NO318235B1 - Stabile protein-fosfolipid-preparater og fremgangsmater for fremstilling av slike - Google Patents

Stabile protein-fosfolipid-preparater og fremgangsmater for fremstilling av slike Download PDF

Info

Publication number
NO318235B1
NO318235B1 NO19974323A NO974323A NO318235B1 NO 318235 B1 NO318235 B1 NO 318235B1 NO 19974323 A NO19974323 A NO 19974323A NO 974323 A NO974323 A NO 974323A NO 318235 B1 NO318235 B1 NO 318235B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
mgdf
protein
csf
preparation
dmpg
Prior art date
Application number
NO19974323A
Other languages
English (en)
Other versions
NO974323D0 (no
NO974323L (no
Inventor
David Collins
Younsik Cha
David N Brems
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of NO974323D0 publication Critical patent/NO974323D0/no
Publication of NO974323L publication Critical patent/NO974323L/no
Publication of NO318235B1 publication Critical patent/NO318235B1/no

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/196—Thrombopoietin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/145—Colony stimulating factor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Oppfinnelsens bakgrunn
Foreliggende oppfinnelse angår stabile protein-fosfolipid-preparater og fremgangsmåter for fremstilling av slike. Nærmere bestemt angår oppfinnelsen MGDF-fos folipidprepa-rater med økt stabilitet, økt holdbarhet og som kan anvendes i formuleringer ved høy temperatur og som nye utleveringsvehikler.
Atskillige proteiner er blitt vist å gå over i en smeltet, globulær tilstand (MGS), Van der Goot, F.G., Nature, 354, 408-410 (1991). Proteiner i den smeltede, globulære tilstand har en sekundærstruktur som er sammenlignbar med det native protein, men som allikevel mangler stiv tertiærstruktur, Pitsyn et al., FEBS Letters, 262:1, 20-24 (1990). I noen tilfeller medfølges overgang til denne tilstand av avdekking av tidligere skjulte hydrofobe områder i proteinet. Ved avdekking av kritiske hydrofobe rester kan MGS være et mellomprodukt ved aggregering og utfelling av proteiner. MGS-konformasjonen kan påvises ved sammenligning av den sirkulære dikroisme i det fjerne UV-området med spektrene til aromatiske sidekjeder (nær-UV-sirkulærdikroisme og fluorescens). Den smeltede, globulære tilstand oppviser aromatisk gruppe-spektralendringer i fravær av endringer i fjern-UV-sirkulærdikroisme, Bychkova et al., FEBS Letters, 238:231-234
(1988), og kan være involvert i membranpenetrasjon av noen proteiner, Bychkova et al., FEBS Letters, 238:231-234 (1988); Van der Goot, F.G., Nature, 354, 408-410 (1991).
Granulocyttkolonistimulerende faktor (G-CSF) er et protein kjent for å gå over i MGS før aggregering. Human, rekombinant G-CSF stimulerer selektivt nøytrofiler, en type hvite blodceller anvendt for bekjempelse av infeksjon. For tiden er Filgrastim, en rekombinant G-CSF, tilgjengelig for terapeutisk anvendelse. Strukturen til G-CSF under forskjellige betingelser er blitt omfattende undersøkt; Lu et al., J. Biol. Chem., vol. 267, 8770-8777 (1992). På grunn av dens hydrofobe karakteristika er G-CSF vanskelig å formulere for utvidet holdbarhet. Formuleringer av visse hydrofobe proteiner taper aktivitet på grunn av dannelse av dimere aggregater og aggregater av høyere orden (makroområde) under langtidslagring. Andre kjemiske endringer, slik som deamidering og oksidasjon, kan også forekomme ved lagring. G-CSF-formulatoren må dessuten beskytte mot denaturering og spesielt opprettholde stabiliteten av proteinets sekundære og tertiære struktur.
Human GM-CSF er et 22-kDa glykoprotein som kontinuerlig kreves for in vi tro-proliferasjonen av makrofag- og granul-ocyttstamceller. Den kontrollerer også disse stamcellers ir-reversible forpliktelse til å danne granulocytter og makrofager. Andre biologiske aktiviteter kan inkludere regulering av den funksjonelle aktivitet hos modne celletyper; Gough et al., Nature, 309, 763-767 (1984), og økende kjemotaksis overfor gjenkjente kjemiske tiltrekningsmidler; Williams et al., Hem-atology, 4. ut. (1990). GM-CSF stimulerer også produksjonen av monocytter og kan således være anvendelig ved behandlingen av monocyttforstyrrelser, slik som monocytopeni.
Human GM-CSF kan erholdes og renses fra et antall kilder. Prosedyrer for fremstilling av rekombinant, human GM-CSF er tidligere beskrevet av Burgess et al., Blood, 69:1, 43-51
(1987). US patentskrift 5 047 504 (Boone), inkorporert heri ved referanse, har muliggjort produksjon av kommersielle mengder av GM-CSF i ikke-glykosylert form som et produkt av prokaryot vertscelleekspresj on.
MGDF, eller megakaryocyttvekst- og differensierings-faktor, er et nylig klonet cytokin som synes å være den viktigste regulator av sirkulerende blodplatenivåer. Se Bartley, T.D. et al., Cell, 77:1117-1124 (1994); Lok, S. et al., Nature, 369:565-568 (1994); de Sauvage, F.J. et al., Nature, 369:533-538 (1994); Miyazake, H. et al., Exp. Hematol., 22:838 (1994); og Kuter, D.J. et al., PNAS USA, 91:11104-11108 (1994). MGDF refereres også til som trombopoietin (TPO), mpl-ligand og megapoietin. Modent humant MGDF er et protein med totalt 332 aminosyrer. Sekvensen til dette protein og det tilsvarende cDNA er vist i figur 29 heri.
Rekombinant MGDF produsert i både kinesisk hamster-ovarie (CHO) og B. coli-celler er vist å ha en biologisk aktivitet ved spesifikt å stimulere eller øke megakaryocytter og/eller blodplater in vivo i mus, rotter og aper. Se f.eks. Hunt, P. et al., Blood, 84(10):390A (1994). Humane MGDF-molekyler som er blitt trunkert slik at de har en lengde på minst 151 aminosyrer, med start fra aminoposisjon 1 i figur 29, bibeholder biologisk aktivitet in vivo. Det er også mulig å fjerne inntil de første seks aminosyrer ved N-terminalen i sekvensen i det humane MGDF-protein og bibeholde biologisk aktivitet. Det synes derfor som om biologisk aktivitet bibeholdes innen aminosyrer 7-151 (inklusive) i den modne aminosyresekvens i human MGDF vist i figur 29.
Naturlig forekommende MGDF er et glykosylert molekyl. Glykosyleringsmønsteret for naturlig MGDF er forbundet med to nøkkeldomener som er funnet i MGDF. Sekvensen til de ca. 151 første aminosyrer i human MGDF, tilsvarende en aktiv del av molekylet, er bemerkelsesverdig homolog med erytropoietin (EPO), et cytokin som er i stand til å stimulere produksjon av erytrocytter, og refereres til som det "EPO-lignende" domenet i human MGDF. De resterende aminosyrer i det modne protein utgjør et såkalt "N-bundet karbohydrat11-domene fordi de inkluderer de fleste, hvis ikke alle, setene for N-bundet glykosylering. I human MGDF er det seks N-bundne glykosyleringsseter som alle er inneholdt i det N-bundne glykosyleringsdomenet. Begge domener inneholder O-bundne glykosyleringsseter. Det er anslått 12-14 0-bundne glykosyleringskjeder i molekylet. Eksperimentelt bevis med human MGDF-DNA uttrykt rekombinant i CHO-celler, avslører at i det EPO-lignende domenet er minst to O-bundne seter glykosylert i posisjon 1 (Ser) og 37 (Thr).
Selv om proteiner som G-CSF og MGDF kan være stabilisert under visse definerte betingelser, foreligger det fremdeles et behov for å utvide holdbarheten av disse og andre proteiner ved stabilisering av proteinenes sekundære og tertiære struktur. En tidligere måte for å arbeide med slike proteiner er anvendelse av liposomer. Liposomer er fullstendig lukkede, dobbeltlagsmembraner dannet av vannuoppløselige, polare lipider, spesielt fosfolipider. Liposomvesikler kan ha et enkelt dobbeltlagsmembran (unilamellær) eller kan ha mange dobbeltlagsmembraner (multi-lamellære). Dobbeltlaget er sammensatt av to enkle lipidlag med et hydrofilt (polart) "hode"-område og et hydrofobt (upolart) "hale"-område hvor de hydrofobe haler er orientert mot sentrum av dobbeltlaget, mens de hydrofile hoder er orientert mot den vandige fase. Stabiliteten, stivheten og permeabiliteten til liposomer kan endres ved forandringer i fosfolipid-sammensetningen, ved forandringer i temperaturen, ved inkludering av en sterol eller ved inkorporering av en ladet amfifil forbindelse. Den grunnleggende strukturen til liposomer kan dannes ved hjelp av mange forskjellige kjente teknikker.
I deres dannelsesprosess kan liposomer innestenge van-noppløsninger i vannkanalene og frigir dem i forskjellig tempo. Ved oppdagelsen av at liposomer kan innføre enzymer i celler og endre deres metabolisme (Gregoriadis, New Engl. J. Med. 295, 704-710, 765-770 (1976)), ble liposomer forkynt som svaret på spør-smålet om målrettet legemiddelutlevering. Som et resultat foregår det en omfattende utviklingsforskning i den farmasøytiske indu-stri som involverer anvendelse av liposomer som langsomt frigivende depoter for legemidler, vitaminer og proteiner som er avsatt i de hydrofobe lag eller den hydrofobe kjerne i liposomer.
Vellykket anvendelse av liposomer som legemiddelbærere har vært begrenset fordi forskernes som har forsøkt en slik anvendelse, har truffet på mange problemer. Liposomer er f.eks. kjent for å virke som kraftige immunologiske supplementer til innesperrede antigener, og det må utøves forsiktighet når enzymer eller andre proteiner av xenogen opprinnelse innesperres i 1-iposomene. Diffusjonshastigheten til legemidlet er også vanskelig å kontrollere. Dette er en funksjon av liposomenes iboende us-tabilitet og tilstedeværelse av visse blodkomponenter som akselererer diffusjon av visse legemidler. På grunn av deres beskaffenhet blir dessuten noen stoffer svakt innesperret i liposomer og diffunderer derfor hurtig inn i sirkulasjonen. Til sist har det vært et problem å målrette andre celler eller organer foruten leveren eller milten. En utmerket oversikt over liposomer, stoffer som er blitt inkorporert i liposomer, og pro-blemene forbundet med anvendelse av liposomer som legemiddelbærere, er "Liposomes" av Gregory Gregoriadis, som finnes i Drug Carriers in Biology and Medicine, kapittel 14, 287-341 (Academic Press, N.Y., 1979).
Selv om mye er blitt rapportert angående forsøk på å anvende liposomer som legemiddelbærere, er det beskrevet lite angående anvendelse av liposomer for formålene å øke holdbarheten til terapeutiske peptider eller proteiner ved å stabilisere strukturen til peptidet og/eller proteinet. I PCT/US90/ 05163, med tittelen "Therapeutic Peptides and Proteins", Hostetler et al., beskrives anvendelse av tomme liposomer som et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmidde1 for å oppløse polypeptider og/eller proteiner for å forhindre akkumulering av polypeptidene og/eller proteinene i en luft-/vanngrense- flate, og forhindre adsorpsjon av polypeptidene og/eller proteinene på beholderoverflater. Hostetler et al. beskriver at negativt ladet fosfolipid kan tilsettes i opptil ca. 50 mol%, og at fosfatidylcholin, et nøytralt fosfolipid, er det foretrukne liposom. Hostetler et al. gir ingen beskrivelse av et fortynningsmiddel som er vist å stabilisere strukturen til et polypeptid og/eller protein.
I PCT/US91/07694, med tittelen "Preparation and Characterization of Liposomal Formulations of Tumor Necrosis Factor", Hung et al., beskrives et lipofilt, modifisert tumor-nekrosefaktor(TNF)molekyl i forbindelse med overflaten av, eller innkapslet i, et liposom. De liposomale, lipofile TNF-molekyler rapporteres å ha forhøyet stabilitet in vivo. Stabiliteten refer-erte til en reduksjon eller en redusert tendens hos TNF-liposomer til å lekke TNF inn i systemet in vivo. De foretrukne liposomer var nøytrale lipider. Hung et al. gir ingen beskrivelse av et TNF-preparat hvor eksipiensene har en stabiliserende effekt på strukturen til proteinet.
Ingenting kan utledes fra litteraturen angående at et protein, f.eks. G-CSF eller MGDF, bringes i kontakt med en negativt ladet lipidvesikkel og derved direkte stabiliserer proteinet mot termisk indusert aggregering, denaturering, tap av aktivitet og utfolding av den sekundære struktur. Det eksisterer et behov for slike preparater som gir fordelen ved å være anvendelige i formuleringsprosedyrer som fordrer høye temperaturer (f.eks. inkorporering av G-CSF og/eller MGDF i polymerer), så vel som anvendelige som nye utleveringsvehikler (f.eks. oral administrering av pegylert G-CSF). Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer slike preparater.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse angår tilsetning av hydrofobe eksipienser, f.eks. lysofosfolipider eller andre liposomer, til et protein under betingelser for smeltet, globulær tilstand som direkte stabiliserer proteinets sekundære og tertiære struktur og derved beskytter proteinet mot termisk indusert aggregering, denaturering og tap av aktivitet. Nærmere bestemt angår foreliggende oppfinnelse et preparat kjennetegnet ved at det omfatter et protein som er i stand til å gå over i den smeltede, globulære tilstand når det blandes med en intakt fosfolipid-liposomvesikkel der liposomvesikkelen består av negativt ladete fosfolipider, for å danne et liposom-proteinkompleks hvori kun en del av proteinet er innføyd i lipiddelen av liposomvesikkelen, der proteinet er MGDF og preparatet har pH mellom 3,0 - 7,5 og har et lipid: protein-forhold på minst 10:1.
Oppfinnelsen omfatter også fremgangsmåte for fremstilling av et liposom-proteinpreparat kjennetegnet ved at den omfatter blanding av et protein, idet proteinet er i stand til å gå over i den smeltede, globulære tilstand, med en intakt fosfolipid-liposomvesikkel der liposomvesikkelen er negativt ladet, slik at kun en del av proteinet innføyes i lipiddelen av liposomvesikkelen, og isolering av liposom-proteinpreparatet, der proteinet er MGDF og preparatet har pH mellom 3,0 - 7,5 og har et lipid: protein-forhold på minst 10:1.
De foretrukne MGDF-fosfoli-pidpreparater kan overraskende sykliseres flere ganger mellom 10 og 95 °C med fullstendig gjenvinning av sekundær proteinstruktur ved av-kjøling. Preparatene er anvendelige for formuleringsprosedyrer som fordrer høye temperaturer, så vel som for anvendelse som nye utleveringsvehikler. Preparatene oppviser dessuten en forlenget holdbarhet sammenlignet med protein alene, og inter-
aksjonen mellom protein og fosfolipidvesikkel forhindrer adsorpsjon av protein til glassampuller.
I en foretrukket utførelsesform omfatter protein-fosfolipidkomplekset et negativt ladet liposom som er utvalgt fra: dioleoylfosfatidylglyserol (DOPG),
dimyristoylfosfatidylglyserol (DMPG),
dipalmitoylfosfatidylglyserol (DPPG),
eggfosfatidylglyserol,
dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE),
eggfosfatidyletanolamin,
dioleoylfosfatidsyre (DOPA),
dimyristoylfosfatidsyre (DMPA),
dipalmitoylfosfatidsyre (DPPA),
dioleoylfosfatidylserin (DOPS),
dirayristoylfosfatidylserin (DMPS),
dipalmitoylfosfatidylserin (DPPS),
eggfosfatidylserin,
lysofosfatidylglyserol,
lysofosfatidyletanolamin,
lysofosfatidylserin.
DOPG, et negativt ladet, umettet fosfolipid, er spesielt foretrukket. Oppfinnelsen omfatter dessuten en pH-verdi opprettholdt i området 3,0-7,5, og et forhold mellom lipid og protein på minst 10 :1.
Ytterligere elementer som tilveiebringer foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen, inkluderer anvendelse av kjemisk modifiserte proteiner i protein-fosfolipidkomplekset, så vel som anvendelse av ett eller flere av de følgende: et isotonitetsjusterende middel, et bufringsmiddel og et pH-justeringsmiddel. Som det vil fremgå for en fagperson, omfatter oppfinnelsen stabile protein-fosfolipidpreparater med forskjellige kombinasjoner av disse ytterligere elementer.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser fluorescensemisjonsspekteret for rhG-CSF
i nærvær (kurve 1) og fravær (kurve 2) av DOPG-vesikler. Konsentrasjonen av rhG-CSF var 0,2 mg/ml. Forholdet mellom DOPG og rhG-CSF (kurve 1) var 100:1 (mol:mol).
Figur 2 viser virkningen av et økende forhold mellom lipid og protein på rhG-CSF-fluorescensen. F0 er den innledende fluorescens (intet lipid), og F refererer til fluorescensen etter tilsetning av lipid for å oppnå det angitte molare forhold mellom lipid og rhG-CSF. Figur 2(a) viser F/F0 (■) og maksimale emisjonsbølgelengder (A) for blandinger av DOPG:rhG-CSF. Figur 2(b) viser F/F0 (■) og maksimale emisjonsbølgelengder (A) for blandinger av DOPG:rhG-CSF. Figur 3 viser Stern-Volmer-plot for slukking av rhG-CSF- fluorescens med Kl i fravær (•) og nærvær (O) av DOPG-vesikler. Slukkingseksperimenter ble utført ved tilsetning av aliquoter av Kl til rhG-CSF (0,2 mg/ml) og DOPG:rhG-CSF (100:1 molar). Figur 4 viser slukking av rhG-CSF-tryptofanfluorescens veci tilsetning av pyrendekansyre. Emisjonsbølgelengden var 327 nm. Forholdet mellom DOPG og rhG-CSF var 100:1 (molar). Figur 5 er et diagram som viser en sammenligning mellom F-intensitetsendringer for rhG-CSF i fravær og nærvær av forskjellige lipider. I hvert tilfelle var forholdet mellom lipid og protein 100:1 (molar). Figur 6 er et diagram som viser en sammenligning mellom skift i emisjonsmaksimum for rhG-CSF i fravær og nærvær av forskjellige lipider. I hvert tilfelle var forholdet mellom lipid og protein 100:1 (molar). Figur 7 viser virkningen av DMPC (kurve 2), DMPG (kurve 3) og DMPA (kurve 4) på CD på rhG-CSF (kurve 1). I hvert tilfelle var forholdet mellom lipid og protein 50:1 (molar) i vann, pH 6,0. Figur 8 viser virkningen av økende temperatur på CD for rhG-CSF (kurve 1) eller DOPG:rhG-CSF (140:1 molar) (kurve 2). rhG-CSF-konsentrasjonen var 80 ug/ml i vann, pH 6,0. Temperaturen ble skannet fra 10 til 90 °C ved en hastighet på 100 °C/time. Figur 9 viser differensialskanningskalorimetritermo-grammer for rhG-CSF (kurve 1) og DOPG:rhG-CSF (45:1 molar) (kurve 2). Konsentrasjonen av rhG-CSF i prøvene var 1 mg/ml (pH 7,0 i vann). Skanningshastigheten var 90 °C/time. Figur 10 viser virkningen av temperaturomløp på CD for rhG-CSF (kurve 1) og DOPG:rhG-CSF (140:1 molar) (kurve 2). Prøvene ble hurtig oppvarmet til 95 °C og avkjølt til 10 °C som angitt med piler. rhG-CSF-konsentrasjonen i prøvene var 80 ug/ml, pH 6,0. Figur 11 viser virkningen av temperaturomløp på CD for rhG-CSF (kurve 1) og DMPG:rhG-CSF (150:1 molar) (kurve 2). Prøvene ble oppvarmet til 95 °C og avkjølt til 10 °C. rhG-CSF-konsentrasjonen i prøvene var 80 ug/ml, pH 6,0. Figur 12 viser virkningen av temperaturomløp på CD for rhG-CSF (kurve 1) og DPPG:rhG-CSF (150:1 molar) (kurve 2). Prøvene ble oppvarmet til 95 °C og avkjølt til 10 °C. rhG-CSF-konsentrasjonen i prøvene var 80 ug/ml, pH 6,0. Figur 13 er et diagram som viser forskjellige lipiders evne til å stabilisere rhG-CSF under frysetørking. Forholdet mellom lipid og protein var 100:1 i hvert tilfelle. Stabilitet var basert på retensjon av in vi tro-aktivitet i benmargsanalysen. rhG-CSF alene overlever ikke frysetørkingsprosessen, slik at den anvendte kontroll er rhG-CSF i fravær av lipid. Figur 14 viser virkningene av forskjellige lipider på in vivo-aktiviteten av rhG-CSF. Aktivitet (WBC-telling) ble målt etter subkutan injeksjon i hamstere. rhG-CSF-dosen var 100 ug/kg med et forhold mellom lipid og protein på 100:1. Figur 15 viser virkningene av forskjellige lipider på in vivo-aktiviteten av rhG-CSF. Aktivitet {WBC-telling) ble målt etter subkutan injeksjon i hamstere. rhG-CSF-dosen var 100 ug/kg med et forhold mellom lipid og protein på 50:1. Figur 16 er et diagram som viser en sammenligning mellom F-intensitetsendringer for CHO-G-CSF i fravær og nærvær av DOPG ved forskjellige pH-verdier. I hvert tilfelle var forholdet mellom lipid og protein på 100:1 (molar). Figur 17 er et diagram som viser en sammenligning mellom skift i emisjonsmaksimum for CHO-G-CSF i fravær og nærvær av DOPG ved forskjellige pH-verdier. I hvert tilfelle var forholdet mellom lipid og protein på 100:1 (molar). Figur 18 viser virkningen av temperaturomløp på CD for PEG-G-CSF ( ) og DMPG:PEG-G-CSF (17:1 molar) { ). Prøvene ble oppvarmet til 90 °C og avkjølt til 10 °C. Figur 19 viser: (a) virkningen av temperaturomløp på CD for G-CSF i PBS, pH 7,0. GM-CSF ved 10 °C ( ) er sammenlignet med GM-CSF som ble oppvarmet til 90 °C og deretter avkjølt til 10 °C ( ); (b) virkningen av temperaturomløp på CD for DPPG:PEG-G-CSF (17:1 molar). DPPG:GM-CSF ved 10 °C ( ) er sammenlignet med DPPG:GM-CSF som ble oppvarmet til 90 °C og deretter avkjølt til 10 °C ( ) . Figur 20 viser: (a) resultatene av den totale WBC-respons på intraduodenal infusjon av rhG-CSF i fravær og nærvær av DOPG. rhG-CSF dosen var 750 ug/kg og forholdet mellom lipid og protein var 100:1; (b) resultatene av den totale WBC-respons på intraduodenal infusjon av PEG-G-CSF i fravær og nærvær av DOPG. PEG-G-CSF dosen var 750 ug/kg og forholdet mellom lipid og protein var 100:1. Figur 21 viser virkningen av DOPG på serumnivåer av PEG-G-CSF etter intraduodenal pumpeinfusjon. PEG-G-CSF-dosen var 750 ug/kg og forholdet mellom lipid og protein var 100:1. Figur 22 viser fluorescensemisjonsspekteret til MGDF i nærvær og fravær av DMPG-vesikler. Konsentrasjonen av MGDF var 0,1 mg/ml. MGDF var E. coli-avledet MGDF 1-163. Forholdet mellom DMPG og MGDF var 100:1 (mol:mol). Figur 23 viser virkningen av et økende forhold mellom lipid og protein på MGDF-fluorescensen. MGDF var E. coli-avledet MGDF 1-163. Maksimale emisjonsbølgelengder for blandinger av DMPG:MGDF ved pH 5,0 (-0-) og pH 7,0 (-•-) er vist. Figur 24 viser Stern-Volmer-plot for slukkingen av MGDF-fluorescens ved hjelp av Kl i fravær (O) og nærvær (•) av DMPG-vesikler. MGDF var E. coli-avledet MGDF 1-163. Slukkingseksperimenter ble utført ved tilsetning av aliquoter av Kl til MGDF (0,1 mg/ml) og DMPG:MGDF (100:1 molar). Figur 25 viser virkningen av temperaturomløp på CD for MGDF (O) og DMPG:MGDF (100:1 molar) (•) . MGDF var E. coli-avledet MGDF 1-163. Prosent resterende spiralform refererer til mengden CD påvist ved 10 °C etter hver syklus (én syklus = prøver ble hurtig oppvarmet til 95 °C og avkjølt til 10 °C) . Figur 26 viser graden av MGDF(± DMPG)-denaturering i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av urea. Sirkulærdikroisme MRE for MGDF (-0-) og DMPG:MGDF {-•-) er avbildet, så vel som MGDF (-D-) og DMPG:MGDF (-■-) fluorescensemisjonsmaksimum. MGDF var E. coli-avledet MGDF 1-163. Forholdet mellom DMPG og MGDF var 100:1 (mol:mol). Figur 27 er en grafisk avbildning av fluorescens-emisjonsmaksima for MGDF (± DMPG) og PEG-MGDF (± DMPG). MGDF var E. coli-avledet MGDF 1-163, og PEG-MGDF var monopegylert E. coli-avledet MGDF 1-163. DMPG:MGDF- og DMPG:PEG-MGDF-forholdet var 100:1 (mol:mol). Figur 28 viser graden av PEG-MGDF(+ DMPG)-adsorpsjon til glassampuller ved forskjellige PEG-MGDF-konsentrasjoner. MGDF var E. coli-avledet MGDF 1-163, og PEG-MGDF var monopegylert E. coli-avledet MGDF 1-163. Prosent gjenvinning av PEG-MGDF {-□-) og DMPG:PEG-MGDF (-0-) ble analysert ved å telle mengden av radiomerket MGDF som kunne gjenvinnes fra glassampullene etter inkubasjon i 18 timer ved romtemperatur. Figur 2 9 viser DNA- og aminosyresekvensen av human MGDF (SEKV.ID. NR. 1 og 2), inkludert et signalpeptid (aminosyrer -21 til -1) og den modne aminosyresekvens (1-332). Figur 30 viser et eksempel på setespesifikk, MGDF-reduktiv alkylering ved a-aminogruppen av den N-terminale rest ved anvendelse av monometoksypolyetylenglykolaldehyder som fører til et hovedsakelig monopegylert produkt. Figur 31 viser in vivo-aktivitet av DMPG:MGDF og DMPG:PEG-MGDF i normale mus, uttrykt ved blodplatetellinger. MGDF var E. coli-avledet MGDF 1-163, og PEG-MGDF var monopegylert E. coli-avledet MGDF 1-163. DMPG:MGDF- og DMPG:PEG-MGDF-dosen var 100 ug/kg og 300 ug/kg, og forholdet mellom lipid og protein var 100:1.
Detaljert beskrivelse
Preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse beskrives i nærmere detalj i den etterfølgende diskusjon og illustreres ved hjelp av eksemplene vist nedenfor. Eksemplene viser forskjellige aspekter av oppfinnelsen og inkluderer resultater fra stabilitets- og biologisk aktivitetstesting av forskjellige protein-fosfolipidpreparater. Reaksjonen mellom proteinene og lipidvesikkelen gav overraskende en direkte stabilisering av proteinets proteinstruktur og utøvet derved en stabiliserende effekt på proteinet, selv under betingelser som fører til denaturering av proteinet i fravær av lipid.
Den orale administrering av et kjemisk modifisert G-CSF-fosfolipidpreparat er også beskrevet heri, ved anvendelse av G-CSF (som beskrevet ovenfor) som polyetylenglykolmolekyler er blitt bundet til.
For utøvelsen av foreliggende oppfinnelse kan det anvendes mange forskjellige proteiner som er i stand til å gå over i den smeltede, globulære tilstand. Eksempler på anvendelige proteiner er cytokiner, inkludert forskjellige hematopoetiske faktorer, slik som de ovennevnte G-CSF, GM-CSF, MGDF, M-CSF, interferonene (a, p og y), interleukinene (1-11) , erytropoietin (EPO), fibroblastvekstfaktor, stamcellefaktor, nervevekstfaktor, BDNF, NT3, blodplateavledet vekstfaktor og tumorvekstfaktor (a, p). Andre proteiner kan evalueres for evnen til å gå over i MGS. Dersom det aktuelle protein er i stand til å gå over i MGS, kan dette protein deretter bringes i kontakt med en negativt ladet liposomvesikkel, og stabiliseringseffektene kan evalueres.
Generelt kan G-CSP som er anvendelig ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, være en nativ form renisolert fra pattedyrorganismer, eller alternativt et produkt av kjemiske synteseprosedyrer eller av prokaryot eller eukaryot vertsekspresjon av eksogene DNA-sekvenser erholdt ved genomisk eller cDNA-kloning eller ved gensyntese. Egnede prokaryote verter inkluderer forskjellige bakterieceller (f.eks. E. coli) . Egnede eukaryote verter inkluderer gjærceller (f.eks. S. cerevisiae) og pattedyrceller (f.eks. kinesisk hamsterovarieceller, apeceller).
Avhengig av den anvendte vert kan
G-CSF-ekspresjonsproduktet glykosyleres med pattedyr- eller andre eukaryote karbohydrater, eller det kan være uglyko-
sylert. Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av enhver og alle slike former av G-CSF, selv om rekombinant G-CSF, spesielt E. coli-avledet, er foretrukket på grunn av at den har den høyeste kommersielle praktiske anvendelighet.
G-CSF som skal modifiseres kjemisk for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse, kan også være enten naturlig human G-CSF (nhG-CSF) eller produktet av en rekombinant nukleinsyre-prosess, slik som prokaryot eller eukaryot vertscelleekspresjon. Generelt er den aktuelle kjemiske modifikasjon binding av en kjemisk komponent til selve G-CSF-molekylet. En oversiktsartikkel som beskriver proteinmodifikasjon og fusjonsproteiner, er Francis, Focus on Growth Factors, 3:4-10 (mai 1992) (publisert av Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Låne, London N20 OLD, UK). Se f.eks. EP 0 401 384, med tittelen "Chemically Modified Granulocyte Colony Stimulating Factor", som beskriver materialer og metoder for fremstilling av G-CSF som polyetylenglykolmolekyler er festet til. Festingen kan foregå ved binding direkte til proteinet eller til en komponent som virker som en bro til den aktive forbindelse. Kovalent binding er foretrukket som den mest stabile for binding. Den kjemiske modifikasjon kan bidra til den kontrollerte vedvarende eller utvidede effekt av G-CSF. Dette kan f.eks. virke til å kontrollere tiden som medgår for at den kjemisk modifiserte G-CSF skal nå sirkulasjonen. Et eksempel på en kjemisk modifikator er polyetylenglykolblandinger, inkludert derivater derav.
Ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse kan det anvendes ethvert kjemisk modifisert G-CSF-preparat som gir virkningsfullhet ved administrering. Virkningsfullhet kan bestemmes ved hjelp av metoder kjent for fagfolk. Pegylert G-CSF, spesielt pegylert E. coli-avledet G-CSF, og nærmere bestemt tri-tetrapegylert E. coli-avledet G-CSF, er foretrukket.
G-CSF er blitt rapportert å være mest stabil under sure betingelser, til tross for det faktum at i pH-området 2,5-5,0 foregår det en konformasjonsendring som involverer en åpning av den tertiære struktur og en økning i innholdet av a-heliks, Narhi et al., J. Protein Chem. 10, 359-367 (1991). Denne konformasjonsendring er karakteristisk for den smeltede, globulære tilstand (MGS). Som det således er tilfelle med en formulator som arbeider med andre proteiner som er i stand til å gå over i MGS, må en formulator som arbeider med G-CSF beskytte mot termisk indusert utfolding av sekundær- og tertiærstruktur for å forhindre aggregering og denaturering.
GM-CSF som kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse, kan være en nativ form renisolert fra pattedyrorganismer, eller et produkt av prokaryot eller eukaryot vertsekspresjon av eksogene DNA-sekvenser erholdt ved genomisk eller cDNA-kloning, eller ved gensyntese. Egnede prokaryote verter inkluderer forskjellige bakterieceller (f.eks. E. coli). Egnede eukaryote verter inkluderer gjærceller (f.eks. S. cerevisiae) og pattedyrceller (f.eks. kinesisk hamster-ovarieceller, apeceller). Avhengig av den anvendte vert kan GM-CSF-ekspresjonsproduktet være glykosylert med pattedyr- eller andre eukaryote karbohydrater, eller det kan være uglykosylert. Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av enhver og alle slike former av GM-CSF, selv om rekombinant GM-CSF, spesielt E. coli-avledet, er foretrukket på grunn av den høyeste kommersielle praktiske anvendelighet.
Betegnelsen "MGDF", som anvendt heri, inkluderer naturlig forekommende MGDF, trunkeringer av naturlig forekommende MGDF, så vel som ikke-naturlig forekommende polypeptider med en aminosyresekvens og en glykosylering som er tilstrekkelig likelydende som den i naturlig forekommende MGDF for å tillate besittelse av en biologisk aktivitet ved spesifikk stimulering av vekst, utvikling og/eller produksjon av megakaryocytter og/eller blodplater.
I en foretrukket utførelsesform er MGDF produktet av ekspresjonen av en eksogen DNA-sekvens som er blitt transfektert i en eukaryot eller prokaryot vertscelle; dvs. at i en foretrukket utførelsesform er MGDF "rekombinant MGDF". Den foretrukne eukaryote vert er fra pattedyr, spesielt foretrukket CHO-celler, og den foretrukne prokaryote vert er fra bakterier, spesielt foretrukket E. coli. Rekombinant MGDF produseres fordelaktig i overensstemmelse med prosedyrene beskrevet heri og i publikasjonene anført heri angående kloning og ekspresjon av
MGDF.
Noen ytterligere foretrukne MGDF-molekyler har de følgende aminosyresekvenser, basert på figur 29 heri:
I hvert av disse tilfeller kan Met-Lys ytterligere inkluderes i N-terminalene.
Forskjellige analoger av MGDF kan også anvendes ved foreliggende oppfinnelse. Som anvendt heri, refererer uttrykket "analog av MGDF" til MGDF med én eller flere endringer i aminosyresekvensen som fører til en endring i typen (N- eller 0-bundet), antallet eller beliggenheten av seter for karbo-hydratbinding. MGDF-analogen(e) bibeholder minst ekvivalent biologisk aktivitet sammenlignet med MGDF med naturlig sekvens {f.eks. human MGDF), og kan ha vesentlig høyere aktivitet, som målt i analyser for biologisk aktivitet. De resulterende analoger kan ha færre eller flere (fortrinnsvis flere) karbohydratkjeder enn naturlig human/rekombinant MGDF.
Inkludert i analogene ifølge foreliggende oppfinnelse er også analoger som har én eller flere aminosyrer som strekker seg fra den karboksyterminale ende av MGDF, hvori den karboksyterminale utvidelse tilveiebringer minst ett ytterligere karbohydratsete. Karboksyterminalen av MGDF vil variere, avhengig av den spesielle form på det anvendte MGDF (f.eks. MGDF 1-332 aminosyrer eller MGDF 1-163 aminosyrer). Et ytterligere karbohydratsete kan tilføyes til karboksyterminalen av en MGDF-type ved tilføyelse av aminosyrer til karboksyterminalen, idet slike aminosyrer inneholder ett eller flere N- eller O-bundne glykosyleringsseter.
Foreliggende oppfinnelse inkluderer også i store trekk kjemisk modifiserte MGDF-preparater. Generelt er den kjemiske modifikasjon et MGDF-produkt hvori MGDF-proteinet er bundet til minst ett polyetylenglykolmolekyl (dvs. pegylert MGDF). Pegylering av MGDF kan utføres ved hjelp av enhver av pegyleringsreaksjonene kjent i teknikken. Se f.eks. Focus on Growth Factors, 3(2):4-10 (1992); EP 0 154 316; EP 0 401 384: og de andre publikasjoner referert til heri som angår pegylering. Pegyleringen utføres fortrinnsvis via en acyleringsreaksjon eller en alkyleringsreaksjon med et reaktivt polyetylenglykolmolekyl (eller en analog reaktiv, vannoppløselig polymer).
Pegylering ved acylering involverer vanligvis omsetning av et aktivt esterderivat av polyetylenglykol (PEG) med et MGDF-protein. Ethvert kjent, eller senere oppdaget, reaktivt PEG-molekyl kan anvendes for å utføre pegyleringen av MGDF. En foretrukket aktivert PEG-ester er PEG-forestret til N-hydroksysuccinimid ("NHS"). Som anvendt heri, inkluderer "acylering", uten begrensning, de følgende typer bindinger mellom MGDF og en vannoppløselig polymer som PEG: amid, karbamat, uretan og lignende. Se Bioconjugate Chem., 5:133-140 (1994). Reaksjonsbetingelser kan utvelges fra enhver av de kjente i pegyleringsteknikken eller de som er utviklet senere, men bør unngå betingelser som temperatur, løsningsmiddel og pH som vil inaktivere MGDF-typene som skal modifiseres.
Pegylering ved acylering vil vanligvis føre til et polypegylert MGDF-produkt, hvori lysin-e-aminogruppene er pegylert via en acylbindingsgruppe. Bindingsgruppen vil fortrinnsvis være et amid. Det resulterende produkt vil også fortrinnsvis kun være (f.eks. > 95 %) mono-, di- eller tripegylert. Noen typer med høyere pegyleringsgrad (opptil det maksimale antall lysin-E-aminogrupper i MGDF pluss én a-aminogruppe ved aminoterminalen av MGDF) vil imidlertid dannes i mengder som avhenger av de spesifikt anvendte reaksjonsbetingelser. Hvis ønsket kan flere rensede, pegylerte forbindelser separeres fra blandingen, spesielt ureagerte forbindelser, ved hjelp av sta-ndard renseteknikker, inkludert blant andre dialyse, utsalting, ultrafiltrering, ionebytterkromatografi, gel-filtreringskromatografi og elektroforese.
Pegylering ved alkylering involverer vanligvis omsetning av et terminalt aldehydderivat av PEG med et protein, slik som MGDF, i nærvær av et reduksjonsmiddel. Pegylering ved alkylering kan også resultere i polypegylert MGDF. Man kan dessuten manipulere reaksjonsbetingelsene, som beskrevet heri, for å begunstige pegylering hovedsakelig kun på a-aminogruppen i N-terminalen av MGDF-forbindelsene (dvs. en monopegylert forbindelse). Et eksempel på en reduktiv alkyleringsreaksjon med MGDF for å gi et monopegylert produkt er vist i figur 30. Både ved monopegylering og polypegylering bindes PEG-gruppene fortrinnsvis til proteinet via en -CH2-NH-gruppe. Med spesiell referanse til -CH2-gruppen refereres denne type binding til heri som en "alkyl"-binding.
Derivatisering via reduktiv alkylering for å produsere et monopegylert produkt utnytter forskjellig reaktivitet av forskjellige typer primære aminogrupper (lysin mot N-terminalen) som er tilgjengelige for derivatisering i MGDF. Reaksjonen utføres ved en pH (se nedenfor) som tillater at man drar fordel av pKa-forskjellene mellom e-aminogruppene i lysinrestene og a-aminogruppen i den N-terminale rest av proteinet. Ved en slik selektiv derivatisering kontrolleres binding av en vannoppløselig polymer som inneholder en reaktiv gruppe, slik som et aldehyd, til et protein: konjugasjonen med polymeren finner sted hovedsakelig ved N-terminalen av proteinet, og ingen betydelig modifikasjon av andre reaktive grupper, slik som lysinsidekj edeaminogruppene, forekommer.
I et foretrukket aspekt angår foreliggende oppfinnelse således pegylert MGDF, hvori PEG-gruppen(e) er bundet via acyl-eller alkylgrupper. Som diskutert ovenfor, kan slike produkter være monopegylerte eller polypegylerte (f.eks. inneholdende 2-6, fortrinnsvis 2-5, PEG-grupper). PEG-gruppene er vanligvis bundet til proteinet ved aminosyrers a- eller e-aminogrupper, men det antas også at PEG-gruppene kan være bundet til enhver aminogruppe bundet til proteinet som er tilstrekkelig reaktiv til å bli bundet til en PEG-gruppe under egnede reaksjonsbetingelser.
De anvendte polymermolekyler i både acylerings- og alkyleringsmetodene kan utvelges fra vannoppløselige polymerer eller en blanding derav. Den utvalgte polymer bør være vann-oppløselig slik at proteinet som den er bundet til, ikke utfelles i et vandig miljø, slik som et fysiologisk miljø. Den utvalgte polymer bør fortrinnsvis være modifisert til å inneholde en enkelt reaktiv gruppe, slik som en aktiv ester for acylering eller et aldehyd for alkylering, slik at graden av polymerisering kan kontrolleres som i de foreliggende fremgangsmåter. Et foretrukket reaktivt PEG-aldehyd er polyetylen-glykolpropionaldehyd, som er stabilt i vann, eller mono-Ci-Cio-alkoksy- eller aryloksyderivater derav (se US patentskrift nr. 5 252 714). Polymeren kan være forgrenet eller uforgrenet. For terapeutisk anvendelse av sluttproduktpreparatet vil polymeren fortrinnsvis være farmasøytisk akseptabel. Den vannoppløselige polymer kan utvelges fra gruppen som f.eks. består av polyetylenglykol, monometoksypolyetylenglykol, dekstran, poly-(N-vin-ylpyrrolidon)polyetylenglykol, propylenglykolhomopolymerer, en polypropylenoksid-/etylenoksidkopolymer, polyoksyetylerte pol-yoler (f.eks. glyserol) og polyvinylalkohol. For acyleringsreaksjonene bør den (de) utvalgte polymer(er) inneholde en enkelt reaktiv estergruppe. For den foreliggende reduktive alkylering bør den (de) utvalgte polymer(er) inneholde en enkelt reaktiv aldehydgruppe. Den vannoppløselige polymer vil vanligvis ikke være utvalgt fra naturlig forekommende glykosylrester fordi disse vanligvis fremstilles mer bekvemt ved hjelp av rekombinante pattedyrekspresjonssystemer. Polymeren kan ha enhver molekylvekt og kan være forgrenet eller uforgrenet.
En spesielt foretrukket vannoppløselig polymer for anvendelse heri er polyetylenglykol, forkortet som PEG. Som anvendt heri, er polyetylenglykol ment å omfatte enhver av formene av PEG som er blitt anvendt for å derivatisere andre proteiner, slik som mono-(Ci-Cio)alkoksy- eller aryloksypoly-etylenglykol. Fremgangsmåter for fremstilling av pegylert MGDF vil vanligvis omfatte trinnene med (a) omsetning av et MGDF-polypeptid med polyetylenglykol (slik som et reaktivt ester-eller aldehydderivat av PEG) under betingelser hvorved MGDF blir bundet til én eller flere PEG-grupper, og (b) isolering av reaksjonsproduktet (reaksjonsproduktene). De optimale reaksjonsbetingelser for acyleringsreaksjonene vil generelt bestemmes fra tilfelle til tilfelle, basert på kjente parametere og det ønskede resultat. Prosentdelen av polypegylert produkt øker f.eks. med økning av forholdet mellom PEG og protein.
En annen viktig faktor er molekylvekten til polymeren. Generelt, jo høyere molekylvekten av polymeren er, jo lavere er antallet polymermolekyler som kan bindes til proteinet. Forgrening av polymeren bør likeledes tas med i beregning ved optimalisering av disse parametere. Generelt, jo høyere molekylvekt (eller flere forgreninger), jo høyere forhold mellom polymer og protein. For pegyleringsreaksjonene beskrevet heri er generelt den foretrukne gjennomsnittlige molekylvekt fra ca. 2 kDa til ca. 100 kDa (betegnelsen "ca." indikerer ± 1 kDa). Den foretrukne gjennomsnittlige molekylvekt er fra ca. 5 kDa til 50 kDa, spesielt foretrukket fra ca. 12 kDa til 25 kDa og helst 20 kDa. Forholdet mellom vannoppløselig polymer og MGDF-protein vil vanligvis variere fra 1:1 til 100:1, fortrinnsvis (for polypegylering) 1:1 til 20:1 og (for monopegylering) 1:1 til 5:1.
Ved anvendelse av de ovenfor angitte betingelser vil reduktiv alkylering tilveiebringe selektiv binding av polymeren til ethvert MGDF-protein med en a-aminogruppe ved aminoterminalen, og tilveiebringe et vesentlig homogent preparat av monopolymer-/MGDF-proteinkonjugat.■ Betegnelsen "monopolymer-/MGDF-proteinkonjugat" anvendes her for å betegne et preparat sammensatt av ett enkelt polymermolekyl bundet til et MGDF-proteinmolekyl. Monopolymer-/MGDF-proteinkonjugatet vil fortrinnsvis inneholde et polymermolekyl lokalisert ved N-terminalen, men ikke på lysinaminosidégrupper. Preparatet vil fortrinnsvis utgjøres av mer enn 90 % monopolymer-/MGDF-proteinkonjugat og mer foretrukket mer enn 95 % monopoly-
mer-/MGDF-proteinkonjugat, hvor resten av observerbare molekyler er ureagerte (dvs. protein som mangler polymerkomponenten). Eksemplene nedenfor tilveiebringer et preparat som utgjøres av minst ca, 90 % monopolymer-/proteinkonjugat og ca. 10 % ureagert protein. Monopolymer-/proteinkonjugatet har biologisk aktivitet.
Lipidvesiklene som kan anvendes i preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse, er de negativt ladete liposomer som er i stand til å reagere med det aktuelle protein. Spesielle liposomer som kan anvendes, inkluderer: dioleoylfosfatidylglyserol (DOPG),
dimyristoylfosfatidylglyserol (DMPG),
dipalmitoylfosfatidylglyserol (DPPG),
eggfosfatidylglyserol,
dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE),
eggfosfatidyletanolamin,
dioleoylfosfatidsyre (DOPA),
dimyristoylfosfatidsyre (DMPA),
dipalmitoylfosfatidsyre (DPPA),
dioleoylfosfatidylserin (DOPS),
dimyristoylfosfatidylserin (DMPS),
dipalmitoylfosfatidylserin (DPPS),
eggfosfatidylserin,
lysofosfatidylglyserol,
lysofosfatidyletanolamin,
lysofosfatidylserin.
Mengden av liposom kan variere, avhengig av det spesielle liposom som anvendes.
Protein-/fosfolipidpreparatene inkluderer fortrinnsvis et bufringsmiddel for å opprettholde pH i oppløsningen innenfor et ønsket område. Foretrukne midler inkluderer natriumacetat, natriumfosfat og natriumsitrat. Blandinger av disse bufringsmid-ler kan også anvendes. Mengden av bufringsmiddel som kan anvendes i preparatet, avhenger i stor grad av den spesielt anvendte buffer og pH i oppløsningen. Acetat er f.eks. en mer effektiv buffer ved pH 5 enn ved pH 6, slik at mindre acetat kan anvendes i en oppløsning ved pH 5 enn ved pH 6. Det foretrukne pH-området for preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse er pH 3,0-7,5.
Preparatene ifølge oppfinnelsen kan videre inkludere et isotonitetsjusterende middel for å gjøre oppløsningen isotonisk og mer forenlig for injeksjon. Det mest foretrukne middel er natriumklorid i et konsentrasjonsområde på 0-150 mM.
Foreliggende oppfinnelse angår også farmasøytiske preparater som omfatter effektive mengder av polypeptidprodukter ifølge oppfinnelsen, sammen med farmasøytisk akseptable fortyn-ningsmidler, konserveringsmidler, oppløsningsmidler, emulgatorer, adjuvanser og/eller bærere. Slike preparater vil påvirke proteinets fysikalske tilstand, stabilitet og biotilgjengelighet. Se f.eks. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. utg., 1435-1712 (Mack Publishing Co., Easton, PA., 1990), som er inkorporert heri ved referanse. Hva som utgjør en effektiv mengde av proteinet i et spesielt tilfelle, vil avhenge av forskjellige faktorer som vil tas med i beregningen av den dyktige praktiserende lege, inkludert det ønskede terapeutiske resultat, alvorligheten av tilstanden eller sykdommen som behandles, individets fysiske tilstand osv.
I en foretrukket utførelsesform som involverer E. coli-avledet rhG-CSF, er den anvendte liposomvesikkel DOPG med et DOPG:G-CSF-forhold på 50:1, ved pH 4,5, inneholdende 10 mM natriumacetat.
I en foretrukket utførelsesform som involverer E. coli-avledet rhGM-CSF, er den anvendte liposomvesikkel DMPG, med et DMPG:GM-CSF-forhold på 17:1, ved pH 7,0, i fosfatbufret saltløs-ning (PBS) .
I en foretrukket utførelsesform som involverer E. coli-avledet rhG-CSF som er blitt kjemisk modifisert (pegylert), er rhG-CSF tri-tetrapegylert, den anvendte liposomvesikkel er DMPG med et DMPG:PEG-G-CSF-et forhold på 17:1, ved pH 4,5.
I en foretrukket utførelsesform som involverer E. coli-avledet MGDF 1-163, er den anvendte liposomvesikkel DMPG med et DMPG:MGDF-forhold på 100:1, ved pH 5,0, i 10 mM natriumacetat, 5 % sorbitol.
I en foretrukket utførelsesform som involverer E. coli-avledet MGDF 1-163 som er blitt kjemisk modifisert (pegylert), er
MGDF monopegylert (2 0 kDa) via reduktiv alkylering, den anvendte liposomvesikkel er DMPG med et DMPG:MGDF-forhold på 100:1, ved pH 5,0, i 10 mM natriumacetat, 5 % sorbitol.
I en foretrukket utførelsesform som involverer CHO-avledet MGDF 1-332, er den anvendte liposomvesikkel DMPG med et DMPG:MGDF-forhold på 100:1, ved pH 5,0, i 10 mM natriumacetat, 5 % sorbitol.
De følgende eksempler vil illustrere i nærmere detalj de forskjellige aspekter av foreliggende oppfinnelse.
Eksempel 1
Innledende eksperimenter ble utført for å undersøke muligheten for inkorporering av rekombinant human G-CSF (rhG-CSF) i en lipidvesikkel. rhG-CSF ble produsert ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi, hvor E. coli-celler ble transfektert med en DNA-sekvens som koder for human G-CSF, som beskrevet i US patentskrift nr. 4 810 643, Souza. rhG-CSF ble fremstilt som en 4 mg/ml oppløsning i fortynnet HCl, pH 4,0. Alle lipider ble erholdt fra Avanti Polar Lipids (Alabaster, Ala) og ble lagret ved -20 °C under nitrogen ved en sluttkonsentrasjon på 100 mg/ml i kloroform.
Fremstilling av G- CSF:fosfolipid- komplekser
For å fremstille lipidvesikler for kombinasjon med G-CSF ble 3 0 umol av det passende lipid overført til et glassrør og tørket til en tynn film ved anvendelse av en strøm av nitro-gengass. Lipidfilmene ble tørket i minst 2 timer under vakuum for å fjerne alle spor av kloroform. Lipidfilmene ble hydratisert i 1 ml av enten destillert, deionisert vann (ddH20) , fosfatbufret saltløsning, pH 7,2 (Gibco/BRL "D-PBS") eller 150 mM NaCl. Prøvene ble deretter sonikert i en sonikator av badtypen (Laboratory Supplies, Hicksville, N.Y.). Sonikering ble fortsatt inntil prøvene var optisk klare (vanligvis mellom 10 og 15 minutter) . Prøvene ble lagret ved 4 °C under nitrogen inntil de ble anvendt. Den endelige lipidkonsentrasjon var 30 mM. Alternativt kunne lipidvesiklene fremstilles ved at 300 umol lipid ble tørket under nitrogen og vakuumtørket, som beskrevet ovenfor. De tørre lipidfilmene ble hydratisert i 10 ml av en egnet vandig oppløsning, som beskrevet ovenfor. Prøvene ble deretter mik-rofluidisert i en
laboratorieskalaemulgator {"Microfluidics", modell HOS, Microfluidics, Inc., Cambridge, MA) drevet ved 703 kg/cm<2>. Prøvene ble resirkulert gjennom instrumentet i 10 sykluser. De mikrofluidiserte prøver ble deretter lagret ved 4 °C, som beskrevet ovenfor.
G-CSF:fosfolipid-kompleksene ble fremstilt ved å blande G-CSF (som beskrevet ovenfor) med et spesielt lipid (som beskrevet ovenfor). Blanding ble oppnådd ved virvling, omrøring eller forsiktig risting. Forskjellige molforhold mellom lipid og G-CSF ble fremstilt for å evaluere membraninnføyelse og stabilisering av protein. For f.eks. å fremstille en 3 ml prøve (i vann) som inneholder 0,2 mg/ml G-CSF i et molforhold på 40:1 mellom lipid og G-CSF, blandes 150 ul
G-CSF-stamløsning med 44 ul lipid (30 mM stamløsning, preparert i vann ved sonikering), og vann tilsettes for å oppnå et endelig prøvevolum på 3 ml. Inkubasjon i 5 minutter anbefales (men er ikke nødvendig) og ble anvendt her før prøven ble anvendt eller analysert.
G-CSF kan også blandes med det hydratiserte lipid før mikrofluidisering. Etterfølgende mikrofluidisering av blandingene, som beskrevet ovenfor, fører til inkorporering av G-CSF i lipidmembranen.
Analyse av G- CSF:fosfolipid- kompleksene
1. Tryptofanemi sj ons spektra
Det er to tryptofanrester i rhG-CSF som er temmelig sensitive overfor lokale miljøforhold. Analyse ble derfor utført for å bestemme rhG-CSF-tryptofanfluorescensen når rhG-CSF bringes i kontakt med et liposom. Et blått skift i fluorescensemisjonsmaksimum ville antyde at tryptofanene befinner seg i et mer hydrofobt miljø, og rhG-CSF ble derfor innesluttet i lipidmembranene. En utmerket oversikt over trypto-fanfluorescensanalyse er Principles of Fluorescence Microscopy, av J. Lakowicz, kap. 11 (Plenum Press, New York, 1983).
Tryptofanfluorescens fra G-CSF:lipid-kompleksene (som beskrevet ovenfor) ble analysert ved å eksitere prøvene ved 280 nm og under skanning av emisjonen fra 285 nm til 420 nm med økninger på 1 nm ved en hastighet på 1 nm/sekund. Prøvevolumet var 3 ml, og sluttkonsentrasjonen av G-CSF var 0,2 mg/ml for alle prøver. Forholdene mellom lipid og G-CSF varierte. Alle fluor-escensmålinger ble utført ved anvendelse av et "PTI Alphascan" fluorometer (South Brunswick, NJ). Alle målinger ble utført ved 25 °C, og denne temperaturen ble opprettholdt ved anvendelse av en kyvetteholder forsynt med vannkappe forbundet med et sirkulerende vannbad. Emisjonsspektra ble oppsamlet og analysert ved anvendelse av data-software fra PTI.
Fluorescensspektrene for rhG-CSF i nærvær og fravær av små, unilamellære vesikler bestående av DOPG er vist i figur 1. rhG-CSF har et emisjonsmaksimum ved 334 nm i fravær av DOPG-vesikler. I nærvær av DOPG ved et forhold mellom lipid og protein på 100:1 oppviser rhG-CSF-tryptofanfluorescens et blått skift i fluorescensemisjonsmaksimum til 327 nm og en dramatisk økning i fluorescensintensitet. Den lave bølgelengden til fluorescensemisjonen i nærvær av DOPG antyder at tryptofanene befinner seg i et miljø som er mer hydrofobt enn det native protein. Som vist i figur 2, avhenger fluorescensskiftingene av molforholdet mellom DOPG og G-CSF, og membraninnføyelse kan påvises når et forhold på 10:1 mellom DOPG og G-CSF nås.
2. Bremsingseksperimenter med jod
Jod er en effektiv kollisjonsbremser for tryptofanfluorescens, men kan ikke gjennomtrenge lipidmembraner. Effektiv bremsing av tryptofanfluorescens med jod indikerer derfor at tryptofanrestene utsettes for hele det vandige løsningsmiddel, mens beskyttelse mot jodbremsing forekommer når proteintryptofaner isoleres fra det vandige løsningsmiddel. I disse eksperimenter ble det anvendt G-CSF og et DOPG-G-CSF-preparat (forholdet mellom lipid og protein var 100:1). Etter at innledende avlesninger (F0) av prøvene ble utført og registrert, ble fluorescensintensitet målt etter tilsetning av økende mengder kaliumjodid (Kl) (5 M stamløsning). Både prøven og KI-oppløsningene ble preparert for å inneholde 1 mM Na2S03 {sluttkonsentrasjon) som beskrevet av Lee et al., Biochem. Biophys. Acta, 984:174-182 (1989), og Le Doan et al., Biochem. Biophys. Acta, 858:1-5 (1986). Tilsetningen av Na2S03 forhindrer dannelsen av l2, som kan fordele seg i upolare områder av proteiner og membraner. Dataene ble analysert ved hjelp av Stern-Volmer-ligningen (F0/F = l + KKi[KI]), hvor F0 og F er fluores-censintensitetene for prøver henholdsvis i fravær og nærvær av Kl i konsentrasjonen [Kl]. Kki er Stern-Volmer-bremsingskonstanten for KI-bremsing av G-CSF-tryptofanrester; Lehrer, S., Biochemistry 10:3254-3263 (1979).
Stern-Volmer-plottene av dataene er vist i figur 3. I fravær av DOPG-vesikler blir rhG-CSF-fluorescens effektivt bremset av Kl. I nærvær av DOPG er Stern-Volmer-plottet av dataene lineært, hvilket indikerer at jod har dårlig tilgang til begge tryptofaner. Dataene viser at tryptofanresten som er tilgjengelig for jod i fravær av DOPG, blir utilgjengelig for jod i nærvær av DOPG. Den delen av rhG-CSF som inneholder dette try-ptof anet, må derfor innesluttes i DOPG-dobbeltiaget.
3. Energioverføringsmålinger
Som tidligere vist, kan energioverføring forekomme mellom tryptofandonorer og lipidoppløselige, fluorescensakseptorer, slik som pyrendekansyre, fordi eksitasjonsspekteret for denne proben i vesentlig grad overlapper emisjonsspektrene til tryptofan, Friere et al., Biochemistry 22:1675-1680 (1983). Dersom proteinet innføyes i lipidmembraner, vil energioverføring fra tryptofan til pyren føre til bremsing av tryptofanfluorescensen. I dette eksperiment ble tryptofanemisjonsintensiteten til forskjellige lipid:G-CSF-komplekser registrert før (F0) og etter
(F) tilsetning av forskjellige mengder pyrendekansyre (30 ug/ml stamløsning i tetrahydro-
furan). Prøvene ble omrørt kontinuerlig under pyrendekansyre-tilsetningen for å fremme blanding mellom pyrendekansyre og prøven. Forholdet F/F0 er proporsjonalt med mengden av energi-overføring som foregår mellom G-CSF-tryptofaner og den hydrofobe energiakseptor pyrendekansyre.
Figur 4 viser bremsingsprofilen for rhG-CSF i nærvær av DOPG (forholdet mellom lipid og protein var 100:1) som en funksjon av tilsatt pyrendekansyre. Bremsingen foregår ved meget lave pyrendekansyrekonsentrasjoner (< 1 mol%), slik at effekten av fluorescensproben på membranens struktur og opptreden er minimal. Fordi pyrendekansyre kan forventes å hurtig fordele seg i lipiddobbeltlag, indikerer de foreliggende data at rhG-CSF blir innesluttet tilstrekkelig dypt i DOPG-membraner til å muliggjøre effektiv energioverføring fra tryptofan til pyrenakseptoren. Energioverføring ble bekreftet ved å undersøke eksitas-jonsspektrene til pyrendekansyremerkede DOPG-vesikler i nærvær og fravær av rhG-CSF.
Den ovenfor beskrevne analyse viser at rhG-CSF kan reagere inngående med et umettet fosfolipid som DOPG. I nærvær av DOPG-vesikler beskyttes et rhG-CSF-tryptofan fra en vann-oppløselig fluorescensbremser, men det er mottakelig for bremsing via energioverføring til en hydrofob, fluorescerende probe. Samlet viser dataene at rhG-CSF kan innføyes i membraner sammensatt av DOPG. Membraninnføyelse kan påvises når et 10:1-forhold (lipid:G-CSF) nås, og dette tallet kan representere antallet lipider som omgir den innføyde del av proteinet.
Eksempel 2
I dette eksemplet ble evnen til rhG-CSF til å reagere med andre fosfolipider bestemt ved benyttelse av sammenligninger mellom F/F0-intensitets- og emisjonsmaksima, som beskrevet ovenfor. I hvert tilfelle var molforholdet mellom lipid og rhG-CSF 100:1.
Figur 5 viser F/F0-dataene for rhG-CSF i fravær og nærvær av forskjellige lipider. Figur 6 viser emisjonsmaksi-mumsdata for de samme preparater. Dataene i figur 5 og figur 6 viser at i tillegg til DOPG kan rhG-CSF innføyes i DMPG, DPPG og mindre effektivt i fosfatidyletanolaminene (PE) og fosfati-dylserinene (PS). NG-DOPE (DOPE-prøve hvor PE-ledergruppen var gjort mer negativ) ble dessuten funnet å tilveiebringe en mer forbedret innføyelse av rhG-CSF enn DOPE.
DOPC, DMPC og DPPC er nøytrale lipider, og disse vesikler hadde liten, eller ingen, effekt på verken emisjonsmaksimum eller fluorescensintensitet til rhG-CSF, hvilket indik-erte at ingen interaksjon fant sted med disse fosfolipider (se figurene 5 og 6, og figur 7, kurve 2).
De ovenfor angitte data viser at et protein som er i stand til å gå over i den smeltede, globulære tilstand, kan innføyes i forskjellige lipidvesikler. Denne rhG-CSF-lipidinter-aksjon foregår imidlertid kun når det anvendes en negativt ladet lipidvesikkel. Blant de negativt ladete lipidvesikler synes de vesikler som har den høyere negative ladning, å gi sterkere rhG-CSF- lipidinteraks joner .
Eksempel 3
I dette eksemplet ble effekten av DOPG:rhG-CSF-interaksjonen bestemt i forbindelse med proteinstabilitet. Målinger av sirkulærdikroisme ble utført på et "Jasco J-720"-instrument utstyrt med en celleholder av Peltier-type med termostat og et magnetisk røreverk. Sirkulærdikroisme ved 222 nm ble målt ved anvendelse av en rhG-CSF-sluttkonsentrasjon på 80 ug/ml, pH 6,0. Differensialskanningskalorimetrimålinger ble utført ved anvendelse av et "Microcal MC-2"-kalorimeter. Prøver av rhG-CSF (1 mg/ml, i vann) eller DOPG:rhG-CSF (45:1 mol/mol, i vann) ble skannet ved en hastighet på 90 "C/time. Data ble lagret og analysert ved anvendelse av "Microcal"-software.•
Temperaturinduserte endringer i a-spiralformethet i G-CSF kan følges ved måling av sirkulærdikroisme (222 nm) som en funksjon av økende temperaturer. Den termisk induserte utfolding av rhG-CSF ved pH 6,0 er vist i figur 8. Kurven indikerer at det foregår en ganske skarp overgang ved ca. 60-70 °C, hvilket fører til tap av a-spiralformethet. Etter denne overgangen utfelles rhG-CSF irreversibelt fra oppløsning. Temperaturområdet for utfoldingen er lik smeltetemperaturen til rhG-CSF ved pH 7,0, som bestemt ved differensialskanningskalorimetri, som vist i figur 9.
I motsetning til dette viser DOPG:rhG-CSF et gradvis tap av a-spiralformethet med økende temperatur, og, i motsetning til rhG-CSF alene, synes den temperaturinduserte utfolding av DOPG:rhG-CSF ikke å være kooperativ (se figur 8). Denne konklusjon demonstreres også ved tapet av en smelteovergang, som vist ved differensialskanningskalorimetri (figur 9). Det er bemerkelsesverdig at DOPG:rhG-CSF-prøver kan gjenvinne a-spiralformethet etter oppvarming til 95 °C, og kan gjentatte ganger sirkuleres mellom 95 °C og 10 °C med full gjenvinning av spiralformetheten ved avkjøling (se figur 10). rhG-CSF alene blir under disse betingelser utfoldet irreversibelt og utfelles fra oppløsning.
Virkningene av DMPG og DPPG på G-CSF-sirkulærdikroisme ble også undersøkt. Et forhold mellom lipid og rhG-CSF på 150:1 ble anvendt, og hvilket også var tilfellet med DOPG stabiliserer også DMPG og DPPG den sekundære struktur til rhG-CSF (figurene 11-13) .
Disse dataene demonstrerer at interaksjonen av rhG-CSF med DOPG, DMPG og DPPG forhøyer stabiliteten til proteinet under betingelser hvor rhG-CSF alene er ustabil. Interaksjonen stabiliserer direkte den sekundære og tertiære struktur til rhG-CSF.
Eksempel 4
I dette eksemplet ble effekten av rhG-CSF:DOPG-interaksjonen bestemt med hensyn til den biologiske aktivitet av rhG-CSF. In vi tro-aktiviteten av rhG-CSF ble analysert ved anvendelse av det G-CSF-avhengige opptak av [<3>H]-tymidin ved hjelp av musebenmargsceller, som beskrevet av Zsebo et al., Immunobiology, 172:175-184 (1986). Alle aktivitetsanalyser ble utført i tre eksemplarer. In vivo-aktivitet ble bestemt ved subkutan injeksjon i hamstere (rhG-CSF-dose på 100 ug/kg) og målinger av antall hvite blodceller (WBC).
1. In vitro- aktivitet
A. Den spesifikke aktivitet av rhG-CSF i fravær og nærvær av DOPG ble bestemt. Varmebehandlede rhG-CSF- og DOPG:rhG-CSF -prøve r ble også testet. Resultatene er oppsummert i tabell 1.
<b>DOPG:rhG-CSF-forhold på 50:1 (mol/mol).
Som vist i tabell 1, gir innføyelse i DOPG-dobbeltlag ingen ugunstig virkning på den biologiske aktivitet av rhG-CSF. Etter oppvarming til 85 °C i 10 minutter har rhG-CSF ingen på-visbar aktivitet, og proteinet utfelles. Etter lignende be-handling bibeholder DOPG:rhG-CSF ca. 85 % av aktiviteten til uoppvarmet rhG-CSF, og gjenvinner fullstendig sekundærstruktur etter avkjøling.
B. Evnen til forskjellige lipider til å stabilisere rhG-CSF under frysetørking, ble også undersøkt. Prøver av rhG-CSF i kombinasjon med forskjellige lipider ble frysetørket og analysert {som beskrevet ovenfor) for aktivitet. DOPG, DMPG og DPPG tillater, når de blandes med rhG-CSF, ca. 100 % bibeholdelse av rhG-CSF-bioaktivitet etter frysetørking (figur 14). rhG-CSF alene overlevde ikke frysetørkingsprosessen,
2. In vivo - aktivitet
Aktiviteten (WBC-telling) av rhG-CSF i fravær og nærvær av lipid ble bestemt. Aktiviteten ble målt etter subkutan injeksjon (rhG-CSF-dose på 100 ug/kg) på dag 0. Fem forskjellige lipid:rhG-CSF-komplekser ble analysert, og i hvert tilfelle bibeholdt lipid:rhG-CSF-kompiekset in vivo-aktivitet (figurene 15 og 16).
De ovenfor beskrevne undersøkelser viser at innføyeIse
i negativt ladete lipiddobbeltlag ikke gir noen ugunstig påvirkning av den biologiske aktivitet av rhG-CSF. Det synes dessuten som om den beskyttende effekt til lipidet beskytter rhG-CSF under frysetørkingsprosessen.
Eksempel 5
I dette eksemplet ble kjemisk modifisert G-CSF (pegylert G-CSF (PEG-G-CSF)) og G-CSF erholdt som et produkt av eukaryot vertscelleekspresjon (CHO-G-CSF), testet for deres evne til å reagere med negativt ladete lipidvesikler. For CHO-G-CSF ble bestemmelsene utført ved anvendelse av sammenligninger mellom F/F0-intensitet og emisjonsmaksimum (som beskrevet i eksempel 1 ovenfor). I hvert tilfelle var molforholdet mellom lipid og protein 100:1. For PEG-G-CSF var bestemmelsen basert på sirkulærdikroismeanalyse.
Den anvendte CHO-G-CSF ble produsert ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi, hvori kinesisk hamster-ovarie-(CHO)celler ble transfektert med en DNA-sekvens som koder for human G-CSF, som beskrevet i US patentskrift nr. 4 810 643, Souza. CHO-G-CSF ble fremstilt som en 0,6 mg/ml oppløsning i PBS, pH 7,0. CHO-G-CSF ble vist å reagere med DOPG på en lignende måte som rhG-CSF, hvor hver prøve viser økt fluorescensintensitet i nærvær av DOPG, så vel som et blått skift i emisjonsmaksimum i nærvær av DOPG (figurene 17 og 18). DOPG-interaksjonen skyldes derfor ikke noen eiendommelighet hos den rekombinante form av G-CSF.
PEG-G-CSF som ble anvendt i disse eksperimenter, var tri-tetrapegylert, E. coli-avledet G-CSF (ved anvendelse av PEG 6000). DMPG:PEG-G-CSF-prøver (17:1 mol/mol) ble preparert ved anvendelse av prosedyrer beskrevet ovenfor. DMPG:PEG-G-CSF-prøvene ble funnet å fullstendig gjenvinne sekundærstruktur etter oppvarming (figur 19). Til tross for tilstedeværelsen av PEG-molekylene var det derivatiserte protein i stand til å reagere med lipidet på samme måte som det native protein.
De ovenfor angitte data viser at de stabiliserende effekter forbundet med G-CSF-interaksjon med en negativt ladet lipidvesikkel, ikke er unike for kun rhG-CSF erholdt som et produkt av prokaryot vertscelleekspresjon. Et kjemisk modifisert protein som er i stand til å overgå til MGS, og brakt i kontakt med en liposomvesikkel, her PEG-G-CSF:DMPG, oppviste også stabiliserende effekter.
Eksempel 6
I dette eksemplet ble effektene av DMPG og DPPG på GM-CSF undersøkt. GM-CSF var rekombinant, human-GM-CSF, som beskrevet i US patentskrift nr. 5 047 504, Boone, og fremstilt som en 1 mg/ml oppløsning i fosfatbufret saltløsning (PBS), pH 7,0. Et forhold mellom lipid og GM-CSF på 17:1 ble anvendt, og den termiske stabilitet ble målt ved anvendelse av sirkulærdikroismeanalyse, som beskrevet ovenfor. DMPG og DPPG kan føre til bedre termisk stabilitet for GM-CSF, dvs. gjenvinning' av sekundærstruktur etter oppvarming (figurene 2 0a og 20b).
Disse dataene gir et annet eksempel på et protein som er i stand til å gå over i den smeltede, globulære tilstand og reagerer med en negativt ladet lipidvesikkel for å gi proteinet bedre termisk stabilitet.
Eksempel 7
I dette eksemplet ble et DOPG:PEG-G-CSF-kompleks anvendt for å evaluere muligheten til å øke den terapeutiske respons på G-CSF etter enteral administrering. For dette eksemplet ble DOPG preparert som beskrevet i eksempel 1, og PEG-G-CSF ble preparert som beskrevet i eksempel 5. 100 umol lipid (797 ul) ble tørket under vakuum, og deretter ble 1 ml milli Q-vann tilsatt for å danne en 100 mM oppløsning av lipidet. Denne oppløsningen ble sonikert i 5 minutter i et sonikeringsvannbad (modell G 112SPIT fra Lab. Supply Inc., Hicksville, NY) eller inntil lipidoppløsningen var klar. 9 umol av DOPG-oppløsningen (90 ul) ble tilsatt til 90 nmol nativ rhG-CSF eller PEG-G-CSF i 1 mM HCl. Oppløsningen ble virvlet og brakt til et sluttvolum på 2 ml med 1 mM HCl. For intraduodenal administrering i rotter ble materialet plassert i en osmotisk pumpe som ble implantert i dyret. Frigivelsen av materialet foregår i løpet av 24 timer.
Resultatene av den totale WBC-analyse i dyrene som mottok både rhG-CSF og PEG-G-CSF, med og uten lipid, er vist i figur 21. Figur 21a viser at infusjon av nativ G-CSF ikke stimulerer en WBC-respons sammenlignet med vehikkelkontroll. Tilsetningen har liten virkning på dyrenes terapeutiske respons på rhG-CSF.
Rottenes respons på det pegylerte G-CSF er vist i figur 2lb. Det fremgår at PEG-G-CSF alene har stimulert en WBC-respons. Forhøyelsen av WBC vedvarer i 48 timer før den vender tilbake til basislinjen. PEG-G-CSF formulert med DOPG stimulerer også en WBC-respons, og denne responsen er nesten to ganger høyere enn for PEG-G-CSF alene. Disse resultater bekreftes ved de målte serumnivåer i PEG-G-CSF etter infusjonen (figur 22).
Disse dataene viser at inkludering av et anionisk lipid, slik som DOPG, i en oral formulering av PEG-G-CSF synes å øke den terapeutiske respons utløst av det derivatiserte protein. Den involverte mekanisme er ennå ikke klarlagt.
Eksempel 8
I dette eksemplet ble virkningene av DMPG på MGDF undersøkt. MGDF var rekombinant, humant, E. coli-avledet MGDF 1-163, fremstilt som en 1,0 mg/ml oppløsning i 10 mM natriumacetat, 5 % sorbitol, pH 5,0. DMPG:MGDF-kompleksene ble fremstilt som beskrevet i eksempel 1.
Analyse av DMPG:MGDF- kompieksene
1. Tryptofanemisj onsspektra
Det finnes én tryptofanrest i MGDF (posisjon 51) som ble anvendt for å overvåke interaksjonen mellom MGDF- og DMPG-vesikler. Tryptofanfluorescens av DMPG:MGDF-kompleksene ble analysert som beskrevet i eksempel 1 ved anvendelse av en MGDF-konsentrasjon på 0,1 mg/ml. Fluorescensspektrene av MGDF i nærvær og fravær av små, unilamellære vesikler bestående av DMPG er vist i figur 22. MGDF har et emisjonsmaksimum ved 336 nm i fravær av DMPG-vesikler. I nærvær av DMPG ved et forhold mellom lipid og protein på 100:1 oppviser MGDF-tryptofanfluorescens et blått skift i fluorescensemisjonsmaksimum til 328 nm. Den lave bøl-gelengde til fluorescensemisjonen i nærvær av DMPG antyder at tryptofanene befinner seg i et miljø som er mer hydrofobt enn det native protein. Som vist i figur 23, avhenger fluorescensskiftene av molforholdet mellom DMPG og MGDF, hvor membraninnføyelse kan påvises når et forhold på 8-30:1 mellom DMPG og MGDF nås. Fluorescensendringen er maksimal ved et molforhold > 100:1, og MGDF oppviser en tilsynelatende høyere affinitet for DMPG-vesikler når pH senkes fra 7,0 til 5,0. Dette antyder at titrering av visse aminosyrer (f.eks. histidin) kan benyttes for å forsterke eller svekke interaksjonen.
2. Jodbremsingseksperimenter
I disse eksperimenter ble MGDF og et DMPG:MGDF-preparat (100:1 DMPG:MGDF) anvendt for jodbremsingseksperimenter, som beskrevet i eksempel 1. Stern-Volmer-plottene av dataene er vist i figur 24. I fravær av DMPG-vesikler blir MGDF-fluorescens effektivt bremset av Kl. I motsetning til dette, i nærvær av DMPG, er tryptofanet tilgjengelig for jod, hvilket indikerer at den del av MGDF som inneholder dette tryptofanet, må være innesluttet i DMPG-dobbeltlaget.
Den ovenfor beskrevne analyse viser at, slik som for G-CSF og GM-CSF, MGDF kan reagere inngående med et umettet fosfolipid som DMPG. I nærvær av DMPG-vesikler beskyttes et MGDF-tryptofan mot en vannoppløselig fluorescensbremser. Samlet viser dataene at MGDF kan innføyes i membraner bestående av DMPG. Membraninnføyelse kan påvises når et 8:l-forhold (DMPG:MGDF) nås, og dette tallet kan representere antallet lipider som omgir den innføyde del av proteinet.
Eksempel 9
I dette eksemplet ble virkningen av DMPG:MGDF-interaksjon bestemt med hensyn til proteinstabilitet. Termisk stabilitet, stabilitet i nærvær av urea og holdbarhetsstabilitet av MGDF (± DMPG) ble evaluert. I hver av undersøkelsene ble det anvendt et DMPG:MGDF-molforhold på 100:1.
1. Termisk stabilitet
Den sirkulære dikroisme (CD ved 222 nm) av MGDF alene eller innføyd i DMPG-vesikler ble overvåket som en funksjon av termisk sirkulering mellom 95 °C og 10 °C, som beskrevet i eksempel 3, figur 10. Prosent resterende CD refererer til mengden av påvist CD (ved 10 °C) etter hver syklus (én syklus er 10 °C-»95 °C-»10 °C) sammenlignet med CD for en uoppvarmet prøve av det angitte preparat. Selv om MGDF taper mer enn 70 % av dets spiralformethet etter tre sykluser med oppvarming, bibeholder DMPG:MGDF fullt ut dets opprinnelige a-spiralformethet under de samme betingelser (se figur 25).
2. Stabilitet i nærvær av urea
Urea er et kaotropt reagens som kan utfolde og denaturere proteiner. Likevektsdenatureringen av MGDF (± DMPG) ble overvåket ved hjelp av fluorescens, dvs. måling av tertiærstruktur, og ved hjelp av sirkulærdikroisme, dvs. et mål for sekundærstruktur. Som avbildet i figur 26, blir, når proteinets tertiærstruktur går tapt, tryptofanrestene mer utsatt for vannfasen, og emisjonsbølgelengden til MGDF skiftes til lengre bølgelengder; og, når sekundærstrukturen går tapt, blir "mean residue elipicity" (MRE) mindre negativ når a-spiralformethet går tapt. I fravær av DMPG forekommer 50 % tap av tertiærstruktur ved ca. 3 M urea, mens 8 M urea fordres for å oppnå 50 % tap av struktur i nærvær av DMPG. Et 50 % tap av MGDF-MRE fordrer likeledes 7 M urea i fravær av MGDF sammenlignet med 9 M urea i nærvær av DMPG.
3. Holdbarhetsstabilitet
E. coli-MGDF 1-163 (± DMPG) ble lagret under beting-elsene angitt i tabell 2 nedenfor og deretter undersøkt ved hjelp av størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) ved anvendelse av en Toso-Haas G3000SWXL-kolonne med en mobil fase av 100 mM fosfatbuffer, 10 % etanol, 0,2 % Tween-20, pH 6,9. Prøver ble fortynnet med etanol og Tween-20 til den samme konsentrasjon som anvendt i den mobile fase, og 10-20 ug prøve ble injisert pr. kromatografering. Kolonnetemperaturen ble opprettholdt ved 40 °C. Eventuelt aggregert MGDF som dannes, eluerer tidligere enn det ikke-aggregerte protein og kvantifiseres ved å måle arealet under kurven for aggregattoppen og monomertoppen. Data refererer til prosent totalt MGDF i aggregattoppen.
Som vist i tabell 2, reduserer DMPG dramatisk dannelsen av aggregater ved lagring. DMPG kan således anvendes for å øke holdbarheten av MGDF.
Disse dataene viser at interaksjonen mellom MGDF- og DMPG-vesikler forhøyer stabiliteten av proteinet under betingelser hvor MGDF alene er ustabilt. Interaksjonen stabiliserer direkte den sekundære og tertiære struktur til MGDF i nærvær av denaturerende midler som urea, og forbedrer vesentlig holdbarheten av MGDF ved forskjellige temperaturer.
Eksempel 10
I dette eksemplet ble kjemisk modifisert MGDF 1-163 (monopegylert (20 kDa) MGDF 1-163 (PEG-MGDF)) testet for dets evne til å reagere med negativt ladete lipidvesikler. For PEG-MGDF ble bestemmelsene utført ved anvendelse av sammenligninger mellom F/F0-intensitet og emisjonsmaksimum (som beskrevet i eksemplene 1 og 8 ovenfor). I hvert tilfelle var molforholdet mellom lipid og protein 100:1.
PEG-MGDF anvendt i disse eksperimenter var monopegylert (20 kDa) E. coli-avledet MGDF 1-163 ved anvendelse av monometoksypolyetylenglykolaldehyd (MePEG) (gjennomsnittlig molekylvekt 20 kDa) via reduktiv alkylering. Homogeniteten til PEG-MGDF-konjugatene ble bestemt ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese ved anvendelse av 4-20 % ferdig-støpte gradientgeler (Novex). Ett hovedbånd som tilsvarte posisjonen for et 46,9 kDa protein, ble avslørt.
DMPG:PEG-MGDF-prøver (100:1 mol/mol) ble deretter preparert ved anvendelse av prosedyrene beskrevet ovenfor. DMPG:PEG-MGDF-prøvene ble funnet fullstendig å gjenvinne sekundærstruktur etter oppvarming (figur 27). Til tross for tilstedeværelsen av PEG-molekylene var det derivatiserte protein i stand til å reagere med lipidet på samme måte som det native protein.
Disse data viser at skiftene i emisjonsmaksima forbundet med MGDF-interaksjon med en negativt ladet lipidvesikkel ikke er enestående kun for MGDF erholdt som et produkt av prokaryot vertscelleekspresjon. Som vist med kjemisk modifisert rhG-CSF, oppviste DMPG:PEG-MGDF også emisjonsskift, og dataene viser at kjemisk modifisert MGDF kan innføyes i membraner bestående av DMPG.
Eksempel 11
I dette eksemplet ble virkningen av DMPG:PEG-MGDF-interaksjon evaluert med hensyn til problemet med MGDF-adsorpsjon til glassampuller. Cirka 11 pg/ml [125I] -PEG-MGDF ble kombinert med forskjellige konsentrasjoner av umerket PEG-MGDF for å oppnå' de angitte PEG-MGDF-sluttkonsentrasjoner (se figur 28). Der det er angitt, ble DMPG inkludert i fortynningen (se også figur 27). 1 ml av preparatene ble plassert i 3 cm<3> glassampuller (Kimble). Den prosentvise gjenvinning av PEG-MGDF ble analysert ved å telle mengden av radiomerket MGDF som kunne gjenvinnes fra glassampullene etter 18 timers inkubasjon ved romtemperatur. Som vist i figur 28, adsorberes PEG-MGDF lett til glassbeholderne når konsentrasjonen av proteinet reduseres, og adsorpsjonen er spesielt høy i området 0,1-50 ug/ml. I motsetning til dette viser DMPG:PEG-MGDF-prøver nesten ingen adsorpsjon til glass i området 0,1-50 ug/ml PEG-MGDF.
Eksempel 12
I dette eksemplet ble virkningen av reaksjonen mellom DMPG:MGDF 1-163 og DMPG:PEG-MGDF 1-163 bestemt med hensyn til den biologiske aktivitet av MGDF 1-163 og PEG-MGDF 1-163. MGDF 1-163 var E. coli-avledet, og forholdet mellom lipid og protein var 100:1. Blodplatetellinger fra mus behandlet med 100 ug/kg og 300 ug/kg MGDF, PEG-MGDF, DMPG:MGDF eller DMPG:PEG-MGDF ble målt, og resultatene er vist i figur 31. Den angitte konsentrasjon av hver form ble administrert subkutant i normale Balb/c-hunnmus én gang pr. dag i 8 dager. Testblodprøver fra et lite lateralt kutt i en halevene ble oppsamlet 24 timer etter den siste injeksjon. Blodcelleanalyser ble utført med en Sysmex elektronisk blodcelleanalysator (Baxter Diagnostics, Inc., Irvine, CA). Data er representert som gjennomsnittet for bestemmelser av fire dyr +/- gjennomsnittlig standardfeil. Andre blodcelleparametere, slik som totalt antall hvite blodceller eller røde blodceller, ble ikke påvirket av disse behandlinger (data ikke vist). Resultatene viser at pegylering av E. coli-MGDF 1-163 øker in vivo-aktiviteten i molekylet. Mer viktig viser de ovenfor angitte under-søkelser at innføyelse av negativt ladete lipiddobbeltlag ikke gir noen ugunstig påvirkning av den biologiske aktivitet av de forskjellige MGDF-former.

Claims (27)

1. Preparat, karakterisert ved at det omfatter et protein som er i stand til å gå over i den smeltede, globulære tilstand når det blandes med en intakt fosfolipid-liposomvesikkel der liposomvesikkelen består av negativt ladete fosfolipider, for å danne et liposom-proteinkompleks hvori kun en del av proteinet er innføyd i lipiddelen av liposomvesikkelen, der proteinet er MGDF og preparatet har pH mellom 3,0 - 7,5 og har et lipid: protein-forhold på minst 10:1.
2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at liposomvesikkelen er utvalgt fra gruppen bestående av dioleoylfosfatidylglyserol (DOPG), dimyristoylfosfatidylglyserol (DMPG), dipalmitoylfosfatidylglyserol (DPPG), eggfosfatidylglyserol, dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE), eggfosfatidyletanolamin, dioleoylfosfatidsyre (DOPA), dimyristoylfosfatidsyre (DMPA), dipalmitoylfosfatidsyre (DPPA), dioleoylfosfatidylserin (DOPS), dimyristoylfosfatidylserin (DMPS), dipalmitoylfosfatidylserin (DPPS), eggfosfatidylserin, lysofosfatidylglyserol, lysofosfatidyletanolamin og lysofosfatidylserin.
3. Preparat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at MGDF er naturlig humant MGDF eller erholdt som et produkt av prokaryot eller eukaryot vertscelleekspresj on.
4. Preparat ifølge krav 3, karakterisert ved at MGDF har aminosyresekvensen: MGDF 1-163 aminosyrene 1-163 i fig. 29.
5. Preparat ifølge krav 3, karakterisert ved at MGDF har aminosyresekvensen -. MGDF 1-332 aminosyrene 1-332 i fig. 29.
6. Preparat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at MGDF er kjemisk modifisert MGDF.
7. Preparat ifølge krav 6, karakterisert ved at det kjemisk modifiserte MGDF er pegylert MGDF (PEG-MGDF).
8. Preparat ifølge krav 7, karakterisert ved at PEG-MGDF er pegylert med polyetylenglykol.
9. Preparat ifølge krav 8, karakterisert ved at PEG-MGDF er monopegylert MGDF (mPEG-MGDF).
10. Preparat ifølge krav 9, karakterisert ved at PEG-gruppen er festet til N-terminale ende av dette.
11. Preparat ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at det inneholder en farmasøytisk akseptabel bærer.
12. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinet er E. coli-avledet MGDF 1-163, hvori liposomvesikkelen er DMPG, og hvori preparatet har et DMPG:MGDF-forhold på 100:1, en pH på 5,0 og inneholder 10 mM natriumacetat, 5 % sorbitol.
13. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinet er monopegylert, E. coli-avledet MGDF (mPEG-MGDF), hvori liposomvesikkelen er DMPG, og hvori preparatet har et DMPG:mPEG-MGDF-forhold på 100:1, en pH på 5,0 og inneholder 10 mM natriumacetat, 5 % sorbitol.
14. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinet er kinesisk hamster ovarie (CHO)-avledet MGDF 1-332, hvori liposomvesikkelen er DMPG, og hvori preparatet har et DMPG:MGDF-forhold på 100:1, en pH på 5,0 og inneholder 10 mM natriumacetat, 5 % sorbitol.
15. Fremgangsmåte for fremstilling av et liposom-proteinpreparat, karakterisert ved blanding av et protein, idet proteinet er i stand til å gå over i den smeltede, globulære tilstand, med en intakt fosfolipid-liposomvesikkel der liposomvesikkelen er negativt ladet, slik at kun en del av proteinet innføyes i lipiddelen av liposomvesikkelen, og isolering av liposom-proteinpreparatet, der proteinet er MGDF og preparatet har pH mellom 3,0 - 7,5 og har et lipid: protein-forhold på minst 10:1.
16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at liposomvesikkelen fremstilles fra et lipid utvalgt fra gruppen bestående av dioleoylfosfatidylglyserol (DOPG), dimyristoylfosfatidylglyserol (DMPG), dipalmitoylfosfatidylglyserol (DPPG), eggfosfatidylglyserol, dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE), eggfosfatidyletanolamin, dioleoylfosfatidsyre (DOPA), dimyristoylfosfatidsyre (DMPA), dipalmitoylfosfatidsyre (DPPA), dioleoylfosfatidylserin (DOPS), dimyristoylfosfatidylserin (DMPS), dipalmitoylfosfatidylserin (DPPS), eggfosfatidylserin, lysofosfatidylglyserol, lysofosfatidyletanolamin og lysofosfatidylserin.
17. Fremgangsmåte ifølge krav 15 eller 16, karakterisert ved at MGDF er naturlig humant MGDF eller erholdt som et produkt av prokaryot eller eukaryot vertscelleekspresjon.
18 Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at MGDF har aminosyresekvensen: MGDF 1-163 aminosyrene 1-163 i fig. 29.
19. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at MGDF har aminosyresekvensen: MGDF 1-332 aminosyrene 1-332 i fig. 29.
20. Fremgangsmåte ifølge krav 15 eller 16, karakterisert ved at MGDF er kjemisk modifisert MGDF.
21. Fremgangsmåte ifølge krav 20, karakterisert ved at det kjemisk modifiserte MGDF er pegylert MGDF (PEG-MGDF).
22. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at PEG-MGDF er pegylert med polyetylenglykol.
23. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at PEG-MGDF er monopegylert MGDF (mPEG-MGDF).
24. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at PEG-gruppen er festet til N-terminale ende av dette.
25. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 15 til 24, karakterisert ved at preparatet inneholder en farmasøytisk akseptabel bærer.
26. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 15 til 25, karakterisert ved at innføyelsen inkluderer innføyelse av en del av proteinet i et lipiddobbeltlag av lipidvesikkelen.
27. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at liposom-proteinpreparatet blir direkte stabilisert overfor utfolding av den sekundære struktur i proteinet.
NO19974323A 1995-03-31 1997-09-19 Stabile protein-fosfolipid-preparater og fremgangsmater for fremstilling av slike NO318235B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/414,161 US5874075A (en) 1993-10-06 1995-03-31 Stable protein: phospholipid compositions and methods
PCT/US1996/004261 WO1996029989A1 (en) 1995-03-31 1996-03-28 Stable protein:phospholipid compositions and methods____________

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO974323D0 NO974323D0 (no) 1997-09-19
NO974323L NO974323L (no) 1997-11-28
NO318235B1 true NO318235B1 (no) 2005-02-21

Family

ID=23640216

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19974323A NO318235B1 (no) 1995-03-31 1997-09-19 Stabile protein-fosfolipid-preparater og fremgangsmater for fremstilling av slike

Country Status (24)

Country Link
US (1) US5874075A (no)
EP (1) EP0817614B1 (no)
JP (1) JP3856471B2 (no)
KR (1) KR100228415B1 (no)
CN (1) CN1241548C (no)
AT (1) ATE222096T1 (no)
BR (1) BR9607999A (no)
CA (1) CA2215534C (no)
CZ (1) CZ292788B6 (no)
DE (1) DE69623003T2 (no)
DK (1) DK0817614T3 (no)
EA (1) EA000415B1 (no)
ES (1) ES2177781T3 (no)
HK (1) HK1006079A1 (no)
HU (1) HU224691B1 (no)
IL (1) IL117690A0 (no)
NO (1) NO318235B1 (no)
NZ (1) NZ306156A (no)
PT (1) PT817614E (no)
SK (1) SK283596B6 (no)
TW (1) TW400236B (no)
UA (1) UA62911C2 (no)
WO (1) WO1996029989A1 (no)
ZA (1) ZA962483B (no)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6429290B1 (en) 1994-08-17 2002-08-06 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and derivatives
US6001968A (en) 1994-08-17 1999-12-14 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and compositions
CN1142940C (zh) * 1996-10-04 2004-03-24 安姆根有限公司 含有mpl配体的药物组合物
DK0937456T3 (da) * 1998-02-23 2004-11-08 Cilag Ag Int Liposomal dispersion af erytropoietin
PL206536B1 (pl) 1998-10-16 2010-08-31 Biogen Idec Inc Kompozycja, kompozycja farmaceutyczna glikozylowanego interferonu-beta-1a, zastosowanie kompozycji glikozylowanego interferonu-beta-1a, sposób in vitro przedłużania aktywności glikozylowanego interferonu-beta-1a
CA2343094A1 (en) * 1998-10-16 2000-04-27 Biogen, Inc. Interferon-beta fusion proteins and uses
WO2001012141A1 (fr) 1999-08-18 2001-02-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Stimulants pour la pousse de cheveux
PT1129720E (pt) 2000-02-29 2004-08-31 Pfizer Prod Inc Factor estimulador de colonias de granulocitos estabilizado
US6416745B1 (en) * 2001-05-03 2002-07-09 Block Drug Company, Inc. Dental composition for treating hypersensitive teeth
US7173003B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
WO2004099231A2 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7214660B2 (en) * 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
CA2952488C (en) * 2002-01-18 2019-05-07 Biogen Ma Inc. Polyalkylene glycol with moiety for conjugating biologically active compounds
US20060193905A1 (en) * 2002-05-14 2006-08-31 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Direct cellular energy delivery system
US7803777B2 (en) * 2003-03-14 2010-09-28 Biogenerix Ag Branched water-soluble polymers and their conjugates
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
WO2006127896A2 (en) * 2005-05-25 2006-11-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor ix
AU2004229253B2 (en) * 2003-04-15 2009-11-05 Cantab Biopharmaceuticals Patents Limited Pharmaceutical composition comprising proteins and/or polypeptides and colloidal particles
WO2005012484A2 (en) * 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US8633157B2 (en) * 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) * 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
CN101072789B (zh) * 2004-01-08 2013-05-15 生物种属学股份公司 肽的o-连接的糖基化
US20070081986A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-12 Shunji Tomatsu Beta-glucuronidase with an attached short peptide of acidic amino acids
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
EP1799249A2 (en) * 2004-09-10 2007-06-27 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
US20080176790A1 (en) * 2004-10-29 2008-07-24 Defrees Shawn Remodeling and Glycopegylation of Fibroblast Growth Factor (Fgf)
MX2007008229A (es) * 2005-01-10 2007-09-11 Neose Technologies Inc Factor estimulador de colonias de granulocitos glicopegilado.
DE102005012457B3 (de) 2005-03-18 2006-08-31 Basf Coatings Ag Epoxid- und Silangruppen enthaltende Oligomere und Polymere, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
US9187546B2 (en) * 2005-04-08 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
KR100770704B1 (ko) 2005-08-04 2007-10-29 삼성전자주식회사 픽쳐 스킵 방법 및 장치
US20070105755A1 (en) * 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
EP2049144B8 (en) * 2006-07-21 2015-02-18 ratiopharm GmbH Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
EP2054521A4 (en) * 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
SI2068907T1 (en) * 2006-10-04 2018-01-31 Novo Nordisk A/S Pegylated sugars and glycopeptides are associated with glycerol
JP2010523582A (ja) * 2007-04-03 2010-07-15 バイオジェネリクス アクチェンゲゼルシャフト グリコｐｅｇ化ｇ−ｃｓｆを用いた治療方法
EP2162535A4 (en) * 2007-06-04 2011-02-23 Novo Nordisk As O-linked glycosylation using N-acetylglucosamine transferases
MX2009013259A (es) * 2007-06-12 2010-01-25 Novo Nordisk As Proceso mejorado para la produccion de azucares de nucleotidos.
RS53404B (en) 2007-08-27 2014-10-31 Ratiopharm Gmbh LIQUID FORMULATION OF G-CSF CONJUGATES
US8207112B2 (en) * 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
US8101565B2 (en) 2007-09-20 2012-01-24 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Sustained release of Apo A-I mimetic peptides and methods of treatment
US7985727B1 (en) 2007-09-20 2011-07-26 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Apo A-I mimetic peptides and methods of treatment
US9173890B2 (en) * 2007-09-20 2015-11-03 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Sustained release of Apo A-I mimetic peptides and methods of treatment
US7985728B1 (en) 2007-09-20 2011-07-26 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Sustained release of Apo A-I mimetic peptides and methods of treatment
US8044021B2 (en) * 2007-09-20 2011-10-25 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Sustained release of apo A-I mimetic peptides and methods of treatment
JP5647899B2 (ja) * 2008-01-08 2015-01-07 ラツィオファルム ゲーエムベーハーｒａｔｉｏｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ オリゴサッカリルトランスフェラーゼを使用するポリペプチドの複合糖質化
CN103497247A (zh) 2008-02-27 2014-01-08 诺沃—诺迪斯克有限公司 缀合的因子viii分子
DK2767546T3 (en) 2011-02-07 2019-02-04 Cerenis Therapeutics Holding Sa Lipoprotein complexes and their preparation and uses
EP3578203A1 (en) 2011-10-28 2019-12-11 Integritybio Inc. Protein formulations containing amino acids
WO2013129935A1 (en) 2012-02-27 2013-09-06 Epitarget As Use of a particulate immunomodulator in cancer therapy

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4515736A (en) * 1983-05-12 1985-05-07 The Regents Of The University Of California Method for encapsulating materials into liposomes
US4744989A (en) * 1984-02-08 1988-05-17 E. R. Squibb & Sons, Inc. Method of preparing liposomes and products produced thereby
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4810643A (en) * 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
DE68913003T2 (de) * 1988-05-16 1994-06-09 Vestar Inc An hormone gekoppelte liposome.
JPH0334920A (ja) * 1989-04-21 1991-02-14 Otsuka Pharmaceut Co Ltd リポソームに結合及至組合わされた生物活性化合物及びそれを含有する医薬
AU6428890A (en) * 1989-09-12 1991-04-18 Regents Of The University Of California, The Therapeutic peptides and proteins
JPH03127622A (ja) * 1989-10-09 1991-05-30 Green Cross Corp:The ｐＨ感受性リポソーム
US5225212A (en) * 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
JPH0482839A (ja) * 1990-07-20 1992-03-16 Green Cross Corp:The 蛋白質類・脂質小体複合体
JPH06247842A (ja) * 1993-02-23 1994-09-06 Green Cross Corp:The リポソーム組成物の製造方法
HUT72326A (en) * 1993-10-06 1996-04-29 Amgen Inc Stable protein phospholipid compositions and methods

Also Published As

Publication number Publication date
US5874075A (en) 1999-02-23
NO974323D0 (no) 1997-09-19
SK126097A3 (en) 1999-06-11
AU688678B2 (en) 1998-03-12
CA2215534A1 (en) 1996-10-03
DE69623003T2 (de) 2003-03-27
EP0817614B1 (en) 2002-08-14
UA62911C2 (en) 2004-01-15
ES2177781T3 (es) 2002-12-16
WO1996029989A1 (en) 1996-10-03
HUP9801370A2 (hu) 1998-10-28
CA2215534C (en) 2003-05-20
TW400236B (en) 2000-08-01
PT817614E (pt) 2002-12-31
BR9607999A (pt) 1998-06-23
EP0817614A1 (en) 1998-01-14
KR100228415B1 (ko) 1999-11-01
HU224691B1 (hu) 2005-12-28
CZ291297A3 (cs) 1999-02-17
ZA962483B (en) 1996-10-03
NO974323L (no) 1997-11-28
CN1241548C (zh) 2006-02-15
AU5434196A (en) 1996-10-16
NZ306156A (en) 1999-02-25
JP3856471B2 (ja) 2006-12-13
HK1006079A1 (en) 1999-02-12
SK283596B6 (sk) 2003-10-07
DK0817614T3 (da) 2002-10-07
IL117690A0 (en) 1996-07-23
JPH11502851A (ja) 1999-03-09
ATE222096T1 (de) 2002-08-15
CZ292788B6 (cs) 2003-12-17
EA000415B1 (ru) 1999-06-24
MX9707137A (es) 1997-11-29
EA199700197A1 (ru) 1998-04-30
DE69623003D1 (de) 2002-09-19
CN1150756A (zh) 1997-05-28
HUP9801370A3 (en) 2000-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO318235B1 (no) Stabile protein-fosfolipid-preparater og fremgangsmater for fremstilling av slike
JP2007063291A (ja) 親油性薬物送達ビヒクルおよびこれらの使用方法
AU683698B2 (en) Stable protein: phospholipid compositions and methods
JP2001278898A (ja) 安定化した顆粒球コロニー刺激因子
EP1469811A2 (en) Methods and compositions for oxygen transport comprising modified hemoglobin in plasma
AU688678C (en) Stable protein:phospholipid compositions and methods
TW201138831A (en) Modified granulocyte colony stimulating factor (G-CSF)
MXPA97007137A (en) Stable protein compositions: fosfolipidos ymeto
WO2003059287A2 (en) Methods and compositions for oxygen transport comprising an oxygen carrier and a crystalloid in hypertonic solution