KR100228415B1 - 안정한 단백질, 인지질 조성물 및 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 안정한 단백질 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 용융 구형 상태(molten globular state)로 전이될 수 있는 단백질을 음전하 지질 소포와 접촉시킴으로써, 열-유도 집합체, 변성 및 활성도 상실로부터 단백질을 안정시키는 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
단백질 : 인지질 복합체는 단백질의 2차 및 3차 구조를 직접 안정시키며, 본 조성물은 고온 제제형 및 새로운 운반 매개체로서 유용하다.
Description
[발명의 명칭]
안정한 단백질, 인지질 조성물 및 제조방법
[발명의 배경]
본 발명은 용융 구형 상태(molten globular state)로 전이될 수 있는 단백질의 2차 및 3차 구조를 안정시키는 데 유용한 단백질 : 인지질 구조에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 증가된 안정성을 가지고, 증가된 저장 수명을 보이며 고온에서 제제형 및 새로운 운반 매개체로 사용할 수 있는 G-CSF : 인지질 및 MGDF : 인지질 조성물에 관한 것이다.
몇몇 단백질은 용융 구형 상태(MGS)로 전이되는 것으로 나타났다[Van der Goot, F.G., Nature 354, 408-410(1991) 문헌 참조]. 용융 구형 상태의 단백질은 천연 단백질에 비길만한 2차 구조를 보이기는 하지만, 단단한 3차 구조는 결핍되어 있다[Pitsyn 등의 FEBS Letters 262 : 1, 20-24(1990) 참조]. 일부 경우에 있어서, 이러한 상태로의 전이는 미리 숨겨진 단백질의 소수성 부위를 노출시킴으로써 이루어진다. 결정적인 소수성 잔기를 노출시킴으로써, MGS는 단백질의 응집 및 침전의 중간체가 될 것이다. MGS 입체 형태는 방향족 곁사슬의 스펙트럼(근 UV 원편광 이색성 및 형광)을 원 UV 부위의 원편광 이색성과 비교하여 검출할 수 있다. 용융 구형 상태는 원 UV 원편광 이색성 변화가 없을때 방향족 군의 스펙트럼 변화를 보이며[Bychkova 등의 FEBS Letters 238 : 231-234(1988) 참조], 일부 단백질에 의한 막 침투에 관계할 것이다[Bychkova 등의 FEBS Letters 238 : 231-234(1988) ; Van der Goot, F.G., Nature 354, 408-410(1991) 참조].
과립구 군체 자극 인자(G-CSF)는 응집 이전에 MGS로 전이되는 것으로 알려진 단백질이다. 인체 재조합 G-CSF는 감염에 대항하는 백혈구의 한 유형인 호중구를 선택적으로 자극한다. 일반적으로 재조합 G-CSF 인필그라스팀(Filgrastim)은 치료학적 용도로 유용하다. 여러 조건하의 G-CSF의 구조는 광범위하게 연구되어 왔다[Lu 등의 J. Biol. Chem. Vol. 267, 8770-8777(1992) 참조]. 그것의 소수성 성질 때문에 G-CSF는 저장 수명을 연장시키기 위해 제형화하기가 까다롭다. 특정 소수성 단백질의 제제형은 장기간 보존시에 이량체의 형성 및 고차수의 응집(거시 범위)의 형성으로 활성도를 잃는다. 저장중에 탈아미노화 및 산화와 같은 그외의 화학적 변화가 일어날 수도 있다. 뿐만 아니라, G-CSF 제제형은 변성으로부터 보호되어야 하며, 특히 단백질의 2차 및 3차 구조의 안정성을 유지시켜야 한다.
인체 GM-CSF는 대식세포 및 과립구 선조 세포의 시험관 내증식을 위해 끊임없이 필요한 22-kDa의 당단백질이다. 또한 과립구 및 대식세포를 형성시키기 위하여 이들 선조 세포의 비가역적 개입을 조절한다. 그외의 생물학적 활성도는 성숙 세포 유형의 기능 활성도 조절[Gough 등의 Nature, 309, 763-767(1984) 참조] 및 인식된 화학유인물을 향한 주화성 증가[Williams 등의 Hematology, 4th ed. (1990) 참조]를 포함한다. 또한 GM-CSF는 단구의 생성을 자극하므로 단구감소증과 같은 단구 질환 치료에 유용할 것이다.
인체 GM-CSF는 다수의 원료에서 수득하여 정제될 수 있따. 재조한 인체 GM-CSF의 생산 과정은 Burgess 등의 Blood, 69 : 1, 43-51(1987) 문헌에 이미 기술되었다. 본원에서 참고문헌으로 인용된 미국 특허 제5,047,504호(Boone)에서는 원핵 숙주 세포 발현 산물로서 비-글리코실레이션 형태의 GM-CSF를 상업적 규모량으로 생산할 수 있었다.
MGDF 또는 거핵구 성장 및 분화 인자는 순환성 혈소판 수준의 주요 조절기인 것으로 나타난, 최근에 클론된 시토킨이다. Bartley, T.D. 등의 Cell 77 : 1117-1124(1994); Lok, S. 등의 Nature 369 : 565-568(1994) ; de Sauvage, F.J. 등의 Nature 369 : 533-538(1984) ; Miyazake, H. 등의 Exp. Hematol. 22 : 838(1994) ; 및 Kuter, D.J. 등의 PNAS USA, 91 : 11104-11108(1994) 문헌을 참조하라, 또한 MGDF는 트롬보포이에틴(TPO), mp1-리간드 및 메가포이에틴으로 언급된다. 성숙 인체 MGDF는 전체 332 아미노산을 갖는 단백질이다. 이 단백질과 이에 상응하는 cDNA 서열은 본원의 제29(a)도 및 제29(b)도에 나타나 있다.
중국 햄스터 난소(CHO)세포 및 E. coli 세포 둘다에서 생산된 재조합 MGDF는 마우스, 랫 및 원숭이에서 생체내 거핵세포 및/또는 혈소판을 특히 자극하거나 증가시키는 생물학적 활성도를 갖는 것으로 기술되었다. 예를들어, Hunt, P. 등의 Blood 84(10) : 390A(1994) 문헌을 참조하라. 제29(a)도 및 제29(b)도에서 위치 1의 아미노산으로부터 시작되어 적어도 151 아미노산까지 연장되도록 절단된 인체 MGDF 분자는 생체내 생물학적 활성도를 보유한다. 또한 인체 서열 MGDF 단백질의 N-말단 초기 6개의 아미노산을 제거하여도 생물학적 활성도를 보유하는 것이 가능하다. 따라서, 생물학적 활성도는 제29(a)도 및 제29(b)도에 나타나 있는 인체 MGDF의 성숙 아미노산 서열의 아미노산 7 내지 151(7과 151도 포함)내에 보유된다.
자연발생적인 MGDF는 글리코실화된 분자이다. 천연 MGDF의 글리코실화 형태는 MGDF에서 발견되는 두개의 키 도메인과 관계가 있다. 분자의 활성 부분에 해당하는 인체 MGDF의 초기 대략 151 아미노산 서열은 적혈구의 생산을 자극할 수 있는 시토킨인 에리스로포이에틴(EPO)과 현저한 상동성을 가지며, 인체 MGDF의 "EPO-유사" 도메인이라 명명된다. N-결합 글리코실화 부위의 전부는 아니지만 대부분을 함유하기 때문에 성숙 단백질의 잔존 아미노산은 소위 "N-결합 탄수화물" 도메인을 구성한다. 인체 MGDF에 있어서, N-결합 글리코실화 도메인에 함유된 6개의 모든 N-결합 글리코실화 부위가 존재한다. 두 도메인은 O-결합 글리코실화 부위를 포함한다. 분자내에는 12-14개의 O-결합 글리코실화 사슬이 존재하는 것으로 추정된다. CHO 세포에서 재조합적으로 발현된 인체 MGDF DNA로 실험하여 적어도 두개의 O-결합 부위의 EPO-유사 도메인 내에서 위치 1(Ser) 및 37(Thr)이 글리코실화된다.
G-CSF 및 MGDF와 같은 단백질이 일부 한정된 조건하에서 안정한 반면에, 단백질의 2차 및 3차 구조를 안정시킴으로써 이들 단백질 및 그외의 단백질의 저장 수명을 연장시킬 필요성이 여전히 존재한다. 과거에 이러한 단백질 연구에 시도되었던 한 방법은 리포솜을 이용하는 것이다. 리포솜은 물-불용성 극성 지질, 특히 인지질에 의해 형성된 완전 폐쇄 지질 이중막이다. 리포솜 소포는 단일막 이분자층(단일층)을 갖거나 다중막 이분자층(다중층)을 갖는다. 이분자층은 친수성(극성) "머리" 부위 및 소수성(비극성) "꼬리" 부위를 갖는 두개의 지질 단일분자층으로 이루어지되, 여기에서 소수성 꼬리는 이분자층의 중심을 향하고 친수성 머리는 수층을 향한다. 리포솜의 안정성, 강성 및 투과성은 인지질 조성물의 변화, 온도 변화, 스테롤의 함유 또는 전하 양친매성의 결합에 의해 변할 수 있다. 리포솜의 기본 구조는 본 분야에서 공지된 다양힌 기술로 제조될 수 있다.
형성 과정 중에 리포솜은 수용성 채널에 수성 용질을 유입시켜 가변 속도로 그것을 방출시킬 수 있다. 리포솜이 세포내로 효소를 도입시켜 그들의 대사작용을 변화시킬 수 있음이 발견되자[Gregoriadis, New Engl, J. Med. 295, 704-710, 765-770(1976) 참조], 표적 약물 운반에 대한 연구의 해답으로서 리포솜이 대두되었다. 결국, 이는 리포솜의 소수성 층이나 소수성 코어 내부에서 분리된 약물, 비타민 및 단백질을 서서히 유리하는 저장부(depots)로서의 리포솜의 용도와 관련된 제약업에 있어서 획기적인 개발 연구이다. 약물-운반체로서의 리포솜의 성공적인 이용은 그것을 사용하는 연구자들이 몇가지 문제에 부딪히면서 제한되었다. 예를 들어, 리포솜은 유입 항원에 대한 강력한 면역학적 보조약으로 작용하는 것으로 공지되어 있고, 이종 기원의 효소나 다른 단백질이 리포솜내로 유입될 때 산증을 기해야만 한다. 또한, 약물의 확산 속도를 조절하기가 어렵다. 이는 리포솜의 본래의 불안정성과 특정 약물의 확산을 가속화시키는 특정 혈액 성분이 존재하기 때문이다. 뿐만 아니라, 그 성질로 인해 일부 물질은 리포솜내로 불안전하게 유입되어 급속도로 혈형내로 확산된다. 결국, 간이나 비장 이외에 다른 어떤 세포나 기관을 표적으로 하는 것은 문제가 있었다. 리포솜내로 결합되는 물질 및 약물 운반체로서의 리포솜의 용도와 관련된 문제를 다루는, 리포솜에 관한 우수한 평론지는 Drug Carriers in Biology and Medicine, Chapter 14, 287-341(Academic Press, N.Y., 1979)에 수록된 Gregory Gregoriaidis의 "Liposomes"이다.
약물 운반체로서의 리포솜의 용도에 관하여 많은 연구가 이루어졌지만, 펩티드 및/또는 단백질의 구조를 안정시킴으로써 치료학적 펩티드 또는 단백질의 저장 수명을 증가시키기 위한 리포솜의 용도에 관해서는 거의 밝혀지지 않았다. 발명의 명칭이 "Therapeutic Peptides and Proteins" 인 Hostetler 등의 제 PCT/US90/05163 호에는 대기/물 계면에 폴리펩티드 및/또는 단백질이 축적되는 것을 방지하고 용기 표면에 폴리펩티드 및/또는 단백질이 흡착되는 것을 방지하기 위하여 폴리텝티드 및/또는 단백질을 가용화시킨 제약학적으로 용인가능한 희석제로서의 중공 리포솜의 용도에 대해 기술되어 있다.
Hostetler 등은 음전하 인지질을 약 50몰% 까지 가할 수 있으며, 중성 인지질인 포스파티딜콜린이 바람직한 리포솜이라고 기술하고 있다. Hostetler 등은 폴리펩티드 및/또는 단백질의 구조를 안정시키는 희석제에 대해서는 기술하지 않았다.
발명의 명칭이 "Preparation and Characterization of Liposomal Formulations of Tumor Necrosis Factor"인 Hung 등의 제 PCT/US91/07694 호에는 리포솜 내부에서 피막되거나 그 표면과 관련된 지방친화성 변이 종양 괴사 인자(TNF) 분자에 대해 기술되어 있다. 리포솜 지방친화성 TNF 분자는 생체내 안정성을 증진시키는 것으로 보고되어 있다. 안정성은 생체내 시스템내로 TNF를 누출시키는 TNF-리포솜의 감소 성향 또는 감소와 관계가 있다. 바람직한 리포솜은 중성 지질이었다. Hung 등은 부형제가 단백질의 구조를 안정시키는 효과를 갖는 TNF 조성물에 대해서는 기술하지 않았다.
단백질, 예를들어 G-CSF 또는 MGDF를 음전하 지질 소포와 접촉시킴으로써 열-유도 응집, 변성, 활성도의 상실 및 2차 구조의 펼쳐짐으로부터 단백질을 직접적으로 안정시키는 것에 관해서는 어떤 문헌에도 나타나 있지 않다. 고온을 요하는 제제화 과정에 유용할 뿐만 아니라(예를들어, 폴리머내로의 G-CSF 및/또는 MGDF의 결합), 새로운 운반 매개체(예를들어, 폴리에틸렌글리콜화된 G-CSF의 경구 투여)로 사용될 수 있는 잇점을 제공하는 조성물이 존재할 필요가 있다. 본 발명은 그러한 조성물을 제공한다.
[발명의 요약]
본 발명은 용융 구형 상태 조건하의 단백질에 리소-인지질이나 그외의 리포솜과 같은 소수성 부형제를 가하여 단백질의 2차 및 3차 구조를 직접 안정시킴으로써 열-유도 응집, 변성 및 활성도의 상실로부터 단백질을 보호하는 것에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 안정한 G-CSF : 인지질 및 MGDF : 인지질 조성물에 관한 것이다. 놀랍게도, 바람직한 MGDF : 인지질 조성물은 냉각 중에 단백질의 2차 구조가 완전히 회복된 것을 가지고 10-95℃에서 여러 번 순환시킬 수 있다. 이 조성물은 높은 온도를 요하는 제제화 과정에 유용할 뿐 아니라, 새로운 G-CSF 운반 매개체로 사용하기에 유용하다. 뿐만 아니라, 조성물은 단백질 단독에 비해 연장된 저장 수명을 나타내며, 단백질과 인지질 소포의 상호작용은 바이알병에 단백질이 흡착되는 것을 막는다.
바람직한 구체예에서, 단백질 : 인지질 복합체는 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 에그포스파티딜글리세롤, 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 에그포스파티딜에탄올아민, 디올레오일포스파티드산(DOPA), 디미리스토일포스파티드산(DMPA), 디팔미토일포스파티드산(DPPA), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 디미리스토일포스파티딜세린(DMPS), 디팔미토일포스파티딜세린(DPPS), 에그포스파티딜세린, 리소포스파티딜글리세롤, 리소포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜세린으로부터 선택한 음전하 리포솜을 포함한다. 음전하를 띠며 불포화 인지질인 DOPG가 특히 바람직하다. 본 발명은 또한 3.0-7.5 범위로 유지되는 pH 및 적어도 10:1 비율의 지질:단백질을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예를 제공하는 부가요소는 단백질 : 인지질 복합체내에 화학적으로 변형된 단백질의 사용 뿐만 아니라 하나 또는 그 이상의 등장 조절제, 완충제 및 pH 조절계의 사용을 포함한다. 본 분야의 통상적인 지식을 가진 자들이 이해하는 바와 같이, 본 발명은 이들 부가요소를 다양하게 결합시킨 안정한 단백질 : 인지질 조성물을 포함한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 DOPG 소포의 존재(곡선 1) 및 부재(곡선 2)시 rhG-CSF의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다. rhG-CSF의 농도는 0.2㎎/㎖였다. DOPG:rhG-CSF의 비율(곡선 1)은 100:1(몰:몰)이었다.
제2도는 rhG-CSF 형광에 대한 지질:단백질의 비율 증가 효과를 나타낸 것이다. F0는 초기 형광(지질 무첨가)이고, F는 지질:rhG-CSF의 지정된 몰비율에 이르도록 지질을 가한 후의 형광을 말한다. 제2(a)도는 DOPG:rhG-CSF 혼합물에 대한 F/F0(■) 및 최대 방출 파장(△)을 나타낸 것이다. 제2(b)도는 DOPC:rhG-CSF 혼합물에 대한 F/F0(■) 및 최대 방출 파장(△)을 나타낸 것이다.
제3도는 DOPG 소포의 부재(ㆍ) 및 존재(○)시 KI에 의한 rhG-CSF 형광 소광의 스테른-볼머 도표를 나타낸 것이다. 소광 실험은 rhG-CSF(0.2㎎/㎖) 및 DOPG:rhG-CSF(100:1몰)에 KI의 분취량을 가함으로써 실시하였다.
제4도는 피렌 데칸산 첨가시 rhG-CSF 트립토판 형광의 소광을 나타낸 것이다. 방출 파장은 327㎚였고, DOPG:rhG-CSF의 비율은 100:1(몰)이었다.
제5도는 다양한 지질의 부재 및 존재시 rhG-CSF에 대한 F 세기 변화의 비교를 나타내는 그래프이다. 각 경우에 있어서, 지질:단백질의 비율은 100:1(몰)이었다.
제6도는 다양한 지질의 부재 및 존재시 rhG-CSF에 대한 방출 최대치에서 이동의 비교를 나타내는 그래프이다. 각 경우에 있어서, 지질:단백질의 비율은 100:1(몰)이었다.
제7도는 rhG-CSF(곡선 1)의 CD에 대한 DMPC(곡선 2), DMPG(곡선 3) 및 DMPA(곡선 4)의 효과를 나타낸다. 각 경우에 있어서, 지질:단백질의 비율은 pH 6.0의 물내에서 50:1(몰)이었다.
제8도는 rhG-CSF(곡선 1) 또는 DOPG:rhG-CSF(140:1 몰)(곡선 2)의 CD에 대한 온도 증가의 효과를 나타내는 것이다. rhG-CSF의 농도는 pH 6.0의 물내에서 80㎍/㎖ 였다. 온도는 100℃/시 의 속도로 10-90℃에서 스캐닝하였다.
제9도는 rhG-CSF(곡선 1) 및 DOPG:rhG-CSF(45:1 몰)(곡선 2)에 대한 시차 스캐닝 열량측정의 온도기록도를 나타낸 것이다. 시료의 rhG-CSF의 농도는 1㎎/㎖(pH 7.0, 물내에 함유됨)였다. 스캔 속도는 90℃/시였다.
제10도는 rhG-CSF(곡선 1) 및 DOPG:rhG-CSF(140:1 몰)(곡선 2)의 CD에 대한 온도 순환 효과를 나타내는 것이다. 화살표로 가리킨 바와 같이 시료를 급속하게 95℃ 까지 가열하고 10℃로 냉각하였다. 시료의 rhG-CSF 농도는 80㎍/㎖, pH 6.0이었다.
제11도는 rhG-CSF(곡선 1) 및 DMPG:rhG-CSF(150:1 몰)(곡선 2)의 CD에 대한 온도 순환 효과를 나타낸 것이다. 시료를 90℃ 까지 가열한 다음 10℃로 냉각하였다. 시료의 rhG-CSF 농도는 80㎍/㎖, pH 6.0 이었다.
제12도는 rhG-CSF(곡선 1) 및 DPPG:rhG-CSF(150:1 몰)(곡선 2)의 CD에 대한 온도 순환 효과를 나타낸 것이다. 시료를 95℃까지 가열한 다음 10℃로 냉각하였다. 시료의 rhG-CSF 농도는 80㎍/㎖, pH 6.0 이었다.
제13도는 동결-건조시에 rhG-CSF를 안정화시키는 다양한 지질의 능력을 나타내는 그래프이다. 각 경우에 있어서, 지질:단백질의 비율은 100:1 이었다. 안정성은 골수 검정시 시험관내 활성도의 보유를 기초로 하였다. rhG-CSF만이 동결 건조 과정에서 잔존하지 않으므로 사용된 대조는 지질이 결핍된 비처리 rhG-CSF 이다.
제14도는 rhG-CSF의 생체내 활성도에 대한 여러가지 지질의 효과를 나타낸 것이다. 활성도(WBC 수)는 햄스터에 피하주사한 후에 측정하였다. rhG-CSF 투여량은 100:1의 지질:단백질 비율을 갖는 100㎍/㎏ 이었다.
제15도는 rhG-CSF의 생체내 활성도에 대한 다양한 지질의 효과를 나타낸 것이다. 활성도(WBC 수)는 햄스터에 피하주사한 후에 측정하였다. rhG-CSF 투여량은 50:1의 지질:단백질 비율을 갖는 100㎍/㎏이었다.
제16도는 다양한 pH에서 DOPG의 부재 및 존재시 CHO-G-CSF에 대한 F 세기 변화의 비교를 나타내는 그래프이다. 각 경우에 있어서, 지질:단백질 비율은 100:1(몰)이었다.
제17도는 다양한 pH에서 DOPG의 부재 및 존재시 CHO-G-CSF에 대한 방출 최대치에서 이동의 비교를 나타내는 그래프이다. 각 경우에 있어서, 지질:단백질 비율은 100:1(몰)이었다.
제18도는 PEG-G-CSF(―) 및 DMPG:PEG-G-CSF(17:1)몰(---)의 CD에 대한 온도 순환 효과를 나타낸 것이다. 시료를 90℃까지 가열하고 10℃로 냉각하였다.
제19(a)도는 PBS, pH 7.0에 함유된 GM-CSF의 CD에 대한 온도 순환 효과를 나타낸 것이다. 10℃에서의 GM-CSF를 90℃까지 가열한 다음 10℃로 냉각한 GM-CSF(---)와 비교한 것이다. 제19(b)도는 DPPG:PEG-G-CSF(17:1 몰)의 CD에 대한 온도 순환 효과를 나타낸 것이다. 90℃까지 가열한 다음 10℃로 냉각한 DPPG:GM-CSF(---)와 10℃에서의 DPPG:GM-CSF(―)를 비교한 것이다.
제20(a)도는 DOPG의 부재 및 존재시에 rhG-CSF의 십이지장내 주입에 반응하는 총 WBC의 결과이다. rhG-CSF 투여량은 750㎍/㎏ 이었고, 지질 : 단백질의 비율은 100:1 이었다. 제20(b)도는 DOPG의 부재 및 존재시에 PEG-G-CSF의 십이지장내 주입에 반응하는 총 WBC의 결과이다. PEG-G-CSF 투여량은 750㎍/㎏ 이었고, 지질:단백질의 비율은 100:1 이었다.
제21도는 펌프 주입 후 PEG-G-CSF의 혈청 수준에 대한 DOPG의 효과를 나타낸 것이다. PEG-G-CSF 투여량은 750㎍/㎏ 이었고, 지질:단백질의 비율은 100:1이었다.
제22도는 DMPG 소포의 존재 및 부재시에 MGDF의 형광방출 스펙트럼을 나타낸 것이다. MGDF의 농도는 0.1㎎/㎖ 였다. MGDF는 E.coli 유래 MGDF 1-163이었다. DMPG:MGDF의 비율은 100:1(몰:몰)이었다.
제23도는 MGDF 형광에 대한 지질:단백질 비율 증가 효과를 나타낸 것이다. MGDF는 E.coli 유래 MGDF 1-163 이었다. pH 5.0(-○-) 및 pH 7.0(-●-)에서 DMPG:MGDF 혼합물에 대한 최대 방출 파장을 나타낸 것이다.
제24도는 MGDF 소포의 부재(○) 및 존재(●)시 KI에 의한 MGDF 형광 소광의 스테른-볼머 도표를 나타낸 것이다. MGDF는 E.coli 유래 MGDF 1-163 이었다. 소광 실험은 MGDF(0.1㎎/㎖) 및 DMPG:MGDF(100:1 몰)에 KI 분취량을 가함으로써 실시하였다.
제25도는 MGDF(○) 및 DMPG:MGDF(100:1몰)(●)의 CD에 대한 온도 순환 효과를 보여주는 것이다. MGDF는 E.coli 유래 MGDF 1-163 이었다. 잔존 나선성 백분율은 각 순환(1회 순환=시료가 급속히 95℃로 가열된 다음 10℃로 냉각됨) 후 10℃에서 검출되는 CD의 양을 나타낸다.
제26도는 다양한 농도의 요소 존재시에 MGDF(±DMPG)의 변성 정도를 나타내는 것이다. MGDF(-○-) 및 DMPG:MGDF(-●-)에 대한 원편광 이색성 MRE 뿐만 아니라 MGDF(-□-) 및 DMPG:MGDF(-■-) 형광방출 최대치를 나타낸 것이다. MGDF는 E.coli 유래 MGDF 1-163 이었다. DMPG:MGDF 비율은 100:1(몰:몰) 이었다.
제27도는 MGDF(±DMPG) 및 PEG-MGDF(±DMPG)에 대한 형광 방출 최대치의 그래프도이다. MGDF는 E.coli 유래 MGDF 1-163 이었고, PEG-MGDF는 모노-폴리에틸렌글리콜화된 E.coli 유래 MGDF 1-163 이었다. DMPG:MGDF 및 DMPG:PEG-MGDF 비율은 100:1(몰:몰) 이었다.
제28도는 다양한 PEG-MGDF 농도에서 바이알병에 대한 PEG-MGDF(±DMPG)의 흡착 정도를 나타낸 것이다. MGDF는 E.coli 유래 MGDF 1-163 이었고, PEG-MGDF는 모노-폴리에틸렌글리콜화된 E.coli 유래 MGDF 1-163 이었다. PEG-MGDF(-□-) 및 DMPG:PEG-MGDF(-○-)의 회수 백분율은 실온에서 18시간 항온 후 바이알병으로부터 회수가능한 방사성 표지된 MGDF의 양을 측정함으로써 검정하였다.
제29(a)도 및 제29(b)도는 시그날 펩티드(아미노산 -21 내지 -1) 및 성숙 아미노산 서열(1-332)을 포함하는 인체 MGDF의 DNA 서열 및 아미노산 서열(서열번호 : 1 및 2)을 나타낸 것이다.
제30도는 모노-메톡시-폴리에틸렌글리콜 알데히드를 사용한 N-말단 잔기의 α-아미노기에 대한 부위-특이적 MGDF 환원성 알킬화로 실질적으로 모노-폴리에틸렌글리콜화된 생성물을 생성시키는 예를 나타낸 것이다.
제31도는 정상적인 마우스에서 DMPG:MGDF 및 DMPG:PEG-MGDF의 생체내 활성도를 혈소판의 총수로 나타낸 것이다. MGDF는 E.coli 유래 MGDF 1-163 이었고, PEG-MGDF는 모노-폴리에틸렌글리콜화된 E.coli 유래 MGDF 1-163 이었다. DMPG:MGDF 및 DMPG:PEG-MGDF 투여량은 100㎍/㎏ 및 300㎍/㎏ 이었고, 지질:단백질 비율은 100:1 이었다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명의 조성물은 다음의 논문에 더 상세히 기술되어 있고 하기한 실시예에 잘 설명되어 있다.
실시예는 본 발명의 여러가지 양상을 보여 주며 다양한 단백질:인지질 조성물의 안정성 및 생물학적 활성도 시험의 결과를 포함한다. 놀랍게도, 지질 소포와 단백질의 상호작용은 그 단백질의 단백질 구조를 직접 안정시킴으로써, 지질 부재시에 단백질의 변성을 초래하는 조건하에서도 단백질을 안정시킨다.
폴리에틸렌글리콜 분자를 결합시킨 G-CSF(상기한 바와 같이)를 이용한, 화학적으로 변형된 G-CSF:인지질 조성물의 경구 투여 또한 본원에 기술되어 있다.
본 발명의 실시에서 주목할만한 것은 용융 구형 상태로 전이될 수 있는 단백질의 다양성이다. 주목할만한 전형적인 단백질은 전술한 G-CSF, GM-CSF, M-CSF, 인터페론(알파, 베타 및 감마), 인터루킨(1-11), 에리스로포이에틴(EPO), 섬유아세포 성장 인자, 간 세포 인자, 신경 성장인자, BDNF, NT3, 혈소판-유래 성장 인자 및 종양 성장 인자(알파, 베타) 같은 다양한 조혈 인자를 포함하는 시토킨이다. 다른 단백질의 MGS로 전이되는 능력을 평가할 수 있을 것이다. 문제의 단백질이 MGS로 전이될 수 있는 능력이 있다면, 음전하 리포솜 소포와 접촉할 것이고, 안정화 효과를 평가할 수 있을 것이다.
일반적으로, 본 발명의 실시에 유용한 G-CSF는 포유동물 기관에서 순수하게 분리한 천연형이거나 택일적으로, 게놈이나 cDNA 클로닝 또는 유전자 합성에 의해 수득한 외인성 DNA 시퀀스의 원핵 또는 진핵 숙주세포 발현 생성물 또는 화학 합성 생성물일 수 있다. 적합한 원핵 숙주는 다양한 박테리아(예를 들어 E.coli) 세포를 포함한다. 적합한 진핵 숙주는 효모[예를 들어, 에스. 세레비세(S. cerevisiae)] 및 포유동물(예를 들어, 중국 햄스터 난소, 원숭이) 세포를 포함한다. 사용한 숙주에 따라 G-CSF 발현 생성물은 포유동물 또는 다른 원핵 탄소화물로 글리코실화되거나 비-글리코실화될 수 있다. 재조합 G-CSF 이기는 하나, 특히 E.coli 에서 유래한 일부 및 모든 형의 G-CSF를 본 발명에 사용하는 것은 그것이 상업적인 실용성 면에서 가장 바람직하기 때문이다.
또한 본 발명에 사용하기 위해 화학적으로 변형시킨 G-CSF는 천연 인체 G-CSF(nhG-CSF) 또는 원핵이나 진핵 숙주세포 발현과 같은 재조합 핵산 공정의 생성물 중 하나일 것이다. 일반적으로, 의도한 화학적 변형은 G-CSF 분자 자체에 화학성분을 부착하는 것이다. 단백질 변형 및 융합 단백질에 관하여 기술한 평론지는 Francis의 Focus on Growth Factors 3:4-10(1992.5)(연합왕국 런던 N20 오엘디 프리에른 바르넷 레인 마운트뷰 코트 메디스크립트에서 출판)이다.
예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 분자를 부착시킨 G-CSF의 제조 방법 및 그 물질에 대해 기술한, 발명의 명칭이 "Chemically Modified Granulocyte Colony Stimulating Factor,"인 유럽 특허 제 0 401 384 호를 참조하라. 부착은 활성제에 다리로서 작용하는 단백질 또는 그 성분에 직접 결합함으로써 이루어질 것이다. 공유결합이 부착을 가장 안정하게 하므로 바람직하다. 화학적 변형은 G-CSF의 효과를 조절, 유지 또는 연장하는데 기여할 수도 있다. 이것은 화학적으로 변형된 G-CSF가 혈행에 이르는 시간을 조절하는 효과를 갖는다. 화학적 변형체의 예로는 그의 유도체를 포함하는 폴리에틸렌글리콜 조성물이 있다.
본 발명의 실시에서 주목할만한 것은 투여시 효능을 나타내는 화학적으로 변형된 G-CSF의 제조이다. 효능은 본 분야의 의사가 인지하는 바와 같은 공지된 방법으로 결정된다. 폴리에틸렌글리콜화된 G-CSF, 특히 폴리에틸렌글리콜화된 E.coli 유래 G-CSF, 더욱 특별하게는 트리-테트라 폴리에틸렌글리콜화된 E.coli 유래 G-CSF가 바람직하다.
G-CSF는 2.5-5.0 pH 범위에서 3차 구조의 결합이 약화되고 알파 헬릭스 함량이 증가하는 입체형태의 변화를 보임에도 불구하고, 산성 조건하에서 가장 안정한 것으로 보고되었다[Narhi 등의 J. Protein Chem. 10, 359-367, (1991) 참조]. 이러한 입체형태의 변화는 용융 구형 상태(MGS)의 특징이다. 따라서, MGS로 전이될 수 있는 다른 단백질을 수반하여 제조한 제제형의 경우에서와 같이 G-CSF를 수반하여 제조한 제제형도 응집과 변성을 방지하기 위하여 2차 및 3차 구조의 열-유도 펼쳐짐으로부터 보호해야만 한다.
본 발명에 유용한 GM-CSF는 포유동물 기관에서 순수하게 분리한 천연형 또는 게놈이나 cDNA 클로닝에 의해 또는 유전자 합성에 의해 수득한 외인성 DNA 시퀀스의 원핵 또는 진행 숙주 발현 생성물일 것이다. 적합한 진핵 숙주는 다양한 박테리아(예를 들어, E.coli) 세포를 포함한다. 적합한 원핵 숙주는 효모(예를 들어, 에스. 세레비세) 및 포유동물(예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포, 원숭이) 세포를 포함한다. 숙주의 사용에 따라 GM-CSF 발현 생성물은 포유동물 또는 다른 원핵 탄수화물로 글리코실화되거나 비글리코실화될 것이다. 재조합 G-CSF 이기는 하나, 특히 E.coli 에서 유래한 일부 및 모든 형의 G-CSF를 본 발명에 사용하는 것은 그것이 상업적인 실용성 면에서 가장 바람직하기 때문이다.
본원에서 사용된 용어 "MGDF"는 자연발생적인 MGDF, 자연발생적인 MGDF의 절단물 뿐만 아니라 거핵세포 및/또는 혈소판의 성장, 발육 및/또는 생산을 특히 자극하는 생물학적 활성도를 갖게 하는 자연발생적인 MGDF의 아미노산 서열 복제의 충분한 글리코실화 및 아미노산 서열을 갖는 비자연발생적인 폴리펩티드를 포함한다.
바람직한 실시형태에 있어서, MGDF는 진핵 또는 원핵 숙주 세포내로 형질감염된 외인성 DNA 서열의 발현 산물이다. 즉, 바람직한 실시형태의 MGDF는 "재조합 MGDF"이다. 바람직한 진핵 숙주는 포유동물, 특히 CHO 세포이며, 바람직한 원핵 숙주는 박테리아, 특히 E.coli 이다. 재조합 MGDF는 MGDF의 클로닝 및 발현에 대하여 본원에 인용된 공고 및 본원에 기술된 방법에 따라 바람직하게 생산된다.
일부 부가적인 바람직한 MGDF 분자는 본원의 제29(a)도 및 제29(b)도에 기초한 다음의 아미노산 서열을 갖는다 :
[서열 1]
상기 각 경우에 있어서, Met-Lys는 그것의 N-말단에 더 포함될 수 있다.
또한 본 발명의 이용에서 주목할만한 것은 다양한 MGDF 유사체이다. 본원에서 사용된 어구 " MGDF 유사체"는 탄수화물 결합 부위의 위치, 형태(N- 또는 O- 결합) 또는 수의 변화를 가져오는 MGDF의 아미노산 서열에 하나 또는 그 이상의 변화를 갖는 MGDF를 말한다. MGDF 유사체는 천연 서열의 MGDF(예를들어, 인체 MGDF)에 비해 적어도 동등한 생물학적 활성도를 가지며, 생물학적 활성도에 대한 검정에서 측정된 바로는 실질적으로 더 높은 활성도를 가질 것이다. 결과적으로, 유사체는 천연 인체/재조합 MGDF 보다 적거나 많은(많은 것이 바람직함) 탄수화물 사슬을 가질 것이다.
또한 본 발명의 유사체의 범주에 속하는 것은 MGDF의 카르복시 말단에서 연장된 하나 또는 그 이상의 아미노산을 갖는 유사체이며, 여기에서 카르복시 말단 연장은 적어도 하나의 부가적인 탄수화물 부위에서 제공된다. MGDF의 카르복시 말단은 사용되는 MGDF의 특정 형태(예를들어, MGDF 1-332 아미노산 또는 MGDF 1-163 아미노산)에 따라 달라질 것이다. 부가적인 탄수화물 부위는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 N- 또는 O- 결합 글리코실화 부위를 함유하는 아미노산을 가함으로써 MGDF 종의 카르복시 말단에 부가될 것이다.
또한 본 발명은 화학적으로 변형된 MGDF 조성물을 광범위하게 포함한다. 일반적으로, 주목할만한 화학 변형체는 MGDF 산물인데, 여기에서 상기 MGDF 단백질은 적어도 하나의 폴리에티렌글리콜 분자와 결합된다(즉, 폴리에틸렌글리콜화된 MGDF). MGDF의 폴리에틸렌글리콜화는 본 분야에서 공지된 폴리에틸렌글리콜화 반응 중 하나에 의해 실시된다. 예를들어, Focus on Growth Factors 3(2) : 4-10(1992) ; 유럽특허 제 0 154 316 호 ; 유럽특허 제 0 401 384 호 ; 및 폴리에틸렌글리콜화에 관하여 본원에서 인용된 그외의 공고를 참조하라. 바람직하게, 폴리에틸렌글리콜화는 반응성 폴리에틸렌글리콜 분자(또는 유사한 반응성 수용성 폴리머)와 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 실시한다.
아실화에 의한 폴리에틸렌글리콜화는 일반적으로 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 활성 에스테르 유도체를 MGDF 단백질과 반응시킴을 내포한다. 일부 공지되거나 그 직후 발견된 반응성 PEG 분자는 MGDF의 폴리에틸렌글리콜화를 실시하는데 이용될 것이다. 바람직한 활성화 PEG 에스테르는 N-하이드록시숙신이미드("NHS")에 에스테르화된 PEG 이다.
본원에 사용된 바와 같이, "아실화"는 PEG와 같은 수용성 폴리머와 MGDF 간의 결합의 다음 형태, 즉 아미드, 카르바메이트, 우레탄 등에 한정되지 않고 그것을 포함하는 것으로 생각된다[Bioconjugate Chem. 5 : 133-140(1994) 문헌 참조]. 반응 조건은 폴리에틸렌글리콜화 분야에서 공지된 것이나 직후에 개발된 조건 중에서 선택할 수 있으나, 변형되는 MGDF 종을 불활성시키는 온도, 용매 및 pH 와 같은 조건은 피해야 한다.
아실화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 일반적으로 폴리-폴리에틸렌 글리콜화된 MGDF 생성물을 생산하며, 여기서 리신 ε-아미노기가 아실 결합기에 의해 폴리에틸렌 글리콜화된다. 바람직하게, 연결결합은 아미드일 것이다. 또한 바람직하게, 결과 생성물은 실질적으로 유일하게(예를들어, ≥95%) 모노, 디 또는 트리 폴리에틸렌 글리콜화될 것이다. 그러나, 보다 높은 정도로 폴리에틸렌 글리콜화된 일부 종(species)(MGDF 리신 ε-아미노산기의 최대수+MGDF 아미노 말단에서의 하나의 α-아미노기 까지)은 보통 사용한 특이 반응 조건에 따른 양으로 형성될 것이다. 원한다면, 표준 정제 기술, 특히 투석, 염석, 한외여과, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 전기영동을 포함하는 기술로 혼합물, 특히 비반응 종으로 부터 보다 많이 정제된, 폴리에틸렌 글리콜화된 종을 분리할 수도 있다.
아실화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 일반적으로 환원제의 존재하에서 MGDF와 같은 단백질을 PEG의 말단 알데히드 유도체와 반응시킨다. 또한 아실화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 폴리-폴리에틸렌 글리콜화된 MGDF를 생성할 수 있다. 이외에, 실질적으로 유일하게 MGDF 종 N-말단의 α-아미노기에서 폴리에틸렌 글리콜화시키기 위해, 본원에서 기술한 바와 같은 반응조건을 조작할 수 있다(즉, 모노-폴리에틸렌 글리콜화된 종). 모노 폴리에틸렌 글리콜화된 생성물을 생산하기 위한, MGDF를 수반하는 전형적인 환원성 알킬화 반응은 제30도에 도시되어 있다. 모노폴리에틸렌 글리콜화나 폴리폴리 에틸렌 글리콜화 중 어느 경우든지, PEG 기가 -CH2-NH- 기에 의해 단백질에 결합되는 것이 바람직하다. 특히 -CH2- 기에 관하여, 이 유형의 결합은 본원에서 "알킬" 결합으로서 언급한다.
모노폴리에틸렌 글리콜화된 생성물을 생산하는 환원성 알킬화에 의한 유도체합성은 MGDF의 유도체합성에 유용한 1차 아미노기의 다른 유형(리신 대 N-말단)의 시차 반응성을 이용한다. 리신 잔기의 ε-아미노기와 단백질 N-말단의 α-아미노기 사이의 pKa 차이를 이용할 수 있는 pH(하기 참조)에서 상기 반응을 수행한다. 상기 선택적 유도체합성에 의해, 단백질에 대한, 알데히드와 같은 반응기를 함유하는 수용성 중합체의 부가는 조절된다 : 중합체와의 콘쥬게이션은 단백질의 N-말단에서 주로 일어나며 리신 측쇄 아미노기와 같은 다른 반응기의 유의 변형은 발생하지 않는다.
따라서, 본 발명의 바람직한 양상은 폴리에틸렌 글리콜화된 MGDF에 관한 것이며, 여기서 PEG 기(들)는 아실기나 알킬기에 의해 부가된다. 상기와 같이, 그러한 생성물은 모노-폴리에틸렌 글리콜화되거나 폴리-폴리에틸렌 글리콜화(예를들어, 2-6, 바람직하게 2-5 개의 PEG 기를 함유)될 수도 있다. PEG 기는 일반적으로 아미노산의 α또는 ε아미노기에서 단백질에 부가되나, 단백질에 부가된 임의의 아미노기에 PEG 기가 부가될 수도 있으며, 이 임의의 아미노기는 적합한 반응 조건하에서 PEG 기에 부가되도록 충분한 반응성을 가진다.
아실화 및 알킬화 접근법에 사용되는 중합체 분자는 수용성 중합체 또는 그의 혼합물 중에서 선택할 수 있다. 선택한 중합체는 단백질에 부가되어 생리적 환경과 같은 수성 환경에서 침전되지 않도록 수용성이어야 한다. 선택한 중합체는 아실화용 활성 에스테르나 알킬화용 알데히드와 같은 단일 반응기를 갖도록 변형되어야 하며, 바람직하게는 본 방법에서 제공한 바와 같이 중합도가 조절될 수 있도록 변형되어야 한다. 바람직한 반응성 PEG 알데히드는 물에 안정한, 폴리에틸렌글리콜 프로피온알데히드이거나, 모노 C1-C10 알콕시 또는 그의 아릴록시 유도체이다(미국 특허 번호 제 5,252,714 호 참조). 중합체는 가지나거나 가지나지 않을 수도 있다. 최종 생성물 제제의 치료학적 용도를 위해 중합체는 제약학적으로 용인 가능한 것이 바람직하다. 수용성 중합체는 예를들어, 폴리에틸렌 글리콜, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 동종 중합체류, 폴리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공-중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올류(예를들어, 글리세롤) 및 폴리비닐 알콜로 구성된 그룹에서 선택할 수 있다. 아실화 반응용으로 선택한 중합체(들)는 단일 반응성 에스테르기를 가져야 한다. 본 환원성 알킬화용으로 선택한 중합체(들)는 단일 반응성 알데히드기를 가져야 한다. 일반적으로, 수용성 중합체는 자연 발생적인 글리코실 잔기 중에서는 선택하지 않을 것인데, 그 이유는 이들이 보통 포유동물 재조합 발현계에 의해 보다 알맞게 제조되기 때문이다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수도 있으며 가지나거나 가지나지 않을 수도 있다.
본원에 사용하기 위해 특히 바람직한 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 약어로 PEG 이다. 본원에 사용한 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은 모노-(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴록시- 폴리에틸렌 글리콜과 같이, 다른 단백질의 유도체 합성에 사용되어 왔던 임의의 PEG 형태를 포함할 것이다. 폴리에틸렌 글리콜화된 MGDF의 제조방법은 일반적으로 (a) MGDF가 하나 이상의 PEG 기에 부가될 수 있는 조건하에서 폴리에틸렌 글리콜(예를들어, PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체)과 MGDF 폴리펩티드를 반응시키고, (b) 상기 반응 생성물(들)을 수득하는 단계를 포함할 것이다. 일반적으로, 아실화 반응을 위한 최적의 반응 조건은 공지의 변수 및 원하는 결과에 근거하여 그때 그때 결정될 것이다. 예를들어, PEG:단백질의 비율이 더 클수록 폴리-폴리에틸렌 글리콜화된 생성물의 백분율은 더 높을 것이다.
중요한 다른 고려할 사항은 중합체의 분자량이다. 일반적으로, 중합체의 분자량이 더 높을 수록 단백질에 부가될 수 있는 중합체 분자의 수는 더 적을 것이다. 유사하게, 중합체의 가지치기(branching)도 이들 변수를 최대로 이용할때 고려해야 한다. 일반적으로, 분자량이 더 높을수록(또는 더 가지날 수록) 중합체 : 단백질 비율은 더 높다. 일반적으로 본원에서 의도한 폴리에틸렌 글리콜화 반응을 위한 바람직한 평균 분자량은 약 2kDa 내지 약 100kDa 이다(용어 "약"은 ±1kDa 을 의미함). 바람직한 평균 분자량은 약 5kDa 내지 약 50kDa이고, 특히 바람직하게 약 12kDa 내지 약 25kDa 이며, 가장 바람직하게는 20kDa 이다. MGDF 단백질에 대한 수용성 중합체의 비율은 일반적으로 1 : 1 내지 100 : 1의 범위이며, 바람직하게(폴리폴리에틸렌 글리콜용으로) 1 : 1 내지 20 : 1 및(모노폴리에틸렌글리콜용으로) 1 : 1 내지 5 : 1 이다.
상기한 조건을 이용하여 환원성 알킬화시키면, 아미노 말단에서 α-아미노기를 가지는 임의의 MGDF 단백질에 중합체가 선택적으로 부가될 것이며 단중합체/MGDF 단백질 결합체의 실질적인 동종 제제가 제공될 것이다. 여기서 사용하는 용어 "단중합체/MGDF 단백질 결합체"는 MGDF 단백질 분자에 부가된 단일 중합체 분자로 이루어진 조성물을 의미한다. 단중합체/MGDF 단백질 결합체는 바람직하게 N-말단에 위치하지만, 리신 아미노 측면 기에는 위치하지 않는 중합체 분자를 가질 것이다. 제제는 비반응의, 식별가능한 분자 잔류물(즉, 중합체 성분이 결여되어 있는 단백질)과 함께, 단중합체/MGDF 단백질 결합체가 90% 이상인 것이 바람직할 것이며, 95% 이상의 단중합체/MGDF 단백질 결합체가 보다 바람직할 것이다. 하기 실례는 적어도 약 90% 단중합체/단백질 결합체 및 약 10% 비반응 단백질인 제제를 제공한다. 단중합체/단백질 결합체는 생물학적 활성도를 가진다.
본 발명의 조성물에 유용한 지질 소포는 문제의 단백질과 상호작용할 수 있는 음전하 리포솜이다.
본원에서 사용된 주목할만한 리포솜은 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 에그포스파티딜글리세롤, 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 에그포스파티딜에탄올아민, 디올레오일포스파티드산(DOPA), 디미리스토일포스파티드산(DMPA), 디팔미토일포스파티드산(DPPA), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 디미리스토일포스파티딜세린(DMPS), 에그포스파티딜세린, 리소포스파티딜글리세롤, 리소포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜세린을 포함한다. 사용되는 특별한 리포솜에 따라 리포솜의 양은 달라진다.
단백질:인지질 조성물은 원하는 범위내로 용액의 pH를 유지하기 위해 완충제를 함유하는 것이 바람직하다.
바람직한 완충제에는 아세트산나트륨, 인산나트륨 및 시트르산 나트륨이 포함된다. 또한 이들 완충제 혼합물을 사용할 수도 있다. 조성물에 유용한 완충제의 양은 사용하는 특별한 완충용액 및 용액의 pH에 크게 의존한다. 예를 들면, 아세테이트는 pH 6의 완충용액 보다 pH 5의 완충용액에 더 효과적이므로, pH 6 보다 pH 5인 용액에서 더 적은 양의 아세테이트가 사용된다. 본 발명의 조성물에 대한 바람직한 pH 범위는 pH 3.0-7.5이다.
본 발명의 조성물이 주사액으로 더 알맞고 등장성인 용액이 되도록 등장 조절제를 함유시킨다. 가장 바람직한 완충제는 0-150mM 농도 범위의 염화나트륨이다.
또한 본 발명은 제약학적으로 용인가능한 희석제, 방부제, 용해제, 유화제, 보조제 및/또는 담체와 함께 본 발명의 유효량의 폴리펩티드 산물을 함유하는 제약학적 조성물을 포함한다. 그러한 조성물은 단백질의 물리적 상태, 안정성 및 생물학적 유용성에 영향을 끼칠 것이다.
본원에서 참고문헌으로 인용한 Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, 1435-1712(펜실베니아 이스톤에 소재하는 맥 퍼블리싱 캄파니, 1990)를 참조하라. 특별한 경우에 있어서 단백질의 유효량을 정하는 것은 바람직한 치료 결과, 증상의 심각성 또는 치료될 질병, 환자의 물리적 상태 등을 포함하여 지식있는 의사가 고려해야 할 요소의 다양성에 달려 있다.
E.coli 유래 rhG-CSF와 관련된 바람직한 구체예에서, 사용한 리포솜 소포는 pH 4.5, 10mM 아세트산나트륨 내에 함유시킨 50:1 비율의 DOPG:G-CSF를 갖는 DOPG이다.
E.coli 유래 rhGM-CSF와 관련된 바람직한 구체예에서, 사용한 리포솜 소포는 pH 7.0, 인산염 완충 식염수(PBS) 내에 함유시킨 17:1 비율의 DMPG:GM-CSF를 갖는 DMPG이다.
화학적으로 변형시킨(폴리에틸렌 글리콜화된) E.coli 유래 rhG-CSF와 관련된 바람직한 구체예에서,RhG-CSF는 트리-테트라 폴리에틸렌 글리콜화된 것이고, 사용한 리포솜 소포는 pH 4.5, 17:1 비율의 DMPG:PEG-G-CSF를 갖는 DMPG 이다.
E.coli 유래 MGDF 1-163과 관련된 바람직한 구체예에서, 사용한 리포솜 소포는 pH 5.0, 10mM 아세트산 나트륨 5% 소르비톨 내에 함유시킨 100:1 비율의 DMPG:MGDF를 갖는 DMPG 이다.
화학적으로 변형시킨(폴리에틸렌 글리콜화된) E.coli 유래 MGDF 1-163과 관련된 바람직한 구체예에서, MGDF는 환원성 알킬화에 의해 모노-폴리에틸렌 글리콜화되고(20 kDa), 사용한 리포솜 소포는 pH 5.0 10mM 아세트산 나트륨 5% 소르비톨내에 함유시킨 100:1 비율의 DMPG:MGDF를 갖는 DMPG 이다.
CHO 유래 MGDF 1-332와 관련된 바람직한 구체예에서, 사용한 리포솜 소포는 pH 5.0, 10mM 아세트산 나트륨 5% 소르비톨내에 함유시킨 100:1 비율의 DMPG:MGDF를 갖는 DMPG 이다.
본 발명을 특수한 단백질:지질 조성물 및 처리 방법에 관하여 기술하고 설명하였지만, 본 발명의 범주에서 벗어나지 않고 조성물 및 처리 방법을 변화시킬 수 있음은 통상의 기술자들에게 자명할 것이다.
다음 실시예는 본 발명의 여러가지 양상을 더 상세히 설명해 줄 것이다.
[실시예 1]
재조합 인체 G-CSF(rhG-CSF)가 지질 소포내로 결합되는 가능성을 조사하기 위한 초기 실험을 수행하였다. rhG-CSF는 Souza의 미국 특허 제 4,810,643 호에 기술된 바와 같이 인체 G-CSF를 암호화하는 DNA 시퀀스로 E.coli 세포를 형질감염시키는 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성하였다.
rhG-CSF를 묽은 염산, pH 4.0내에 함유시켜 4㎎/㎖ 용액으로서 제조하였다. 모든 지질은 아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids)(앨라배마 앨러배스터에 소재)에서 수득하고 클로로포름내에 함유시켜 최종농도 100㎎/㎖ 로 질소하 -20℃에서 저장하였다.
[G-CSF:인지질 복합체의 제조방법]
G-CSF를 결합시키기 위한 지질 소포를 제조하기 위해, 30μmole의 적당한 지질을 유리 시험관에 나누어 넣고 질소가스 흐름을 이용하여 얇은막으로 건조시켰다. 진공하에서 적어도 2시간 동안 지질막을 건조시켜 모든 미량의 클로로포름을 제거하였다. 지질막을 증류된 탈염수(ddH2O), 인산염 완충 식염수, pH 7.2(집코/BRL "D-PBS")나 아니면 150mM NaCl에서 수화시켰다. 그런 다음 욕조형 음파처리기(뉴욕 힉스빌에 소재하는 라보라토리 서플라이스에서 수득)에서 시료를 음파처리하였다.
시료가 시각적으로 맑아질 때까지 음파처리를 계속하였다(보통 10-15분). 사용할 때까지 시료를 질소하 4℃에서 저장하였다. 최종 지질 농도는 30mM 이었다. 택일적으로, 300μmole의 지질을 취하여 질소하에서 건조시킨 후 상기와 같이 건조시켜 지질 소포를 제조할 수 있다. 건조 지질막을 상기와 같이 10㎖의 적당한 수용액에서 수화시켰따. 그런 다음 시료를 10,000 psi에서 작동하는 벤치 스케일 유화기(bench scale emulsifier)(마이크로 플루이딕스 모델 110S, 메사츄세츠 캠브리지에 소재하는 마이크로플루이딕스 인코포레이티드에서 수득)로 미세유동화하였다. 상기 장치를 통하여 10 순환 동안 시료를 재순환시켰다. 그런 다음 미세유동화된 시료를 상기와 같이 4℃에서 저장하였다.
G-CSF(상기와 같음)를 특정 지질(상기와 같음)과 혼합하여 G-CSF:인지질 복합체를 제조하였다. 혼합은 와동(vortexing), 교반(stirring), 또는 서서히 진탕(shaking)시켜서 행한다. 단백질의 막 삽입 및 안정성을 평가하기 위해 여러가지 몰비를 갖는 지질 : G-CSF를 제조하였다. 예를 들어, 지질:G-CSF의 몰비가 40:1인 0.2㎎/㎖ G-CSF의 시료 3㎖(물내에 함유됨)를 제조하기 위해, 150㎕의 G-CSF 저장물을 44㎕의 지질(음파처리에 의해 물내에서 제조한 30mM 저장물)과 결합시키고 최종 시료 부피가 3㎖가 되도록 물을 가한다. 5분간 항온하는 것을 권하며(필수적이지는 않음), 시료를 사용하거나 분석하기 전에 본원에서는 이와 같이 행하였다.
G-CSF를 미세유동화하기 전에 수화 지질과 결합시킬 수도 있다. 상기와 같이 혼합물을 직후에 유동화시킨 결과 G-CSF가 지질막 내로 결합된다.
[G-CSF:인지질 복합체의 분석]
1. 트립토판 방출 스펙트럼
rhG-CSF에는 2개의 트립토판 잔기가 있는데, 이는 위치적 환경조건에 절대적으로 민감하다. 따라서, rhG-CSF를 리포솜과 접촉시킬 때의 rhG-CSF 트립토판 형광을 측정하기 위한 분석을 수행하였다. 형광 방출 최대치에서의 청색이동은 트립토판이 보다 소수성 환경하에 존재하기 때문이므로 rhG-CSF가 지질막내에 삽입되어져 있음을 암시한다. 트립토판 형광 분석에 관한 우수한 평론지는 Principles of Fluorescence Microscopy, by J. Lakowicz, chap 11(Plenum Press, New York, 1983)이다.
G-CSF:지질 복합체의 트립토판 형광은, 시료를 280㎚에서 흥분시키는 반면에 1㎚/sec의 속도에서 1㎚ 증가량으로 285㎚에서 420㎚ 까지의 방출을 스캐닝하여 분석하였다. 시료 부피는 3㎖ 였고 모든 시료에 대한 G-CSF의 최종 농도는 0.2㎎/㎖ 였다. PTI 알파스캔(Alphascan) 형광측정계(뉴저지 사우스 브룬스윅에서 수득)를 사용하여 모든 형광 측정을 수행하였다. 모든 측정은 25℃에서 행하였는데 이 온도는 순환 수조에 연결된 워터-자켓 크벳 홀더(water-jacketed cuvette holder)를 사용하여 유지하였다. 방출 스펙트럼을 모아 PTI에서 제공한 데이타 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
DOPG로 구성된 작은 단일층 소포가 존재하거나 부재할 때의 rhG-CSF 형광 스펙트럼이 제1도에 도시되어 있다. rhG-CSF는 DOPG 소포의 부재시 334㎚에서 방출 최대치를 가진다. 지질:단백질의 비율은 100:1로서 DOPG가 존재하면, rhG-CSF 트립토판 형광은 327㎚의 형광 방출 최대치에서 청색 이동을 나타내고 형광의 세기는 극적으로 증가한다. DOPG 존재시 저파장의 형광 방출은 트립토판이 천연 단백질보다 더 소수성인 환경에서 존재함을 암시한다. 제2도에서 입증된 바와 같이, 형광 이동은 DOPG:G-CSF의 몰비에 달려있으며 막 삽입은 DOPG:G-CSF의 비가 10:1이 되었을 때 검출가능하다.
2. 요오드화물 소광(quenching) 실험
요오드화물은 트립토판 형광의 유효 충돌 소광제(quencher)이지만 지질막을 투과하지는 못한다. 따라서, 요오드화물에 의한 트립토판 형광의 유효 소광은 대부분의 수용성 용매에 잔기가 노출되었음을 의미하지만, 요오드화물 소광으로 부터의 보호는 단백질 트립토판이 수용성 용매에서 떨어져 있을 때에 발생한다. 이 실험에서, G-CSF와 DOPG:G-CSF 조성물(100:1 의 지질:단백질 비율)을 사용했다. 시료에 대한 초기 읽기(F0)를 택하여 기록한 후, 요오드화 칼륨(KI)(5M 저장물)을 증량하여 가한 후에 형광의 세기를 측정하였다. Lee 등의 Biochem. Biophys. Acta, 984 : 174-182(1989) 문헌 및 Doan 등의 Biochem. Biophys. Acta, 858 : 1-5(1986) 문헌에 기술된 바와 같이 시료와 KI 용액 모두가 1mM Na2SO3(최종 농도)를 함유하도록 제조하였다. Na2SO3의 첨가를 단백질과 막을 비극성 부분으로 분리시킬 수 있는 I2의 형성을 방지한다. 데이타는 스턴-볼머(Stern-Volmer) 방정식(F0/F=1+KKI[KI])으로 분석하되, 여기서 F0와 F는 각기 농도 [KI]에서 KI의 존재 및 부재시 시료의 형광 세기이다. KKI는 G-CSF 트립토판 잔기의 KI 소광에 대한 스턴-볼머 소광 상수이다 ; Lehrer, S. 의 Biochemistry 10 : 3254-3263(1979).
데이타의 스턴-볼머 플롯(plot)은 제3도에 나타나 있다. DOPG 소포가 없을 때, rhG-CSF 형광은 KI에 의해 효과적으로 소광된다. DOPG가 존재할 때, 데이타의 스턴-볼머 플롯은 직선이며, 이는 요오드화물이 두 트립토판에 근소하게 접근함을 의미한다. 데이타는, DOPG가 없을 때에 요오드화물-접근가능한 트립토판 잔기가 DOPG가 존재할 때에는 요오드화물에 접근하기 어렵게 됨을 나타낸다. 따라서, 이러한 트립토판을 함유하는 rhG-CSF의 일부가 DOPG 이분자층에 삽입되어져 있음은 틀림없다.
3. 에너지 이동 측정
예기한 바와 같이, 에너지 이동은 트립토판 공여체와 피렌데칸산(pyrene decanoic acid)과 같은 지질 가용성 형광 수용체 사이에서 발생하는데, 이는 이 프로브의 여기 스펙트럼이 트립토판의 방출 스펙트럼과 상당히 중복되기 때문이다. Friere 등의 Biochemistry 22 : 1675-1680(1983) 문헌 참조. 단백질이 지질막내에 삽입되면, 트립토판에서 피렌으로의 에너지 이동은 결과적으로 트립토판 형광의 소광을 초래할 것이다. 이 실험에서, 여러가지 지질:G-CSF 복합체의 트립토판 방출 세기는 다양한 양의 피렌 데칸산(테트라히드로푸란내에 함유된 30㎍/㎖ 저장물)을 가하기 전(F0) 및 후(F)에 기록한 것이다. 피렌 데칸산과 시료 사이의 혼합물 촉진시키도록 피렌 데칸산을 가하는 동안 시료를 계속 교반하였다. F/F0의 비는 G-CSF 트립토판과 소수성 에너지 수용체 피렌 데칸산 사이에 발생하는 에너지 이동량에 비례한다.
제4도는 부가한 피렌 데칸산의 작용에 따른, DOPG의 존재시(100:1의 지질:단백질 비율) rhG-CSF에 대한 소광 프로필을 나타낸다. 소광은 매우 낮은 피렌 데칸산 농도(<1몰 %)에서 발생되므로, 막 구조 및 작용에 대한 형광 프로브의 효과는 최소이다. 피렌 데칸산이 지질 이분자층을 신속히 분리한다고 예상할 수 있으므로, 본 데이타는 rhG-CSF가 트립토판에서 피렌 수용체로 에너지 이동이 효과적으로 가능하게 하도록 충분히 DOPG 막 깊이 삽입되어 있음을 나타낸다. 에너지 이동은 rhG-CSF의 존재 및 부재시 피렌 데칸산-표지 DOPG 소포의 여기 스펙트럼을 조사함으로써 입증하였다.
상기 분석은 rhG-CSF가 DOPG와 같은 불포화 인지질과 밀접하게 상호작용할 수 있음을 나타낸다. DOPG 소포가 존재할 때, rhG-CSF 트립토판은 수용성 형광 소광제로부터 보호되나, 소수성 형광 프로브로의 에너지 이동에 의한 소광에는 민감하다. 종합하면, 데이타는 rhG-CSF가 DOPG로 구성된 막내에 삽입될 수 있음을 나타낸다. 막 삽입은 10:1 비율(지질:G-CSF)이 되었을 때 검출가능한데, 여기서 수는 단백질의 삽입부분을 둘러싸는 지질의 수를 의미할 수도 있다.
[실시예 2]
이 실시예에서, 다른 인지질과 상호작용하기 위한 rhG-CSF의 능력을 상기한 바와 같이 F/F0세기 및 방출 최대치를 비교하여 결정하였다. 각 예에서, 지질:rhG-CSF의 몰비는 100:1 이었다.
제5도는 다양한 지질의 부재 및 존재시 rhG-CSF에 대한 F/F0데이타를 나타낸 것이다. 제6도는 동일 조성물에 대한 방출 최대치 데이타를 나타낸 것이다.
제5도 및 6도의 데이타는 DOPG 이외에 rhG-CSF가 DMPG, DPPG내에 삽입될 수 있고, 덜 효과적이지만, 포스파티딜에탄올아민류(PE'S) 및 포스파티딜세린류(PS's)내에 삽입될 수 있음을 설명한다. 또한, NG-DOPE(PE 헤드그룹을 보다 음성적으로 제조한 DOPE 시료)가 DOPE 보다 rhG-CSF의 삽입을 증진시킨다고 밝혀졌다.
DOPG, DMPC 및 DPPC는 중성 지질이며 이들 소포는 rhG-CSF의 방출 최대치나 아니면 형광 세기에 거의 영향을 미치지 않는데, 이는 rhG-CSF가 이들 인지질과 상호작용하지 않음을 의미한다(제5 및 6도, 제7도, 곡선 2 참조).
상기 데이타는 용융 구현 상태로 전이될 수 있는 단백질이 다양한 지질 소포내에 삽입될 수 있음을 설명한다.
그러나, 이 rhG-CSF:지질의 상호작용은 단지 음전하 지질 소포를 사용할 때 발생한다. 음전하 지질 소포 중에서 최대 음전하를 갖는 소포가 보다 강한 rhG-CSF:지질 상호작용을 제공한다고 여겨진다.
[실시예 3]
이 실시예에서, DOPG:rhG-CSF 상호작용의 효과-단백질 안정성과 관련되므로 - 를 측정하였다. 펠티어-타입(Peltier-type) 온도조절기 세포 홀더와 자석 교반기를 갖춘 자스코(Jasco) J-720 장치로 원편광 이색성을 측정하였다. 80㎍/㎖, pH 6.0의 최종 rhG-CSF 농도를 사용하여 222㎚에서 원편광 이색성을 측정하였다.
마이크로칼(Microcal) MC-2 열량계를 사용하여 시차 스캐닝 열량측정법을 행하였다. rhG-CSF(1㎎/㎖, 물에 함유)나 DOPG:rhG-CSF(45:1 몰/몰, 물에 함유)의 시료를 90℃/시의 속도에서 스캐닝하였다. 데이타를 저장하여 마이크로칼소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
G-CSF의 알파 나선성의 온도-유도 변화는 증가하는 온도의 작용에 따른 원편광 이색성(222㎚)을 측정한 결과일 수 있다. pH 6.0에서 rhG-CSF의 열-유도 펼쳐짐에 관하여는 제8도에 나타나 있다. 곡선은, 상당히 뚜렷한 전이가 알파 나선성의 상실을 초래하는 ~60-70℃에서 발생함을 나타낸다.
이러한 전이후에 rhG-CSF는 용액으로부터 비가역적으로 침전된다. 펼쳐짐의 온도 범위는 제9도에 도시한 대로 시차 스캐닝 열량측정법으로 측정한 바와 같이 pH 7.0에서 rhG-CSF의 녹는 온도와 유사하다.
대조적으로, DOPG:rhG-CSF 시료는 rhG-CSF 단독과는 다르게, 온도가 상승하면서 알파 나선성이 점차적으로 상실됨을 나타내되, DOPG:rhG-CSF의 온도-유도 펼쳐짐은 협조적인 것 같지 않다(제8도 참조). 또한 이러한 결과는 시차 스캐닝 열량측정법으로 제시한 바와 같이 용융 전이의 결여로써 설명된다(제9도). DOPG:rhG-CSF 시료를 95℃로 가열한 후에 알파 나선성이 회복될 수 있음은 주목할 만하며, 냉각시 나선성이 완전히 회복되도록 95℃와 10℃ 사이를 되풀이해서 순환시킬 수 있다(제10도 참조). 이들 조건하에서 rhG-CSF 만이 비가역적으로 펼쳐져 용액으로 부터 침전된다.
G-CSF 원편광 이색성에 대한 DMPG와 DPPG의 효과도 조사하였다. 150:1 비율의 지질:rhG-CSF를 사용하였고, DOPG, DMPG 및 DPPG를 수반한 경우에도 마찬가지로 rhG-CSF의 2차 구조를 안정시켰다(제11-13도).
이들 데이타는 DOPG, DMPG 및 DPPG와 rhG-CSF의 상호작용이, rhG-CSF 단독만으로는 불안정한 조건하에서 단백질의 안정화를 증진시킴을 설명한다. 상호작용은 rhG-CSF의 2차 및 3차 구조를 직접 안정시킨다.
[실시예 4]
이 실시예에서, rhG-CSF:DOPG 상호작용의 효과 -rhG-CSF의 생물학적 활성도와 관련되므로 - 를 측정하였다. rhG-CSF의 시험관내 활성도는 Zsebo 등의 Immunobiology 172:175-184(1986) 문헌에 기술된 대로 쥐(mouse) 골수 세포에 의한 [3H]-티미딘의 G-CSF 의존 섭취를 이용하여 측정하였다.
모든 활성도는 3번씩 측정하였다. 생체내 활성도는 햄스터를 피하주사하여(100㎍/㎏의 rhG-CSF 투여량) 백혈구(WBC) 수를 측정하여 결정하였다.
1. 시험관내 활성도
A. DOPG의 부재 및 존재시 rhG-CSF의 고유활성도를 측정하였다. 열 처리한 rhG-CSF와 DOPG:rhG-CSF 시료도 시험하였다. 결과는 표 1에 요약되어 있다.
[표 1]
표 1에서 제시한 바와 같이, rhG-CSF를 DOPG 이분자층내에 삽입시켜도 생물학적 활성도에 역영향을 미치지 않는다. 85℃로 10분간 가열한 후에 rhG-CSF는 검출 불가능한 활성도와 단백질 침전물을 가진다. 이와 유사하게 처리한 후에 DOPG:rhG-CSF는 가열하지 않은 rhG-CSF 활성도를 ~85% 유지하고 냉각에 대한 2차 구조를 완전히 회복한다.
B. 냉동건조시키는 동안에 rhG-CSF를 안정화시키는 다양한 지질의 능력 또한 연구하였다. 다양한 지질과 함께 rhG-CSF의 시료를 냉동건조시켜서 활성도를(상기와 같이) 측정하였다. DOPG,DMPG 및 DPPG를 rhG-CSF와 혼합하면 냉동건조후 rhG-CSF의 생물학적 활성도는 ~100% 유지된다(제14도). rhG-CSF 단독은 냉동건조 과정에서 잔존하지 않는다.
3. 생체내 활성도
지질의 부재 및 조재시 rhG-CSF의 활성도(WBC 수)를 측정하였다. 활성도는 0 일째 피하주사(100㎍/㎏의 rhG-CSF 투여량) 한 후 측정하였다. 5개의 상이한 지질:rhG-CSF 복합체를 측정하였으며 각 경우에 지질:rhG-CSF 복합체는 생체내 활성도를 유지했다(제15 및 16도).
상기 연구는 음전하 지질 이분자층내로의 삽입이 rhG-CSF의 생물학적 활성도에 역영향을 미치지 않음을 설명한다. 게다가, 지질의 보호 효과로 냉동건조 과정 동안에 rhG-CSF가 보호됨은 자명하다.
[실시예 5]
이 실시예에서, 화학적으로 변형시킨 G-CSF[폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF(PEG-G-CSF)] 및 진핵 숙주세포 발현 생성물(CHO-G-CSF)로서 수득한 G-CSF를 음전하 지질 소포와 상호 작용하는 능력에 대해 시험하였다. CHO-G-CSF에 있어서, F/F0세기 및 방출 최대치를 비교하여 측정하였다(상기 실시예 1에 기술된 바와 같음). 각 경우에, 지질:단백질의 몰비는 100:1 이었다. PEG-G-CSF에 있어서, 원편광 이색성 분석을 기초로 하여 측정하였다.
사용한 CHO-G-CSF는 Souza의 미국 특허 제 4,810,643 호에 기술된 대로 인체 G-CSF를 암호화하는 DNA 시퀀스로 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 형질감염시키는 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성하였다. CHO-G-CSF를 PBS, pH 7.0 내에 함유시킨 0.6㎎/㎖ 용액으로서 제조하였다. CHO-G-CSF는 rhG-CSF와 유사한 방법으로 DOPG와 상호작용하였으며, 각 시료는 DOPG의 존재시 증가된 형광 세기를 나타낼 뿐만 아니라 DOPG의 존재시 방출 최대치에서 청색 이동을 나타냈다(제17 및 18도). 따라서, DOPG 상호작용은 G-CSF 재조합형의 다소의 특이성에 기인하는 것은 아니다.
이 실험에서 사용한 PEG-G-CSF는 트리-테트라 폴리에틸렌 글리콜화된 E.coli 유래 G-CSF 였다(PEG 6000 사용). DMPG:PEG-G-CSF(17:1 몰/몰) 시료를 상기 방법을 사용하여 제조하였다. DMPG:PEG-G-CSF 시료는 가열후 2차 구조가 완전히 회복된다고 밝혀졌다(제19도). PEG 분자가 존재함에도 불구하고, 유도체화된 단백질은 천연 단백질과 동일한 방법으로 지질과 상호작용할 수 있었다.
상기 데이타는 음전하 지질 소포와 G-CSF의 상호작용과 관련된 안정화 효과가 원핵 숙주세포 발현 생성물로서 수득한 rhG-CSF에만 유일한 것이 아님을 나타낸다. MGS로 전이될 수 있으며 리포솜 소포와 접촉시킨 화학적으로 변형된 단백질인 본원의 PEG-G-CSF:DMPG 또한 안정화 효과를 나타냈다.
[실시예 6]
이 실시예에서, GM-CSF에 대한 DMPG와 DPPG의 효과를 연구 하였다. GM-CSF는 Boone의 미국 특허 제 5,047,504 호에 기술된 바와 같은 재조합 인체 GM-CSF이며, 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.0 내에 함유시킨 1㎎/㎖ 용액으로서 제조하였다. 지질:GM-CSF의 비율은 17:1로 사용하였고 상기한 바와 같이 원편광 이색성 분석을 이용하여 열 안정성을 측정하였다. DMPG와 DPPG는 GM-CSF의 열 안정성을 보다 우수하게 하는데, 즉 가열 후에 2차 구조를 회복시킬 수 있다(제20(a)도 및 제20(b)도).
이들 데이타는 단백질에 대한 보다 우수한 열 안정성을 제공하도록 용융 구형 상태로 전이될 수 있고, 음전하 지질 소포와 상호작용할 수 있는 단백질의 또 다른 실시예를 제공한다.
[실시예 7]
이 실시예에서, 소장내 투여후 G-CSF에 대한 치료학적 반응을 증가시키는 가능성을 평가하기 위해 DOPG:PEG-G-CSF 복합체를 사용하였다. 이 실험을 위해, DOPG는 실시예 1에 기술한 대로 제조하였고 PEG-G-CSF는 실시예 5에 기술한 대로 제조하였다. 100μmole의 지질(797㎕)을 진공하에서 건조시킨 후 1㎖의 밀리 Q 물을 가하여 100mM 용액의 지질을 만들었다. 이 용액을 소니케이팅 수조(뉴욕 힉스빌에 소재하는 라보라토리 서플라이 인코포레이티드로 부터 구입한 모델 G 112SP1T)에서 5분간 또는 지질 용액이 맑아질 때까지 소니케이션시켰다. 9μmol의 DOPG용액(90㎕)을 1mM HCl에 함유시킨 90nmol의 천연 rhG-CSF 나 PEG-G-CSF에 가하였다. 이 용액을 와동시키고 1mM HCl과 함께 2㎖의 최종 부피가 되게 하였다. 쥐(rat)내로 십이지장내 투여하기 위해, 상기 물질을 이 동물내로 삽입시킨 삼투성 펌프에 두었다. 이 물질은 24시간 동안 방출된다.
rhG-CSF와 PEG-G-CSF를 지질과 함께 주입시킨 상기 동물 및 지질 없이 주입시킨 상기 동물에 대한 총 WBC 분석 결과는 제20도에 도시되어 있다. 제20(a)도는 천연 G-CSF 주입이 매개체 대조와 비교하여 WBC 반응을 자극하지 않음을 나타낸다. 이와 같은 부가는 rhG-CSF에 대한 상기 동물의 치료학적 반응에 거의 영향을 주지 않는다.
폴리에틸렌 글리콜화된 G-CSF에 대한 쥐의 반응은 제20(b)도에 도시되어 있다. PEG-G-CSF를 단독으로 주입한 경우 WBC 반응을 자극하였음을 알 수 있다. WBC의 증가는 기선(baseline)으로 되돌아 오기 전 48시간 까지는 계속된다. DOPG와 함께 제제화시킨 PEG-G-CSF 역시 WBC 반응을 자극하는데, 이 반응은 PEG-G-CSF 단독 주입의 경우보다 거의 2배다 더 크다. 이 결과는 주입후 PEG-G-CSF의 혈청 수준을 측정함으로써 확인된다(제21도).
이 데이타는 PEG-G-CSF의 경구 제제형내에 DOPG와 같은 음이온성 지질을 포함시킴으로써 유도체화시킨 단백질에 의해 유도되는 치료학적 반응이 증가함을 입증한다. 관련 메카니즘은 현재로서 이해되지 않는다.
[실시예 8]
이 실시예에서, MGDF에 대한 DMPG의 효과를 연구하였다. 이 MGDF는 10mM 아세테이트, 5% 소르비톨, pH 5.0 내에 함유시킨 1.0㎎/㎖ 용액으로서 제조한 재조합 인체 E.coli 유래 MGDF 1-163 이었다. DMPG:MGDF 복합체는 실시예 1에 기술한 대로 제조하였다.
[DMPG:MGDF 복합체 분석]
1. 트립토판 방출 스펙트럼
DMPG 소포체와 MGDF의 상호작용 측정에 사용했던 MGDF에는 하나의 트립토판 잔기가 존재한다(위치 51).
DMPG:MGDF 복합체의 트립토판 형광은 0.1㎎/㎖의 MGDF 농도를 사용하여, 실시예 1에 기술한 대로 검정하였다. DMPG로 구성된 작은 단층판 소포의 존재 및 부재시 MGDF 형광 스펙트럼이 제22도에 도시되어 있다. MGDF는 DMPG 소포 부재 하의 336㎚에서 방출 최대치를 가진다. 지질:단백질의 비율이 100:1인 DMPG의 존재하에서, MGDF 트립토판 형광은 328㎚의 형광 방출 최대치에서 청색이동을 나타낸다. DMPG 존재하에서 낮은 파장의 형광 방출은 트립토판이 천연 단백질 보다 더 많은 소수성 환경하에 있음을 암시한다. 또한, 제23도에 도시된 바와 같이, 일단 8-30:1 비율의 DMPG:MGDF에 이르면 막 삽입이 검출 가능하므로, 형광 이동은 DMPG:MGDF의 몰 비율에 의존한다. 형광 이동은 ≥100:1 몰 비율에서 최대이고 MGDF는 pH가 7.0에서 5.0 으로 낮아짐에 따라 DMPG 소포에 대하여 분명히 더 높은 친화성을 나타낸다. 이 사실은 상기 상호작용을 증가시키거나 감소시키는데 특정 아미노산(예를들어, 히스티딘) 적정을 이용할 수도 있음을 암시한다.
2. 요오드화물 소광 실험
이 실험에서 요오드화물 소광 실험용으로 실시예 1에 기술한 바와 같은 MGDF 및 DMPG:MGDF 조성물(100:1 DMPG:MGDF)을 사용하였다. 데이타의 스턴-볼머 플롯은 제24도에 나타나있다. DMPG 소포의 부재시 MGDF 형광은 KI에 의해 효과적으로 소광된다. 대조적으로, DMPG가 존재할 때 트립토판은 요오드화물에 도달하기 어려운데, 이는 이 트립토판을 함유하는 MGDF 부분이 DMPG 이중층에 파묻혀 있음을 의미한다.
상기 분석은 G-CSF 및 GM-CSF를 수반한 경우 MGDF가 불포화 인지질 유사 DMPG와 밀접하게 상호 작용할 수 있음을 나타낸다. DMPG 소포가 존재할 때 MGDF 트립토판은 수용성 형광 소광제로부터 보호된다. 종합하면, 이 데이타는 MGDF가 DMPG로 구성된 막내로 삽입될 수 있음을 나타낸다. 막 삽입은 8:1 비율(DMPG:MGDF)에 도달하면 검출가능한데, 여기서 숫자는 단백질의 삽입부분을 둘러싸는 지질의 수를 의미할 수 있다.
[실시예 9]
이 실시예에서, DMPG:MGDF 상호작용의 효과-단백질의 안정성과 관련되므로 - 를 측정하였다. 열 안정성, 요소 존재시 안정성 및 MGDF(±DMPG)의 저장수명 안정성을 평가하였다. 각 연구에서 100:1 몰 비율의 DMPG:MGDF를 사용하였다.
1. 열 안정성
MGDF 단독, 또는 DMPG 소포내로 삽입시킨 MGDF의 원편광 이색성(222㎚ 에서의 CD)을 실시예 3, 제10도에 기술된 바와 같이 95℃와 10℃ 사이의 열 순환운동의 작용에 따라 측정하였다. 잔존 CD(%)는 상기 조성물의 비가열 시료의 CD와 비교하여 각 순환(1 순환은 10℃→95℃→10℃ 이다) 후 검출된 CD(10℃ 에서)의 양을 의미한다. MGDF가 가열 3 순환 후 그의 나선성이 70% 이상 상실된 반면, DMPG:MGDF는 동일 조건하에서 그의 본래 알파 나선성이 완전히 남아 있다(제25도 참조).
2. 요소 존재시 안정성
요소는 단백질을 펼치고 변성시킬 수 있는 챠오트로픽(chaotropic) 시약이다. MGDF(±DMPG)의 평형 변성은 형광 - 3차 구조 측정 - 및 원편광 이색성 - 2차 구조 측정 - 으로 측정하였다. 제26도에 도시된 바와 같이, 단백질의 3차 구조가 상실됨에 따라 트립토판 잔기는 물 상(phase)에 더 많이 노출되고 MGDF의 방출파장은 더 긴 파장으로 이동하며, 2차 구조가 상실됨에 따라 평균잔기 타원율(MRE)은 알파 나선성이 상실되므로 보다 덜 음성적이게 된다.
DMPG의 부재시, 3차 구조의 50% 상실은 약 3M 요소에서 발생하는 반면, DMPG의 존재시, 구조의 50%가 상실되기 위해서는 8M 요소가 필요하다. 유사하게, MGDF MRE 의 50% 상실은 DMPG 존재시 9M 요소가 필요한 반면, DMPG 부재시는 7M 요소를 필요로 한다.
3. 저장 수명 안정성
하기 표 2에 나타낸 조건하에서 E.coli MGDF 1-163(±DMPG)을 저장한 후, 100mM 인산염 완충액, 10%에탄올, 0.2% 트윈-20, pH 6.9의 이동상과 함께 토소-하스(Toso-Hass) H3000SWXL 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 시험하였다. 이동상에서 사용한 농도와 같은 농도의 에탄올과 트윈-20 으로 시료를 희석하여 10-20㎍ 시료를 런(run) 당 주입하였다. 컬럼 온도는 40℃에서 유지하였다. 임의의 응집 MGDF가 비-응집 단백질 보다 더 일찍 용리되며, 응집체 피크와 단량체 피크 곡선 아래의 면적을 측정함으로써 정량한다. 데이타는 응집체 피크의 총 MGDF(%)를 나타낸다.
[표 2]
표 2에 나타난 바와 같이, DMPG는 저장에 대한 응집체 형성을 극적으로 감소시킨다. 따라서 DMPG는 MGDF의 저장 수명을 증가시키는데 사용할 수 있다.
이 데이타는 MGDF와 DMPG 소포의 상호작용이, MGDF 단독만으로는 불안정한 조건하에서 단백질의 안정성을 증가시킴을 입증한다. 이 상호작용은 요소와 같은 변성제가 존재할 때 MGDF의 2차 및 3차 구조를 직접 안정시키며, 여러 온도에서 MGDF의 저장 수명을 상당히 증가시킨다.
[실시예 10]
이 실시예에서, 화학적으로 변형시킨 MGDF 1-163[모노-폴리에틸렌 글리콜화된(20kDa) MGDF 1-163(PEG-MGDF)]을 음전하 지질 소포와 상호작용하는 그의 능력에 대해 시험하였다. PEG-MGDF에 대하여 F/F0세기 및 방출 최대치를 비교하여 측정하였다(상기 실시예 1 및 8에 기술된 바와 같음). 각 경우에, 지질:단백질의 몰비는 100:1 이었다.
이 실험에서 사용한 PEG-MGDF는 환원성 알킬화에 의해, 모노-메톡시-폴리에틸렌 글리콜 알데히드(MePEG)(평균 분자량 20kDa)를 사용하여 모노-폴리에틸렌 글리콜화시킨(20kDa) E.coli 유래 MGDF 1-163 이었다. PEG-MGDF 결합체의 균질성은 미리 만든 4-20% 구배의 겔(노벡스)을 사용하여 도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정하였다. 46.9kDa 단백질 위치에 상응하는 하나의 주요 밴드가 나타났다.
상기한 과정을 이용하여 DMPG:PEG-MGDF(100:1 몰/몰)시료를 제조하였다. DMPG:PEG-MGDF 시료는 가열후 2차 구조가 완전히 회복된다고 밝혀졌다(제27도). PEG 분자가 존재함에도 불구하고, 유도체화된 단백질은 천연 단백질과 같은 방법으로 지질과 상호작용할 수 있었다.
이 데이타는 음전하 지질 소포와 MGDF의 상호작용과 관련되는 방출 최대치 변화가 원핵 숙주세포 발현 생성물로서 수득한 MGDF 에만 유일한 것이 아님을 나타낸다.
화학적으로 변형시킨 rhG-CSF로 입증된 바와 같이, DMPG:PEG-MGDF 역시 방출의 변화를 나타냈으며 이 데이타는 화학적으로 변형시킨 MGDF가 DMPG로 구성된 막 내로 삽입될 수 있음을 나타낸다.
[실시예 11]
이 실시예에서, DMPG:PEG-MGDF 상호작용 효과 - MGDF가 유리에 흡착하는 문제와 관련되므로 - 를 평가하였다. 지시된 최종 PEG-MGDF 농도를 획득하도록 약 11pg/㎖의 [125I]-PEG-MGDF를 다양한 농도의 비표지 PEG-MGDF 와 혼합하였다(제28도 참조). DMPG를 상기 희석물에 포함시켰다(또한 제27도 참조). 1㎖의 제제물을 3cc 유리 바이알(킴블)에 두었다. 실온에서 18시간 항온시킨 후 유리 바이알로부터 회수될 수 있는 방사표지 MGDF의 양을 계수하여 PEG-MGDF의 회수율(%)을 검정하였다. 제28도에 도시된 바와 같이, PEG-MGDF는 단백질의 농도가 낮아짐에 따라 유기 용기에 쉽게 흡착되는데, 이 흡착은 0.1-50㎍/㎖ 범위에서 특히 높다. 대조적으로, DMPG:PEG-MGDF 시료는 0.1-50㎍/㎖ PEG-MGDF 의 범위에서 유리에 거의 흡착하지 않는다.
[실시예 12]
이 실시예에서, DMPG:MGDF 1-163 과 DMPG:PEG-MGDF 1-163의 상호작용 효과 - MGDF 1-163 및 PEG-MGDF 1-163의 생물학적 활성도와 관련되므로 - 를 측정하였다. MGDF 1-163은 E.coli 유래된 것이고, 지질:단백질 비율은 100:1 이었다. 100㎍/㎏ 및 300㎍/㎏의 MGDF, PEG-MGDF, DMPG:MGDF 또는 DMPG:PEG-MGDF로 처리한 쥐(mouse)들로부터 혈소판 수를 측정하였으며 그 결과는 제31도에 도시되어 있다. 각 형태의 지시 농도를 정상의 암컷 Balb/c 쥐내로 8일간 매일 1회 피하 투여하였다. 마지막 주사후 24 시간에서 꼬리 정맥의 측면을 절단하여 시험용 출혈물을 모았다. 시스멕스(Sysmex) 전자 혈구분석기(캘리포니아 어빈에 소재하는 백스터 다이어그노스틱스 인코포레이티드에서 구입)를 사용하여 혈구 분석하였다. 데이타는 4 마리 동물의 평균 측정치, 이 평균의 +/- 표준오차로서 나타낸다. 이러한 처리는 총 백혈구수나 적혈구수와 같은 다른 혈구 변수에는 영향을 미치지 않았다(데이타는 도시하지 않았음).
이 결과는 E.coli MGDF 1-163의 폴리에틸렌 글리콜화가 이 분자의 생체내 활성도를 증가시킴을 나타낸다. 보다 중요하게 상기 연구는 음전하 지질 이중층 내로의 삽입이 다양한 MGDF 형태의 생물학적 활성도에 역영향을 미치지 않음을 입증한다.
Claims (25)
- 음으로 하전된 인지질로 구성된 자연 그대로의 인지질 리포솜 소포와 혼합되어 리포솜-MGDF 복합체를 형성하는 MGDF를 포함하며, 상기 MGDF는 리포솜 소포의 지질 부분내로 삽입되며 또 상기 리포솜-MGDF 복합체는 MGDF의 이차 구조의 펼쳐짐으로부터 직접적으로 안정화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물이 3.0-7.5의 pH를 가지고, 10:1 비율 이상의 지질:MGDF를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 리포솜 소포는 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 에그포스파티딜글리세롤, 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 에그포스파티딜에탄올아민, 디올레오일포스파티드산(DOPA), 디미리스토일포스파티드산(DMPA), 디팔미토일포스파티드산(DPPA), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 디미리스토일포스파티딜세린(DMPS), 디팔미토일포스파티딜세린(DPPS), 에그포스파티딜세린, 리소포스파티딜글리세롤, 리소포스파티딜에탄올아민 및 리소포스파티딜세린으로 구성된 군에서 선택한 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, MGDF는 천연 인체 MGDF이거나 원핵 또는 진핵 숙주 세포 발현 생성물로서 수득된 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제4항에 있어서, MGDF는 제29도의 MGDF 1-163 아미노산 1-163의 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 조성물.
- 제4항에 있어서, MGDF는 제29도의 MGDF 1-332 아미노산 1-332의 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, MGDF는 페길화된 MGDF(PEG-MGDF)인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제7항에 있어서, PEG-MGDF는 폴리에틸렌 글리콜로 페길화된 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제8항에 있어서, PEG-MGDF는 모노-페길화된 MGDF(mPEG-MGDF)인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제9항에 있어서, PEG기는 MGDF의 N-말단에 결합됨을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 제약학적으로 용인가능한 담체를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 MGDF는 대장균 유래 MGDF 1-163이고, 상기 리포솜 소포는 DMPG이며 또 상기 조성물은 100:1 비율의 DMPG:MGDF를 가지고, 5.0의 pH를 가지며, 10mM 아세트산 나트륨, 5% 소르비톨을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 MGDF는 모노-페길화된 대장균 유래 MGDF(mPEG-MGDF)이고, 상기 리포솜 소포는 DMPG이며, 또 상기 조성물은 100:1 비율의 DMPG:MGDF를 가지고 5.0의 pH를 가지며, 10mM 아세트산 나트륨, 5% 소르비톨을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 MGDF는 CHO 유래된 MGDF 1-332이고, 상기 리포솜 소포는 DMPG이며, 상기 조성물은 100:1 비율의 DMPG:MGDF를 가지고 5.0의 pH를 가지며, 10mM 아세트산 나트륨, 5% 소르비톨을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
- MGDF를 자연 그대로의 인지질 리포솜 소포와 혼합시키는 것을 포함하는 리포솜-MGDF 조성물의 제조 및 수득 방법에 있어서, 상기 리포솜 소포는 MGDF가 리포솜 소포의 지질 부분에 삽입되도록 음으로 하전되어 있고 또 상기 리포솜-MGDF 복합체는 상기 MGDF의 2차 구조의 펼쳐짐으로부터 직접적으로 안정화되는 것을 특징으로 하는 리포솜-MGDF 조성물의 제조 및 수득 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 조성물은 3.0-7.5의 pH를 가지고, 10:1 비율 이상의 지질:MGDF를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 리포솜 소포는 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 에그포스파티딜글리세롤, 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 에그포스파티딜에탄올아민, 디올레오일포스파티드산(DOPA), 디미리스토일포스파티드산(DMPA), 디팔미토일포스파티드산(DPPA), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 디미리스토일포스파티딜세린(DMPS), 디팔미토일포스파티딜세린(DPPS), 에그포스파티딜세린, 리소포스파티딜글리세롤, 리소포스파티딜에탄올아민 및 리소포스파티딜세린으로 구성된 군에서 선택한 지질로부터 제조된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제15항에 있어서, MGDF는 천연 인체 MGDF이거나 진핵 또는 원핵 숙주 세포 발현 생성물로서 수득된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제18항에서 있어서, MGDF는 제29도의 MGDF 1-163 아미노산 1-163의 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 방법.
- 제18항에 있어서, MGDF는 제29도의 MGDF 1-332 아미노산 1-332의 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 방법.
- 제15항에 있어서, MGDF가 페길화된 MGDF(PEG-MGDF)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제21항에 있어서, PEG-MGDF는 폴리에틸렌 글리콜로 페길화된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제22항에 있어서, PEG-MGDF는 모노-페길화된 MGDF(mPEG-MGDF)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제23항에 있어서, PEG기는 MGDF의 N-말단에 결합됨을 특징으로 하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 조성물은 제약학적으로 용인가능한 담체를 포함함을 특징으로 하는 방법.
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