CN1241548C - 稳定的蛋白质∶磷脂组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及稳定的蛋白质组合物和有关方法，其中能转变成熔融球形状态的蛋白质与带负电荷的脂泡囊接触，从而稳定蛋白质抵抗热诱导的凝集、变性和失活。蛋白质：磷脂复合物直接稳定蛋白质的二级和三级结构，且该组合物在高温配制和在新传递载体中有用。
Description
本发明的背景
本发明涉及对稳定能转变成熔融球形状态的蛋白质之二级和三级结构有用的蛋白质∶磷脂结构。更具体地说，本发明涉及具有稳定性增强，表现出贮藏寿命延长并能用于高温配制及作为新传递载体的G-CSF∶磷脂和MGDF∶磷脂组合物。
一些蛋白质显示出转变成熔融的球形状态(MGS)。Van derGoot，F.G.，Nature
354，408-410(1991)。熔融的球形状态的蛋白质表现出的二级结构可比得上天然蛋白质且它们缺乏刚性的三级结构。Pitsyn等，FEBS Letters
262：1，20-24(1990)。在某些情况下，转变成这一状态伴随着将以前隐蔽的蛋白质疏水区域暴露出来。经过暴露关键的疏水残基，MGS可以是蛋白质聚集和沉淀的中间体。经过比较远紫外区的园二色性与芳香族侧链的光谱(近紫外圆二色性和荧光)可检测MGS的构象。熔融的球形状态在缺乏远紫外圆二色性变化时表现出芳香族基团光谱变化，Bychkova等，FEBS.Letters
238：231-234(1988)，并可能涉及一些蛋白质的膜穿透，Bychkova等，FEBSLetters
238：231-234(1988)；Van der Goot，F.G.，Nature
354，408-410(1991)。
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种已知的在聚集前转变成MGS的蛋白质。人重组体G-CSF选择性地刺激中性白细胞，一种用于抗感染的白血细胞。通常，Filgrastim(一种重组G-CSF)可用于治疗用途。已广泛研究了G-CSF在各种条件下的结构；Lu等，J.Biol.Chem.Vol.
267，8770-8777(1992)。由于其疏水特征，G-CSF难以配成具有延长的贮藏寿命。某些疏水蛋白质的配制品由于在长期贮存形成二聚体和更高级的聚合体(大范围)而失去活性。其它的化学变化，如脱酰胺作用和氧化作用可在贮存时发生。另外，应保护G-CSF配制品不变性，特别是注意维持蛋白质二级和三级结构的稳定性。
人GM-CSF是体外巨噬细胞和粒细胞祖先细胞增生所连续需要的一种22KDa的糖蛋白。它还控制着这些祖先细胞的不可逆定型以形成粒细胞和巨噬细胞。其它生物学活性可包括成熟细胞类型的功能活性的调节；Gough等，Nature，
309，763-767(1984)，增加对识别的化学引诱物的趋化性；Williams等，Hematology，4th.ed.(1990)。GM-CSF还刺激单核细胞的生产，从而在治疗单核细胞紊乱(如单核细胞减小症)中有用。
可从许多来源获得和纯化人GM-CSF。以前已描述了重组人GM-CSF的生产方法，Burgess等，Blood，
69：1，43-51(1987)。美国专利5,047,504(Boone)(本文引用以供参考)实现了以原核宿主细胞表达以生产非糖基化形式商用批量的GM-CSF。
MGDF或巨核细胞生长和分化因子是最近克隆的细胞因子，它似乎是循环血小板水平的主要调节物。见Bartley，T.D.等，Cell 77：1117-1124(1994)；Lok，S.等，Nature
369：565-568(1994)；deSauvage.F.J.等，Nature
369：533-538(1994)；Miyazake，H.等，Exp.Hematol.
22：838(1994)；和Kuter，D.J.等，PNAS USA，
91：11104-11108(1994)。MGDF也称为血小板生成素(TPO)，mpl-配体和巨核细胞生成素。成熟的人MGDF是总共具有332个氨基酸的蛋白质。该蛋白质和相应的cDNA序列在本文图29中表示。
在中国仓鼠卵巢(CHO)和大肠杆菌细胞中产生的重组MGDF在小鼠，大鼠和猴体内具有特异性地刺激或增加巨核细胞和/或血小板的生物活性。见例如：Hunt.P.等，Blood
84(10)：390A(1994)。在图29中从1位氨基酸起延伸到至少151个氨基酸的被截短的人MGDF分子保留体内生物学活性。还可能到达人序列MGDF蛋白质N末端的前6个氨基酸并保留生物活性。因此，似乎在图29中所示的人MGDF成熟氨基酸序列的氨基酸7到151(包括)内保留生物学活性。
天然存在的MGDF是糖基化的分子。天然MGDF的糖基化方式涉及在MGDF中发现的两个关键区域。人MGDF的大约前151个氨基酸的序列(与该分子的活性部分相对应)与红细胞生成素(EPO)具有显著的同源性(EPO是一种能刺激红细胞生产的细胞因子)并称为人MGDF的“类EPO”区域。成熟蛋白质的剩余氨基酸构成所谓的“N-连接的碳水化合物”区，因为它们包括大多数(如果不是全部)N-连接糖基化的位点。在人MGDF中，有6个N-连接的糖基化位点，均包含在N连接的糖基化区域。两个区域都含O-连接的糖基化位点。在该分子中有一个估计的12-14O-连接的糖基化链。在CHO细胞中经重组表达的人MGDF DNA的实验证据表明在类EPO区域至少有2个O-连接的位点是糖基化的，在位置1(Ser)和37(Thr)。
尽管诸如G-CSF和MGDF的蛋白质在某些限定的条件下是稳定的，但仍存在对经过稳定蛋白质的二级和三级结构而延长它们和其它蛋白质贮藏寿命的需要。过去尝试研究这类蛋白质的一种方法是使用脂质体。脂质体是完全封闭的脂双层膜，由水溶性极性脂类，特别是磷脂形成。脂质体泡囊可具有单个膜双层(单层)或可具有多个膜双层(多层)。双层由2层脂单层组成，具有亲水(极性)“头”区和疏水(非极性)“尾”区，其中疏水尾指向双层的中央，而亲水头部指向水相。脂质体的稳定性，刚性和可通透性可经过改变磷脂组成，改变温度，包含固醇，或掺入带电的两亲化合物来改变。脂质体的基本结构可经过本领域已知的各种技术来制备。
在其形成过程中，脂质体可在含水通路中诱捕水溶解物并以可变速率释放它们。基于脂质体可将酶导入细胞并改变其代谢的发现(Gregoriadis，New Engl.J.Med.
295，704-710，765-770(1976)，预示脂质体可用于定向药物传递。结果，在制药工业中涉及使用脂质体作为药品的缓释贮存物的研究有大量发展，包括将维生素和蛋白质封闭在疏水层或脂质体的疏水核心中。
成功地将脂质体作为药物载体受到限制，因为尝试这种用途的研究者碰到了一些困难。例如，已知脂质体充当包埋抗原的有效的免疫佐剂，当异源性酶或其它蛋白质包埋于脂质体中时必须小心。另外，药品的扩散速率难以控制。这是因为脂质体的内在不稳定性和存在加速某些药品扩散的某些血液成份。而且根据其性质，一些物质在脂质体中包埋较差，因此在循环中迅速扩散。最后，定向肝脏和脾脏之外的其它细胞和器官中存在问题。关于脂质体，掺入脂质体的物质，和与使用脂质体作为药物载体有关的问题的较好的综述是Gregory Gregoriaidis的“脂质体”，见用于生物和医学的药物载体14章，287-341(Academic Press，N.Y，1979)。
尽管关于尝试使用脂质体作为药物载体的报道有许多，但关于使用脂质体以达到经过稳定肽和/或蛋白质的结构而增加治疗性肽或蛋白质的贮藏寿命之目的公开很少。在题目为“治疗性肽和蛋白质”的PCT/US90/05163中，Hostetler等公开了使用空脂质体作为药用上可接受的稀释剂来溶解多肽和/或蛋白质以便防止多肽和/或蛋白质在空气/水界面积累并防止多肽和/或蛋白质吸附到容器表面。Hostetler等公开了以大约50摩尔百分比加入带负电的磷脂且磷脂酰胆碱(一种中性磷脂)是优选的脂质体。Hostetler等未公开显示出稳定多肽和/或蛋白质结构的稀释剂。
在题目为“肿瘤坏死因子之脂质体配制品的制备和鉴定”的PCT/US91/07694中，Hung等描述了与表面相联系的或包埋于脂质体内的亲脂修饰的肿瘤坏死因子(TNF)分子。报道了脂质体的亲脂TNF分子增强了体内稳定性。稳定性指TNF脂质体释放进体内系统的TNF减少或有减少倾向。优选的脂质体是中性脂质体。Hung等未公开其中赋形剂对蛋白质结构具有稳定效应的TNF组合物。
从文献中不能推断将蛋白质(例如G-CSF或MGDF)与带负电的脂泡囊接触就能直接稳定蛋白质抵抗热诱导聚集，变性，失活和二级结构的去折叠。存在对提供在需要高温(例如将G-CSF和/或MGDF掺入聚合物)以及用作新传递载体(例如，PFG化的G-CSF的口服用药)的配制方法中有用之优点的这类组合物的需要。本发明提供了这类组合物。
发明概述
本发明涉及向在熔融球形状态条件下的蛋白质中加入疏水赋形剂，例如，溶血磷脂或其它脂质体以便稳定蛋白质的二级和三级结构，从而保护蛋白质抵抗热诱导的聚集，变性和失活。特别是，本发明涉及稳定的G-CSF∶磷脂和MGDF∶磷脂组合物。令人惊奇的是，优选的GCSF∶磷脂和MDGF∶磷脂组合物在10-95℃之间可循环几次，且冷却时蛋白质二级结构完全恢复。该组合物在需要高温的配制方法中以及用作新传递载体中有用。另外，该组合物与单独的蛋白质相比表现出贮藏寿命延长，且蛋白质与磷脂泡囊的相互作用阻止了蛋白质吸附到玻璃瓶上。
在优选的实施方案中，蛋白质∶磷脂复合物包含带负电的脂质体，它选自：二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，卵磷脂酰甘油，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，卵磷脂酰乙醇胺，二油酰磷脂酸(DOPA)，二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)，二棕榈酰磷脂酸(DPPA)，二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)，二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)，二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)，卵磷脂酰丝氨酸，溶血磷脂酰甘油，溶血磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰丝氨酸。DOPG，一种带负电的不饱和磷脂是特别优选的。本发明进一步包含维持在3.0-7.5范围内的pH，且脂∶蛋白质比为至少10∶1。
提供本发明优选的实施方案的其它成份包括使用在蛋白质∶磷脂复合物中的化学修饰的蛋白质以及使用下面一种或多种物质：等渗性调节剂，缓冲剂，pH调节剂。本领域的技术人员应明白，本发明包含具有这些额外成份之各种组合的稳定的蛋白质∶磷脂组合物。
附图简述
图1描绘了在存在(曲线1)和缺乏(曲线2)DOPG泡囊的条件下rhG-CSF的荧光发射光谱。rhG-CSF浓度是0.2mg/ml。DOPG∶rhG-CSF比(曲线1)是100∶1(摩尔∶摩尔)。
图2显示了增加脂∶蛋白质比对rhG-CSF荧光的影响。Fo是起始荧光(无脂)，F指加入脂达到显示的脂∶rhG-CSF摩尔比后的荧光。图2(a)显示了F/Fo(■)和DOPG∶rhG-CSF混合物的最大发射波长(△)。图2(b)显示F/Fo(■)和DOPC∶rhG-CSF混合物的最大发射波长(△)。
图3显示了在缺乏(●)和存在(○)DOPG泡囊时，经KI对rhG-CSF荧光猝灭的Stern-Volmer样方图。猝灭实验经过向rhG-CSF(0.2mg/ml)和DOPG∶rhG-CSF(100∶1摩尔)加入KI的等分试样进行。
图4描绘了加入芘癸酸时rhG-CSF色氨酸荧光猝灭。发射波长为327nm。DOPG∶rhG-CSF比为100∶1(摩尔)。
图5显示了在缺乏和存在各种脂时rhG-CSF的F强度变化的比较。在每种情况下，脂∶蛋白质比为100∶1(摩尔)。
图6显示了在缺乏和存在各种脂时rhG-CSF发射最大值变化的比较。在每种情况下，脂∶蛋白质比为100∶1(摩尔)。
图7显示了DMPC(曲线2)，DMPG(曲线3)，DMPA(曲线4)对rhG-CSF CD(曲线1)的影响，在每种情况下，在pH6.0的水中脂∶蛋白质比为50∶1(摩尔)。
图8显示了增加温度对rhG-CSF(曲线1)或DOPG∶rhG-CSF(140∶1摩尔)(曲线2)CD的影响。在pH6.0的水中rhG-CSF浓度是80μg/ml。温度以100℃/小时的速率在10-90℃间变化。
图9显示了rhG-CSF(曲线1)和DOPG∶rhG-CSF(45∶1摩尔)(曲线2)的不同扫描量热法的温谱图。样品中rhG-CSF的浓度是1mg/ml(pH7.0的水中)。扫描速率为90℃/小时。
图10显示了温度循环对rhG-CSF(曲线1)和DOPG∶rhG-CSF(140∶1摩尔)(曲线2)CD的影响。如箭头所示，样品迅速加热到95℃并冷却到10℃。样品中rhG-CSF浓度是80μg/ml，pH6.0。
图11显示了温度循环对rhG-CSF(曲线1)和DMPG∶rhG-CSF(150∶1摩尔)(曲线2)CD的影响。样品加热到95℃并冷却到10℃。样品中rhG-CSF浓度是80μg/ml，pH6.0。
图12显示了温度循环对rhG-CSF(曲线1)和DPPG∶rhG-CSF(150∶1摩尔)(曲线2)CD的影响。样品加热到95℃并冷却到10℃。样品中rhG-CSF浓度为80μg/ml，pH6.0。
图13显示了各种脂在冷冻干燥过程中稳定rhG-CSF的能力。在每种情况下脂∶蛋白质比为100∶1。稳定性是根据在骨髓试验中体外活性的保留。rhG-CSF单独不能在冷冻干燥过程后存活，因此使用的对照是缺乏脂的未处理的rhG-CSF。
图14显示了各种脂对rhG-CSF体内活性的影响。仓鼠经皮下注射后测定活性(WBC值)。具有100∶1脂∶蛋白质比的rhG-CSF剂量为100μg/kg。
图15显示了各种脂对rhG-CSF体内活性的影响。仓鼠皮下注射后测量活性(WBC值)。具有50∶1脂∶蛋白质比的rhG-CSF剂量是100μg/kg。
图16显示了在各种pH下在缺乏和存在DOPG时CHO-G-CSF的F强度变化的比较。在每种情况下，脂∶蛋白质比例为100∶1(摩尔)。
图17是显示在各种pH值下在缺乏和存在DOPG时CHO-G-CSF发射最大值的变化的比较。在每种情况下，脂∶蛋白质比为100∶1(摩尔)。
图18显示温度循环对PEG-G-CSF(-)和DMPG∶PEG-G-CSF(17∶1摩尔)(---)CD的影响。样品加热到90℃并冷却到10℃。
图19显示：(a)温度循环对PBS，pH7.0中GM-CSF的CD的影响。在10℃的GM-CSF(-)与加热到90℃再冷却到10℃的GM-CSF(---)进行比较；(b)温度循环对DPPG∶PEG-G-CSF(17∶1摩尔)CD的影响。在10℃时DPPG∶GM-CSF(-)与加热到90℃再冷却到10℃的DPPG∶GM-CSF(---)进行比较。
图20显示：(a)在缺乏和存在DOPG时反应rhG-CSF十二指肠内灌注的总WBC结果。rhG-CSF剂量是750μg/kg，脂∶蛋白质比为100∶1；(b)反应在缺乏和存在DOPG时PEG-G-CSF的十二指肠内灌注的总WBC结果。PEG-G-CSF剂量是750μg/kg，脂∶蛋白质比率是100∶1。
图21显示十二指肠内泵灌注后DOPG对PEG-G-CSF血清水平的影响。PEG-G-CSF剂量为750μg/kg，脂∶蛋白质比率是100∶1。
图22描绘了在存在和缺乏DMPG泡囊时MGDF的荧光发射光谱。MGDF浓度为0.1mg/ml。MGDF是来自大肠杆菌的MGDF 1-163。DMPG∶MGDF比率是100∶1(摩尔∶摩尔)。
图23显示了增加脂∶蛋白质比率对MGDF荧光的影响。MGDF是来自大肠杆菌的MGDF 1-163。描绘了在pH5.0(-○-)和pH7.0(-●-)时DMPG∶MGDF混合物的最大发射波长。
图24显示了在缺乏(○)和存在(●)DMPG泡囊时KI的MGDF荧光猝灭的Stem-Volmer样方图。MGDF是来自大肠杆菌的MGDF 1-163。经过向MDGF(0.1mg/ml)和DMPG∶MGDF(100∶1摩尔)中加入KI的等份试样进行猝灭实验。
图25显示了温度循环对MGDF(O)和DMPG∶MGDF(100∶1摩尔)(●)CD的影响。MGDF是来自大肠杆菌的MGDF 1-163。剩余的螺旋性％指每循环后在10℃检测的CD量(一个循环＝样品迅速加热到95℃并冷却到10℃)。
图26显示了在存在各种浓度的尿素时MGDF(±DMPG)的变性程度。MGDF(-○-)和DMPG∶MGDF(-●-)的圆二色性被出示并描绘了MGDF(-□-)和DMPG∶MGDF(-■-)荧光发射最大值。MGDF是来自大肠杆菌的MGDF 1-163。DMPG∶MGDF比率是100∶1(摩尔∶摩尔)。
图27表示MGDF(±DMPG)和PEG-MGDF(±DMPG)的荧光发射最大值。MGDF是来自大肠杆菌的MGDF 1-163，PEG-MGDF是单PEG化的来自大肠杆菌的MGDF 1-163。DMPG∶MGDF和DMPG∶PEG-MGDF比是100∶1(摩尔∶摩尔)。
图28显示在各种PEG-MGDF浓度下PEG-MGDF(±DMPG)吸附到玻璃瓶上的程度。MGDF是来自大肠杆菌的MGDF 1-163。PEG-MGDF是来自大肠杆菌的单PEG化的MGDF 1-163。经过计算室温培养18小时后从玻璃瓶上可回收的放射标记的MGDF量测定PEG-MGDF(-□-)和DMPG∶PEG-MGDF(-○-)的回收率％。
图29显示包括信号肽(氨基酸-21到-1)和成熟氨基酸序列(1-332)的人MGDF的DNA和氨基酸序列(SEQ ID NOs：1和2)。
图30显示了在N端残基的α-氨基上点特异性MGDF还原性烷基化的例子，使用单-甲氧基-聚乙二醇醛产生基本上单PEG化的产物。
图31显示了在正常小鼠中对血小板数的DMPG∶MGDF和DMPG∶PEG-MGDF的体内活性。MGDF是来自大肠杆菌的MGDF 1-163，PEG-MGDF是单PEG化的来自大肠杆菌的MGDF 1-163。DMPG∶MGDF和DMPG∶PEG-MGDF剂量是100μg/kg和300μg/kg，脂∶蛋白质比是100∶1。
详细描述
本发明的组合物在随后的讨论中更详细地描述并由下面提供的实施例说明。实施例显示了本发明的各个方面并且包括试验各种蛋白质∶磷脂组合物的稳定性和生物活性结果。令人惊奇的是，蛋白质与脂泡囊的相互作用直接稳定该蛋白质的蛋白质结构，从而甚至在缺乏脂时导致蛋白质变性的条件下对蛋白质产生稳定效应。
本文还描述了化学修饰的G-CSF∶磷脂组合物的口服用药，其中使用连接有聚乙二醇分子的G-CSF(如上所述)。
预期能转变成溶融球形状态的各种蛋白质可用于本发明的实践中。预期的蛋白质例子是细胞因子，包括各种血细胞生成因子，如前述的G-CSF，GM-CSF，MGDF，M-CSF，干扰素(α、β和γ)，白细胞介素(1-11)，红细胞生成素(EPO)，成纤维细胞生长因子，干细胞因子，神经生长因子，BDNF，NT3，来自血小板的生长因子，和肿瘤生长因子(α，β)。可评价其它蛋白质转变成MGS的能力。如果所述蛋白质能转变成MGS，那么所述蛋白质可与带负电的脂质体泡囊接触并评价其稳定效果。
一般来说，在本发明实践中有用的G-CSF可以是从哺乳动物生物体分离的纯的天然形式或作为选择，可以是化学合成方法的产物或是原核或真核宿主表达经基因组成cDNA克隆或经基因合成获得的外源性DNA序列的产物。合适的原核宿主包括各种细菌(例如，大肠杆菌)细胞。合适的真核宿主包括酵母(例如，啤酒糖酵母)和哺乳动物(例如，中国仓鼠卵巢，猴)细胞。取决于所用的宿主，G-CSF表达产物可用哺乳动物的或其它真核细胞的碳水化合物糖基化，或可以是非糖基化的。本发明预期使用任意和全部G-CSF的这类形式，尽管优选重组G-CSF，特别是来自大肠杆菌的，因为其商业实用性最大。
用于本发明的化学修饰的G-CSF可以是天然的人G-CSF(nhG-CSF)或重组核酸过程的产物，如原核或真核宿主细胞表达。一般来说，预期的化学修饰是将化学基团连接到G-CSF分子本身上。描述蛋白质修饰和融合蛋白质的综述是Francis，生长因子聚焦
3：4-10(May1992)(由Mediscript，Mountview Court，Friern Barnet Lane，London N20OLD，UK出版)。例如见题目为“化学修饰的粒细胞集落刺激因子”的EP 0 401 384，它描述了制备连接有聚乙二醇分子的G-CSF的材料和方法。连接可以是经过接合，直接结合到蛋白质上或充当连接活性试剂的桥上。化学修饰可用于控制，维持或延长G-CSF的效力。这可以具有诸如控制化学修饰的G-CSF到达循环所用的时间总量之效力。化学修饰剂的例子是聚乙二醇组合物，包括其衍生物。
任何在用药时有效的化学修饰的G-CSF制品预期可用于本发明的实践中，可用已知方法测定其效力，本领域的技术人员将认识到这点。优选PEG化的G-CSF，特别是PEG化的来自大肠杆菌的G-CSF，更具体地说，三至四个PEG化的来自大肠杆菌的G-CSF。
已报道在酸性条件下G-CSF是最稳定的，尽管在pH2.5-5.0的范围内，会发生涉及三级结构变松和α-螺旋含量增加的构象变化。Narhi等，蛋白质化学杂志，
10，359-367，(1991)。这种构象变化是熔融球形状态(MGS)的特征。因此，由于用能转变成MGS的其它蛋白质进行配制时会出现这种情况，所以用G-CSF进行配制时应保护其抵抗热诱导的二级和三级结构的去折叠以防止聚集和变性。
在本发明中有用的GM-CSF可以是从哺乳动物生物体中分离的纯的天然形式或原核或真核宿主表达经基因组或cDNA克隆或经基因合成获得的外源性DNA序列的产物。合适的原核宿主包括各种细菌(例如，大肠杆菌)细胞。合适的真核宿主包括酵母(例如，啤酒糖酵母)和哺乳动物(例如，中国仓鼠卵巢，猴)细胞。取决于所用的宿主，GM-CSF表达产物可以是用哺乳动物或其它真核生物碳水化合物糖基化的，或者可以是非糖基化的。本发明预期使用GM-CSF的任何和全部这类形式，尽管优选重组GM-CSF，特别是来自大肠杆菌的，因为其商业实用性最大。
本文使用的术语“MGDF”包括天然存在的MGDF，天然存在的MGDF的截短形式以及具有以重复天然存在的MGDF的氨基酸序列和糖基化以使其具有特异性地刺激巨核细胞和/或血小板生长，发育和/或生产之生物学活性的非天然存在的多肽。
在优选的实施方案中，MGDF是被转染进真核或原核宿主细胞中的外源性DNA序列的表达产物，这就是说，在优选的实施方案中，MGDF是“重组MGDF”。优选的真核宿主是哺乳动物，特别优选CHO细胞，优选的原核宿主是细菌，特别优选大肠杆菌。根据本文描述的方法和本文在MGDF克隆和表达方面引证的文献中的方法可具优势地产生重组MGDF。
根据本文图29，一些其它优选的MGDF分子具有下列氨基酸序列：
MGDF 1-332 图29的氨基酸1-332
MGDF 1-191 图29的氨基酸1-191
MGDF 1-183 图29的氨基酸1-183
MGDF 1-174 图29的氨基酸1-174
MGDF 1-163 图29的氨基酸1-163
MGDF 1-153 图29的氨基酸1-153
MGDF 1-152 图29的氨基酸1-152
MGDF 1-151 图29的氨基酸1-151
MGDF 7-332 图29的氨基酸7-332
MGDF 7-191 图29的氨基酸7-191
MGDF 7-183 图29的氨基酸7-183
MGDF 7-174 图29的氨基酸7-174
MGDF 7-163 图29的氨基酸7-163
MGDF 7-153 图29的氨基酸7-153
MGDF 7-152 图29的氨基酸7-152
MGDF 7-151 图29的氨基酸7-151
在上面每种情况下，在其N末端还可包括Met-Lys。
还可预期MGDF的各种类似物可用于本发明。本文所用的短语“MGDF的类似物”指MGDF在氨基酸序列中具有一个或多个改变导致碳水化合物连接位点的类型(N或O-连接)，数目或位置改变。MGDF类似物与天然序列MGDF(例如人MGDF)相比至少保留相当的生物学活性并且在生物学活性试验中测定时可具有基本上更高的活性。所得的类似物比天然的人/重组MGDF具有更少或更多(优选更多)的碳水化合物链。
本发明的类似物还包括具有从MGDF羧基端延伸的一个或多个氨基酸的类似物，其中羧基端延伸提供了至少一个额外的碳水化合物位点。MGDF的羧基末端可根据所用的MGDF的特定形式(例如，MGDF 1-332氨基酸，或MGDF 1-163氨基酸)而变化。经过向羧基末端增加氨基酸可将额外的碳水化合物位点加到MGDF种类的羧基末端，所加的这种氨基酸含有一个或多个N-或O-连接的糖基化位点。
本发明还广泛地包括化学修饰的MGDF组合物。一般来说，预期的化学修饰物是一种MGDF产物，其中所说的MGDF蛋白质与至少一个聚乙二醇分子连接(即，PEG化的MGDF)。MGDF的PEG化可用本领域已知的任意PEG化反应实现。例如，见Focus on Growth Factors 3(2)：4-10(1992)；EP 0 154 316；EP 0 401 384；本文引用的涉及PEG化的其它文献。优选的是，经过与反应性聚乙二醇分子(或反应性水溶性聚合物类似物)的酰化反应或烷基化反应实现PEG化。
经过酰基化的PEG化一般涉及将聚乙二醇(PEG)的活性酯衍生物与MGDF蛋白质反应。任何已知的或随后公开的反应性PEG分子可用于实现MGDF的PEG化。优选的激活的PEG酯是PEG酯化的N-羟基琥珀亚胺(“NHS”)。本文所用的“酰化”预期包括非限制性的MGDF与水溶性聚合物间的下列类型的键，如PEG∶酰胺，氨基甲酸酯，氨基甲酸乙酯和类似物。见Bioconjugate Chem
5：133-140(1994)。反应条件可从PEG化领域已知的任意条件或随后形成的条件中选择，但应避免诸如温度，溶剂和pH会使将要修饰的MGDF种类失活的条件。
经酰基化的PEG化一般导致产生多PEG化的MGDF产物。其中，赖氨酸的ε-氨基经乙酰连接基团PEG化。优选的是连接键是酰胺。还优选所得的产物基本上仅仅(例如≥95％)单个，二个或三个PEG化。然而，取决于所用的特定反应条件，一般会以一定量形成具有更高PEG化程度的一些种类(多达MGDF赖氨酸ε-氨基加上MGDF氨基末端α-氨基的最大数)。如果需要，可用标准纯化技术，包括透析，盐析，超滤，离子交换色谱，凝胶过滤色谱和电泳及其它从混合物，特别是未反应的种类中分离出更纯化的PEG化种类。
用烷基进行PEG化一般涉及在还原剂存在下将PEG末端醛衍生物与诸如MGDF的蛋白质反应。经过烷基化的PEG化也可产生多PEG化的MGDF。另外，可按本文所述利于基本上仅在MGDF种类N端α-氨基上PEG化(即单PEG化的种类)的反应条件下操作。与MGDF发生还原性烷基化反应产生单PEG化产物的例子在图30中表示。在单个PEG化或多个PEG化的每种情况下，PEG基团优选经过-CH2-NH基团连接到蛋白质上。特别对于-CH2-基团，这类键本文称为“烷基”键。
经还原性烷基化修饰产生单PEG化产物利用了可得到的一价氨基(赖氨酸对N-末端)的不同类型的不同反应性用于MGDF修饰。在允许利用蛋白质赖氨酸残基ε-氨基和N-端残基α-氨基pKa之间差异的pH(见下面)下进行反应。经过这种选择性修饰，可控制含有诸如醛基的反应性基团的水溶性聚合物连接到蛋白质上，所发生的与聚合物的连接在蛋白质的N端是优选，其它反应性基团，如赖氨酸侧链氨基不发生明显修饰。
因此，在一个优选的方面，本发明涉及PEG化的MGDF，其中PEG基团经酰基或烷基基团连接。如上面所讨论的，这种产品可以是单PEG化的或多个PEG化的(例如，含2-6个，优选2-5个PEG基团)。PEG基团一般在氨基酸的α或ε氨基上连接到蛋白质上，但也预期PEG基团可连接到连接于蛋白质上的任意氨基基团上，该基因在合适的反应条件下是以发生反应并连接到PEG基团上。
用于酰化和烷基化研究的聚合物分子可选自水溶性聚合物或其混合物。选择的聚合物应是水溶性的以便其所连接的蛋白质在含水环境(如生理环境)中不沉淀。选择的聚合物应修饰成具有单个反应基团，如优选的是用于酰化的活性酯或用于烷基化的醛，以便可以按本方法所提供的控制聚合程度。优选的反应性PEG醛是聚乙二醇丙醛，它是水稳定的，或其单个C1-C10烷氧或芳氧衍生物(见美国专利5,252,714)。聚合物可以是分枝的或不分枝的。例如，该水溶性聚合物选自聚乙二醇，单甲氧基聚乙二醇，右旋糖，聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇。对于酰基化反应，所选择的聚合物应该含有单个的反应酯基基团。对于本文的还原烷基，该聚合物应该含有单个反应性醛基。一般来说，该水溶性聚合物不选自天然产生的糖基化残基，因为它们通常可更方便地由哺乳动物重组体表达系统产生。聚合物可以是分枝的或不分枝，并可以是任意分子量的。
本文使用的特别优选的水溶性聚合物是聚乙二醇，缩写为PEG。本文所用的聚乙二醇指包含用于修饰其它蛋白质的PEG的任何形式，如单个(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇。制备PEG化的MGDF的方法一般包含步骤：(a)在MGDF变成连接于一个或多个PEG基团的条件下将MGDF多肽与聚乙二醇(如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应，(b)获得反应产物。一般来说，酰化反应的最适反应条件根据已知参数和所需结果逐例测定。例如，PEG∶蛋白质的比例越大，多PEG产物的百分含量越大。
另一重要的方面是聚合物的分子量。一般来说，聚合物的分子量越高，可连接于蛋白质上的聚合物分子的数目越少。同样地，当优化这些参数时应考虑聚合物的分枝。一般来说，分子量越高(或分枝越多)，聚合物∶蛋白质的比例就越高。一般来说，对于本文预期的PEG化反应，优选的平均分子量是大约2KDa到大约100KDa(术语“大约”指±1KDa)。优选的平均分子量是大约5KDa到大约50KDa，特别优选大约12KDa到大约25KDa，最优选20KDa。水溶性聚合物与MGDF蛋白质的比率一般范围为从1∶1到100∶1，优选(对于多个PEG化)1∶1到20∶1和(对于单PEG化)1∶1到5∶1。
使用上面所述的条件，提供还原性烷基化将聚合物选择性地连接到在氨基末端具有α-氨基的任意MGDF蛋白质上，并提供单聚体/MGDF蛋白质连接物基本上均一的制品。术语“单个聚合物/MGDF蛋白质连接物”这里用于指包含单个聚合物分子连接到MGDF蛋白质分子上的组合物。单个聚合物/MGDF蛋白质连接物优选具有位于N端的聚合物分子，而不是在赖氨酸氨基侧连基团上。该制品优选大于90％的单个聚合物/MGDF蛋白质连接物，更优选大于95％的单个聚合物MGDF蛋白质连接物，余下的可观察的分子未反应(即，缺乏聚合物部分的蛋白质)。下面提供了至少大约90％单个聚合物/蛋白质连接物和大约10％未反应的蛋白质之制品的实施例。单个聚合物/蛋白质连接物具有生物学活性。
在本发明的组合物中有用的脂泡囊是那些带负电的能与所述蛋白质作用的脂质体。预期使用的特定脂质体包括二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，卵磷脂酰甘油，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，卵磷脂酰乙醇胺，二油酰磷脂酸(DOPA)，二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)，二棕榈酰磷脂酸(DPPA)，二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)，二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)，二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)，卵磷脂酰丝氨酸，溶血磷脂酰甘油，溶血磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰丝氨酸。取决于所用的特定脂质体，脂质体的量可以变化。
蛋白质∶磷脂组合物优选包括将溶液pH维持在所需范围内的缓冲剂。优选的试剂包括乙酸钠，磷酸钠，和柠檬酸钠。也可使用这些缓冲剂的混合物。在组合物中有用的缓冲剂的量在很大程度上取决于所用的特定的缓冲液和溶液的pH。例如，乙酸在pH5时比在pH6时是更有效的缓冲液，因此，在pH5时比在pH6的溶液中使用的乙酸要少。本发明的组合物优选的pH范围是pH3.0-7.5。
本发明的组合物可进一步包括一种等渗性调节剂以产生等渗溶液和更适合于注射。最优选的试剂是在0-150mM浓度范围内的氯化钠。
本发明还包含药用组合物，它含有本发明有效量的多肽产物以及药用上可接受的稀释剂，防腐剂，增溶剂，乳化剂，佐剂和/或载体。这类组合物会影响蛋白质的物理状态，稳定性，和生物可用性。例如见Pemingtons Pharmaceutical Sciences，18th Edition，1435-1712(Mack Pulishing Co.Easton，PA.，1990)，本文引用以供参考。在具体情况下有效量蛋白质的组成取决于技术人员应考虑的各种因素，包括所需的治疗结果，所治疗的症状或疾病的严重性，病人的身体状态等等。
在涉及大肠杆菌来源的rhG-CSF的优选的实施方案中，所用的脂质体泡囊是具有pH4.5，含10mM乙酸钠，DOPG∶G-CSF为50∶1的DOPG。
在涉及来源于大肠杆菌的rhGM-CSF的优选实施方案中，使用的脂质体泡囊是具有在pH7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的DMPG∶GM-CSF为17∶1的DMPG。
在涉及来源于大肠杆菌的rhG-CSF的优选实施方案中，rhG-CSF已经过了化学修饰(PEG化)，是三至四个PEG化，所用的脂质体泡囊是具有pH4.5，DMPG∶PEG-G-CSF为17∶1的DMPG。
在涉及大肠杆菌来源的MGDF 1-163的优选实施方案中，所用的脂质体泡囊是在pH5.0的10mM乙酸钠5％山梨醇中具有DMPG∶MGDF为100∶1的DMPG。
在涉及来源于大肠杆菌的已被化学修饰(PEG化)的MGDF 1-163的优选实施方案中，MGDF是经还原性烷基化被单PEG化(20KD)，所用的脂质体泡囊是在pH5.0的10mM乙酸钠5％山梨醇中的具有MDPG∶MGDF为100∶1的DMPG。
在涉及来源于CHO的MGDF 1-332的优选实施例中，使用的脂质体泡囊是在pH5.0的10mM乙酸钠5％山梨醇中的具有DMPG∶MGDF为100∶1的DMPG。
尽管本发明描述和说明了具体的蛋白质∶脂组合物和治疗方法，但存在不偏离本发明范围的有关组合物和治疗方法的各种变化，这对普通技术人员而言是显而易见的。
下面实施例将更详细地说明本发明的各个方面。
实施例1
进行起始实验检查将重组人G-CSF(rhG-CSF)掺入脂泡囊的可能性。使用重组DNA技术产生rhG-CSF，其中按Souza的美国专利号4810643所述用编码人G-CSF的DNA序列转染大肠杆菌细胞。在稀释的HCl，pH4.0中以4mg/ml溶液制备rhG-CSF。全部脂从AvantiPolar Lipids(Alabaster，Ala)获得并在氯仿中以100mg/ml的终浓度贮存在-20℃的氮气中。
G-CSF∶磷脂复合物的制备
为了制备与G-CSF组合的脂泡囊，将30μmole的合适的脂分散于玻璃管中并使用氮气蒸汽干燥成薄膜。脂膜在真空中干燥至少2小时以去掉任何微量的氯仿。脂膜在1ml蒸馏过的去离子水(ddH2O)，磷酸盐缓冲溶液pH7.2(Gibco/BRL“D-PBS”)或150mM NaCl中水合。然后样品在水浴型超声处理器(Laboratory Supplies，Hicksville，N.Y.)中进行超声处理。超声处理持续至样品经肉眼观察透明(通常10-15分钟)。样品贮存于4℃氮气中备用。最终脂浓度为30mM。作为选择，可经过取300μmole脂在氮中干燥并按上面所述脱水制备脂泡囊。干燥的脂膜如上所述在10ml合适的水溶液中水合。然后样品在台式乳化器(Microfluidics Model 110S，Microfluidics，Inc，Cambridge，MA)中以10,000psi操作微液滴化。样品通过仪器再循环10个循环。然后按上面所述将微液滴化的样品贮存于4℃。
经过将G-CSF(如上所述)与特定脂(如上所述)混合制备G-CSF∶磷脂复合物。经过旋转，搅拌或轻轻摇动实现混合。制备脂∶G-CSF的各种摩尔比以评价蛋白质的膜插入和稳定。例如，为了制备以脂∶G-CSF为40∶1摩尔比的0.2mg/ml G-CSF的3ml样品(水中)，将150山G-CSF贮液与44μl脂(30mM贮液，经超声处理在水中制备)合并，加入水以得到3ml的最终样品体积。建议保温5分钟(但不是必要的)，并在使用或测定样品前用于这一步。
G-CSF也可在微液滴化前与水合的脂合并。随后按上面所述对混合物进行的微液滴化导致将G-CSF掺入脂膜中。
G-CSF∶磷脂复合物的分析
1.色氨酸发射光谱
在rhG-CSF中有2个色氨酸残基对局部环境条件十分敏感。因此当rhG-CSF与脂质体接触时进行分析以测定rhG-CSF色氨酸荧光。荧光发射最大值向蓝光移动表明色氨酸在更疏水的环境中，因此rhG-CSF包埋于脂膜中。色氨酸荧光分析的极好的综述是荧光显微术的原理
J.Lakowicz，Chap 11(Plenum Press，New York，1983)。
经过在280nm下激发样品并以1nm/sec的速率扫描从285nm到420nm间增加1nm时的发射。样品体积为3ml，所有样品中G-CSF的终浓度为0.2mg/ml。改变脂∶G-CSF的比率。所有荧光测量使用PTI Alphascan荧光计(South Brunswick，NJ)。所有测量在25℃下进行，通过使用与循环水浴连接的水套保温池维持这一温度。收集发射光谱并使用PTI提供的软件数据进行分析。
存在和不存在由DOPG组成的小单层泡囊时rhG-CSF的荧光光谱在图1中显示。在缺乏DOPG泡囊时rhG-CSF在334nm具有发射最大值。在以100∶1脂∶蛋白质比存在DOPG时，rhG-CSF色氨酸荧光表现出荧光发射最大值兰光迁移到327nm且荧光强度显著增加。在DOPG存在时，荧光发射的短波长表明色氨酸存在于比天然蛋白质更疏水的环境中。如在图2中所示，荧光变化取决于DOPG∶G-CSF的摩尔比且一旦DOPG∶G-CSF达到10∶1的比率就可检测到膜的插入。
2.碘猝灭实验
碘是色氨酸荧光的有效碰撞型猝灭剂，但不能穿透脂膜。因此，碘对色氨酸荧光的有效猝灭表明该残基暴露于大量水溶剂中而当蛋白质色氨酸与水溶剂隔离时出现不被碘猝灭。在这些实验中，使用G-CSF和DOPG∶G-CSF组合物(100∶1脂∶蛋白质比率)。进行并记录样品的起始读数(Fo)后，加入增加量的碘化钾(KI)(5M贮液)后测量荧光强度。制备的样品和KI溶液含1mM Na2SO3(终浓度)，如Lee等，生物化学与生物物理杂志，
984：174-182(1989)和Le Doan等，生物化学与生物物理杂志，
858：1-5(1986)所述。加入Na2SO3可防止形成I2，它能分隔成蛋白质和膜的非极性区。用Stern-Volmer方程(Fo/F＝1+KKI[KI])分析数据，其中Fo和F分别是缺乏和以浓度[KI]存在KI时样品的荧光强度。KKI是KI猝灭G-CSF色氨酸残基的Stern-Volmer猝灭常数；Lehrer，S.，生物化学
10：3254-3263(1979)。
Stern-Volmer样方数据在图3中显示。在缺乏DOPG泡囊时，rhG-CSF荧光被KI有效猝灭。存在DOPG时，Stern-Volmer样方的数据呈线型，表明碘很少进入两个色氨酸。数据表明在缺乏DOPG时碘可进入的色氨酸残基在存在DOPG时变成碘不可进入。因此，含有这个色氨酸的rhG-CSF部分可能包埋于DOPG双层中。
3.能量转移测量
如前面所示，可以在色氨酸供体与诸如芘癸酸的脂溶性荧光受体间发生能量转移，因该探针的发射光谱与色氨酸的发射光谱明显重叠。Friere等，生物化学
22：1675-1680(1983)。如果蛋白质插入脂膜，从色氨酸向芘的能量转移将导致色氨酸荧光猝灭。在本实验中，记录了加入不同量芘癸酸(在四氢呋喃中的30μg/ml贮液)前(Fo)和后(F)各种脂∶G-CSF复合物的色氨酸发射强度。在加入芘癸酸启动芘癸酸与样品的混合过程中连续搅拌样品。F/Fo比率是在G-CSF色氨酸与疏水能量受体芘癸酸之间发生能量转移量的比例。
图4显示了由于加入芘癸酸的作用在存在DOPG(100∶1的脂∶蛋白质比)时rhG-CSF的猝灭图。在非常低的芘癸酸浓度(＜1mole％)时发生猝灭，所以荧光探针对膜结构和行为的影响较少。由于预期芘癸酸能迅速分散成脂双层，该资料表明rhG-CSF较深地包埋于DOPG膜中，是以允许从色氨酸向芘受体发生有效的能量转移。在存在和缺乏rhG-CSF时检查芘癸酸标记的DOPG泡囊的激发光谱证实了能量转移。
上面的分析表明rhG-CSF能与象DOPG一样的不饱和磷脂密切相互作用。在存在DOPG泡囊时，rhG-CSF色氨酸可防止水溶性荧光猝灭剂但易于将能量转移给疏水荧光探针而猝灭。综合起来，资料表明rhG-CSF能插入由DOPG组成的膜。一旦达到10∶1的比率(脂∶G-CSF)就可检测到膜插入，且这一数值可代表围绕蛋白质插入部分的脂的数值。
实施例2
在本实施例中，使用如上所述比较F/Fo强度和发射最大值测定rhG-CSF与其它磷脂相互作用的能力。在每个例子中，脂∶rhG-CSF的摩尔比为100∶1。
图5显示了在缺乏和存在各种脂时rhG-CSF的F/Fo资料。图6显示了相同组合物的发射最大值资料。在图5和图6的数据表明，除了DOPG，rhG-CSF可插入DMPG，DPPG中，且以较低的效率插入磷脂酰乙醇胺(PE’s)和磷脂酰丝氨酸(PS’s)中。另外，发现NG-DOPG(DOPG样品，其中使PE头部基团带更多负电)提供的rhG-CSF插入比DOPE更高。
DOPC，DMPC和DPPC是中性脂且这些泡囊对发射最大值或rhG-CSF的荧光强度具有很小或无影响，表明在这些磷脂中未发生相互作用(见图5和6，及图7，曲线2)。
上面的资料表明，能转变成熔融球形状态的蛋白质能插入各种脂泡囊中。然而，只有当使用带负电的脂泡囊时才会发生这种rhG-CSF∶脂相互作用。在带负电的脂泡囊中，那些具有更大阴性电荷的泡囊似乎提供更强的rhG-CSF∶脂相互作用。
实施例3
在本实施例中，测定了DOPG∶rhG-CSF相互作用的影响，因为它涉及蛋白质的稳定性。在装配有帕尔帖型恒温细胞容器和磁力搅拌器的Jasco J-720仪器上进行圆二色性测量。使用终rhG-CSF浓度为80μg/ml，pH6.0测量222nm处的圆二色性。使用Microcal MC-2量热器进行不同扫描量热测量。以90℃/小时的速率扫描rhG-CSF(1mg/ml，在水中)或DOPG∶rhG-CSF(45∶1mole/mole，在水中)样品。使用Microcal软件贮存和分析数据。
可做为增加温度的函数经过测量圆二色性(222nm)而追踪G-CSF α螺旋的温度诱导性变化。在pH6.0时rhG-CSF的热诱导去折叠在图8中表示。曲线表明在～60℃-70℃发生相当突然的转变，导致α螺旋丢失。经过这一转变后，rhG-CSF不可逆地从溶液中沉淀出来。去折叠的温度范围与在图9中所示的以不同扫描量热法测定的在pH7.0时的rhG-CSF的溶解温度相似。
与此相反，DOPG∶rhG-CSF样品随温度增加显示出α螺旋逐渐丢失，且不象单独的rhG-CSF，DOPG∶rhG-CSF的温度诱导性去折叠似乎不是协同的(见图8)。以不同扫描量热法所示的缺乏熔解转变也证实了这一结论(图9)。值得注意的是：加热到95％后DOPG∶rhG-CSF样品可恢复α螺旋并且能在95℃到10℃间重复循环且在冷却时螺旋完全恢复(见图10)。在这些条件下单独的rhG-CSF不可逆地去折叠且从溶液中沉淀。
还检查了DMPG和DPPG对G-CSF圆二色性的影响。对于DOPG，DMPG和DPPG，使用150∶1的脂∶rhG-CSF比率也可稳定rhG-CSF的二级结构(图11-13)。
这些资料表明rhG-CSF与DOPG，DMPG和DPPG的相互作用增强了在单独的rhG-CSF不稳定的条件下蛋白质的稳定性。相互作用直接稳定了rhG-CSF的二级和三级结构。
实施例4
在本实施例中，测定了rhG-CSF∶DOPG相互作用对涉及rhG-CSF生物学活性的影响。利用经鼠骨髓细胞对[3H]-胸苷的G-CSF依赖性吸收测定rhG-CSF的体外活性，如在Zsebo等，免疫生物学
172：175-184(1986)中所述。所有活性测定重复三次。经过皮下注射仓鼠(rhG-CSF剂量为100μg/kg)并测量白血细胞(WBC)数测定体内活性。
1.体外活性
A.测定在不存在和存在DOPG时rhG-CSF的比活。还试验了热处理的rhG-CSF和DOPG∶rhG-CSF样品。结果在表1中小结。
表1
样品 比活(U/mg/蛋白质)
rhG-CSF 0.66±0.09
rhG-CSF(加热过的)a 检测不到
DOPG∶rhG-CSFb 0.61±0.11
DOPG∶rhG-CSFb(加热过的)a 0.52±0.08
a样品在进行测定前在85℃水浴中保温10分钟。
bDOPG∶rhG-CSF比率为50∶1(摩尔/摩尔)。
如表1所示，插入DOPG双层对rhG-CSF的生物活性无有害影响。加热到85℃ 10分钟后，rhG-CSF检测不到活性且蛋白质沉淀。经过相似处理后，DOPG∶rhG-CSF保留未加热的rhG-CSF的活性的～85％并且在冷却时完全恢复二级结构。
B.还研究了在冷冻干燥期间各种脂稳定rhG-CSF的能力。rhG-CSF样品与各种脂组合后冻干并测定(如上所述)活性。DOPG，DMPG，和DPPG当与rhG-CSF混合时冷冻干燥后可保留～100％的rhG-CSF生物活性。单独的rhG-CSF在冻干过程后不能幸存。
2.体内活性
测定了存在和不存在脂时rhG-CSF的活性(WBC计数)。在第0天皮下注射(rhG-CSF剂量为100μg/kg)后测定活性。测定了5种不同的脂∶rhG-CSF复合物，在每种情况下脂∶rhG-CSF复合物保留体内活性(图15和16)。
上面的研究证实插入带负电荷的脂双层对rhG-CSF生物活性无有害影响。另外，似乎在冻干过程中脂的保护性效力保护了rhG-CSF。
实施例5
在本实施例中，试验了化学修饰的G-CSF(PEG化的G-CSF(PEG-G-CSF))和作为真核宿主细胞表达产物获得的G-CSF(CHO-G-CSF)与带负电荷的脂泡囊相互作用的能力。对于CHO-G-CSF，使用比较F/Fo强度和发射最大值(如上面实施例1所述)进行测定。在每种情况下，脂∶蛋白质的摩尔比为100∶1。对于PEG-G-CSF，根据圆二色性分析进行测定。
使用的CHO-G-CSF使用重组DNA技术生产，其中，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用编码人G-CSF的DNA序列转染，如在Souzd的美国专利4810643中所述。CHO-G-CSF在PBS，pH7.0中以0.6mg/ml溶液制备。CHO-G-CSF显示出以与rhG-CSF相似的方式与DOPG相互作用，在存在DOPG时每样品显示出荧光强度增加，以及在存在DOPG时发射最大值向兰光转移(图17和18)。因此，DOPG相互作用不是由于G-CSF重组形式的一些独特性质决定的。
用于这些实验的PEG-G-CSF是三至四个PEG化的来自大肠杆菌的G-CSF(使用PEG6000)。使用上述程序制备DMPG∶PEG-G-CSF(17∶1mole/mole)样品。发现DMPG∶PEG-G-CSF样品加热后完全恢复二级结构(图19)。尽管存在PEG分子，衍生的蛋白质能以与天然蛋白质相同的方式与脂相互作用。
上述资料表明：与G-CSF和带负电荷的脂泡囊相互作用相联系的稳定效应并不唯一局限于作为原核宿主细胞表达产物获得的rhG-CSF。能转变成MGS的并与脂质体泡囊相接触的化学修饰的蛋白质(这里是PEG-G-CSF∶DMPG)也表现出稳定效应。
实施例6
在本实施例中，研究了DMPG和DPPG对GM-CSF的影响。GM-CSF是重组的人GM-CSF，如Boone在美国专利5047504中所述，并在pH7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中制备成1mg/ml的溶液。使用17∶1的脂∶GM-CSF比率并使用如上所述的圆二色性分析测定热稳定性。DMPG和DPPG可导致GM-CSF的热稳定性更好，即加热后恢复二级结构(图20a和20b)。
这些资料提供了能转变成熔融球形状态，与带负电荷的脂泡囊相互作用以给该蛋白质提供更好的热稳定性之蛋白质的另一例子。
实施例7
在本实施例中，DOPG∶PEG-G-CSF复合物用于评价经肠道用药后增加对G-CSF治疗学反应的可能性。为进行本实验，按实施例1所述制备DOPG并按实施例5所述制备PEG-G-CSF。将100μmole的脂(797μl)在真空中干燥，然后加入1ml毫Q水以制备100mM的脂溶液。该溶液在超声处理水浴中(来自Lab.Supply Inc.，Hicksville，NY的Model G 112SP1T)超声处理5分钟或直到脂溶液透明。将9μmolDOPG溶液(90μl)加入溶于1mM HCl的90nmol天然rhG-CSF或PEG-G-CSF中。旋涡振荡溶液并用1mM HCl加至终体积为2ml。为了给大鼠十二脂肠用药，将物质放入植入动物体内的渗压泵中，在24小时内发生物质的释放。
接受含有和不含脂的rhG-CSF和PEG-G-CSF之动物的总WBC分析结果在图21中表示。图21a显示了与载体对照相比天然G-CSF灌注不能刺激WBC反应。加入后动物对rhG-CSF的治疗学反应具有很小的影响。
大鼠对PEG化的G-CSF的反应在图26中表示。可见单独的PEG-G-CSF刺激WBC反应。在返回基线前WBC的升高持续48小时。用DOPG配制的PEG-G-CSF也刺激WBC反应，该反应比单独的PEG-G-CSF几乎大2倍。灌注后经测量PEG-G-CSF的血清水平证实了这些结果。
这些资料证实包括诸如DOPG的阴离子脂在PEG-G-CSF的口服配方中似乎增加由修饰蛋白质激发的治疗学反应。所涉及的机制目前还不了解。
实施例8
在本实施例中，研究了DMPG对MGDF的影响。MGDF是重组人大肠杆菌产生的MGDF 1-163，在10mM乙酸钠，5％山梨醇，pH5.0中配成1.0mg/ml的溶液。DMPG∶MGDF复合物按实施例1所述制备。
DMPG∶MGDF复合物的分析
1.色氨酸发射光谱
在MGDF中有一个色氨酸残基(51位)，用于监测MGDF与DMPG泡囊的相互作用。使用0.1mg/ml的MGDF浓度，按实施例1所述测定DMPG∶MGDF复合物的色氨酸荧光。在存在和缺乏由DMPG组成的小的单层泡囊的条件下MGDF的荧光光谱在图22中显示。在缺乏DMPG泡囊时MGDF在336nm下具有发射最大值。在以100∶1的脂∶蛋白质比存在DMPG时，MGDF色氨酸荧光表现出荧光发射最大值的兰光移动到328nm。在存在DMPG时荧光发射的短波表明色氨酸存在于比天然蛋白质更疏水的环境中。并且如图23所示，荧光移位取决于DMPG∶MGDF的摩尔比，一旦达到8-30∶1的DMPG∶MGDF比就可检测到膜插入。在≥100∶1摩尔比时荧光变化最大且当pH从pH7.0降低到pH5.0时MGDF对DMPG泡囊表现出明显更高的亲和力。这表明某些氨基酸(例如组氨酸)的滴度可用于增强或减弱相互作用。
2.碘猝灭实验
在这些实验中，MGDF和DMPG∶MGDF组合物(100∶1 DMPG∶MGDF)用于按实施例1所述进行碘猝灭实验。数据的Stern-Volmer样方在图24中显示。在缺乏DMPG泡囊的条件下，MGDF荧光被KI有效猝灭。与此相反，在存在DMPG的条件下，色氨酸对碘是不可进入的，表明MGDF中含该色氨酸的部分包埋于DMPG双层中。
上面的分析表明对于G-CSF，GM-CSF和MGDF可与诸如DMPG的不饱和磷脂进行密切的相互作用。在存在DMPG泡囊的条件下，保护MGDF色氨酸不受水溶性荧光猝灭剂的影响。综合起来，该资料表明MGDF可插入由DMPG组成的膜中。一旦达到8∶1的比率(DMPG∶MGDF)就可检测到膜插入，且这一数值可代表围绕蛋白质的插入部分的脂数目。
实施例9
在本实施例中，测定了DMPG∶MGDF相互作用对其所涉及的蛋白质稳定性的影响。评价了MGDF(±DMPG)的热稳定性，在存在尿素的稳定性和贮藏寿命稳定性。在每次研究中，使用的DMPG∶MGDF为100∶1的摩尔比。
1.热稳定性
按实施例3，图10所述监测由于在95℃和10℃之间热循环的作用单独的MGDF或插入DMPG泡囊的MGDF的圆二色性(CD为222nm)。剩余CD的％指每次循环(一个循环是10℃-＞95℃-＞10℃)后检测的CD量(在10℃)与所示组合物未加热样品的CD之比。尽管3次加热循环后MGDF丢失超过70％的其螺旋性，但在相同条件下DMPG∶MGDF完全保留其原始α螺旋(见图25)。
2.存在尿素时的稳定性
尿素是能去折叠和变性蛋白质的促溶剂。以荧光(即三级结构的测量)和以圆二色性(即二级结构的测量)监测MGDF(±DMPG)的平衡变性。如图26所示，由于蛋白质三级结构丢失，色氨酸残基更暴露于水相中且MGDF发射波长移位到较长波长，由于二级结构丢失，平均残基椭圆率(elipicity)(MRE)因丢失α螺旋性而变得带较少负电。在缺乏DMPG时，在大约3M尿素时三级结构丢失50％，而在存在DMPG时需要8M尿素才能实现结构丢失50％。同样地，在缺乏DMPG时MGDFMRE丢失50％需要7M尿素，相比而言在存在DMPG时需要9M尿素。
3.贮藏寿命稳定性
大肠杆菌MGDF 1-163(±DMPG)在下面表2所示条件下贮存，然后使用Toso-Haas G3000SWXL柱以100mM磷酸缓冲液，10％乙醇，0.2％Tween-20，pH6.9为移动相经大小排阻层析(SEC)检查。用乙醇和Tween-20稀释样品至与移动相中所用相同的浓度且每次过柱注射10-20μg样品。柱温度维持在40℃。形成的任何聚集的MGDF比未聚集的蛋白质更早地洗脱出来且经过测量聚集峰和单体峰曲线下的面积进行定量。数据指在聚集峰MGDF的％。
表2
经SEC测量的聚集％
样品 温度 5周 11周
MGDF -80℃ 0 0.2
4℃ 0.4 0.6
37℃ 18 39.2
DMPG∶MGDF -80℃ 0 0.14
4℃ 0 0
37℃ 1.9 2.5
如在表2中所示，DMPG显著减少由于贮存形成的聚集体。因此DMPG可用于增强MGDF的贮藏寿命。
这些资料证实MGDF与DMPG泡囊的相互作用增强了在单独的MGDF不稳定的条件下该蛋白质的稳定性。在存在变性剂如尿素时，相互作用直接稳定了MGDF的二级和三级结构，且明显增强了在各种温度下MGDF的贮藏寿命。
实施例10
在本实施例中，试验了化学修饰的MGDF 1-163(单PEG化(20KDa)的MGDF 1-163(PEG-MGDF))与带负电荷的脂泡囊相互作用的能力。对于PEG-MGDF，使用F/Fo强度比较和发射最大值(如上面实施例1和8所述)进行测定。在每种情况下，脂∶蛋白质的摩尔比为100∶1。
用于这些实验的PEG-MGDF是使用单甲氧基聚乙二醛(MePEG)(平均分子量20KDa)经还原性烷基化而单PEG(20KDa)化的来自大肠杆菌的MGDF 1-163。经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳使用4-20％预制梯度凝胶(NOVEX)测定PEG-MGDF连接物的均一性。显示出相应于46.9KDa蛋白质位置的一个主要带。
然后使用上述程序制备DMPG∶PEG-MGDF(100∶1摩尔/摩尔)样品。发现DMPG∶PEG-MGDF样品加热后完全恢复二级结构(图27)。尽管存在PEG分子，修饰的蛋白质能以与天然蛋白质相同的方式与脂相互作用。
该资料表明和MGDF与带负电荷的脂泡囊相互作用相联系的发射最大值移位不仅仅局限于作为原核宿主细胞表达产物获得的MGDF。正如用化学修饰的rhG-CSF所证实的，DMPG∶PEG-MGDF也表现出发射移位，该资料表明化学修饰的MGDF能插入由DMPG组成的膜中。
实施例11
在本实施例中，评价了DMPG∶PEG-MGDF相互作用对其所涉及的MGDF吸附到玻璃瓶上问题的影响。将大约11pg/ml的[125I]-PEG-MGDF与各种浓度的未标记的PEG-MGDF合并以获得所示PEG-MGDF终浓度(见图28)。其中表明，DMPG包括在稀释液中(也见图27)。将1ml的制品放在3cc玻璃瓶(Kimble)中。经过计数在室温保温18小时后可从玻璃瓶回收的放射性标记的MGDF量测定PEG-MGDF的回收率％。如图28所示，当蛋白质浓度降低时PEG-MGDF易于吸附在玻璃容器中，在0.1-5050μg/ml范围内吸附特别高。与此相反，在0.1-50μg/ml PEG-MGDF的范围内DMPG∶PEG-MGDF样品几乎不吸附在玻璃上。
实施例12
在本实施例中，测定了DMPG∶MGDF 1-163和DMPG∶PEG-MGDF 1-163相互作用对其所涉及的MGDF 1-163和PEG-MGDF 1-163生物活性的影响。MGDF 1-163是大肠杆菌产生的，且脂∶蛋白质比率为100∶1。测量用100μg/kg和300μg/kg MGDF，PEG-MGDF，DMPG∶MGDF或DMPG∶PEG-MGDF处理的小鼠的血小板数，结果在图31中提供。在8天中每天一次将每种形式的所示浓度经皮下给正常的雌性Balb/c小鼠用药。最后一次注射后24小时在尾静脉小侧向切口收集试验血液。用Sysmex电子血细胞分析仪(BaxterDiagnostics，Inc.Irvine，CA)进行血细胞分析。数据以4只动物测定的平均值±平均标准误差提供。其它血细胞参数如总白血细胞数或红血细胞数不受这些处理的影响(数据未显示)。结果表明大肠杆菌MGDF 1-163的PEG化增加了分子的体内活性。更重要的是，上面研究证实插入带负电荷的脂双层对各种MGDF形式的生物活性无有害影响。
序列表
(1)一般资料：
(i)申请人：
(ii)发明题目：稳定的蛋白质∶磷脂组合物及方法
(iii)序列数：2
(iv)联系地址：
(A)联系人：Amgen Inc.
(B)街道：1840 Dehavilland Drive
(C)城市：Thousand Oaks
(D)州：加利福尼亚
(E)国家：美国
(F)邮编：91320-1789
(v)计算机可读形式：
(A)媒介类型：软磁盘
(B)计算机：IBM PC兼容性
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25
(vi)目前申请资料：
(A)申请号：
(B)申请日：
(C)分类：
(2)SEQ ID NO：1资料：
(i)序列特征：
(A)长度：1342个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(ix)特征：
(A)名称/链：CDS
(B)位置：99..621
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG 60
TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT 113
Ser Pro Ala Pro Pro
1 5
GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC 161
Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val
10 15 20
CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA 209
Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr
25 30 35
CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC 257
Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr
40 45 50
CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT 305
Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu
55 60 65
CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC 353
Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys
70 75 80 85
CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT 401
Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu
90 95 100
GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG 449
Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg
105 110 115
ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC 497
Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His
120 125 130
CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC 545
Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr
135 140 145
CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC 593
Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr
150 155 160 165
TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC C CAAACAGGAC TTCTGGATTG 641
Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu
170
TTGGAGACAA ACTTCACTGC CTCAGCCAGA ACTACTGGCT CTGGGCTTCT GAAGTGGCAG 701
CAGGGATTCA GAGCCAAGAT TCCTGGTCTG CTGAACCAAA CCTCCAGGTC CCTGGACCAA 761
ATCCCCGGAT ACCTGAACAG GATACACGAA CTCTTGAATG GAACTCGTGG ACTCTTTCCT 821
GGACCCTCAC GCAGGACCCT AGGAGCCCCG GACATTTCCT CAGGAACATC AGACACAGGC 881
TCCCTGCCAC CCAACCTCCA GCCTGGATAT TCTCCTTCCC CAACCCATCC TCCTACTGGA 941
CAGTATACGC TCTTCCCTCT TCCACCCACC TTGCCCACCC CTGTGGTCCA GCTCCACCCC 1001
CTGCTTCCTG ACCCTTCTGC TCCAACGCCC ACCCCTACCA GCCCTCTTCT AAACACATCC 1061
TACACCCACT CCCAGAATCT GTCTCAGGAA GGGTAAGGTT CTCAGACACT GCCGACATCA 1121
GCATTGTCTC GTGTACAGCT CCCTTCCCTG CAGGGCGCCC CTGGGAGACA ACTGGACAAG 1181
ATTTCCTACT TTCTCCTGAA ACCCAAAGCC CTGGTAAAAG GGATACACAG GACTGAAAAG 1241
GGAATCATTT TTCACTGTAC ATTATAAACC TTCAGAAGCT ATTTTTTTAA GCTATCAGCA 1301
ATACTCATCA GAGCAGCTAG CTCTTTGGTC TATTTTCTGC A 1342
(2)SEQ ID NO：2资料：
(i)序列特征：
(A)长度：174个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu
1 5 10 15
Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val
20 25 30
His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu
35 40 45
Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu
50 55 60
Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln
65 70 75 80
Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln
85 90 95
Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu
100 105 110
Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe
115 120 125
Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu
130 135 140
Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala
145 150 155 160
Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu
165 170
Claims (16)
1.一种组合物，该组合物包括能转变成熔融球形状态的MGDF或用聚乙二醇修饰的MGDF即PEG-MGDF，它们与完整的磷脂脂质体泡囊混合以形成脂质体-蛋白复合物，其中组合物中脂：MGDF或PEG-MGDF的比例为10∶1-100∶1，所述脂质体泡囊由带负电荷的磷脂组成并且其中只有一部分所述的MGDF或PEG-MGDF被插入到脂质体泡囊的脂部分中。
2.权利要求1的组合物，其中所述的MGDF具有图29所示的1-332的氨基酸序列。
3.权利要求1的组合物，其中所述的MGDF具有图29中的1-163的氨基酸序列。
4.权利要求1的组合物，其中所述的PEG-MGDF是单PEG化的MGDF。
5.权利要求4的组合物，其中所述的PEG基团被连在N-末端。
6.权利要求1的组合物，其中所述的MGDF或PEG-MGDF在N末端还包括一个Met-Lys序列。
7.权利要求1的组合物，其中所述组合物的pH值为3.0-7.5。
8.权利要求1的组合物，其中所述脂质体泡囊选自下组：
二油酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油、二棕榈酰基磷脂酰甘油、卵磷脂酰甘油、二油酰基磷脂酰乙醇胺、卵磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酸、二肉豆蔻酰基磷脂酸、二棕榈酰基磷脂酸、二油酰基磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸、卵磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰丝氨酸。
9.权利要求1的组合物，其中所述的MGDF是大肠杆菌来源的MGDF1-163；所述的脂质体泡囊是DMPG；和所述组合物DMPG∶MGDF的比例是100∶1，pH值为5.0并且含有10mM的乙酸钠和5％的山梨醇。
10.权利要求1的组合物，其中所述的MGDF是单PEG化的大肠杆菌来源的MGDF；所述的脂质体泡囊是DMPG；所述组合物中DMPG∶mMGDF的比例是100∶1，pH值为5.0并且含有10mM的乙酸钠和5％的山梨醇。
11.权利要求1的组合物，其中所述的MGDF是CHO来源的MGDF1-332；所述的脂质体泡囊是DMPG；和所述组合物的DMPG∶MGDF比例是100∶1，pH值为5.0并且含有10mM的乙酸钠和5％的山梨醇。
12.权利要求1的组合物，该组合物包括药学上可以接受的载体。
13.一种制备权利要求1的组合物的方法，所述方法包括将能够转变为熔融球形状态的MGDF或PEG-MGDF和完整的磷脂脂质体泡囊混合从而使只有一部分MGDF或PEG-MGDF掺入到脂质体泡囊的脂部分，其中所述的脂质体带有负电荷，而所述的混合是在脂：MGDF或PEG-MGDF的比例为10∶1-100∶1的条件下进行的；得到所述的组合物。
14.权利要求13的方法，其中所述的混合是在pH 3.0-7.5的条件下进行的。
15.权利要求13的方法，其中所述的脂质体泡囊选自下组：
二油酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油、二棕榈酰基磷脂酰甘油、卵磷脂酰甘油、二油酰基磷脂酰乙醇胺、卵磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酸、二肉豆蔻酰基磷脂酸、二棕榈酰基磷脂酸、二油酰基磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸、卵磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰丝氨酸。
16.权利要求13的方法，所述方法还包括所述组合物与药学上可接受的载体组合的步骤。
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