ES2283423T3

ES2283423T3 - Emulsion estructurada de anfotericina b.

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Publication number: ES2283423T3
Application number: ES01958366T
Authority: ES
Inventors: Srikanth A. Bharat Serums & Vaccines Ltd PAI; Shilpa S. Kocharekar; Sangeeta H. Bharat Serums & Vacc. Ltd Rivankar
Original assignee: Bharat Serums and Vaccines Ltd
Current assignee: Bharat Serums and Vaccines Ltd
Priority date: 2000-06-22
Filing date: 2001-06-19
Publication date: 2007-11-01
Anticipated expiration: 2021-06-19
Also published as: WO2001097778A2; AU2001280084B2; CN1447682A; KR100812764B1; ZA200300330B; AU8008401A; CN100502834C; RU2275899C2; US20030206929A1; WO2001097778A3; DE60127140D1; DE60127140T2; JP4804702B2; IN188843B; EP1313449B1; EP1313449A2; ATE355825T1; US7053061B2; KR20030039331A; JP2004525068A

Abstract

Una composición parenteral esterilizada en autoclave de anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada, que tiene una LD50 de al menos 400 mg/kg en ratones, que comprende a) una fase oleosa en una cantidad de hasta 30% p/v de la composición, seleccionada de aceites vegetales; b) Anfotericina B en una cantidad de 0, 05% a 1% p/v de la composición, dispersada en la fase oleosa; c) agua como fase acuosa; d) un agente modificador de la tonicidad disuelto en la fase acuosa; y e) un emulsionante fosfátido natural en una cantidad de hasta 3% p/v de la composición, dispersado en la fase acuosa.

Description

Emulsión estructurada de anfotericina B.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a una composición de anfotericina B con baja toxicidad. Esta invención se refiere particularmente a una composición de anfotericina B con baja toxicidad en una emulsión estructurada de tipo aceite en agua, para administración parenteral.

Antecedentes de la invención

La anfotericina B es un antibiótico poliénico, macrocíclico, producido por el Streptomyces nodosus. Es eficaz frente a una amplia variedad de hongos, levaduras y algunos protozoos.

La anfotericina B para administración intravenosa estuvo originalmente disponible en una forma coloidal convencional. Incluso hoy, unos 35 años después de su desarrollo, se usa ampliamente como un importante agente antifúngico debido a su fiable eficacia terapéutica. La tolerabilidad del fármaco es baja a la vista del número de efectos adversos comunicados cuando se usa clínicamente. En casi todos los pacientes que reciben intravenosamente anfotericina B convencional aparece nefrotoxicidad. Los otros efectos adversos incluyen hipertensión, hipotensión, arritmia cardiaca incluyendo fibrilación ventricular, parada cardiaca, trastornos hepáticos. Aparecen daños tanto tubulares como glomerulares y hay riesgo de deterioro permanente de la función renal. Las soluciones de anfotericina B irritan el endotelio venoso y pueden causar dolor y tromboflebitis en el sitio de la inyección debido al tensioactivo sintético desoxicolato de sodio usado en la preparación para solubilizar la anfotericina B.

Para reducir los efectos tóxicos, se ha formulado la anfotericina B en diferentes sistemas de administración de fármacos tales como complejos lipídicos, liposomas y emulsiones. Estas composiciones tienen mayor eficacia, teniendo además una menor toxicidad en comparación con el fármaco cuando se usa en la forma libre. Tanto las formulaciones de complejos lipídicos como las formulaciones liposómicas de anfotericina B están ahora disponibles en el mercado y han sido aprobadas en diferentes países en todo el mundo.

La principal desventaja de las formulaciones lipídicas basadas en complejos lipídicos y liposomas, es el alto coste de la terapia. La anfotericina B es un fármaco lipófilo que se une a los esteroles y se intercala en las bicapas lipídicas y por tanto la anfotericina B es particularmente adecuada para uso con los sistemas de administración basados en lípidos.

Se ha hecho en este laboratorio un intento de formular la anfotericina B en la forma de una emulsión basada en lípidos que tiene los beneficios de una baja toxicidad a un coste más bajo de la terapia.

Volker Heinemann et al., han asumido [Antimicrobial agents and chemotherapy 1997, 41(4); 728-732] que las emulsiones lipídicas reducen la cantidad de anfotericina B oligomérica y con ello reducen la interacción de la anfotericina B con el colesterol de las membranas celulares humanas. Sin embargo, la anfotericina B monomérica restante retiene su potencial de unión con el ergosterol de las membranas celulares fúngicas.

Kirsh R. Goldstein R, Tarloff J, et al., han publicado (J. Infect. Dis. 1988, 158; 1065-1070) que la composición de emulsión lipídica de la anfotericina B, preparada mezclando con una emulsión de lípidos, tiene una baja toxicidad sin pérdida de actividad antifúngica. Sin embargo, se ha encontrado que la estabilidad física de dicha emulsión lipídica que contiene la anfotericina B es mala.

Moreau P, et al., han publicado (J. Antimicro. Chemother. 1992, 30; 535-541) que los pacientes tratados con una emulsión de lípidos mezclada con anfotericina B inyectable, parecían tener una reducción significativa de la toxicidad relacionada con la infusión y de la disfunción renal.

El uso de la anfotericina B mezclada con una emulsión de lípidos de nutrición parenteral va en aumento tanto en Europa como en Estados Unidos.

Los procedimientos de la técnica anterior para preparar la emulsión de anfotericina B se detallan a continuación:

Patente de Estados Unidos 5364632 (1994) / Patente Japonesa JP 2290809 (1990)

El procedimiento de preparación de una emulsión de acuerdo con esta invención se describe en el ejemplo típico siguiente:

Se disolvió la anfotericina B en metanol (0,8 mg/ml) en un baño de ultrasonidos (15 minutos). Se disolvieron en cloroformo los fosfolípidos E-80 (que contienen principalmente 80% de fosfatidil-colina y 8% de fosfatidil-etanolamina). Se mezclaron ambas soluciones y se filtraron a través de un sistema filtrante combinado que comprende un prefiltro de fibra de vidrio y un filtro de membrana de celulosa regenerada de 0,45 \mu (RC 5) (GF92) para separar los pirógenos y los agregados. La solución lipídica límpida resultante se depositó como una película fina sobre las paredes de un matraz de fondo redondo mediante evaporación rotatoria bajo presión reducida a 40ºC. La fase acuosa que comprende el poloxámero, el desoxicolato de sodio y la glicerina, se filtró a través de un filtro Millipore de 0,22 \mu, se vertió al matraz y se sonicó la dispersión hasta que se obtuvo una mezcla homogénea de liposomas.

Se calentó a 70ºC, aceite MCT (triglicérido de cadena media), filtrado a través de un filtro Millipore de 0,22 \mu, y conteniendo \alpha-tocoferol, y después se mezcló con la mezcla liposómica calentada a 45ºC y se dispersó en ella mediante un agitador magnético.

Se llevó a cabo la emulsificación mientras se mantenía la misma temperatura usando un mezclador de alto cizallamiento, Polytron. Se enfrió rápidamente la emulsión grosera resultante. Se consiguió una emulsión fina monodispersada usando un homogenizador en dos etapas.

Finalmente, se ajustó el pH de la emulsión y se filtró a través de un filtro Millipore de 0,45 \mu para separar las gotas gruesas y los restos, generados durante el procedimiento de emulsificación y homogenización.

Todas las operaciones del procedimiento se llevaron a cabo en condiciones asépticas.

Las cantidades relativas de los diferentes ingredientes en las emulsiones finales del Ejemplo y el intervalo dado en la descripción son los siguientes:

Anfotericina B 0,075% (0,015-0,15%), aceite MCT 20% (3-50%), fosfolípido E80 0,5% (0,5-20%), poloxámero 2% (0,3-10% ), desoxicolato de sodio 1% (0,5-5%), glicerina 2,25%, \alpha-tocoferol 0,02% y agua bidestilada 200%.

Los inconvenientes del procedimiento de la Patente de Estados Unidos 5364632 (1994) y la Patente Japonesa JP 2290809 (1990) son:

i.: Como la solubilidad de la anfotericina B en metanol es baja, se requiere una gran cantidad de metanol para disolver la cantidad requerida de anfotericina B. Esto limita el nivel del fármaco en la composición final.

ii.: En este procedimiento es necesario formar en primer lugar una película delgada de fármaco, anfotericina B y fosfolípidos, y después hidratar dicha película utilizando la fase acuosa. La fase acuosa contiene un agente emulsionante no iónico, poloxámero, un tensioactivo, desoxicolato de sodio, y glicerina.

iii.: La fase oleosa usada es aceite MCT con \alpha-tocoferol añadido. Se prepara la emulsión añadiendo la fase oleosa mantenida a 70ºC a la fase acuosa mantenida a 45ºC. Esto no asegura que la anfotericina B sea retenida en la fase oleosa. Este procedimiento no aprovecha el potencial total de reducir la toxicidad de la anfotericina B si fuera puesta en la fase oleosa.

iv.: El producto del procedimiento de la Patente de Estados Unidos 5364632 (1994) se prepara en condiciones asépticas para hacerle estéril. El procedimiento preferido de esterilización especificado en las farmacopeas es el autoclavado del producto en el envase final. Además como la anfotericina B se administra comúnmente por vía intravenosa, la esterilización terminal es la única alternativa preferida que ofrece la más alta confianza de cumplimiento de la esterilidad.

v.: El producto en emulsión aunque es estable frente al estrés mecánico, no ha sido estudiado en cuanto a toxicidad. Por tanto la toxicidad del producto no se conoce. Sin embargo se han hecho estudios comparativos in vivo en ratones Balb/c en comparación con Fungizone, que es una formulación comercial de anfotericina B que contiene desoxicolato de sodio. Este estudio indicó que el producto es menos tóxico que el Fungizone.

vi.: El uso de aceite MCT y el poloxámero aumenta la concentración plasmática del fármaco reduciendo la captación del fármaco por el sistema retículo-endotelial (RES). En el caso de infecciones fúngicas, se requiere que la anfotericina B sea distribuida en el sistema retículo-endotelial, que es el sitio de la infección.

Patente Japonesa 11-60491 (1989)

En esta Patente Japonesa se ha descrito una formulación medicinal que contiene anfotericina B en forma de emulsión. La emulsión contiene

i): Anfotericina B (1 a 10 mg/ml de emulsión final).

ii): la fase oleosa - La fase oleosa consiste en aceites vegetales, aceite de pescado o triglicéridos, (1-50%, preferiblemente 5-30%). El aceite preferido usado es aceite de soja o aceite de sésamo.

iii): Emulsionantes - El emulsionante usado son fosfolípidos. Adicionalmente se emplean también emulsionantes no tóxicos. Los fosfolípidos usados son tales como fosfolípidos de yema de huevo, fosfolípidos de soja, o un producto hidrogenado obtenido de estos materiales. Se han usado también fosfatidil-colina, fosfatidil-etanolamina, fosfatidil-inositol, fosfatidil-serina, ácido fosfatídico y fosfatidil-glicerol. La cantidad recomendada es 1-50% en peso del componente oleoso, preferiblemente 10-30% en peso del componente oleoso o 1-10% p/v, preferiblemente 4-6% p/v de la emulsión.

\quad: Se emplean emulsionantes no iónicos tales como polialquilenglicol (peso molecular 1000-10000, preferiblemente 4000-6000); o polímeros de polioxietileno o polioxi-propileno (peso molecular 1000-20000, preferiblemente 2000-10000), derivados de polioxi-alquileno de aceite de ricino hidrogenado tales como aceite de ricino hidrogenado polioxietilen-20-éter, -40-éter, -100-éter, en cantidades menores de 5% p/v preferiblemente menores de 1% p/v. Se puede usar también una combinación de los dos emulsionantes no iónicos.

iv): ácidos grasos y sus sales (farmacéuticamente aceptables) - hasta el 1%, preferiblemente 0,5% p/v.

v): agentes de estabilización, menos del 5% p/v, preferiblemente menos del 1% p/v, que incluyen

a): sustancias poliméricas de alto peso molecular, tales como albúmina de origen humano; copolímeros vinílicos por ejemplo, polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico); aminas alifáticas,

b): gelatina, almidón hidroxietilado; variedades de colesterol.

vi): agentes isotónicos - menos de 5% p/v, preferiblemente menos de 1% p/v.

vii): glicerina o sus monoésteres, tales como mono-oleína, mono-palmitina.

viii): sacáridos tales como mono y disacáridos, sorbitol, xilitol, menos de 5% p/v, preferiblemente menos de 1% p/v.

ix): antioxidantes tales como tocoferol, menos de 5% p/v, preferiblemente menos de 1% p/v;

x): agentes controladores del pH tales como ácidos, álcalis y tampones.

El procedimiento de fabricación seguido es el publicado en el pasado. Este procedimiento incluye formar en primer lugar una emulsión agua en aceite (w/o) y después convertirla en una emulsión aceite en agua (o/w) por dilución con agua. En este procedimiento, se mezclan juntos aceite de soja, fosfolípido, anfotericina B y algo de agua así como otros aditivos (cuando se usen) y se calientan si fuera necesario. Se homogeniza después la mezcla en un homogenizador de alta presión. Se añade más agua en la cantidad requerida para convertir la emulsión w/o en una emulsión o/w, que se homogeniza de nuevo.

En un ejemplo típico, 200 g de aceite de soja, 50 g de fosfolípido y 2,5 g de anfotericina B y 750 ml de agua, se someten al procedimiento anterior.

En otro ejemplo se ha incorporado a la composición anterior glicerina al 2,2% p/v de la composición.

El tamaño medio de las gotas de la emulsión es de 0,1-0,2 \mu. La emulsión y su tamaño de gota son estables hasta 10 días bajo condiciones de refrigeración.

Los inconvenientes de este procedimiento de la Patente Japonesa 11-60491 (1989) son:

Es sabido que la anfotericina B en una formulación en emulsión es menos tóxica que la formulación convencional de anfotericina B. Sin embargo, las formulaciones de esta Patente Japonesa 11-60491 (1989) no aprovechan todo el potencial de reducción de la toxicidad disponible para este concepto de emulsión, debido al procedimiento de preparación de la emulsión seguido en esta patente.

i.: Debido a que el tamaño medio de partícula de la emulsión obtenida en la Patente Japonesa JP 11-60491 (1989) varía de 0,1 a 0,2 \mu, es imposible aprovechar el beneficio bien conocido de la captación preferente de las partículas de mayor tamaño por el sistema retículoendotelial. Es necesaria la captación preferente de anfotericina B por el sistema retículoendotelial, ya que éste es el sitio para la mayor parte de las infecciones fúngicas.

ii.: La estabilidad de la emulsión se estudia durante 10 días en refrigerador.

iii.: Se proponen para adición a la formulación de la emulsión un gran número de aditivos que incluyen agentes de soporte de la emulsificación tales como aminas alifáticas, polímeros de alto peso molecular, agentes tensioactivos de naturaleza no iónica, variedades de colesterol, sacáridos tales como mono y disacáridos y antioxi- dantes.

iv.: La etapa del procedimiento de preparación de un producto estéril no ha sido especificada.

En la Patente Japonesa 4-173736 (1992), se ha descrito un producto que contiene 0,005% a 5% de anfotericina B, 0,5% a 25% de fosfolípido, preferiblemente lecitina de huevo. La composición tiene un tamaño medio de partícula de 100 nm de diámetro. Esta no es una emulsión y no contiene ninguna fase oleosa.

En la Patente de Estados Unidos 5389373 (1995), se describe un procedimiento para preparar una emulsión aceite en agua (o/w) de fármacos poco solubles. El procedimiento incluye disolver la anfotericina B en una solución acuosa de alto o bajo pH, añadir la solución resultante de no más de 100 \mug/ml de concentración a una emulsión preformada, añadir a la emulsión una cantidad de ácido, base o tampón apropiado para neutralizar y ajustar el pH del producto a un valor deseado.

Los inconvenientes de este procedimiento de la Patente de Estados Unidos 5389373 (1995) son:

El principal punto débil de este procedimiento es la limitación de la baja concentración de anfotericina B en la emulsión. En este procedimiento, la concentración de anfotericina B es del orden de 100 \mug/ml. Por tanto se requiere un volumen mayor de la composición para ser inyectado, lo que no es terapéuticamente ventajoso.

En la Patente de Estados Unidos 5534502 (1996), la anfotericina B se descristaliza usando un ácido y etanol y después se dispersa de forma homogénea en un lípido, tras lo cual se emulsiona. En este procedimiento es esencial disolver la anfotericina B en etanol, siendo la cantidad más preferida de etanol de 400 a 600 ml/g de anfotericina B. El principal punto débil de este procedimiento es que la anfotericina B no es estable a pH ácido.

La Patente Europea EP 0700678 (1996) describe una emulsión lipídica que contiene esencialmente ácido cítrico o una de sus sales farmacéuticamente aceptables y al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en metionina, fenilalanina, serina, histidina y sus sales farmacéuticamente aceptables, con la condición de que no contenga simultáneamente metionina y fenilalanina.

Es un requerimiento esencial usar simultáneamente ácido cítrico y al menos uno de los anteriores aminoácidos. El procedimiento de preparación de una emulsión de acuerdo con esta invención se describe a continuación:

Se disuelven en un disolvente orgánico apropiado tal como hexano, los fosfolípidos y agentes auxiliares para emulsificación tales como ácido oleico y después se separa el disolvente por destilación a presión reducida para dar una película lipídica. A la película lipídica resultante, se añade el componente oleoso y agua y la mezcla se emulsiona preliminarmente mediante agitación vigorosa con sacudidas. El líquido resultante se emulsiona usando un emulsionante de uso normal. Después de completar la emulsificación se ajusta el valor del pH de la emulsión resultante a un nivel determinado mediante la adición de ácido clorhídrico o de hidróxido de sodio. Después se añaden ácido cítrico y aminoácido a la emulsión para dar una emulsión lipídica. Alternativamente la emulsión lipídica se puede preparar asimismo añadiendo un componente oleoso y una solución acuosa de ácido cítrico y aminoácidos a la película lipídica preparada por los procedimientos mencionados y sometiendo después la mezcla resultante a los procedimientos de emulsificación.

Los inconvenientes de este procedimiento de la Patente Europea EP 0700678 (1996) son:

El procedimiento de preparar una emulsión de anfotericina B no ha sido descrito específicamente. La anfotericina B es uno de los fármacos de una lista de aproximadamente 70 fármacos que se definen como "que pueden ser formulados en emulsión lipídica".

i): El procedimiento de preparar emulsiones lipídicas incluye disolver los fosfolípidos en disolventes orgánicos apropiados tales como hexano.

ii): En los ejemplos de esta patente, se añaden aminoácidos y ácido cítrico a las emulsiones lipídicas preformadas y se estudia la estabilidad a 60ºC en cuanto a cambio de color. Se requiere que las emulsiones intravenosas sean estables a las temperaturas de esterilización en autoclave.

iii): El procedimiento de esterilización especificado en uno de los ejemplos es calentar a 60ºC durante 1 hora y repetir este procedimiento de esterilización tres veces cada 24 horas. Este procedimiento no es adecuado para preparar inyecciones intravenosas.

El principal objetivo de la presente invención es desarrollar un procedimiento para una emulsión de anfotericina B útil para la administración parenteral, que tiene muy baja toxicidad y para resolver los inconvenientes y puntos débiles de los procedimientos de la técnica anterior enumerados antes.

Así la parte principal del objetivo más importante, es desarrollar un procedimiento para recubrir el polvo sólido de anfotericina B con aceite, y poner el polvo sólido de anfotericina B recubierto con aceite en la fase oleosa de la emulsión aceite en agua, con la condición de retener la anfotericina B incorporada en la fase oleosa de la emulsión a lo largo de todo el procedimiento de fabricación, incluyendo el procedimiento de esterilización en autoclave, y después hasta su fecha de caducidad o uso.

Otra parte del objetivo principal es desarrollar un procedimiento para preparar dicha emulsión estructurada aceite en agua, con un promedio de gotas oleosas en la emulsión controlado en el intervalo óptimo, de forma que sean preferiblemente distribuidas en el sistema retículo-endotelial, dando una baja concentración plasmática. Por lo tanto, con fines inyectables actúa como una emulsión de fase exterior acuosa que lleva glóbulos oleosos que contienen la anfotericina B recubierta con aceite.

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Otra parte del objetivo principal es desarrollar un procedimiento para preparar dicha emulsión estructurada de anfotericina B que necesitará solamente un mínimo de aditivos, que son esenciales para preparar una emulsión aceite en agua.

Sumario de la invención

Por consiguiente, la presente invención se refiere a una composición parenteral esterilizada en autoclave de anfotericina B recubierta con aceite en una forma de emulsión estructurada, que tiene una LD_{50} de al menos 400 mg/kg en ratones, que comprende

a): una fase oleosa (hasta 30% p/v de la composición) seleccionada del grupo de aceites vegetales tales como aceite de soja, aceite de sésamo, aceite de cártamo;

b): Anfotericina B (0,05% a 1% p/v de la composición) dispersada en la fase oleosa;

c): agua como fase acuosa;

d): agentes modificadores de la tonicidad tales como glicerina, manitol, dextrosa, disueltos en la fase acuosa y;

e): un emulsionante fosfátido natural (hasta 3% p/v de la composición) dispersado en la fase acuosa.

En otra realización, esta invención se refiere al procedimiento para la fabricación de dicha composición parenteral de anfotericina B recubierta con aceite en una forma de emulsión estructurada, que tiene una LD_{50} de al menos 400 mg/kg en ratones, que comprende dispersar la anfotericina B en la fase oleosa; preparar la fase acuosa disolviendo un agente modificador de la tonicidad en agua; dispersar el agente emulsionante en la fase acuosa; ajustar el pH de la fase acuosa a aproximadamente 8-11; añadir la fase oleosa a la fase acuosa con agitación para obtener una emulsión grosera estructurada; homogenizar la emulsión grosera estructurada hasta un tamaño de partícula inferior a 2 micras; filtrar, llenar la emulsión estructurada homogenizada en recipientes de vidrio bajo nitrógeno, cerrar los recipientes de vidrio, sellar los recipientes de vidrio cerrados y esterilizar los recipientes llenos sellados mediante autoclavado. El orden de las etapas de este procedimiento es importante. La alteración del orden de las etapas de este procedimiento cambia la estructura de la emulsión como se refleja por los estudios de
toxicidad.

Es característico del procedimiento de la presente invención que el fosfátido de huevo se dispersa en la fase acuosa mientras que la anfotericina B en polvo se dispersa en la fase oleosa y por tanto el producto se describe como anfotericina B recubierta con aceite en la forma de una emulsión estructurada.

En otra realización, esta invención se refiere a una composición parenteral de anfotericina B recubierta con aceite en forma de una emulsión estructurada que se fabrica por el procedimiento descrito antes.

La formulación de la anfotericina B como forma de emulsión estructurada de tipo aceite en agua mediante el procedimiento de la presente invención, dio como resultado una reducción considerable de su toxicidad y aseguró la esterilidad de la composición sin alterar su actividad antifúngica. La composición de la presente invención, al ser menos tóxica, proporciona la posibilidad de aumentar los niveles de dosis para tratar ciertas infecciones.

La composición parenteral de anfotericina B recubierta con aceite en forma de una emulsión estructurada de la presente invención es menos tóxica y se caracteriza por

a): tener una LD_{50} de al menos 400 mg/kg de peso corporal en un estudio de toxicidad con dosis única y de al menos 40 mg/kg de peso corporal en un estudio de toxicidad con dosis repetidas, en ratones;

b): tener una LD_{50} de al menos 150 mg/kg de peso corporal en ratas en un estudio de toxicidad con dosis única;

c): tener al menos 20 veces menos efecto hemolítico sobre los glóbulos rojos humanos cuando se compara con la formulación convencional que contiene desoxicolato de sodio;

d): tener una distribución tisular preferente en el sistema retículo-endotelial y tener al menos dos veces el t_{1/2} en órganos del sistema retículo-endotelial comparada con la formulación convencional que contiene desoxicolato de sodio en un estudio de dosis única en ratones;

e): no tener síntomas de toxicidad cardiaca después de inyectar a los ratones, tales como distrés respiratorio grave, irritación local, distrés abdominal, y agitación.

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Descripción detallada de realizaciones de la invención

El contenido de anfotericina B en la composición parenteral de anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada de la invención, varía ampliamente en el intervalo de 0,05% a 1% p/v de la composición. Preferiblemente varía de 0,1 a 0,5% p/v y específicamente está en aproximadamente 0,5% o en aproximadamente 0,25% p/v de la composición.

En el procedimiento de la presente invención, la anfotericina B se dispersa en la fase oleosa antes de la emulsificación. Se usa la anfotericina B como tal o se microniza antes de la dispersión en la fase oleosa. La fase oleosa está presente en una cantidad que varía hasta el 30% p/v de la composición, preferiblemente de 5 a 25% p/v y más preferiblemente es 10-20% p/v, específicamente es aproximadamente el 10% p/v o aproximadamente el 20% p/v. Típicamente la fase oleosa usada es un aceite vegetal y puede ser uno de los aceites vegetales tales como aceite de soja, aceite de sésamo, aceite de semillas de algodón, aceite de cártamo, aceite de girasol, aceite de cacahuete, aceite de maíz, aceite de ricino o aceite de oliva. El aceite vegetal preferido es el aceite de soja.

En esta invención, el emulsionante se disuelve en la fase acuosa. Los emulsionantes adecuados incluyen fosfátidos naturales y fosfátidos modificados. Los emulsionantes preferidos son los fosfátidos naturales tales como fosfátido de huevo y los fosfátidos de soja. El emulsionante usado en la presente invención puede comprender una mezcla de dos o más de los emulsionantes mencionados antes. El fosfátido natural preferido es fosfátido de huevo purificado.

La composición parenteral de anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada de la presente invención, se formula para el intervalo de pH 6,0-8,5. En el procedimiento de la presente invención el pH de la fase acuosa se ajusta entre 8 y 11 con un álcali tal como solución de hidróxido de sodio o de hidróxido de potasio en agua de forma que el pH de la composición de la presente invención después del autoclavado permanezca en el intervalo de 6-8,5.

La composición parenteral de la anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada de la presente invención, se hace isotónica con la sangre mediante la incorporación de un agente modificador de la tonicidad tal como glicerina, manitol, dextrosa, o una combinación de los mismos. El agente modificador de la tonicidad preferido es la glicerina. La glicerina está presente en una cantidad de 2-3% p/v de la composición. Preferiblemente la cantidad de glicerina usada es aproximadamente 2,25% p/v de la composición.

Las composiciones parenterales de la anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada de la presente invención son específicamente emulsiones aceite en agua estériles, preparadas según los procedimientos de fabricación en condiciones controladas y se esterilizan terminalmente por autoclavado. Cuando se realiza la emulsificación a una temperatura más alta, o la fase acuosa o la fase oleosa o ambas fases se mantienen a una temperatura de hasta 75ºC.

El tamaño medio de partícula de la composición de la presente invención se mantiene deliberadamente hasta 2 \mu, de modo que la anfotericina B se distribuye preferiblemente en el sistema retículo-endotelial, dando de este modo una baja concentración plasmática.

La presente invención se describe mediante un ejemplo típico en el que la emulsión estructurada comprende anfotericina B (0,5% p/v); aceite de soja como fase oleosa (20% p/v); fosfátido de huevo purificado como emulsionante (1,2% p/v); glicerina como agente modificador de la tonicidad (2,25% p/v) y; agua (c.s.p. 100% en volumen); fabricada por el procedimiento que comprende dispersar la anfotericina B en aceite de soja; preparar la fase acuosa añadiendo glicerina al agua; seguido por la dispersión del fosfátido de huevo purificado en la fase acuosa; ajustar el pH de la fase acuosa a 10,8; añadir el aceite de soja que contiene la anfotericina B a la fase acuosa con agitación para obtener una emulsión grosera; homogenizar la emulsión grosera hasta un tamaño de partícula inferior a 2 micras; filtrar a través de un filtro de 2 micras, llenar en recipientes de vidrio bajo nitrógeno, cerrar los recipientes de vidrio, sellar los recipientes de vidrio cerrados y esterilizar los recipientes llenos sellados por autoclavado.

La emulsión estructurada de la composición parenteral de anfotericina B recubierta de aceite estructurada en una emulsión tipo aceite en agua de la presente invención, tiene baja toxicidad y tiene bajo tamaño de partícula y es adecuada para uso parenteral. La esterilidad de la composición de la presente invención se asegura porque el producto se esteriliza por autoclavado final sin pérdida significativa de actividad de la anfotericina B y sin desestabilizar la emulsión. La composición de la presente invención es fácil de usar porque el producto se puede diluir con dextrosa inyectable al 5% o con solución salina para obtener la concentración requerida para la administración parenteral. La composición de la presente invención tiene también un largo periodo de validez y por tanto es adecuada como un producto fácilmente comercializable.

Se ha estudiado el perfil de toxicidad de las emulsiones preparadas por procedimientos en los que se han hecho variaciones en el modo de adición de la anfotericina B y del fosfátido de huevo purificado. Estas variaciones se describen en los ejemplos como se indican en la siguiente Tabla.

1

En el procedimiento de la presente invención, se observa que cuando la anfotericina B se suspende en una fase acuosa da un producto que por inyección a ratones produjo síntomas de toxicidad cardiaca tales como distrés respiratorio grave, irritación local, distrés abdominal, y agitación. Sin embargo estos síntomas tóxicos no se observaron cuando la anfotericina B se suspende en la fase oleosa. Esto podría ser debido al efecto de depósito debido tanto a las gotas oleosas de la emulsión como a las células Kuppfer. Esta baja liberación podría llevar a la presencia de anfotericina B monomérica en el plasma después de la inyección de la formulación de la emulsión, reduciendo con ello la toxicidad [Ref Antimicrobial agents and chemotherapy, 1997; Vol. 41(4): Pg. 728-732].

Se ha encontrado que la composición preparada añadiendo el emulsionante lecitina de huevo en la fase oleosa producía también los síntomas de toxicidad cardiaca que se han mencionado antes. Después de una extensa experimentación se resolvió este problema añadiendo lecitina de huevo a la fase acuosa. Estos estudios del procedimiento se describen del Ejemplo I al Ejemplo VI. El Ejemplo II y el Ejemplo III que son las variaciones del Ejemplo I son todos de la presente invención, mientras que los Ejemplos IV, V y VI no son de la invención. El Ejemplo VII describe los estudios de toxicidad in vitro frente a glóbulos rojos humanos. El Ejemplo VIII y el Ejemplo XI describen los estudios de toxicidad en ratones, ratas y perros. El Ejemplo IX describe un estudio farmacocinético en conejos y el Ejemplo X describe estudios de distribución en órganos en ratones.

La observación de que la anfotericina B dispersada en aceite y la lecitina de huevo dispersada en agua dan una emulsión con una toxicidad muy baja sugiere una fuerte interacción entre las gotas oleosas y la anfotericina B. Por tanto la emulsión de anfotericina B se puede considerar como un depósito de la forma monomérica de anfotericina B, y debido a la alta estabilidad de la formulación, solamente podrían ser liberadas progresivamente cantidades limitadas de la anfotericina libre. La forma monomérica de anfotericina B es capaz de unirse al ergosterol de las células fúngicas pero es inactiva frente al colesterol de las células del mamífero hospedante y por tanto causa menor toxicidad. En el caso de la formulación convencional de anfotericina B, la liberación de altos niveles de anfotericina B libre en el plasma lleva a la presencia de oligómeros autoasociados en la circulación. Estas formas oligoméricas interactúan con el colesterol que contienen las membranas celulares del hospedante y por tanto causan más toxicidad. Esto explica el mecanismo de baja toxicidad de la emulsión de anfotericina B de la presente invención en comparación con la formulación convencional. El pico inferior de la concentración y los valores AUC en suero (Ejemplo IX) y en consecuencia la deposición más rápida de anfotericina B en los tejidos (Ejemplo X-A) explica también la razón para la toxicidad más baja de la emulsión de anfotericina B de la presente invención. La baja toxicidad se confirma por los hallazgos de esta invención, como se ve en los Ejemplos VIII-A, VIII-B y VIII-C.

Estos estudios de toxicidad demuestran que aunque la composición parenteral de la anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada del producto de la presente invención parece similar a la descrita en la Patente Japonesa 11-60491 (1989), el producto de la presente invención tiene una baja toxicidad biológica característica debido al procedimiento de fabricación.

El procedimiento de la presente invención da un producto en emulsión que favorece la formación de monómeros debido a la lenta liberación de la anfotericina B en el plasma cuando se inyecta, lo que no ocurre con el producto preparado por el procedimiento descrito en la Patente Japonesa 11-60491 (1989). Por tanto, la estructura de la emulsión de la presente invención es diferente de la obtenida por la Patente Japonesa como se demuestra por los estudios de toxicidad. Por tanto, la emulsión de la presente invención se denomina emulsión estructurada.

En la realización principal de la invención, la anfotericina B se dispersa en la fase oleosa de modo que el polvo de anfotericina B es recubierto por aceite. La lecitina de huevo usada como un emulsionante se dispersa en la fase acuosa.

En otra realización de la invención, la homogenización se hace en ciclos repetidos para conseguir una distribución del tamaño de partícula por debajo de 2 \mu.

En otra realización de la invención, la composición parenteral final de la anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada, se esteriliza terminalmente por autoclavado final.

Diferencias con la técnica anterior

Se podrá ver a continuación que el procedimiento de la presente invención es diferente de la Patente.

a): El procedimiento de la presente invención se diferencia de la Patente de Estados Unidos 5364632 (1994) en que no usa ningún disolvente para la anfotericina B; en que no sigue un procedimiento de preparación de una película de anfotericina B y fosfolípido y subsiguiente hidratación; en que no usa aceite MCT con \alpha-tocoferol añadido; en el ajuste del pH de la fase acuosa que contiene fosfátido de huevo a 8-11; en tener una etapa de esterilización terminal - y en el producto que tiene baja toxicidad y buena distribución en el sistema retículo-endotelial (RES).

\quad: El uso de una cantidad tan grande de disolvente hace que el procedimiento sea difícil de adoptar comercialmente. Se ha encontrado en diferentes ejemplos que el tamaño de partícula es inferior a 100 nm, sin embargo la toxicidad de la composición no ha sido publicada.

\quad: En el procedimiento de la presente invención, la baja toxicidad se mantiene incluso a 5 mg/ml, lo que es terapéuticamente ventajoso ya que el volumen requerido para ser inyectado es bajo.

b): El procedimiento de la presente invención se diferencia de la Patente Japonesa 11-60491 (1989) en que el tamaño del glóbulo/partícula de la emulsión es 0,1-0,21 \mu en la Patente Japonesa, y el de la presente invención es hasta 2 \mu.

\quad: En el procedimiento de la presente invención el fosfátido de huevo se añade a la fase acuosa y el pH de la fase acuosa se ajusta a 8-11.

\quad: El tiempo de validez del producto de la presente invención es superior a 2 años mientras que el de la Patente Japonesa es del orden de 10 días o unas semanas.

\quad: Se requiere un gran número de agentes de soporte de la emulsión en el procedimiento de las Patentes Japonesas que no son requeridos en la presente emulsión del fármaco.

\quad: El procedimiento de la presente invención proporciona un producto estéril, esterilizado terminalmente en autoclave, mientras que el de la Patente Japonesa de la técnica anterior no se esteriliza.

c): El producto preparado por el procedimiento de la Patente Japonesa 4-173736 (1992) no contiene partículas con diámetros mayores que 1 \mum y este producto no contiene un componente oleoso y por tanto es diferente de la composición de la presente invención.

d): En la Patente de Estados Unidos 5389373 (1995), la anfotericina B se añade a una emulsión preformada mientras que en el procedimiento de la presente invención, la anfotericina B se dispersa en la fase oleosa.

e): En la Patente Europea EP 0700678 (1996), la emulsión de anfotericina B como tal no ha sido descrita. La anfotericina B es uno de los fármacos, entre aproximadamente 70 fármacos especificados en la patente, como "que pueden ser formulados como una emulsión lipídica".

\quad: Las emulsiones descritas en esta patente deben tener esencialmente aminoácidos y ácido cítrico o sus sales, que no son en absoluto requeridos en el procedimiento de la presente invención.

\quad: El procedimiento de preparación de la emulsión en esta patente empieza esencialmente con la preparación de una película de fosfolípido con o sin un fármaco. Este procedimiento no es seguido en absoluto en el método de la presente invención.

\quad: En el procedimiento de preparación de la emulsión, el método especifica diferentes modos de adición de emulsionante, mientras que el procedimiento de la presente invención especifica un método de adición del emulsionante solamente a la fase acuosa.

\quad: El objetivo de la invención mencionada en la Patente Europea EP 0700678 (1996) es esencialmente resolver el problema de cambio de color de la emulsión lipídica, usando ácido cítrico y aminoácidos, mientras que el objetivo de la presente invención es desarrollar una anfotericina B recubierta con aceite estructurada en una emulsión tipo aceite en agua que tiene una baja toxicidad, caracterizada por una LD_{50} de al menos 400 mg/kg en ratones.

Ejemplos

La invención se ilustrará ahora por medio de Ejemplos.

Todas las materias primas usadas en este ejemplo fueron de grado parenteral. Los equipos usados fueron convencionales. Se realizó el procedimiento completo en un área con ambiente controlado. Se proporcionó una atmósfera de nitrógeno mientras se procesaba el lote.

La anfotericina B usada en estos Ejemplos fue de grado parenteral obtenida de Alpharma y cumple las especificaciones de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP).

El fosfátido de huevo purificado usado en los ejemplos era de grado parenteral y fue proporcionado por Lipoids.

La anfotericina B inyectable comercialmente disponible que contiene desoxicolato de sodio se denomina anfotericina B inyectable convencional a lo largo de los estudios farmacocinéticos, estudios de distribución en órganos y estudios de toxicidad. Solamente se usa una marca de la composición convencional a lo largo de todos los
estudios.

Ejemplo I

Se preparó la fase oleosa dispersando 1 g de anfotericina B en 40 g de aceite de soja.

Se preparó la fase acuosa añadiendo 4,5 g de glicerina a 150 ml de agua y dispersando después en ella 2,4 g de fosfátido de huevo. Se ajustó el pH a 10,6 usando solución acuosa de hidróxido de sodio.

La fase oleosa preparada anteriormente se añadió a la fase acuosa con agitación a alta velocidad. Se completó el volumen a 200 ml con agua. La emulsión formada se pasó a través de un homogenizador de alta presión. Se repitió la homogenización hasta que el tamaño de glóbulo/partícula fue inferior a 2 \mum. Se enfrió el producto a aproximadamente 20ºC inmediatamente después de cada ciclo de homogenización.

La emulsión homogenizada se filtró a través de un filtro de 2 \mu y se llenó, bajo nitrógeno, en recipientes que se sellaron y se esterilizaron por autoclavado.

El producto preparado por este procedimiento tiene la siguiente composición:

a)	Anfotericina B	-	1,0 g
b)	Aceite de soja	-	40,0 g
c)	Fosfátido de huevo purificado	-	2,4 g
d)	Glicerina	-	4,5 g
e)	Hidróxido de sodio	-	c.s.p. ajustar el pH
f)	Agua	-	c.s.p. 200 ml

El producto esterilizado obtenido se sometió a estudios de toxicidad en ratones, ratas y perros (Ejemplo VIII-A, VIII-B, VIII-C, VIII-D), estudios farmacocinéticos (Ejemplo IX), estudios de distribución en órganos (Ejemplo X-A, X-B). Los estudios de estabilidad se llevaron a cabo mediante almacenamiento del producto en los viales a 2ºC-8ºC y los resultados se dan a continuación.

Datos de estabilidad del producto del ejemplo I

2

Los estudios de toxicidad muestran claramente que la emulsión preparada por el procedimiento de la invención es una composición sinérgica.

Ejemplo II

Se micronizó la anfotericina B polvo usando un molino Air jet hasta un tamaño de partícula inferior a 10 micras.

Se preparó la fase oleosa dispersando 1 g de anfotericina B (micronizada) en 40 g de aceite de soja.

Se preparó la fase acuosa añadiendo 4,5 g de glicerina a 150 ml de agua y dispersando después en ella 2,4 g de fosfátido de huevo. Se ajustó el pH a 10,8 usando solución acuosa de hidróxido de sodio.

La fase oleosa preparada antes se añadió a la fase acuosa con agitación a alta velocidad. Se completó el volumen a 200 ml con agua. La emulsión formada se pasó a través de un homogenizador de alta presión. Se repitió la homogenización hasta que el tamaño de glóbulo/partícula fue inferior a 2 \mum.

La emulsión homogenizada se filtró a través de un filtro de 2 \mu y se llenó, bajo nitrógeno, en recipientes que se sellaron y autoclavaron.

El producto preparado por este procedimiento tiene la siguiente composición:

a)	Anfotericina B (micronizada)	-	1,0 g
b)	Aceite de soja	-	40,0 g
c)	Fosfátido de huevo purificado	-	2,4 g
d)	Glicerina	-	4,5 g
e)	Hidróxido de sodio	-	c.s.p. ajustar el pH
f)	Agua	-	c.s.p. 200 ml

Este Ejemplo prueba que no es necesario el enfriamiento durante la homogenización si se usa anfotericina B micronizada.

Ejemplo III

Se preparó la fase oleosa dispersando 1 g de anfotericina B en 40 g de aceite de soja previamente calentado a 70ºC.

Se preparó la fase acuosa añadiendo 4,5 g de glicerina a 150 ml de agua previamente calentada a 65ºC y dispersando después en ella 2,4 g de fosfátido de huevo. Se ajustó el pH a 10,8 usando solución acuosa de hidróxido de sodio.

La fase oleosa a 70ºC se añadió a la fase acuosa a 65ºC con agitación a alta velocidad. Se completó el volumen a 200 ml con agua. La emulsión formada se pasó a través de un homogenizador de alta presión. Se repitió la homogenización hasta que el tamaño de glóbulo/partícula fue inferior a 2 \mum. Se enfrió el producto a aproximadamente 20ºC inmediatamente después de cada ciclo de homogenización.

La emulsión homogenizada se filtró a través de un filtro de 2 \mu y se llenó, bajo nitrógeno, en recipientes que se sellaron y se esterilizaron por autoclavado a 110ºC durante 40 minutos.

El producto preparado por este procedimiento tiene la siguiente composición:

Se analizó el contenido de anfotericina B en el producto obtenido y se encontró que era satisfactorio lo que indica que la emulsificación podría ser realizada a temperatura más alta.

Ejemplo IV

(No pertenece a la invención)

Fase oleosa - 40 g de aceite de soja

Se preparó la fase acuosa añadiendo 4,5 g de glicerina a 150 ml de agua y dispersando después en ella 2,4 g de fosfátido de huevo. Se dispersó 1 g de anfotericina B en esta solución de fosfátido de huevo y se ajustó el pH a 10,8 usando solución acuosa de hidróxido de sodio.

La fase oleosa se añadió a la fase acuosa con agitación a alta velocidad. Se completó el volumen a 200 ml con agua. La emulsión formada se pasó a través de un homogenizador de alta presión. Se repitió la homogenización hasta que el tamaño de glóbulo/partícula fue inferior a 2 \mum. Se enfrió el producto a aproximadamente 20ºC inmediatamente después de cada ciclo de homogenización.

El producto preparado por este procedimiento tiene la siguiente composición:

El producto esterilizado se sometió a estudios de toxicidad según los detalles dados en el Ejemplo XI y se encontró que produce síntomas de toxicidad cardiaca. Por tanto, no se recomienda la adición de anfotericina B a la fase acuosa.

Ejemplo V

(No pertenece a la invención)

Se preparó la fase oleosa disolviendo 2,4 g de fosfátido de huevo purificado con agitación en 40 g de aceite de soja previamente calentado a 70ºC.

Se preparó la fase acuosa añadiendo 4,5 g de glicerina a 150 ml de agua previamente calentada a 65ºC y dispersando después en ella 1 g de anfotericina B. Se ajustó el pH a 11,0 usando solución acuosa de hidróxido de sodio.

El producto preparado por este procedimiento tiene la siguiente composición:

El producto esterilizado se sometió a estudios de toxicidad según los detalles dados en el Ejemplo XI y se encontró que produce síntomas de toxicidad cardiaca. Por tanto, no se recomienda la adición de fosfátido de huevo purificado a la fase oleosa ni la adición de anfotericina B a la fase acuosa.

Ejemplo VI

(No pertenece a la invención)

Se calentaron 40 g de aceite de soja a 75ºC y se disolvieron en ellos 2,4 g de lecitina de huevo con agitación. Se dispersó 1 g de anfotericina B con agitación en la fase oleosa, para obtener una dispersión uniforme de anfotericina B en la fase oleosa. Se hizo pasar nitrógeno durante 15 minutos en la fase oleosa.

Se calentaron 150 ml de agua a 65ºC. Se añadieron a ellos 4,5 g de glicerina con agitación. Se ajustó el pH a 10,65 usando solución diluida de hidróxido de sodio. Se añadió dispersión oleosa de anfotericina B a esta fase acuosa con agitación a alta velocidad para obtener una emulsión grosera. Se completó el volumen a 200 ml con agua. Se homogenizó entonces esta emulsión grosera usando un homogenizador APV a alta presión hasta que el producto homogenizado fue filtrable a través de un filtro de fibra de vidrio de 2 \mu. Se enfrió el producto a aproximadamente 20ºC inmediatamente después de cada ciclo de homogenización. El producto filtrado se llenó, bajo nitrógeno, en recipientes de vidrio, que se sellaron y se esterilizaron por autoclavado.

El producto preparado por este procedimiento tiene la siguiente composición:

El producto esterilizado se sometió a estudios de toxicidad según los detalles dados en el Ejemplo XI, y se encontró que produce síntomas de toxicidad cardiaca. Por tanto, no se recomienda la adición de fosfátido de huevo purificado a la fase oleosa.

La composición parenteral de anfotericina B recubierta con aceite estructurada en una emulsión tipo aceite en agua, en los siguientes ejemplos se denomina emulsión de anfotericina B (5 mg/ml).

Ejemplo VII

La emulsión de anfotericina B (5 mg/ml) preparada según el procedimiento y fórmula del Ejemplo I, se sometió a un test de toxicidad in vitro frente a los glóbulos rojos humanos (RBCs) junto con la formulación convencional de anfotericina B que contiene desoxicolato de sodio.

Materiales y Método

Sistema de ensayo: Glóbulos rojos (RBCs) de donantes varones humanos normales.

Material de ensayo: Emulsión de anfotericina B (5 mg/ml) preparada según el procedimiento y fórmula del Ejemplo I.

Material comparativo: Anfotericina B inyectable convencional (5 mg/ml).

Diseño del estudio: Se recogió sangre en tubos heparinizados. Se aislaron los RBC por centrifugación a 450 g durante 10 min a 4ºC. Se separaron el plasma y la capa leucítica y se lavaron los RBC 3 veces con solución salina fosfatada (PBS, pH 7,4) a 4ºC antes de ser dispersados en PBS. Se contaron entonces en un contador de células Sysmex KX-21 y se usaron el día de su recogida. Para la determinación de la sensibilidad de los RBC a la anfotericina B, se incubaron 2 ml de suspensión de células (5 x 10^{7} células/ml) en PBS durante 1 h a 37ºC con emulsión de anfotericina B o con anfotericina B inyectable convencional. Se centrifugaron entonces los RBC durante 5 min a 1500 g y se lavaron 3 veces con PBS. El sedimento de los RBC se lisó con 2 ml de agua, se agitó y se centrifugó (1500 g durante 5 min), con el fin de separar las membranas. Se midió la hemoglobina en el contador de células. Se calculó la liberación como la diferencia entre las células control y las células tratadas y se expresó como un porcentaje del contenido total de hemoglobina.

TABLA 1 Dosis de formulaciones de anfotericina B estudiadas en cuanto a toxicidad in vitro frente a los RBCs humanos

3

Análisis estadístico:

Los datos obtenidos se analizaron comparando los grupos tratados con el grupo control negativo usando el test de la t de Student.

Resultados y Discusión TABLA 2 Contenido de hemoglobina en G/DL para las formulaciones de anfotericina B

4

Hay una creciente salida de hemoglobina con las concentraciones crecientes de anfotericina B en la anfotericina B inyectable convencional y en la emulsión (véase la Fig. 1). La anfotericina B inyectable convencional mostró una media de salida de hemoglobina de 77,55% para 5 mg/l y 100% para 50 mg/l, 100 mg/l y 200 mg/l. La emulsión mostró una media de 2,04% para 5 mg/l, 4,08% para 50 mg/l, 4,18% para 100 mg/l y 9,49% para 200 mg/l. La emulsión de anfotericina B fue significativamente menos tóxica que la anfotericina B inyectable convencional a las dosis estudiadas (P<0,05).

Conclusión

Por tanto los datos de toxicidad in vitro indican claramente que la emulsión de anfotericina B preparada en el Ejemplo I, es menos tóxica que la anfotericina B inyectable convencional cuando las células objetivos son los RBC humanos.

Ejemplo VIII

La emulsión de anfotericina B (5 mg/ml) preparada según el procedimiento y fórmula del Ejemplo I, se sometió a estudios de toxicidad in vivo en ratones junto con la anfotericina B convencional que contiene desoxicolato de sodio.

Se realizó el estudio con los siguientes objetivos:

\Box: Estimar los valores de LD_{50} para las dos formulaciones anteriores, a partir de estudios de dosis única.

\Box: Determinar los efectos sobre la toxicidad de las 2 formulaciones anteriores, a partir de estudios de dosis repetidas.

VIII-A) Estudio de toxicidad con dosis única en ratones Materiales y Método

Sistema de ensayo: Se obtuvieron ratones Swiss albinos hembras en el intervalo de peso de 20-22 g de la casa Bharata Serums & Vaccines Ltd (BSVL) y se emplearon para el estudio. Se proporcionó a los animales comida estándar y agua Aquaguard™, ad libitum.

Material de ensayo: Emulsión de anfotericina B (5 mg/ml) preparada según el procedimiento y fórmula del Ejemplo I, que se administró intravenosamente como una dosis en embolada.

Material comparativo: Anfotericina B inyectable convencional (5 mg/ml), que se administró intravenosamente como una dosis en embolada.

Diseño del estudio: Se dividieron los animales en 2 grupos de 8 animales cada uno, a saber, GRUPO 1 y GRUPO 2. El GRUPO 1 recibió diferentes dosis de la anfotericina B inyectable convencional, el GRUPO 2 recibió diferentes dosis de la emulsión de anfotericina B.

TABLA 3 Dosis de formulaciones de anfotericina B estudiadas en estudios de toxicidad con dosis única en ratones

5

Todos los grupos recibieron inyecciones por la vía intravenosa. Se observaron todos los animales en cuanto a cualquier signo de toxicidad clínica y en cuanto a mortalidad durante un periodo de 72 horas. Se calculó el porcentaje de mortalidad para todas las dosis.

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Análisis estadístico:

Se utilizó el método de Probit Analysis para determinar los valores de LD_{50} para todas las formulaciones.

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Resultados Y Discusión

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TABLA 4 Porcentaje de mortalidad para las diferentes dosis de las 2 formulaciones

6

La Tabla anterior indica que la preparación de anfotericina B inyectable convencional es más tóxica que la emulsión de anfotericina B. El porcentaje de mortalidad para las formulaciones aumentó de una forma dosis-dependiente. Los valores de la LD_{50} para las 2 formulaciones se determinaron por el método de Probit Analysis. La figura 2 es una representación del porcentaje de mortalidad frente a la dosis para las 2 formulaciones.

7

Conclusión

La emulsión de anfotericina B preparada en el Ejemplo I tiene un valor de LD_{50} alto y es menos tóxica que la anfotericina B inyectable convencional.

VIII-B) Estudio de toxicidad con dosis repetidas en ratones Materiales y Método

Diseño del estudio: Se dividieron los animales en 3 grupos de 6 animales cada uno, a saber, GRUPO 1, GRUPO 2 y GRUPO 3. El GRUPO 1 recibió el vehículo de la emulsión o blanco (Control), el GRUPO 2 recibió diferentes dosis de la anfotericina B inyectable convencional y el GRUPO 3 recibió las diferentes dosis de la emulsión de anfotericina B.

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TABLA 5 Dosis de anfotericina B convencional y emulsión de anfotericina B estudiadas en estudios de toxicidad con dosis repetidas en ratones

8

Todos los grupos recibieron inyecciones como se indica en la Tabla 5 diariamente por la vía intravenosa. Los grupos control recibieron el volumen máximo del vehículo. Se observaron todos los animales en cuanto a cualquier signo de toxicidad clínica. Se registraron sus pesos corporales en días alternos durante 14 días. También se observaron los animales en cuanto a mortalidad durante un periodo de 14 días. Se calculó el porcentaje de mortalidad para todas las dosis.

Análisis estadístico:

Los datos obtenidos se analizaron para comparar el cambio en los pesos corporales durante el estudio. Tales cambios se compararon entre los grupos tratados.

Resultados y Discusión TABLA 6 Porcentaje de mortalidad para las diferentes dosis de las 2 formulaciones

9

La Tabla anterior (véase también la Fig. 3) indica que la anfotericina B inyectable convencional es más tóxica que la emulsión de anfotericina B. El porcentaje de mortalidad para las formulaciones aumentó de una forma dosis-dependiente. No se vio mortalidad para el grupo tratado con el vehículo durante 14 días. La emulsión de anfotericina B presentó menor toxicidad que la anfotericina B inyectable convencional incluso a dosis más altas.

TABLA 7 Media de los pesos corporales a diferentes dosis para el estudio de toxicidad con dosis repetidas en ratones

10

El grupo tratado con la anfotericina B inyectable convencional mostró una reducción en el peso corporal de los animales a las dosis de 1,5 mg/kg y 2,5 mg/kg, mientras que la emulsión de anfotericina B mostró una reducción en el peso corporal de los animales a las dosis de 20 mg/kg y 40 mg/kg (véase la Fig. 4). Los días 6 y 8 los pesos corporales de los ratones tratados con la emulsión de anfotericina B a dosis de 20 mg/kg y 40 mg/kg fueron significativamente menores que los de los ratones tratados con la emulsión de anfotericina B a dosis de 10 mg/kg.

El examen histopatológico mostró algunos cambios degenerativos en las células parenquimales del hígado y de los riñones lo que puede ser debido al metabolismo general de los ratones. Los miofibrilos senosos probablemente fueron el resultado de la hipoxia durante el sacrificio. Los cambios en general fueron de tipo reversible. El efecto de la anfotericina B apareció más en el hígado y en los riñones y en algunos casos en el corazón, causando lesiones muy agudas. La intensidad, en general, fue dependiente de la dosis. Con la anfotericina B inyectable convencional, se vieron lesiones a bajos niveles de dosis.

Conclusión

La emulsión de anfotericina B presentó menor toxicidad que la anfotericina B inyectable convencional.

VIII-C) Estudio de toxicidad en ratas con dosis únicas Materiales y Método

Sistema de ensayo: Se obtuvieron ratas Wistar albinas de cualquier sexo en el intervalo de peso de 140-160 g de la casa Bharata Serums & Vaccines Ltd (BSVL) y se emplearon para el estudio. Se proporcionó a los animales comida estándar y agua Aquaguard™, ad libitum.

Diseño del estudio: Se dividieron los animales en 2 grupos de 6 animales cada uno, a saber, GRUPO 1 y GRUPO 2. El GRUPO 1 recibió diferentes dosis de la anfotericina B inyectable convencional. El GRUPO 2 recibió la dosis de la emulsión de anfotericina B.

TABLA 8 Dosis de anfotericina B inyectable convencional y emulsión de anfotericina B estudiadas en estudios de toxicidad con dosis única en ratas

11

Todos los grupos recibieron inyecciones como se indica en la Tabla 8 por la vía intravenosa. Se observaron todos los animales en cuanto a cualquier signo de toxicidad clínica y en cuanto a mortalidad durante un periodo de 72 horas. Se calculó el porcentaje de mortalidad para todas las dosis.

Análisis estadístico:

Resultados y Discusión TABLA 9 Porcentaje de mortalidad para las diferentes dosis de las 2 formulaciones

12

La Tabla anterior (véase también la Fig. 5) indica que la anfotericina B inyectable convencional es más tóxica que la emulsión de anfotericina B. El porcentaje de mortalidad para las formulaciones aumentó de una forma dosis-dependiente. Los valores de la LD_{50} para las 2 formulaciones se determinaron por el método de Probit Analysis. Se observó una mortalidad del 50% para la emulsión de anfotericina B después de 72 horas. No hubo cambios en los pesos corporales durante 72 horas.

13

Conclusión

La emulsión de anfotericina B es menos tóxica que la anfotericina B inyectable convencional.

VIII-D) Estudio de toxicidad con dosis única en perros

El presente estudio se llevó a cabo con el objetivo de evaluar la toxicidad y seguridad de la emulsión de anfotericina B en perros.

Materiales y Método

Sistema de ensayo: Se emplearon en este estudio doce perros sanos de cualquier sexo con un peso medio de 10-15 kg. Se mantuvo a los animales en condiciones estándar en Kennel con acceso a comida y agua, ad libitum.

Diseño del estudio: Se dividieron los animales en 2 grupos de 6 animales cada uno, a saber, GRUPO 1 y GRUPO 2. El GRUPO 1 recibió la anfotericina B inyectable convencional. El GRUPO 2 recibió la emulsión de anfotericina B preparada en el Ejemplo I.

TABLA 10 Detalles de las dosis de anfotericina B inyectable convencional y de emulsión de anfotericina B estudiadas en estudios de toxicidad con dosis única en perros

14

Todos los grupos recibieron inyecciones como se indica en la Tabla 10, disueltas en 6-20 ml de dextrosa al 5%, por la vía intravenosa. Se observaron todos los animales en cuanto a cualquier signo de toxicidad clínica y durante un periodo de 21 días después de la inyección. Se pesaron los animales en las visitas V0, V2, V4, V6 y V8. Se recogió sangre para estudios hematológicos y bioquímicos (ensayo de la función renal y de la función hepática) en las visitas V0, V4 y V8.

Programa de visitas:

	V0 Visita de la línea base	V5 Después de 12 días de V0
	V1 Antes de 2 días de la visita de la línea base	V6 Después de 15 días de V0
	V2 Después de 3 días de V0	V7 Después de 18 días de V0
	V3 Después de 6 días de V0	V8 Después de 21 días de V0
	V4 Después de 9 días de V0

15

Análisis estadístico:

Los datos obtenidos se analizaron para comparar el cambio en los parámetros de la línea base durante el estudio. Tales cambios se compararon entre los grupos tratados.

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(Tabla pasa a página siguiente)

Resultados y Discusión

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Se encontró que todos los parámetros hematológicos presentaban una variación desde los valores de la línea base en ambos grupos. El porcentaje de caída del recuento de leucocitos para la emulsión fue significativamente más alto que para la preparación convencional, pero estaba dentro del intervalo normal y por tanto no tenía trascendencia clínica.

TABLA 12 Porcentaje medio de cambio de los parámetros bioquímicos sobre la línea base en los perros a diferentes visitas

17

El parámetro de la función hepática (véase la Fig. 6), AST, mostró un aumento del 334,38% en la visita V8 en el grupo de la anfotericina B inyectable convencional, mientras que se limitó a sólo el 108,86% en el grupo de la emulsión de anfotericina B. Se observaron hallazgos similares para ALT y la bilirrubina total. El aumento para el grupo convencional fue estadísticamente significativo en comparación con la emulsión.

Los parámetros de la función renal (véase la Fig. 7) estuvieron significativamente trastornados en el grupo de la anfotericina B inyectable convencional. La desviación con la emulsión de anfotericina B fue significativamente menor que la del grupo de la anfotericina B inyectable convencional.

La nefrotoxicidad, la principal toxicidad de la anfotericina B, resulta de la interacción citotóxica no selectiva entre la anfotericina B de la anfotericina B inyectable convencional (que contiene desoxicolato de sodio) y el colesterol de las células del mamífero. La citotoxicidad en los mamíferos se atenúa incorporando anfotericina B en una formulación en emulsión con base lipídica. Esto altera la afinidad de la anfotericina B y reduce su transferencia selectiva al colesterol que contienen las células del mamífero.

TABLA 13 Media de los pesos corporales a diferentes dosis para el estudio de toxicidad con dosis única en perros

18

El grupo tratado con anfotericina B inyectable convencional mostró una mayor reducción en los pesos corporales de los animales en comparación con la emulsión de anfotericina B (véase la Fig. 8).

Conclusión

La emulsión de anfotericina B ofrece una protección significativa frente a la hepatotoxicidad y nefrotoxicidad en comparación con la anfotericina B inyectable convencional.

Ejemplo IX

Se utilizó la emulsión de anfotericina B (5 mg/ml) preparada según el procedimiento y la fórmula del Ejemplo I, para evaluar los parámetros farmacocinéticos en conejos en comparación con la anfotericina B inyectable convencional.

Materiales y Método

Sistema de ensayo: Se obtuvieron conejos New Zealand blancos, machos, en el intervalo de peso de 1,5-2,0 kg, de la casa Bharata Serums & Vaccines Ltd (BSVL) y se emplearon para el estudio. Se proporcionaron a los animales vegetales nutricionales estándar y agua Aquaguard™, ad libitum.

Diseño del estudio: Se dividieron los animales en 2 grupos de 3 animales cada uno, a saber, GRUPO 1 y GRUPO 2. Los GRUPOS 1 y 2 recibieron anfotericina B inyectable convencional y emulsión de anfotericina B respectivamente. Se recogieron muestras de sangre a los 5, 15, 30, 45, y 60 minutos y a las 1, 2, 3, 4, 5, 24, y 48 horas después de una dosis única intravenosa en embolada. Se centrifugaron las muestras a 3000-4000 rpm para separar el plasma. Se mantuvo el plasma a -20ºC hasta el análisis.

Vía de administración: En la vena marginal de la oreja de los conejos.

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TABLA 14 Dosis de las formulaciones de anfotericina B para estudios farmacocinéticos en conejos

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Análisis del contenido de anfotericina B

El contenido de anfotericina B en plasma se analizó por el método de HPLC en fase usando una columna C-18. Se extrajo la anfotericina B del plasma usando dimetilsulfóxido grado HPLC y acetonitrilo en una proporción de 1:3:1. Se centrifugaron después las muestras a 3000 rpm y se inyectó el sobrenadante en la columna.

Análisis estadístico:

Los datos obtenidos se analizaron comparando los grupos tratados usando el test de la t de Student.

Resultados y Discusión TABLA 15 Indica los parámetros farmacocinéticos para las 2 formulaciones

20

200

No hay diferencia significativa en C_{max}, T_{max}, T_{1/2}, Vd entre las dos formulaciones. Con respecto al aclaramiento, la emulsión es eliminada del plasma a una velocidad significativamente más rápida que la anfotericina B inyectable convencional (P<0,05). Esto indica que la distribución de la emulsión en los tejidos tiene lugar más rápidamente que la distribución de la anfotericina B inyectable convencional (véase la Fig. 9).

Ejemplo X

La emulsión de anfotericina B (5 mg/ml) preparada según el procedimiento y fórmula del Ejemplo I, se utilizó para estudios de distribución en órganos en ratones en comparación con la anfotericina B inyectable convencional.

Se realizó el presente estudio con los siguientes objetivos:

\Box: Estimar el modelo de distribución en órganos en ratones para las 2 formulaciones anteriores, a partir de estudios de dosis única.

\Box: Determinar el modelo de distribución en órganos en ratones para 2 formulaciones, a partir de estudios de dosis repetidas.

X-A) Estudio de distribución en órganos con dosis única en ratones Materiales y Método

Vía de administración: Intravenosa

Diseño del estudio: Se dividieron los animales en 2 grupos de 20 animales cada uno, a saber, GRUPO 1 y GRUPO 2. El GRUPO 1 recibió la anfotericina B inyectable convencional en una dosis de 1 mg/kg y el GRUPO 2 recibió la emulsión de anfotericina B en una dosis de 5 mg/kg. Cada punto de muestreo consistió en 4 ratones. Las muestras de órganos, especialmente, hígado, pulmones, riñones, bazo y cerebro fueron diseccionadas al final de los puntos de tiempo respectivos, esto es, 0,5, 1, 2, 4, 24 horas. Se congelaron inmediatamente los órganos para detener todas las reacciones enzimáticas. Se pesaron los órganos y se añadió 3 veces el volumen de agua. Después se
homogenizaron.

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TABLA 16 Dosis de anfotericina B inyectable convencional y de emulsión de anfotericina B estudiadas en estudios de distribución en órganos con dosis única en ratones

21

Análisis del contenido de anfotericina B

Se añadió metanol al homogenato en una proporción de 3:1. Se centrifugó después a una velocidad alta de 13.000-14.000 rpm. Se inyectó entonces el sobrenadante en la columna de HPLC para análisis de la anfotericina B.

Análisis estadístico:

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(Tabla pasa a página siguiente)

Resultados y Discusión TABLA 17 Indica los parámetros de distribución en órganos para las 2 formulaciones

22

En comparación con la anfotericina B inyectable convencional, la emulsión de anfotericina B muestra niveles altos en todos los órganos excepto en el riñón (véanse las Figuras 10a a 10d). Los valores más altos de la semi-vida y las tasas más bajas de aclaramiento de la emulsión, justifican adicionalmente estos datos. Por tanto, se ha encontrado que la captación de anfotericina B desde la emulsión a los órganos es más alta que desde la anfotericina B inyectable convencional, siendo estadísticamente significativa en el caso del bazo (P<0,05).

La nefrotoxicidad es el principal inconveniente asociado con la terapia de anfotericina B y es debida a los altos niveles de anfotericina B en el riñón. Desde la AUC(_{0-\infty}) se ve claramente que la emulsión alcanza niveles significativamente más bajos de anfotericina B que la anfotericina B inyectable convencional (P<0,05). También la emulsión fue aclarada más rápidamente de los riñones, lo que explica la baja toxicidad y el valor más alto de la LD_{50}, en comparación con la formulación de la anfotericina B inyectable convencional.

A pesar de las concentraciones plasmáticas decrecientes, los niveles en el hígado y en el bazo continuaron aumentando. Se han indicado observaciones similares para los liposomas lo que da a entender que los fármacos liposómicos en los tejidos retículoendoteliales no están en equilibrio libre con el plasma como lo están los fármacos no liposómicos. (Feilding, R M., et al., 1998). Esto explica posiblemente la alta retención de anfotericina B en los tejidos retículoendoteliales en el caso de la emulsión en comparación con la anfotericina B inyectable convencional.

X-B) Estudio de distribución en órganos con dosis repetidas en ratones Materiales y Método

Diseño del estudio:

Se dividieron los animales en 2 grupos de 24 cada uno, GRUPO 1 y GRUPO 2. El GRUPO 1 recibió la anfotericina B inyectable convencional en una dosis de 1 mg/kg y el GRUPO 2 recibió la emulsión de anfotericina B en una dosis de 5 mg/kg. Se trataron 12 animales durante un periodo de 7 días y los otros 12 se trataron durante 14 días. Se diseccionaron el hígado, los pulmones, el riñón y el bazo después de 6 horas de la última dosis. Se congelaron inmediatamente los órganos para detener todas las reacciones enzimáticas. Se pesaron los órganos y se añadió un equivalente de agua de 3 veces el peso del órgano. Después se homogenizó.

Vía de administración: Intravenosa

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TABLA 18 Dosis de anfotericina B inyectable convencional y de emulsión de anfotericina B para estudios de distribución en órganos con dosis única en ratones

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Análisis del contenido de anfotericina B

El contenido de anfotericina B en plasma se analizó por el método de HPLC usando una columna C-18. Se extrajo la anfotericina B del plasma usando metanol grado HPLC y en una relación de plasma a metanol 1:3. Se centrifugaron después las muestras a 3000 rpm y se inyectó el sobrenadante en la columna.

Análisis estadístico:

Resultados y Discusión

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TABLA 19 Indica los parámetros de distribución en órganos para las 2 formulaciones

24

Fue interesante observar que las concentraciones en los tejidos no aumentaron sustancialmente desde la dosis nº 7 a la dosis nº 14 (véanse las Figuras 11a y 11b), lo que está de acuerdo con la literatura científica (Olsen, S J, et al., 1991). No hubo muertes en el grupo tratado con la emulsión de anfotericina B a pesar de los elevados niveles de anfotericina B en los tejidos. En contraste a esto, la anfotericina B inyectable convencional sí presentó mortalidad durante el periodo del estudio.

Se puede ver que los niveles de anfotericina B en los riñones son los mismos para la anfotericina B inyectable convencional que para la emulsión, a pesar de la gran diferencia observada en nefrotoxicidad. Una posible razón de esto podría ser que lo que se está estimando en los órganos es la anfotericina B sin tener en cuenta si está presente como un complejo con los lípidos o como fármaco libre. En el caso de la anfotericina B inyectable convencional, la anfotericina B está predominantemente presente en la forma libre y por tanto es nefrotóxica. Pero en el caso de la emulsión basada en lípidos, la anfotericina B posiblemente existe como un complejo con los lípidos, lo que hace que no ejerza su toxicidad sobre los tejidos.

La anfotericina B, que es un fármaco anfífilo, existe como un monómero soluble o como oligómeros auto-asociados y por encima de la concentración crítica de micelas forma micelas. Cualquier factor que modifique el equilibrio entre las diferentes especies de anfotericina B en medio acuoso, puede cambiar su actividad y toxicidad globales. Tabosa Do Egito, (1996) considera que la emulsión de anfotericina B actúa como un depósito de la forma monomérica de la anfotericina B. Esta formulación altamente estable sólo libera de forma regular cantidades limitadas del monómero de anfotericina B libre. Probablemente esta forma sólo puede unirse con el ergosterol de las células fúngicas y produce una interacción reducida con el colesterol de las células del mamífero (Tabosa Egito, et al., 1996). Por tanto la emulsión, aunque presenta niveles similares a los de la anfotericina B inyectable convencional, no es muy tóxica.

Conclusión

La emulsión de anfotericina B se formuló con el objetivo de:

1.: Mejorar el perfil de seguridad

2.: Hacer que sea rentable.

Los estudios de toxicidad demuestran que el margen de seguridad de la emulsión es realmente bastante mejor que el de la anfotericina B inyectable convencional. Esto se puede atribuir a la forma en la que la emulsión se presenta frente a sus células fúngicas objetivo. La anfotericina B inyectable convencional libera anfotericina B en cantidades muy grandes y los monómeros liberados de este modo se asocian para formar oligómeros que, se unen asimismo a las células del mamífero, llevando a una severa toxicidad. Por el contrario, la emulsión no es capaz de alcanzar concentraciones tan altas en el plasma debido a la rápida fagocitosis por el sistema retículo-endotelial (RES) y presenta una liberación lenta progresiva de monómeros. Esto explica la acción selectiva de la emulsión sobre las células fúngicas y por tanto la baja toxicidad (Tabosa Do Egito, E S, et al., 1996). Los bajos niveles plasmáticos y la rápida distribución de la emulsión de anfotericina B en los órganos es también una ventaja sobre la anfotericina B inyectable convencional con respecto a sus objetivos potenciales. Además, la emulsión de anfotericina B es un producto rentable en comparación con otras formulaciones de base lipídica como las preparaciones de complejo lipídico y los liposomas.

Por tanto, la emulsión de anfotericina B de la presente invención es un candidato prometedor para la terapia selectiva de las infecciones fúngicas.

Ejemplo XI

La emulsión de anfotericina B preparada en el Ejemplo IV, Ejemplo V y Ejemplo VI, se sometió a estudios de toxicidad in vivo en ratones.

Estudio de toxicidad con dosis única en ratones Materiales y Método

Sistema de ensayo: Se obtuvieron ratones Swiss albinos, hembras, en el intervalo de peso de 20-22 g, de la casa Bharata Serums & Vaccines Ltd (BSVL) y se emplearon para el estudio. Se proporcionó a los animales comida estándar y agua Aquaguard™, ad libitum.

Material de ensayo: Emulsiones de anfotericina B (5 mg/ml) preparadas en el Ejemplo IV, Ejemplo V y Ejemplo VI, que se administraron intravenosamente como una dosis en embolada.

Material comparativo: Emulsión de anfotericina B (5 mg/ml) preparada según el procedimiento y fórmula del Ejemplo I, que se administró como una dosis en embolada.

Observaciones

Los grupos que recibieron muestras del Ejemplo IV, Ejemplo V y Ejemplo VI, presentaron síntomas de toxicidad cardiaca tales como distrés respiratorio grave, irritación local, distrés abdominal, y agitación. Sin embargo estos síntomas tóxicos no se observaron en el grupo que recibió muestras preparadas por el procedimiento y fórmula del Ejemplo I.

Las ventajas de la invención

La formulación de la anfotericina B como una emulsión estructurada de tipo aceite en agua para administración parenteral mediante el procedimiento de la presente invención, redujo su toxicidad considerablemente y aseguró la esterilidad sin alterar su actividad antifúngica.

La anfotericina B incorporada en la fase oleosa de la emulsión preparada por el procedimiento de la presente invención, permanece estable a lo largo de todo el procedimiento de fabricación incluyendo el procedimiento de esterilización por autoclavado y después hasta su fecha de caducidad o uso.

El tamaño medio de las gotas oleosas en la composición parenteral de anfotericina B recubierta con aceite estructurada en una emulsión tipo aceite en agua, preparada por el procedimiento de la presente invención, está controlado en el intervalo óptimo de modo que se distribuye preferiblemente en el sistema retículo-endotelial dando una baja concentración plasmática.

Claims

1. Una composición parenteral esterilizada en autoclave de anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada, que tiene una LD_{50} de al menos 400 mg/kg en ratones, que comprende

a): una fase oleosa en una cantidad de hasta 30% p/v de la composición, seleccionada de aceites vegetales;

b): Anfotericina B en una cantidad de 0,05% a 1% p/v de la composición, dispersada en la fase oleosa;

c): agua como fase acuosa;

d): un agente modificador de la tonicidad disuelto en la fase acuosa; y

e): un emulsionante fosfátido natural en una cantidad de hasta 3% p/v de la composición, dispersado en la fase acuosa.

2. Una composición parenteral esterilizada en autoclave de anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada según la reivindicación 1, en la que la anfotericina B está presente en una cantidad de 0,05% a 0,5% p/v de la composición, dispersada en la fase oleosa.

3. Una composición parenteral esterilizada en autoclave de anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la fase oleosa representa de 10% a 20% p/v de la composición.

4. Una composición parenteral esterilizada en autoclave de anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el aceite vegetal usado es aceite de soja, aceite de sésamo o aceite de cártamo.

5. Una composición parenteral esterilizada en autoclave de anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada según la reivindicación 4, en la que el aceite es aceite de soja y el contenido del mismo es aproximadamente 20% p/v de la composición.

6. Una composición parenteral esterilizada en autoclave de anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el contenido de anfotericina B es aproximadamente 0,5% p/v de la composición.

7. Una composición parenteral esterilizada en autoclave de anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el emulsionante fosfátido natural es un fosfátido de huevo purificado.

8. Una composición parenteral esterilizada en autoclave de anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada según la reivindicación 7, en la que el contenido de fosfátido de huevo purificado es aproximadamente 1,2% p/v de la composición.

9. Una composición parenteral esterilizada en autoclave de anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el modificador de la tonicidad usado es glicerina, manitol, o dextrosa o una combinación de los mismos.

10. Una composición parenteral esterilizada en autoclave de anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada según la reivindicación 9, en la que el modificador de la tonicidad es glicerina y el contenido del mismo es aproximadamente 2,25% p/v de la composición.

11. Una composición parenteral esterilizada en autoclave de anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que la emulsión comprende anfotericina B en una cantidad de 0,5% p/v de la composición; la fase oleosa es aceite de soja en una cantidad de 20% p/v de la composición; el emulsionante es fosfátido de huevo purificado en una cantidad de 1,2% p/v de la composición; el agente modificador de la tonicidad es glicerina en una cantidad de 2,25% p/v de la composición y; agua c.s.p. 100% en volumen de la composición.

12. Un procedimiento para la fabricación de una composición parenteral esterilizada en autoclave de anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada, que tiene una LD_{50} de al menos 400 mg/kg en ratones según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende

i): dispersar la anfotericina B en la fase oleosa;

ii): disolver el agente modificador de la tonicidad en la fase acuosa, agua;

iii): dispersar el agente emulsionante en la fase acuosa;

iv): ajustar el pH de la fase acuosa a aproximadamente 8-11;

v): añadir la fase oleosa a la fase acuosa con agitación, para obtener una emulsión estructurada grosera;

vi): homogenizar la emulsión estructurada grosera a un tamaño medio de partícula inferior a 2 \mum;

vii): filtrar, llenar la emulsión estructurada homogenizada en recipientes de vidrio bajo nitrógeno; cerrar los recipientes de vidrio; sellar los recipientes de vidrio cerrados; y esterilizar los recipientes de vidrio llenos sellados por autoclavado.

13. Un procedimiento para la fabricación de una composición parenteral esterilizada en autoclave de anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada según la reivindicación 12, en el que la fase oleosa o la fase acuosa o ambas fases se mantienen a una temperatura de hasta 75ºC durante el procedimiento de emulsificación.

14. Un procedimiento para la fabricación de una composición parenteral esterilizada en autoclave de anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada según cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, en el que se añade solución de hidróxido de sodio en agua para ajustar el pH entre 8 y 11 de la fase acuosa que contiene el emulsionante fosfátido de huevo.

15. Un procedimiento para la fabricación de una composición parenteral esterilizada en autoclave de anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada según cualquiera de las reivindicaciones 12-14, que comprende dispersar anfotericina B en aceite de soja; preparar la fase acuosa añadiendo glicerina a agua; seguido por dispersar el fosfátido de huevo purificado en la fase acuosa; ajustar el pH de la fase acuosa a 10,8; añadir el aceite de soja que contiene la anfotericina B dispersada en el mismo, a la fase acuosa que contiene el fosfátido de huevo dispersado en la misma, con agitación para obtener una emulsión estructurada grosera; homogenizar la emulsión estructurada grosera a un tamaño medio de partícula inferior a 2 \mum; filtrar a través de un filtro de 2 \mum, llenar la emulsión estructurada homogenizada en recipientes de vidrio bajo nitrógeno, cerrar los recipientes de vidrio, sellar los recipientes de vidrio cerrados y esterilizar los recipientes de vidrio llenos sellados por autoclavado.

16. Una composición parenteral esterilizada en autoclave de anfotericina B recubierta con aceite en la forma de emulsión estructurada, que tiene una LD_{50} de al menos 400 mg/kg en ratones según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, fabricada por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12-15.