JP4804702B2

JP4804702B2 - アムホテリシンｂ構造化エマルション

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Publication number: JP4804702B2
Application number: JP2002503255A
Authority: JP
Inventors: スリカンスアンナッパパイ; サンジータハヌルメッシュリヴァンカー; シルパサダカーコチャレカー
Original assignee: ブハラットセルムズアンドヴァクシンズリミテッド
Priority date: 2000-06-22
Filing date: 2001-06-19
Publication date: 2011-11-02
Anticipated expiration: 2021-06-19
Also published as: WO2001097778A3; IN188843B; ZA200300330B; AU8008401A; EP1313449A2; WO2001097778A2; EP1313449B1; US20030206929A1; KR20030039331A; KR100812764B1; WO2001097778A8; DE60127140D1; AU2001280084B2; ES2283423T3; US7053061B2; CN100502834C; CN1447682A; ATE355825T1; JP2004525068A; RU2275899C2

Description

【０００１】
【技術分野】
本発明は、低い張度を持つアムホテリシンB含有組成物に関するものである。本発明は、特に非-経口投与のための、水中油型の構造化エマルション状態にある、低張度を持つ、アムホテリシンB含有組成物に関するものである。
【０００２】
【背景技術】
アムホテリシンBは、ストレプトマイセーテスノドサス(Streptomycetes nodosus)により生成される巨大環式ポリエン抗生物質である。これは、広範囲に渡る真菌、酵母および幾つかの原生動物に対して有効である。
静脈内投与するためのアムホテリシンBは、元々公知のコロイド形状で入手できた。その開発後約35年にあたる今日でさえ、その信頼性の高い治療上の効能のために、重要な抗真菌剤として広く利用されている。この薬物の許容性は、臨床的に使用した場合に報告された、多くの悪影響のために、低いものである。従来のアムホテリシンBを静脈内投与された殆ど全ての患者において、腎毒性が生じた。その他の悪影響は、高血圧、低血圧、心室細動を含む心不整脈、心臓停止、肝臓疾患等を包含する。尿細管および糸球体両者の損傷が生じ、また腎臓機能の永久的な悪化の危険性がある。アムホテリシンBの溶液は、静脈内皮を刺激し、また注入部位において痛みおよび血栓性静脈炎を起こす可能性がある。というのは、アムホテリシンBを可溶化するために、調剤の際に使用した合成界面活性剤であるナトリウムデオキシコレートが存在するからである。
【０００３】
有害な作用を減じるために、アムホテリシンBは、様々な薬物放出システム、例えば脂質錯体、リポソームおよびエマルション等として処方されている。これら組成物は、大きな効能を持つが、依然として遊離形状で使用した薬物と比較して低い毒性を持つ。アムホテリシンBの脂質錯体およびリポソーム処方物両者は、現在市販品として入手でき、また世界中の様々な国々で承認されている。
脂質錯体およびリポソームに基づく脂質処方物の主な欠点は、治療コストが高いことである。アムホテリシンBは、親油性の薬物であり、ステロールと結合し、また脂質二重膜内に浸入し、結果としてアムホテリシンBは、この脂質を主成分とする放出系で使用するのに特に適したものとなる。
【０００４】
本研究所では、低毒性および低治療コストなる利点を持つ、脂質を主成分とするエマルション形状で、アムホテリシンBを処方しようと試みた。
Volker Heinemann等は、この脂質エマルションが、オリゴマー状のアムホテリシンBの量を減じ、かつ結果としてアムホテリシンBと、ヒト細胞膜のコレステロールとの相互作用を減じるものと仮定した[Anti-microbial agents and chemotherapy, 1997, 41(4): 728-732]。しかし、残りのモノマー状のアムホテリシンBは、真菌細胞膜のエルゴステロールと結合する能力を維持する。
【０００５】
Kirsh R, Goldstein R, Tarloff J 等(J. Infect. Dis. 1988, 158: 1065-1070)は、脂肪エマルションと共に混合することにより調製した、アムホテリシンBの脂質エマルション組成物が、抗真菌性を失うことなしに、低毒性を持つことを報告している。しかし、アムホテリシンBを含む、このような脂質エマルションの安定性は、低いことが分かっている。
Moreau P 等(J. Antimicro. Chemother. 1992, 30: 535-541)は、アムホテリシンB注射液と混合した脂質エマルションで処置した患者が、浸出関連毒性および腎臓機能不全において、大幅な低下を示したことを報告している。
非-経口栄養分の脂質エマルションと混合したアムホテリシンBの使用は、欧州および米国両者において増大しつつある。
アムホテリシンBエマルションの、従来の製法を以下に記載する。
【０００６】
米国特許第5,364,632(1994)/日本国特許JP2,290,809(1990)
この発明によるエマルションの製法を、以下の典型例によって説明する。
アムホテリシンBを、浴超音波処理(15分間)によって、メタノールに溶解した(0.8 mg/ml)。リン脂質(主として、80％のホスファチジルコリンと8％のホスファチジルエタノールアミンとを含む)を、クロロホルムに溶解した。これら2つの溶液を混合し、発熱物質および凝集体を除去するための、グラスファイバー製プレフィルタと、0.45μの再生セルロース膜フィルタ(RC 5) (GF92) とを含む、組合せフィルタ系を通して濾過した。得られた透明な脂質溶液を、減圧下にて、40℃にてロータリーエバポレータにより、丸底フラスコの壁上に、薄膜として堆積させた。ポロキサマー(poloxamer)、ナトリウムデオキシコレートおよびグリセリンを含む該水性相を、0.22μのミリポアフィルタで濾過し、該フラスコに流し込み、得られたこの分散液を、均一なリポソーム混合物が得られるまで、超音波処理した。
【０００７】
0.22μのミリポアフィルタで濾過され、かつα-トコフェロールを含有するMCT(中鎖トリグリセリド)油を70℃に加熱し、次いで45℃に加熱した該リポソーム混合物と混合し、磁気撹拌機でその中に分散させた。
高剪断ミキサーポリトロン(Polytron)を用いて、同一の温度を維持しつつ、乳化を行った。得られたこの粗エマルションを、迅速に冷却した。二段階ホモジナイザーを用いて、微細な単分散エマルションを得た。
最後に、このエマルションのpHを調節し、0.45μのミリポアフィルタで濾過して、該乳化および均質化工程中に生成した、粗い液滴およびデブリを捨てた。
【０００８】
全ての処理操作は、無菌条件下で行った。
この例における最終的なエマルション中の、種々の成分の相対的な量およびその説明中に与えられたその範囲は、以下の通りである：
アムホテリシンB 0.075% (0.015-0.15%)、MCT油 20% (3-50%)、リン脂質 E80 0.5% (0.5-20%)、ポロキサマー 2% (0.3-10%)、ナトリウムデオキシコレート 1% (0.5-5%)、グリセリン 2.25%、α-トコフェロール 0.02%および二重に蒸留した水 200%。
【０００９】
米国特許第5,364,632(1994)/日本国特許JP2,290,809(1990)に記載の方法の欠点i) アムホテリシンBのメタノールに対する溶解度が低いので、所定量のアムホテリシンBを溶解するのに、大量のメタノールが必要とされる。このことは、最終的な組成物における該薬物の濃度を制限する。
ii) この方法では、まず該薬物、即ちアムホテリシンBおよびリン脂質の薄膜を形成し、次いで水性相を用いてこの膜を水和する必要がある。該水性相は、ノニオン性の乳化剤であるポロキサマー、界面活性剤であるナトリウムデオキシコレートを含む。
iii) 使用する該油相は、添加されたα-トコフェロールを含むMCT油である。このエマルションは、70℃に維持された該油相を、45℃に維持された水性相に添加することにより調製される。これは、該アムホテリシンBが該油相中に維持されるのを保証しない。この方法は、該アムホテリシンBが該油相中に配置された場合には、その毒性を減じる十分な能力を利用していない。
【００１０】
iv) 米国特許第5,364,632(1994)の方法で得られる生成物は、これを無菌状態とするために、無菌条件下で作られる。薬局方において指定された好ましい滅菌法は、最終的な容器内で該製品をオートクレーブ処理することである。更に、アムホテリシンBは一般に静脈内経路で投与されるので、最終的な滅菌は、無菌要件に関する高い信頼をもたらす、好ましい唯一の代替法である。
v) このエマルション製品は、機械的な応力に対して安定であるが、その毒性については研究されていない。即ち、この製品の毒性は、未知である。しかし、インビボでの比較研究は、Balb/cマウスで行われ、ナトリウムデオキシコレートを含有する市販のアムホテリシンB処方物である、フンギゾン(Fungizone)と比較されている。この研究は、この製品がフンギゾンよりも低毒性であることを示した。
vi) MCT油および該ポロキサマーの使用は、細網内皮系(RES)による該薬物の取り込みを減じることを通して、該薬物の血漿内濃度を高める。真菌に感染した場合、感染サイトである、該細網内皮系に、アムホテリシンBを分配する必要がある。
【００１１】
日本国特許11-60491(1989)
この日本国特許では、エマルション形状にある、アムホテリシンB含有医薬処方物を記載している。このエマルションは以下の成分を含んでいる：
i) アムホテリシンB(最終的なエマルションの1〜10 mg/ml)、
ii) 油相-この油相は、植物油、魚油またはトリグリセリドからなる(1〜50％、好ましくは5〜30％)。使用する好ましいこの種の油は、大豆油またはゴマ油である、
iii) 乳化剤-使用するこの乳化剤は、リン脂質である。更に、他の非-毒性の乳化剤を使用することも可能である。使用するリン脂質は、卵黄リン脂質、大豆リン脂質、またはこれら材料から得られる、水添製品等である。ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロールを使用することもできる。推奨されるその量は、該油成分の1〜50質量％、好ましくは該油成分の10〜30質量％、または該エマルションの1〜10%w/v、好ましくは4〜6％w/vである。
【００１２】
ノニオン性乳化剤、例えばポリアルキレングリコール(分子量：1000〜10000、好ましくは4000〜6000)、またはポリオキシエチレンまたはポリオキシプロピレンポリマー(分子量：1000〜20000、好ましくは2000〜10000)、水添ヒマシ油ポリオキシアルキレン誘導体、例えば水添ヒマシ油ポリオキシエチレン-20-エーテル、-40-エーテル、-100-エーテルを、5%w/v未満、好ましくは1％w/v未満の量で使用する。2種のノニオン性乳化剤の組合せを使用することも可能である。
iv) 脂肪酸およびその塩(製薬上許容された)：1％w/vまで、好ましくは0.5％w/vまで。
v) 5%w/v未満、好ましくは1％w/v未満の安定剤、該安定剤はa) 高分子量ポリマー物質、例えばヒト起源のアルブミン；ビニルコポリマー、例えばポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール；脂肪族アミン、およびb) ゼラチン、ヒドロキシエチル澱粉；各種コレステロールを含む。
【００１３】
vi) 5%w/v未満、好ましくは1％w/v未満の等張剤。
vii) グリセリンまたはモノオレイン、モノパルミチン等の該グリセリンのモノエステル。
viii) 5%w/v未満、好ましくは1％w/v未満の糖類、例えばモノおよびジサッカライド、ソルビトール、キシリトール。
ix) 5%w/v未満、好ましくは1％w/v未満の酸化防止剤、例えばトコフェロール。x) pH調節剤、例えば酸、アルカリまたは緩衝剤。
【００１４】
以下の製造方法は、以前に報告されたものである。この方法は、まず油中水(w/o)型エマルションを形成し、次いでこれを、水で希釈することによって、水中油(o/w)型エマルションに転化する工程を含む。この方法において、大豆油、リン脂質、アムホテリシンBおよび幾分かの水並びに他の添加物(使用する場合には常に)を、全て一緒に混合し、必要ならば加熱する。次に、この混合物を、高圧ホモジナイザーで均質化する。更に、必要な量の水を添加して、w/oエマルションをo/wエマルションに転化し、これを再度均質化する。
典型的な例においては、200 g の大豆油、50 g のリン脂質および2.5 g のアムホテリシンBおよび750 ml の水を、上記のように処理する。
もう一つの例では、該組成物の2.2％w/vのグリセリンを、上記組成物に配合する。
該エマルション液滴の平均サイズは、0.1〜0.2μmである。このエマルションおよびその液滴のサイズは、冷蔵条件下で10日まで安定である。
【００１５】
この日本国特許11-60491(1989)の方法の欠点は以下の通りである：
エマルション処方物中のアムホテリシンBが、従来のアムホテリシンB処方物よりも低毒性であることは公知である。しかし、この日本国特許11-60491(1989)の処方物は、この特許における以下のようなエマルション製造方法の故に、この乳化の概念にとって達成可能な、毒性を減じる十分な能力を利用していない。
i)該日本国特許11-60491(1989)において得られるエマルションの平均粒径は0.1〜0.2μmであるので、細網内皮系による、より大きなサイズを持つ粒子の優先的な取り込みという、周知の利点を利用することができない。該細網内皮系が大部分の真菌感染サイトであることから、この細網内皮系によるアムホテリシンBの優先的な取り込みが必要とされる。
ii) 該エマルションの安定性は、冷蔵庫内で、10日まで研究されている。
【００１６】
iii) 乳化を支持する薬品、例えば脂肪族アミン、高分子量ポリマー、ノニオン性の界面活性剤、種々のコレステロール、糖類、例えばモノおよびジサッカライド、酸化防止剤を包含する多数の添加物を、このエマルション処方物に添加することを示唆している。
iv) この製品を滅菌するための方法は、特定されていない。
日本国特許4-173736(1992)において、0.005％〜5％のアムホテリシンB、0.5％〜25％のリン脂質、好ましくはエッグレシチンを含む製品が、記載されている。この組成物は、100 nm なる平均粒子径を持つ。これはエマルションではなく、如何なる油相をも含まない。
米国特許第5,389,373号(1995)には、低溶解性の薬物を含む、水中油(o/w)型エマルションの製法が記載されている。この方法は、高または低pHの水性溶液中にアムホテリシンBを溶解し、予め形成したエマルションに、この溶液を100μg/ml 以下の量で添加し、このエマルションに、該製品を中和し、かつそのpHを所定値に調節するのに適した、酸、塩基または緩衝剤を添加する工程を含む。
【００１７】
この米国特許第5,389,373号(1995)記載の方法の諸欠点
この方法の主な弱点は、該アムホテリシンBを、該エマルションに低濃度でしか添加できないことにある。この方法では、アムホテリシンBの濃度は、100μg/ml 程度である。従って、大容量の該組成物を注入する必要があり、これは治療の観点から不利である。
米国特許第5,534,502号(1996)では、アムホテリシンBを、酸およびエタノールの使用により脱結晶化させ、次いで脂質中に均一に分散させ、引き続きこれを乳化している。この方法では、アムホテリシンBをエタノールに溶解することが必須であり、最も好ましいエタノールの量は、アムホテリシンB1 g 当たり400〜600 ml である。この方法の主な弱点は、アムホテリシンBが酸性pHにおいて不安定であることにある。
欧州特許EP 0700678 (1996)は、本質的にクエン酸またはその薬理的に許容される塩および少なくとも1種のメチオニン、フェニルアラニン、セリン、ヒスチジンおよびこれらの薬理的に許容される塩を含むが、同時にメチオニンとフェニルアラニンとを含むことはない、脂質エマルションを開示している。
【００１８】
クエン酸と少なくとも1種の上記アミノ酸とを同時に使用することが必須である。この発明によるエマルションの製造方法を、以下に記載する。
乳化のためのリン脂質および補助薬品、例えばオレイン酸を、ヘキサン等の適当な有機溶媒に溶解し、次いで該溶媒を、減圧下で留去して、脂質膜を得る。得られたこの脂質膜に、油成分と水を添加し、この混合物を、振とうによって激しく撹拌して、予め乳化する。得られたこの液体を、通常使用されている乳化装置を使用して乳化する。この乳化の完了後、得られたこのエマルションのpHを、塩酸または水酸化ナトリウムの添加により、所定レベルに調節する。次に、クエン酸とアミノ酸とをこのエマルションに添加して、脂質エマルションを得る。あるいはまた、この脂質エマルションは、同様に油成分と、クエン酸とアミノ酸との水性溶液とを、上記手順によって調製した該脂質膜に添加し、次いで得られたこの混合物を、該乳化手順に掛けることによって得ることもできる。
【００１９】
この欧州特許EP 0700678 (1996)記載の方法の欠点
このアムホテリシンBエマルションの製法は、具体的に記載されていない。アムホテリシンBは、「脂質エマルションとして処方できる」ものとして述べられている約70種の薬物リスト由来の、薬物の一つである。
i) 脂質エマルションの製法は、リン脂質を適当な有機溶媒、例えばヘキサンに溶解する工程を含む。
ii) この特許の実施例では、アミノ酸およびクエン酸を、予め形成した脂質エマルションに添加し、変色に対する安定性を、60℃にて検討した。静脈内投与されるエマルションは、オートクレーブ処理の滅菌温度に対して安定でなければならない。
iii) これら実施例の一つにおいて特定された滅菌法は、60℃にて1時間加熱し、この滅菌工程を、24時間おきに3回行うことである。この方法は、静脈内投与用の注射液を調製するには不適当である。
【００２０】
本発明の目的は、非-経口投与にとって有用な、極めて低い毒性を持つアムホテリシンBエマルションの製法を開発することであり、また上記した従来法の諸欠点および弱点を克服することにある。
従って、この主な目的の主要な部分は、アムホテリシンBの固体粉末を油で被覆し、この油被覆した固体アムホテリシンB粉末を、水中油型エマルションの油相中に配置させ、しかもアムホテリシンBを、該エマルションの該油相中に配合された状態に、滅菌のオートクレーブ処理およびその後の保存寿命および使用を包含する、全製造工程を通して維持する。
【００２１】
該主な目的のもう一つの部分は、該エマルション中の平均の油滴の大きさが、最適な範囲内に制御され、低い血漿濃度を与える、細網内皮系内に優先的に分配される、構造化された水中油型エマルションの製法を開発することにある。従って、注射の目的にとっては、油被覆した固体アムホテリシンBを含有する、油の小滴を含む、水性の外側相を持つエマルションの如く挙動する。
該主な目的のもう一つの部分は、最小限の添加剤のみを必要とする、このような構造化されたアムホテリシンBエマルションの製法を開発することにあり、この方法では、水中油型エマルションの製造が必須である。
【００２２】
【発明の開示】
従って、本発明は、構造化エマルション形状にある、油被覆アムホテリシンＢの非経口組成物であって、マウス内で少なくとも400 mg/kgなるLD₅₀を有し、a) 植物油、例えば大豆油、ゴマ油、ベニバナ油からなる群から選択される油相(該組成物の30％w/vまで)、b) 該油相中に分散されたアムホテリシンＢ(該組成物の0.05〜1％w/v)、c) 水相の水、d) 該水性層に溶解された、グリセリン、マニトール、デキストロース等の化合物群から選択される張度改良剤、およびe) 該水性層に分散された、天然ホスファチド等の乳化剤(該組成物の3%w/vまで)を含むことを特徴とする、上記非経口組成物に関する。
【００２３】
もう一つの態様において、本発明は、構造化エマルション形状にあり、マウス内で少なくとも400 mg/kgなるLD₅₀を有する、油-被覆アムホテリシンBの非-経口組成物の製法に関わり、この方法は、アムホテリシンBを油相中に分散させ、水に張度改良剤を溶解することにより、水性相を調製し、該乳化剤を該水性相中に分散させ、該水性相のpHを約8〜11に調節し、撹拌しつつ、該油相を該水性相に添加して、粗構造化エマルションを生成し、粒径2μm以下まで、該粗構造化エマルションを均質化し、濾過し、該均質化した構造化エマルションを、窒素雰囲気下でガラス容器内に充填し、閉じた該ガラス容器を密封し、オートクレーブ処理によって、該充填し密封した容器を滅菌する諸工程を含む。これら処理工程の順序は重要である。これら処理工程順序の変更は、毒性の研究によって反映されるように、該エマルションの構造を変えてしまう。
【００２４】
エッグホスファチドを水性相に分散させ、かつ該アムホテリシンB粉末を油相に分散させることが、本発明の方法の特徴であり、結果としてその生成物は、構造化エマルション形状にある、油-被覆アムホテリシンBと呼ばれる。
もう一つの態様において、本発明は、上記方法によって作られたような、構造化エマルション形状にある、油-被覆アムホテリシンBを含有する、非-経口投与型組成物に関する。
水中油型の構造化エマルション形状にあるアムホテリシンBの、本発明の方法による処方は、その毒性の大幅な低下をもたらし、またその抗真菌活性を変更すること無しに、該組成物の滅菌を保証した。より低毒性の、本発明の該組成物は、幾つかの感染の治療における、投与レベルを増大する余地を与える。
【００２５】
本発明の構造化されたエマルション形状にある、油-被覆アムホテリシンBの腸管外投与型の組成物は、より低毒性であり、また以下の事実により特徴付けられる：
a) マウスにおける、一回投与の毒性研究において、少なくとも400 mg/kg体重および反復投与の毒性研究において、少なくとも40 mg/kg体重なるLD₅₀をもつ。
b) ラットでの一回投与毒性研究において、少なくとも150 mg/kg体重なるLD₅₀をもつ。
c) ナトリウムデオキシコレートを含む従来の処方物と比較して、ヒト赤血球に対して、少なくとも20倍低い、溶血作用を持つ。
d) 細網内皮系における優先的組織分布性を有し、またマウスにおける、一回投与の毒性研究において、ナトリウムデオキシコレートを含む従来の処方物と比較して、細網内皮系の器官において、少なくとも２倍のt_1/2をもつ。
e) マウス内に注入した後に、心臓毒性の有害な症状、例えば重篤な呼吸困難、局所的な刺激、腹部窮迫および興奮等を示さない。
【００２６】
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の構造化エマルション形状にある、油-被覆アムホテリシンBを含有する、非-経口投与型組成物中の、アムホテリシンBの含有率は、概して、該組成物の0.05％〜1％w/vなる範囲内にある。好ましくは、該含有率は、0.1〜0.5％w/vなる範囲にあり、特に該組成物の約0.5％または約0.25％w/vである。
本発明の方法において、アムホテリシンBは、乳化前に油相中に分散している。アムホテリシンBはそのまま使用するか、あるいは油相中に分散する前に、微細化する。該油相は、概して、該組成物の30％w/vまで、好ましくは5〜25％w/vおよびより好ましくは10〜20％w/v、特に約10％w/vまたは約20％w/vなる量で存在する。典型的には、使用するこの油相は、植物油であり、例えば大豆油、ゴマ油、綿実油、ベニバナ油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、コーン油、ヒマシ油またはオリーブ油等の植物油の1種であり得る。好ましい植物油は、大豆油である。
【００２７】
本発明において、乳化剤は水性相に溶解する。適当な乳化剤は、天然産のホスファチドおよび変性ホスファチドを含む。好ましい乳化剤は、天然産のホスファチド、例えばエッグホスファチドおよび大豆ホスファチドである。本発明で使用する乳化剤は、上記乳化剤の２種以上の混合物を含むことができる。好ましい天然のホスファチドは、精製したエッグホスファチドである。
本発明の構造化エマルション形状にある、油-被覆アムホテリシンBを含有する、非-経口投与型組成物は、6.0〜8.5なる範囲のpHで処方される。本発明の方法において、該水性相のpHは、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムの水溶液等の、アルカリによって8〜11なる範囲に調節され、従ってオートクレーブ処理後の本発明の組成物のpHは、6〜8.5なる範囲内に留まる。
【００２８】
本発明の構造化エマルション形状にある、油-被覆アムホテリシンBを含有する、非-経口投与型組成物は、張度改良剤、例えばグリセリン、マニトール、デキストロース、またはこれらの組み合わせ等を配合することによって、血液に対して等張化される。好ましい張度改良剤はグリセリンである。グリセリンは、この組成物の2〜3％w/vなる範囲の量で存在する。好ましくは、使用するグリセリンの量は、該組成物の約2.25％w/vである。
より詳しくは、本発明の構造化エマルション形状にある、油-被覆アムホテリシンBを含有する、非-経口投与型組成物は、制御された条件下にある製造手順に従って調製される、無菌水中油型エマルションであり、また最終的にオートクレーブ処理によって滅菌される。この乳化を高温にて行う場合、該水性相または油相もしくはこれら両者は、75℃までの温度に維持される。
【００２９】
本発明の組成物の平均粒径は、慎重に2μmまでに維持され、従ってアムホテリシンBは優先的に細網内皮系内に分配され、その結果低血漿濃度をもたらす。
本発明を、典型的な例で説明する。そこでは、該構造化エマルションは、アムホテリシンB (0.5% w/v)、油相の大豆油(20%w/v)、乳化剤の精製エッグホスファチド(1.2%w/v)、張度改良剤であるグリセリン(2.25%w/v)および水(100容量%とするのに十分な量)を含み、アムホテリシンBを大豆油中に分散させ、グリセリンを水に添加することによって水性相を調製し、次いで該精製エッグホスファチドを、該水性相に分散させ、該水性相のpHを10.8に調節し、アムホテリシンBを含有する該大豆油を、撹拌下に該水性相に添加して、粗エマルションを生成し、この粗エマルションを、粒径2μm以下まで均質化し、2μmのフィルタで濾過し、窒素雰囲気下でガラス容器に充填し、該ガラス容器を閉じ、該閉じたガラス容器を密閉し、該充填し密閉した容器を、オートクレーブ処理によって滅菌する工程を含む方法によって製造する。
【００３０】
本発明の水中油型エマルション形状に構造化された、油-被覆アムホテリシンBを含有する、非-経口投与型組成物の該構造化されたエマルションは、低毒性を有し、かつこれは小さな粒子径を有し、また腸管外投与用に適している。本発明の組成物が、アムホテリシンB活性の大幅な喪失なしに、また該エマルションの安定性の破壊なしに、最終のオートクレーブ処理によって滅菌されることから、この製品の無菌性が保証される。本発明の組成物は、この製品を5％デキストロース注射液または塩水で希釈して、非-経口投与に必要な濃度とすることができるので、容易に使用できる。本発明の組成物は、また長い保存寿命を有し、また結果としてそのまま市販できる製品として適している。
アムホテリシンBおよび精製エッグホスファチドの添加方法に変更を加えた方法により調製した、エマルションの毒性プロフィールを研究した。これらは、以下の表に与えたように、実施例において説明する。
【００３１】
【表１】

【００３２】
本発明の方法において、水性相内にアムホテリシンBを懸濁した場合に、マウスに注射した際に重篤な呼吸困難、局所的刺激、腹部窮迫および興奮等の心臓毒性の症状を発生する製品を与えることが観測される。しかし、これらの有害な症状は、アムホテリシンBを油相中に懸濁した場合には観測されなかった。これは、該エマルションの油状液滴およびクッパー細胞両者による貯蔵作用によるものと考えられる。この緩慢な放出は、エマルション処方物の注入に伴って、血漿におけるモノマー状アムホテリシンBの存在をもたらし、結果としてその毒性を減じるものと考えられる[Anti-microbial agents and chemotherapy, 1997, 41(4): 728-732を参照のこと]。
我々は、油相中に乳化剤エッグレシチンを添加することにより調製した組成物も、上記のような心臓毒性の症状を発生することを見出した。広範な実験の後に、この問題は、エッグレシチンを水性相に添加することにより解決された。これら方法に関わる研究は、実施例I〜VIに記載されている。実施例Iの変形に相当する実施例IIおよびIIIは、本発明に関わるものであり、一方実施例IV、VおよびVIは本発明以外の例である。実施例VIIは、ヒトの赤血球に対するインビトロ毒性研究を記載する。実施例VIIIおよびXIは、マウス、ラットおよびイヌにおける毒性研究を記載する。実施例IXは、ウサギにおける薬物動態学的研究を記載し、実施例Xは、マウスにおける期間内分布研究を記載する。
【００３３】
油中に分散されたアムホテリシンBおよび水中に分散されたエッグレシチンが、極めて低い毒性を持つエマルションを与えるという観測は、油の液滴とアムホテリシンBとの間の強力な相互作用を示唆する。従って、アムホテリシンBエマルションは、モノマー状態にあるアムホテリシンBの貯蔵庫であると考えることができ、またこの処方物の高い安定性のために、限られた量のみの遊離アムホテリシンが、徐々に放出されるのであろう。モノマー状態にあるアムホテリシンBは、真菌細胞のエルゴステロールと結合できるが、宿主哺乳動物細胞に対しては不活性であり、結果として低い毒性をもたらす。従来のアムホテリシンB処方物における、血漿内への高い遊離アムホテリシンB濃度での放出は、循環系内における、自己-結合したオリゴマーの存在に導く。これらオリゴマー形状のものは、宿主の細胞膜を含むコレステロールと相互作用して、より高い毒性をもたらす。このことは、従来の処方物に比して、本発明のアムホテリシンBエマルションの毒性が低いことのメカニズムを説明している。より低いピーク濃度および血漿におけるAUC値(実施例IX)および対応する迅速なアムホテリシンBの組織への堆積(実施例X-A)も、本発明のアムホテリシンBエマルションが低毒性であることの理由を説明している。低毒性は、実施例VIII-A、VIII-BおよびVIII-Cに与えられているように、我々の発見によって確認されている。
【００３４】
これら毒性の研究は、本発明の製品である、構造化エマルション形状にある、油-被覆アムホテリシンBを含有する、非-経口投与型組成物が、日本国特許11-60491(1989)に記載されているものと類似するように考えられるが、本発明の製品は、その製造工程のために、特徴的な生物学的に低い毒性を持つことを示している。
本発明の方法は、注入された際に血漿内にアムホテリシンBを徐々に放出するので、モノマーを容易に生成するエマルション製品を与えるが、かかる現象は、日本国特許11-60491(1989)の方法で製造した製品では起こらない。従って、本発明のエマルション構造は、毒性の研究によって特徴付けられるように、日本国特許により得られたものとは異なる。従って、我々は、本発明のエマルションを、構造化(された)エマルションと呼ぶ。
本発明の主な態様では、アムホテリシンBは油相に分散され、従ってアムホテリシンB粉末は油被覆される。乳化剤として使用するエッグレシチンは、水性相内に分散される。
本発明のもう一つの態様では、該均質化を反復サイクルで行って、2μm以下の粒径分布を達成する。
本発明のもう一つの態様では、構造化エマルション形状にある、油-被覆アムホテリシンBを含有する、最終的な非-経口投与型組成物は、最終的にオートクレーブ処理によって滅菌される。
【００３５】
従来技術との相違：
以下の記載から、本発明の方法が従来の技術とは異なることを理解することができる。
a) 本発明の方法は、米国特許第5,364,632号(1994)とは、アムホテリシンB用の如何なる溶媒も使用しない点、アムホテリシンBおよびリン脂質フィルムの製造工程およびその後の水和工程を経ない点、α-トコフェロールを添加したMCT油を使用しない点、エッグホスファチドを含有する水性相のpHを8-11に調節している点、最終的な滅菌段階を含む点、また該製品が低毒性である点および細網内皮系(RES)内での良好な分配性を持つ点において異なっている。
大量の溶媒の使用は、該従来法の工業的な利用を困難にしている。種々の例において、粒径は100 nm 未満であることが分かっているが、該組成物の毒性は報告されていない。
本発明の方法では、5 mg/ml においてさえ低毒性が維持されており、このことは注入に要する体積が小さいことから、治療上有利である。
【００３６】
b) 本発明の方法は、日本国特許11-60491(1989)とは、該エマルション小球/粒径が、この日本国特許においては0.1〜0.2μmであり、また本発明においては2μmまでである点において異なっている。
本発明の方法において、エッグホスファチドは水性相に添加され、またこの水性相のpHは、8-11に調節される。
本発明の製品の貯蔵寿命は、2年を越えるが、この日本国特許の貯蔵寿命は、10日程度または数週間である。
多数のエマルション維持薬物が、この日本国特許の方法では必要とされるが、本発明の薬物エマルションでは必要ない。
本発明の方法は、オートクレーブ処理によって最終的に滅菌される、無菌製品を提供し、公知の日本国特許の製品は滅菌されていない。
【００３７】
c) 日本国特許4-173736(1992)の方法で作られた製品は、1μmを越える径を持つ粒子を含まず、またこの製品は、油成分を含まず、結果として本発明の組成物とは異なっている。
d) 米国特許第5,389,373号(1995)において、アムホテリシンBは、予め形成されたエマルションに添加されるが、本発明の方法では、アムホテリシンBは油相に分散される。
e) 欧州特許EP 0700678 (1996)では、アムホテリシンBエマルション自体は開示されていない。これは、「脂質エマルションとして処方可能な」ものとして、この特許に指定されている約70種の薬物の一つである。
この特許に記載されているエマルションは、本質的に、アミノ酸およびクエン酸またはその塩を含むべきであり、これらは本発明の方法では全く必要とされない。
この特許のエマルションの製法は、本質的に薬物を含むまたは含まないリン脂質フィルムを製造することから始められる。この手順は本発明の方法では全く必要とされない。
【００３８】
エマルションの製法において、該手順は、乳化剤の種々の添加方法を指定しており、一方本発明の方法は、乳化剤を水性相に添加する手順のみを指定している。
欧州特許EP 0700678 (1996)に記載された発明の目的は、本質的にクエン酸とアミノ酸とを使用して、脂質エマルションの変色の問題を解決することにあり、一方本発明の目的は、マウスにおいて少なくとも400 mg/kg なるLD₅₀によって特徴付けられる低毒性の、水中油型エマルションに構造化された、油-被覆アムホテリシンBを開発することにある。
以上本発明を特定の態様に基づいて説明してきたが、本発明を逸脱することなしに、種々の変更並びに改良が可能であることは、当業者には明らかであろう。
【００３９】
【実施例】
以下本発明を実施例に基づいて説明する。これら実施例は、例示の目的のみで与えられるものであり、本発明の範囲を何等限定するものではない。
以下の実施例で使用する原料全ては、腸管外投与グレードのものである。使用する装置は、従来のものであった。全加工を、制御された環境を持つ領域で行った。窒素雰囲気下で、バッチ処理を行った。
これら実施例で使用したアムホテリシンBは、USP規格に従う、アルファルマ(Alpharma)から入手した、腸管外投与グレードのものであった。
これら実施例で使用する精製エッグホスファチドは、腸管外投与グレードのものであり、またリポイズ(Lipoids)から入手した。
ナトリウムデオキシコレートを含有する、市販品として入手できるアムホテリシンB注射液は、薬物動態学的研究、器官分布研究および毒性研究全体を通して、公知のアムホテリシンB注射液と呼ぶ。ただ一つの銘柄の公知組成物を、研究全体を通じて使用する。
【００４０】
実施例１
40 g の大豆油に1 g のアムホテリシンBを分散させることにより、油相を調製した。
4.5 g のグリセリンを150 ml の水に添加し、次いでこれに2.4 g のエッグホスファチドを分散させることによって、水性相を調製した。水酸化ナトリウム水性溶液を用いて、そのpHを10.6に調節した。
上で調製した油相を、高速撹拌条件下で、該水性相に添加した。水で、全体積を200 ml とした。生成したこのエマルションを、高圧ホモジナイザーに通した。均質化を、該小球/粒径が、2μm以下となるまで繰り返した。この製品は、各均質化サイクル後即座に約20℃に冷却した。
この均質化したエマルションを、2μmのフィルタを介して濾過し、窒素雰囲気下で容器に充填し、密閉し、オートクレーブ処理によって滅菌した。
【００４１】
この方法で製造した製品は、以下のような組成を有している：a) アムホテリシンB 1.0 g；b) 大豆油 40.0 g；c) 精製エッグホスファチド 2.4 g；d) グリセリン 4.5 g；e) 水酸化ナトリウム・・pHを調節するのに十分な量；f) 水・・全体を200mlとするのに十分な量。
得られたこの滅菌された製品を、マウス、ラットおよびイヌにおける毒性研究(実施例VIII-A、VIII-B、VIII-C、VIII-D)、薬物動態学的研究(実施例IX)、器官内分布研究(実施例X-A、X-B)で使用した。安定性の研究を、該製品をバイアル内で2〜8℃にて保存することにより行い、その結果を以下の表に与える。
【００４２】
【表２】
実施例Iで得た製品の安定性に関するデータ

【００４３】
この毒性に関する研究は、明らかに本発明の方法により調製したエマルションが、相乗作用性の組成物であることを示している。
実施例II
アムホテリシンB粉末を、エアージェットミルを用いて、10μ未満の粒径となるまで、微細化した。
40 g の大豆油に1 g のアムホテリシンB(微細化したもの)を分散させることにより、油相を調製した。
4.5 g のグリセリンを150 ml の水に添加し、次いでこれに2.4 g のエッグホスファチドを分散させることによって、水性相を調製した。水酸化ナトリウム水性溶液を用いて、そのpHを10.8に調節した。
【００４４】
上で調製した油相を、高速撹拌条件下で、該水性相に添加した。水で、全体積を200 ml とした。生成したこのエマルションを、高圧ホモジナイザーに通した。均質化を、該小球/粒径が、2μm以下となるまで繰り返した。
この均質化したエマルションを、2μmのフィルタを介して濾過し、窒素雰囲気下で容器に充填し、密閉し、オートクレーブ処理した。
この方法で製造した製品は、以下のような組成を有している：a) アムホテリシンB(微細化したもの) 1.0 g；b) 大豆油 40.0 g；c) 精製エッグホスファチド 2.4 g；d) グリセリン 4.5 g；e) 水酸化ナトリウム・・pHを調節するのに十分な量；f) 水・・全体を200mlとするのに十分な量。
本実施例は、微細化したアムホテリシンBを使用した場合には、均質化の際の冷却が不要であることを明らかにしている。
【００４５】
実施例III
予め70℃に加熱した、40 g の大豆油に、1 g のアムホテリシンBを分散させることにより、油相を調製した。
4.5 g のグリセリンを、予め65℃に加熱した、150 ml の水に添加し、次いでこれに2.4 g のエッグホスファチドを分散させることによって、水性相を調製した。水酸化ナトリウム水性溶液を用いて、そのpHを10.8に調節した。
70℃の該油相を、高速撹拌条件下で、65℃の該水性相に添加した。水で、全体積を200 ml とした。生成したこのエマルションを、高圧ホモジナイザーに通した。均質化を、該小球/粒径が、2μm以下となるまで繰り返した。この製品は、各均質化サイクル後即座に約20℃に冷却した。
この均質化したエマルションを、2μmのフィルタを介して濾過し、窒素雰囲気下で容器に充填し、密閉し、110℃にて40分間オートクレーブ処理することにより滅菌した。
【００４６】
この方法で製造した製品は、以下のような組成を有している：a) アムホテリシンB 1.0 g；b) 大豆油 40.0 g；c) 精製エッグホスファチド 2.4 g；d) グリセリン 4.5 g；e) 水酸化ナトリウム・・pHを調節するのに十分な量；f) 水・・全体を200mlとするのに十分な量。
得られた製品中のアムホテリシンBの含量を分析したところ、満足なものであることが分かった。このことは、乳化をより高温にて行うことができることを示している。
実施例IV
油相-40 g の大豆油。
4.5 g のグリセリンを150 ml の水に添加し、次にこれに2.4 g のエッグホスファチドを分散させて、水性相を調製した。1 g のアムホテリシンBをこのエッグホスファチド溶液に分散させ、水酸化ナトリウム水性溶液を用いて、そのpHを10.8に調節した。
該油相を、高速撹拌条件下で、該水性相に添加した。水で全体積を200 ml とした。生成したこのエマルションを、高圧ホモジナイザーに通した。均質化を、該小球/粒径が、2μm以下となるまで繰り返した。この製品は、各均質化サイクル後即座に約20℃に冷却した。
【００４７】
この均質化したエマルションを、2μmのフィルタを介して濾過し、窒素雰囲気下で容器に充填し、密閉し、オートクレーブ処理によって滅菌した。
この方法で製造した製品は、以下のような組成を有している：a) アムホテリシンB 1.0 g；b) 大豆油 40.0 g；c) 精製エッグホスファチド 2.4 g；d) グリセリン 4.5 g；e) 水酸化ナトリウム・・pHを調節するのに十分な量；f) 水・・全体を200mlとするのに十分な量。
この滅菌製品を、実施例XIに詳しく記載する毒性研究に付し、心臓毒性の有害な症状を生じることを見出した。従って、アムホテリシンBの水性相への添加は推奨できない。
実施例V
撹拌条件下で、予め70℃に加熱した大豆油40 g に、2.4 g の精製エッグホスファチドを溶解して、油相を調製した。
4.5 g のグリセリンを、予め65℃に加熱した、150 ml の水に添加し、次いでこれに1 g のアムホテリシンBを分散させることによって、水性相を調製した。水酸化ナトリウム水性溶液を用いて、そのpHを11.0に調節した。
【００４８】
70℃の該油相を、高速撹拌条件下で、65℃の該水性相に添加した。水で、全体積を200 ml とした。生成したこのエマルションを、高圧ホモジナイザーに通した。均質化を、該小球/粒径が、2μm以下となるまで繰り返した。この製品は、各均質化サイクル後即座に約20℃に冷却した。
この均質化したエマルションを、2μmのフィルタを介して濾過し、窒素雰囲気下で容器に充填し、密閉し、オートクレーブ処理により滅菌した。
この方法で製造した製品は、以下のような組成を有している：a) アムホテリシンB 1.0 g；b) 大豆油 40.0 g；c) 精製エッグホスファチド 2.4 g；d) グリセリン 4.5 g；e) 水酸化ナトリウム・・pHを調節するのに十分な量；f) 水・・全体を200mlとするのに十分な量。
この滅菌製品を、実施例XIに詳しく記載する毒性研究に付し、心臓毒性の有害な症状を生じることを見出した。従って、精製エッグホスファチドの油相への添加およびアムホテリシンBの水性相への添加は推奨できない。
【００４９】
実施例VI
40 g の大豆油を75℃に加熱し、撹拌下に2.4 g のエッグレシチンを溶解した。1 g のアムホテリシンBを撹拌下に油相に分散させて、アムホテリシンBが均一に分散した油相を得た。窒素を、15分間該油相にフラッシングさせた。
150 ml の水を65℃に加熱した。4.5 g のグリセリンを、撹拌下にこれに添加した。水酸化ナトリウム水性溶液を用いて、pHを10.65に調節した。該アムホテリシンB油分散液を、高速撹拌条件下で、この水性相に添加して、粗エマルションを得た。その体積を、水で200 ml とした。次に、この粗エマルションを、APV高圧ホモジナイザーで均質化して、該均質化製品を2μmのガラス繊維フィルタで濾過可能とした。この製品は、各均質化サイクル直後に、約20℃まで冷却した。濾過したこの製品を、窒素雰囲気下でガラス容器に充填し、密閉し、オートクレーブ処理により滅菌した。
この方法で製造した製品は、以下のような組成を有している：a) アムホテリシンB 1.0 g；b) 大豆油 40.0 g；c) 精製エッグホスファチド 2.4 g；d) グリセリン 4.5 g；e) 水酸化ナトリウム・・pHを調節するのに十分な量；f) 水・・全体を200mlとするのに十分な量。
【００５０】
この滅菌製品を、実施例XIに詳しく記載する毒性研究に付し、心臓毒性の有害な症状を生じることを見出した。従って、精製エッグホスファチドの油相への添加は推奨できない。
以下の実施例における、水中油型エマルションに構造化された、油-被覆アムホテリシンB含有非-経口投与型の組成物を、アムホテリシンBエマルション(5 mg/ml)と呼ぶ。
実施例VII
実施例Iの方法並びに処方により調製したアムホテリシンBエマルション(5 mg/ml)を、ナトリウムデオキシコレートを含有する公知のアムホテリシンB処方物と共に、ヒト赤血球(RBCs)に対するインビトロ毒性試験にかけた。
物質および方法
テスト系：正常な男性ヒトドナー由来のRBCs。
テスト物質：実施例Iの方法並びに処方により調製したアムホテリシンBエマルション(5 mg/ml)
比較物質：公知のアムホテリシンB注射液(5 mg/ml)

【００５１】
研究の企画：血液を、ヘパリン処理したチューブに集めた。RBDsを、450 g にて10分間4℃で遠心分離処理することによって、単離した。その血漿およびバッフィーコートを除去し、該RBDsを、4℃にて、リン酸緩衝塩水(PBS、pH7.4)で3回洗浄した後、PBSに分散させた。これを、シスメックス(Sysmex) KX-21細胞計数器で計数し、収穫当日に使用した。アムホテリシンBに対するRBC感受性を決定するために、2 mlのPBS中の細胞懸濁液(5x10⁷ 細胞/ml)を、アムホテリシンBエマルションまたは公知のアムホテリシンB注射液と共に、37℃にて1時間インキュベートした。次に、該RBDsを、1500 g にて5分間遠心分離し、PBSで3回洗浄した。RBDsのペレットを、2 mlの水で溶解し、撹拌し、かつ遠心分離(1500 g にて5分間)して、膜を除去した。ヘモグロブリンを細胞計数器で測定した。遊離は、コントロールとテスト細胞との間の差異として算出し、全ヘモグロビン含量に対する割合として表した。
【００５２】
【表３】
表１：ヒトRBCに対するインビボ毒性について検討した、アムホテリシンB処方物の用量

【００５３】
統計的分析：得られたデータを、スチューデントt-テストを用いて、負のコントロール群と、処置群とを比較することによって、分析した。
結果および議論
【００５４】
【表４】
表２：アムホテリシンB処方物に対する、G/DLにおけるヘモグロビン含有率

【００５５】
公知のアムホテリシンB注射液およびエマルションにおける、アムホテリシンBの濃度の増加に伴って、ヘモグロビン漏出の増加が見られる(図1参照)。公知のアムホテリシンB注射液は、5 mg/Lに対して77.55％および50 mg/L、100 mg/L、200 mg/Lに対して100％なる平均の漏出を示した。エマルションは、5 mg/Lに対して2.04％、50 mg/Lに対して4.08％、100 mg/Lに対して4.18％および200 mg/Lに対して9.49％なる平均の漏出を示した。アムホテリシンBエマルションは、検討した容量において、公知のアムホテリシンB注射液よりも、著しく毒性が低かった(P<0.05)。
結論：かくして、これらインビトロ毒性データは、明らかに、実施例Iにおいて製造したアムホテリシンBエマルションが、ターゲット細胞がヒトRBCsである場合には、公知のアムホテリシンB注射液よりも毒性が低いことを示している。
【００５６】
実施例VIII
実施例Iの方法並びに処方で調製したアムホテリシンBエマルション (5 mg/ml)を、ナトリウムデオキシコレートを含有する公知のアムホテリシンBと共に、マウス内での、インビボ毒性研究に供した。
この研究は、以下の目的で行った：
１回投与研究からの、上記両処方物に関するLD₅₀値の評価。
反復投与研究からの、上記２種の処方物に関する、毒性に及ぼす効果の測定。
VIII-A) マウスにおける１回投与による毒性研究
物質および方法
テスト系：体重20-22 g の雌スイスアルビノマウスを、Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL) のアニマルハウスから入手し、この研究のために使用した。これら動物に、適宜、標準的な食事およびAquaguard^TM水を与えた。
【００５７】
テスト物質：実施例Iの方法並びに処方で調製したアムホテリシンBエマルション (5 mg/ml)を、ボルス用量(bolus dose)として、静脈内投与した。
比較物質：公知のアムホテリシンB注射液(5 mg/ml)を、ボルス用量として、静脈内投与した。
研究企画：これら動物を、８匹づつの2群、即ち群1および群2に分けた。群1には、種々の用量の公知のアムホテリシンB注射液を与え、一方群2には、種々の用量のアムホテリシンBエマルションを与えた。
【００５８】
【表５】
表３：マウス内での、１回投与による毒性研究のための、アムホテリシンB処方物の用量

【００５９】
全ての群は、静脈内経路による、注射を受けた。全ての動物について、臨床的な毒性に関わるあらゆる徴候、および72時間という期間における致死率を観察した。全ての用量に対する、％致死率を算出した。
統計的分析：全ての処方物についてLD₅₀値を決定するために、プロビット分析法を行った。
結果および議論
【００６０】
【表６】
表４：上記２種の処方物の、種々の用量に対する％致死率

【００６１】
上記表は、従来の製剤、公知のアムホテリシンB注射液が、アムホテリシンBエマルションよりも毒性が高いことを示している。これら処方物に関する％致死率は、用量依存様式で増大した。これら２種の処方物のLD₅₀値は、プロビット分析法によって決定した。図２は、これら２種の処方物に関する、用量に対してプロットした％致死率を与える。
【００６２】
【表７】

【００６３】
結論：実施例Iで調製したアムホテリシンBエマルションは、高いLD₅₀値を有し、かつ該公知のアムホテリシンB注射液よりも毒性が低い。
VIII-B) マウス内での反復投与による毒性研究
物質および方法
テスト系：体重20-22 g の雌スイスアルビノマウスを、Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL) のアニマルハウスから入手し、この研究のために使用した。これら動物に、適宜、標準的な食事およびAquaguard^TM水を与えた。
【００６４】
テスト物質：実施例Iの方法並びに処方で調製したアムホテリシンBエマルション (5 mg/ml)を、ボルス用量(bolus dose)として、静脈内投与した。
比較物質：公知のアムホテリシンB注射液(5 mg/ml)を、ボルス用量として、静脈内投与した。
研究企画：これら動物を、6匹づつの3群、即ち群1、群2および群3に分けた。群1には、ブランクとしてのエマルションビヒクル(コントロール)を与え、群2には種々の用量の公知のアムホテリシンB注射液を与え、また群3には、種々の用量のアムホテリシンBエマルションを与えた。
【００６５】
【表８】
表５：マウス内での、反復投与による毒性研究のために検討した、従来のアムホテリシンBおよびアムホテリシンBエマルションの用量

【００６６】
全ての群は、静脈内経路で、毎日表５に記載のように、注射を受けた。該コントロール群は、最大容量のビヒクルの投与を受けた。全ての動物について、臨床的な毒性に関わるあらゆる徴候を観測した。その体重を、14日間に渡り、1日おきに記録した。また、これら動物を、14日間の期間に渡る、致死率について観察した。全ての用量について、％致死率を算出した。
統計的分析：得られたデータを、この研究中の体重変化を比較するために分析した。このような変化を、処置群同士で比較した。
結果および議論
【００６７】
【表９】
表６：該２種の処方物の、様々な用量に対する％致死率

【００６８】
上記表(図３をも参照のこと)は、公知のアムホテリシンB注射液が、アムホテリシンBエマルションよりも毒性が高いことを示している。これら処方物の％致死率は、用量依存様式で増加した。14日間ビヒクルで処理した群には、致死性は観測されなかった。アムホテリシンBエマルションは、より高い用量においてさえ、公知のアムホテリシンB注射液よりも低い毒性を示した。
【００６９】
【表１０】
表７：マウスにおける反復投与による毒性研究のための種々の用量における平均体重

D：観測日；SDEV：標準偏差
太字：コントロールとは大幅に異なることを示す(アムホテリシンBエマルションのビヒクルで処理)。
【００７０】
公知のアムホテリシンB注射液で処理した群では、1.5 mg/kgおよび2.5 mg/kgにおいて、動物体重の減少を示したが、アムホテリシンBエマルション投与群では、20 mg/kgおよび40 mg/kgから動物体重の減少を示した(図４参照)。6日目および8日目に、20 mg/kgおよび40 mg/kgのアムホテリシンBエマルションで処理したマウスの体重は、10 mg/kgのアムホテリシンBエマルションで処理したマウスの体重よりも著しく小さかった。
組織病理学的検査は、肝臓および腎臓の実質細胞における幾分かの変質性の変化を示したが、これはマウス内の一般的な代謝によるものと考えられる。恐らく、筋原線維(senous myofibrils)は、殺した際の低酸素症の結果であった。これらの変化は、一般に可逆型のものであった。アムホテリシンBの作用は、肝臓および腎臓により集中しており、幾分かは心臓にも及び、極めて迅速な病変を引き起こした。その強さは、一般的に用量依存性であった。公知のアムホテリシンB注射液では、これらの病変は、低用量レベルにおいて見られた。
【００７１】
結論：アムホテリシンBエマルションは、公知のアムホテリシンB注射液よりも低い毒性を示した。
VIII-C) ラットにおける１回投与による毒性研究
物質および方法
テスト系：体重範囲140-160 g の、何れかの性のウイスターアルビノラットを、Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL) のアニマルハウスから入手し、この研究のために使用した。これら動物には、適宜、標準的な食事およびAquaguard^TM水を与えた。
テスト物質：実施例Iの方法並びに処方で調製したアムホテリシンBエマルション (5 mg/ml)を、ボルス用量として、静脈内投与した。
比較物質：公知のアムホテリシンB注射液(5 mg/ml)を、ボルス用量として、静脈内投与した。
研究企画：これら動物を、6匹づつの2群、即ち群1および群2に分けた。群1には、種々の用量の公知のアムホテリシンB注射液を与え、群2には、種々の用量のアムホテリシンBエマルションを与えた。
【００７２】
【表１１】
表８：ラットにおける１回投与による毒性研究のために検討した、公知のアムホテリシンB注射液およびアムホテリシンBエマルションの用量

【００７３】
全ての群は、静脈内経路により、表８に記載したように、注射を受けた。全ての動物について、臨床的な毒性に関わるあらゆる徴候、および72時間という期間における致死率を観察した。全ての用量に対する、％致死率を算出した。
統計的分析：全ての処方物についてLD₅₀値を決定するために、プロビット分析を行った。
結果および議論
【００７４】
【表１２】
表９：これら２種の処方物の様々な用量に対する％致死率

【００７５】
上記表(図５をも参照のこと)は、公知のアムホテリシンB注射液が、アムホテリシンBエマルションよりも毒性が強いことを示している。これら処方物に対する％致死率は、用量依存様式で増大した。これら２種の処方物に対するLD₅₀値は、プロビット分析法によって決定した。この50％致死率は、アムホテリシンBエマルションについて、72時間後に観測された。72時間に渡り、体重変化は見られなかった。
【００７６】
【表１３】

【００７７】
結論：このアムホテリシンBエマルションは、公知のアムホテリシンB注射液よりも毒性が低い。
VIII-D) イヌにおける１回投与による毒性研究
本研究は、イヌにおけるアムホテリシンBエマルションの毒性および安全性を評価する目的で行った。
物質および方法
テスト系：本研究では、平均体重10-15kgの、何れかの性の、12匹の健康なイヌを使用した。これら動物は、適宜餌および水を与えて、標準的な条件下で、犬小屋に収容した。
テスト物質：実施例Iの方法並びに処方で調製したアムホテリシンBエマルション (5 mg/ml)を、ボルス用量として、静脈内投与した。
比較物質：公知のアムホテリシンB注射液(5 mg/ml)を、ボルス用量として、静脈内投与した。
研究企画：これら動物を、6匹づつの2群、即ち群1および群2に分けた。群1には、公知のアムホテリシンB注射液を与え、群2には、実施例Iで調製したアムホテリシンBエマルションを与えた。
【００７８】
【表１４】
表１０：イヌにおける1回投与による毒性研究のために検討した、公知のアムホテリシンB注射液およびアムホテリシンBエマルションの用量の詳細

【００７９】
全ての群には、静脈内経路で、6-20mlの5％デキストロースに溶解したものを、表10に記載のように注射した。全ての動物を、注射後21日間の、臨床的毒性に関わるあらゆる徴候について観察した。これら動物の体重を、回診V0、V2、V４、V6およびV8において測定した。V0、V４およびV8に、血液学的および生化学的研究(腎臓機能および肝臓機能テスト)のために、血液を集めた。
回診スケジュール：V0：ベースライン回診；V1：ベースライン回診から２日以内；V2：V0の3日後；V3：V0の6日後；V4：V0の9日後；V5：V0の12日後；V6：V0の15日後；V7：V0の18日後；V8：V0の21日後。
【００８０】
【表１５】

【００８１】
統計的分析：得られたデータは、この研究中の、パラメータのベースラインからの変動を比較するために分析した。このような変動は、処置群間で比較した。
結果および議論
【００８２】
【表１６】
表１１：イヌにおける種々の回診の際の、ベースラインを越える血液学的パラメータの、平均％変化

表11(続き)

SD: 標準偏差を示す。太字：V4およびV8における、白血球および好中球に関する該2種の処方物投与群間の有意な差を示す。
【００８３】
全ての血液学的なパラメータが、両群において、ベースライン値からの変動を示すことがわかった。エマルションに関する白血球数の計数値における％降下は、公知のものよりもかなり高いが、正常な範囲内であり、従って臨床的な有意さはない。
【００８４】
【表１７】
表12：種々の回診において、イヌに見られた、ベースラインを越える生化学的パラメータの平均％変化

SD: 標準偏差を示す。太字：V4およびV8における、該2種の処方物投与群間の有意な差異を示す。
【００８５】
該肝臓機能のパラメータ(図６参照)、ASTは、公知のアムホテリシンB注射液投与群において、V8により334.38%の上昇を示したが、アムホテリシンBエマルション投与群では、これは僅かに108.86%に制限された。同様な発見は、ALTおよび全ビリルビンについても見られた。公知の処方物投与群に関する上昇は、エマルション投与群に比して、統計的に有意であった。
腎臓機能パラメータ(図7参照)は、公知のアムホテリシンB注射液投与群において、大幅に乱された。アムホテリシンBエマルション投与群におけるずれは、公知のアムホテリシンB注射液投与群におけるずれよりも著しく低かった。
腎毒性、即ちアムホテリシンBの主な毒性は、公知のアムホテリシンB注射液(ナトリウムデオキシコレート含有)のアムホテリシンBと、哺乳動物細胞のコレステロールとの、非-選択的細胞毒性型の相互作用に由来する。哺乳動物細胞毒性は、脂質を主成分とするエマルション処方物中にアムホテリシンBを配合することによって、減衰される。これは、アムホテリシンBのアフィニティーを変更し、かつコレステロール含有哺乳動物細胞への選択的な移行性を低下する。
【００８６】
【表１８】
表13：イヌにおける1回投与による毒性研究のための、種々の用量における平均体重

SD：標準偏差を示す。
【００８７】
公知のアムホテリシンB注射液処理群は、アムホテリシンBエマルション処理群と比較して、動物の体重における大きな減少を示した(図８参照)。
結論：アムホテリシンBエマルションは、公知のアムホテリシンB注射液と比較して、大きな肝細胞毒性および腎毒性に対する防御性をもたらす。
実施例IX
実施例Iの方法並びに処方により調製した、アムホテリシンBエマルション(5 mg/ml)を、公知のアムホテリシンB注射液との比較で、ウサギにおける薬物動態学的パラメータを評価するために使用した。
物質および方法
テスト系：1.5〜2.0kgなる範囲の体重を持つ、雄ニュージランド白ウサギを、Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL) のアニマルハウスから入手し、この研究のために使用した。これら動物には、適宜、標準的な栄養分のある野菜およびAquaguard^TM水を与えた。
【００８８】
テスト物質：実施例Iの方法並びに処方で調製したアムホテリシンBエマルション (5 mg/ml)を、ボルス用量として、静脈内投与した。
比較物質：公知のアムホテリシンB注射液(5 mg/ml)を、ボルス用量として、静脈内投与した。
研究企画：これら動物を、3匹づつの2群、即ち群1および群2に分けた。群1および2には、夫々公知のアムホテリシンB注射液およびアムホテリシンBエマルションを与えた。5、15、30、45および60分、並びに１回の静脈内ボルス投与の、1、2、3、4、5、24および48時間後に、血液サンプルを集めた。これらサンプルを、3000-4000 rpmにて遠心分離処理して、血漿を分離した。この血漿を、分析で使用するまで、-20℃にて保存した。
投与経路：ウサギの耳周辺部静脈を介して注入した。
【００８９】
【表１９】
表１４：ウサギにおける薬物動態学的研究のための、アムホテリシンB処方物の用量

【００９０】
アムホテリシンB含有率の分析：血漿中のアムホテリシンBの含有率は、C-18カラムを用いた、相HPLC法により分析した。血漿中のアムホテリシンBは、1：3：1なる比率のHPLCグレードのジメチルスルホキシドおよびアセトニトリルを用いて抽出した。次いで、これらサンプルを、3000 rpmにて遠心分離処理し、得られた上澄を該カラムに注入した。
統計的分析：得られたデータは、スチューデントt-テストによって、処置群と比較するために分析した。
結果および議論
【００９１】
【表２０】
表１５：2種の上記処方物に関する薬物動態学的パラメータ

【００９２】
【表２１】

【００９３】
上記２つの処方物間で、C_max、T_max、T_1/2、Vdには有意な差は見られない。排除に関連して、エマルションは、公知のアムホテリシンB注射液よりもかなり速い速度で、血漿から除去される(P<0.05)。このことは、組織内での該エマルションの分布が、公知のアムホテリシンB注射液よりもかなり迅速に起こることを示す(図9参照)。
実施例X
実施例Iの方法並びに処方により調製した、アムホテリシンBエマルション (5 mg/ml)を、マウスにおける器官分布研究のために使用し、公知のアムホテリシンB注射液と比較した。
本研究は、以下のような目的で実施した。
1回投与研究による、該2種の処方物に係る、マウス内での、器官分布パターンの評価。
反復投与研究による、該2種の処方物に係る、マウス内での、器官分布パターンの評価。
【００９４】
X-A) マウスにおける、１回投与による器官分布研究
物質および方法
テスト系：体重20-22 g の雌スイスアルビノマウスを、Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL) のアニマルハウスから入手し、この研究のために使用した。これら動物に、適宜、標準的な食事およびAquaguard^TM水を与えた。
【００９５】
テスト物質：実施例Iの方法並びに処方で調製したアムホテリシンBエマルション (5 mg/ml)を、ボルス用量として、静脈内投与した。
比較物質：公知のアムホテリシンB注射液(5 mg/ml)を、ボルス用量として、静脈内投与した。
投与経路：静脈内
研究計画：これら動物を、20匹づつの2群、即ち群1および群2に分けた。群1には、用量1 mg/kg の公知のアムホテリシンB注射液を与え、また群2には用量5 mg/kg のアムホテリシンBエマルションを与えた。各サンプリング点は、4匹のマウスからなっていた。器官サンプル、即ち肝臓、肺、腎臓、脾臓および脳を、各時点の終了時、即ち0.5、1、2、4および24時間に切り取った。これら器官を即座に凍結して、あらゆる酵素反応を停止させた。これら器官を秤量し、3倍量の水を添加した。次いで、これを均質化した。
【００９６】
【表２２】
表１６：マウス内での、１回投与による器官分布研究のために検討した、公知のアムホテリシンB注射液およびアムホテリシンBエマルションの用量

【００９７】
アムホテリシンB含有率の分析：3：1の割合で該ホモジネートにメタノールを添加した。次に、これを13,000-14,000 rpmなる高速で、遠心分離処理した。次いで、得られた上澄を、アムホテリシンBの分析用の、HPLCカラムに注入した。
統計的分析：得られたデータは、スチューデントt-テストによって、処置群同士を比較するために、分析した。
結果および議論
【００９８】
【表２３】
表１７：上記２種の処方物に関する、器官分布パラメータ

*: 符号(-)は、組織内でのアムホテリシンBの蓄積を示す。
【００９９】
公知のアムホテリシンB注射液と比較して、アムホテリシンBエマルションは、腎臓以外の全ての器官において高いレベルを示す(図10a〜10d参照)。エマルションのより高い半減期の値およびより低い排除速度は、更にこのデータを支持している。従って、エマルションから該器官へのアムホテリシンBの取り込みは、公知のアムホテリシンB注射液に関する値よりも高いことが分かっており、脾臓の場合には統計的に有意である(P<0.05)。
腎毒性が、アムホテリシンB療法に関連する主な欠点であり、またこれは腎臓におけるアムホテリシンBの高い濃度によるものである。AUC_(0-t)から、エマルションが、公知のアムホテリシンB注射液よりもかなり低いアムホテリシンB濃度を達成することは全く明らかである(P<0.05)。また、エマルションは、腎臓からより迅速に排除されるが、これは、該公知のアムホテリシンB注射液処方物に比して、低い毒性およびより高いLD₅₀値を説明している。
【０１００】
血漿濃度の減少にも拘らず、肝臓および脾臓における濃度は、増大し続けた。同様な観測は、リポソームについても報告されており、このことは、リポソームを含まない薬物とは違って、細網内皮組織中のリポソームが、血漿との自由な平衡状態にはないことを示している(Feilding, RM.等, 1998)。恐らくこのことは、公知のアムホテリシンB注射液に比して、エマルションの場合における、細網内皮組織中のリポソームの高い残留性を説明している。
X-B) マウスにおける、反復投与による器官分布研究
物質および方法
テスト系：体重20-22 g の雌スイスアルビノマウスを、Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL) のアニマルハウスから入手し、この研究のために使用した。これら動物には、適宜標準的な食事およびAquaguard^TM水を与えた。
【０１０１】
テスト物質：実施例Iの方法並びに処方で調製したアムホテリシンBエマルション (5 mg/ml)を、ボルス用量として、静脈内投与した。
比較物質：公知のアムホテリシンB注射液(5 mg/ml)を、ボルス用量として、静脈内投与した。
研究計画：これら動物を、24匹づつの2群、即ち群1および群2に分けた。群1には、用量1 mg/kg で公知のアムホテリシンB注射液を与え、また群2には用量5 mg/kg でアムホテリシンBエマルションを与えた。12匹には、7日間に渡り投与を行い、残りの12匹には、14日間に渡り投与を行った。肝臓、肺、腎臓および脾臓を、最後の投与から6時間後に切り取った。これら器官を即座に凍結して、あらゆる酵素反応を停止させた。これら器官を秤量し、該器官重量の3倍量の水を添加した。次いで、これを均質化した。
投与経路：静脈内
【０１０２】
【表２４】
表１８：マウス内での、１回投与による器官分布研究のために検討した、公知のアムホテリシンB注射液およびアムホテリシンBエマルションの用量

【０１０３】
アムホテリシンB含有率の分析：血漿中のアムホテリシンB含有率は、C-18カラムを用いたHPLC法により分析した。血漿中のアムホテリシンBは、血漿対メタノールの比率1：3にて、HPLCグレードのメタノールを用いて抽出した。次いで、これらサンプルを、3000 rpmにて遠心分離処理し、得られた上澄を、該カラムに注入した。
統計的分析：得られたこれらデータは、スチューデントt-テストによって、処置群同士を比較するために分析した。
結果および議論
【０１０４】
【表２５】
表１９：上記2種の処方物に関する、器官分布パラメータ

【０１０５】
7日目の投与と14日目の投与との間で、組織濃度が実質的に増加しなかったという観測は、興味深いものであった(図11aおよび11b参照)。このことは文献 (Olsen, SJ.等, 1991)と一致している。これとは対照的に、アムホテリシンBの組織濃度が高いにも拘らず、該アムホテリシンBエマルション処置群には、死亡した動物は見られなかった。公知のアムホテリシンB注射液処置群は、この研究中に死亡率を示した。
腎毒性において観測された大きな差にも拘らず、公知のアムホテリシンB注射液および該エマルション両者において、腎臓におけるアムホテリシンB濃度が同一であることを理解することができる。これに関する可能な理由は、脂質との錯体としてあるいは遊離薬物として存在するか否かとは無関係に、該アムホテリシンBが、これら器官内で見積もられたものである、ということであり得る。公知のアムホテリシンB注射液の場合、アムホテリシンBは、支配的に遊離形状で存在し、そのために腎毒性を示す。しかし、該脂質を主成分とするエマルションの場合には、恐らくアムホテリシンBは、脂質との錯体として存在し、組織に対してその毒性を示さない。
【０１０６】
両親媒性薬物であるアムホテリシンBは、可溶性のモノマーまたは自己会合性オリゴマーとして存在し、また臨界ミセル濃度以上では、ミセルを形成する。水性媒体中のアムホテリシンBの種々の種間の平衡を変える任意の因子は、その全体としての活性および毒性を変えることができる。Tabosa Do Egito, (1996)は、該アムホテリシンBエマルションが、モノマー形状のアムホテリシンBの貯槽として機能するものと考えている。この高度に安定な処方物は、限られた量のみのアムホテリシンBモノマーを、定常的に放出する。この形状は、恐らく真菌細胞のエルゴステロールのみと結合でき、また哺乳動物細胞のコレステロールとの低い相互作用を有する(Tabosa Egito等, 1996)。このエマルションは、公知のアムホテリシンB注射液と同程度の濃度を示すが、高い毒性を示すことはない。
結論：アムホテリシンBエマルションは、以下のような目的で処方された。
1. 安全性のプロフィールを改善する。
2. 製造コストを改善する。
【０１０７】
これら毒性の研究は、このエマルションの安全性の限界が、実際に公知のアムホテリシンB注射液を越えて改善されることを明らかにした。これは、該エマルションがターゲット真菌細胞に対してとる形状に起因するものであり得る。公知のアムホテリシンB注射液は、極めて多量のアムホテリシンBを放出し、かくして放出されたそのモノマーは、会合して、オリゴマーを形成し、該オリゴマーは哺乳動物細胞とも結合し、重篤な毒性を発現する。逆に、本発明のエマルションは、RESによる迅速な食作用のために、血漿中でこのような高い濃度を達成できず、また緩慢な段階的なモノマーの放出を示す。このことは、このエマルションの真菌細胞に対する選択的作用および結果としての低い毒性を説明している(Tabosa Do Egito. ES等, 1996)。この低い血漿濃度およびこれら器官へのアムホテリシンBエマルションの迅速な分布は、またその目標を定める能力に関して、公知のアムホテリシンB注射液よりも有利である。更に、アムホテリシンBエマルションは、脂質錯体およびリポソーム製剤等の、他の脂質を主成分とする処方物と比較して、コスト的に有利な製品である。
【０１０８】
このように、本発明のアムホテリシンBエマルションは、真菌感染のターゲット療法にとって、有望な候補である。
実施例XI
実施例IV、VおよびVIで調製したアムホテリシンBエマルションを、マウスにおけるインビボ毒性研究に供した。
マウスにおける1回投与での毒性研究
物質および方法
テスト系：体重20-22 g の雌スイスアルビノマウスを、Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL) のアニマルハウスから入手し、この研究のために使用した。これら動物には、適宜標準的な食事およびAquaguard^TM水を与えた。
【０１０９】
テスト物質：実施例IV、VおよびVIで調製したアムホテリシンBエマルション (5 mg/ml)を、ボルス用量として、静脈内投与した。
比較物質：実施例Iの方法並びに処方で調製したアムホテリシンBエマルション (5 mg/ml)を、ボルス用量として、静脈内投与した。
全ての群に対して、静脈内経路で注射した。全ての動物を、臨床的な毒性に関するあらゆる徴候および72時間という期間内の致死率について観測を行った。全ての用量に対して、％致死率を算出した。
観察：実施例IV、VおよびVIで調製したサンプルが与えられた群は、心臓毒性の症状、例えば重篤な呼吸困難、局部的な刺激、腹部窮迫および興奮を引き起こした。しかし、これら有害な症状は、実施例Iの方法並びに処方で調製したサンプルが与えられた群では観測されなかった。
【０１１０】
本発明の利点：
本発明の方法により、非-経口投与用の水中油型の構造化エマルションとして、アムホテリシンBを処方することによって、その毒性を大幅に低下させ、かつその抗真菌活性を変えることなしに、無菌性を保証した。
本発明の方法により調製した該エマルションの油相中に配合されたアムホテリシンBは、滅菌のためのオートクレーブ処理工程を含む全製造工程中およびその後の保存中および使用中ずっと安定性を維持する。
本発明の方法により調製した水中油型の構造化エマルションとしての、油-被覆アムホテリシンB含有非-経口型の組成物における、平均の油滴の径は、最適範囲に制御されており、従って好ましくは細網内皮系内に分布し、低血漿濃度をもたらす。

Claims

構造化エマルション形状にある、油被覆アムホテリシンＢの非経口組成物であって、マウス内で少なくとも400 mg/kgなるLD₅₀を有し、
a) 植物油からなる油相(該組成物の30％w/vまで)、
b) 該油相中に分散されたアムホテリシンＢ(該組成物の0.05〜1％w/v)、
c) 水相の水、
d) 該水相に溶解された、グリセリン、マンニトール、及びデキストロースからなる群より選択される張度改良剤、および
e) 該水相に分散された乳化剤(該組成物の3%w/vまで)、
を含むことを特徴とする、上記非経口組成物。
該油相が、該組成物の10〜20％w/vである、請求項1記載の構造化エマルション形状にある、油被覆アムホテリシンＢの非経口組成物。
該使用する植物油が大豆油である、請求項1〜2の何れか1項に記載の、構造化エマルション形状にある、油被覆アムホテリシンＢの非経口組成物。
該大豆油の含有量が、該組成物の20％w/vである、請求項3記載の構造化エマルション形状にある、油被覆アムホテリシンＢの非経口組成物。
該アムホテリシンＢの含有率が、該組成物の0.5％w/vである、請求項1〜4の何れか1項に記載の、構造化エマルション形状にある、油被覆アムホテリシンＢの非経口組成物。
該使用する天然ホスファチドが、精製エッグホスファチドである、請求項1〜5の何れか1項に記載の、構造化エマルション形状にある、油被覆アムホテリシンＢの非経口組成物。
該精製エッグホスファチドの含有率が、該組成物の1.2％w/vである、請求項6記載の構造化エマルション形状にある、油被覆アムホテリシンＢの非経口組成物。
該使用する張度改良剤がグリセリンである、請求項1〜7の何れか1項に記載の、構造化エマルション形状にある、油被覆アムホテリシンＢの非経口組成物。
該グリセリンの含有率が、該組成物の2.25％w/vである、請求項8記載の構造化エマルション形状にある、油被覆アムホテリシンＢの非経口組成物。
該エマルションが、アムホテリシンＢ(該組成物の0.5％w/v)を含み、該油相が大豆油(該組成物の20％w/v)であり、該乳化剤が精製エッグホスファチド(該組成物の1.2％w/v)であり、該張度改良剤がグリセリン(該組成物の2.25％w/v)であり、かつ水(該組成物を100容量%とするために必要な量)を含む、請求項1〜9の何れか1項に記載の、構造化エマルション形状にある、油被覆アムホテリシンＢの非経口組成物。
請求項1〜10の何れか1項に記載の、マウス内で少なくとも400 mg/kgなるLD₅₀を有する、構造化エマルション形状にある、油被覆アムホテリシンＢを含有する非経口組成物の製法であって、
i) アムホテリシンＢを油相中に分散させ、
ii) 水相である水中に、グリセリン、マンニトール、及びデキストロースからなる群より選択される張度改良剤を溶解し、
iii) 該乳化剤を該水相中に分散させ、
iv) 該水相のpHを8〜11に調節し、
v) 撹拌しつつ、該油相を該水相に添加して、粗構造化エマルションを生成し、
vi) 粒径2μm以下まで、該粗構造化エマルションを均質化し、
vii) 濾過し、該均質化した構造化エマルションを、窒素雰囲気下でガラス容器内に充填し、閉じた該ガラス容器を密封し、オートクレーブ処理によって、該充填し密封した容器を滅菌する、諸工程を含むことを特徴とする、上記方法。
該油相、該水相またはこれら両者が、該乳化工程中、75℃までの温度に維持される、請求項11記載の構造化エマルション形状にある、油被覆アムホテリシンＢを含有する非経口組成物の製法。
水酸化ナトリウムの水溶液を添加して、乳化剤エッグホスファチドを含有する該水相のpHを、8〜11に調節する、請求項11〜12の何れか1項に記載の、構造化エマルション形状にある、油被覆アムホテリシンＢを含有する非経口組成物の製法。
アムホテリシンＢを大豆油中に分散させ、グリセリンを水中に添加し、次いで該精製エッグホスファチドを該水相に分散させることによって、水相を生成し、該水相のpHを10.8に調節し、分散されたアムホテリシンＢを含有する該大豆油を、撹拌下に、分散されたエッグホスファチドを含む該水相に添加して、粗構造化エマルションを生成し、粒径2μm以下にまで該粗構造化エマルションを均質化し、2μmのフィルターを用いて濾過し、該均質化された構造化エマルションを窒素雰囲気下でガラス容器内に充填し、このガラス容器を閉じ、該閉じたガラス容器を密封し、かつ該充填し密封した容器を、オートクレーブによって滅菌する、請求項11〜13の何れか1項に記載の、構造化エマルション形状にある、油被覆アムホテリシンＢを含有する非経口組成物の製法。
請求項11〜14の何れか1項に記載の方法により製造した、請求項1〜10の何れか1項に記載の、マウス内で少なくとも400 mg/kgなるLD₅₀をもつ、構造化エマルション形状にある、油被覆アムホテリシンＢを含有する非経口組成物。