CN1447682A - 两性霉素b结构化乳剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物及其制备方法，其中所述非肠道组合物在小鼠中的LD50至少为400mg/kg。该方法实质上需要将两性霉素B分散在油状载体中，并将乳化剂分散在水相中。该方法操作简单、成本低廉且能够获得适于非肠道给药的稳定产品。由本发明方法制得的两性霉素B乳剂可被人类或动物服用，用于治疗真菌感染；与常规的含有两性霉素B和脱氧核糖核酸钠的组合物相比，其药效基本相当或更高，其毒性相当或更低。

Description

两性霉素B结构化乳剂
技术领域
本发明涉及低毒性两性霉素B组合物，特别涉及适用于非肠道给药的在水包油型结构化乳剂中低毒的两性霉素B组合物。
背景技术
两性霉素B是由结节链霉素菌制得的大环多烯烃抗生素，其对真菌类、酵母菌类以及一些原生动物类具有广谱的效果。
用于静内给药的两性霉素B起初是以常规的胶态形式存在。即使是发展了大约35年后的今天，由于其可靠的治疗效力，因此仍广泛地用作重要的抗真菌剂。考虑到报道的用于临床的许多不良影响，其耐药性低。几乎在所有静内接受两性霉素B的患者中都存在肾脏毒副作用。其它不良影响包括高血压、低血压、心律失常(包括心室颤动)、心搏停止、肝病。小管损伤和肾小球损伤都会发生，存在肾功能永久性损伤的危险。由于在制备两性霉素B溶液时使用合成表面活性剂去氧胆酸钠，所以两性霉素B会刺激静脉内皮，可能在注射位置导致疼痛和血栓性静脉炎。
为了降低毒性作用，在不同药物传递体系中制成了两性霉素B，所述体系如类脂复合体、脂质体和乳剂。与以游离形式使用的药物相比，这些组合物具有更大的效力、更低的毒性。两性霉素B的类脂复合体和脂质体制剂在市场上都能得到，它们在世界上得到了多个国家的批准。
基于类脂复合体和脂质体的类脂制剂的主要缺点在于其高昂的治疗成本。两性霉素B是一种亲脂性药物，它与甾醇结合，插入类脂双分子层中，因此两性霉素B特别适合与类质传递体系一起使用。
人们在实验室中试图制备基于类脂乳剂形式的两性霉素B，该药物在更低治疗成本下具有毒性低的优点。
Volker Heinemann等人假定(Antimicrobial agents andchemotherapy1997， 41(4)；728-732)类脂乳剂降低低聚体两性霉素B量，由此减少两性霉素B与人类细胞膜胆固醇的相互作用。剩下的单体两性霉素B仍保持其与真菌细胞膜的麦角甾醇结合的可能性。
据Kirsh R，Goldstein R，Tarloff J等人报道(J.Infect.Dis.1998， 158；1065-1070)，通过与脂肪乳剂混合制备的两性霉素B的类脂乳剂组合物具有不失抗真菌活性下的低毒性。但是，人们发现这类含有两性霉素B的类脂乳剂的物理稳定性较差。
据Moreau P等人报道(J.Antimicro.Chemother.1992， 30；535-541)，利用与两性霉素B注射液混合的脂肪乳剂治疗的患者似乎能够显著地降低输注毒性和肾功能不良。
在欧洲和美国，使用与非肠道营养脂肪乳剂混合的两性霉素B的频率不断增加。
现有技术中制备两性霉素B乳剂的方法描述如下：美国专利5364632(1994)/日本专利JP2290809(1990)
在该专利中，制备乳剂的方法以下述典型的实施例描述：
通过槽内超声波降解(15分钟)，将两性霉素B溶解在甲醇(0.8mg/ml)中。将磷脂E-80(主要含有80％卵磷脂和8％磷脂酰乙醇胺)溶解在氯仿中。混合这两种溶液，经包含玻璃纤维预滤器和0.45μ再生纤维膜过滤器(RC5)(GF92)的组合过滤体系过滤，除去热原质和聚集体。在40℃下减压旋转蒸发，将得到的清亮类脂乳液以薄膜形式沉积在圆底烧瓶的壁上。经0.22μMillipore过滤器，过滤poloxamer、去氧胆酸钠和丙三醇，将其注入到烧瓶中，超声波降解分散液，直至得到均质脂质体。
在70℃下加热经0.22μMillipore过滤器过滤且含有α-生育酚的MCT(中链丙三醇三酸酯)油，然后混入加热至45℃的脂质体混合物中，在此通过磁性搅拌其分散。
在保持相同温度的条件下，利用高剪切混合器Polytron进行乳化。迅速冷却所得粗乳液。利用两步均质器，得到澄清的单分散乳液。
最后，调节乳液的pH，经0.45μMillipore过滤器过滤，除去在乳化和均质过程中生成的粗液滴碎屑。
所有操作过程均在无菌条件下完成。
在该实施例中最终乳液不同成分的相对量及配方中给出的范围如下：
两性霉素B0.075％(0.015-0.15％)，MCT油20％(3-50％)，磷脂E800.5％(0.5-20％)，poloxamer2％(0.3-10％)，去氧胆酸钠1％(0.5-5％)，丙三醇2.25％，α-生育酚0.02％和两次蒸馏水200％。美国专利5364632(1994)/日本专利JP2290809(1990)方法的缺陷：
i.由于两性霉素B在甲醇中的溶解度低，所以溶解所需量的两性霉素B需要大量的甲醇。这就限制了最终组合物中的药物含量。
ii.在该方法中，必须要利用水相首先形成药物、两性霉素B和磷脂薄膜，热后再水解形成的薄膜。水相含有非离子乳化剂poloxamer、表面活性剂去氧胆酸钠及丙三醇。
iii.采用的油相为含有α-生育酚的MCT油。通过向维持在45℃的水相中加入维持在70℃下的油相，制备乳液。这不能保证两性霉素B保留在油相中。如果将其置于油相中，那么该方法没有挖掘出降低两性霉素B毒性的全部潜力。
iv.美国专利5364632(1994)方法的产品是在无菌条件下制造的。药典中指明的优选无菌化方法是在最后的容器中高压灭菌产品。进一步地，由于两性霉素B通常是通过静脉内路线给药，最后无菌化是唯一优选的方法，这种方法能给出更高的无菌可信性。
v.即使乳化产品对机械应力很稳定，但却没有研究其毒性，因此产品的毒性仍然未知。尽管如此，为了与两性霉素B(Fungizone)进行比较，在Balb/c小鼠中进行了体内比较研究，Fungizone是一种含有去氧胆酸钠的商业两性霉素B制剂。该研究表明，这种产品比Fungizone毒性低。
vi.通过降低药物经网状内皮系统(RES)摄入，使用MCT油和poloxamer可增加药物血浆浓度。在真菌感染情况下，需要将两性霉素B分布于感染部位的网状内皮系统中。日本专利11-60491(1989)
这份日本专利描述了含有以乳剂形式存在的两性霉素B的药剂。乳剂包含：
i)两性霉素B(1至10mg/ml最终乳剂)。
ii)油相-油相由植物油、鱼油和丙三醇三酯组成(1-50％，优选5-30％)。所使用的油油旋豆油或蓖麻油
iii)乳化剂-所使用的乳化剂为磷脂。另外也可以使用非离子乳化剂。使用的磷脂如蛋黄磷脂、大豆磷脂或由这些物质得到的氢化产品。也可以使用卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷酯酸、磷脂酰丙三醇。推荐量为1-5％(油成分重量)，优选10-30％(油成分重量)；或1-10％w/v乳剂，优选4-6％w/v乳剂。
非离子乳化剂也可被使用，如聚烷基二醇(mol.wt.1000-10000，优选4000-6000)，或聚氧乙烯(或聚氧丙烯聚合物)(mol.wt.1000-20000，优选2000-10000)，氢化蓖麻油聚氧烯烃衍生物，如氢化蓖麻油聚氧乙烯-20-醚、-40-醚、-100-醚，用量小于5％w/v，优选小于1％w/v。还可使用两种非离子乳化剂的组合。
iv)脂肪酸及其盐(可药用)-最高1％，优选0.5％w/v。
v)稳定剂，小于5％w/v，优选小于1％w/v，包括：
a)高分子聚合物质，如人体白蛋白；乙烯基共聚物，如聚
乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇；脂肪胺。
b)明胶、羟基乙基淀粉；胆固醇类。
vi)等渗剂-小于5％w/v，优选小于1％w/v。
vii)丙三醇或其单酯，如单油酸酯、单棕榈酸酯。
viii)糖类，如单糖和二糖、山梨糖醇、木糖醇，小于5％w/v，优选小于1％w/v。
ix)抗氧化剂，如生育酚，小于5％w/v，优选小于1％w/v。
x)pH控制剂，如酸、碱和缓冲剂。
下述制备方法是过去的报道。该方法包括，首先形成油包水乳剂(w/o)，然后通过用水稀释，将其转变成水包油乳剂(o/w)。在该方法中，豆油、磷脂、两性霉素B和一些水及其它添加剂(使用时)一起混合，根据需要加热。混合物然后在高压均质器中均质。加入所需的更多量的水，将w/o乳剂转变成o/w乳剂，在进行均质。
在典型的实施例中，根据上述方法处理200g豆油、50g磷脂和2.5g两性霉素B及750ml水。
在另一个实施例中，在上述组合物中掺入2.2％丙三醇组合物。
乳剂的平均液滴尺寸为0.1-0.2μ。将乳剂及其液滴在冷冻条件下稳定多至10天。日本专利11-60491(1989)方法的缺陷是：
正如人们所知，乳液制剂中的两性霉素B比常规两性霉素B制剂的毒性低。但由于日本专利11-60491(1989)中的乳剂制备方法，该专利制剂没有挖掘出降低毒性至该乳剂概念的全部潜力。
i.由于由日本专利11-60491(1989)得到的乳剂的平均颗粒尺寸为0.1至0.2μ，不可能挖掘经网状内皮系统优先摄入较大颗粒尺寸的显著利益。鉴于大多数真菌感染发生在该位置，通过网状内皮系统优先摄入两性霉素B是需要的。
ii.在冷冻器中研究乳剂稳定多达10天。
iii.大量添加剂被建议加入到乳液制剂中去，包括乳化支持剂，如脂肪胺，高分子量聚合物，非离子天然表面活性剂，胆固醇类，糖类，如单糖和二糖，抗氧化剂。
iv.制造产品的无菌化步骤没有指明。
日本专利4-173736(1992)描述了含有0.005％至5％两性霉素B、0.5％至25％磷脂(优选卵磷脂)的产品。该组合物的平均颗粒直径为100nm。该产品不是乳剂，不含有任何油相。
美国专利5389373(1995)描述了制备溶解性差的药物水包油(o/w)乳剂的方法。该方法包括将两性霉素B溶解在高或低pH水溶液中，将所得到的浓度不超过100μg/ml的溶液加入到乳液中，向乳液中加入适量酸、碱或缓冲液，调节产品pH至所需值。该美国专利5389373(1995)方法的缺陷：
该方法的主要不足在于限制了加入到乳液中的低浓度两性霉素B。在该方法中，两性霉素B的浓度为100μg/ml数量级，因而需要注入对治疗不利的更大体积的组合物。
在美国专利5534502(1996)中，利用酸和乙醇解晶两性霉素B，然后再均匀地分散在类脂中，接着进行乳化。在该方法中，将两性霉素B溶解在乙醇中是实质性的，最优选的乙醇量为400至600ml/gm两性霉素B。该方法的主要不足在于两性霉素B在酸性pH中不稳定。
欧洲专利EP0700678(1996)描述了主要含有柠檬酸或其可药用盐及至少选自蛋氨酸、苯基丙氨酸、丝氨酸、组胺酸及其可药用盐中一种成分的类脂乳剂，条件是不得同时包含蛋氨酸和苯基丙氨酸。
同时使用柠檬酸和至少一种上述氨基酸的要求是实质性的。根据该发明制备乳剂的方法描述如下：
将磷脂和用于乳化的助剂(如油酸)溶解于适当有机溶剂(如己烷)中，然后减压蒸馏溶剂，得到类脂膜。向所得类脂膜中加入油成分和水，通过振动剧烈搅拌初步乳化混合物。利用常用乳化剂乳化得到的液体。乳化完成后，通过加入盐酸或氢氧化钠，将所得乳液的pH调节预先确定水平。然后向乳液中加入柠檬酸和氨基酸，得到液态乳剂。另外，通过向上一步骤制得的液态膜中加入油成分和柠檬酸水溶液，制备液态乳剂，再将所得混合物进行乳化步骤。欧洲专利EP0700678(1996)方法的缺陷：
制备两性霉素B乳剂的方法没有详细描述。两性霉素B为所列举的描述成“可制成类脂乳剂”的大约70种药物中的一种。
i)制备类脂乳剂的方法涉及将磷脂溶解在适当的有机溶剂如己烷中。
ii)在该专利的实施例中，将氨基酸和柠檬酸加入到形成的类脂乳剂中，在60℃下通过褪色进行稳定性研究。静内乳剂必须在高压灭菌的无菌化温度下保持稳定。
iii)一个实施例中指明的无菌化方法是在60℃下加热1小时，每隔24小时，该无菌化方法重复三次。该方法不适于制备静内注射剂。
本发明的主要目的在于开发用于非肠道给药的两性霉素B的制备方法，该药剂毒性很低，克服了上述现有技术方法中缺陷和不足。
该主要目的的主要部分在于开发一种利用油包覆两性霉素B固体粉末并将包覆油的固体两性霉素B粉末置于水包油乳液中的方法，条件是在整个制备过程(包括无菌化高压灭菌)中，将掺入的两性霉素B保留在油相中，直至其货架期或使用。
该主要目的的另一部分在于开发一种制备这类结构化水包油乳剂的方法，所述结构化水包油乳剂在乳液中平均油滴控制在最佳的范围，以致其优先分布于网状内皮系统中，得到低血浆浓度。由此，为了注射，该乳剂起着载有含包覆油的两性霉素B的油珠的水合外层相乳剂的作用。
该主要目的的另外部分在于开发一种制备这类两性霉素B乳剂的方法，该乳剂只需要最少的添加剂，所述添加剂是用于制备油包水乳剂最基本的添加剂。
发明概述
由此，本发明涉及结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物，该组合物在小鼠中的LD50至少为400mg/kg，所述组合物包括：
a)选自植物油，如豆油、蓖麻油、红花油的油相(最高30％w/v组合物)；
b)分散于油相中的两性霉素B(0.05％至1％w/v组合物)；
c)水相；
d)选自溶解于水中的化合物，如丙三醇、甘露醇、葡萄糖的张力调节剂；以及
e)分散于水相中的乳化剂，如天然磷脂(最高3％w/v组合物)。
在另一实施方案中，本发明涉及制备结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物的方法，该组合物在小鼠中的LD50至少为400mg/kg，所述方法包括将两性霉素B分散在油相中，通过将张力调节剂溶解在水中制备水相，将乳化剂分散在水相中，调节水相pH至8-11，在搅拌条件下将油相加入到水相中，得到粗的结构化乳剂，使粗的结构化乳剂均质至颗粒尺寸低于2微米，在氮气气氛下，将均质过的结构化乳剂过滤至玻璃容器中，关闭玻璃容器，密封关闭的玻璃容器，通过高压灭菌无菌化封闭的填充容器。这些操作步骤的顺序非常重要。通过毒性研究表明，改变操作步骤的顺序会改变乳剂的结构。
本发明方法的特征在于卵磷脂分散在水相中，而两性霉素B粉末分散在油相中，因此，产物是指结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B。
在另一实施方案中，本发明涉及由上述方法制备的结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B的非肠道组合物。
通过本发明方法制备水包油型结构化乳剂形式的两性霉素B，可获得毒性显著降低，且可保证在不改变抗真菌活性的前提下的组合物无菌化处理。毒性较低的本发明组合物可提供在治疗一些感染中增加剂量水平的范围。
本发明结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物毒性较低，其特征在于：
a)在小鼠单剂量毒性研究中的LD50至少为400mg/kg体重，在小鼠重复剂量毒性研究中的LD50至少为40mg/kg体重；
b)在大鼠单剂量毒性研究中的LD50至少为150mg/kg体重；
c)与含有去氧胆酸钠的常规制剂相比，其对人红血球的溶血作用低至少20倍；
d)在小鼠单剂量研究中，与含有去氧胆酸钠的常规制剂相比，其在网状内皮系统中优先组织分布，且至少两倍于网状内皮系统器官的t1/2；
e)在小鼠中注射后，没有心脏毒力的毒性征兆，如严重性呼吸困难、局部刺激、腹部痛苦和扰动。
发明实施方案祥述
本发明结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物中两性霉素B含量范围很广泛，为0.05％至1％w/v组合物，优选0.1至0.5％w/v组合物，特别地，可为大约0.5％或大约0.25％w/v组合物。
在本发明方法中，两性霉素B在乳化前分散于油相中。两性霉素B如此使用或在分散于油相前微粉化。油相含量范围很广，可最高30％w/v组合物，优选5至25％w/v，更优选10至20％w/v，特别是大约10％w/v或大约20％w/v。所使用的典型油相为植物油，可以是豆油、芝麻油、棉子油、红花油、向日葵油、花生油、玉米油、蓖麻油或橄榄油中的一种植物油。优选的植物油是豆油。
在本发明中，乳化剂溶解在水相中。适宜的乳化剂包括天然存在的磷脂类和改性磷脂。优选的乳化剂为天然存在的磷脂类，如卵磷脂和大豆磷脂。本发明使用的乳化剂可以包括两种或多种上述乳化剂的混合物。由选的天然磷脂为纯化卵磷脂。
本发明结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物是在pH范围6.0-8.5下形成的。在本发明的方法中，利用碱如氢氧化钠或氢氧化钾水溶液，调节水相pH至8&11，这样高压灭菌后的本发明组合物的pH就保持在6-8.5的范围。
通过掺入张力调节剂，如丙三醇、山梨糖醇、葡萄糖或其组合，本发明结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物在与血液等渗条件下制得。优选的张力调节剂是丙三醇，丙三醇的含量为2-3％w/v组合物，所使用的丙三醇优选含量大约为2.25％w/v组合物。
本发明结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物是根据控制条件下的制备步骤制得的特定无菌水包油乳剂，最后利用高压灭菌进行无菌化处理。当乳化步骤在较高温度下进行时，水箱或油相或两相保持在最高75℃下。
本发明组合物的平均粒径精确地保持在最高2μ，这样可使两性霉素B优先分布在网状内皮系统中，从而得到低血浆浓度。
本发明通过典型的实施例描述，其中结构化乳剂包括：两性霉素B(0.5％w/v)；油相豆油(20％w/v)；乳化剂纯化卵磷脂(1.2％w/v)；张力调节剂丙三醇(2.25％w/v)和水(适量至100％(体积))。通过下述方法制备：将两性霉素B分散在豆油中；通过向水中加入丙三醇制备水相；接着将纯化卵磷脂分散在水相中；调节水相pH至10.8；在搅拌条件下，向水相中加入含有两性霉素B的豆油，得到粗的乳剂；均化粗的乳剂至粒径低于2微米；通过2微米过滤膜过滤，在氮气气氛下加入到玻璃容器中，关闭玻璃容器，封闭关闭的玻璃容器，通过高压灭菌对封闭的填充容器进行无菌化处理。
本发明水包油型乳剂结构化的包覆油的两性霉素B非肠道组合物的结构化乳剂毒性低、粒径小，适合于非肠道使用。因为产品在不显著损失两性霉素B活性且不破坏乳剂稳定性的条件下，通过最终高压灭菌处理，所以本发明组合物的无菌化得到了保障。本发明组合物使用容易，产品可利用5％葡萄糖注射液或盐水稀释，得到非肠道使用所需要的浓度。本发明组合物也具有较长的货架期，适于稳定的市售产品。
我们研究了由本发明方法制备的乳剂的毒性情况，其中以添加两性霉素B和纯化卵磷脂的模式为变量。它们描述在以下表给出的实施例中。
  实施例   两性霉素B     卵磷脂     毒性
  I   油相     水相     未显示出心脏毒性征兆
  IV   水相     水相     显示出心脏毒性征兆
  V   水相     油相     显示出心脏毒性征兆
  VI   油相     油相     显示出心脏毒性征兆
在本发明方法中结果发现，当两性霉素B悬浮在水相中时，得到的产品注射到小鼠中去，则会产生心脏毒性征兆，如严重性呼吸困难、局部刺激、腹部痛苦和扰动。但是，当两性霉素B悬浮在油相中时，则观察不到这些征兆。这可能是因为乳剂油滴和Kuppfer细胞引起的油罐效应(reservoir effect)。这种低释放速度会导致注射乳剂后血浆中存在单体两性霉素B，从而降低毒性(参见：Antimicrobialagents and chemotherapy，1997；vol.41(4)：Pg.728-732)。
我们也发现，通过在油相中加入乳化剂卵磷脂，也会产生上述心脏毒性征兆。在进一步实验后，通过向水相中加入卵磷脂，克服了这个问题。这些过程研究描述在实施例I至实施例VI中。实施例II和实施例III是实施例I的改变形式，也属于本发明；而实施例IV、V和VI不是本发明。实施例VII描述了对人红血球细胞的体外毒性。实施例VIII和实施例XI描述了小鼠、大鼠和狗的毒性研究。实施例IX描述了兔的药物动力学研究，实施例X描述了小鼠中的器官分布。
两性霉素B分散在油相及卵磷脂分散在水相中的观察结果表明，毒性很低的乳剂在油滴与两性霉性B之间具有很强的相互作用。因此，两性霉性B乳剂可被认为是单体形式的两性霉性B的储罐，而且由于制剂稳定性高，所以只要少量的游离两性霉性就可以持续释放。单体形式的两性霉性B可以稳定地与真菌细胞麦角固醇结合，而对宿主哺乳动物细胞的胆固醇惰性，因此造成的毒性较低。在常规的两性霉性B制剂中，游离两性霉性B在血浆中的高释放水平会导致循环中存在自身关联的低聚体。这些低聚体与含有宿主细胞膜的胆固醇相互作用，从而导致较高的毒性。这就解释了与常规制剂相比，本发明两性霉性B乳剂毒性低的原理。血清中较低的峰值浓度和AUC值(实施例IX)及两性霉性B在组织中相应较快的沉积速度(实施例X-A)也解释了本发明两性霉性B乳剂毒性较低的原因。通过实施例VIII-A、VIII-B和VIII-C给出的结果，我们确信了本发明乳剂毒性低的事实。
这些毒性研究表明，尽管本发明产品结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B的非肠道组合物与日本专利11-60491(1989)类似，但是本发明产品由于制备方法不同，其具有生物毒性低的特征。
由于两性霉性B注射后在血浆中释放速度低，本发明方法得到的乳化产品易形成单体，而日本专利11-60491(1989)的方法却得不到这样的产品。由此，通过毒性研究，本发明的乳剂结构不同于日本专利得到的产品，所以我们将本发明乳剂称为结构化乳剂。
在本发明的主要实施方案中，两性霉素B分散在油相中，两性霉素B粉末被油包覆。用作乳化剂的卵磷脂分散在水相中。
在本发明的另一实施方案中，均质步骤重复循环进行，从而得到低于2μ的颗粒分布。
在本发明的另一实施方案中，最终结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B的非肠道组合物在最后进行高压灭菌无菌化处理。与现有技术的区别：
由下述可以看出本发明方法不同于其他专利。
a)本发明方法不同于美国专利5364632(1994)：本发明不使用两性霉素B的任何溶剂；不经过制备两性霉素B核磷脂膜及接着的氢化过程；不使用含有α-生育酚的MCT油；调节含卵磷脂的水相pH至8-11；具有最后的无菌化步骤-以及产品具有毒性低且在网状内皮系统(RES)中分布好。
使用这么多的溶剂使得方法难以适应工业应用。结果发现不同实施例中的颗粒尺寸小于100nm，但组合物的毒性没有报道。
在本发明的方法中，低毒性甚至维持在5mg/ml，这对于治疗有利，注射所需的体积很低。
b)本发明方法不同于日本专利11-60491(1989)，日本专利的乳剂粒径为0.1-0.2μ，本发明最高为2μ。
在本发明方法中，卵磷脂被加到水相中，水相的pH调节至8-11。
本发明产品的货架期超过2年，而日本专利只有10天或几周的数量级。
在日本专利方法中，需要大量的乳液支持剂，而这在本发明药物乳剂却不需要。
本发明方法提供了无菌产品，最后通过高压无菌进行无菌处理，而现有技术日本专利没有无菌化处理步骤。
c)日本专利4-173736(1992)的方法制得的产品不包含直径大于1μm的颗粒，该产品不包括在油成分中，因此不同于本发明组合物。
d)在美国专利5389373(1995)中，两性霉素B被加入到预先制得的乳剂中，而本发明方法中的两性霉素B分散在油相中。
e)在欧洲专利EP0700678(1996)中，没有描述这类两性霉素B乳剂。它只是所列举的描述成“可制成类脂乳剂”的大约70种药物中的一种。
该专利描述的乳剂实质上必须含有氨基酸和柠檬酸或其盐，而在本发明中根本无需这些。
该专利制备乳剂的方法实质上是从制备含有或不含有药物的磷脂膜开始的；而本发明方法不一点也需要这一步骤。
在制备乳剂的方法中，必须指定不同模式的添加乳化剂步骤，而本发明只需要在水相中加入乳化剂。
欧洲专利EP0700678(1996)提及的发明目的实质上是利益柠檬酸和氨基酸克服类脂乳剂褪色的问题，而本发明的目的是开发一种水包油型乳及结构化包覆油的两性霉素B，其毒性特征是小鼠LD50至少为400mg/kg。
尽管本发明已在特定的实施方案中描述过，但对于本领域的技术人员来讲，可在不脱离本发明的条件下进行各种改变和改性。
实施例：
本发明将通过实施例的方式加以阐述。这些实施例仅仅是说明性，绝不是用来限制本发明的范围。
实施例中使用的所有原材料均为非肠道级，使用的设备具有常规性能。整个操作在环境受到控制的区域进行。进行批量处理时需要提供氮气气氛。
这些实施例中使用的两性霉素B是从符合USP说明书的Alpharma获得的，为非肠道级。
实施例中使用的纯化卵磷脂为非肠道级，由类脂获得。
在整个药物动力学研究、器官分布研究和毒性研究中，含去氧胆酸钠的市购两性霉素B注射剂是指常规的两性霉素B注射剂。在所有研究过程中只使用一种品牌的常规组合物。
实施例I
通过将1g两性霉素B分散在40g豆油中，制备油相。
通过将4.5g丙三醇加入到150ml水中，然后再分散在2.4g卵磷脂中，制备水相。利用氢氧化钠水溶液调节pH至10.6。
在高速搅拌下，将上述制得的油相加入到水相中。利用水将体积调至200ml。将形成的乳剂穿过高压均质器。重复均质处理，直至粒径低于2μm。在每次均质循环之后，立即将产物温度冷却至20℃。
通过2μ滤纸过滤均质过的乳剂，在氮气气氛下将其装入容器，封闭并通过高压灭菌进行无菌化处理。
由该方法制得的产品具有下列成分：
a)    两性霉素B                     1.0g
b)    豆油                          40.0g
c)    纯化卵磷脂                    2.4g
d)    丙三醇                        4.5g
e)    氢氧化钠                      适量，调节pH
f)    水                            适量，至200ml
将获得的无菌化产品进行小鼠、大鼠和狗中毒性研究(实施例VIII-A、VIII-B、VIII-C、VIII-D)、药物动力学研究(实施例IX)、器官分布研究(实施例X-A、X-B)。在2℃-8℃下，通过将产品贮存在小瓶中进行稳定性研究，结果示于下表。
        实施例I产品的稳定性数据
    周期   外观     两性霉素B含量
    起初   黄色均匀乳液     104.6％
    6个月   黄色均匀乳液     101.3％
    1年   黄色均匀乳液     99.4％
毒性研究清楚地表明，由本发明方法制得的乳剂是一种协同组合物。
实施例II
利用空气喷射研磨机微粉化两性霉素B粉末，得到粒径范围小于10微米粉末。
通过将1g两性霉素B(微粉化)分散在40g豆油中，制备油相。
通过将4.5g丙三醇加入到150ml水中，然后再分散在2.4g卵磷脂中，制备水相。利用氢氧化钠水溶液调节pH至10.8。
在高速搅拌下，将上述制得的油相加入到水相中。利用水将体积调至200ml。将形成的乳剂穿过高压均质器。重复均质处理，直至粒径低于2μm。
通过2μ滤纸过滤均质过的乳剂，在氮气气氛下将其装入容器，封闭并通过高压灭菌。
由该方法制得的产品具有下列成分：
a)    两性霉素B                 1.0g
      (微粉化)
b)    豆油                      40.0g
c)    纯化卵磷脂                2.4g
d)    丙三醇                    4.5g
e)    氢氧化钠                  适量，调节pH
f)    水                        适量，至200ml
该实施例证实，如果使用微粉化两性霉素B，均质化处理过程中的冷却步骤就不需要。实施例III
通过将1g两性霉素B分散在预先加入至70℃的40g豆油中，制备油相。
通过将4.5g丙三醇加入到预先加热至65℃的150ml水中，然后再分散在2.4g卵磷脂中，制备水相。利用氢氧化钠水溶液调节pH至10.8。
在高速搅拌下，将70℃的油相加入到65℃的水相中。利用水将体积调至200ml。将形成的乳剂穿过高压均质器。重复均质处理，直至粒径低于2μm。在每次均质循环之后，立即将产物温度冷却至20℃。
通过2μ滤纸过滤均质过的乳剂，在氮气气氛下将其装入容器，封闭并通过高压灭菌在110℃进行无菌化处理40分钟。
由该方法制得的产品具有下列成分：
a)    两性霉素B                     1.0g
b)    豆油                          40.0g
c)    纯化卵磷脂                    2.4g
d)    丙三醇                        4.5g
e)    氢氧化钠                      适量，调节pH
f)    水                            适量，至200ml
分析所得产品中两性霉素B含量，结果非常满意，表明乳化步骤可在较高温度下进行。
实施例IV
油相-40g豆油
通过将4.5g丙三醇加入到150ml水中，然后再分散在2.4g卵磷脂中，制备水相。将1g两性霉素B分散在该卵磷脂溶液中，利用氢氧化钠水溶液调节pH至10.8。
在高速搅拌下，将油相加入到水相中。利用水将体积调至200ml。将形成的乳剂穿过高压均质器。重复均质处理，直至粒径低于2μm。在每次均质循环之后，立即将产物温度冷却至20℃。
通过2μ滤纸过滤均质过的乳剂，在氮气气氛下将其装入容器，封闭并通过高压灭菌进行无菌化处理。
由该方法制得的产品具有下列成分：
a)    两性霉素B                       1.0g
b)    豆油                            40.0g
c)    纯化卵磷脂                      2.4g
d)    丙三醇                          4.5g
e)    氢氧化钠                        适量，调节pH
f)    水                              适量，至200ml
根据实施例XI给出的详细步骤，将获得的无菌化产品进行毒性研究，结果产生了心脏毒性征兆。由此可见，将两性霉素B加入到水相中不是本发明所推荐的。
实施例V
通过在搅拌条件下，将2.4g纯化卵磷脂溶解在预先加入至70℃的40g豆油中，制备油相。
通过将4.5g丙三醇加入到预先加热至65℃的150ml水中，然后再在其中分散1g两性霉素B，制备水相。利用氢氧化钠水溶液调节pH至11.0。
在高速搅拌下，将70℃的油相加入到65℃的水相中。利用水将体积调至200ml。将形成的乳剂穿过高压均质器。重复均质处理，直至粒径低于2μm。在每次均质循环之后，立即将产物温度冷却至20℃。
通过2μ滤纸过滤均质过的乳剂，在氮气气氛下将其装入容器，封闭并通过高压灭菌进行无菌化处理。
由该方法制得的产品具有下列成分：
a)    两性霉素B                      1.0g
b)    豆油                           40.0g
c)    纯化卵磷脂                     2.4g
d)    丙三醇                         4.5g
e)    氢氧化钠                       适量，调节pH
f)    水                             适量，至200ml
根据实施例XI给出的详细步骤，将获得的无菌化产品进行毒性研究，结果产生了心脏毒性征兆。由此可见，将纯化卵磷脂加入到油相并向水相中加入两性霉素B不是本发明所推荐的。
实施例VI
将40g豆油加热至70℃，在搅拌条件下，将2.4g纯化卵磷脂溶解在其中。在搅拌条件下，将1g两性霉素B分散在油相中，得到两性霉素B在油相至均匀分散液。利用氮气冲洗油相15分钟。
将150ml水加热至65℃，在搅拌条件下向其中加入4.5g丙三醇。利用氢氧化钠稀溶液调节pH至10.65。在高速搅拌下，将两性霉素B油分散液加入到该水相中，得到粗的乳剂。利用水将体积调至200ml。利用APV高压均质器均质该粗乳剂，直至均质过的产品能够滤过2μ玻璃纤维滤纸。在每次均质循环之后，立即将产物温度冷却至大约20℃。在氮气气氛下将过滤过的产品装入容器，封闭并通过高压灭菌进行无菌化处理。
由该方法制得的产品具有下列成分：
a)    两性霉素B                             1.0g
b)    豆油                                  40.0g
c)    纯化卵磷脂                            2.4g
d)    丙三醇                                4.5g
e)    氢氧化钠                              适量，调节pH
f)    水                                    适量，至200ml
根据实施例XI给出的详细步骤，将获得的无菌化产品进行毒性研究，结果产生了心脏毒性征兆。由此可见，将纯化卵磷脂加入到油相不是本发明所推荐的。
下列实施例中的水包油型乳剂结构化的包覆油的两性霉素B非肠道组合物是指两性霉素B乳剂(5mg/ml)。
实施例VII
将实施例I方法制备的两性霉素B乳剂(5mg/ml)和含有去氧胆酸钠的常规两性霉素B制剂进行人红血球(RBCs)体外毒性试验。材料和方法
试验系统：取自正常人雄性施主的RBCs。
试验材料：根据实施例I方法制得的两性霉素B乳剂(5mg/ml)。
对比材料：常规两性霉素B注射剂(5mg/ml)。
研究设计：将血液收集在肝素化试管中。在4℃、于450g下离心10分钟，分离RBCs。分离血浆和血沉棕黄层，在将RBCs分散在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中之前，在4℃下利用PBS(pH7.4)洗涤三次。然后在Sysmex KX-21细胞计数器上计数RBCs，并在采集的那一天使用RBCs。为了测定RBC对两性霉素B的敏感程度，利用两性霉素B乳剂或常规两性霉素B注射液，在37℃下孵育2ml PBS细胞悬浮液(5×107细胞数/ml)1小时。将RBCs在1500g下离心5分钟，并利用PBS洗涤3次。为了分离细胞膜，将RBCs细胞块溶解在2ml水中、搅拌并进行离心处理(1500g，5分钟)。在细胞计数器上测量血红细胞。以对照细胞和治疗细胞之间的差计算释放数，将其表示成占总血红细胞含量的百分数。
表1用于研究人RBCs体外毒性的两性霉素B剂量
组序号 组     剂量(mg/L)
1 对照     -
2 常规制剂(5mg/ml)     5，50，100，200
3 两性霉素B制剂(5mg/ml)     5，50，100，200
统计分析：
利用Student’s t-试验，比较治疗组与对照组，分析所得到的数据。结果和讨论
表2两性霉素B制剂的血红细胞G/DL含量
剂量(mg/L)               血球溶解百分数
   常规两性霉素B注射剂     乳剂
  5    77.5±0.0     2.04±0.0
  50    100.0±0.0     4.08±0.0
  100    100.0±0.0     4.18±0.82
  200    100.0±0.0     9.49±4.48
在常规两性霉素B注射剂和乳剂中，随着两性霉素B浓度增加，血红细胞溶解量增加(参见图1)。常规两性霉素B注射剂表明，剂量为5mg/L的平均溶解量为77.5％，剂量为50mg/L、100mg/L、200mg/L的平均溶解量为100％；乳剂表明，剂量为5mg/L的平均溶解量为2.04％，剂量为50mg/L的平均溶解量为4.08％，剂量为100mg/L的平均溶解量为4.18％，剂量为200mg/L的平均溶解量为9.49％。在所研究的剂量范围内(P＜0.05)，两性霉素B乳剂毒性显著地低于常规两性霉素B注射剂。结论
由此，体外毒性数据清楚地表明，当靶细胞为人RBCs时，实施例I制得的两性霉素B乳剂的毒性低于常规两性霉素B注射剂。
实施例VIII
将实施例I方法制备的两性霉素B乳剂(5mg/ml)和含有去氧胆酸钠的常规两性霉素B进行小鼠体内毒性研究。
研究的目的如下：
从单剂量研究，评估上述两种制剂的LD50值。
Figure A0181433100231
从重复剂量研究，测定上述两种制剂的毒性作用。VIII-A) 单剂量小鼠毒性研究材料和方法
试验系统：从Bharat Serums & Vaccines Ltd(BSVL)动物房中取出重量为20-22gm瑞士雌性小白鼠，将其用作研究。随意地给动物提供标准的固型食物和AquaguardTM水。
试验材料：以大药丸剂量，静内服用由实施例I方法制得的两性霉素B乳剂(5mg/ml)。
对比材料：以大药丸剂量，静内服用常规两性霉素B注射剂(5mg/ml)。
研究设计：动物被分成两组(第一组和第二组)，每组8只。第一组接受不同剂量的常规两性霉素B注射剂，第二组接受不同剂量的两性霉素B乳剂。
表3用于单剂量小鼠毒性研究的两性霉素B剂量
组序号   组   剂量(mg/kg体重)
1   常规两性霉素B注射剂(5mg/ml) 5，7.5，10，15，20
2   两性霉素B乳剂(5mg/ml)   50，100，150，200，250，300，350，375
所有组通过静内路线接受注射。在72小时内，观察所有动物的任何临床毒性信号及死亡情况。对所有剂量计算死亡百分数。
统计分析：利用正规偏差分析方法，测定所有制剂的LD50值。结果和讨论
表4两种制剂不同剂量的死亡百分数
组     剂量(mg/kg)     死亡百分数
常规两性霉素B注射剂     2.5     33.33
    5     50
    7.5     66.67
    10     83.33
    15     100
    20     100
两性霉素B乳剂     50     0
    100     0
    150     0
    200     0
    250     16.67
    300     16.67
    350     33.33
    375     42.85
上表表明，常规方法制备的常规两性霉素B注射剂的毒性大于两性霉素B乳剂。在与剂量有关的情况下，制剂的死亡百分数增加。通过正规偏差分析方法测定两种制剂的LD50值。图2给出了两种制剂死亡百分数与剂量之间的关系图。
  制剂     估计的LD50(mg/kg)
  常规两性霉素B注射剂     5
  两性霉素B乳剂     432.62
结论
实施例I制备的两性霉素B乳剂的LD50高于常规两性霉素B注射剂，毒性低于常规两性霉素B注射剂。VIII-B) 重复剂量小鼠毒性研究材料和方法
试验系统：从Bharat Serums & Vaccines Ltd(BSVL)动物房中取出重量为20-22gm瑞士雌性小白鼠，将其用作研究。随意地给动物提供标准的固型食物和AquaguardTM水。
试验材料：以大药丸剂量，静内服用由实施例I方法制得的两性霉素B乳剂(5mg/ml)。
对比材料：以大药丸剂量，静内服用常规两性霉素B注射剂(5mg/ml)。
研究设计：动物被分成三组(第一组、第二组和第三组)，每组6只。第一组接受空白乳剂载体(对照)，第二组接受不同剂量的常规两性霉素B注射剂，第三组接受不同剂量的两性霉素B乳剂。
表5用于重复剂量小鼠毒性研究的常规两性霉素B和两性霉素B乳剂的剂量
    组序号 组     剂量(mg/kg体重)
    1 对照     载体
    1 常规两性霉素B注射剂(5mg/ml)     1.5，2.5
    2 两性霉素B乳剂(5mg/ml)     10，20，40
所有组通过静内路线每天接受表5剂量注射。对照组接受最大体积的载体。观察所有动物的任何临床毒性信号。在14天内，每隔一天记录小鼠的体重。另外，在14天内观察死亡率。计算所有剂量的死亡百分数。统计分析：
为了比较研究过程中的体重变化情况，分析所得数据。在治疗组之间比较这种变化。结果和讨论
表6两种制剂不同剂量的死亡百分数
组     剂量(mg/kg)     死亡百分数
常规两性霉素B注射剂     1.5     20
    2.5     80
两性霉素B乳剂     10     0
    20     0
    40     30
对照     载体     0
上表(参见图3)表明，常规方法制备的常规两性霉素B注射剂的毒性大于两性霉素B乳剂。在与剂量有关的情况下，制剂的死亡百分数增加。在14天内，注射载体的治疗组没有死亡。在较高剂量条件下，结果表明，两性霉素B乳剂的毒性小于常规两性霉素B注射剂。
表7重复剂量小鼠毒性研究的不同剂量平均体重
组 剂量(mg/kg)                                         14天内平均体重±SDEV(gm)
  D0   D2   D4   D6   D8   D9   D11   D12   D14
常规两性霉素B注射剂 1.5   19.56±2.74   19.01±2.83   18.64±3.81   21.33±14.38   18.92±4.57   19.71±4.36   19.94±4.15   22.88±4.25   19.82±5.04
2.5   17.54±3.14   15.72±2.92   16.88±3.43   18.85±1.76   16.35±1.62   16.05±1.06   17.3±1.27   19.15±134   17.7±1.83
两性霉素B乳剂 10   16.3±1.19   17±2.01   14.46±1.83   19.57±3.04   17.51±2.61   17.96±2.87   19.01±2.59   21.21±2.45   19.76±2.79
20   16.95±233   17.42±1.87   16.96±1.99   20.61±2.53   17.54±2.8   17.91±3.03   18.83±3.06   19.29±3.46   19.03±3.78
40   19.87±2.83   18.96±3.36   16.43±2.19   19.95±2.56   17.23±2.75   17.53±2.83   17.93±2.65   19.38±3.01   17.88±3.00
对照 0   18.74±1.97   17±2.11   16.42±3.12   16.98±2.87   20.86±3.96   20.08±4.56   21.24±4.39   22.26±4.90   22.74±4.97
D：表示观察的天数；SDEV：表示标准偏差。Bold：与对照组(利用两性霉素B乳剂的载体治疗)显著不同。
常规两性霉素B注射剂治疗组表明，在剂量为1.5mg/kg和2.5mg/kg时，动物体重下降；而两性霉素B乳剂表明，在剂量为20mg/kg和40mg/kg时，动物体重下降(参见图4)。在第6、第8天，利用20mg/kg和40mg/kg两性霉素B乳剂治疗的小鼠体重明显地低于利用10mg/kg两性霉素B乳剂治疗的小鼠体重。
组织病理学说检查显示了肝和肾软组织细胞的一些退化变化，这可能是由于小鼠的一般代谢引起。感觉肌原纤维可能是死亡时的缺氧症的结果。这种变化一般是可逆型的。两性霉素B似乎对肝和肾的作用更大，而对心脏只是一般作用，导致非常急性的损伤。强度一般与剂量相关。在常规两性霉素B注射剂中，损伤可在低剂量水平观察到。结论
两性霉素B乳剂的毒性低于常规两性霉素B注射剂。VIII-C) 单剂量大鼠毒性研究材料和方法
试验系统：从Bharat Serums & Vaccines Ltd(BSVL)动物房中取出重量为140-160gm性别任意的Wistar大白鼠，将其用作研究。随意地给动物提供标准的固型食物和AquaguardTM水。
试验材料：以大药丸剂量，静内服用由实施例I方法制得的两性霉素B乳剂(5mg/ml)。
对比材料：以大药丸剂量，静内服用常规两性霉素B注射剂(5mg/ml)。
研究设计：动物被分成两组(第一组和第二组)，每组6只。第一组接受不同剂量的常规两性霉素B注射剂，第二组接受不同剂量的两性霉素B乳剂。
表8用于单剂量大鼠毒性研究的常规两性霉素B注射剂和两性霉素B乳剂的剂量
组序号 组     剂量(mg/kg体重)
1 常规两性霉素B注射剂(5mg/ml)     1.25，2.5，5
2 两性霉素B乳剂(5mg/ml)     50，100，150
所有组通过静内路线接受表8所示的注射。在72小时内，观察所有动物的任何临床毒性信号及死亡情况。对所有剂量计算死亡百分数。
统计分析：利用正规偏差分析方法，测定所有制剂的LD50值。结果和讨论
表9两种制剂不同剂量的死亡百分数
组    剂量(mg/kg)     死亡百分数
常规两性霉素B注射剂    1.25     0
   2.5     33.33
   5     100
两性霉素B乳剂    50     0
   100     0
150     16.67-24小时后33.33-48小时后50-72小时后
上表(参见图5)表明，常规方法制备的常规两性霉素B注射剂的毒性大于两性霉素B乳剂。在与剂量有关的情况下，制剂的死亡百分数增加。通过正规偏差分析方法测定两种制剂的LD50值。在两性霉素B乳剂中，72小时后的死亡率为50％。在72小时内，体重没有变化。
  制剂     估计的LD50(mg/kg)
  常规两性霉素B注射剂     2.5-5
  两性霉素B乳剂     ＞100
结论
两性霉素B乳剂的毒性低于常规两性霉素B注射剂。VIII-D) 单剂量狗毒性研究
进行本研究的目的在于评估两性霉素B乳剂在狗中的毒性和安全性。材料和方法
试验系统：从在本研究中使用12只性别不限、重量为10-15kg的健康狗。动物在Kennel标准条件下圈养，随意地带有食物和水的进出口。
试验材料：以大药丸剂量，静内服用由实施例I方法制得的两性霉素B乳剂(5mg/ml)。
对比材料：以大药丸剂量，静内服用常规两性霉素B注射剂(5mg/ml)。
研究设计：动物被分成两组(第一组和第二组)，每组6只。第一组接受常规两性霉素B注射剂，第二组接受实施例I制得的两性霉素B乳剂。
表10用于单剂量狗毒性研究的常规两性霉素B注射剂和两性霉素B乳剂的剂量
组序号 组 剂量(mg/kg体重)
1 常规两性霉素B注射剂(5mg/ml) 1
2 两性霉素B乳剂(5mg/ml) 1
所有组通过静内路线接受表10所示的注射，药剂溶解在6-20ml5％葡萄糖中。在注射后21天内，观察所有动物的任何临床毒性信号及死亡情况。在观察的V0、V2、V4、V6和V8，称量体重。为了进行血液学和生化研究(肾功能和肝功能测试)，在V0、V4和V8采集血样。观察时间表：
V0基线观察
V1两天内基线观察
V2V0之后3天
V3V0之后6天
V4V0之后9天
V5V0之后12天
V6V0之后15天
V7V0之后18天
V8V0之后21天
观察     V0     V1     V2     V3     V4     V5     V6     V7     V8
服用药物     X     X     X     X     X     X     X     X
血液学和生物化学     X     X     X
统计分析：
为了比较研究过程中由基线得到的参数变化，分析所得到的数据。在治疗组之间进行了这种变化的比较。结果和讨论
表11在狗的试验中不同观察时间，血液学参数与基线改变的平均百分数
组                                                       血液学参数改变百分数±SD
  观察   RBC   血色素   MCV   比容血细胞   WBC   嗜中性白细胞   淋巴细胞   单细胞   嗜曙红细胞   嗜碱细胞
常规两性霉素B注射剂 V4 -6.61±2.58 -9.37±5.26 -4.29±3.75 -10.46±4.77   (总计)-14.68±16.77 -11.37±4.07 -26.86±10.81 -9.36±33.46 23.33±49.15 0.0±0.0
V8   -10.24±238   -21.68±2.15   -7.31±4.29   -l6.91±4.95   -13.66±16.93   -15.07±6.23   -30.02±13.96   -23.13±37.5   6.11±54.83   0.0±0.0
两性霉素B乳剂 V4   -8.69±3.4   -16.28±8.24   -10.31±13.92   -18.13±11.51   -34.91±6.96   -5.65±3.44   -22.23±14.68   13.39±25.39   67.85±68.57   0.0±0.0
V8   -14.7±5.63   -10.9±44.77   -12.57±16.26   -25.45±13.77   -32.7±8.52   -9.21±7.65   -21.84±18.71   0.69±12.95   25.19±52.32   0.0±0.0
SD表示标准偏差。Bold表示两种制剂组中V4和V8的白细胞和嗜中性细胞之间的显著差异。
结果发现，两组中所有血液学参数均显示出与基线值的偏差。乳剂中白细胞数下降的百分数显著地高于常规注射剂，但属于正常范围内，没有临床差别。
表12在不同观察时间，狗的生化参数与基线改变的平均百分数
组                               生化参数改变百分数±SD
  观察                    肝参数             肾参数
  SGOT(AST)     SGPT(ALT)     总的胆红素 BUN 肌氨酸酐
常规两性霉素B注射剂 V4   143.22±25.89     114.77±35.33     140.9±27.92   86.45±25.15     81.13±32.26
V8   334.38±40.87     261.37±57.27     259.11±73.74   309.35±38.57     214.62±56.49
两性霉素B乳剂 V4   77.11±33.72     39.30±18.49     87.88±25.25   8.08±48.00     25.93±11.16
V8   108.86±38.91     60.79±26.55     153.55±28.65   51.59±4.86     165.28±86.21
SD表示标准偏差。Bold表示两种制剂组在V4和V8之间的显著差异。
在常规两性霉素B注射剂中，V8时的肝功能参数(参见图6)AST上升了334.38％，而在两性霉素B乳剂中仅仅上升108.86％。类似的结果也在ALT和总的胆红素中发现。与乳剂相比，常规组的上升在统计学上是显著的。
在常规两性霉素B注射剂中，肾功能参数(参见图7)明显地被扰乱。两性霉素B乳剂的偏差明显地小于常规两性霉素B注射剂。
作为两性霉素B的主要毒性，足以危害肾脏的毒性导致了常规两性霉素B注射剂(含去氧胆酸钠)和哺乳动物细胞胆固醇的两性霉素B之间的非选择性细胞毒性相互作用。通过在含类脂的乳剂中掺入两性霉素B，使得哺乳动物细胞毒性衰减。这就改变了两性霉素B的亲和力，降低了向黄安哺乳动物细胞的胆固醇的选择性转变。
表13单剂量狗毒性研究中不同剂量的平均体重
组   剂量(mg/kg)                          14天内平均体重±SD(mg)
  V0   V2     V4     V6     V8
常规两性霉素B注射剂 1   15.0±3.85   14.33±3.38     14.0±3.17     13.66±3.12     13.166±3.12
两性霉素B乳剂(BSVL) 1   15.5±2.96   15.0±3.01     15.0±2.774     14.5±2.68     14.16±2.639
SD表示标准偏差。
常规两性霉素B注射剂治疗组中动物体重高于两性霉素B乳剂治疗组(参见图8)。结论
与常规两性霉素B注射剂相比，两性霉素B乳剂对肝脏毒性和肾脏毒性得到了保护。
实施例IX
将实施例I制得的两性霉素B乳剂(5mg/ml)用于评价兔中与常规两性霉素B注射剂比较的药物动力学参数。材料和方法
试验系统：从Bharat Serums & Vaccines Ltd(BSVL)动物房中取出重量为1.5-2.0kg的雄性新西兰白兔，将其用作研究。随意地给动物提供标准的营养蔬菜和AquaguardTM水。
试验材料：以大药丸剂量，静内服用由实施例I方法制得的两性霉素B乳剂(5mg/ml)。
对比材料：以大药丸剂量，静内服用常规两性霉素B注射剂(5mg/ml)。
研究设计：动物被分成两组(第一组和第二组)，每组3只。第一组和第二组分别接受常规两性霉素B注射剂和两性霉素B乳剂。在静内单个大药丸剂量注射后5、15、30、45和60分钟及1、2、3、4、5、24、48小时，采集血样。以3000-4000rpm速度离心血样，分离出血浆。血样存放在-20℃，直至分析。
给药路线：通过兔耳边缘上的静脉血管给药。
表14用于兔药物动力学研究的两性霉素B制剂剂量
组序号    组 剂量(mg/kg体重)
1    常规两性霉素B注射剂(5mg/ml) 1
2    两性霉素B乳剂(5mg/ml) 5
两性霉素B含量分析
利用C-18柱，通过相HPLC方法，分析血浆中两性霉素B含量。利用HPLC级二甲亚砜和乙腈(比例1∶3∶1)提取血浆中的两性霉素B。样品在3000rpm下离心，将上清液注射到柱中。统计分析：
为了比较治疗组，通过Student’s t-试验，分析获得的数据。结果和讨论
表15两种制剂药物动力学参数
  时间(小时)                    血浆浓度(mcg/ml)
两性霉素B乳剂(5mg/kg)     常规两性霉素B注射剂(1mg/kg)
  0.083     0.387±0.176     0.499±0.133
  0.25     0.196±0.101     0.274±0.076
  0.5     0.119±0.018     0.313±0.118
  0.75     0.103±0.0065     0.463±0.0
  1     0.099±0.0078     0.245±0.007
  2     0.099±0.0     0.216±0.0035
  3     0.094±0.0     0.365±0.159
  4     0.093±0.0     0.24±0.081
  5     0.092±0.0     0.175±0.012
  24     0.0±0.0     0.173±0.155
  48     0.0±0.0     0.066±0.0
参数  常规两性霉素B注射剂(1mg/kg)     两性霉素B乳剂(5mg/kg)
Cmax(mcg/ml)  0.576±0.006     0.387±0.176
Tmax(hours)  0.083±0.0     0.083±0.0
T1/2(hours)  1.89±0.728     6.622±10.63
AUC(mcg-hr/ml)  1.851±0.836     1.115±1.558
Vd(L)  1.47±1.26     26.144±18.522
Cl(ml/hr)  540.25±28.01     16062.31±12510.82
两种制剂之间的Cmax、Tmax、T1/2、Vd没有显著的差异。为了清理，以比常规两性霉素B注射剂明显快的速度，将乳剂从血浆中分离出来(P＜0.05)。这就表明乳剂分布到组织中的速度快于常规两性霉素B注射剂(参见图9)。
实施例X
为了与常规两性霉素B注射剂对比，利用实施例I方法制得的两性霉素B乳剂(5mg/ml)，在小鼠中进行器官分布研究。
本研究的目的是：
通过单剂量研究，评价两种制剂在小鼠中器官分布的形式；
通过重复剂量研究，测定两种制剂在小鼠中器官分布的形式。X-A) 小鼠中单剂量器官分布研究材料和方法
试验系统：从Bharat Serums & Vaccines Ltd(BSVL)动物房中取出重量为20-22gm瑞士雌性小白鼠，将其用作研究。随意地给动物提供标准的固型食物和AquaguardTM水。
试验材料：以大药丸剂量，静内服用由实施例I方法制得的两性霉素B乳剂(5mg/ml)。
对比材料：以大药丸剂量，静内服用常规两性霉素B注射剂(5mg/ml)。
给药路线：静内。
研究设计：动物被分成两组(第一组和第二组)，每组20只。第一组接受剂量为1mg/kg的常规两性霉素B注射剂，第二组接受剂量为5mg/kg的两性霉素B乳剂。每个样品点由4只小鼠组成。在各自时间点(0.5、1、2、4、24小时)的最后，分别讨论肝、肺、肾、脾和脑器官样本。器官立即冷冻，阻止一切酶反应。称量器官，加入3倍体积的水。然后进行均质处理。
表16用于单剂量小鼠器官分布研究的常规两性霉素B注射剂和两性霉素B乳剂的剂量
组序号   组    剂量(mg/kg体重)
1   常规两性霉素B注射剂(5mg/ml)    1
2   两性霉素B乳剂(5mg/ml)    5
两性霉素B含量分析
向均浆中以3∶1比例加入甲醇。然后在13,000-14,000rpm下高速离心。再将上清液注入到两性霉素B分析HPLC柱中。统计分析：
为了比较治疗组，通过Student’s t-试验，分析获得的数据。结果和讨论
表17两种制剂器官分布参数
器官 参数     常规两性霉素B注射剂(1mg/kg)     乳剂(5mg/kg)
  肝 Cmax(mcg/g)     3.53     26.95
Tmax(hours)     1.0     24
T1/2(hours)     14.5     34.61
AUC(mcg-hr/ml)     79.97     1227.68
Cl(ml/hr)     12.51     4.07
  脾 Cmax(mcg/g)     2.02     29.3
Tmax(hours)     0.5     24
T1/2(hours)     48.98     -113.88*
AUC(mcg-hr/ml)     88.58     1836
Cl(ml/hr)     11.29     -2.72*
  肺 Cmax(mcg/g)     1.29     1.64
Tmax(hours)     2.0     4
T1/2(hours)     48.87     212.63
AUC(mcg-hr/ml)     89.69     510.93
Cl(ml/hr)     11.15     9.786
  肾 Cmax(mcg/g)     1.15     0.437
Tmax(hours)     0.5     4
T1/2(hours)     59.27     6.69
AUC(mcg-hr/ml)     75.45     0.632
Cl(ml/hr)     13.26     7911.39
*—表示两性霉素B在组织中聚集。
与常规两性霉素B注射剂相比，两性霉素B乳剂除了肾之外，在所有器官中的分布水平均高(参见图10a至10d)。乳剂较高的半衰期和较低的清除速率进一步支持了这一数据。器官摄入乳剂中的两性霉素B的水平高于常规两性霉素B注射剂，在脾的情况下，在统计学上是显著的(P＜0.05)。
肝脏毒性是与两性霉素B治疗相关的主要缺陷，并由于两性霉素B在肾脏中含量高。由AUC(0→∞)可以清楚地看出，与常规两性霉素B注射剂相比，乳剂达到了相当低的水平(P＜0.05)。再者，肾脏能够快速清除乳剂，所以与常规两性霉素B注射剂相比，毒性低、LD50值高。
尽管血浆浓度下降，但肝和脾的含量继续升高。据报道，脂质体也观测到了类似的结果，网状内皮组织中的脂质体药物与非脂质体药物的血浆不是自由平衡(Feilding，RM.，et al，1998)。这可能解释了与常规两性霉素B注射剂相比，乳剂情况下的网状内皮组织中的两性霉素B滞留高。X-B) 小鼠中重复剂量器官分布研究材料和方法
试验系统：从Bharat Serums & Vaccines Ltd(BSVL)动物房中取出重量为20-22gm瑞士雌性小白鼠，将其用作研究。随意地给动物提供标准的固型食物和AquaguardTM水。
试验材料：以大药丸剂量，静内服用由实施例I方法制得的两性霉素B乳剂(5mg/ml)。
对比材料：以大药丸剂量，静内服用常规两性霉素B注射剂(5mg/ml)。
研究设计：动物被分成两组(第一组和第二组)，每组24只。第一组接受剂量为1mg/kg的常规两性霉素B注射剂，第二组接受剂量为5mg/kg的两性霉素B乳剂。12只动物给药周期为7天，其它12只给药14天。最后给药后6小时解剖肝、肺、肾和脾。器官立即冷冻，阻止一切酶反应。称量器官，加入3倍体积的水。然后进行均质处理。
给药路线：静内。
表18用于单剂量小鼠器官分布研究的常规两性霉素B注射剂和两性霉素B乳剂的剂量
组序号 组   剂量(mg/kg体重)
1 常规两性霉素B注射剂(5mg/ml)   1
2 两性霉素B乳剂(5mg/ml)   5
两性霉素B含量分析
利用C-18柱，通过相HPLC方法，分析血浆中两性霉素B含量。利用HPLC级甲醇，血浆与甲醇比为1∶3，提取血浆中的两性霉素B。样品在3000rpm下离心，将上清液注射到柱中。统计分析：
为了比较治疗组，通过Student’s t-试验，分析获得的数据。结果和讨论
表19两种制剂器官分布参数
器官                              器官浓度(mcg/g)
          常规两性霉素B注射剂(1mg/kg)                    乳剂(5mg/kg)
    7天     14天     7天     14天
    肝     15.22±4.34     15.33±3.45     65.34±16.14     63.45±9.86
    脾     4.79±1.04     5.05±0.51     109.08±15.5     75.4±11.32
    肾     2.21±0.27     2.53±0.39     2.71±0.5     1.97±0.65
    肺     3.66±0.75     3.03±0.65     18.12±6.96     11.32±3.08
非常有趣地观察到，从第7次剂量到第14次剂量，组织浓度并没有实质性增加(参见图11a和11b)，这与文献报道相同(Olsen，SJ.et al，1991)。与此形成对照，尽管组织中两性霉素B含量升高，但在两性霉素B乳剂治疗组中，动物没有死亡。在研究过程中，常规两性霉素B注射剂确实显示出死亡。
由此可以看出，对于常规两性霉素B注射剂和乳剂，尽管肾脏毒性差别很大，但肾脏中两性霉素B含量相同。可能的原因在于存在于器官中的两性霉素B，不论其以类脂复合物形式存在，还是以游离药物形式存在。对于常规两性霉素B注射剂，两性霉素B主要以游离形式存在，因此具有肾脏毒性。但是，对于含类脂乳剂，两性霉素B以类脂复合物形式存在，该复合物对组织没有毒性。
作为两性药物的两性霉素B，以可溶性单体或以自身相互关联的低聚体，且在临界分子团浓度至上形成分子团。调节水介质中不同两性霉素B类型之间的平衡可改变其总体活性和毒性。Tabosa Do Egito(1996)认为两性霉素B乳剂起着单体形式两性霉素B的储罐作用。这种高稳定性的制剂仅有规则地释放有限量的游离两性霉素B单体。这种形式只可能与真菌细胞的麦角固醇结合，具有与哺乳动物细胞的胆固醇相互作用降低的功能(Tabosa Egito，et al，1996)。因此，尽管乳剂与常规两性霉素B注射剂含量类似，却没有严重的毒性。结论
制成两性霉素B乳剂的目的是：
1.改进安全性
2.使其具有成本效益
毒性研究表明，乳剂的安全界限确实比常规两性霉素B注射剂有所改进。这可能得益于乳剂本身以靶向真菌细胞的形式存在。常规两性霉素B注射剂大量地释放两性霉素B，由此释放的单体与形成低聚体有关，低聚体与哺乳动物细胞结合，导致严重毒性。相反地，由于迅速地被RES嗜菌细胞分解，乳剂在血浆中不可能达到如此高的浓度，因此显示出渐进释放单体。这就解释了乳剂对真菌细胞具有选择性作用且毒性低(Tabosa Egito，et al，1996)。对其靶向能力，低血浆含量及两性霉素B迅速地分布到器官中去也优于常规两性霉素B注射剂。再者，与其它含类脂的制剂(如类脂复合物&脂质体制剂)相比，两性霉素B乳剂是一种有成本效益的产品。
由此可见，本发明两性霉素B乳剂是治疗真菌感染的有前途的候补药物。
实施例XI
将实施例IV、实施例V和实施例VI制得的两性霉素B乳剂用于进行小鼠体内毒性研究。单剂量小鼠毒性研究材料和方法
试验系统：从Bharat Serums & Vaccines Ltd(BSVL)动物房中取出重量为20-22gm瑞士雌性小白鼠，将其用作研究。随意地给动物提供标准的固型食物和AquaguardTM水。
试验材料：以大药丸剂量，静内服用由实施例IV、实施例V和实施例VI制得的两性霉素B乳剂(5mg/ml)。
对比材料：以大药丸剂量，静内服用由实施例I方法制得的两性霉素B乳剂(5mg/ml)。
所有组通过静内路线接受注射。在72小时内，观察所有动物的任何临床毒性信号及死亡情况。对所有剂量计算死亡百分数。观察结果
接受是实例IV、实施例V和实施例VI制得的样品的组都显示出了心脏毒性征兆，如严重性呼吸困难、局部刺激、腹部痛苦和扰动。但这些毒性征兆在接受由实施例I方法制得的样品组中都没有观察到。
发明优点
根据本发明方法制备的用于非肠道给药的水包油型结构化乳剂两性霉素B大大降低了其毒性并可在不改变其抗真菌活性的条件下保证无菌性。
由本发明方法制备的掺入乳剂油相的两性霉素B在制备整个过程中保持了其稳定性，包括高压灭菌无菌化过程及其后的货架期或使用。
由本发明方法制得的结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物的平均液滴尺寸被控制在最大范围，从而使其在得到低血浆浓度的条件下优先分布于网状内皮系统。

Claims (15)

1.一种结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物，其在小鼠中的LD50至少为400mg/kg，该组合物包括
a)选自植物油，如豆油、蓖麻油、红花油的油相(最高30％w/v组合物)；
b)分散于油相中的两性霉素B(0.05％至1％w/v组合物)；
c)水相；
d)选自溶解于水中的化合物，如丙三醇、甘露醇、葡萄糖的张力调节剂；以及
e)分散于水相中的乳化剂，如天然磷脂(最高3％w/v组合物)。
2.根据权利要求1的结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物，其中油相为大约10％至20％w/v组合物。
3.根据权利要求1-2任一的结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物，其中使用的植物油为豆油。
4.根据权利要求3的结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物，其中豆油含量为大约20％w/v组合物。
5.根据权利要求1-4任一的结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物，其中两性霉素B含量为大约0.5％w/v组合物。
6.根据权利要求1-5任一的结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物，其中使用的天然磷脂为纯化卵磷脂。
7.根据权利要求6的结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物，其中纯化卵磷脂含量为大约1.2％w/v组合物。
8.根据权利要求1-7任一的结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物，其中使用的张力调节剂为丙三醇。
9.根据权利要求8的结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物，其中丙三醇含量为大约2.25％w/v组合物。
10.根据权利要求1-9任一的结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物，其中乳剂包括两性霉素B(0.5％w/v组合物)；油相为豆油(20％w/v组合物)；乳化剂为纯化卵磷脂(1.2％w/v组合物)；张力调节剂为丙三醇(2.25％w/v组合物)和水(适量至100％(组合物体积))。
11.制备权利要求1-10任一的结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物的方法，所述组合物在小鼠中的LD50至少为400mg/kg，该方法包括
i)将两性霉素B分散在油相中；
ii)将张力调节剂溶解在水相中；
iii)将乳化剂分散在水相中；
iv)调节水相pH至大约8-11；
v)在搅拌条件下，将油相加入到水相中，得到粗结构化乳剂；
vi)将粗结构化乳剂均质至粒径小于2微米；
vii)过滤，在氮气气氛下将均质过的结构化乳剂填充到玻璃容器中，关闭玻璃容器，封闭关闭的玻璃容器，并通过高压灭菌无菌化封闭的填充玻璃容器。
12.制备权利要求11的结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物的方法，其中油相或水相或两相在乳化过程中维持在最高温度75℃。
13.制备权利要求11-12任一的结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物的方法，其中加入氢氧化钠水溶液调节含卵磷脂乳化剂的水相的pH至8与11之间。
14.制备权利要求11-13任一的结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物的方法，该方法包括：将两性霉素B分散在豆油中；通过向水中加入丙三醇制备水相；接着将纯化卵磷脂分散在水相中；调节水相pH至10.8；在搅拌条件下，向水相中加入含有两性霉素B的豆油，得到粗的乳剂；均化粗的乳剂至粒径低于2微米；通过2微米过滤膜过滤，在氮气气氛下加入到玻璃容器中，关闭玻璃容器，封闭关闭的玻璃容器，通过高压灭菌对封闭的填充容器进行无菌化处理。
15.由权利要求11-14的任一方法制得的结构化乳剂形式的包覆油的两性霉素B非肠道组合物的方法，权利要求1-10的任一组合物在小鼠中的LD50至少为400mg/kg。
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