KR20030039331A - 구조화된 암포테리신 ｂ 유제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 마우스에서 적어도 400 mg/kg의 LD50을 갖는, 구조화된 유제 형태내에 포함된 오일-코팅-암포테리신 B의 비경구 투여용 조성물 및 이 조성물을 제조하는 방법에 관한것이다. 본 발명에 따른 제조방법은 암포테리신 B를 오일 부형제에 분산시키고, 유화제는 수용액층에 분산시키는 단계를 필수적으로 수반한다. 본 발명에 따른 제조방법은 간단하고, 경제적이며, 비경구 투여에 적합한 안정한 결과물을 제공한다. 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 암포테리신 B 유제 조성물은, 암포테리신 B 및 소듐 데옥시콜레이트를 포함하는 일반적인 암포테리신 B 조성물에 비하여, 실질적으로 유사하거나 증가된 효능 및 감소된 약제 독성으로 인간 및 동물의 진균류 감염을 치료하기 위하여 투여할 수 있다.
Description
암포테리신 B는 스트랩토마이세테스 노도서스(Streptomycetes nodosus) 에 의해 발현되는 거대고리, 폴리엔 항생제이다. 이 항생제는 곰팡이, 효모 및 일부 원충류에 대하여 광범위하게 효과적이다.
정맥내 투여를 위한 암포테리신 B는 최초에 통상적인 콜로이드 형태로 사용할 수 있었다. 이 항생제의 신뢰할만한 치료효과 때문에, 개발이후 35년이 지난 현재에 있어서도 중요한 항진균제로 널리 사용하고있다. 이 암포테리신 B의 임상 적용에서 보고된 부작용의 수를 고려할 때, 이 항생제의 관용성은 낮은 것으로 나타났다. 통상적인 암포테리신 B를 정맥내로 투여받은 모든 환자에서 신장독성이 나타났다. 다른 부작용으로는 고혈압, 저혈압, 심실세동(ventricular fibrillation)을 포함한 심장 부정맥, 심박정지(cardiac arrest), 간질환 등을 포함한다. 신장 세뇨관 및 사구체 손상이 발생하며, 영구적인 신장 손상의 위험이있다. 암포테리신 B 용액은 암포테리신 B를 용액화 시킬 때 사용하는 합성 계면활성제인 소듐 데옥시콜레이트로 인해 정맥내피에 자극을 일으키고, 고통을 야기할 수 있으며, 주사 부위에 정맥염(thrombophlebitis)을 유발할 수 있다.
독성 효과를 감소시키기 위해서, 암포테리신 B를 지질 복합체, 리포좀 및 유제와 같은 다른 약물전달시스템으로 제형화시켜 왔다. 이런 조성물들은 암포테리신 B 단독으로 사용된 약제와 비교하여 낮은 독성을 가지면서도 현저히 증가된 효과를 나타낸다. 지질 복합체 및 리포좀 제형의 암포테리신 B는 현재 상품화되어 있으며 세계 여러 국가에서 승인하고 있다.
지질 복합체 및 리포좀에 근거한 지질 제형의 중요한 단점은 치료에 소요되는 높은 비용이다. 암포테리신 B는 스테롤에 결합하고 지질 이중층에 삽입되는 지질친화성 약제이기 때문에, 암포테리신 B는 특히 지질-기반 전달시스템의 사용이 적절하다.
본 연구소에 의해 추진된 하나의 시도는 암포테리신 B를 낮은 치료 경비로, 낮은 독성의 장점을 갖는 지질 기반 유제의 형태로 제형화하려는 것이었다.
Volker Heinemann 등은 지질 유제가 올리고머 형태의 암포테리신 B의 양을 감소시키고, 따라서 인간 세포막에 존재하는 콜레스테롤과 암포테리신의 결합을 감소시킬 수 있다고 제안했다 (Antimicrobial agents and chemotherapy1997,41(4); 728-732).
Kirsh R, Goldstein R, Tarloff J 등은 지방 유제와 함께 혼합한 암포테리신 B의 지질 유제 조성물은 항진균성 효과의 손실없이 낮은 독성을 갖을 수 있음을 개시했다 (J. Infect. Dis. 1998,158; 1065-1070). 하지만, 암포테리신 B를 포함하는 이런 지질 유제의 물리적 안정성이 나쁜것으로 알려져 왔다.
Moreau P 등은 암포테리신 B와 혼합된 지방 유제를 투여한 환자들에서 주입에 관련된 독성 및 신장 기능부전의 현저한 감소를 개시했다 (J. Antimicro. Chemother. 1992,30; 535-541).
비경구 영양제의 지방 유제와 혼합된 암포테리신 B의 사용은 유럽 및 미국에서 증가 추세에 있다.
암포테리신 B 유제를 제조하는 방범의 종래기술은 하기에서 기술한다:
미합중국특허 제 5,364,632 호(1994년)/일본특허공고 JP 2290809 호(1990년)
이 발명에 따른 유제의 제조방법은 하기에서 전형적인 실시예로서 기술한다:
암포테리신 B를 중탕 음파처리(bath sonication; 15분)에 의해 메탄올(0.8 mg/ml)에 용해하였다. 인지질 E-80 (주요 성분으로 80%의 포스파티딜콜린 및 8%의 포스파티딜 에탄올아민을 포함)은 클로로포름에 용해하였다. 상기 두 용액을 혼합하고, 파이로젠 및 응집물을 제거하기 위해 유리섬유 사전여과기 및 0.45 μ재형성 셀룰로오즈 막 여과기(RC 5)(GF92)를 포함하는 복합 여과 시스템에 의해 여과하였다. 여과된 순수 지질용액을 40℃에서 감압 회전 증발기를 사용하여 둥근바닥 플라스크의 내면에 박막형태로 침착시켰다. 폴옥사머, 소듐 데옥시콜레이트 및 글리세린을 포함하는 수용액층을 0.22 μMillipore 여과기를 통해 여과하였고, 상기 플라스크에 첨가하였으며, 균질한 지질성 혼합물이 형성될 때까지 상기 분산물을 음파처리하였다.
0.22 μMillipore 여과기를 통해 여과 하였으며, α-토코페롤을 포함하는 MCT(Medium chain triglyceide) 오일을 70℃로 가열한 후, 45℃로 가열된 상기 지질성 혼합물에 첨가하고 자기 교반기를 이용해서 분산시켰다.
유화는 Polytron의 고장력 혼합기를 사용하여 균일한 온도에서 수행하였다. 조악한 유제의 이 결과물을 급속하게 냉각하였다. 2단계 균질기를 이용하여 미세한 단일분산 유제를 형성시켰다.
최종적으로, 유제의 pH를 적정하고 0.45 μMillipore 여과기를 이용하여 유화 및 균질화 과정에서 생성된 조악한 소적 및 찌거기를 제거하였다.
모든 제조 공정은 무균 조건하에서 수행하였다.
실시예의 최종 유제에 포함된 다양한 첨가물의 상대적인 양 및 상세한 설명에서 명시된 범위는 다음과 같다:
암포테리신 B 0.075%(0.015-0.15%), MCT 오일 20%(3-50%), 인지질 E80 0.5%(0.5-20%), 폴옥사머 2%(0.3-10%), 소듐 데옥시콜레이트 1%(0.5-5%), 글리세린 2.25%, α-토코페롤 0.02% 및 2차 증류수 200%.
미합중국특허 제 5,364,632 호(1994년)/일본특허공고 JP 2290809 호(1990년)에 따른 제조방법의 단점:
i. 메탄올에 대한 암포테리신 B의 용해도가 낮기 때문에, 필요한 양의 암포테리신 B를 용해하기 위해서는 많은 양의 메탈올이 요구된다. 이 문제점은 상기 최종 조성물에 포함될 수 있는 암포테리신 B의 양을 제한한다.
ii. 이 발명에 따른 제조방법에 있어서, 암포테리신 B의 박막, 암포테리신 B 및 인지질을 우선 형성시켜야 하고, 이후에 이 박막을 수용액층을 이용하여 수화시켜야한다. 이 수용액층은 비이온계 유화제인 폴옥사머, 계면활성제인 소듐 데옥시콜레이트 및 글리세린을 포함한다.
iii. 사용된 오일층은 첨가된 α-토코페롤을 포함하는 MCT 오일이다. 상기 유제는 70℃로 유지된 상기 오일층을 45℃로 유지된 수용액층에 첨가하여 형성하였다. 만약, 암포테리신 B가 상기 오일층에 존재하면, 이 제조방법은 암포테리신 B의 독성을 완전히 감소시키지 못한다.
iv.미합중국특허 제 5,364,632 호(1994년)에 따른 제조방법의 결과물은 무균처리를 위하여 무균조건에서 수행한다. 약전에 기재된 멸균과정의 바람직한 과정은 상기 최종 용기에 포함된 상기 최종 결과물을 가압멸균하는 것이다. 하지만, 암포테리신 B를 일반적인 정맥내 주입 경로를 통해 투여할 경우에는 최종 멸균은 멸균성이 높은 바람직한 다른 방법을 통해서만 수행되어야 한다.
v. 이 제조방법에 따른 유제 결과물은 비록 물리적으로 안정하지만, 독성에 대해서는 시험되어지지 않았다. 따라서, 이 결과물에 대한 독성은 확인되지 않은 상태이다. 단지, Balb/c 마우스에서in vivo비교 시험은 소듐 데옥시콜레이트를 포함하여 시판되고 있는 암포테리신 B 제형인 Fungizone과 함께 수행되었다. 이 시험 결과를 통해 이 제조방법에 따른 상기 결과물이 낮은 독성을 갖는다는 것을 개시하였다.
vi. MCT 오일 및 폴옥사머의 이런 사용은 망상내피계(reticulo endothelial system; RES)에 의한 약물의 흡수를 감소시켜 혈장내에 존재하는 약물의 농도를 증가시킨다. 하지만, 진균 감염에 있어서, 암포테리신 B는 진균의 감염부위인 망상내피계에 분포해야한다.
일본특허 11-60491 (1989년)
이 일본특허를 통해서, 유제 형태내에 암포테리신 B를 포함하는 의약적 조성물이 개시되었다. 이 유제는 다음을 포함한다:
i)암포테리신 B(1-10 mg/ml의 최종 유제).
ii)오일층 -오일층은 식물성 오일, 어류 오일 또는 트리글리세라이드로 구성된다(1-50%, 바람직하게는 5-30%). 사용할 수 있는 바람직한 오일은 대두유 또는 참깨유이다.
iii)유화제 -사용된 유화제는 인지질이다. 추가적으로 비독성 유화제를 또한 사용할 수 있다. 사용된 인지질은 예로 난황 인지질, 대두 인지질 또는 이 인지질들에서 수득된 가수 결과물이다. 포스파티딜콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 세린, 포스파트산, 포스파티딜 글리세롤 등도 또한 사용하였다. 권장된 양은 1-50 중량%의 오일성분, 바람직하게는 10-30 중량%의 오일성분 또는 1-10 % w/v, 바람직하게는 4-6% w/v의 유제이다.
비이온계 유화제로는예로, 폴리알킬렌 글리콜(분자량 1000-10000, 바람직하게는 4000-6000); 또는 폴리옥시에틸렌 또는 폴리옥시 프로필렌 중합체(분자량 100-20000, 바람직하게는 2000-10000), 가수 캐스터유 폴리옥시알킬렌 유도체 예로 가수 캐스터유 폴리옥시에틸렌-20-에테르, -40-에테르, -100-에테르 등을 5%w/v 이하, 바람직하게는 1%w/v 이하로 사용한다. 또한, 이 두가지 비온계 유화제의 복합물을 사용할 수도 있다.
iv)지방산 및 이것의 염(약제학적으로 허용 가능한 것) - 1%, 바람직하게는 0.5%w/v 까지 사용할 수 있다.
v)안정화제로는 다음의 것들을 5%w/v 이하, 바람직하게는 1%w/v 이하로 사용할 수 있다:
a) 인간 알부민과 같은 고분자량 중합체 물질; 비닐 공중합체 예로, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올; 지방족 아민.
b) 젤라틴, 히드록시 에틸 전분; 콜레스테롤 유도체.
vi)등장성 제제- 5%w/v, 바람직하게는 1%w/v이하로 사용할 수 있다.
vii)글리세린또는 이것의 모노에스테르 예로, 모노 올레인, 모노 팔미틴을 사용할 수 있다.
viii)당류로는 예로, 단당류 및 이당류, 소비톨, 자일리톨을 5%w/v, 바람직하게는 1%w/v 이하로 사용할 수 있다.
ix)항산화제로는 예로, 토코페롤을 5%w/v, 바람직하게는 1%w/v 이하로 사용할 수 있다.
x)pH 조절제로는 예로, 산, 염기 및 완충용액을 사용할 수 있다.
하기의 제조공정은 종래에 개시된 것이다. 이 공정은 우선 유중수(w/o) 유제를 형성한 후에, 물로 희석하여 수중유(o/w) 유제로 전환하는 단계를 포함한다. 이 공정에서, 대두유, 인지질, 암포테리신 B 및 일부 물 뿐만아니라 다른 첨가제(사용하는 경우에는)를 전부 함께 혼합하고, 필요시에는 가열한다. 이 혼합물을 고압 균질기로 균질화시킨다. w/o 유제를 o/w 유제로 전환시키는데 필요한 추가적인 물을 첨가하고 다시 균질화 시켰다.
전형적인 실시예에서, 200 g의 대두유, 50 g의 인지질 및 2.5 g의 암포테리신 B 및 750 ml의 물을 상기와 같은 방법으로 제조하였다.
다른 실시예에서, 2.2%w/v의 글리세린 조성물을 상기 조성물에 첨가시켰다.
유제에 포함된 소적 평균 크기는 0.1-0.2 μ이다. 이 유제 및 소적 크기는 냉장조건에서 10일 동안 안정하다.
일본특허 11-60491 (1989년)에 따른 제조방법의 단점은 다음과 같다:
유제 제형에 포함된 암포테리신 B는 일반적인 암포테리신 B 제형에 비해 독성이 낮은것으로 알려졌다. 하지만, 이일본특허 11-60491 (1989년)에 따른 제형은 이 특허에 수반되는 유제 제조공정 때문에 독성을 완전히 제거하지 못했다.
i.일본특허 11-60491 (1989년)에서 수득된 유제의 평균 입자 크기는 0.1-0.2 μ이기 때문에, 망상내피계에 의한 크기가 더 큰 입자의 우선적 흡수라는 공지된 장점을 수득할 수가 없다. 망상내피계에 의한 암포테리신 B의 우선적 흡수는 망상내피계가 대부분의 진균류 감염 부위이기 때문에 필요한 조건이다.
ii. 이 유제의 안정성은 냉장하에서 10일 동안 시험되어졌다.
iii. 지방족 아민, 고분자량 중합체, 비이온계 표면 활성제, 콜레스테롤 유도체, 단당류 및 이당류와 같은 당류, 항산화제와 같은 유화 보조제와 같은 다수의 첨가제를 유제 제형물에 첨가할 수 있다.
iv. 이 결과물을 멸균하는 제조 단계는 특정하게 언급하지 않았다.
일본특허 4-173736 (1992년)에서는, 0.005%-5% 암포테리신 B, 0.5%-25%의 인지질, 바람직하게는 난 레시틴을 포함하는 결과물을 개시하고 있다. 이 조성물은 평균 입자크기로 100 nm의 직경을 갖는다. 이 조성물은 유제 형태가 아니며, 어떤 오일층도 포함하지 않는다.
미합중국특허 제 5,389,373 호(1995년)에서는, 수용성이 낮은 약제의 수중유(o/w)를 제조하는 방법을 개시하고있다. 이 제조방법은 암포테리신 B를 높거나 낮은 pH의 수용액에 용해하고, 100 μg/ml 이하의 농도로 미리 형성시킨 유제에 첨가하며, 상기 유제를 중화시키기위해 적정한 양의 산, 염기 또는 완충용액를 첨가하고, 바람직한 정도로 pH를 적정하는 단계를 포함한다.
미합중국특허 제 5,389,373 호(1995년)에 따른 제조방법의 단점은 다음과 같다:
이 제조방법의 중요한 단점은 이 유제내에 포함되는 암포테리신 B의 농도가 낮다는 것이다. 이 제조방법에 있어서, 암포테리신 B의 농도는 100 μg/ml의 정도이다. 따라서, 많은 양의 이 조성물을 투여해야하기 때문에 치료학적으로 불리하다.
미합중국특허 제 5,534,502 (1996년)에서는, 암포테리신 B를 산 및 에탄올로 결정용해하고, 지질에 균질하게 분산시켜 유제화하는 방법이 개시되어있다. 이 제조방법에 있어서, 암포테리신 B를 에탄올에 용해시키는 것이 필수적이고, 가장 바람직한 에탄올의 양은 400-600 ml/gm 암포테리신 B이다. 이 제조방법의 중요한 단점은 암포테리신 B가 산에 안정하지 않다는 것이다.
유럽특허 EP 0700678 호 (1996년)에서는, 시트르산 또는 약제학적으로 허용 가능한 이것의 염, 및 메티오닌 및 페닐알라닌을 동시에 포함하지 않으면서 메티오닌, 페닐알라닌, 세린, 히스티딘 및 약제학적으로 허용 가능한 이들의 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 필수적으로 포함하는 지질 유제를 개시하고있다.
시트르산 및 상기 아미노산의 적어도 하나를 동시에 사용하는 것은 필수적 요구조건이다. 이 발명에 따른 유제의 제조방법은 다음에서 설명된다:
인지질 및 올레산과 같은 유화 보조제를 헥산과 같은 적절한 유기용매에 용해하고, 이 용매를 감압 증류하여 지질 필름을 형성하였다. 이 지질 필름에 오일 성분 및 물을 첨가하고, 이 혼합물을 강하게 교반하여 미리 유화시켰다. 이 액체를 당시 사용되는 유화제를 이용하여 유화하였다. 유화를 완료한 후에, 최종 유제를 염산 또는 수산화나트륨을 이용하여 원하는 pH로 적정하였다. 다음으로, 시트르산 및 아미노산을 이 유제에 첨가하여 지질 유제를 형성하였다. 선택적으로, 오일 성분, 및 시트르산 및 아미노산의 수용액을 상기 형성한 지질 필름에 첨가한 후에, 이 혼합물을 유화시켜 유사하게 상기 지질 유제를 제조할 수 있다.
유럽특허 EP 0700678 호 (1996년)에 따른 제조방법의 단점은 다음과 같다:
암포테리신 B 유제를 제조하는 방법을 구체적으로 개시하지 않았다. 암포테리신 B는 "지질 유제로 제형될 수 있는" 약 70 가지의 약제 목록 중의 하나일 뿐이다.
i) 지질 유제를 제조하는 이 제조방법은 헥산과 같은 적절한 유기 용매에 인지질을 용해시키는 단계를 포함한다.
ii) 이 특허의 실시예에서, 아미노산 및 시트르산을 사전에 형성된 지질 유제에 첨가하였고, 안정도로는 단지 60℃에서 변색정도를 시험하였다. 정맥내 투여용 유제는 가압 멸균의 온도에서도 안정하여야 한다.
iii) 실시예에 개시된 멸균 공정은 1 시간 동안 60℃로 가열하고, 이 멸균 공정을 매 24 시간마다 3회 반복하는 것이다. 결과적으로, 이 제조방법은 정맥내 주사용제를 제조하는 것에는 적절하지 않다.
본 발명이 추구하는 주요 목적은 매우 낮은 독성을 갖으면서, 상기 열거된 종래기술의 단점을 극복한 비경구 투여에 유용한 암포테리신 B 유제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명이 추구하는 주요 목적의 핵심적인 부분은 (a)암포테리신 B 고체 분말을 오일로 코팅하는 단계, 및 (b)상기 오일 코팅 고체 암포테리신 B 분말을 수중유 유제의 오일층에 위치하게 하여, 가압 멸균 공정을 포함한 전체 제조공정부터, 유통기한 또는 사용시까지 암포테리신 B가 유제의 오일층에 존재하도록 하는 단계를 포함하는 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 추구하는 주요 목적의 다른 부분은, 망상내피계에 바람직하게 분포하여 결과적으로 낮은 혈장 농도를 유지할 수 있도록, 최적 범위로 조절된 유제내에서 평균 오일 소적을 가진 구조화된 수중유 유제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 따라서, 주사용 목적으로는 오일 코팅된 암포테리신 B를 포함하는 오일구를 갖는 수용성 외층 유제로서 작용한다.
본 발명이 추구하는 주요 목적의 또 다른 부분은, 수중유 유제를 제조하는데 필수적인 최소의 첨가제만을 수반하는 구조화된 암포테리신 B 유제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 마우스에서 적어도 400 mg/kg의 LD50을 갖으면서, 다음의 a)-e)를 포함하는 구조화된 유제 형태에서 오일-코팅-암포테리신 B 의 비경구용 조성물에 관한 것이다:
a) 대두유, 참깨유 및 홍화유와 같은 식물유의 그룹으로부터 선택된 오일층(조성물의 30%w/v까지);
b) 오일 층에 분산된 암포테리신 B (조성물의 0.05% - 1%w/v);
c) 수용성층인 물;
d) 수용액층에 용해된 글리세린, 만니톨, 덱스트로오즈와 같은 화합물의 그룹으로부터 선택된 장도 변형제; 및
e) 수용액층에 분산된 천연 포스파티드(조성물의 3%w/v까지)와 같은 유화제.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 마우스에서 적어도 400 mg/kg의 LD50을 갖으면서, 구조화된 유제 형태에서 오일-코팅-암포테리신 B 의 비경구용 조성물을 제조하는 제조방법에 있어서, 오일층에 암포테리신 B를 분산하는 단계; 물에 장도 변형제를 용해하여 수용액층을 준비하는 단계; 상기 수용액층에 유화제를 분산시키는단계; 수용액층의 pH를 약 8-11로 적정하는 단계; 상기 오일층을 교반하에서 수용액층에 첨가하여 조악하게 구조화된 유제를 형성하는 단계; 상기 조악한 유제를 입자크기 2 미크론 이하로 균질화시키는 단계; 여과하고, 질소 충진하에서 상기 균질화하여 구조화된 유제를 유리 용기에 포장하며, 유리 용기를 막고, 상기 유리 용기를 밀봉하며, 상기 밀봉된 용기를 가압 멸균하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 상기 제조방법에 있어서, 각 단계의 순서가 중요하다. 이 제조방법의 단계를 바꾸면, 유제의 구조가 변한다는 것이 독성 시험을 통해 나타났다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 난 포스파티드는 수용액층에 분산되는 반면에 암포테리신 B 분말은 오일층에 분산되는 특징을 보이며, 따라서 본 발명에 따른 결과물을 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B라 명명한다.
바람직한 다른 구현예에서, 본 발명은 상기 기술된 제조방법에 의해 제조된 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B의 비경구용 조성물에 관한것이다.
본 발명에 따른 제조방법에 의해 암포테리신 B를 수중유 형태의 구조화된 유제 형태로 제형화함으로써, 암포테리신 B의 항진균 효과를 저해하지 않으면서도 상기 조성물의 무균상태를 유지하고, 독성을 현저히 감소시킬 수 있다. 감소된 독성을 갖는 본 발명에 따른 상기 조성물은 특정 감염의 치료에 있어서, 투여량을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B의 비경구용 조성물은 독성이 낮고 다음의 a)-e)의 특성을 포함한다:
a) 마우스에서 단일 투여 독성시험에 있어서 적어도 400 mg/kg체중의 LD50을 갖고, 반복 투여 독성시험에 있어서는 적어도 40 mg/kg체중의 LD50을 갖는다;
b) 쥐에서 단일 투여 독성시험에 있어서 적어도 150 mg/kg체중의 LD50을 갖는다;
c) 소듐 데옥시콜레이트를 포함하는 일반적인 제형에 비교하여, 인간 적혈구에 대한 용혈이 적어도 20배 감소된 효과를 갖는다;
d) 망상내피계에서 바람직한 조직 분포를 갖으며, 마우스에서 단일 투여 시험을 수행했을 때, 소듐 데옥시콜레이트를 포함하는 일반적인 제형에 비교하여 망상내피계의 기관에서 적어도 두배의 t1/2를 갖는다;
e) 마우스에 주입했을 때, 심한 호흡 곤란, 국부 자극, 복부 고통 및 불안과 같은 심장독성의 증상을 보이지 않는다.
본 발명은 저독성 암포테리신 B 조성물에 관한것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 비경구 투여를 위한 구조화된 수중유 유제에 포함된 저독성 암포테리신 B에 관한것이다.
본 발명에 따른 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B의 비경구용 조성물에서의 암포테리신 B의 함량은 조성물의 0.05% - 1%w/v로 광범위하다. 바람직하게는 상기 함량은 0.1% - 0.5 %w/v이고, 특정하게는 약 0.5% 또는 약 0.25%w/v일 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 암포테리신 B는 유화전에 오일층에 분산되어 있다. 암포테리신 B를 그대로 사용할 수 있거나 오일층에 분산시키기 전에 미세화 시킬 수 있다. 오일층은 조성물의 30%w/v까지 광범위한 양으로 존재할 수 있으며, 바람직하게는 5 - 25%w/v, 보다 바람직하게는 10 - 20%w/v이며, 특정하게는 약 10%w/v 또는 약 20%w/v이다. 전형적으로 상기 사용된 오일층은 식물성 오일이고, 예로는 대두유, 참깨유, 목화씨유, 홍화유, 해바라기유, 땅콩유, 옥수수유, 캐스터유 또는 올리브유와 같은 식물성 오일 일 수 있다. 바람직한 식물성 오일은 대두유이다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 유화제는 수용액층에 용해한다. 적절한 유화제로는 천연 포스파티드 및 변형 포스파티드일 수 있다. 바람직한 유화제는 난 포스파티드 및 대두 포스파티드이다. 본 발명에 따른 유화제는 상기 언급된 유화제의 2 가지 또는 그 이상의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직한 천연 포스파티드는 정제된 난 포스파티드이다.
본 발명에 따른 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B의 비경구용 조성물은 pH 6.0 - 8.5의 범위로 제형한다. 본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 수용액층의 pH는 수산화나트륨 또는 수산화칼륨 수용액으로 8 - 11사이로 적정하여, 가압 멸균 후에도 6 - 8.5 범위를 유지할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B의 비경구용 조성물은 글리세린, 만니톨, 덱스트로오즈 또는 이들의 조합과 같은 장도 변형제를 첨가하여 혈액과 등장이 되도록 한다. 바람직한 장도 변형제는 글리세린이다. 글리세린은 조성물의 2 - 3%w/v의 양이 되도록 한다. 사용된 바람직한 글리세린의 양은 조성물의 약 2.25%w/v이다.
본 발명에 따른 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B의 비경구용 조성물은 구체적으로 멸균된 수중유 유제이고, 조절된 조건의 제조단계에 따라 제조되고 최종적으로 가압 멸균으로 멸균한다. 고온에서 유화를 수행하는 경우에는, 수용액층 또는 오일층, 또는 상기 두층은 75℃까지로 유지할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 평균 입자 크기는 암포테리신 B를 바람직하게 망상내피계에 분포시킴으로써 낮은 혈장 농도를 야기하기 위하여 의도적으로 2μ로 유지한다.
본 발명은 전형적인 실시예에 의해 설명되어지고, 전형적인 실시예의 구조화된 유제는 다음을 포함한다:
암포테리신 B (0.5%w/v); 오일층을 이루는 대두유 (20%w/v); 유화제로서 정제된 난포스파티드 (1.2%w/v); 장도 변형제로서 글리세린 (2.25%w/v); 및 물 (부피가 100% 되도록 충분한 양): 그리고,
다음의 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되어진다:
대두유에 암포테리신 B를 분산시키는 단계; 물에 글리세린을 첨가하여 수용액층을 준비하는 단계; 상기 수용액층에 정제된 난 포스파티드를 분산시키는 단계; 수용액층의 pH를 10.8로 적정하는 단계; 암포테리신 B를 포함하는 대두유를 교반하에서 상기 수용액층에 첨가하여 조악한 유제를 수득하는 단계; 이 조악한 유제를 입자 크기 2 미크론 이하가 되도록 균질화시키는 단계; 2 미크론 여과기로 여과하고, 유리 용기에 질소 충진하에 포장하며, 유리 용기를 막고, 상기 유리 용기를 밀봉하며, 상기 밀봉된 용기를 가압 멸균하는 단계.
본 발명에 따른 수중유형 유제내의 오일-코팅-암포테리신 B의 비경구용 조성물이 구조화된 유제는 감소된 독성을 갖고, 작은 입자 크기를 갖으며, 비경구용 사용에 적합하다. 본 발명에 따른 조성물의 멸균은 암포테리신 B의 현저한 활성 저하 및 유제의 불안정화 없이 가압 멸균할 수 있기 때문에 신뢰할만 하다. 본 발명에 따른 조성물은 5%의 덱스트로오즈 또는 식염수와 희석하여 비경구 투여에 적합한 농도로 만들 수 있기 때문에 사용이 용이하다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 연장된 유통기한을 갖기 때문에 완제품으로 판매하기에 적합하다.
본 발명자들은 제조방법에 있어서, 암포테리신 B 및 정제된 난 포스파티드를 변화시켜 유제의 독성을 시험하였다. 이 결과는 하기의 표에서 나타나는 실시예에서 보여진다.
| 실시예 | 암포테리신 B | 난 레시틴 | 독성 |
| I | 오일층에 존재 | 수용액층에 존재 | 심장 독성 증상 없음 |
| IV | 수용액층에 존재 | 수용액층에 존재 | 심장 독성 증상 보임 |
| V | 수용액층에 존재 | 오일층에 존재 | 심장 독성 증상 보임 |
| VI | 오일층에 존재 | 오일층에 존재 | 심장 독성 증상 보임 |
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 수용액층에 부유된 암포테리신 B를 마우스에 주사하는 경우에는 심한 호흡곤란, 국부적 자극, 복부 고통 및 불안과 같은 심장 독성의 증상을 나타낸다. 하지만, 이 독성 증상은 오일층에 분산된 암포테리신 B를 사용하는 경우에는 나타나지 않는다. 이런 현상은 유제의 오일 소적 및 Kuppfer cell에 의한 저장기 효과로 설명할 수 있다. 이런 느린 점진적 방출은 유제 제형의 주입 후에 혈장내에서 암포테리신 B를 모노머로 존재하게 하여 독성을 감소시킨다(Antimicrobial agents and chemotherapy, 1997; Vol41(4): 728-732).
또한, 유화제인 난 레시틴을 오일층에 첨가하여 제조된 상기 조성물도 심장 독성의 증상을 나타낸다. 다수의 실험을 통해, 난 레시틴을 수용액층에 첨가하여 이 문제를 해결했다. 상기의 시험 과정은 실시예 1 - 4에서 설명되어진다. 실시예 1의 변화된 실시예인 실시예 2 및 실시예 3은 본 발명에 따른 것이고, 실시예 4, 5 및 6은 본 발명의 바람직한 구현예에 따른 것이 아니다. 실시예 7은 인간 적혈구에 대한in vitro독성 시험을 나타낸다. 실시예 8 및 실시예 11은 마우스, 쥐 및 개에서의 독성 시험을 나타낸다. 실시예 9는 토끼에서 약동학적 시험을 나타내고, 실시예 10은 마우스에서 기관의 분포 시험을 나타낸다.
암포테리신 B는 오일에 분산되고 난 레시틴은 물에 분산되어 제조된 유제에서의 현저히 감소된 독성은 오일 소적 및 암포테리신 B의 강한 결합에 의해 설명할 수 있다. 따라서, 암포테리신 B 유제는 모노머 형태의 암포테리신 B의 저장기로 작용하며, 이런 제형의 높은 안정성 때문에 제한된 양의 자유 암포테리신 B만이 점진적으로 방출될 수 있다. 모노머 형태의 암포테리신 B는 진균세포의 에르고스테롤과는 결합하지만 숙주 포유동물 세포의 콜레스테롤과는 결합하지 않기 때문에, 결과적으로 감소된 독성을 나타낸다. 종래의 일반적인 암포테리신 B 제형인 경우에는, 많은 양의 자유 암포테리신 B가 혈장내로 방출되기 때문에 순환계에서 올리고머로 형성된 암포테리신 B가 존재하게 된다. 이런 올리고머는 숙주 세포막에 포함된 콜레스테롤과 결합하여, 결과적으로 증가된 독성을 나타낸다. 이런 사실은 본 발명에 따른 암포테리신 B 유제가 일반적인 제형에 비해 낮은 독성을 갖는 기작을 보여준다. 혈장에서 감소된 최고 농도 및 AUC 수치 (실시예 9), 및 조직에서 암포테리신 B의 빠른 누적 (실시예 9-A)는 본 발명에 따른 암포테리신 B 유제의 감소된 독성을 보여준다. 감소된 독성은 실시예 8-A, 8-B 및 8-C에서 재확인 되었다.
비록, 본 발명에 따른 결과물인 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B의 비경구용 조성물은일본특허 11-60491 (1989년)에서 개시된 것과 유사하지만, 본 발명에 따른 결과물은 제조공정의 차이에 의해 생물학적으로 감소된 독성을 나타낸다는 것에서 차별화된다.
본 발명에 따른 제조방법은 주입되었을 때, 혈장내로 암포테리신 B를 느리게 방출하기 때문에 모노머의 제형에 적합한 유제를 제공하는 반면에,일본특허 11-60491 (1989년)에 개시된 제조방법으로는 이런 효과를 수득할 수 없다. 따라서, 본 발명에 따른 유제 구조는 이 일본특허에 의해 수득된 것과는 차별화된다는 것은 독성 시험들을 통해 잘 나타나고 있다. 결과적으로, 본 발명자들은 본 발명에 따른 유제를 "구조화된 유제"로 명칭한다.
본 발명에 따른 주요 구현예에서, 암포테리신 B를 오일층에 분산하여 암포테리신 B 분말이 오일에 의해 코팅되도록 한다. 유화제로 사용된 난 레시틴은 수용액층에 분산시킨다.
본 발명에 따른 다른 구현예에서, 입자 크기가 2 μ이하가 될때까지 반복해서 균질화를 수행한다.
본 발명에 따른 또 다른 구현예에서, 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B의 최종 비경구용 조성물을 최종적으로 가압 멸균한다.
종래기술과의 차이점:
종래기술을 개시하고 있는 특허들과 차별되는 본 발명에 따른 제조방법의 차이점은 하기에서 기술되어진다.
a) 본 발명에 따른 제조방법은 다음의 관점에서미합중국특허 제 5,364,632 호(1994년)와는 차별된다:
암포테리신 B를 용해하기 위한 어떤 용매도 사용하지 않는다; 암포테리신 B 및 인지질의 필름을 제조하고 가수화시키지 않는다; 첨가된 α-토코페롤을 포함하는 MCT 오일을 사용하지 않는다; 난 포스파티드를 포함하는 수용액층의 pH를 8-11로 적정한다; 최종적인 멸균 단계를 갖는다 ; 및
본 발명에 따른 결과물은 망상내피계(RES)에서 감소된 독성 및 향상된 분포를 나타낸다.
상기 미합중국특허와 같이 많은 양의 용매를 사용하는 경우에는 상업적으로 제조하기에 부적합하다. 상기 미합중국특허의 다른 실시예에서는 입자 크기를 100 nm이하로 개시하고 있지만, 이 조성물의 독성에 대해서는 개시하지 않고 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 감소된 독성은 5 mg/ml에서도 유지되고, 이런 점은 주입에 필요한 부피가 적다는 점에서 치료학적으로 유리하다.
b) 본 발명에 따른 제조방법은일본특허 11-60491 (1989년)의 유제 구/입자 크기가 0.1-0.2 μ인 반면, 본 발명은 2μ라는 점에서 차별화된다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 난 포스파티드는 수용액층에 첨가하고 수용액층의 pH를 8-11로 적정한다.
본 발명에 따른 결과물의 유통기한은 2년 이상인 반면에 상기 일본특허의 결과물은 10일 또는 몇주 정도에 불과하다.
여러 종류의 유화 보조제가 상기 일본특허에 개시된 발명에 요구되는 반면에, 본 발명에 따른 유화 약제에서는 필요하지 않다.
상기 일본특허에 개시된 종래기술에서는 멸균처리 되지 않은 반면에, 본 발명에 따른 제조방법에서는 최종적으로 가압 멸균한다.
c)일본특허 4-173736 (1992년)에 개시된 제조방법에 따른 결과물은 직경 1 μm 이상의 입자를 포함하지 않으며, 오일 성분을 포함하지 않는다는 점에서 본 발명에 따른 조성물과는 차별화된다.
d)미합중국특허 제 5,389,373 호(1996년)에서는 암포테리신 B를 사전에 형성된 유제에 첨가하는 반면에, 본 발명에 따른 제조방법에서는 암포테리신 B를 오일층에 분산시킨다.
e)유럽특허 EP 0700678 (1996년)에서는 암포테리신 B 유제와 같은 것을 개시하지 않았다. 이 특허에서는 암포테리신 B는 "지질 유제로 제형할 수 있는" 70 가지 약제 중의 하나로 특정되어졌다.
상기 유럽특허에서 개시된 유제는 아미노산 및 시트르산 또는 이의 염을 필수적으로 포함하는 반면에, 본 발명에 따른 제조방법에서는 요구되어지지 않는다.
상기 유럽특허에 따른 유제 제조방법은 약제를 포함하거나 포함하지 않는 인지질 필름을 필수적으로 형성하여 시작된다. 이 단계는 본 발명에 따른 제조방법에서는 요구되어지지 않는다.
상기 유럽특허에 따른 유제 제조방법에서는 유화제를 첨가하는 다른 형태들을 개시하고 있는 반면에, 본 발명에 따른 제조방법은 유화제를 필수적으로 수용액층에 첨가해야 한다고 한정하고 있다.
유럽특허 EP 0700678 (1996년)에서 언급된 발명의 목적은 시트르산 및 아미노산을 이용하여 지질 유제의 변색의 문제점을 극복하는 것인 반면에, 본 발명에 따른 목적은 마우스에서 적어도 400 mg/kg의 LD50의 감소된 독성을 갖는 구조화된 수중유형유제내의 오일-코팅-암포테리신 B를 제공하는 것이다.
이하에서 본 발명을 구체적인 구현예로 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 본 발명의 실질적인 범위내에서 다양한 변형 및 개조가 가능하다는 것은 명백하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
이하 실시예에서 사용된 모든 재료들은 비경구 투여로 허용 가능한 재료이다. 사용된 장비들은 당업계의 통상적인 것들이다. 모든 제조공정들은 조절된 환경하에서 수행됐다. 각 배치를 수행하는 동안 질소가스로 충진하였다.
이하 실시예에서 사용된 암포테리신 B는 미합중국특허 명세서에서 특정된 Alpharma로 부터 구입한 비경구 투여용이다.
이하 실시예에서 사용된 정제된 난 포스파티드는 비경구 투여용이고 리포이드로 경화하였다.
소듐 데옥시콜레이트를 포함하고 상업적으로 시판되고 있는 암포테리신 B 주사제는 약동학적 시험, 조직 분포 시험 및 독성 시험 등에서 "일반적인 암포테리신 B 주사제 (Conventional Amphotericin B Injection)"로 표기한다.
실시예 1
오일층은 1 g의 암포테리신 B를 40 g의 대두유에 분산시켜 준비하였다.
수용액층은 4.5 g의 글리세린을 150 ml의 물에 첨가하고 2.4 g의 난 포스파티드를 분산시켜 준비하였다. 이 수용액층을 수산화나트륨 수용액으로 pH를 10.6으로 적정하였다.
상기 준비된 오일층을 고속 교반하에서 수용액층에 첨가하였다. 물을 첨가하여 전체 부피를 200 ml로 하였다. 형성된 유제를 고압 균질기에 통과시켰다. 균질화는 구/입자 크기가 2 μm 이하가 될때까지 반복하였다. 균질화 결과물은 각 균질화 단계 직후에 20℃로 냉각하였다.
상기 균질화된 유제를 2 μ여과기로 여과하고, 질소 충진하에서 용기에 주입하였으며, 밀봉하고 가압멸균으로 무균처리하였다.
상기 제조공정을 통해 수득된 결과물은 다음의 조성을 포함한다:
a) 암포테리신 B - 1.0 g
b) 대두유 - 40.0 g
c) 정제된 난 포스파티드 - 2.4 g
d) 글리세린 - 4.5 g
e) 수산화나트륨 - pH 적정에 충분한 양
f) 물 - 전체부피가 200 ml이 되는 양
수득된 상기 무균 결과물을 이용하여, 마우스, 쥐 및 개에서 독성 시험(실시예 8-A, 8-B, 8-C, 8-D), 약동학적 시험(실시예 9) 및 기관 분포 시험(실시예 10-A, 10-B) 등을 수행하였다. 안정화 시험은 상기 결과물을 2℃ - 8℃에서 바이얼내에 저장하여 수행하였고 그 결과는 하기의 표에 표시된다.
실시예 1에 의해 수득한 결과물의 안정도 결과
| 기간 | 형태 | 암포테리신 B의 함량 |
| 초기 | 균일한 황색 유제 | 104.6% |
| 6 개월 | 균일한 황색 유제 | 101.3% |
| 1 년 | 균일한 황색 유제 | 99.4% |
독성 시험은 본 발명의 제조방법에 따른 상기 유제는 상승적 효과를 갖는조성물임을 명백히 보여주고있다.
실시예 2
암포테리신 B 분말을 에어 젯 분쇄기(Air jet mill)로 입자 크기가 10 미크론 이하가 되도록 미세화하였다.
오일층은 1 g의 암포테리신 B(세분화된 것)를 40 g의 대두유에 분산시켜서 준비하였다.
수용액층은 4.5 g의 글리세린을 150 ml의 물에 첨가하고 2.4 g의 난 포스파티드를 분산시켜 준비하였다. 이 수용액층을 수산화나트륨 수용액으로 pH를 10.8으로 적정하였다.
상기 준비된 오일층을 고속 교반하에서 수용액층에 첨가하였다. 물을 첨가하여 전체 부피를 200 ml로 하였다. 형성된 유제를 고압 균질기에 통과시켰다. 균질화는 구/입자 크기가 2 μm 이하가 될때까지 반복하였다.
상기 균질화된 유제를 2 μ여과기로 여과하고, 질소 충진하에서 용기에 주입하였으며, 밀봉하고 가압멸균으로 무균처리하였다.
상기 제조공정을 통해 수득된 결과물은 다음의 조성을 포함한다:
a) 암포테리신 B(미세화된 것) - 1.0 g
b) 대두유 - 40.0 g
c) 정제된 난 포스파티드 - 2.4 g
d) 글리세린 - 4.5 g
e) 수산화나트륨 - pH 적정에 충분한 양
f) 물 - 전체부피가 200 ml이 되는 양
실시예 2를 통해 미세화된 암포테리신 B를 사용하는 경우에는 균질화 동안에 냉각할 필요가 없다는 것을 보여주고 있다.
실시예 3
오일층은 1 g의 암포테리신 B를 사전에 70℃로 가열한 40 g의 대두유에 분산시켜서 준비하였다.
수용액층은 4.5 g의 글리세린을 사전에 65℃로 가열한 150 ml의 물에 첨가하고 2.4 g의 난 포스파티드를 분산시켜 준비하였다. 이 수용액층을 수산화나트륨수용액으로 pH를 10.8으로 적정하였다.
상기 70℃로 가열한 오일층을 고속 교반하에서 상기 65℃로 가열한 수용액층에 첨가하였다. 물을 첨가하여 전체 부피를 200 ml로 하였다. 형성된 유제를 고압 균질기에 통과시켰다. 균질화는 구/입자 크기가 2 μm 이하가 될때까지 반복하였다. 균질화 결과물은 각 균질화 단계 직후에 20℃로 냉각하였다.
상기 균질화된 유제를 2 μ여과기로 여과하고, 질소 충진하에서 용기에 주입하였으며, 밀봉하고 110℃에서 40 분 동안 가압멸균하여 무균처리하였다.
상기 제조공정을 통해 수득된 결과물은 다음의 조성을 포함한다:
a) 암포테리신 B - 1.0 g
b) 대두유 - 40.0 g
c) 정제된 난 포스파티드 - 2.4 g
d) 글리세린 - 4.5 g
e) 수산화나트륨 - pH 적정에 충분한 양
f) 물 - 전체부피가 200 ml이 되는 양
실시예 3을 통해 수득된 결과물내의 암포테리신 B의 함량을 분석한 결과, 유화공정을 고온에서 수행할 수도 있다는 것을 보여준다.
실시예 4
오일층 - 40 g의 대두유
수용액층은 4.5 g의 글리세린을 사전에 65℃로 가열한 150 ml의 물에 첨가하고 2.4 g의 난 포스파티드를 분산시켜 준비하였다. 1 g의 암포테리신 B를 상기 난 포스파티드 용액에 분산시키고 수산화나트륨 수용액을 이용하여 pH를 10.8로 적정하였다.
상기 준비된 오일층을 고속 교반하에서 수용액층에 첨가하였다. 물을 첨가하여 전체 부피를 200 ml로 하였다. 형성된 유제를 고압 균질기에 통과시켰다. 균질화는 구/입자 크기가 2 μm 이하가 될때까지 반복하였다. 균질화 결과물은 각 균질화 단계 직후에 20℃로 냉각하였다.
상기 균질화된 유제를 2 μ여과기로 여과하고, 질소 충진하에서 용기에 주입하였으며, 밀봉하고 가압멸균으로 무균처리하였다.
상기 제조공정을 통해 수득된 결과물은 다음의 조성을 포함한다:
a) 암포테리신 B - 1.0 g
b) 대두유 - 40.0 g
c) 정제된 난 포스파티드 - 2.4 g
d) 글리세린 - 4.5 g
e) 수산화나트륨 - pH 적정에 충분한 양
f) 물 - 전체부피가 200 ml이 되는 양
실시예 4를 통해 수득된 상기 무균처리된 결과물을 실시예 11의 방법으로 독성 시험한 결과, 심장 독성 증상을 보였다. 결과적으로, 암포테리신 B를 수용액층에 첨가하는 것은 바람직하지 않다.
실시예 5
오일층은 2.4 g의 정제된 난 포스파티드를 교반하에서, 사전에 70℃로 가열한 40 g의 대두유에 분산시켜서 준비하였다.
수용액층은 4.5 g의 글리세린을 사전에 65℃로 가열한 150 ml의 물에 첨가하고 1 g의 암포테리신 B를 분산시켜서 준비하였다. 수산화나트륨 수용액으로 pH를 11.0으로 적정하였다.
상기 70℃로 가열한 오일층을 고속 교반하에서 상기 65℃로 가열한 수용액층에 첨가하였다. 물을 첨가하여 전체 부피를 200 ml로 하였다. 형성된 유제를 고압 균질기에 통과시켰다. 균질화는 구/입자 크기가 2 μm 이하가 될때까지 반복하였다. 균질화 결과물은 각 균질화 단계 직후에 20℃로 냉각하였다.
상기 균질화된 유제를 2 μ여과기로 여과하고, 질소 충진하에서 용기에 주입하였으며, 밀봉하고 가압멸균으로 무균처리하였다.
상기 제조공정을 통해 수득된 결과물은 다음의 조성을 포함한다:
a) 암포테리신 B - 1.0 g
b) 대두유 - 40.0 g
c) 정제된 난 포스파티드 - 2.4 g
d) 글리세린 - 4.5 g
e) 수산화나트륨 - pH 적정에 충분한 양
f) 물 - 전체부피가 200 ml이 되는 양
실시예 5를 통해 수득된 상기 무균처리된 결과물을 실시예 11의 방법으로 독성 시험한 결과, 심장 독성 증상을 보였다. 결과적으로, 정제된 난 포스파티드를 오일층에 첨가하고, 암포테리신 B를 수용액층에 첨가하는 것은 바람직하지 않다.
실시예 6
40 g의 대두유를 70℃로 가열하고 2.4 g의 난 레시틴을 교반하에서 용해하였다. 1 g의 암포테리신 B를 교반하에서 오일층에 분산시켜서 오일층내에 균일하게 분산된 암포테리신 B를 수득하였다. 이 오일층에 질소가스를 15 분동안 충진하였다.
150 ml의 물을 65℃로 가열하고 4.5 g의 글리세린을 교반하에서 첨가하였다. 수산화나트륨 수용액을 이용하여 pH를 10.65로 적정하였다. 이 수용액층에 오일에 분산된 암포테리신 B를 교반하에서 첨가하여 조악한 유제를 수득하였다. 물을 첨가하여 전체 부피를 200 ml로 하였다. 상기 조악한 유제를 APV 고압 균질기 이용하여 2 μ유리섬유 여과기로 여과할 수 있을때 까지 여과하였다. 균질화 결과물은 각 균질화 단계 직후에 20℃로 냉각하였다. 상기 여과된 결과물을 질소 충진하에서 유리용기에 주입하였으며, 밀봉하고 가압멸균으로 무균처리하였다.
상기 제조공정을 통해 수득된 결과물은 다음의 조성을 포함한다:
a) 암포테리신 B - 1.0 g
b) 대두유 - 40.0 g
c) 정제된 난 포스파티드 - 2.4 g
d) 글리세린 - 4.5 g
e) 수산화나트륨 - pH 적정에 충분한 양
f) 물 - 전체부피가 200 ml이 되는 양
실시예 6을 통해 수득된 상기 무균처리된 결과물을 실시예 11의 방법으로 독성 시험한 결과, 심장 독성 증상을 보였다. 결과적으로, 정제된 난 포스파티드를 오일층에 첨가하는 것은 바람직하지 않다.
수중유형 유제에 포함된 구조화된 오일-코팅-암포테리신 B는 이하의 실시예에서 암포테리신 B 유제 (Amphotericin B Emulsion; 5mg/ml)로 표기한다.
실시예 7
실시예 1에 따른 조성 및 제조방법으로 준비된 암포테리신 B 유제 (5mg/ml)를 소듐 데옥시콜레이트를 포함하는 일반적인 암포테리신 B 제형과 비교하여 인간 적혈구(RBCs)에 대한in-vitro독성 시험을 하였다.
시험재료 및 방법
시험 시스템:정상인 남자의 RBCs.
시험 재료:실시예 1의 조성 및 제조방법으로 준비된 암포테리신 B 유제 (5mg/ml).
대조 시험 재료:일반적인 암포테리신 B 주사제 (5mg/ml).
시험 방법:헤파린 처리된 튜브에 혈액을 채취하였다. 4℃에서 450 g로 10 분 동안 원심분리하여 RBCs를 분리하였다. 혈장 및 백혈구 연층을 제거하고 RBCs를 4℃에서 인산완충용액 (PBS, pH 7.4)으로 3회 세척하고 PBS에 분산시켰다. 이 세포를 Sysmex KX-21 세포 계수기로 분석하고 수득한 당일에 사용하였다. 암포테리신 B에 대한 RBC의 민감도를 측저하기 위하여, 2 ml의 PBS에 현탁된 세포 현탁액 (5 X 107세포/ml)을 암포테리신 B 유제 또는 일반적인 암포테리신 B 주사제와 함께 37℃에서 1 시간 동안 배양시켰다. 상기 RBCs를 1500 g에서 5 분 동안 원심분리 하였고 PBS로 3회 세척하였다. 상기 RBCs의 침사(pellet)를 2 ml의 물로 용혈시키고, 교반한 후에 원심분리 (1500 g 에서 5 분)하여 세포막을 제거하였다. 헤모글로빈을 상기 세포 계수기로 분석하였다. 방출은 대조시험의 세포와 처리된 세포 사이의 차이를 계산하였으며, 전체 헤모글로빈에 대한 백분율로 나타냈다.
표 1. 인간 RBCs에 대한
in vitro
독성 시험을 위한 암포테리신 B 제형의투여량
| 그룹 번호 | 그룹 | 투여량 (mg/L) |
| 1. | 대조군 | - |
| 2. | 일반적인 제형 (5 mg/ml) | 5, 50, 100, 200 |
| 3. | 암포테리신 B 유제 (5 mg/ml) | 5, 50, 100, 200 |
통계학적 분석:
수득된 결과는 음성 대조군과 시험군을 Studenet's t-test로 비교하여 분석하였다.
결과 및 토의
표 2 :암포테리신 B 제형에 대한 헤모글로빈의 g/dl 함량
| 투여량 (mg/L) | 용혈 백분율 | |
| 일반적인 암포테리신 B 주사제 | 유제 | |
| 5 | 77.5 ±0.0 | 2.04 ±0.0 |
| 50 | 100 0 ±0.0 | 4.08 ±0.0 |
| 100 | 100 0 ±0.0 | 4.18 ±0.82 |
| 200 | 100 0 ±0.0 | 9.49 ±4.48 |
일반적인 암포테리신 B 주사제 내의 암포테리신 B의 농도 및 유제의 증가에 따라 헤모글로빈 용혈도 증가하였다 (도 1). 일반적인 암포테리신 B 주사제는 5 mg/L에서 77.55%의 용혈을 보였고, 50 mg/L, 100 mg/L 및 200 mg/L에서는 100%의 평균 용혈을 보였다. 본 발명에 따른 유제의 경우에는 5 mg/L에서 2.04%, 50 mg/L에서 4.08%, 100 mg/L에서 4.18%, 200 mg/L에서 9.49%의 용혈을 보였다. 일반적인 암포테리신 B 주사제에 비하여 암포테리신 B 유제는 시험된 투여량에서 현저히 감소된 독성을 나타냈다 (P<0.05).
결론
따라서,in vitro독성 결과는 실시예 1에서 준비된 암포테리신 B 유제는 타겟 세포가 인간 RBCs인 경우에 일반적인 암포테리신 B 주사제에 비하여 감소된 독성을 갖는다는 것을 명백히 나타낸다.
실시예 8
실시예 1에 따른 조성 및 제조방법으로 준비된 암포테리신 B 유제 (5mg/ml)를 소듐 데옥시콜레이트를 포함하는 일반적인 암포테리신 B 제형과 비교하여 마우스에서in-vivo독성 시험을 하였다.
이 시험은 다음의 목적을 달성하기 위해 수행하였다:
■상기의 두 가지 제형의 단일 투여에 대한 LD50값을 측정하기 위한 목적
■상기의 두 가지 제형의 반복 투여에 대한 독성 효과를 측정하기 위한 목적
8-A)마우스에서 단일 투여에 의한 독성
시험재료 및 방법
시험 시스템:20-22 gm 범위의 체중을 갖는 자성 스위스 알비뇨 마우스를Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL)의 동물 사육소로 부터 제공받아, 이 시험에 사용하였다. 상기 시험 동물들은 표준 사료 및 AquaguardTM식수를 충분하게 제공하여 사육하였다.
시험 재료:실시예 1의 조성 및 제조방법으로 준비된 암포테리신 B 유제 (5mg/ml)를 볼루스(bolus) 투여양 만큼 정맥내에 주입하였다.
대조 시험 재료:일반적인 암포테리신 B 주사제 (5mg/ml)을 볼루스(bolus)의 투여양 만큼 정맥내에 주입하였다.
시험 방법:시험 동물을 8마리씩 포함하는 그룹 1 및 그룹 2로 분류한 2 그룹으로 분할하였다. 그룹 1은 다양한 양의 일반적인 암포테리신 B 주사제를 투여하고, 그룹 2는 다양한 양의 암포테리신 B 유제를 투여하였다.
표 3.마우스에서 단일 투여에 의한 독성 시험을 위해 사용된 암포테리신 B 제형의 투여량
| 그룹 번호 | 그룹 | 투여량(mg/kg 체중) |
| 1. | 일반적인 암포테리신 B 주사제 (5 mg/ml) | 5, 7.5, 10, 15, 20 |
| 2. | 암포테리신 B 유제 (5 mg/ml) | 50, 100, 150 ,200, 250, 300, 350, 375 |
모든 그룹은 정맥내 경로를 통해 투여하였다. 모든 시험 동물에 대하여 그어떤 치료학적 독성의 증상이 나타나는지를 72 시간 동안 점검하였다. 모든 투여량에서 백분율 치사율을 계산하였다.
통계학적 분석:투여된 제형에 대한 LD50수치를 측정하기 위하여 프로빗 분석 방법을 수행하였다.
결과 및 토의
표 4 :상기 2 제형의 다양한 투여량에 대한 백분율 치사율
| 그룹 | 투여량 (mg/kg) | 백분율 치사량 |
| 일반적인 암포테리신 B 주사제 | 2.5 | 33.33 |
| 5 | 50 | |
| 7.5 | 66.67 | |
| 10 | 83.33 | |
| 15 | 100 | |
| 20 | 100 | |
| 암포테리신 B 유제 | 50 | 0 |
| 100 | 0 | |
| 150 | 0 | |
| 200 | 0 | |
| 250 | 16.67 | |
| 300 | 16.67 | |
| 350 | 33.33 | |
| 375 | 42.85 |
상기 표의 결과는 일반적인 암포테리신 B 주사제의 통상적인 제조는 본 발명에 따른 암포테리신 B 유제에 비해 훨씬 독성이 강하다는 것을 보여준다. 제형들에 대한 백분율 치사율은 투여량에 의존적으로 증가한다. 상기 두가지 제형에 대한 LD50은 프로빗 분석 방법으로 계산하였다. 도 2는 두가지 제형에서 투여량에 대한 백분율 치사율을 나타내는 표이다.
| 제형 | 측정된 LD50(mg/kg) |
| 일반적인 암포테리신 B 주사제 | 5 |
| 암포테리신 B 유제 | 432.62 |
결론:본 발명에 따른 실시예 1에서 제조한 암포테리신 B 유제는 높은 LD50값을 갖으며, 따라서 일반적인 암포테리신 B 주사제에 비해 감소된 독성을 나타낸다.
따라서,in vitro독성 결과는 실시예 1에서 준비된 암포테리신 B 유제는 타겟 세포가 인간 RBCs인 경우에 일반적인 암포테리신 B 유제에 비하여 감소된 독성을 갖는다는 것을 명백히 나타낸다.
8-B)마우스에서 반복 투여에 의한 독성
시험재료 및 방법
시험 시스템:20-22 gm 범위의 체중을 갖는 자성 스위스 알비뇨 마우스를 Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL)의 동물 사육소로 부터 제공받아, 이 시험에 사용하였다. 상기 시험 동물들은 표준 사료 및 AquaguardTM식수를 충분하게 제공하여 사육하였다.
시험 재료:실시예 1의 조성 및 제조방법으로 준비된 암포테리신 B 유제 (5mg/ml)을 볼루스(bolus)의 투여양 만큼 정맥내에 주입하였다.
대조 시험 재료:일반적인 암포테리신 B 주사제 (5mg/ml)을 볼루스(bolus)의 투여양 만큼 정맥내에 주입하였다.
시험 방법:시험 동물을 6 마리씩 포함하는 그룹 1, 그룹 2 및 그룹 3으로 분류한 3 그룹으로 분할하였다. 그룹 1은 공 유제 부형제 (대조군)을 투여하였고, 그룹 2는 다양한 양의 일반적인 암포테리신 B 주사제를 투여하고, 그룹 3은 다양한 양의 암포테리신 B 유제를 투여하였다.
표 5.마우스에서 반복 투여에 의한 독성 시험을 위해 사용된 암포테리신 B 제형의 투여량
| 그룹 번호 | 그룹 | 투여량(mg/kg 체중) |
| 1. | 대조군 | 부형제 |
| 2. | 일반적인 암포테리신 B 주사제 (5 mg/ml) | 1.5, 2.5 |
| 3. | 암포테리신 B 유제 (5 mg/ml) | 10, 20, 40 |
모든 그룹은 매일 표 5에 표시된 대로 정맥내 경로를 통해 투여하였다. 대조군 그룹은 부형제의 최대 부피로 투여하였다. 모든 시험 동물에 대하여 그 어떤 치료학적 독성의 증상이 나타나는지 점검하였다. 시험 동물들의 체중은 이틀에 한번씩 14일 동안 측정하였다. 모든 투여량에서 백분율 치사율을 계산하였다.
통계학적 분석:
수득된 결과를 시험 기간동안의 체중 변화를 비교하기 위한 목적으로 분석하였다. 각 처리된 그룹들의 이 변화를 비교하였다.
결과 및 토의
표 6 :상기 두가지 제형의 다양한 투여량에 대한 백분율 치사율
| 그룹 | 투여량 (mg/kg) | 백분율 치사율 |
| 일반적인 암포테리신 B 주사제 | 1.5 | 20 |
| 2.5 | 80 | |
| 암포테리신 B 유제 | 10 | 0 |
| 20 | 0 | |
| 40 | 30 | |
| 대조군 | 부형제 | 0 |
상기 표의 결과(또한, 도 3 참조)는 일반적인 암포테리신 B 주사제의 통상적인 제조는 본 발명에 따른 암포테리신 B 유제에 비해 훨씬 독성이 강하다는 것을 보여준다. 제형들에 대한 백분율 치사율은 투여량에 의존적으로 증가한다. 부형제를 주사한 그룹에서는 14일 동안 한마리의 치사도 나타나지 않았다. 암포테리신 B 유제는 더 높은 농도에서도 일반적인 암포테리신 B 주사제보다 감소된 독성을 나타냈다.
표 7 :마우스에서 다양한 투여량을 반복 투여한 경우의 평균 체중
D는 측정한 날짜이고; SDEV는 표준편차를 나타낸다.
볼드체:대조군 (암포테리신 B 유제의 부형제를 처리한 것)에 비해 유효하게 다른 것을 나타낸다.
일반적인 암포테리신 B 주사제를 처리한 그룹에서는 1.5 mg/kg 및 2.5 mg/kg의 투여에서 시험 동물의 체중감소를 보였지만, 암포테리신 B 유제를 처리한 그룹에서는 20 mg/kg 및 40 mg/kg에서 체중감소를 보였다 (도 4). 6일 및 8일에서, 암포테리신 B 유제 20 mg/kg 및 40 mg/kg을 투여한 마우스의 체중은 암포테리신 B 유제 10 mg/kg을 투여한 마우스에 비해 현저히 감소한 체중을 나타냈다.
조직병리학적 검사를 통해 간 및 신장의 실질세포(parenchymal cells)에서 퇴화적인 변화가 나타났으며, 이것은 마우스에서 일반적인 대사에 의한 것일 수 있다. 노화된 근섬유는 시험 동물을 죽이는 과정에서 발생한 저산소증에 의한 것이다. 따라서, 일반적인 변화들은 가변적인 것이다. 암포테리신 B의 영향은 심한 급성 변병을 보이며 간 및 신장에서 강하게 나타나며, 심장에서도 어느정도 나타난다. 일반적으로, 부작용의 정도는 투여량에 비례한다. 하지만, 일반적인 암포테리신 B 주사제에서는 낮은 농도에서도 상기 변병이 나타난다.
결론:
암포테리신 B 유제는 일반적인 암포테리신 B 주사제에 비해 감소된 독성을 나타낸다.
8-C)쥐에서 단일 투여에 의한 독성
시험재료 및 방법
시험 시스템:140-160 gm 범위의 체중을 갖는 웅성 및 자성의 위스타 알비뇨 마우스를 Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL)의 동물 사육소로 부터 제공받아, 이 시험에 사용하였다. 상기 시험 동물들은 표준 사료 및 AquaguardTM식수를 충분하게 제공하여 사육하였다.
시험 재료:실시예 1의 조성 및 제조방법으로 준비된 암포테리신 B 유제 (5 mg/ml)을 볼루스(bolus)의 투여양 만큼 정맥내에 주입하였다.
대조 시험 재료:일반적인 암포테리신 B 주사제 (5mg/ml)을 볼루스(bolus)의 투여양 만큼 정맥내에 주입하였다.
시험 방법:시험 동물을 6 마리씩 포함하는 그룹 1 및 그룹 2 으로 분류한 2 그룹으로 분할하였다. 그룹 1은 다양한 양의 일반적인 암포테리신 B 주사제를 투여하고, 그룹 2는 다양한 양의 암포테리신 B 유제를 투여하였다.
표 8.쥐에서 단일 투여에 의한 독성 시험을 위해 사용된 암포테리신 B 제형의 투여량
| 그룹 번호 | 그룹 | 투여량(mg/kg 체중) |
| 1. | 일반적인 암포테리신 B 주사제 (5 mg/ml) | 1.25, 2.5, 5 |
| 2. | 암포테리신 B 유제 (5 mg/ml) | 50, 100, 150 |
모든 그룹은 표 8에 표시된 투여량을 정맥내 경로를 통해 투여하였다. 모든 시험 동물에 대하여 그 어떤 치료학적 독성의 증상이 나타나는지를 72 시간 동안 점검하였다. 모든 투여량에서 백분율 치사율을 계산하였다.
통계학적 분석:투여된 제형에 대한 LD50수치를 측정하기 위하여 프로빗 분석 방법을 수행하였다.
결과 및 토의
표 9 :상기 2 제형의 다양한 투여량에 대한 백분율 치사율
| 그룹 | 투여량 (mg/kg) | 백분율 치사율 |
| 일반적인 암포테리신 B 주사제 | 1.25 | 0 |
| 2.5 | 33.33 | |
| 5 | 100 | |
| 암포테리신 B 유제 | 50 | 0 |
| 100 | 0 | |
| 150 | 24시간후-16.6748시간후-33.3372시간후-50 |
상기 표의 결과(또한, 도 5)는 일반적인 암포테리신 B 주사제의 통상적인 제조는 본 발명에 따른 암포테리신 B 유제에 비해 훨씬 독성이 강하다는 것을 보여준다. 제형들에 대한 백분율 치사율은 투여량에 의존적으로 증가한다. 상기 두가지 제형에 대한 LD50은 프로빗 분석 방법으로 계산하였다. 암포테리신 B 유제에 의한 50% 치사율은 72 시간에서 나타났다. 72 시간 동안 체중의 변화는 나타나지 않았다.
| 제형 | 측정된 LD50(mg/kg) |
| 일반적인 암포테리신 B 주사제 | 2.5-5 |
| 암포테리신 B 유제 | >100 |
결론:암포테리신 B 유제는 일반적인 암포테리신 B 주사제에 비해 감소된 독성을 나타낸다.
8-D)개에서 단일 투여에 의한 독성
본 시험은 개에서 암포테리신 B 유제의 독성 및 안전성을 측정하기 위해서수행하였다.
시험재료 및 방법
시험 시스템:10-15 kg 범위의 체중을 갖는 웅성 및 자성의 개를 이 시험에 사용하였다. 상기 시험 동물들은 사료 및 식수를 충분하게 제공하여 개 사육장에서 표준조건으로 사육하였다.
시험 재료:실시예 1의 조성 및 제조방법으로 준비된 암포테리신 B 유제 (5 mg/ml)을 볼루스(bolus)의 투여양 만큼 정맥내에 주입하였다.
대조 시험 재료:일반적인 암포테리신 B 주사제 (5mg/ml)을 볼루스(bolus)의 투여양 만큼 정맥내에 주입하였다.
시험 방법:시험 동물을 6 마리씩 포함하는 그룹 1 및 그룹 2 으로 분류한 2 그룹으로 분할하였다. 그룹 1은 다양한 양의 일반적인 암포테리신 B 주사제를 투여하고, 그룹 2는 실시예 1에서 준비한 암포테리신 B 유제를 투여하였다.
표 10.개에서 단일 투여에 의한 독성 검사를 위해 투여된 일반적인 암포테리신 B 주사제 및 암포테리신 B 유제의 투여량
| 그룹 번호 | 그룹 | 투여량(mg/kg 체중) |
| 1. | 일반적인 암포테리신 B 주사제 (5 mg/ml) | 1 |
| 2. | 암포테리신 B 유제 (5 mg/ml) | 1 |
모든 그룹은 표 10에 표시된 투여량을 6-20 ml의 덱스트로오즈에 용해하여 정맥내 경로를 통해 투여하였다. 모든 시험 동물에 대하여 그 어떤 치료학적 독성의 증상이 나타나는지를 21일 동안 점검하였다. 모든 시험동물은 V0, V2, V4, V6 및 V8에 방문하여 체중을 측정하였다. 혈액학적 및 생화학적 검사(신장 및 간기능 검사)를 위하여 V0, V4 및 V8에 혈액을 채취하였다.
방문 스케줄:
VO 베이스라인 방문 V5 V0 후 12일 째
VO 베이스라인 후 2일내 V6 V0 후 15일 째
VO VO 후 3일 째 V7 V0 후 18일 째
VO VO 후 6일 째 V8 V0 후 21일 째
VO VO 후 9일 째
| 방문 | V0 | V1 | V2 | V3 | V4 | V5 | V6 | V7 | V8 |
| 약제 투여 | X | X | X | X | X | X | X | X | |
| 혈액 및 생화학 검사 | X | X | X |
통계학적 분석:
수득된 결과들은 시험 기간동안 베이스라인 이후의 변화들을 비교하기 위하여 분석하였다. 이런 변화들은 처리된 그룹들 사이에서 비교하였다.
결과 및 토의
표 11 :개에서 베이스라인에 대한 여러 차례 방문에서 검사된 혈액학적 변화의 평균 백분율
SD 는 표준편차를 나타낸다.
볼드체는 V4 및 V8에서 백혈구(WBC) 및 호중구(neutrophil)에 대한 두 그룹사이에서 검사된 중요한 차이를 나타낸다.
모든 혈액학적 항목들은 두 그룹에서 베이스라인 수치에 대한 변화로 표시하였다. 유제에서 백혈구 수의 감소율은 일반적인 것에 비해 현저히 높았지만, 정상 범위에 내에 존재하였기 때문에 치료학적으로 중요성을 갖지 않는다.
표 12 :개에서 베이스라인에 대한 여러 차례 방문에서 검사된 생화학적 변화의 평균 백분율
SD 는 표준편차를 나타낸다.
볼드체는 V4 및 V8에서 두 그룹사이에서 검사된 중요한 차이를 나타낸다.
간기능 파라미터 (도 6 참조)인 AST는 V8에서 일반적인 암포테리신 B 주사제 그룹에서 334.38 %의 증가를 보인 반면에, 암포테리신 B 유제의 그룹에서는 단지 108.86 %의 증가를 보였다. 유사한 검사결과가 ALT 및 전체 빌리루빈(bilirubin)에서도 나타났다. 일반적인 그룹의 이런 증가수치는 유제에 비하여 통계학적으로 중요한 수치이다.
신장기능 파라미터 (도 7 참조)는 일반적인 암포테리신 B 주사제 그룹에서 현저하게 범위를 벗어났다. 암포테리신 B 유제의 범위는 일반적인 암포테리신 B주사제에 비하여 현저히 감소된 것으로 나타났다.
암포테리신 B의 기본적인 독성인 신장독성은 일반적인 암포테리신 B 주사제 (소듐 데옥시콜레이트 함유)의 암포테리신 B 및 포유동물 세포의 콜레스테롤이 결합하여 비선택적 세포독성에 의해 야기된다. 포유동물의 세포독성은 지질 기반 유제 제형에 암포테리신 B를 포함시킴으로써 감소시킬 수 있다. 이런 개선은 암포테리신 B의 친화력을 변화시키고, 포유동물 세포의 콜레스테롤에 대한 선택적 전달을 감소시킨다.
표 13 :개에서 다양한 양으로 단일 투여에 의한 독성 검사에서 측정된 평균 체중
SD는 표준편차를 나타낸다.
일반적인 암포테리신 B 주사제를 처리한 그룹은 암포테리신 B 유제에 비하여 현저하게 감소된 체중을 나타냈다(도 8 참조).
결론:암포테리신 B 유제는 일반적인 암포테리신 B 주사제에 비해, 간독성 및 신장독성에 대하여 현저히 개선된 효과를 제공한다.
실시예 9
실시예 1에 따른 조성 및 제조방법으로 준비된 암포테리신 B 유제 (5 mg/ml)를 이용하여 일반적인 암포테리신 B 주사제와 비교하여 토끼에서 약동학적 항목을 평가하였다.
시험재료 및 방법
시험 시스템:1.5-2.0 kg 범위의 웅성 뉴질랜드 흰토끼를 Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL)의 동물 사육소로 부터 제공받아, 이 시험에 사용하였다. 상기 시험 동물들은 표준 식물사료 및 AquaguardTM식수를 충분하게 제공하여 사육하였다.
시험 재료:실시예 1의 조성 및 제조방법으로 준비된 암포테리신 B 유제 (5 mg/ml)을 볼루스(bolus)의 투여양 만큼 정맥내에 주입하였다.
대조 시험 재료:일반적인 암포테리신 B 주사제 (5mg/ml)을 볼루스(bolus)의 투여양 만큼 정맥내에 주입하였다.
시험 방법:시험 동물을 3 마리씩 포함하는 그룹 1 및 그룹 2 으로 분류한 2 그룹으로 분할하였다. 그룹 1 및 그룹 2는 일반적인 암포테리신 B 주사제 및 암포테리신 B 유제를 각각 투여하였다. 단일 정맥내 투여 후, 5, 15, 30, 45, 60분 및 1, 2, 3, 4, 5, 24, 48시간에 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액을 3000-4000 rpm으로 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 혈장은 분석을 위해 -20℃에서 보관하였다.
투여 경로 :토끼의 귀 가장자리 정맥을 통해 투여하였다.
표 14.토기에서 약동학적 시험을 위해 사용된 암포테리신 B 제형의 투여량
| 그룹 번호 | 그룹 | 투여량(mg/kg 체중) |
| 1. | 일반적인 암포테리신 B 주사제 (5 mg/ml) | 1 |
| 2. | 암포테리신 B 유제 (5 mg/ml) | 5 |
암포테리신 B 함량의 분석
혈장내의 암포테리신 B의 함량은 C-18 컬럼을 사용하여 상(phase) HPLC를 이용하여 분석하였다. 혈장내의 암포테리신 B는 HPLC 등급 디메틸 설폭사이드 및 아세토니트릴을 1:3:1 비율로 하여 추출하였다. 상기 시료를 3000 rpm으로 원심분리하고 상층액을 컬럼에 주입하였다.
통계학적 분석:
수득된 결과는 처리된 그룹들을 비교하여 Student's t-test를 통해 분석하였다.
결과 및 토의
표 15 :상기 2 제형에 대한 약동학적 파라미터
상기 두 제형에 대하여, Cmax, Tmax, T1/2, Vd의 현저한 차이는 없었다. 약제의 흡수에 관련하여, 혈장내에서 유제는 일반적인 암포테리신 B 주사제에 비해 현저히 빠르게 사라졌다 (P< 0.05). 이것은 조직내로의 유제의 분산이 일반적인 암포테리신 B 주사제에 비해 현저하게 신속하게 이루어진다는 것을 보여준다 (도 9 참조).
실시예 10
실시예 1에 따른 조성 및 제조방법으로 준비된 암포테리신 B 유제 (5 mg/ml)를 이용하여 일반적인 암포테리신 B 주사제와 비교하여 마우스에서 기관 분포 시험을 수행하였다.
시험재료 및 방법
본 시험은 다음의 목적으로 수행하였다:
■마우스에서 상기 2 제형의 단일투여에 의한 기관 분포를 평가하기 위한 목적
■마우스에서 상기 2 제형의 반복투여에 의한 기관 분포를 평가하기 위한 목적
10-A)마우스에서 단일투여에 의한 기관 분포시험
시험재료 및 방법
시험 시스템:20-22 gm 범위의 자성 스위스 알비뇨 마우스를 Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL)의 동물 사육소로 부터 제공받아, 이 시험에 사용하였다. 상기 시험 동물들은 표준 식물사료 및 AquaguardTM식수를 충분하게 제공하여 사육하였다.
시험 재료:실시예 1의 조성 및 제조방법으로 준비된 암포테리신 B 유제 (5 mg/ml)을 볼루스(bolus)의 투여양 만큼 정맥내에 주입하였다.
대조 시험 재료:일반적인 암포테리신 B 주사제 (5mg/ml)을 볼루스(bolus)의 투여양 만큼 정맥내에 주입하였다.
투여 경로 :정맥내 투여
시험 방법:시험 동물을 20 마리씩 포함하는 그룹 1 및 그룹 2 으로 분류한 2 그룹으로 분할하였다. 그룹 1은 일반적인 암포테리신 B 주사제를 1 mg/kg으로 투여하고, 그룹 2는 암포테리신 B 유제를 5 mg/kg으로 투여하였다. 각 샘플은 4 마리의 마우스 단위로 이루어졌다. 간, 허파, 신장, 비장 및 뇌의 기관 샘플은 0.5, 1, 2, 4, 24 시간에서 각각 해부하여 수득하였다. 상기 수득된 기관들은 냉동하여 모든 효소반응을 정지시켰다. 상기 기관들의 무게를 측정하고 3배의 물을 첨가하였다. 이후에, 상기 기관들을 균질화하였다.
표 16.마우스에서 단일 투여에 의한 기관 분포 시험에 사용된 일반적인 암포테리신 B 주사제 및 암포테리신 B 유제의 투여량
| 그룹 번호 | 그룹 | 투여량(mg/kg 체중) |
| 1. | 일반적인 암포테리신 B 주사제 (5 mg/ml) | 1 |
| 2. | 암포테리신 B 유제 (5 mg/ml) | 5 |
암포테리신 B 함량의 분석
메탄올을 상기 균질화된 기관에 3:1의 비율로 첨가하였다. 이 혼합물을 13,000-14,000 rpm으로 고속 원심분리하였다. 이 상층액을 암포테리신 B 분석을 위하여 HPLC 컬럼에 주입하였다.
통계학적 분석:
수득된 결과는 처리된 그룹들을 비교하여 Student's t-test를 통해 분석하였다.
결과 및 토의
표 17 :상기 2가지 제형에 대한 기관 분포
* 는 조직에서의 암포테리신 B의 축적을 나타낸다.
일반적인 암포테리신 B 주사제에 비교하여, 암포테리신 B 유제는 신장을 제외한 모든 기관에서 고농도로 나타났다 (도 10a 및 10b 참조). 기관에서 유제의 높은 반생존율 및 낮은 약제 제거율은 상기 결과를 뒷받침한다. 따라서, 기관에서 유제의 암포테리신 B 의 흡수가 일반적인 암포테리신 B 주사제에 비해 높은 것으로 나타났으며, 이 수치는 비장에서 통계학적으로 현저하게 나타난다 (P< 0.05).
신장독성은 암포테리신 B 치료에 있어서 주요한 단점이며 신장에서 높은 농도의 암포테리신 B의 축적에 의해 야기된다. 혈중약제 농도 곡선하 면적 (AUC(0-∞))으로 부터, 유제가 일반적인 암포테리신 B 주사제에 비해 현저하게 낮은 암포테리신 B 농도를 달성한다는 것이 나타났다 (P< 0.05). 또한, 유제는 신속하게 신장에서 제거되어졌으며, 이는 일반적인 암포테리신 B 주사제 제형에 비하여 높은 LD50및 낮은 독성때문이다.
혈장내에서는 농도가 감소하는 반면, 간 및 비장에서의 농도는 계속해서 증가하였다. 유사한 결과가 리포좀에 대해서 있었으며, 이 보고는 망상내피 조직에서 리포좀 형태의 약제는 비-리포좀 약제과 달리 혈장과 평형 농도로 존재하지 않음을 개시하고 있다 (Feilding, RM., 등, 1998).
10-B)마우스에서 반복투여에 의한 기관 분포시험
시험재료 및 방법
시험 시스템:20-22 gm 범위의 자성 스위스 알비뇨 마우스를 Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL)의 동물 사육소로 부터 제공받아, 이 시험에 사용하였다. 상기 시험 동물들은 표준 식물사료 및 AquaguardTM식수를 충분하게 제공하여 사육하였다.
시험 재료:실시예 1의 조성 및 제조방법으로 준비된 암포테리신 B 유제 (5 mg/ml)을 볼루스(bolus)의 투여양 만큼 정맥내에 주입하였다.
대조 시험 재료:일반적인 암포테리신 B 주사제 (5mg/ml)을 볼루스(bolus)의 투여양 만큼 정맥내에 주입하였다.
시험 방법:
시험 동물을 24 마리씩 포함하는 그룹 1 및 그룹 2 으로 분류한 2 그룹으로 분할하였다. 그룹 1은 일반적인 암포테리신 B 주사제를 1 mg/kg으로 투여하고, 그룹 2는 암포테리신 B 유제를 5 mg/kg으로 투여하였다. 각 12 마리의 마우스를 7 일 및 14 일 동안 투여하였다. 간, 허파, 신장 및 비장은 최종 투여 6 시간 후에 해부하여 수득하였다. 상기 수득된 기관들은 냉동하여 모든 효소반응을 정지시켰다. 상기 기관들의 무게를 측정하고 3배의 물을 첨가하였다. 이후에, 상기 기관들을 균질화하였다.
투여 경로 :정맥내 투여
표 18.마우스에서 반복 투여에 의한 기관 분포 시험에 사용된 일반적인 암포테리신 B 주사제 및 암포테리신 B 유제의 투여량
| 그룹 번호 | 그룹 | 투여량(mg/kg 체중) |
| 1. | 일반적인 암포테리신 B 주사제 (5 mg/ml) | 1 |
| 2. | 암포테리신 B 유제 (5 mg/ml) | 5 |
암포테리신 B 함량의 분석
혈장내의 암포테리신 B의 함량은 C-18 컬럼을 사용하여 상 HPLC를 이용하여 분석하였다. 혈장내의 암포테리신 B는 HPLC 등급 메탄올을 사용하여 메탄올에 대한 혈장을 1:3의 비율로 추출하였다. 상기 시료를 3000 rpm으로 원심분리하고 상층액을 컬럼에 주입하였다.
통계학적 분석:
수득된 결과는 처리된 그룹들을 비교하여 Student's t-test를 통해 분석하였다.
결과 및 토의
표 19 :상기 2 제형에 대한 기관 분포
상기 조직에서의 농도가 종래의 보고(Olsen, SJ 등, 1991)와 같이, 7일 내지 14일 동안 실질적으로 증가하지 않았다(도 11a 및 11b). 암포테리신 B 유제를 처리한 그룹에서는 조직내의 농도가 증가 하여도 치사를 보이지 않았다. 이와는 대조적으로, 일반적인 암포테리신 B 주사제의 경우에는 시험 기간동안 치사를 나타냈다.
비록 신장독성에 있어서 큰 차이를 나타내지만, 일반적인 암포테리신 B 주사제와 본 발명의 유제에 있어서, 신장내의 암포테리신 B의 농도는 동일하였다. 이것은 암포테리신 B와 지질의 복합체 또는 자유 암포테리신 B의 존재와는 무관하게 상기 기관에서 암포테리신 B의 농도를 측정하였기 때문일 수 있다. 일반적인 암포테리신 B 주사제의 경우에는 암포테리신 B가 주로 자유 형태로 존재하여 신장독성을 야기한다. 하지만, 지질 기반 유제의 경우에는, 암포테리신 B가 지질과의 복합체로 존재하여 조직에 독성을 나타내지 않는다.
양쪽성 약제인 암포테리신 B는 모노머 또는 단일-형성 올리고머로 존재하고, 마이셀(micelle) 결정 농도 이상이 되면 마이셀을 형성한다. 수용액 매질에서 암포테리신 B의 상기 두 형태의 평형을 바꾸는 모든 요소에 따라 약제의 활성 및 독성이 달라질 수 있다. Tabosa Do Egito 등은 암포테리신 B 유제를 암포테리신 B의 모노머의 저장기로 보고하였다. 상기 유제는 제한된 양의 자유 암포테리신 B 모노머를 점진적으로 방출하는 매우 안정한 제형이다. 이 제형은 단지 진균 세포의 에르고스테롤과 결합하고, 포유동물 세포의 콜레스테롤과의 결합은 감소된다 (Tabosa Egito, 등, 1996). 따라서, 비록 유제가 일반적인 암포테리신 B 주사제와 유사한 농도에서도 심각한 독성을 나타내지 않는다.
결론
암포테리신 B 유제는 다음의 목적을 달성하기 위하여 제형시킨다:
1. 향상된 안정성
2. 제형 경비의 경제성
상기 독성 시험은 본 발명에 따른 유제의 안정성은 일반적인 암포테리신 B주사제에 대하여 실제적으로 향상된 것임을 나타낸다. 이것은 본 발명에 따른 유제가 타겟 진균 세포에 직접 결합하는 형태이기 때문이다. 일반적인 암포테리신 B 주사제는 암포테리신 B를 매우 많은 양으로 방출하여 방출된 모노머들이 올리고머를 형성하고 포유동물 세포에도 결합하여 결과적으로, 심각한 독성을 야기한다. 이와는 대조적으로, 본 발명에 따른 유제는 상기와 같은 높은 농도로 혈장에 방출하지 않으며, 이는 RES에 의한 빠른 식작용 및 느리고 점진적인 모노머의 방출에 기인한 것이다. 이런 사실은 본 발명에 따른 유제는 진균 세포에 선택적으로 작용하여, 결과적으로 감소된 독성을 나타낸다 (Tabosa Do Egito, ES, 등, 1996). 낮은 혈장내 농도 및 기관내에서 암포테리신 B 유제의 신속한 분산은 약제의 타겟팅 관점에서 일반적인 암포테리신 B 주사제에 대조적인 장점이다. 더군다나, 암포테리신 B 유제는 지질 복합체 및 리포좀 제형과 같은 다른 지질 기반 제형들에 비하여 경비가 저렴하다.
결과적으로, 본 발명에 따른 암포테리신 B 유제는 진균 감염에 대한 선택적 치료로 사용할 수 있는 효과적인 물질이다.
실시예 11
실시예 4, 실시예 5 및 실시예 6에 따라 제조된 암포테리신 B 유제를 이용하여 마우스에서in-vivo독성 시험을 수행하였다.
마우스에서 단일 투여에 의한 독성
시험재료 및 방법
시험 시스템:20-22 gm 범위의 체중을 갖는 자성 스위스 알비뇨 마우스를 Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL)의 동물 사육소로 부터 제공받아, 이 시험에 사용하였다. 상기 시험 동물들은 표준 사료 및 AquaguardTM식수를 충분하게 제공하여 사육하였다.
시험 재료:실시예 4, 실시예 5 및 실시에 6에서 준비된 암포테리신 B 유제 (5mg/ml)을 볼루스(bolus)의 투여양 만큼 정맥내에 주입하였다.
대조 시험 재료:실시예 1에서 준비된 암포테리신 B 유제 (5mg/ml)을 볼루스(bolus)의 투여양 만큼 정맥내에 주입하였다.
모든 그룹은 정맥내 경로를 통해 투여하였다. 모든 동물에서 72 시간 동안 치료학적 독성의 증상 및 치사를 관찰하였다. 모든 투여량에서 치사 백분율을 계산하였다.
관찰:
실시예 4, 실시예 5 및 실시예 6의 샘플을 투여한 그룹에서는 심한 호흡 곤란, 국부적 자극, 복부 통증 및 불안과 같은 심장 독성의 증상이 나타났다. 이와는 대조적으로, 실시예 1의 조성 및 제조방법으로 준비된 샘플을 투여한 그룹에서는 이런 독성 증상이 나타나지 않았다.
본 발명의 장점:
본 발명에 따른 제조방법에 의해 수중유 형태의 구조화된 유제의 비경구 투여용으로 암포테리신 B를 제형화 하면, 독성을 현저히 감소시키면서, 항진균 효과에는 영향을 주지않고 무균처리를 할 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 의해 암포테리신 B를 유제의 오일층에 분산시키면, 무균처리를 위한 가압 멸균공정, 및 유통기한 또는 사용시까지 안정화시킬 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된, 수중유형 유화내의 구조화된 오일-코팅-암포테리신 B의 비경구 투여용 조성물의 평균 오일 소적 크기를 적절하게 조절하여, 결과적으로 망상내피계에 우선적으로 분포하여 혈장내의 농도를 감소시킬 수 있다.
Claims (15)
- a) 대두유, 참깨유 및 홍화유와 같은 식물유의 그룹으로부터 선택된 오일층(조성물의 30%w/v까지);b) 오일층에 분산된 암포테리신 B (조성물의 0.05% - 1%w/v);c) 수용액층을 구성하는 물;d) 수용액층에 용해된 글리세린, 만니톨, 덱스트로오즈와 같은 화합물의 그룹으로부터 선택된 장도 변형제; 및e) 수용액층에 분산된 천연 포스파티드와 같은 유화제(조성물의 3%w/v까지)를 포함하고, 마우스에서 적어도 400 mg/kg의 LD50을 갖는 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B 의 비경구 투여용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 오일층은 전체 조성물에 대하여 약 10 내지 20 %w/v인 것을 특징으로하는 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B 의 비경구 투여용 조성물.
- 제 1 항 및 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사용된 식물유는 대두유인 것을 특징으로하는 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B 의 비경구 투여용 조성물.
- 제 3 항에 있어서, 상기 대두유의 함량은 전체 조성물에 대하여 약 20 %w/v인 것을 특징으로하는 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B 의 비경구 투여용 조성물.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암포테리신 B의 함량은 전체 조성물에 대하여 약 0.5 %w/v인 것을 특징으로하는 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B 의 비경구 투여용 조성물.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사용된 천연 포스파티드는 정제된 난 포스파티드인 것을 특징으로하는 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B 의 비경구 투여용 조성물.
- 제 6 항에 있어서, 상기 정제된 난 포스파티드의 함량은 전체 조성물에 대하여 약 1.2 %w/v인 것을 특징으로하는 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B 의 비경구 투여용 조성물.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사용된 장도 변형제는 글리세린인 것을 특징으로하는 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B 의 비경구 투여용 조성물.
- 제 8 항에 있어서, 상기 글리세린의 함량은 전체 조성물에 대하여 약 2.25 %w/v인 것을 특징으로하는 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B 의 비경구 투여용 조성물.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유제는 암포테리신 B (전체 조성물에 대하여 0.5%w/v); 오일층을 이루는 대두유 (전체 조성물에 대하여 20%w/v); 유화제로서 정제된 난 포스파티드 (전체 조성물에 대하여 1.2%w/v); 장도 변형제로서 글리세린 (전체 조성물에 대하여 2.25%w/v); 및 물 (전체 조성물의 부피가 100% 되도록 충분한 양)을 포함하는 것을 특징으로하는 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B 의 비경구 투여용 조성물.
- i) 오일층에 암포테리신 B를 분산하는 단계;ii) 수용액층인 물에 장도 변형제를 용해시키는 단계;iii) 상기 수용액층에 유화제를 분산시키는 단계;iv) 상기 수용액층의 pH를 약 8-11로 적정하는 단계;v) 교반하에서 상기 오일층을 상기 수용액층에 첨가하여 조악하게 구조화된 유제를 수득하는 단계;vi) 상기 조악하게 구조화된 유제를 입자 크기가 2 미크론 이하가 될 때까지 균질화시키는 단계; 및vii) 상기 균질화시킨 구조화된 유제를 여과하여, 질소 충진하에서 유리용기에 담고, 상기 유리용기를 막은 후, 상기 막은 유리용기를 밀봉하고, 상기 밀봉된 용기를 가압멸균하여 무균처리하는 단계를 포함하여, 마우스에서 적어도 400 mg/kg의 LD50을 갖는 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 상기 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B 의 비경구 투여용 조성물을 제조하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 오일층 또는 상기 수용액층, 또는 두 층 모두를 상기 유화 공정동안 75℃ 까지의 온도로 유지시키는 것을 특징으로하는 상기 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B 의 비경구 투여용 조성물을 제조하는 방법.
- 제 11 항 및 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 상기 유화제로서 난 포스파티드를 포함하는 수용액층의 pH를 8-11로 적정하는 것을 특징으로하는 상기 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B 의 비경구 투여용 조성물을 제조하는 방법.
- 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,i) 대두유에 암포테리신 B를 분산하는 단계;ii) 물에 글리세린을 첨가하여 수용액층을 준비하는 단계;iii) 상기 수용액층에 상기 정제된 난 포스파티드를 분산시키는 단계;iv) 상기 수용액층의 pH를 10.8로 적정하는 단계;v) 교반하에서 분산된 암포테리신 B를 포함하는 상기 대두유를 분산된 난 포스파티드를 포함하는 상기 수용액층에 첨가하여 조악하게 구조화된 유제를 수득하는 단계;vi) 상기 조악하게 구조화된 유제를 입자 크기가 2 미크론 이하가 될 때까지 균질화시키는 단계; 및vii) 상기 균질화시킨 구조화된 유제를 2 미크론 여과기로 여과하여, 질소 충진하에서 유리용기에 담고, 상기 유리용기를 막은 후, 상기 막은 유리용기를 밀봉하고, 상기 밀봉된 용기를 가압멸균하여 무균처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로하는 상기 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B 의 비경구 투여용 조성물을 제조하는 방법.
- 제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 제조방법에 의해 제조되고, 마우스에서 적어도 400 mg/kg의 LD50을 갖는 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 상기 구조화된 유제 형태내의 오일-코팅-암포테리신 B 의 비경구 투여용 조성물.
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