uma primeira modalidade é revelado um processo de obtenção formado por cristais líquidos do tipo lamelar de forma estável, desenvolvidos a partir de lipídios e solventes por fusão, homogeneização e ultrassonicação em haste, permitindo a veiculação da seriniquinona por via tópica para o tratamento do melanoma. Em uma segunda modalidade, é revelado outro processo capaz de obter de nanopartículas de albumina preparadas através de dessolvatação, o que permite a incorporação e a veiculação da seriniquinona, bem como seu direcionamento ao microambiente tumoral e a sua posterior captação pela célula transformada, para administração sistêmica. Adicionalmente a presente invenção contempla os produtos obtidos pelos referidos processos e o uso das nanopartículas de albumina como agente antifúngico para infecções fúngicas mucocutâneas e sistêmicas.

Description

PROCESSO DE OBTENÇÃO DE SISTEMAS NANOESTRUTURADOS, CRISTAIS LÍQUIDOS DO TIPO LAMELAR DE FORMA ESTÁVEL, USO DOS REFERIDOS CRISTAIS LÍQUIDOS, PROCESSO DE OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE ALBUMINA, AS REFERIDAS NANOPARTÍCULAS DE ALBUMINA E USOS DAS NANOPARTÍCULAS DE ALBUMINA CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se insere no campo da nanobiotecnologia, uma vez que se refere ao processo de obtenção de dois sistemas nanoestruturados, o primeiro formado por géis de cristais líquidos do tipo lamelar de forma estável, que permite a veiculação da seriniquinona por via tópica para o tratamento do melanoma e o segundo formado por nanopartículas de albumina, que permite a incorporação e a veiculação da seriniquinona por diversas vias, bem como seu direcionamento ao microambiente tumoral e a sua posterior captação pela célula.

[002] Adicionalmente, a presente invenção possibilita o uso para estudos pré-clínicos no tratamento de melanoma e infecções fúngicas mucocutâneas e sistêmicas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] A seriniquinona (SQ), de fórmula molecular C20H8O4S e de massa molar 344 g/mol, é uma quinona inicialmente descrita como produto da reação de 2,3-dicloro1,4-naftoquinona com ditioxamida (Matsuoka et al., 1991).

[004] A mesma molécula também foi obtida como um metabólito secundário de uma bactéria marinha Gram-positiva rara (actinobactéria), Serinicoccus sp. (CNJ927) que foi recuperada de amostras de sedimentos coletados a uma profundidade de 50m na região da República do Palau em 2004. O rendimento da produção de SQ pela bactéria em meio de cultura líquido é de 0,067 mg/L, devido ao baixo rendimento, a SQ vem sendo obtida por síntese química para condução de ensaios biológicos. A substância foi divulgada em 30 de janeiro de 2014 por meio da patente WO 2014/018919 Al e do manuscrito na revista Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (Trzoss et al., 2014). Ambos os documentos contêm detalhamentos da síntese química do composto de SQ e, atualmente, ele é disponível comercialmente em diversas fontes.

[005] Os primeiros estudos da atividade anticâncer da SQ demonstraram, por meio de testes in vitro, elevada atividade citotóxica e seletividade para linhagens de melanoma (Trzoss et al., 2014). Apesar de ter se apresentado muito promissora para o tratamento de melanoma por conta de um possível mecanismo de ação novo e alvo farmacológico nunca modulado, a SQ apresenta baixa solubilidade em água (0,06 μM), o que impede a progressão de estudos pré-clínicos e clínicos envolvendo essa substância.

[006] Nos estudos publicados em 2014, foi observado que a SQ apresentou ação contra células de câncer, por meio de testes utilizando o painel de linhagens celulares do National Cancer Institute - NCI-60, e predominante atividade para células de melanoma. Em relação ao seu mecanismo de ação, foi observado que a SQ se liga à proteína dermicidina e promove, por meio de mecanismos que ainda não foram completamente elucidados, a indução de autofagocitose e, em seguida, morte celular por apoptose (Trzoss et al., 2014). A dermicidina (gene DCD), por sua vez, é um peptídeo de 110 aminoácidos de função antimicrobiana bem estabelecida da literatura (Schittek, 2012), sendo secretada no suor e processada em peptídeos menores, a fim de promover a defesa inata da pele. Ainda, outros peptídeos derivados da clivagem da dermicidina, como o Y-P30 e o PIF, estão envolvidos com a sobrevivência celular de neurônios e de células tumorais, como no melanoma, e com a caquexia, respectivamente (Hirata et al., 2021). Há de se ressaltar que a SQ é a única molécula conhecida capaz de se ligar e modular a expressão de tal proteína que, até então, não era considerada um alvo terapêutico.

[007] Considerando a escassez de tratamentos efetivos para o melanoma, é de grande interesse o desenvolvimento de novas possibilidades terapêuticas. O tratamento atual disponível para o melanoma é realizado principalmente por meio de ressecção cirúrgica, quimioterapia e imunoterapia, entretanto há duas principais limitações: os efeitos adversos, como a toxicidade decorrente de reações imunes e da baixa especificidade às células tumorais e a resistência, observada nas diversas formas de tratamento (Domingues et al., 2018). Diante disso, uma possível solução para eliminar esses gargalos na terapia do melanoma é a introdução na clínica de novos fármacos antineoplásicos com diferentes propriedades farmacológicas, como é o caso da SQ. Entretanto, o processo tradicional de pesquisa e desenvolvimento (P&D) de novos medicamentos, principalmente daqueles baseados em produtos naturais, é longo e repleto de obstáculos, como a baixa solubilidade em água de novas entidades farmacêuticas, observada na SQ (Apolinário et al., 2020a). Em razão disso, no trabalho publicado por Hammons et al., 2019, foram explorados o desenho e a síntese de novas moléculas baseadas na estrutura química da SQ (protótipo) com o intuito de melhorar a solubilidade da substância em água (0,06 μM em pH 6,5), de atingir a pureza isomérica e de manter ou aumentar a citotoxicidade da molécula original. As modificações moleculares realizadas geraram novos análogos da SQ com solubilidades melhoradas, entretanto, os derivados mais solúveis eram aqueles de misturas racêmicas, sendo um problema para futuras aplicações clínicas que visam substâncias enantiomericamente puras. Já os análogos puros obtiveram uma pequena perda da atividade biológica quando comparada a SQ.

[008] Sendo assim, tendo em vista os dados apresentados até então e o mecanismo de ação ímpar, ainda valem os esforços para melhorar a solubilidade da SQ por outras metodologias. Foi explorada, então, a aplicação da nanotecnologia, que, dentre diversas funções, pode proporcionar um aumento de solubilidade aparente de fármacos hidrofóbicos e um direcionamento da substância ativa ao tecido alvo (Kumar et al., 2013). Tal estratégia, que tem se mostrado promissora para melhorar propriedades farmacocinéticas para aplicações terapêuticas em diversas doenças, foi impulsionada na medicina a partir da década de 1990, tendo, do período de 1974 a 2015, cerca de 47 novos medicamentos baseados em nanotecnologia aprovados pelo US Food and Drug Administration - FDA, sendo a maioria deles voltada para o tratamento do câncer (D’Mello et al., 2017). Dentre eles, há o Doxil®, que consiste em doxorrubicina lipossomal, um dos primeiros medicamentos baseados em nanotecnologia, utilizado no tratamento de câncer de ovário, mama e sarcoma de Kaposi; e o Abraxane®, constituído de paclitaxel encapsulado em nanopartículas de albumina, administrado no tratamento do câncer de mama e de pâncreas (Vieira & Gamarra, 2016).

[009] Para o tratamento das micoses, há a anfotericina B - um antifúngico de largo espectro de ação, mas altamente tóxico - incorporada em lipossomas (AmBisome ®), que resultou em uma redução importante dos efeitos adversos por direcionar o fármaco para o alvo da célula fúngica permitindo o aumento da dose e do tempo de tratamento das micoses sistêmicas (Stone et al., 2016).

[010] Esses exemplos bem-sucedidos motivaram o desenvolvimento de nanoformulações para incorporação e administração da SQ, a fim de permitir estudos clínicos translacionais para avaliação de sua eficácia em pacientes. Além de permitir o uso no câncer melanoma, discutido até este momento, demonstrou-se nesta invenção a atividade antifúngica do composto, não descrita anteriormente. Assim, as nanoformulações desenvolvidas podem aplicar-se também ao tratamento de infecções fúngicas da pele, unha e mucosas, no caso dos géis para administração tópica, assim como de micoses sistêmicas, no caso das nanopartículas de albumina.

ESTADO DA TÉCNICA

[011] No estado da técnica existem diversos trabalhos relacionados à obtenção de nanoformulações baseadas em sistemas lipídicos que, dentre suas diversas propriedades e funções, permitem a incorporação, dissolução, administração e direcionamento de fármacos.

[012] Comparada com o pedido de patente BR 1020190185015 A2, intitulado “FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA E SEU USO”, a presente invenção diferencia-se pela estrutura interna e propriedades macroscópicas. Enquanto a formulação anterior é um líquido isotrópico, estruturado na forma de microemulsão sem água e voltado para administração parenteral de um retinoide, a formulação descrita nesta invenção é um gel de estrutura lamelar voltado para aplicação tópica. O sistema lamelar apresenta como vantagens em relação à microemulsão o conteúdo de água, que é considerado muito importante para aumento da atividade termodinâmica de compostos lipofílicos e promoção da penetração cutânea, essencial para o tratamento tópico adjuvante do melanoma (Otto et al. 2009); a permissão de incorporação do DMSO com a dupla função de auxiliar na solubilização da SQ, possibilitando o aumento da quantidade de SQ incorporada em 2 (duas) vezes, e de atuar como promotor de absorção (Apolinário et al., 2020a; Woodford & Barry, 1986); a apresentação macroscopicamente como um gel, que por ser mais viscoso que a microemulsão, permite administração tópica sem que a formulação escorra e sem necessitar de aditivos poliméricos para geleificação (como ocorre com as microemulsões) (Friberg, 1990); e a fase lamelar que apresenta estrutura semelhante à pele e é capaz de prolongar a liberação de compostos, permitindo a formação de depósitos na pele (Rajak et al., 2019; Guo et al., 2010).

[013] Com relação ao documento de patente BR 10 2019 018500 7, intitulado “FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA E SEU USO”, a presente invenção se diferencia também pela estrutura interna da mesofase formada. A referida patente BR 10 2019 018500 7 é baseada no lipídio polar monoleína (embora também contenha fosfatidilcolina e tricaprilina como a presente) e estrutura-se na forma de microemulsão. Além disso, a geometria molecular da monoleína leva à formação de um sistema hexagonal quando exposto à água, mais viscoso e de liberação mais lenta do que o aqui proposto. A monoleína promove efeitos irritativos mais exacerbados comparado à fosfatidilcolina devido à sua capacidade de intumescimento, retirando água intersticial (Lopes et al., 2005).

[014] No que se refere à invenção BR 10 2021 0024933, que também contém fosfatidilcolina, a presente formulação diferencia-se não só quanto à composição como também quanto à estrutura. A invenção anterior é composta por etossomas, vesículas lipídicas contendo álcool e de base aquosa.

[015] A importância prática da quimioterapia do melanoma por meio da via tópica, apesar de ser uma neoplasia altamente metastática, já tem sido investigada com o imiquimode, quimioterápico tópico aprovado para outros tipos de cânceres, inclusive o câncer de pele carcinoma basocelular (Fan et al., 2015). Tal estratégia terapêutica visa, principalmente, o tratamento de melanoma e das margens do local do câncer após a excisão cirúrgica (Pandit et al., 2015; Swetter et al., 2015). Ainda, a exploração da administração tópica como uma via alternativa, que não envolve a utilização de agulhas e idas a centros de atenção à saúde, apresenta como vantagem uma possível maior adesão ao tratamento por parte dos pacientes. Um outro benefício diz respeito ao fato de que tratamentos capazes de promover a localização e/ou direcionamento de fármacos ao sítio alvo e sua liberação sustentada também reduzem a frequência de administração e contornam os possíveis efeitos adversos sistêmicos dos fármacos (Carey & Burish, 1988; Rehman et al., 2013). Ainda, a administração tópica contorna e evita limitações relacionadas à administração oral, como o metabolismo hepático de primeira passagem e eventuais problemas com a baixa biodisponibilidade (Kim et al., 2015). Tendo em vista essas vantagens, valem-se os esforços para a progressão do desenvolvimento dos sistemas de fase lamelar para a administração tópica da SQ.

[016] Apesar de esses sistemas poderem ser utilizados para o tratamento de estágios não invasivos do melanoma, essa neoplasia é altamente metastática; ainda, apenas 25% dos pacientes com um quadro de disseminação sistêmica desse tumor sobrevivem após 5 anos do diagnóstico inicial (American Cancer Society, 2020). Assim sendo, há urgência quanto à necessidade de se desenvolver novas estratégias que possibilitem o tratamento do melanoma metastático. Diante desse cenário e do Abraxane® como um exemplo de nanotecnologia de sucesso atualmente comercializada, a presente invenção desenvolve nanopartículas de albumina para a incorporação, veiculação e direcionamento da SQ. O Abraxane®, aprovado em 2005 pelo USFDA e em 2017 pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) do Brasil, consiste em uma alternativa à administração de paclitaxel na forma de Taxol® (USFDA; Anvisa). O Taxol®, por sua vez, é uma formulação convencional que contém etanol e óleo de castor polioxietilado (Cremophor EL), responsável não só pela dissolução e veiculação do paclitaxel, como pelo favorecimento da ocorrência de neuropatia e de reações de hipersensibilidade. Além disso, a presença de Cremophor EL na formulação promove a lixiviação de componentes do plástico contendo a formulação a ser administrada, quando feito de policloreto de vinila (PVC), levantando-se a necessidade de outros tipos de embalagem para o armazenamento e a administração do fármaco (Miele et al., 2009; Stinchcombe, 2007). Por conta disso, as nanopartículas de albumina foram a estratégia selecionada para promover a administração do paclitaxel, justamente por serem carreadores macromoleculares muito atrativos por serem estáveis, biodegradáveis, atóxicos, não imunogênicos e por apresentarem diferentes sítios de ligação/interação a moléculas de interesse (Elzoghby et al., 2012).

[017] Ainda no caso do Abraxane®, essas nanopartículas permitem um direcionamento passivo do fármaco, já que, quando livre, a substância pode se difundir a diversos tecidos e, quando encapsulado em nanopartículas, que apresentam maior tamanho, elas dificilmente atravessam o endotélio dos vasos de tecidos saudáveis, reduzindo, assim, a chance de ocorrência de efeitos adversos. No entanto, esses nanocarreadores podem se acumular no microambiente de tumores sólidos por conta dos capilares altamente permeáveis gerados pela angiogênese e pela drenagem linfática prejudicada do tecido, contornando, assim, possíveis efeitos adversos oriundos da administração sistêmica (Peer et al., 2020; Allen & Cullis, 2004). Um outro mecanismo que favorece o direcionamento da albumina associada ao paclitaxel ao microambiente tumoral é a sua ligação à glicoproteína 60 (gp60), que facilita a transcitose do complexo albuminapaclitaxel através das células endoteliais adjacentes aos tumores (Desai et al., 2006; Simionescu, 2002; John et al., 2003).

[018] Além desses fatores fisiopatológicos, as nanopartículas de albumina podem ser sequestradas por proteínas superexpressas pelas células tumorais, como a proteína ácida e rica em cisteína secretada (SPARC - secreted protein acidic and rich in cysteine), o que contribui ainda mais para o efeito de retenção das nanopartículas (Yardley, 2013). Com esse acúmulo dos nanocarreadores, uma hipótese seria que o fármaco possa chegar mais facilmente ao seu alvo intracelular por meio da internalização da proteína a ser endocitada por meio da via da caveolina-1, promovendo a degradação lisossomal da albumina, a ser usada como fonte de energia para o crescimento desenfreado do tumor e a consequente liberação do fármaco na célula (Stehle et al., 1997; Chatterjee, 2017).

[019] Assim sendo, diante de todas essas vantagens previamente descritas para o paclitaxel, o desenvolvimento de nanopartículas de albumina para a administração intravenosa de SQ é uma opção bastante ambiciosa frente à baixa solubilidade dessa substância e ao cenário do melanoma como um câncer altamente metastático. As nanopartículas contempladas pela presente invenção são preparadas utilizando-se o método de dessolvatação, também chamado de coacervação, e polimerização, o que já as difere do Abraxane® (ou nab-paclitaxel), dado que esse medicamento é preparado utilizando-se a técnica de homogeneização em alta pressão. A dessolvatação consiste no gotejamento de etanol sobre uma solução aquosa contendo albumina, até a separação de fases decorrente da redução da solubilidade da proteína em água por conta da presença do etanol, o que é evidenciado por meio da turbidez gerada no sistema após a adição do solvente.

[020] Com esse gotejamento, são formados coacervados de albumina, que podem facilmente se dissolver em água novamente. Por isso, eles devem ser estabilizados através de métodos de reticulação. Nesta invenção, foram comparadas (i) adição de glutaraldeído nos sistemas, que, por meio de seu grupo aldeído, promove a formação de ligações cruzadas (crosslinking) entre o grupo amino de resíduos de lisina e a porção guanidina da cadeia lateral de resíduos de arginina, presentes na estrutura primária da albumina (Elzoghby et al., 2012); (ii) alta temperatura (60-70ºC) e (iii) o uso de glicose como agente reticulante com exposição à luz ultravioleta (UV). (Weber et al., 2000; Niknejad & Mahmoudzadeh, 2015). A vantagem da reticulação é que a estrutura da nanopartícula se manteria in vivo, ao contrário da tecnologia do nab-paclitaxel, para a qual, logo após a administração, é observada a redispersão individual da albumina associada ao paclitaxel na corrente sanguínea, que passa a transportar o fármaco como a proteína endógena o faria (Gradishar, 2006). É antecipado que, por conta do crosslinking das nanopartículas, alguns processos farmacocinéticos sejam diferentes em relação ao que já foi descrito ao Abraxane®.

[021] O método utilizado para desenvolver as nanopartículas desta patente foi inicialmente baseado nos estudos de Weber et al. (2000) e Galisteo-González & MolinaBolívar (2014). Nesses estudos, inicialmente, a albumina foi diluída (humana - HSA - ou bovina - BSA) em água ou tampão numa concentração variando de 50 a 100 mg/mL. Depois disso, 4 mL de etanol foram gotejados a cada mL de água ou tampão adicionado previamente a fim de promover a dessolvatação, e volumes variáveis de glutaraldeído foram adicionados a 3 ou a 8% para proporcionar a reticulação (crosslinking) das proteínas e a solução foi deixada em agitação por 8 ou 24h. Passado esse tempo, as amostras eram purificadas por três ciclos de centrifugação a 14000 rpm por 30 minutos a 20ºC, a fim de se remover o etanol e o glutaraldeído, e os experimentos de caracterização subsequentes foram realizados. Diversos parâmetros não foram reproduzidos nos experimentos, tais como a massa de albumina, o volume de etanol e o uso de tampão nas formulações, evidenciando a necessidade de nova padronização dos processos de produção.

[022] Ainda, como mencionado brevemente, a presente invenção traz informações inéditas da ação antifúngica da SQ. Embora os antifúngicos sejam muito utilizados na prática clínica das micoses, eles possuem algumas limitações, dentre elas o aumento de isolados clínicos resistentes às três (3) principais classes de antifúngicos (polienos, equinocandinas e azóis) (Perlin et al., 2017; Lee et al., 2020). Adicionalmente, os antifúngicos convencionais são fármacos que possuem um espectro de ação limitado, são muito tóxicos para o hospedeiro, possuem baixa estabilidade química, baixa solubilidade em água, pouca absorção pelo sistema gastrointestinal, financeiramente não são acessíveis e são disponíveis poucas opções medicamentosas de uso oral (www.gaffii.org; Perfect et al., 2010; Pappas et al., 2016). Dessa forma, faz-se necessário a busca de novas estratégias terapêuticas (ex. novas entidades químicas e formulações) para ampliar as opções na terapia das micoses, principalmente causadas por isolados multirresistentes e, também, reduzir os problemas de toxicidade, de resistência, e farmacocinéticas dos atuais antifúngicos. Um agente é considerado inovador quando cumpre alguns critérios como a ausência de resistência cruzada ao antimicrobiano existente, nova classe química, novo alvo na célula microbiana e novo mecanismo de ação (Who, 2017). Portanto, este documento descreve outra aplicação farmacológica da SQ, a atividade antifúngica; além da possibilidade da utilização das nanoformulações no tratamento das micoses.

[023] O documento de patente US 9 481 662 (B2) intitulado “SERINIQUINONES, MELANOMA-SPECIFIC ANTICANCER AGENTS” refere-se à substância seriniquinona e derivados. O referido documento revela análogos da molécula e seus usos como agentes anticâncer, em particular melanoma. Adicionalmente, o documento revela formulações, formulações lipossomais e de uso tópico ou sistêmico.

[024] Embora o referido documento mencione que essas substâncias possam “ser incorporadas em lipossomas ou administrados por meio de bombas transdérmicas ou adesivos”, não há menção sobre como isso pode ser feito. Como descrito na presente invenção, foram feitas tentativas para incorporar a seriniquinona em vesículas lipossomais, contudo, não foi possível a concretização devido à baixa solubilidade da molécula e sua precipitação na formulação. No caso de câncer de pele, um dos objetivos da presente invenção é a administração tópica, a fim de possibilitar a maior concentração do composto na pele e não sua absorção transdérmica. Destacam-se importantes diferenças entre o referido documento e a presente invenção: a presente invenção não só cita a utilização de sistemas nanoestruturados para a incorporação, veiculação e administração de seriniquinona, mas descreve as etapas de produção dos respectivos sistemas, detalhando aqueles que não deram certo a fim de mostrar que a veiculação da molécula em nanoformulações não é trivial. Adicionalmente, entre todas as opções citadas, não há relatos de fases líquido-cristalinas nem nanopartículas baseadas em proteínas. Além disso, não é demonstrada a atividade antifúngica como descrita na presente invenção.

[025] O documento científico intitulado “EXPLORING THE BENEFITS OF NANOTECHNOLOGY FOR CANCER DRUGS IN DIFFERENT STAGES OF THE DRUG DEVELOPMENT PIPELINE” refere-se ao uso da nanotecnologia para auxiliar o desenvolvimento de tratamentos anticâncer. O documento descreve sobre a seriniquinona como um produto natural citotóxico, seletivo para melanoma que, apesar de sua eficácia comprovada, possui problemas referentes a sua solubilidade, o que prejudica o desenvolvimento efetivo de medicamentos. Adicionalmente, o documento revela possíveis estratégias como: acomodar a SQ em compartimentos não polares de nanotransportadores, como a bicamada de estruturas vesiculares como lipossomas ou polimeromas, o núcleo hidrofóbico de micelas e a matriz hidrofóbica de nanopartículas lipídicas, bem como em formulações em massa nanoestruturadas como fases líquidocristalinas para entrega tópica.

[026] Contudo, a presente invenção, não apenas cita os sistemas nanoestruturados, mas descreve os métodos para incorporação de seriniquinona nos sistemas, revelando etapas específicas nas quais a seriniquinona é incorporada, com relato das camadas da pele nas quais é possível se levar a molécula. Além disso, a presente invenção revela a tentativa de incorporar a seriniquinona em vesículas lipossomais e nanopartículas lipídicas, o que não foi possível devido à baixa solubilidade da molécula e sua precipitação na formulação. Embora o referido documento mencione formulações em massa nanoestruturadas como fases líquido-cristalinas para entrega tópica, não especifica como isso pode ser feito.

[027] O documento científico intitulado “ADVANCE OF SERINIQUINONE ANALOGUES AS MELANOMA AGENTS” refere-se à atividade da molécula de seriniquinona, fornecendo uma estratégia, através da modificação da estrutura química, para preparar análogos que retêm a atividade e oferecem uma melhor solubilidade. Desta forma, não há menção à atividade antifúngica conforme descrita na presente invenção e, ainda, a presente invenção não contempla nenhuma modificação proposital da estrutura química da seriniquinona.

[028] O documento científico intitulado “ALBUMINBASED NANOPARTICLES AS POTENTIAL CONTROLLED RELEASE DRUG DELIVERY SYSTEMS”, se refere ao estudo sobre a fabricação de nanopartículas de albumina para entrega de fármacos insolúveis e discute métodos para obtenção de nanopartículas de albumina. O referido documento não especifica fármacos a serem encapsulados, apenas dá exemplos gerais de antitumorais que já foram estudados. A seriniquinona não figura dentre esses exemplos. Além disso, como demonstrado na presente invenção, a obtenção das nanopartículas na presença da seriniquinona não seguiu a literatura clássica. Foi realizado um longo processo padronizando a variação de parâmetros, como o volume de etanol no método de dessolvatação, massa de albumina e tempo de agitação. Além disso, foi demonstrado que as reações podem alterar a estrutura da molécula. Quando empregada a reticulação com glutaraldeído, verificou-se mudança de coloração, muito embora a nanopartícula tenha atividade antitumoral.

[029] O documento científico intitulado “APPLICATION OF SURFACTANTS IN SOLID DISPERSION TECHNOLOGY FOR IMPROVING SOLUBILITY OF POORLY WATER SOLUBLE DRUGS” refere-se ao estudo capaz de melhorar a solubilidade de fármacos. O documento descreve que a adição de surfactantes à formulação não só aumenta a miscibilidade do fármacopolímero, mas também reduz a recristalização, melhora a molhabilidade da dispersão sólida e promove o aumento da dissolução e estabilidade física.

[030] Entretanto, o referido documento descreve técnicas não relatadas na invenção, como o preparo de dispersões sólidas com tensoativos por meio de secagens em spray dryer, liofilizador, extrusão hot melt a fim de aumentar a solubilidade de compostos. Na presente invenção, por outro lado, não está descrita nenhuma técnica de secagem e nem o uso de tensoativos para dispersões sólidas. Descreveu-se sistemas líquido-cristalinos e nanopartículas de albumina que, embora possam empregar tensoativos para estabilização em alguns casos (não na presente invenção), apresentam estrutura diferente do descrito no referido documento.

[031] O documento científico intitulado “LECITHIN BASED LAMELLAR LIQUID CRYSTALS AS A PHYSIOLOGICALLY ACCEPTABLE DERMAL DELIVERY SYSTEM FOR ASCORBYL PALMITATE” refere-se ao desenvolvimento e caracterização de sistemas de liberação dérmica, compatíveis com a pele, com uma estrutura líquido-cristalina para melhorar a solubilidade de fármacos pouco solúveis.

[032] Todavia, o referido documento não descreve moléculas antitumorais como a seriniquinona. Adicionalmente, há diferenças na composição, com por exemplo, a presente invenção não utiliza Tween 80 para auxiliar a formação de fase, é utilizada a fosfatidilcolina como único lipídio formador de fase combinada com um triglicerídeo de cadeia média, que auxilia na estabilização de sistemas lipídicos nanodispersos, ocorre ainda a solubilização de fármacos apolares, e propilenoglicol como umectante e modulador de viscosidade. Muito embora fases líquido-cristalinas de fosfatidilcolina sejam conhecidas, há bastante debate a respeito da concentração necessária no sistema devido à sua instabilidade e custo. Na presente invenção, ao adicionar um triglicerídeo de cadeia média e propilenoglicol, pode-se reduzir a quantidade de fosfatidilcolina sem prevenir a formação da fase desejada.

[033] O documento científico intitulado “LECITHIN BASED LAMELLAR LIQUID CRYSTALS AS A PHYSIOLOGICALLY ACCEPTABLE DERMAL DELIVERY SYSTEM FOR ASCORBYL PALMITATE” refere-se ao desenvolvimento de sistemas de liberação dérmica, compatíveis com cosméticos tópicos. Ainda, os cristais líquidos lamelares formados por lecitina (semelhante à estrutura lipídica do estrato córneo da pele), são adotados como carreadores para melhorar a solubilidade de fármacos pouco solúveis. Entretanto, o referido documento é estruturalmente distinto do proposto na presente invenção, que possui uma fase bulk, ou seja, contínua e não fragmentada com ajuda de tensoativos e fornecimento de energia. O método de preparação envolve etapas diferentes, como a dispersão em turrax e ajuste de pH.

[034] O documento científico intitulado “ANTICANCER COMPOSITION CONTAINING NAPHTHOQUINONE-BASED COMPOUND FOR INTESTINE DELIVERY SYSTEM” refere-se à uma composição farmacêutica contendo compostos à base de naftoquinonas, que apresentam efeitos benéficos ao tratamento de câncer, doenças infecciosas fúngicas e/ou doenças dermatológicas.

[035] Contudo, nenhum dos sistemas descritos na presente invenção visa direcionamento para o intestino e consequentemente, apresentam uma composição diferente. Além disso, o referido documento faz menção à preparação de lapachona e não seriniquinona.

[036] Assim, a presente invenção permite contornar a baixa solubilidade em água da seriniquinona, uma vez que desenvolve nanoformulações baseadas em sistemas lipídicos que, dentre suas diversas propriedades e funções, permitem a incorporação, dissolução e administração da SQ. Dentre mais de 20 formulações avaliadas, tornou-se possível a incorporação da SQ em dois sistemas nanoestruturados formados por cristais líquidos do tipo lamelar de forma estável, permitindo sua veiculação por via tópica para o tratamento do melanoma. Adicionalmente, tendo em vista que o melanoma é uma doença altamente metastática, a invenção revela, ainda, a possibilidade de administração sistêmica da seriniquinona e, para isso, apresenta nanopartículas de albumina, que permitem a incorporação e a veiculação da SQ, bem como seu direcionamento ao microambiente tumoral e a sua posterior captação pela célula transformada. Por fim, a presente invenção também demonstra a atividade antifúngica da seriniquinona, o que possibilita o seu uso em formulações para o tratamento de infecções fúngicas mucocutâneas e sistêmicas.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[037] A presente invenção revela sistemas nanoestruturados para a incorporação, veiculação e administração de seriniquinona, uma substância com ação anticâncer no tratamento de melanoma e, também, atividade antifúngica, o que possibilita o seu uso em formulações para tratamento de infecções fúngicas mucocutâneas e sistêmicas.

[038] Deste modo, a presente invenção em suas primeira e segunda modalidades, propõe um processo de obtenção de um sistema nanoestruturado formado por cristais líquidos do tipo lamelar de forma estável, permitindo a veiculação de seriniquinona por via tópica para o tratamento do melanoma e o referido produto formado pelos cristais líquidos. Na terceira e quarta modalidade, a presente invenção propõe um processo de obtenção de nanopartículas de albumina que são capazes de permitir a incorporação e a veiculação da seriniquinona, assim como seu direcionamento ao microambiente tumoral e a sua posterior captação pela célula transformada, o que possibilita a administração sistêmica da molécula de seriniquinona, e o referido produto formado pelas nanopartículas.

[039] Em sua quinta modalidade, a presente invenção revela o uso das nanopartículas de albumina como agente antifúngico para infecções fúngicas mucocutâneas e sistêmicas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[040] Para auxiliar na identificação das principais características da presente invenção, são apresentadas as figuras às quais se faz referências, conforme se segue:

[041] A figura 1 ilustra um painel de sistemas desenvolvidos durante o screening para a incorporação da seriniquinona (SQ) em uma nanoformulação. Em que A) revela um filme de SQ e fosfatidilcolina formado após a rotaevaporação do clorofórmio; B) revela um sistema formado após a hidratação do filme e consequente formação de nanoestruturas; C) revela, à esquerda, sistema A com a SQ diluída uniformemente, porém com altas concentrações de tensoativos; à direita, sistema G com uma alta proporção de fase aquosa, o que provavelmente foi responsável pela não dissolução da SQ; D) revela o sistema B apresentando menor viscosidade e concentração de tensoativos, o que não promoveu a solubilização da SQ; E) revela o sistema C, com um incremento na concentração de álcool perílico, o que também não promoveu a solubilização da molécula, mas a sua adesão ao plástico; F) revela o sistema D, com um incremento de 3 a 5% na concentração de Tween 80, que também apresentou a SQ aderida ao plástico; G) revela o sistema E, que apresenta 10% de Tween 80, com a presença de precipitados de SQ; H) revela o sistema F com a adição de 2% de alginato de sódio sobre a composição do sistema E, o que promoveu a dissolução de somente 0,1 mg de SQ; I) revela o sistema H logo após a sonicação em haste apresentando a molécula dispersa uniformemente; J) revela o sistema H após 5 dias, apresentando precipitados de SQ no meio da formulação; K) revela o sistema 3, que difere do Sistema 1 (Figura 2), na adição de 10% de água, apresentando duas fases em sua composição por conta da má homogeneização por vórtex.

[042] A Figura 2 ilustra as características das nanoformulações selecionadas após o screening e contempladas pela presente invenção. Em que A) revela a solubilidade da SQ em água e nas formulações 1 e 2, bem como o pH de cada formulação. Como apresentado, as formulações promoveram um aumento na solubilidade aparente da substância de quase cinquenta mil e cem mil vezes cada uma, respectivamente. Ainda, a presença de DMSO na formulação 2 não promoveu alteração no pH em relação à formulação 1; B) revela, à esquerda, a formulação 1 contendo 0,5mg de SQ; à direita, a SQ pura na forma de cristais. O preparo dos sistemas, portanto, promoveu uma redução considerável no tamanho dos cristais da SQ, o que promoveu sua dispersão através das nanoformulações; e em que C) revela, da esquerda para a direita, uma formulação 1 sem SQ, formulação 1 com SQ, formulação 2 sem SQ e formulação 2 com SQ; considerando que cada formulação tem aproximadamente 500μL

[043] A figura 3 ilustra a microscopia óptica das formulações 1 e 2, com ou sem seriniquinona (SQ) na composição. Em que a cada dupla de fotos, há imagens sem (fundo cinza à esquerda) e com polarizador (fundo azulado à direita) em aumento de 200x (Bar = 100 μm). Ainda que a formulação 2 apresente o dobro de SQ em relação à formulação 1, os cristais de ambas as formulações apresentam o mesmo tamanho (13-20 μm).

[044] A figura 4 ilustra, graficamente, o comportamento reológico das formulações 1 e 2, analisadas após 72h de seu preparo. A taxa de cisalhamento foi variada até 1500 s-1 e avaliados à temperatura ambiente, mantida por ar-condicionado à 25°C. São apresentados reogramas das formulações 1 (A) e 2 (B); e viscosidades dinâmicas das formulações 1 (C) e 2 (D); sendo n = índice de comportamento do fluido: para formulação 1, tem-se n = 0,4694; para formulação 2 tem-se n = 0,4192.

[045] A figura 5 ilustra, graficamente, a quantificação da seriniquinona (SQ) após o ensaio de penetração e localização cutânea do controle com óleo de girassol (n=4) e das formulações 1 (n=8) e 2 (n=13) por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (210nm). Os gráficos representam média ± desvio padrão. Pelo teste estatístico de Dixon, não há outliers significativos. Retenção da SQ no estrato córneo (EC) (controle = 0,42 ± 0,02 μg/cm2; formulação 1 = 2,09 ± 0,57 μg/cm2; formulação 2 = 1,75 ± 0,57 μg/cm2). Retenção da SQ na epiderme viável e derme (ED) (controle = 0 μg/cm2; formulação 1 = 2,28 ± 0,86 μg/cm2; formulação 2 = 2,95 ± 1,25 μg/cm2). Não houve permeação transdérmica de SQ, já que não se pôde detectar a substância na fase receptora (FR) pelo método. Não houve diferenças significativas, pelo teste-t de Welch, entre a formulação 1 e a 2 quanto à retenção da SQ nas camadas da pele (p = 0,3224 - EC; p = 0,1504 - ED). Os estudos de permeação cutânea foram realizados com células de difusão de Franz (área de difusão de 0,65 cm2), utilizando pele de orelha de porco não dermatomizada. 100 mg de SQ foram adicionados em óleo de girassol a 300 μg/mL previamente sonicadas por 10 minutos ou em formulação preparada com 72h de antecedência foram colocados no compartimento doador do estrato córneo. A fase receptora era constituída por 1% de Tween 80 em PBS (m/v) e foi mantida em constante agitação de 300 rpm a 32°C por 6h. Depois disso, realizou-se o tape stripping, referente à separação do EC da ED para a extração da SQ com acetonitrila (ACN). A recuperação média da SQ da pele foi de 83,5%.

[046] A figura 6 ilustra a visualização da distribuição cutânea da SQ em microscópio invertido de fluorescência (verde-vermelha; 600 ms de exposição), no aumento de 40x, após ensaio de penetração e localização cutânea de 6h. Algumas imagens não apresentam nenhuma fluorescência, mostrando apenas um campo escuro, evidenciando a ausência de penetração cutânea. O painel A) revela a pele em campo claro evidenciando a orientação dos cortes nas figuras subsequentes: com o estrato córneo localizado na porção superior das imagens e a hipoderme na porção inferior; B) revela o tratamento com a formulação 1 sem SQ (n = 1) sendo a ausência de fluorescência importante para mostrar que, na exposição utilizada, não há autofluorescência interferindo com a visualização da penetração da seriniquinona; C) revela o tratamento com a formulação 1 com SQ (n = 2); D) revela o tratamento com a formulação 2 sem SQ (n = 1), sendo a ausência de fluorescência importante para mostrar que, na exposição utilizada, não há autofluorescência interferindo com a visualização da penetração da seriniquinona; e E) revela o tratamento com a formulação 2 com SQ (n = 2). Os estudos de permeação cutânea foram realizados em células de difusão de Franz (área de difusão de 0,65 cm2; utilizando pele de orelha de porco não dermatomizada. Cerca de 100 mg de formulação preparada com 96 h de antecedência foram colocados no compartimento doador do estrato córneo. A fase receptora era constituída por 1% de Tween 80 em PBS (m/v) e foi mantida em constante agitação de 300 rpm a 32°C por 6 h. Depois disso, removeu-se o excesso de formulação, a área de difusão foi cortada ao meio e essas secções de pele foram embebidas em meio O. C. T. e armazenadas a -80ºC por 3 semanas. Foram obtidos cortes de 10 µm a cada 40 µm em criostato (Leica) a -30ºC. Em cada lâmina, havia 4 cortes.

[047] A figura 7 ilustra a avaliação do potencial irritativo das formulações 1 e 2 por HET-CAM, após a exposição e o tratamento da membrana corioalantoide de ovos fertilizados de galinha da raça Leghorn. Para isso, ovos pesando entre 50 e 60 g foram incubados por 9 dias a 37°C ± 0,5 e umidade relativa de aproximadamente 70%. Então, a membrana corioalantoide dos ovos foi tratada com 100 µL das duas formulações sem SQ, solução salina (controle negativo) ou NaOH (0,1 M, controle positivo). A ocorrência de lise vascular, hemorragia e coagulação foi avaliada nos tempos 0 s, 30 s, 1 min, 2 min, 3 min, 4 min e 5 min e foi calculado o score de irritação de cada tratamento. Como esperado, o controle de NaOH promoveu eventos de lise vascular e coagulação sanguínea, consistente com sua classificação como irritante severa (S = 16,01), enquanto os tratamentos com salina e com ambas as formulações testadas não resultou em alteração perceptível na membrana corioalantoide (S = 0). As formulações, portanto, são consideradas não irritantes.

[048] A figura 8 ilustra, graficamente, curvas dose-resposta dos sistemas com e sem SQ em células de melanoma (SK-Mel-28 – BRAFV600E; SK-Mel-147 – NRASQ61R), avaliadas por meio de ensaio de MTT e indicada através da inibição celular pela concentração de formulação em meio de cultura (concentrações finais de 0,01 a 10 mg/mL de formulação), após 48h de tratamento (3x104 células/mL). Células sem tratamento (controle negativo) foram usadas para a normalização das análises das formulações. Na tabela apresentada estão os valores de concentração inibitória média (IC50), intervalo de confiança - CI (95%) e de R2 das formulações 1 e 2, contendo ou não SQ, em linhagens de melanoma (n=3). As formulações sem SQ não apresentaram citotoxicidade às células de melanoma nas concentrações testadas e, por isso, suas IC50 estão indicadas como >10mg/mL.

[049] A figura 9 ilustra, graficamente, curvas dose-resposta referentes à concentração de SQ incorporada nas formulações em comparação com a SQ diluída apenas em DMSO (concentrações finais de 0,01 a 5 μM SQ). Os ensaios de MTT foram realizados em células de melanoma (SK-Mel-28 – BRAFV600E; SK-Mel-147 – NRASQ61R) após 48h de tratamento (3x104 células/mL). Para a normalização, consideraram-se as células tratadas com as formulações sem SQ, a fim de remover qualquer efeito tóxico possível de componentes da formulação em si para se observar apenas a citotoxicidade da substância. Na tabela, estão os valores de concentração inibitória média (IC50), intervalo de confiança (95%) e de R2 das formulações 1 e 2 contendo SQ em comparação com a substância pura (n=3). Observando-se esses dados, não houve diferenças significativas entre a substância pura e as formulações, o que indica que a citotoxicidade da SQ nos sistemas foi mantida.

[050] A figura 10 ilustra um painel das formulações contendo nanopartículas de albumina, desenvolvidas a partir de coacervação. Em que A) revela um sistema do design 1 após a agitação por 8h, contendo 100 mg de BSA em PBS. É de se notar a presença de grumos amarelados no fundo do frasco, decorrente do intenso fluxo de gotejamento, e de albumina aderida às paredes do frasco, decorrente do vórtex; B) revela sistemas do design 1 após o primeiro ciclo de centrifugação. É possível visualizar pellets de diferentes colorações com composição heterogênea; C e D) revelam sistemas do design 1 imediatamente após o fim dos ciclos de centrifugação e ressuspensão, em que (C) é no dia seguinte e (D) indica a instabilidade dos sistemas; E) revela um sistema do design 2 durante o processo de crosslinking. É de se notar a formação de uma crosta no frasco, decorrente da agitação e da adição sem pausas de glutaraldeído; F) e G) revelam sistemas do design extra no claro, em que (F) é no escuro e (G) após o gotejamento de etanol. Pode-se observar o diferente comportamento dos sistemas diante da luz e a sua coloração: o sistema com o menor volume de etanol (1,5 mL) apresenta-se translúcido e opalescente, enquanto o sistema com o maior volume do solvente (2 mL) apresenta-se opaco e leitoso; H) e I) revelam sistemas do design extra após o primeiro ciclo de centrifugação. É de se notar que o sistema com o menor volume de etanol (H) apresenta um sobrenadante turvo e um pellet menor do que o sistema com o maior volume (I), de sobrenadante transparente e maior pellet, em decorrência da presença de partículas em escala superior à nanométrica; J) revela um sistema do design extra com o menor volume de etanol após o último ciclo de centrifugação, transparente e com distribuição homogênea; K, L e M) revelam formulações finais, após a recapitulação do design 2 e o design 3 com as seguintes exclusividades entre si: K) 4h de agitação com glutaraldeído; L) 24h de agitação com glutaraldeído e M) 2h de agitação a 60ºC.

[051] A figura 11 ilustra um painel das formulações da tentativa de incorporação da SQ nos sistemas de albumina. Em que A) revela um sistema após o gotejamento da solução de SQ em etanol (125 µg/mL). É de se notar que, visualmente, ele se parece com o sistema sem SQ (Figuras 10F e 10G); B) revela um sistema sem SQ após a adição de glutaraldeído; C) revela um sistema com SQ após a adição de glutaraldeído; D) revela sistemas após o crosslinking. Os dois sistemas à esquerda não têm SQ, enquanto os outros dois passaram pelo processo de incorporação da substância. É de se notar que o sistema com a substância, que quando pura é amarela, apresenta uma coloração atípica (lilás), dado que o esperado era aumentar a intensidade da coloração amarela no sistema; E) revela sistemas sem SQ (as duas formulações preparadas por meio de 4h de reticulação à esquerda; os outros dois por 24h) após o primeiro ciclo de centrifugação. É de se observar que eles se assemelham às Figuras 10H e 10I; F) revela sistemas com SQ (as duas formulações preparadas por meio de 4h de reticulação à esquerda; os outros dois por 24h) após o primeiro ciclo de centrifugação. É de se observar que tanto o pellet quanto o sobrenadante apresentam cor lilás e roxa.

[052] A figura 12 ilustra, graficamente, os sistemas de albumina com e sem SQ em células de melanoma (SK-Mel-28 – BRAFV600E; SK-Mel-147 – NRASQ61R), avaliadas por meio de ensaio de MTT e indicada através da inibição celular pela concentração de formulação em meio de cultura (concentrações finais de 50 a 100 mg/mL de formulação), após 48h de tratamento (3x104 células/mL). Células sem tratamento (controle negativo) foram usadas para a normalização das análises das formulações. Na tabela ao lado estão os valores de concentração inibitória média (IC50), intervalo de confiança - CI (95%) e de R2 das formulações reticuladas com glutaraldeído e com glicose e UV, contendo ou não SQ, em linhagens de melanoma (n=3). As formulações sem SQ não apresentaram citotoxicidade às células de melanoma nas concentrações testadas e, por isso, suas IC50 estão indicadas como >100 mg/mL. Já as formulações com SQ apresentaram valores de IC50 semelhantes, de acordo com os valores de citotoxicidade e de intervalo de confiança.

[053] A figura 13 ilustra, esquematicamente, um fluxograma indicando o raciocínio em que se baseou o desenvolvimento das formulações tópicas da presente invenção. Frente à baixa solubilidade da seriniquinona (SQ), desenvolveu-se, inicialmente, nanocarreadores que não promoveram a incorporação da substância: as vesículas lipídicas, as micelas poliméricas e os carreadores lipídicos nanoestruturados. Conseguindo-se incorporar o produto natural em cristais líquidos, os estudos puderam finalmente progredir, por meio da caracterização tecnológica e biológica das formulações selecionadas

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[054] A presente invenção refere-se aos processos de obtenção de dois sistemas nanoestruturados formados por cristais líquidos do tipo lamelar de forma estável e por nanopartículas de albumina, utilizados para o tratamento do melanoma e infecções fúngicas mucocutâneas e sistêmicas.

[055] Assim, em suas primeira e segunda modalidades, a presente invenção propõe um processo de obtenção de um sistema nanoestruturado formado por cristais líquidos do tipo lamelar de forma estável, permitindo a veiculação de seriniquinona por via tópica para o tratamento do melanoma e o referido produto formado pelos cristais líquidos.

[056] O processo descrito foi feito com base em um Screening de formulações e posterior desenvolvimento das formulações selecionadas para os experimentos seguintes. O processo em suma compreende as seguintes etapas: a) misturar os componentes fosfatidilcolina, tricaprilina e propilenoglicol; b) fundir os referidos componentes em banho-maria à 80ºC por 20 minutos; c) submeter o sistema a agitação por vórtex a cada 5 minutos por 15 segundos, até a dissolução da fosfatidilcolina na mistura e homogeneização do sistema; d) incorporar a seriniquinona em pó ou diluída em dimetilsulfóxido (DMSO); e) promover a ultrassonicação em haste até completa dissolução do fármaco (quando adicionado em pó); e f) adicionar água no sistema até transformação em fase lamelar com consequente aumento da viscosidade.

[057] Para demonstrar o potencial do processo de desenvolvimento dos sistemas, a presente invenção será mais detalhadamente descrita sob aspecto de etapas realizadas, assim como dos resultados obtidos. Cabe ressaltar que a descrição das etapas a seguir tem apenas a finalidade de elucidar o entendimento da invenção proposta e revelar de forma mais detalhada a concretização da invenção sem limitála ao mesmo. Dessa forma, variáveis similares ao exemplo também estão dentro do escopo da invenção.

Screening de formulações:

[058] A presente invenção contempla duas formulações nanoestruturadas baseadas em cristais líquidos de fase lamelar que permitem a incorporação e a veiculação por via tópica da seriniquinona (SQ), fornecendo um aumento de sua solubilidade aparente. Adicionalmente, a incorporação da SQ nesses sistemas nanoestruturados permite a administração tópica dessa substância, o que favorece o direcionamento da molécula ativa ao sítio primário do melanoma: a camada mais basal da epiderme e a derme.

[059] Para chegar a estas formulações finais, foi realizada uma triagem com 20 sistemas baseados em diferentes nanotecnologias, que variaram entre vesículas lipídicas, micelas poliméricas, carreadores lipídicos nanoestruturados e cristais líquidos, todos visando à administração tópica ou parenteral, a depender do tipo de sistema. Como critério para progressão dos demais estudos e caracterização das nanoformulações, foi realizada uma análise organoléptica e da estabilidade dos sistemas, em que eram escolhidas formulações que não apresentavam precipitados da SQ. O raciocínio por trás do desenvolvimento, caracterização e avaliação da atividade dos sistemas preparados para a administração tópica da SQ contemplados pela presente invenção está organizado na figura 13.

[060] Inicialmente, desenvolveram-se vesículas lipídicas baseadas em lecitina de soja, contendo SQ. Para isso, dissolveu-se, por meio de agitação em vórtex, 1 mg de SQ em 500 μL de clorofórmio, e adicionaram-se 10 mg de fosfatidilcolina nessa solução. Esta concentração foi padronizada em trabalhos anteriores do grupo (Apolinário et al., 2020b; Apolinário et al., 2021). Após homogeneização em vórtex, a mistura foi levada ao rotaevaporador até a formação de um filme lipídico na parede do frasco (Figura 1A). Após isso, adicionaram-se 500 μL de água até a solubilização do biofilme para a formação das nanoestruturas (Figura 1B). A nanoformulação final foi analisada por espalhamento dinâmico da luz (DLS) e demonstrou, por essa técnica, três picos distintos de tamanho de partículas e valores altos de índice de polidispersão (PdI). Após 24 h, como a SQ apresentou-se sedimentada, o sistema foi submetido à sonicação com homogeneizador ultrassônico de haste por 10 minutos (pulsos de 50s on, 30s off), mas os precipitados permaneceram após 24h. Tentou-se, ainda, desenvolver micelas poliméricas a partir da tentativa de incorporação de 1 mg de SQ em 500 μL de suspensão aquosa de Poloxamer 127 a 2% m/v (podendo ser entre 0.5 e 2%). Entretanto, ambas apresentaram precipitados de SQ logo após a ultrassonicação em haste por 10 minutos (pulsos de 50s on, 30s off, períodos de até 15 min foram testados, mas não apresentaram diferenças).

[061] Depois dessas tentativas, a estratégia foi direcionada para o desenvolvimento de carreadores lipídicos nanoestruturados. A base racional da escolha é a capacidade destes sistemas de dissolverem compostos anfifílicos e lipofílicos, evitando o contato com água uma vez que a fase oleosa é sólida. Tais sistemas foram formados a partir da fusão a 70-80ºC de uma fase oleosa contendo span 80 (monooleato de sorbitan), compritol e tricaprilina, podendo conter ou não álcool perílico. Após a fusão, uma fase aquosa composta por polisorbato 80 (mono-oleato de sorbitan etoxilado) e poloxamer 188 (copolímero de polioxietileno e polioxipropileno) foi adicionada por gotejamento, podendo incorporar ou não alginato de sódio posteriormente para a gelificação do sistema (Tabela 1). Depois disso, a SQ foi adicionada ao sistema, o que era seguido de ultrassonicação em haste por 10 minutos (pulsos de 50s on, 30s off; foram testados até 20 min, sem alteração no resultado). Inicialmente, 0,1 mg de SQ foram adicionadas nas formulações, a fim de não haver um desperdício de grande parte da SQ e, mediante a ausência de precipitação, sistemas com 1 mg de SQ foram produzidos no intuito de verificar a capacidade de incorporação do sistema. Tabela 1: Composições em massa e percentual das nanoformulações (sistemas de A à G) que foram projetadas inicialmente para atuar como carreadores lipídicos nanoestruturados. Como componentes, estão o Tween 80 (tensoativo), solução aquosa a 1% m/v de Poloxamer 188 (tensoativo polimérico), SPAN 80 (tensoativo), compritol (cera/lipídio sólido), tricaprilina (triglicerídeo), álcool perílico (terpeno), alginato de sódio (polissacarídeo) e seriniquinona (SQ - substância ativa).

[062] O primeiro sistema (sistema A) foi preparado e apresentou capacidade de manter a SQ uniformemente distribuída sem a presença de precipitados (Figura 1C). Apesar disso, sua alta concentração final de tensoativos (18,4% de Tween 80 + 61,6% de Poloxamer a 1% + 3% de span 80) é um entrave à administração dessa formulação em estudos pré-clínicos com modelos animais e em ensaios clínicos devido ao seu alto potencial irritativo. Após essa primeira formulação, preparou-se o sistema G; entretanto, nesse sistema foram incorporados apenas 0,1 mg de SQ, tendo apresentado precipitação com 1 mg da substância mesmo após ultrassonicação (Figura 1C), o que levantou a hipótese da necessidade de se desenvolver sistemas semissólidos para a manutenção da uniformidade da distribuição da SQ nos sistemas. Assim, preparou-se o sistema B, que, por apresentar uma consistência intermediária aos sistemas A e G, não promoveu a dispersão da SQ (Figura 1D), o que confirmou a hipótese da necessidade de um sistema de maior viscosidade.

[063] Para tentar descobrir o que promovia aumento da viscosidade da formulação, diminuiu-se a proporção de tricaprilina (lipídio líquido) e aumentou-se a proporção de álcool perílico de 1% a 5% por meio do sistema C; entretanto, mesmo adicionando-se apenas 0,1 mg de SQ, houve precipitação (Figura 1E). Assim sendo, como o aumento na concentração de tensoativos foi um dos fatores preponderantes para se promover um incremento na consistência do sistema, uma incorporação e distribuição homogênea da SQ nos sistemas, esse foi o próximo parâmetro a ser alterado. Inicialmente, por meio do sistema D, aumentou-se a concentração de Tween 80 de 3% para 5%, bem como a da solução aquosa contendo Poloxamer 188 de 1% para 5%, o que não promoveu a dissolução da substância na formulação (Figura 1F). Após isso, com o sistema E, utilizou-se 10% de Tween 80 e solução aquosa a 1% de Poloxamer 188, mas mesmo colocando 0,1 mg de SQ, ela se apresentou sob a forma de precipitados macroscópicos (Figura 1G). Ao gerar o sistema F, objetivou-se incluir 2% de alginato de sódio (poderia utilizar 1-2% de alginato) na composição da nanoformulação E, a fim de promover um aumento da viscosidade do sistema por meio da gelificação com esse polissacarídeo. Apesar de o sistema se apresentar semissólido, conseguiu-se obter apenas a dissolução da molécula nas formulações com 0,1 mg de SQ, enquanto as nanotecnologias com 1 mg apresentaram-se sedimentadas (Figura 1H).

[064] Assim sendo, diante da necessidade de se desenvolver sistemas semissólidos e da impossibilidade de se administrar formulações com altas concentrações de tensoativos, o processo de pré-formulação desviou-se a cristais líquidos e emulsões estabilizadas por cristais líquidos, que são uma classe de sistemas que apresentam características intermediárias entre líquidos e sólidos (Tabela 2). O primeiro desses sistemas desenvolvidos (formulação H), foi preparado por meio de fusão a 80ºC de fosfatidilcolina e monoleína (na proporção de 2:1), que, por sua vez, eram homogeneizadas e fundidas com óleo de girassol (na proporção 6:4). Após a total fusão do sistema, adicionouse 0,1 mg de SQ e procedeu-se a ultrassonicação em haste por 10 minutos (50s on, 30s off). Depois disso, adicionou-se 15% de água destilada em relação à massa inicial da mistura, a fim de se promover um aumento na consistência do sistema. Apesar de ter apresentado uma boa estabilidade inicial (Figura 1I), o sistema apresentou precipitados da SQ no meio da formulação após 5 dias (Figura 1J). Partiu-se então para sistemas constituídos de fosfatidilcolina, tricaprilina, manteiga de karitê e óleo de girassol, que eram fundidos a 80ºC. Após a fusão, foi incorporado 0,1 mg de SQ e água a esse sistema, que foi homogeneizado manualmente. Entretanto, a SQ também não se solubilizou no sistema; ainda, tanto o sistema H quanto o I apresentam óleo de girassol em sua composição, que é conhecidamente um agente antioxidante.

Desenvolvimento das formulações selecionadas para os experimentos seguintes:

[065] Após todas as tentativas falhas de incorporação da SQ nesses sistemas nanoestruturados prédesenvolvidos, finalmente as duas formulações baseadas em cristais líquidos abrangidas pela presente invenção foram desenvolvidas. Tais sistemas contêm fosfatidilcolina e tricaprilina (na proporção de 9:1, ou 95:5-80:20 m/m) e propilenoglicol (na proporção de 1:1 com a mistura do fosfolipídio com o triacilglicerol (1:1 – 1.5:1). Esses componentes, por sua vez, eram fundidos a 80ºC por 20 minutos, sendo que, a cada 5 minutos, o sistema era submetido à agitação por vórtex por 15 segundos, a fim de se facilitar a dissolução da fosfatidilcolina no propilenoglicol e, assim, promover a homogeneização do sistema. Após a fusão da formulação, foi realizada a incorporação da SQ em pó ou diluída em dimetilsulfóxido (DMSO), seguida de ultrassonicação em haste para solubilização do fármaco e adição de água no sistema, o que proporciona a formação de fase lamelar e aumento em sua viscosidade (Tabela 3).

[066] De início, desenvolveu-se o sistema 1, no qual era adicionado de 0,1 a 1 mg de SQ pura, seguida de ultrassonicação em haste por 10 minutos (50s on, 30s off) e adição de 5% de água em relação à massa inicial da formulação. Apesar disso, só foi possível incorporar até 0,5 mg de SQ na formulação, já que, ao colocar 1 mg da substância ativa, sedimentos da molécula eram aparentes após 24h da preparação da nanoformulação. A fim de saber se a adição de mais água no sistema (no caso, um aumento de 10% em relação à massa inicial) manteria ou melhoraria a dissolução da molécula, desenvolveu-se o sistema 3; contudo, não foi possível homogeneizá-lo adequadamente por meio da agitação por vórtex (Figura 1K). Diante disso e da capacidade de dissolução da SQ em DMSO, solvente orgânico utilizado como principal veículo para testes pré-clínicos in vitro com a molécula, pensou-se em incorporar esse solvente na composição do sistema 1. Para isso, tentou-se dissolver 1 mg de SQ em 66,66 μL (70 mg) de DMSO (solução final de 15 mg/ml). Entretanto, mesmo com aquecimento a 80ºC por 10 minutos e agitações por vórtex de 15 segundos a cada 2 minutos, era possível a identificação de alguns cristais de SQ a olho nu, indicando que só foi possível dilui-la parcialmente no solvente. Ainda assim, adicionou-se essa solução supersaturada à formulação, levando-a à ultrassonicação em haste por 10 minutos (50s on, 30s off) e adicionou-se 5% de água, o que deu origem ao sistema 2, que apresentou estabilidade e distribuição uniforme da substância ativa. Assim, com essa diluição em DMSO, mesmo que parcial, conseguiu-se incorporar o dobro de SQ que havia sido atingido com a formulação 1, seguindo os mesmos parâmetros de componentes, sonicação e adição de água.

[067] No entanto, pensando que o DMSO pode ser irritante em altas concentrações na formulação, tentou-se preparar duas formulações distintas (sistemas 4 e 5) com teores menores do solvente orgânico (5% e 10%, respectivamente, em vez de 14%, em relação à massa dos componentes-base) e a mesma massa de SQ que o sistema 2 (1 mg); entretanto, nenhuma delas foi capaz de manter a SQ uniformemente distribuída e sem precipitados. Em razão dos resultados obtidos a partir do ensaio de microscopia de luz polarizada com as formulações 1 e 2 (ver mais adiante), em que se pôde observar a presença de cristais que foram atribuídos à SQ, tentou-se, ainda, alterar as proporções dos componentes-base do sistema 1, obtendo-se as formulações 6 e 7. Também foram alterados os tempos de ultrassonicação do sistema 1 para 15 e 20 minutos, com o mesmo pulso. Entretanto, não houve alterações perceptíveis no tamanho dos microcristais de SQ em nenhuma dessas formulações observadas no microscópio óptico. Considerando que essas etapas aumentam o custo e tempo de preparo sem melhorar a solubilização, elas foram eliminadas do processo.

[068] Diante de tudo que foi apontado até agora, as formulações 1 e 2 (Figura 2B e Tabela 3) foram selecionadas como os melhores sistemas para a incorporação da SQ, seguindo, assim, para os próximos estudos de caracterização de performance tecnológica e biológica da nanoformulação. Assim, a presente invenção se refere, a partir de agora, a esses sistemas, que apresentam as seguintes vantagens/propriedades: a) São capazes de incorporar de 0,5 a 1 mg de SQ em 525 e 595 mg de formulação, respectivamente (Tabela 3). O termo incorporar foi empregado ao invés do termo solubilizar, pois entende-se que, embora não haja formação de precipitados ou cristais visíveis macroscopicamente a olho nu nas formulações, há cristais microscópicos, demonstrando que nem toda a substância está solúvel, mas homogeneamente dispersa. Assim, há uma porção solúvel (que permite dizer que a formulação aumenta a solubilidade da molécula) e outra dispersa. b) Considerando a capacidade de incorporação, pode-se dizer que eles aumentam a quantidade da SQ em até quase cem mil vezes comparado a veículo aquoso, considerando que cada formulação apresentava aproximadamente 500μL (Figura 2B); c) Proporcionam uma distribuição homogênea da molécula ao longo do tempo em um sistema passível de administração (Figuras 2A e 2C).

[069] A principal inovação da presente invenção, portanto, diz respeito ao fato de que essas são as primeiras formulações farmacêuticas desenvolvidas para a veiculação da SQ, o que elimina a necessidade de se utilizar veículos apolares e muitas vezes tóxicos, sem propriedades específicas (como bioadesão, boa espalhabilidade sem escorrer na pele, maior tempo de retenção na pele, promoção da penetração, entre outras atribuídas a sistemas líquido cristalinos) para a solubilização e administração da molécula em estudos a posteriori. Tabela 3: Composições em massa e percentual dos sistemas líquido-cristalinos (de 1 a 7). Como componentes, estão a fosfatidilcolina (fosfolipídio), tricaprilina (triglicerídeo), propilenoglicol (umectante e promotor de absorção), dimetilsulfóxido (promotor de absorção), água e seriniquinona (SQ).

Testes Comprobatórios de Eficácia:

[070] Para demonstrar o potencial das nanoformulações obtidas e comprovar sua eficácia, a presente invenção será mais detalhadamente descrita sob aspecto de testes realizados assim como dos seus respectivos resultados obtidos. Assim, foram realizados os seguintes testes após o processo de preparo: a. Caracterização das nanoformulações selecionadas; b. Penetração e localização cutânea; c. Potencial irritativo das formulações tópicas por HET-CAM; d. Citotoxicidade em linhagens de melanoma.

[071] Os exemplos a seguir têm o intuito apenas de ilustrar, sem limitar o escopo da presente invenção. Quaisquer variações passíveis de serem realizadas por um técnico no assunto devem ser consideradas como dentro do escopo da presente invenção.

Caracterização das nanoformulações selecionadas:

[072] Todos os ensaios e seus respectivos resultados descritos nesta seção foram realizados com os sistemas após 72h de sua preparação, período necessário para a formação e estabilização das nanoestruturas. Inicialmente, realizou-se a medição do pH dos sistemas por meio da fita universal e obteve-se pH = 5,0 (Figura 2C), independentemente da presença de DMSO. Adicionalmente, eles foram caracterizados de acordo com sua estrutura por meio de microscopia de luz polarizada (Figura 3). Nas imagens obtidas com polarizador, pôde-se observar anisotropia nas duas formulações, o que, somada à sua aparência macroscópica de gel, as caracteriza como cristais líquidos de fase lamelar, ou seja, sistemas que apresentam características intermediárias entre líquidos e sólidos e que se organizam em bicamadas fosfolipídicas empilhadas. Assim sendo, há diferentes locais que permitem interações entre os componentes de acordo com suas propriedades físico-químicas. Isso também é um indicador de que a presença de DMSO não altera as características estruturais do sistema 1. Ainda, na Figura 3, é possível observar a presença de cristais que provavelmente são da SQ, já que não há esses cristais nos sistemas sem a substância. Embora isso indique que parte da molécula não esteja totalmente dissolvida, os sistemas apresentaram grande estabilidade organoléptica a longo prazo e não houve precipitação ou separação de fases, o que permite sua administração.

[073] Caracterizaram-se, também, as formulações por meio do ensaio de avaliação do comportamento reológico como pseudoplásticos, já que há uma redução na viscosidade conforme a taxa de cisalhamento aumenta (Figuras 4C e 4D) e os índices de comportamento de ambos os fluidos (n), presentes na fórmula da lei de potência (Equação 1) que descreve a curva dos reogramas (Figuras 4A e 4B), apresentaram valores menores que 1, o que indica comportamento não-newtoniano.

[074] Em que T é a tensão de cisalhamento, k é o índice de consistência e γ é a taxa de cisalhamento. A formulação 1 teve n = 0,4694 e formulação 2: n = 0,4192 (valores obtidos no software de avaliação de data fitting).

Penetração e localização cutânea:

[075] Por conta de suas características tecnológicas, propõe-se utilizar tais sistemas como veículos para a administração tópica da SQ, já que essa via favorece uma localização preferencial da substância na pele, aumentando sua concentração no alvo desejado, que são as lesões não metastáticas formadas pelos melanócitos transformados. Além disso, tal estratégia também pode diminuir a disponibilidade sistêmica da SQ em comparação a outras vias de administração, como a oral e a intravenosa, podendo minimizar a chance de ocorrência de possíveis efeitos adversos da substância. Ainda, essas formulações poderiam ser utilizadas principalmente para realizar o controle de bordas após ressecção cirúrgica das lesões de melanoma e para o tratamento adjuvante de lesões não metastáticas de pacientes idosos ou daqueles que não sejam candidatos à cirurgia (Pandit et al., 2015; Swetter et al., 2015).

[076] Para tal proposta, realizaram-se ensaios de penetração em células de difusão de Franz usando como modelo pele de orelha de porco, que demonstraram, como indicado na Figura 5, que as duas formulações promoveram retenção da molécula no estrato córneo (formulação 1 = 2,09 ± 0,57 μg/cm2; formulação 2 = 1,75 ± 0,57 μg/cm2), na epiderme viável e na derme (formulação 1 = 2,28 ± 0,86 μg/cm2; formulação 2 = 2,95 ± 1,25 μg/cm2).). Entretanto, os sistemas não proporcionaram uma permeação transdérmica detectável pelo método, mesmo apresentando promotores de absorção (propilenoglicol e DMSO), o que é ideal para formulações de administração tópica e ação local. Por outro lado, uma solução de SQ em óleo de girassol (300 μg/mL), utilizada como controle, promoveu apenas retenção da SQ no EC (0,42 ± 0,02 μg/cm2), a qual foi 4,2-5 vezes inferior à formulação, demonstrando a clara vantagem da formulação desenvolvida. A dissolução da SQ no óleo de girassol é mais difícil do que na formulação e, também, requer sonicação.

[077] No intuito de visualizar a distribuição da SQ pela pele após o ensaio de penetração cutânea, pensou-se em usufruir da fluorescência intrínseca da substância, descrita por Trzoss et al. (2014), para avaliar cortes histológicos de peles tratadas com as formulações. A Figura 6 contém as imagens obtidas em microscópio invertido de fluorescência, com filtro de fluorescência verde-vermelha, sob o tempo de exposição de 600 ms. Os resultados sugerem que os excipientes das formulações sem a substância e os componentes da pele não apresentaram fluorescência no tempo de exposição testado, o que corrobora para a hipótese de que a SQ é a responsável pela fluorescência apresentada nas Figuras 6C e 6E. Por esse método, observou-se que a substância se distribui principalmente pelo EC da pele, não sendo possível verificar a presença de SQ em camadas mais profundas da pele através dessa técnica, como quantificado previamente por CLAE.

[078] Pode-se concluir, então, com base nesses dois experimentos, que os sistemas descritos podem ser utilizados para o tratamento de lesões não metastáticas de melanoma, já que o objetivo da administração tópica foi atingido por meio da quantificação da retenção da SQ nas camadas da pele relacionadas ao sítio primário dessa neoplasia. Ainda, observou-se que a via de permeação cutânea da SQ a partir das formulações é por meio do estrato córneo. A característica inovadora dessa criação, portanto, diz respeito não só a uma nova possibilidade de tratamento para o melanoma in situ, como também a uma nova via de administração para a quimioterapia de alguns tipos de lesões de melanoma, controle de bordas pós-cirurgia e outros tipos de tumores cutâneos.

Potencial irritativo das formulações tópicas por HETCAM:

[079] Com o objetivo de verificar a irritabilidade das formulações, em decorrência da futura administração dos sistemas em modelos in vivo e em pacientes, realizou-se o ensaio utilizando o modelo HET-CAM, modelo alternativo ao uso de animais. O método utilizado foi padronizado previamente pelo laboratório e foi descrito por Carvalho et al. (2019). A membrana corioalantoide de ovos previamente incubados foi exposta e tratada com 100 µL das duas formulações sem SQ, solução salina (controle negativo) ou NaOH (0,1 M, controle positivo). A ocorrência de lise vascular, hemorragia e coagulação foi avaliada imediatamente e nos tempos 30 s, 1 min, 2 min, 3 min, 4 min e 5 min e o score de irritação foi calculado a partir da Equação 2, sendo h, l e c o tempo de ocorrência de hemorragia, lise vascular e coagulação sanguínea, respectivamente:

[080] Para classificar as formulações, os seguintes intervalos foram utilizados, conforme padronizado por Luepke (1985): S < 0,9: não-irritante; 1 < S < 4,9: levemente irritante; 5,0 < S < 8,9: irritação moderada; 9,0 < S < 21: irritação severa. As membranas corioalantoides dos ovos, no início e no fim do experimento, estão representadas na Figura 7. Ambas as formulações não foram consideradas irritantes (S = 0), já que elas não acarretaram prejuízo vascular algum. Portanto, pode-se afirmar que as duas formulações são seguras para a administração tópica da SQ, dado que ambas apresentaram nenhuma evidência de irritação no tempo de ensaio.

Citotoxicidade em linhagens de melanoma:

[081] Para verificar se a atividade citotóxica da SQ foi mantida, potencializada ou reduzida com as nanoformulações, realizaram-se testes em linhagens celulares de melanoma: SK-Mel-28 (BRAFV600E) e SK-Mel-147 (NRASQ61R). Como indicado na Figura 8, as formulações sem SQ não apresentaram citotoxicidade para as células de melanoma nas concentrações testadas, o que é ideal, pois se deseja que apenas a SQ apresente atividade citotóxica. A Figura 9, por sua vez, cuja normalização foi feita a partir das formulações sem a substância, indica que ambas as formulações apresentaram valores de IC50 muito próximos ou iguais entre si e a substância pura, o que foi evidenciado pelos seus respectivos intervalos de confiança (95%). Sendo assim, os sistemas descritos nesta invenção são produtos capazes de manter o efeito de morte celular de células tumorais, assim como a SQ livre o faz, e não apresentam excipientes tóxicos em sua formulação-base na ausência da molécula.

[082] Nas suas terceira e quarta modalidades, a presente invenção propõe um processo de obtenção de nanopartículas de albumina que são capazes de permitir a incorporação e a veiculação da seriniquinona, assim como seu direcionamento ao microambiente tumoral e a sua posterior captação pela célula transformada, o que possibilita a administração sistêmica da molécula, e o referido produto formado pelas nanopartículas de albumina.

[083] As nanopartículas de albumina permitem a incorporação, por conta dos diferentes sítios de interação da proteína, e a veiculação da SQ por uma via distinta da tópica: a via sistêmica/intravenosa, subcutânea e intramuscular. Antecipa-se que a incorporação da SQ nesses nanocarreadores permitiu uma administração mais segura da substância, dado que as nanopartículas de albumina são carreadores estáveis, biodegradáveis, atóxicos e não imunogênicos. Ainda, apesar de a administração sistêmica tradicionalmente promover uma maior distribuição do fármaco, o que favorece a ocorrência de possíveis efeitos adversos, essas nanopartículas permitem um direcionamento passivo do fármaco ao microambiente tumoral, devido ao efeito de retenção e permeação aumentadas. Devido à farmacocinética clássica, sabe-se que o fármaco ligado a proteínas plasmáticas não promove efeito biológico e que somente o fármaco livre pode transpor ou se difundir pelas membranas celulares. Entretanto, com a incorporação do fármaco em nanopartículas de albumina, o seu direcionamento passivo, o seu acúmulo no microambiente tumoral e sua internalização pela célula por meio de receptores para a endocitose de albumina, a interação da SQ com seu alvo terapêutico seria possível.

[084] Para desenvolver as nanopartículas, prepararam-se, inicialmente, formulações vazias (sem SQ) a fim de padronizar o método para nossas condições laboratoriais. Partiu-se das condições descritas por Weber et al. (2000) e Galisteo-González & Molina-Bolívar (2014) a fim de padronizar as melhores condições de formação das nanopartículas e não gerar um dispêndio excessivo da substância. Ainda, para fins de comparação e reprodutibilidade, todas as formulações foram feitas em duplicata. Como os resultados abaixo evidenciarão, a padronização foi complexa, necessitando de muitas variações, o que evidencia que o processo de obtenção desses carreadores é altamente variável e não intuitivo.

[085] O processo de formação de nanopartículas por meio de reticulação com glutaraldeído foi formulado através de testes de execução com a definição de diversos designs até que fosse encontrado o design ideal para formulação das etapas de obtenção das nanopartículas; assim a execução dos designs deu-se da seguinte forma: (a) Definição do Design 1; (b) Reformulação do Design 1; (c) Definição do Design 2; (d) Reformulação do Design 2; (e) Definição do Design Extra; e (f) Recapitulação do Design 2.

[086] Inicialmente, foram determinadas as principais variáveis e parâmetros que pudessem afetar o desenvolvimento dos nanocarreadores, a fim de entender qual deles mais influenciaria no percentual de formação de nanopartículas, no tamanho, no índice de polidispersão (PdI) e no potencial zeta. Para isso, selecionaram-se os seguintes critérios, que foram divididos, a princípio, em 2 designs (como indicado na Tabela 4): concentração de albumina, solvente, tempo e concentração de reagente para crosslinking.

[087] Apesar de ter sido feito tal planejamento, será revelado que o desenvolvimento das nanopartículas, na prática, foi feito de acordo com as necessidades de aprimoramento notadas pela presente invenção, levando-se em consideração as dificuldades encontradas ao longo do progresso de trabalho, como por exemplo: a presença de grandes precipitados de albumina na solução e de proteína na parede do frasco (na forma de grandes agregados dispersos ao longo da superfície do recipiente e formando um anel na interface ar-líquido) e a impossibilidade de homogeneizar o pellet completamente após a centrifugação.

[088] Os componentes dos sistemas de cada design do desenvolvimento das nanopartículas por dessolvatação e crosslinking com glutaraldeído e suas variáveis estão contidos na Tabela 5. Para a caracterização das nanopartículas, foram feitos experimentos para medição de tamanho e PDI pela técnica do espalhamento dinâmico da luz (DLS), de potencial zeta e da estimativa do percentual de formação de nanopartículas pela técnica de Bradford. Um sistema ideal teria tamanho inferior a 400 nm, PDI menor que 0,25, potencial zeta superior a 30 mV em módulo e o maior percentual de formação de nanopartículas. Tabela 5: Componentes e variáveis de cada design envolvendo o desenvolvimento de nanopartículas de albumina por dessolvatação e crosslinking com glutaraldeído.

[089] Assim, após execução de cada experimento, concluiu-se que cada sistema possui vantagens e desvantagens e, por isso, existem diferentes opções para o desenvolvimento das nanopartículas de albumina com a SQ. De qualquer forma, os processos de obtenção das formulações possuem etapas em comum: a. Diluição da albumina em água. A SQ pode ser adicionada nesta etapa, misturada com DMSO para desnaturação da albumina e dispersão da SQ no sistema. Uma outra variação desta etapa consiste na possibilidade de adição de ditiotetriol (DTT) para promover uma maior desnaturação da proteína. Esta variação visa aumentar a encapsulação de seriniquinona, mas não é essencial para produzir nanopartículas. Ainda não foi possível avaliar a eficiência de encapsulação; b. Gotejamento de etanol contendo SQ, para promover a dessolvatação e a formação de agregados de albumina e SQ; c. Estabilização dos sistemas por meio de reticulação com glutaraldeído ou glicose associado à exposição ao UV. d. Centrifugação e ressuspensão para a purificação das formulações.

[090] Deseja-se obter nanopartículas com tamanho inferior a 400 nm, PDI inferior a 0,250, potencial zeta superior a 30 mV em módulo, com um grande percentual de formação de nanopartículas e de incorporação da substância.

[091] Para demonstrar o potencial do processo de obtenção das nanopartículas, a presente invenção será mais detalhadamente descrita sob aspecto de testes de execução, assim como dos resultados obtidos. Cabe ressaltar que a descrição das etapas a seguir tem apenas a finalidade de elucidar o entendimento da invenção proposta e revelar de forma mais detalhada a concretização da invenção sem limitála ao mesmo. Dessa forma, variáveis similares ao exemplo também estão dentro do escopo da invenção.

Testes para obtenção das nanopartículas com glutaraldeído como agente de reticulação Design 1:

[092] Neste design, seguiu-se o método preconizado por Weber et al. (2000) Galisteo-González & Molina-Bolívar (2014). Preparou-se uma solução aquosa contendo PBS a 2 mM com pH 7,2. Diluíram-se 50 ou 100 mg de albumina sérica bovina (BSA) em 1 mL de água destilada ou PBS conforme o design 1 da Tabela 4. Gotejaram-se 4 mL de etanol em um fluxo de 1 mL/min, com agitação em vórtex à temperatura ambiente. Depois disso, o sistema ficou sob agitação magnética por 10 minutos a 300 rpm. Preparou-se uma solução de glutaraldeído a 8% e adicionou-se 30 µL dela nas formulações com 50 mg de BSA e 60 µL nas formulações com 100 mg de proteína, mantendo a proporção de 0,6 µL de glutaraldeído/mg de BSA. Após a adição de glutaraldeído, as formulações ficaram sob agitação magnética a 400 rpm por 8h. Posteriormente, os sistemas passaram por 3 ciclos de 15 minutos de centrifugação a 14000 rpm a 20ºC.

[093] Visualmente, durante e logo após o gotejamento de etanol, foi possível detectar a presença de agregados dispersos de albumina aderidos às paredes do frasco, o que provavelmente decorreu do processo de vórtex durante o gotejamento, de um anel de BSA na interface arlíquido após a adição de glutaraldeído e de precipitados grandes da proteína imersos na solução aquosa de etanol, o que também não permitiu a solubilização completa dos pellets entre um ciclo e outro de centrifugação. Nas figuras 10A-D, estão indicados os sistemas após a reticulação com glutaraldeído, o primeiro e o último ciclos de centrifugação e a instabilidade da formulação a curto prazo. Isso tudo, então, sugere que boa parte da albumina não formou nanopartículas e que, portanto, era preciso aprimorar a técnica.

Reformulação do Design 1:

[094] Preparou-se uma solução de tampão fosfato (contendo 71 mg de fosfato de sódio dibásico e 18 mg de fosfato de sódio monobásico em 200 mL de água) a 2mM com pH 7,2. Então, diluiu-se a BSA em água ou tampão fosfato nas proporções anteriores, reduzindo o volume de etanol para 1,2 mL nos sistemas com 100 mg de BSA e para 2 mL nos sistemas com 50 mg da proteína, justamente porque esses volumes permitiam a formação de um líquido de aspecto leitoso, sem a presença de precipitados visíveis da proteína. Ainda, também para evitar a formação dos precipitados, reduziu-se o fluxo de gotejamento para 1 mL de etanol ao longo de 5 minutos (200 µL/min), com um intervalo de 5 minutos entre um mililitro e o volume restante. Além disso, deixou-se de submeter os sistemas ao vórtex e, em vez disso, levaram-se as formulações à agitação magnética a 500 rpm, o que fez com que a BSA se aderisse ao vidro do frasco. Adicionou-se a solução de glutaraldeído (8%) como descrito anteriormente (0,6 µL/mg de BSA), e deixaram-se as formulações sob agitação magnética a 500 rpm por 4 h, dado que não se observaram previamente alterações visíveis a olho nu entre a quarta e a oitava horas de crosslinking.

[095] Apesar de todas essas alterações, ainda se formou o anel de BSA, após a adição de glutaraldeído, na parede do frasco e interface entre a solução e o ar. Posteriormente, os sistemas passaram pelos mesmos parâmetros de centrifugação. Os pellets formados após cada ciclo de centrifugação não podiam ser ressuspendidos por completo, o que impossibilitou a quantificação da formação de nanopartículas por indicar que partículas em escala superior à nanométrica ainda estavam sendo formadas. Apesar disso, após o último ciclo, descartou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se parcialmente o pellet em água para análise de tamanho, PDI e potencial zeta. Os resultados obtidos estão indicados na Tabela 6. Assim sendo, para o próximo design, utilizou-se como base os 50 mg de BSA em 1 mL água, já que foi o sistema que apresentou as melhores características de tamanho, PDI e potencial zeta: 304,4 nm; 0,28 e -30,1 mV, respectivamente.

Design 2:

[096] Neste design, alterou-se a concentração de glutaraldeído e o tempo de agitação para crosslinking, conforme planejado previamente e indicado na Tabela 4. Utilizou-se o método de dessolvatação com etanol padronizado no design 1 e prepararam-se duas soluções de glutaraldeído: uma a 3% e outra a 8% em água e adicionaram-se 30 µL dessa solução nos sistemas. Após a adição de glutaraldeído, as formulações ficaram sob agitação magnética a 500 rpm por 4 ou 24h. Durante a agitação, formou-se novamente o anel de BSA na parede do frasco no limite entre a solução e o ar (Figura 10E), o que fez com que em mais estratégias para alterar o método de crosslinking fossem pensadas. Após os ciclos de centrifugação, o pellet, mais uma vez, só pôde ser ressuspendido parcialmente.

Reformulação do Design 2:

[097] Por conta da formação do anel de BSA na interface ar-líquido durante a agitação com glutaraldeído, modificaram-se alguns parâmetros do Design 2. Seguiram-se, mais uma vez, os parâmetros de dessolvatação previamente padronizados e prepararam-se duas soluções de glutaraldeído: uma a 3% e outra a 8% em água, e adicionaram-se 30 µL dessa solução nos sistemas, desta vez com intervalos de 15 segundos a cada 5 µL, a fim de promover uma distribuição mais lenta e homogênea de glutaraldeído nos sistemas. Nos frascos com glutaraldeído a 8%, percebeu-se que havia formação imediata do agregado em forma de anel de BSA logo após a adição de 20 µL; então, pensou-se em reduzir o volume total dessa solução para 15 µL, preparando-se novos sistemas. Após a adição de glutaraldeído, as formulações ficaram sob agitação magnética a 500 rpm por 4 ou 24h, sem apresentarem agregados de proteína na parede do frasco. Posteriormente, os sistemas passaram pelos ciclos de centrifugação e tornaram a apresentar dificuldades na ressuspensão completa dos pellets. Apesar disso, após o último ciclo de centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o pellet foi parcialmente ressuspendido para caracterização. Os resultados obtidos estão indicados na Tabela 7. Como a utilização de 15 µL de uma solução de glutaraldeído a 8% por 4h promoveu melhores características de tamanho, PDI e potencial zeta (220,4 nm, 0,132 e -45,6 mV, respectivamente), esse protocolo foi escolhido para seguir nas próximas etapas do desenvolvimento das nanopartículas.

Design extra:

[098] Tendo observado nos designs anteriores que, durante a etapa de gotejamento de etanol, a adição de 1,5 mL do solvente fazia com que o sistema se apresentasse translúcido e acinzentado e que, na literatura, preconizase a formação uma solução opalescente após o gotejamento de etanol (Jithan et al., 2011), pensou-se em verificar se a redução de 0,5 mL do volume original de etanol influenciaria positivamente nas características do sistema. Portanto, utilizou-se o mesmo método padronizado anteriormente, com a redução no volume de etanol. De fato, houve diferenças quanto à coloração dos sistemas; como indicado nas Figuras 10F e 10G, os sistemas com menor volume de etanol se apresentavam opalescentes e translúcidos.

[099] Após o primeiro ciclo de centrifugação, os sistemas apresentaram diferentes colorações no sobrenadante, como indicado nas figuras 10H e 10I. Como o sistema com o menor volume de etanol apresentou um sobrenadante mais turvo e um pellet menor, era de se esperar que ele tivesse mais BSA livre e, por consequência, fosse pensado que houve menor formação de nanopartículas. No entanto, a ressuspensão dos pellets pôde ser feita por completo nesse sistema (Figura 10J) e continuou dificultada no sistema com 2 mL de etanol. Padronizou-se a utilização de 1,5 mL de etanol no desenvolvimento das nanopartículas de albumina.

Recapitulação do Design 2:

[0100] Tendo padronizado a massa de BSA do sistema, o solvente utilizado para a sua dissolução inicial, o volume e o fluxo de gotejamento de etanol, a concentração e o volume de glutaraldeído utilizado para crosslinking, pensou-se em avaliar novamente o efeito do tempo na formação de nanopartículas (4 ou 24h de agitação), conforme Design 2 da Tabela 4 previamente planejado. Passado o tempo de agitação, os sistemas passaram por 3 ciclos de 15 minutos de centrifugação a 14000 rpm a 20ºC. A ressuspensão dos pellets foi promovida por completo nos dois sistemas (Figuras 10K e 10L), ainda que o pellet dos sistemas em agitação por 24h fosse maior, o que, na verdade, é um indicativo de maior formação de nanopartículas nesse sistema. Após o último ciclo de centrifugação, descartou-se o sobrenadante e ressuspenderam-se os pellets para análise de tamanho e PDI e de potencial zeta. Os resultados obtidos estão indicados na Tabela 8. Ambos os tipos de sistemas apresentaram características de tamanho e PDI ideais e, por isso, foram comparados para a incorporação da SQ, até mesmo porque um tempo grande de agitação pode levar à precipitação da substância.

Tentativa de incorporação da SQ nas nanopartículas de albumina:

[0101] Dado que ambas as formulações descritas na recapitulação do Design 2 apresentaram características ideais de tamanho e PDI e demonstraram apresentar apenas partículas nanométricas de albumina em seu pellet após a centrifugação, elas foram selecionadas para incorporar a SQ. Como veículo para a adição da substância nas formulações, preparou-se uma solução com 500 µg de SQ em 4 mL de etanol (125 µg/mL) e levou-se esse sistema à sonicação em haste por 20 minutos (50 segundos on; 30 segundos off), com seu recipiente envolto por filme protetor para evitar a evaporação do etanol. Para preparar os sistemas, então, seguiu-se o que havia sido preconizado anteriormente: 50 mg de BSA foram diluídos em 1 mL de água, adicionaram-se 1,5 mL da solução de SQ em etanol (totalizando 187,5 µg de substância) por meio de gotejamento, num fluxo de 200 µL/min, com intervalo de 5 minutos entre o primeiro mililitro e o volume restante, a fim de se promover a dessolvatação e a interação da substância com a albumina, e posteriormente, adicionaram-se 15 µL de glutaraldeído a 8% para proporcionar a reticulação. O tempo de agitação com glutaraldeído é o parâmetro no qual as duas formulações diferem, dado que uma delas permaneceu agitando por 4h e a outra, por 24h. Passados os tempos, os sistemas foram levados aos três ciclos de centrifugação de 15 minutos cada, a 20ºC e 14000 rpm.

[0102] Os sistemas com e sem SQ eram visualmente parecidos até a adição de glutaraldeído (Figuras 10F, 10G e 11A). Pouco tempo após a adição do reagente no sistema e a consequente agitação, as formulações passaram a apresentar diferentes colorações: o sistema sem a substância possuía uma coloração amarelada (Figura 11B), como observado anteriormente, e aquele com SQ apresentou-se inicialmente rosado até atingir (Figura 11C), ao final do processo de reticulação, uma coloração lilás/roxa (Figura 11D). Após o primeiro ciclo de centrifugação, formou-se sobrenadante e pellet amarelados nos sistemas sem SQ (Figura 11E), como observado em experimentos anteriores de padronização, e roxos nos sistemas com SQ (Figura 11F). Ainda, pode-se observar que, nos sistemas com SQ e preparados por meio de crosslinking por 24h, há um pellet que se assemelha ao observado em formulações anteriormente testadas, o que pode indicar que a reticulação por um tempo prolongado promove a precipitação da SQ.

[0103] De qualquer forma, realizou-se a caracterização de tamanho, PDI, potencial zeta e formação de nanopartículas dos quatro sistemas. Para caracterizar tamanho e PDI, diluiu-se a formulação na proporção de 1:50 v/v em água e, para potencial zeta, de 1:50 v/v em KCl a 1 mM. Os resultados obtidos nos experimentos de caracterização estão localizados na Tabela 9. Como se pode observar, todas as formulações apresentaram características ideais de tamanho, PDI e potencial zeta, podendo ser todas, a partir desses parâmetros, utilizadas em experimentos futuros. Ressalta-se que, como será descrito mais adiante neste documento, a nanoformulação ainda apresentou atividade citotóxica a despeito da mudança de coloração.

Métodos alternativos ao uso de glutaraldeído para o desenvolvimento de nanopartículas de albumina: uso de temperatura e UV-glicose para reticulação

[0104] Devido à alteração de coloração no sistema contendo SQ após a adição de glutaraldeído, buscaram-se técnicas alternativas de desenvolvimento das nanopartículas. Assim sendo, primeiramente, utilizaram-se técnicas envolvendo alta temperatura para a polimerização das nanopartículas. Assim, utilizando-se dos mesmos procedimentos até a etapa de gotejamento de etanol, levaramse os sistemas à agitação em 500 rpm em Thermomixer (Eppendorf) a 60ºC por 2h. Após o aquecimento, os sistemas apresentaram-se levemente viscosos e foram levados aos 3 ciclos de 15 minutos de centrifugação a 14000 rpm a 20ºC. A ressuspensão dos pellets foi promovida por completo nos sistemas entre um ciclo e outro (Figura 10M) e, após o último ciclo de centrifugação, o sistema foi levado para análise de tamanho e PDI e de potencial zeta. Os resultados obtidos estão indicados na Tabela 10. Observa-se maior tamanho, assim como um desvio padrão alto, e potencial zeta inferior a 30 mV em módulo.

[0105] Mantendo-se a temperatura de 60ºC, o tempo de reticulação foi variado em 1h, 2h e 4h por meio da agitação das formulações em sistema de agitação com aumento de temperatura (usando Thermomixer a 120-500 rpm). Passado esse tempo, essas formulações passaram pelos métodos de centrifugação e de caracterização por DLS e potencial zeta que foram previamente padronizados. Os resultados do DLS constam na Tabela 11. Como observado, apenas a formulação reticulada a 60ºC por 4h apresenta características ideais de tamanho e PDI. Por conta disso, selecionou-se esse tempo de 4h e variou-se, então, a temperatura a 60ºC e a 70ºC seguindo a mesma metodologia já descrita, obtendo-se os resultados indicados na Tabela 11B. Assim sendo, a reticulação a 60ºC por 4h resultou em partículas com características ideais de tamanho e PDI. A adição de SQ nos sistemas não alterou a sua coloração. Os resultados finais, com a substância, se encontram ao final desta sessão.

[0106] Em paralelo aos sistemas de polimerização em alta temperatura, desenvolveram-se nanopartículas de albumina reticuladas com glicose e radiação ultravioleta, baseadas no trabalho de Niknejad & Mahmoudzadeh (2015). Para isso, o método de dessolvatação padronizado foi seguido (também sem SQ) e, para o crosslinking, foram adicionadas diferentes massas de glicose anidra nos sistemas: 0,9 mg, 1,8 mg e 2,7 mg (concentrações finais de 2, 4 e 6 mM, respectivamente), a fim de se determinar qual seria a melhor opção. As formulações foram, então, imediatamente expostas a uma lâmpada UV (254 nm) por 30 minutos, com uma distância de aproximadamente 15 cm. Os resultados de caracterização após a centrifugação das formulações estão indicados na Tabela 12A. Por conta de suas características ideais de tamanho e PDI, bem como um menor custo de materiais, a formulação com 4 mM de glicose foi selecionada para a próxima etapa. Assim sendo, a próxima variação foi no tempo de exposição à luz UV: 15 minutos, 30 minutos e 1h. Os resultados de caracterização dessa variação estão indicados na Tabela 12B. Por conta das características de tamanho e PDI, o sistema com 4 mM de glicose, exposto por 1h à luz UV foi selecionado.

Tentativa de aumento da incorporação da SQ nos sistemas

[0107] Ao se avaliarem as formulações tópicas, é de se notar que, na formulação 2 (que apresenta DMSO), há uma concentração de 2 mg/mL de SQ (500 µg de SQ em 0,5 mL de formulação). Ao calcular a concentração de SQ adicionada nas nanopartículas de albumina, observa-se que essas formulações apresentam 0,075 mg/mL de substância (187,5 µg de SQ em 2,5 mL de solução), o que corresponde a 3,75% da concentração incorporada nas formulações previamente desenvolvidas. Frente a isso, pensou-se que, com as formulações obtidas até então, não se alcançariam resultados terapêuticos suficientemente eficazes para a progressão de possíveis futuros estudos em modelos animais. Assim sendo, possíveis estratégias foram desenvolvidas, permitindo uma maior adição de SQ, seja por meio de sua dispersão em outros veículos, seja por meio da adição de substâncias que favorecessem a sua incorporação por modificações na estrutura da albumina.

[0108] O trabalho de Kayani et al. (2018) demonstra que o emprego de DMSO no preparo de nanopartículas de albumina promove a sua desnaturação e a formação de nanoestruturas com formato não-esférico (doughnut-shaped), o que, inclusive, permite uma atividade biológica diferenciada em relação a nanopartículas esféricas. Assim sendo, o grupo pensou em utilizar esse solvente para promover uma dispersão da SQ e uma maior adição da substância no sistema, o que poderia favorecer sua incorporação nas nanopartículas. Com base no que foi descrito por Kayani et al. (2018), misturou-se uma solução com 50 mg de albumina em 700 µL de água a 300 µL de uma dispersão de SQ em DMSO (na concentração de 1 mg/mL), de modo a se obter uma solução aquosa de albumina na concentração de 50 mg/mL, como padronizado. Isso promoveu a formação de espuma, um possível indicativo de desnaturação da proteína, o que poderia favorecer uma maior interação da substância com os sítios hidrofóbicos da macromolécula. Após 30 minutos de agitação, gotejou-se uma dispersão de 250 µg/mL de SQ em etanol (o dobro da solução preparada anteriormente), num fluxo de 200 µL/min, até a obtenção de opalescência, atingida com apenas 1 mL de etanol (em função da presença de DMSO). Depois disso, adicionaram-se 1,8 mg de glicose (o que equivalia a 4 mM nas formulações anteriores) e levaram-se os sistemas à UV por 1h. Não houve alteração de cor em relação ao sistema sem a substância, turbidez no sobrenadante após a centrifugação ou a formação de um grande pellet de SQ, o que indica que o DMSO pode ser empregado para o preparo das nanopartículas e, consequentemente, estudos de caracterização podem ser empregados nessa formulação.

[0109] O trabalho de Abolhassani et al. (2020) descreve o preparo de nanopartículas por meio de dois métodos: de dessolvatação e de self-assembly. Esse segundo método emprega o ditiotreitol (DTT) numa concentração de 5mM no intuito de promover a quebra de pontes dissulfeto entre os aminoácidos constituintes da albumina e favorecer, assim, uma maior exposição dos sítios hidrofóbicos da proteína. Apesar de ser um método diferente, o grupo pensou em empregar tal reagente para possivelmente promover uma maior interação da SQ com a proteína. Assim sendo, seguiu-se o mesmo método empregado para a adição de DMSO no sistema, com a adição de 0,7 mg de DTT (concentração final de 5 mM) após o tempo de agitação e formação de espuma com o DMSO. A adição desse reagente no sistema promoveu as mesmas propriedades conferidas pela adição de DMSO, com o adicional de que o pellet de SQ parecia visivelmente menor. Assim sendo, tal sistema também pode ser utilizado para caracterização em estudos futuros. Ainda, para promover uma melhor interação da SQ com a albumina e, eventualmente, reduzir o seu tamanho, pode-se levar as formulações ao homogeneizador ultrassônico em haste por tempos curtos de 1 a 5 minutos.

[0110] Apesar disso, após a centrifugação, as nanopartículas se agregam, atrapalhando a sua completa ressuspensão no sobrenadante. Para evitar este problema, podem ser adicionados agentes estabilizadores que favoreçam a desagregação dessas nanoestruturas, como poloxamer e polisorbatos.

Testes Comprobatórios de Eficácia:

[0111] Para demonstrar o potencial das nanopartículas obtidas e comprovar sua eficácia, a presente invenção será mais detalhadamente descrita sob aspecto de testes realizados assim como dos seus respectivos resultados obtidos. Assim, foram realizados os seguintes testes após o processo de preparo: a. Padronização da caracterização por espalhamento dinâmico da luz (DLS) e por potencial zeta; b. Quantificação do percentual de formação de nanopartículas; c. Análise da atividade antitumoral da seriniquinona (SQ) nas nanoformulações de albumina.

[0112] Os exemplos a seguir têm o intuito apenas de ilustrar, sem limitar o escopo da presente invenção. Quaisquer variações passíveis de serem realizadas por um técnico no assunto devem ser consideradas como dentro do escopo da presente invenção.

Padronização da caracterização por espalhamento dinâmico da luz (DLS) e por potencial zeta:

[0113] Ao longo dos designs dos experimentos, observaram-se inconsistências nos gráficos de tamanho, PDI e potencial zeta, que não apresentavam um único pico homogêneo, o que poderia ser decorrente da metodologia empregada para as análises. Assim sendo, as seguintes variáveis foram alteradas, a fim de verificar os melhores parâmetros: tempo de equilíbrio prévio às análises, proporção de diluição e solvente. Dessa forma, padronizouse, para avaliar as características dos sistemas contendo a SQ: um tempo de equilíbrio de 60-120 segundos, e diluição de 1:50 v/v em água para analisar tamanho e PDI e de 1:50 v/v em KCl (1 mM) para analisar potencial zeta.

[0114] Dessa forma, os 4 sistemas finais descritos até aqui puderam ter a SQ incorporada e foram caracterizados de acordo com seu tamanho, PDI e potencial zeta. Os resultados finais de caracterização dos sistemas com e sem SQ se encontram na Tabela 13.

Quantificação do percentual de formação de nanopartículas

[0115] Para quantificar o percentual de formação de nanopartículas, coletou-se o sobrenadante dos sistemas após a primeira centrifugação para se aferir a massa de BSA livre e, assim, calcular indiretamente a quantidade de albumina que formou nanopartículas. Por isso, tal quantificação só faz sentido se o sistema consiste apenas em duas fases após a primeira centrifugação: um sobrenadante (com BSA livre em solução) e um pellet contendo as nanopartículas, como observado ao longo dos últimos experimentos, e não agregados maiores como observado nos primeiros experimentos. Para a técnica de Bradford, montou-se uma curva-padrão com BSA, que possibilitava a quantificação da albumina entre 1 e 20 µg nas amostras e, para as amostras em si, foram misturados em cada poço: 60 µL de reagente de Bradford, 239 µL de água e 1 µL do sobrenadante de cada sistema, diluído previamente em água na proporção de 1:1. A análise foi feita em duplicata em espectrofotômetro no comprimento de onda 595 nm. Os resultados finais obtidos por essa técnica também estão contidos na Tabela 13.

[0116] Por conta dos resultados de caracterização, as formulações polimerizadas em alta temperatura foram descartadas pelo grupo. Por conta do tempo elevado e dos resultados menos satisfatórios em comparação com as formulações agitadas por 4h, os sistemas com glutaraldeído e agitados por 24h também foram descartados. Assim sendo, para estudos subsequentes, restaram as formulações com glutaraldeído agitadas por 4h e com glicose, exposta à UV por 1h.

Análise da atividade antitumoral da seriniquinona (SQ) nas nanoformulações de albumina:

[0117] Ao se reticularem as nanopartículas de albumina contendo SQ com glutaraldeído, os sistemas passaram por uma transição de cores até atingir uma coloração rosa/roxa, o que levantou a hipótese de degradação da substância e consequente perda de atividade da substância. Assim sendo, outros métodos foram desenvolvidos, até mesmo porque o glutaraldeído apresenta toxicidade e pode se apresentar em concentrações-traço mesmo após os ciclos de centrifugação. Para verificar se houve perda da atividade citotóxica da SQ nas formulações, então, prepararam-se dois sistemas contendo SQ: um reticulado com glutaraldeído por 24h e outro com glicose (4 mM) a 1h (que não apresentou alterações de coloração). Então, realizaram-se testes em linhagens celulares de melanoma: SK-Mel-28 (BRAFV600E) e SK-Mel-147 (NRASQ61R), em que a atividade da substância foi avaliada por ensaio de MTT. A Figura 12 indica que ambas as formulações apresentaram valores de IC50 muito próximos entre si, o que foi evidenciado pelos seus respectivos intervalos de confiança (95%), demonstrando que a atividade da substância é a mesma independentemente do processo de reticulação.

[0118] No entanto, vale ressaltar que concentrações iguais de formulação não indicam concentrações iguais de nanopartículas e, consequentemente, de SQ. Em outras palavras, este ensaio serve como prova de conceito de que, mesmo com a alteração da coloração do sistema, há atividade citotóxica. No entanto, não é possível comparar a citotoxicidade das duas nanopartículas com base na concentração de SQ, uma vez que ainda não foi padronizado método para quantificação da sua eficiência da encapsulação nas nanopartículas e, consequentemente, qual porcentagem da SQ permanece nas nanopartículas após as etapas de centrifugação (as quais eliminam a fração de fármaco não encapsulado). Essa figura, ainda, demonstra que as formulações sem SQ não apresentaram citotoxicidade para as células de melanoma nas concentrações testadas.

[0119] Em uma quinta modalidade, a presente invenção revela a ação antifúngica da seriniquinona (SQ).

[0120] A atividade antifúngica da SQ contra leveduras (Candida spp. e Cryptococcus spp.) e fungos dimórficos (Sporothrix brasiliensis – fase leveduriforme), está relacionada com a inibição do crescimento fúngico em concentrações ≤ 2 µg/mL; resultado este, que é comparável ao antifúngico fluconazol (Tabela 14). Vale ressaltar que, provavelmente, a SQ possui atividade inibitória atuando em alvo molecular na célula fúngica diferente do proposto para os melanócitos, pois os fungos não produzem a proteína dermicidina. Dessa forma, esse resultado dá a possibilidade da investigação do mecanismo de ação da SQ sobre os fungos. Adicionalmente, as nanoformulações desenvolvidas têm o potencial para serem aplicadas no tratamento de micoses mucocutâneas (ex. candidíase), subcutâneas (ex. esporotricose) e sistêmicas (ex. candidíase, criptococose).

CI50, menor concentração que inibe ~50% do crescimento fúngico CI90, menor concentração que inibe ~90% do crescimento fúngico CFM, menor concentração que reduz ~99.9% da viabilidade do fungo AMB, anfotericina B, a concentração inibitória mínima é definida como o valor de CI90 FLC, fluconazol, a concentração inibitória mínima é definida como o valor de CI50 Categoria de suscetibilidade: I, Intermediário; R, resistente a droga fungicida b droga fungistática n.d., não determinado

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Claims (30)

1. Processo de obtenção de sistemas nanoestruturados caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: a) misturar os componentes fosfatidilcolina, tricaprilina e propilenoglicol; b) fundir os referidos componentes em banho-maria à 80ºC por 20 minutos; c) submeter o sistema a agitação por vórtex a cada 5 minutos por 15 segundos, até a dissolução da fosfatidilcolina na mistura e homogeneização do sistema; d) incorporar a seriniquinona em pó ou diluída em dimetilsulfóxido (DMSO); e) promover a ultrassonicação em haste até completa dissolução do fármaco (quando adicionado em pó); f) adicionar água no sistema até transformação em fase lamelar com consequente aumento da viscosidade.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (a) a mistura de fosfatidilcolina e tricaprilina está na proporção de 95:5- 80:20 m/m, preferencialmente 9:1.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que na etapa (a) a proporção da mistura de fosfatidilcolina e tricaprilina com o propilenoglicol é de 1:1 - 1,5:1, preferencialmente 1:1.
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende a formação de um primeiro sistema que consiste em 0,1 a 1 mg de seriniquinona pura, seguida de ultrassonicação em haste por 10 minutos em ciclos de 50s on - 30s off, e adição de 5% de água em relação à massa inicial da formulação.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que, preferencialmente, até 0,5 mg de seriniquinona são incorporados na formulação.
6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um segundo sistema que consiste em 1 mg de SQ em 66,66 μL (70 mg) de DMSO, em solução final de 15 mg/ml; em que a solução final é aquecida à 80ºC por 10 minutos passando por agitações no vórtex de 15 segundos e, em seguida, adicionando-se essa solução supersaturada à formulação, levando-a à ultrassonicação em haste por 10 minutos em ciclos de 50s on - 30s off e adicionando-se 5% de água.
7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6 caracterizado pelo fato de que os primeiro e segundo sistemas são formados por cristais líquidos do tipo lamelar de forma estável.
8. Cristais líquidos do tipo lamelar de forma estável, obtidos conforme processo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizados pelo fato de que o primeiro sistema consiste em 42,86% de fosfatidilcolina; 4,76% de tricaprilina; 47,60% de propilenoglicol; 4,76% e de 0,1 a 1 mg de seriniquinona, preferencialmente 0,5 mg de seriniquinona.
9. Cristais líquidos do tipo lamelar de forma estável, caracterizados pelo fato de que o segundo sistema consiste em 37,82% de fosfatidilcolina; 4,20% de tricaprilina; 42,02% de propilenoglicol; 4,20%; 11,76% de dimetilsulfóxido e de 0,1 a 1 mg de seriniquinona, preferencialmente 1 mg de seriniquinona.
10. Cristais líquidos, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizados pelo fato de que incorporam de 0,5 a 1 mg de seriniquinona em 525 de formulação do primeiro sistema e 595 mg de formulação do segundo sistema, respectivamente.
11. Cristais líquidos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizados pelo fato de que aumentam a quantidade da seriniquinona em até quase cem mil vezes.
12. Cristais líquidos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizados pelo fato de que proporcionam uma distribuição homogênea da molécula ao longo do tempo em um sistema passível de administração.
13. Cristais líquidos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizados pelo fato de que possuem o pH = 5 e comportamento reológico pseudoplástico, não-newtoniano.
14. Cristais líquidos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizados pelo fato de que apresentam uma retenção de seriniquinona no estrato córneo (EC) de 2,09 ± 0,57 μg/cm2 para o primeiro sistema; e 1,75 ± 0,57 μg/cm2 para o segundo sistema;
15. Cristais líquidos, de acordo com a reivindicação 14, caracterizados pelo fato de que apresentam uma retenção de seriniquinona na epiderme viável e na derme ED de 2,28 ± 0,86 μg/cm2 para o primeiro sistema e 2,95 ± 1,25 μg/cm2 para o segundo sistema.
16. Cristais líquidos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 15, caracterizados pelo fato de que os primeiro e segundo sistemas são não-irritantes, apresentando resultado do teste de Luepke S = 0.
17. Uso dos cristais líquidos do tipo lamelar, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 8 a 16, caracterizado pelo fato de ser no preparo de uma nanoformulação para o tratamento do câncer melanoma por via tópica.
18. Processo de obtenção de nanopartículas de albumina, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: a) diluir a albumina em água e, eventualmente, misturar com DMSO e seriniquinona até que ocorra desnaturação e dispersão da molécula no sistema; b) gotejar etanol e seriniquinona até promoção da dessolvatação e formação de agregados de albumina e seriniquinona; c) estabilizar os sistemas por meio de reticulação com glutaraldeído ou glicose associado à exposição ao UV; d) Centrifugar e ressuspender, em ciclos, até a purificação das formulações.
19. Processo de obtenção de nanopartículas de albumina de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende, opcionalmente, a adição de 5 mM ditiotetriol (DTT).
20. Processo de obtenção de nanopartículas de albumina de acordo com a reivindicação 18 ou 19 caracterizadas pelo fato de que na etapa (a) o componente albumina sérica bovina (BSA) está preferencialmente na concentração de 50 mg/mL em 1 mL de água; opcionalmente 700 µL de água e 300 µL DMSO.
21. Processo de obtenção de nanopartículas de albumina de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20 caracterizado pelo fato de que na etapa (b) é gotejado preferencialmente de 1 a 1,5 mL de etanol, em fluxo de 200 µL/min, até a obtenção de opalescência.
22. Processo de obtenção de nanopartículas de albumina de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21 caracterizado pelo fato de que na etapa (c), é adicionado 15 µL de glutaraldeído a 8% ou glicose a 4-6 mM, seguido de agitação por 4h ou exposição a UV, respectivamente.
23. Nanopartículas de albumina, obtidas conforme processo definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizadas pelo fato de que possuem tamanho de partícula inferior a 400 nm, índice de polidispersão (PDI) menor que 0,250 e potencial zeta superior a 30 mV em módulo.
24. Nanopartículas de albumina de acordo com a reivindicação 23, caracterizadas pelo fato de que preferencialmente possuem tamanho de partícula 220,4 nm, PDI 0,132 e potencial zeta de -45,6 mV.
25. Nanopartículas de albumina, de acordo com a reivindicação 23, caracterizadas pelo fato de que compreendem concentrações de 75 a 550 µg/mL de seriniquinona.
26. Uso das nanopartículas de albumina, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de ser no preparo de um medicamento para administração sistêmica da seriniquinona, em que ocorre o direcionamento ao microambiente tumoral e a sua posterior captação pela célula transformada.
27. Uso das nanopartículas de albumina, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de ser no preparo de um medicamento para tratar infecções fúngicas.
28. Uso das nanopartículas de albumina, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que as infecções fúngicas são selecionadas do grupo que consiste em micoses mucocutâneas, subcutâneas e sistêmicas, preferencialmente candidíase, criptococose e esporotricose.
29. Uso, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que a atividade antifúngica é contra leveduras, preferencialmente Candida spp. e Cryptococcus spp. e fungos dimórficos, preferencialmente o Sporothrix brasiliensis em fase leveduriforme.
30. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizado pelo fato de que a atividade antifúngica está relacionada com a inibição do crescimento fúngico em concentrações ≤ 2 µg/mL.

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