CZ292788B6 - Farmaceutická kompozice obsahující protein a fosfolipid a způsob její přípravy - Google Patents

Farmaceutická kompozice obsahující protein a fosfolipid a způsob její přípravy Download PDF

Info

Publication number
CZ292788B6
CZ292788B6 CZ19972912A CZ291297A CZ292788B6 CZ 292788 B6 CZ292788 B6 CZ 292788B6 CZ 19972912 A CZ19972912 A CZ 19972912A CZ 291297 A CZ291297 A CZ 291297A CZ 292788 B6 CZ292788 B6 CZ 292788B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
mgdf
csf
pharmaceutical composition
cytokine
liposome
Prior art date
Application number
CZ19972912A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ291297A3 (cs
Inventor
David Collins
Younsik Cha
David Brems
Original Assignee
Amgen Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc. filed Critical Amgen Inc.
Publication of CZ291297A3 publication Critical patent/CZ291297A3/cs
Publication of CZ292788B6 publication Critical patent/CZ292788B6/cs

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/196—Thrombopoietin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/145—Colony stimulating factor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Řešení se týká farmaceutické kompozice s prodlouženou skladovatelností, která obsahuje cytokin smísený s předem připraveným intaktním fosfolipidovým liposomovým vehikulem, které je tvořeno záporně nabitými fosfolipidy, v molárním poměru liposom:cytokin alespoň 25:1 ve formě liposom-cytokinového komplexu, ve kterém je pouze část cytokinu inzertována do lipidové části liposomového vehikula a liposom-cytokinový komplex je přímo stabilizovaný proti rozvinutí sekundární struktury cykotinu; a farmaceuticky přijatelný nosič. Řešení se rovněž týká způsobu přípravy této farmaceutické kompozice.ŕ

Description

Oblast techniky
Vynález se týká protein: fosfolipidových struktur schopných přecházet do roztaveného globulámího stavu, které lze použít pro stabilizaci sekundární a terciální struktury proteinu. Tento vynález se zejména týká G-CSF: fosfolipidových a MGDF: fosfolipidových kompozic, které mají zvýšenou stabilitu, vykazují delší dobu skladování a mohou být použity ve vysokoteplotních formulacích a jako nová dopravní vehikula.
Dosavadní stav techniky
Ukázalo se, že několik proteinů přechází do roztaveného globulámího stavu (MGS). Van der Goot, F.G., Nátuře 354, 408-410 (1991). Proteiny v roztaveném globulámím stavu mají sekundární strukturu, která je srovnatelná se strukturou přirozeného proteinu, který ještě postrádá tuhou terciální strukturu. Pitsyn a kol., FEBS Leters 262:1. 20-24 (1990). V některých případech je přechod do tohoto stavu doprovázet odkrytím již skrytých hydrofobních úseků proteinu. Díky odkrytí kritických hydrofobních zbytků může MGS tvořit mezikrok při agregaci a srážení proteinu. MGS konformaci lze detekovat porovnání cirkulámího dichroismu v daleké UV oblasti se spektrem aromatických bočních řetězců (cirkulámí dichroismus blízkého UV a fluorescence). Roztavený globulámí stav vykazuje spektrální změny aromatických skupin za nepřítomnosti změn cirkulámího dichroismu dalekého UV; Bychkova a kol., FEBS Letters 238: 231-234 (1988); a může být součástí pronikání určitých proteinů membránou; Bychkova a kol., FEBS Letters 238: 231-234 (1988); Van der Goot, F.G., Nátuře 354, 408^110 (1991).
Faktor, stimulující granulocytovou kolonii (G-CSF), je jedním z proteinů o kterých se ví, že přechází do MGS před agregací. Humánní rekombinantní G-CSF selektivně stimuluje neutrofily, což je typ bílých krvinek používaný pro boj s infekcí. V současné době je pro tyto terapeutické účely dostupný Filgrastin, což je rekombinantní G-CSF. Byla provedena celá řada studií zabývajících se určováním struktury G-CSF za různých podmínek; Lu a kol., J. Biol. Chem. sv. 267, 8770-8777 (1992). Vzhledem kjeho hydrofobním vlastnostem je obtížné formulovat G-CSF do formulací, které by bylo možno dlouhodobě skladovat. Formulace určitých hydrofobních proteinů ztrácí během dlouhodobého skladování svou účinnost v důsledku vzniku dimerových a řádově vyšších agregátů. Při skladování může rovněž docházet k dalším chemickým změnám, například deamidaci a oxidaci. Kromě toho je třeba G-CSF při přípravě formulací chránit proti denaturaci a zejména dbát na udržení stability sekundární a terciální struktury proteinu.
Humánní GM-CSF představuje 22-kDa glykoprotein, jehož přítomnost je nepřetržitě potřebná pro in vitro proliferaci makrofágu a granulocytámích prekurzorových buněk. Tento glykoprotein rovněž kontroluje nevratné převedení těchto buněk na glanulocyty a makrofágy. Mezi jeho další biologické aktivity patří například regulace funkční aktivity zralých buněčných typů; Gough a kol., Nátuře 309, 763-767 (1984); a zvyšování chemotaxe k příslušným chemicky vábícím činidlům; Willams a kol., Hematology, 4. vyd. (1990). GM-CSF rovněž stimuluje produkci monocytů a může být tedy použit při léčení monocytámích poruch, například monocytopenie.
Humánní GM-CSF lze získat a purifikovat z celé řady zdrojů. Způsoby přípravy rekombinantního humánního GM-CSF již popsal Burges a kol., Blood, 69:1, 43-51 (1987). Patent US 5 047 504 (Boone) popisuje způsob výroby, který umožňuje vyrábět GM-CSF v neglyosylátované formě jako produkt exprese prokaryotických hostitelských buněk v průmyslovém měřítku.
-1 CZ 292788 B6
Zdá se, že MGDF, nebo-li megakaryocytový růstový a diferenciační faktor, kterým je nedávno klonovaný cytokin, je hlavním regulátorem hladin krevních destiček v oběhovém systému. Viz Bartley, T.D. a kol., Cell 77:1117-1124 (1994); Lok, S. a kol., Nátuře 369:565-568 (1994); de Sauvage, F.J. a kol., Nátuře 369:533-538 (1994); Miyazake, H. a kol., Exp. Hematol. 22:838 (1994); a Kuter D.J. a kol., PNAS USA, 91:11104-11108 (1994). MGDF je rovněž označován jako trombopoietin (TPO), mpl-ligand a megapoietin. Zralý humánní MGDF je protein, který má celkem 332 aminokyselin. Sekvence tohoto proteinu a odpovídající cDNA jsou znázorněny na přiloženém obr. 29.
Ukázalo se, že rekombinantní MGDF produkovaný jak ve vaječníku čínského křečka (CHO), tak v buňkách E. coli je biologicky aktivní a specificky stimuluje nebo zvy šuje hladinu megakaryocytů a/nebo krevních destiček in vivo v těle myší, krys a opic. Viz například Hunt, P. a kol., Blood 84 (10):390A (1994). Molekuly humánního MGDF, které byly upraveny tak, že dosahovaly alespoň 151 aminokyselin, počítáno od aminokyselinové polohy 1 (viz obr. 29), si ponechaly svou biologickou aktivitu in vivo. Rovněž je možné odstranit prvních šest aminokyselin zN-konce humánní sekvence MGDF proteinu, aniž by došlo k ovlivnění biologické aktivity. Je tedy zřejmé, že biologická aktivita je kódována aminokyselinami 7 až 151 (včetně zralé aminokyselinové sekvence humánní MGDF, znázorněné na obr. 29).
Přirozeně se vyskytující MGDF má formu glykosylátované molekuly. Glykosylační vzor přirozeného MGDF je spojován s dvěma klíčovými doménami, které se nacházejí v MGDF. Sekvence prvních přibližně 151 aminokyselin humánního MGDF, která odpovídá aktivní části molekuly, nese značnou homologii se sekvencí erythropoietinu (EPO), což je cytokin schopný stimulovat produkci erythrocytů a je označován jako „EPO-podobný“ doména humánního MGDF. Zbývající aminokyseliny zralého proteinu tvoří tzv. „N-navázanou karbohydrátovou,, doménu, protože zahrnují většinu míst pro N-navázanou glykosylaci, pokud ne všechna tato místa. V humánní MGDF je šest míst N-navázané glykosylace a všechny tato místa jsou obsažena v doméně N-navázané glykosylace. Obě domény obsahují místa O-navázané glykosylace. Bylo zjištěno 12-14 O-navázaných glykosylačních řetězců v molekule. Experimenty prováděné sDNA humánního MGDF exprimovanou rekombinantně v CHO buňkách ukázaly, že v EPO-podobné doméně jsou alespoň dvě O-navázaná míst glykosylátovaná, a to v poloze 1 (Ser) a 37 (Thr).
I když již lze proteiny, jakými jsou například G-CSF a MGDF, za určitých přesně definovaných podmínek stabilizovat, stále přetrvává potřeba prodloužit dobu skladování těchto a dalších proteinů stabilizací jejich sekundární a terciální struktury. Jednou cestou, která byla v minulosti použita pro práci s těmito proteiny, je použití liposomů. Liposomy jsou zcela uzavřené lipidové dvouvrstvé membrány, tvořené vodou nerozpustnými polárními lipidy, zejména fosfolipidy. Liposomová vehikula mohou mít jedinou membránovou dvouvrstvu (unilamelámí) nebo mohou mít těchto membránových dvouvrstev více (multilamelámí). Tato dvouvrstvá se skládá ze dvou lipidových monovrstev, které mají hydrofilní (polární) oblast „hlavy“ a hydrofobní (nepolární) oblast „paty“, přičemž hydrofobní paty jsou orientovány směrem do středu dvouvrstvy, zatímco hydrofilní hlavy jsou orientovány směrem k vodné fázi. Stabilita, tuhost a propustnost liposomů může být ovlivněna ve fosfolipidovém složení, změnami teploty, zahrnutím sterolu nebo zabudováním nabitého amfifilu. Bazická struktura liposomů může být vytvořena celou řadou technik v daném oboru známých.
Při procesu vytváření liposomů mohou liposomy zachycovat ve vodných kanálcích látky rozpouštěné ve vodě a následně je různými rychlostmi uvolňovat. Zjištění toho, že liposomy mohou zavádět enzymy do buněk a měnit jejich metabolismus (Gregoriadis, New Engl.. J. Med. 295. 704-710, 765-770 (1976)) poskytlo odpověď na otázku, jak cíleně dopravovat účinné látky. Tento objev měl velký podíl na rozvoji výzkumu prováděného ve farmaceutickém průmyslu a zabývajícího se pozvolným uvolňováním účinných látek vitaminů a proteinů. Liposomy se používají jako depoty pozvolna uvolňující účinné látky, vitaminy a proteiny, maskované v hydrofobních vrstvách nebo hydrofobních jádru liposomů.
-2CZ 292788 B6
Úspěšné použití liposomů jako nosičů účinné látky je omezeno, protože testy zabývající se použitím těchto liposomů odhalily několik problémů. Je například známo, že liposomy působí jako výkonné imunologické adjuvansy pro zachycené antigeny a proto je třeba se v případě, kdy se v liposomech zachytí enzymy nebo další proteiny xenogenního původu, chovat obezřetně. Řízení rychlosti difúze účinné látky je rovněž obtížné. Tyto obtíže způsobuje vlastní nestabilita liposomů a přítomnosti určitých krevních složek, které urychlují difúzi určitých účinných látek. Navíc díky své povaze jsou některé látky špatně zachytitelné v liposomech a difundují tedy rychleji do oběhu. Konečně existuje problém v případě, že cílem pro působení účinné látky má být libovolná buňka nebo orgán jiný než játra a slezina. Dokonalým přehledem o liposomech, látkách, které byly zabudovány do liposomů, a problémech, spojených s použitím liposomů jako nosičů účinných látek, je přehled „Liposomes“ od Gregora Gregoriaidise, který lze nalézt v publikaci Drug Carries in Biology and Mediáne, kapitola 14, 287-341 (Academie Press, N.Y., 1979).
Přesto, že o pokusech použití liposomů jako nosičů účinných látek bylo napsáno již mnoho, málo publikací se zabývá použitím liposomů pro účely stabilizace struktury peptidu a/nebo proteinu a prodloužení doby skladovatelnosti terapeutických peptidů. V WO 91/04019 s názvem „ Therapeutic Peptides and Proteins“, Hostetler a kol. popisuje použití prázdných liposomů jako farmaceuticky přijatelného ředidla pro rozpouštění polypeptidů a/nebo proteinů, jehož cílem je chránit tyto polypeptidy a/nebo proteiny před akumulací na rozhraní vzduchu a vody a před adsorpcí těchto polypeptidů a/nebo proteinů na povrchu nádoby. Hostetler a kol. uvádí, že záporně nabitý fosfolipid může být přidán až do konečné koncentrace přibližně 50 molámích % a že výhodným lipidem je fosfatidylcholin, což je neutrální fosfolipid. Hostetler a kol. neuvádí, že by ředidlo stabilizovalo strukturu polypeptidů a/nebo proteinu.
V patentu WO 92/06995 s názvem „Preparation and Characterization of Liposomal Formulations of Tumor Necrosis Factor“, Hung a kol., je popsána molekula lipofilně modifikovaného tumor nekrotizujícího faktoru (TNF), navázaná na povrch liposomů nebo zachycená uvnitř liposomů. Jak uvádí tento dokument, bylo zjištěno, že liposomové a lipofilní TNF molekuly mají zvýšenou in vivo stabilitu. Stabilita souvisí se snížením tendence TNF-liposomu uvolňovat TNF do systému in vivo. Jako výhodné liposomy byly označeny neutrální lipidy. Hung a kol. nepopisuje TNF kompozici, ve které by měla vehikula stabilizační účinek na strukturu proteinu.
Doposud nebylo publikováno nic, co by se týkalo kontaktování proteinu, například G-CSF nebo MGDF, se záporně nabitým lipidovým vehikulem, jehož úkolem by bylo přímo stabilizovat protein proti tepelně indukované agregaci, denaturaci, ztrátě účinnosti a rozbalení sekundární struktury. Stále tedy přetrvává potřeba připravit takové kompozice, které by bylo možné použít při formulačních procesech vyžadujících vysoké teploty (například zabudování G-CSF a/nebo MGDF do polymerů) a které by byly použitelné jako nová dopravní vehikula (například pro orální podání pegylovaného G-GSF). Předložený vynález také kompozice poskytuje.
Podstata vynálezu
Vynález se týká farmaceutické kompozice s prodlouženou skladovatelnosti, která obsahuje cytokin smísený s předem připraveným intaktním fosfolipidovým liposomovým vehikulem, které je tvořeno záporně nabitými fosfolipidy, vmolámím poměru liposom:cytokin alespoň 25:1 ve formě liposomcytokinového komplexu, ve kterém je pouze část cytokinu inzertována do lipidové části liposomového vehikula a liposom-cytokinový komplex je přímo stabilizovaný proti rozvinutí sekundární struktury cytokinu; a farmaceuticky přijatelný nosič.
Vynález se rovněž týká způsobu přípravy této farmaceutické kompozice, při kterém se cytokin smísí s intaktním fosfolipidovým liposomovým vehikulem, které má záporný náboj, v molámím
-3CZ 292788 B6 poměru liposom:cytokin alespoň 25:1, ve formě liposom-cytokinového komplexu, ve kterém je pouze část cytokinu inzertována do lipidové části liposomového vehikula a liposom-cytokinový komplex je přímo stabilizován proti rozvinutí sekundární struktury cytokinu; a s farmaceuticky přijatelným nosičem.
Vynález se zejména týká stabilních farmaceutických kompozic obsahujících G-CSM: fosfolipidový a MDGF:fosfolipidový komplex. Překvapivě se zjistilo, že výhodný G-CSM:fosfolipidové a MDGF:fosfolipidové kompozice lze několikrát cyklovat mezi 10 °C a 95 °C a po ochlazení opět získat úplnou sekundární proteinovou strukturu. Kompozice lze použít při formulačních postupech, které vyžadují vysoké teploty a rovněž jako nová dopravní vehikula. Kromě toho tyto kompozice vykazují prodlouženou dobu skladování v porovnání se samotným proteinem a interakce proteinu s fosfolipidovým vehikulem brání adsorpci proteinu na stěny skleněné nádoby.
U výhodného provedení protein:fosfolipidový komplex obsahuje záporně nabitý liposom, který se zvolí z dioleoylfosfatidylglycerolu (DOPG), dimyristoylfosfatidylglycerolu (DMPG), dipalmitoylfosfatidylglycerolu (DPPG), vaječného fosfatidylglycerolu, dioleoylfosfatidylethanolaminu (DOPE), vaječného fosfatidylethanolaminu, kyseliny dioleoylfosfatidové (DOPA), kyseliny dimyristoylfosfatidové (DMPA), kyseliny dipalmitoylfosfatidové (DPPA), dioleylfosfatidylserinu (DOPS), dimyristoylfosfatidylserinu (DMPS), dipalmitoylfosfatidylserinu (DPPS), vaječného fosfatidylserinu, lysofosfatidylglycerolu, lysofosfatidylethenolaminu a lysofosfatidylserinu. Zvláště výhodným je DOPG, záporně nabitý nenasycený fosfolipid. Dalšími znaky vynálezu je udržení pH hodnoty v rozmezí od 3,0 do 7,5 a lipid:proteinového poměru alespoň 10:1.
Dalšími znaky vynálezu, použitý ve výhodných provedeních vynálezu, je například použití chemicky modifikovaných proteinů v protein :fosfolipidovém komplexu a rovněž použití alespoň jednoho činidla regulujícího isotonicitu, pufrovacího činidla a/nebo činidla, regulujícího pH hodnotu. Vynález tedy zahrnuje stabilní protein:fosfolipidové kompozice, které obsahují různé kombinace těchto dodatečných znaků.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 znázorňuje fluorescenční emisní spektrum rhG-CSF v přítomnosti (křivka 1) a za absence (křivka 2) DOPG vehikul. Koncentrace rhG-CSF byla 0,2 mg/ml. poměr DOPG:rhG-CSF (křivka 1) byl 100:1 (molámí poměr).
Obr. 2 znázorňuje vliv zvýšení lipid-proteinového poměru na rhG-CSF fluorescenci. Fo označuje počáteční fluorescenci (bez lipidů) a F označuje fluorescenci po přidání lipidu a po dosažení označeného molámího poměru lipis-rhG-CSF. Obr. 2 (a) znázorňuje F/Fo () a maximální emisní vlnové délce (Δ) pro směsi DOPG:rhG-CSF. Obr. 2(b) znázorňuje F/Fo () a maximální emisní vlnové délky (Δ) pro směsi DPC:rhG-CSF.
Obr. 3 znázorňuje Stem-Volmerovy grafy potlačení rhG-CSF fluorescence přidáním KI za absence (·) a v přítomnosti (O) DOPG vehikul. Potlačení fluorescence se provádělo přidáním alikvotních podílů KI k rhG-CSF (0,2 mg/ml) a při molámím poměru DPG-CSF (100:1).
Obr. 4 znázorňuje potlačení rhG-CSF tryptofanové fluorescence po přidání pyrendekanové kyseliny. Emisní vlnová délka byl 327 nm a molámí poměr DOPG:rhG-CSF byl 100:1.
Obr. 5 znázorňuje graf, který ukazuje srovnání změn F intenzity pro rhG-CSF za nepřítomnosti a v přítomnosti různých lipidů. Ve všech případech byl molámí lipid:proteinový poměr 100:1.
-4CZ 292788 B6
Obr. 6 znázorňuje graf, který ukazuje srovnání posunů emisních maxim pro rhG-CSF za nepřítomnosti a v přítomnosti různých lipidů. Ve všech případech byl molámí lipid-proteinový poměr 100:1.
Obr. 7 znázorňuje vliv DMPC (křivka 4) na CD rhG-CSF (křivka 1). Ve všech případech byl molámí lipid:proteinový poměr 50:1 ve vodě a pH hodnota 6,0.
Obr. 8 znázorňuje vliv zvýšení teploty na CD rhG-CSF (křivka 1) nebo DOPG:rhG-CSF (140:1 molámí poměr) (křivka 2). Koncentrace rhG-CSF byla 80 pg/ml ve vodě a pH hodnota ío 6,0. Teplota se rastrovala v rozsahu od 10 do 90°C, rychlostí 100 °C/h.
Obr. 9 znázorňuje termogramy diferenční rastrovací kalorimetrie pro rthG-CSF (křivka 1) a DOPG:rhG-CSF (45:1 molámí poměr) (křivka 2). Koncentrace rhG-CSF ve vzorcích byla 1 mg/ml ve vodě a pH 7,0. Rastrovací rychlost byla 90 °C/h.
Obr. 10 znázorňuje vliv teplotní cyklizace na CD rhG-CSF (křivka 1) a DOPG:rhG-CSF (140:1 molámí poměr) (křivka 2). Vzorky se rychle ohřály na 95 °C a ochladily na 10 °C, jak označují šipky. Koncentrace rhG-CSF ve vzorcích byla 80 pg/ml a ph hodnota 6,0.
Obr. 11 znázorňuje vliv teplotní cyklizace na CD rhG-CSF (křivka 1) a DMPG.rhG-CSF (150:1) molámí poměr (křivka 2). Vzorky se rychle ohřály na 95 °C a ochladily na 10 °C, jak označují šipky. Koncentrace rhG-CSF ve vzorcích byla 80 pg/ml a pH hodnota 6,0.
Obr. 12 znázorňuje vliv teplotní cyklizace na CD rhG-CSF (křivka 1) a DPPG:rhG-CSF 25 (150:1 molámí poměr) (křivka 2). Vzorky se rychle ohřály na 95 °C a ochladily na 10 °C, jak označují šipky. Koncentrace rhG-CSF ve vzorcích byla 80pg/ml a pH hodnota 6,0.
Obr. 13 znázorňuje graf, který ukazuje schopnost různých lipidů stabilizovat rhG-CSF v průběhu lyofilizace. Lipid:proteinový poměr byl ve všech případech 100:1. Stabilita se stanovila na 30 základě výsledků testů kostní dřeně, stanovujících zachování in vitro aktivity. Samotný rhG-CSF nepřežil lyofilizační proces, takže jako kontrolní vzorek se použil neošetřený rhG-CSF v nepřítomnosti lipidu.
Obr. 14 znázorňuje účinky různých lipidů na in vivo aktivitu rhG-CSF. Aktivita (WBC součet) se 35 měřila po subkutánním injektování křečků. Dávka rhG-CSF byla 100 gg/kg a lipid:proteinový poměr byl 100:1.
Obr. 15 znázorňuje účinky různých lipidů na in vivo aktivitu rhG-CSF. Aktivita (WBC součet) se měřila po subkutánním injektování křečků. Dávka rhG-CSF byla 100 pg/kg a lipid:proteinový 40 poměr byl 50:1.
Obr. 16 znázorňuje graf, který ukazuje srovnání změn intenzity pro CHO-G-CSF za nepřítomnosti a v přítomnosti DOPG při různých pH hodnotách. Ve všech případech byl lipid:proteinový poměr 100:1 (molámí).
Obr. 17 znázorňuje graf, který ukazuje srovnání posunů emisních maxim pro CHO-G-CSF za nepřítomnosti a v přítomnosti DOPG při různých pH hodnotách. Ve všech případech byl lipid:proteinový poměr 100:1 (molámí).
Obr. 18 znázorňuje vliv teplotní cyklizace na CD PEG-G-CSF (----) a DMPG:PEG-G-CSF (17:1 molámí poměr) (----). Vzorky se ohřály na 90 °C a ochladily na 10 °C.
Obr. 19 znázorňuje: (a) vliv teplotní cyklizace na CD GM-CSF v PBS při pH 7,0; GM-CSF se při 10 °C (----) ochladil na 10 °C (----(b) vliv teplotní cyklizace na CD DPPG:PEG-G-5CZ 292788 B6
CSF (17:1 molámí poměr). DPPG:GM-CSF při 10 °C (----) se porovnával s DPPG:GM-CSF, který se ohřál na 90 °C a následně ochladil na 10 °C (---).
Obr. 20 znázorňuje: (a) výsledky WBC odpovědi na intraduodenální infuzi rhG-CSF za absenci a v přítomnosti DOPG; rhG-CSF dávka byla 750 pg/kg a lipid:proteinový poměr byl 100:1; (b) výsledky celkové WBC odpovědi na intraduodenální infuzi PEG-G-CSF za absence a v přítomnosti DOPG: PEG-G-CSF dávka byla 750 pg/kg a lipid:proteinový poměr byl 100:1.
Obr. 21 znázorňuje vliv DOPG na hladinu PEG-G-CSF v séru po intraduodenální infuzi; PEG-G-CSF dávka byla 750 pg/kg a lipid:proteinový poměr byl 100:1.
Obr. 22 znázorňuje fluorescenční emisní spektrum MGDF v přítomnosti a za absence DMPG vehikul. Koncentrace MGDF byla 0,1 mg/ml. MGDF byl zE. coli odvozený MGDF 1-163. DMPG:MGDF molámí poměr byl 100:1 (molámí poměr).
Obr. 23 znázorňuje vliv zvýšení lipid:proteinového poměru na MGDF fluorescenci. MGDF byl zE. coli odvozený MGDF 1-163. Obrázek ukazuje maximální emisní vlnové délky pro směsi DMPG:DGDF pro pH 5,0 (-O- a pH 7,0 (-·-).
Obr. 24 znázorňuje Stem-Volmarovy grafy potlačení MDGF fluorescence přidáním KI za absence (O) a v přítomnosti (·) DMPG vehikul. MGDF byl zE. coli odvozený MGDF 1-163. Potlačení fluorescence se provádělo přidáním alikvotních podílů KI kMDGF (0,1 mg/ml) a při molámím poměru DMPG:MGDF (100:1).
Obr. 25 znázorňuje vliv teplotní cyklizace na CD MGDF (O) a DMPG:MGDF (100:1 molámí poměr) (·). MGDF byl zE. coli odvozený MGDF 1-163. Procento zbývající helicity označuje množství CD detekovaného při 10 °C po každém cyklu (jeden cyklus = vzorky se rychle ohřály na 95 °C a ochladily na 10 °C).
Obr. 26 znázorňuje rozsah MGDF (+ DMPG) denaturace v přítomnosti různých koncentrací močoviny. Obrázek ukazuje cirkulámí dichroismus MRE pro MGDF (-O-) a DMPG:MGDF (-·-), a rovněž MGDF (-□-) a DMPG:MGDF (--) fluorescenční emisní maxima. MGDF byl z E. coli odvozený MGDF 1-163 a poměr DMPG:MGDF byl 100:1 (molámí poměr).
Obr. 27 graficky zobrazuje fluorescenční emisní maxima pro MGDF (± DMPG) a PEG-MGDF (± DMPG). MGDF byl zE. coli odvozený MGDF 1-163 a PEG-MGDF byl mono pegylovaný zE. coli odvozený MGDF 1-163. Poměr DMPG:MGDF a DMPG:PEG-MGDF byl 100:1 (molámí poměr).
Obr. 28 znázorňuje rozsah PEG-MGDF (± DMPG) adsorpce na povrch skleněných lahviček při různých koncentracích PEG-MGDF. MGDF byl zE. coli odvozený MGDF 1-163 a PEG-MGDF byl mono pegylovaný zE. coli odvozený MGDF 1—163. Procento izolovaného PEG-MGDF (-□-) a DMPG:PEG-MGDF (-O-) se stanovilo sečtením radiologicky značeného MGDF izolovaného ze skleněných lahviček po osmnáctihodinové inkubaci při pokojové teplotě.
Obr. 29 znázorňuje DNA a aminokyselinovou sekvenci humánního MGDF (SEQ ID NO: 1 a 2) včetně signálního peptidu (aminokyseliny -21 až -1) a zralé aminokyselinové sekvence (1-332).
Obr. 30 znázorňuje příklad místně specifické MGDF redukční alkylace na a-aminoskupině N-koncového zbytku, prováděné za použití monomethoxypolyethylenglykolaldehydů, která poskytuje v podstatě mono pegylovaný produkt.
Obr. 31 znázorňuje in vivo aktivitu DMPG:MGDF a DMPG:PEG-MGDF v těle normálních myší, ve smyslu počtu krevních destiček. MGDF byl zE. coli odvozený MGDF 1-163
-6CZ 292788 B6 a PEG-MGDF byl mono pegylovaný zE. coli odvozený MGDF 1-163. DMPG:MGDF a DMPG:PEG-MGDF dávka byla 100 pg/kg a 300 pg/kg a lipid:proteinový poměr byl 100:1.
Kompozice podle vynálezu popisuje podrobněji následující popisná část a ilustrační příklady. Tyto příklady ukazují různé aspekty vynálezu a zahrnuji výsledky testů, které určují stabilitu a biologickou aktivitu různých protein:fosfolipidových kompozic. Překvapivě se zjistilo, že interakce proteinů s lipidovým vehikulem přímo stabilizovala proteinovou strukturu, čímž stabilizovala protein za podmínek, které by v nepřítomnosti lipidu vedly k denaturaci proteinu.
Popisná část rovněž popisuje orální podání chemicky modifikované G-CSF:fosfolipidové kompozice, přičemž k modifikaci G-CSF byly použity výše popsané polyethylenglykolové molekuly.
V rámci vynálezu lze použít celou řadou různých proteinů, které jsou schopny přecházet do roztaveného globulámího stavu. Těmito použitelnými proteiny jsou například cytokiny včetně různých hematopoietických faktorů, například výše zmíněné G-CSF, GM-CSF, MGDF, M-CSF, interferony (α, β a γ), interleukiny (1-11), erythropoietin (EPO), fíbroblastový růstový faktor, faktor kmenové buňky nervový růstový faktor, BDNF, NT3, z krevní destičky odvozený růstový faktor a tumorový růstový faktor (α, β). U dalších proteinů lze hodnotit schopnost přecházet do MGS. Pokud je hodnocený protein schopen přecházet do MGS, potom může být uveden do kontaktu se záporně nabitým liposomovým vehikulem a může se určit stabilizační účinek.
G-CSF, který se používá v rámci vynálezu, má zpravidla přirozenou formu izolovanou a purifíkovanou ze savčích organismů nebo představuje produkt chemických syntetických procesů nebo prokaryotické, případně eukaryotické, hostitelské exprese exogenní DNA sekvencí, získaných genomových nebo cDNA klonováním nebo genovou syntézou. Vhodnými prokaryotickými hostiteli jsou různé bakteriální (například E. coli) buňky. Vhodnými eukaryotickými hostiteli jsou například kvasinky (například S. verevisiae) a savčí například vaječníku čínského křečka, opičí) buňky. V závislosti na použitém hostiteli se G-CSF expresní produkt může glykosylovat savčími nebo jinými eukaryotickými uhlovodíky nebo může zůstat neglykosylátovaný. V rámci vynálezu lze použít všechny tyto formy G-CSF i když z hlediska největšího komerčního využití je nej výhodnější rekombinantní G-CSF, zejména odvozený z E. coli.
G-CSF, kteiý má být chemicky modifikován pro použití v rámci vynálezu, může rovněž být buď přirozený humánní G-CSF (nhG-CSF), nebo produkt rekombinantních nukleokyselinových procesů, například exprese prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk. Použitou chemickou modifikací je zpravidla navázání chemického zbytku na samotnou molekulu G-CSF. Přehledným článkem, popisujícím modifikaci proteinů a fúzní proteiny, je Francisův článek, Focis on Growth Factors 3: 4-10% (květen 1992) (publikováno v Mediscript, Mountview Court, Friem Bamet Lané, London N20 OLD, UK). Například viz EP 0 401 384 s názvem „Chemically Modified Granulocyte Colony Stimulating Factor“, popisuje materiály a způsoby přípravy G-CSF, na kterém jsou navázány polyethylenglykolové molekuly. Navázání lze vést přímo na protein nebo na zbytek, který působí jako můstek pro účinnou látku. Vzhledem knejvyšší stabilitě je výhodné navázání kovalentní vazbou. Chemická modifikace může přispět ke kontrolovanému nepřetržitému nebo dlouhodobému účinku G-CSF. To může mít například vliv na řízení doby, za kterou chemicky modifikovaný G-CSF dosáhne krevního oběhu. Příkladem chemického modifikačního činidla jsou polyethylenglykolové kompozice včetně jejich derivátů.
Pro provádění tohoto vynálezu lze použít libovolné chemicky modifikované G-CSF přípravky, které si po podání zachovají svou účinnost. Účinnost lze stanovit známými metodami. Výhodný je zejména pegylovaný G-CSF, výhodnější zejména pegylovaný zE. coli odvozený G-CSF a nejvýhodnější je tri-tetra pegylovaný z E. coli odvozený G-CSF.
Bylo zjištěno že G-CSF je nejstabilnější za kyselých podmínek navzdory skutečnosti, že při pH hodnotách 2,5 až 2,0 dochází ke konformačním změnám, mezi které patří ztráta terciální struktury a zvýšení obsahu α-helikální struktury. Narhi a kol., J. Protein Chem. 10, 359-367, (1991). Pro tuto konformační změnu je charakteristický roztavený globulámí stav (MGS). Takže stejně jako v případě, kdy se pro formulování použijí další proteiny schopné přecházet do MGS, je třeba při práci s G-CSF tento protein chránit proti tepelně indukovanému rozbalování sekundární a terciální struktury' a tím zabránit denaturaci a agregaci.
GM-CSF, který se používá v rámci vynálezu, má zpravidla přirozenou formu izolovanou a purifikovanou ze savčích organismů nebo představuje produkt chemických syntetických procesů nebo prokaryotické, případně eukaryotické hostitelské exprese exogenních DNA sekvencí, získaných genomovým nebo cDNA klonováním nebo genovou syntézou. Vhodnými prokaryotickými hostiteli jsou různé bakteriální (například E. coli) buňky. Vhodnými eukaryotickými hostiteli jsou například kvasinky (například 5. cerevisiae) a savčí (například vaječníku čínského křečka, opičí) buňky. V závislosti na použitém hostiteli se GM-CSF expresní produkt může glykosylovat savčími nebo jinými eukaryotickými glycidy nebo může zůstat neglykosylátovaný. V rámci vynálezu lze použít všechny tyto formy Gm-CSF i když z hlediska největšího komerčního využití je nejvýhodnější rekombinantní GM-CSF, zejména odvozený od E. coli.
Výraz „MGDF“ jak je zde použit, zahrnuje přirozeně se vyskytující MGDF, upravené formy přirozeně se vyskytujícího MGDF a rovněž syntetické polypeptidy, které mají aminokyselinovou sekvenci a glykosylaci natolik odpovídající aminokyselinové sekvenci, a glykosylaci přirozeně se vyskytujícího MGDF, aby mu umožnily vykazovat biologickou aktivitu spočívající ve specificky stimulujícím růstu, vývoji a/nebo produkci megakaryocytů a/nebo krevních destiček.
U výhodného provedení je MGDF produktem exprese exogenní DNA sekvence, která byla transfektována do eukaryotické nebo prokaryotické hostitelské buňky. To znamená, že u výhodného provedení se jako MGDF použije „rekombinantní MGDF“. Výhodným eukaryotickým hostitelem jsou savčí, zvláště výhodně CHO buňky, a výhodným prokaryotickým hostitelem je bakterie, zvláště výhodně bakterie E. coli. Rekombinantní MGDF se výhodně připravuje pomocí způsobů, které budou dále popsány a které lze rovněž najít v citovaných publikacích, týkajících se klonování a exprese MGDF.
Některé další výhodné MGDF molekuly mají následující aminokyselinové sekvence, které znázorňuje obr. 29:
MGDF 1-332
MGDF 1-191
MGDF 1-183
MGDF 1-174
MGDF 1-163
MGDF 1-153
MGDF 1-152
MGDF 1-151
MGDF 1-332
MGDF 1-191
MGDF 1-183
MGDF 1-174
MGDF 1-163
MGDF 1-153
MGDF 1-152
MGDF 1-151 aminokyselina 1-332 z obr. 29 aminokyselina 1-191 z obr. 29 aminokyselina 1-183 z obr. 29 aminokyselina 1-174 z obr. 29 aminokyselina 1-163 z obr. 29 aminokyselina 1-153 z obr. 29 aminokyselina 1-152 z obr. 29 aminokyselina 1-151 z obr. 29 aminokyselina 1-332 z obr. 29 aminokyselina 1-191 z obr. 29 aminokyselina 1-183 z obr. 29 aminokyselina 1-174 z obr. 29 aminokyselina 1-163 z obr. 29 aminokyselina 1-153 z obr. 29 aminokyselina 1-152 z obr. 29 aminokyselina 1-151 z obr. 29
V každé z výše uvedených příkladů může N-konec dále obsahovat Met-Lys.
-8CZ 292788 B6
V případě vynálezu lze rovněž použít různé analogy MGDF. Výraz „analog MGDF“, jak je zde použit, označuje MGDF s jednou nebo více změnami v aminokyselinové sekvenci MGDF, které mají za následek změnu typu (N- nebo O-navázání), počet nebo oblast míst pro navázání glycidů. MGDF analog(y) si zachovává (zachovávají) alespoň ekvivalentní biologickou aktivitu v porovnání s MGDF s přirozenou sekvencí (například humánní MGDF) a mohou vykazovat podstatně vyšší aktivitu, jak bylo naměřeno v testech, stanovujících biologickou aktivitu. Výsledné analogy mohou mít méně nebo více (výhodně více) glycidových řetězců než přirozený humánní/rekombinantní MGDF.
Do skupiny analogů použitelných v rámci vynálezu lze rovněž zahrnout analogy, které mají alespoň jednu aminokyselinu vybíhající z karboxylového konce MGDF a u kterých toto rozšíření karboxylového konce poskytuje alespoň jedno další glycidové místo. Karboxylový konec MGDF se bude lišit v závislosti na konkrétní použité formě MGDF (například MGDF 1-332 aminokyselin nebo MGDF 1-163 aminokyselin). Další glycidové místo lze dodat do karboxylového zbytku MGDF druhů přidáním aminokyselin do karboxylového zbytku, například aminokyselin obsahujících alespoň jedno N- nebo O-navázané glykosylační místo.
Vynález rovněž zahrnuje chemicky modifikované MGDF kompozice. Chemickou modifikací se má obecně na mysli MGDF produkt, ve kterém je uvedený MGDF protein navázán na alespoň jednu polyethylenglykolovou molekulu (tj. pegylovaný MGDF). K provádění pegylace MGDF lze použít libovolnou, v daném oboru známou, pegylační reakci. Viz například Focus on Growht Factors 3 (2): 4-10 (1992); EP 0 154 316; EP 0 401 384; a další zde citované publikace, které se týkají pegylace. Výhodně se pro pegylaci použije acylační nebo alkylační reakce s reakční polyethylenglykolovou molekulou (nebo analogickým, reakční vodou rozpustným, polymerem).
Při pegylaci, k níže se použilo acylační reakce, se obecně aktivní esterový derivát polyethylenglykolu (PEG) uvede do reakce s MGDF proteinem. K provádění pegylace MGDF lze použít libovolnou známou nebo následně objevenou reakční PEG molekulu. Výhodným aktivovaným PEG esterem je PEG esterifíkovaný na N-hydroxysukcinimid („NHS“). Výrazem „acylace“, jak je zde uveden, se rozumí například následující typy vazeb mezi MGDF a rozpustným polymerem, jakým je PEG:amidová vazba, karbamátová vazba, urethanová vazba apod.. Viz Bijoconjugate Chem. 5:133-140 (1994). Reakčními podmínkami mohou být libovolné, pro pegylaci vhodné, reakční podmínky, které jsou v daném oboru známy, ale měly by se vyloučit takové podmínky, například teplota, rozpouštědlo a pH, které by inaktivovaly MGDF druhy, které mají být modifikovány.
Výsledkem pegylační acylace bude zpravidla póly pegylovaný MGDF produkt, ve kterém jsou lysinové ε-aminoskupiny pegylované pomocí acylové vazebné skupiny. Spojovací vazbou bude výhodně amid. Výsledným produktem bude rovněž výhodně v podstatě pouze (například > 95%) mono-, di— nebo tri- pegylovaný produkt. Nicméně v závislosti na specifických použitých reakčních podmínkách se bude zpravidla tvořit i odpovídající množství druhů s vyššími stupni pegylace (maximální počet lysinových ε-aminokyselin plus jedna α-aminoskupina na N-konci MGDF). Pokud je to žádoucí, je možné ze směsi pomocí standardních purifikačních technik, například dialýzy, vysolování, ultrafiltrace, iontoměničové chromatografie, gelové filtrační chromatografie a elektroforézy, separovat čistší pegylované druhy, zejména nezreagované druhy.
Pegylace alkylací zpravidla zahrnuje uvedení koncového aldehydového derivátu PEG do reakce s proteinem, například MGDF v přítomnosti redukčního činidla. Alkylační pegylaci lze rovněž získat póly pegylovaný MGDF. Kromě toho lze manipulovat s reakčními podmínkami tak, aby pegylace proběhla v podstatě pouze na α-aminoskupině N-konce MGDF druhů (tj. aby se získaly mono pegylované druhy). Exemplámě-redukční alkylační reakce s MGDF, poskytující mono pegylovaný produkt, je znázorněn na obr. 30. Jak v případě monopegylace, tak i v případě polypegylace jsou PEG skupiny výhodně navázány na protein přes -CH2-NH-skupinu. Pokud jde o -CH2-skupinu, tento typ vazby je zde označován jako „alkylová“ vazba.
-9CZ 292788 B6
Derivatizací pomocí redukční alkylace se získá monopegylovaný produkt, využívající různou reaktivitu různých typů primárních aminokyselin (lysin versus N-konec) dostupný pro derivatizací pro MGDF. Reakce se provádí při pH (viz níže), která umožní využít výhody pKa diferencí mezi ε-aminokyselinami lysinových zbytků a α-aminoskupiny N-koncového zbytku proteinu. Pomocí této selektivní derivatizace se řídí navázání vodou rozpustného polymeru, který obsahuje reakční skupinu, například aldehyd na protein. Konjugace s polymerem probíhá převážně na N-konci proteinu a nedochází k žádné podstatnější modifikaci ostatních reakčních skupin, například aminoskupin v lysinovém postranním řetězci.
Takže u výhodného provedení se vynález týká pegylovaného MGDF, u kterého jsou PEG skupina nebo PEG skupiny navázány přes acylovou nebo alkylovou skupinu. Jak již bylo diskutováno výše, tyto produkty mohou být polypegylované nebo mono pegylované (například obsahující 2-6, výhodně 2-5, PEG skupin). PEG skupiny jsou zpravidla navázány na protein přes a- nebo ε-aminoskupiny aminokyselin, ale rovněž je třeba vzít v úvahu, že PEG skupiny mohou být navázány na libovolnou aminoskupinu navázanou na protein, která je dostatečně reaktivní na to, aby se za vhodných reakčních podmínek navázala na PEG skupinu.
Polymemí molekuly, použité v rámci acylačního i alkylačního způsobu, lze zvolit mezi vodou rozpustnými polymery a jejich směsmi. Zvolený polymer by měl být vodou rozpustný tak, aby se protein, na který se naváže, nevysrážel ve vodném prostředí, například ve fyziologickém prostředí. Zvolený polymer by měl být modifikovaný tak, aby měl jednu reakční skupinu, například aktivní esterovou skupinu, pro acylaci nebo aldehydovou skupinu pro alkylaci. Zvolený polymer by měl být výhodně modifikován tak, aby mohl být řízen stupeň polymerace. Výhodným reakčním PEG aldehydem je polyethylenglykolpropionaldehyd, který je ve vodě stabilní, nebo jeho monoalkoxyderivát s 1 až 10 atomy uhlíku v alkoxyskupině nebo aryloxyderivát (viz patent US 5 252 714). Polymer může být větvený nebo nevětvený. Pro terapeutické provedení finálního přípravku je výhodné, aby byl polymer farmaceuticky přijatelný. Vodu rozpustný polymer lze zvolit ze skupiny tvořené například polyethylenglykolem, monomethoxypolyethylenglykolem, dextranem, poly(N-vinylpyrrolidon)polyethylenglykolem, homopolymery propylenglykolu, kopolymery propylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylátovanými polyoly (například glycerolem) a polyvinylalkoholem. Pro účely acylačních reakcí by měl mít zvolený polymer(y) jednu reakční esterovou skupinu. Pro účely redukční alkylace by měl mít zvolený polymer(y) jednu reakční aldehydovou skupinu. Vodou rozpustný polymer by zpravidla neměl být zvolen z přirozeně se vyvíjejících glykosylovaných zbytků, protože by se zpravidla běžněji připravují pomocí savčích rekombinantních expresních systémů. Polymer může mít libovolnou molekulovou hmotnost a může být větvený nebo nevětvený.
Zvláště výhodným vodou rozpustným polymerem pro účely vynálezu je polyethylenglykol, zkráceně PEG. Výraz „polyethylenglykol“, jak je zde použit, zahrnuje veškeré formy PEG, které se používají pro derivatizací ostatních proteinů, například monoalkoxypolyethylenglykol s 1 až 10 atomy uhlíku v alkoxyzbytku nebo aryloxypolyethylenglykol. Způsob přípravy pegylovaného MGDF bude zpravidla zahrnovat (a) uvedení MGDF peptidu do reakce s polyethylenglykolem (například reakčním esterovým nebo aldehydovým derivátem PEG) za podmínek, za kterých se MGDF naváže na alespoň jednu PEG skupinu; a (b) získání reakčního produktu(ů). Optimální reakční podmínky pro acylační reakce se budou zpravidla určovat případ od případu na základě známých parametrů a požadovaného výsledku. Například čím větší poměr PEG:proteinu se použije, tím větší je procento získaného póly pegylovaného produktu.
Dalším důležitým parametrem je molekulová hmotnost polymeru. Zpravidla platí, že čím větší molekulovou hmotnost má polymer, tím méně polymemích molekul se může navázat na protein. Při optimalizaci těchto parametrů by mělo být obdobným způsobem zváženo větvení polymeru. Zpravidla platí, že čím vyšší je molekulová hmotnost (více větví), tím vyšší je poměr polymer:protein. Pro zde uvažované pegylační reakce je výhodnou průměrnou molekulovou hmotností přibližně 2000 až 100 000 (výraz „přibližně“ označuje ± 1000). Výhodnou průměrnou
-10CZ 292788 B6 molekulovou hmotností je přibližně 5000 až 50 000, zvláště výhodně přibližně 12 000 až 25 000, nejvýhodněji 20 000. Poměr vodou rozpustného polymeru ku MGDF proteinu se bude zpravidla pohybovat v rozmezí od 1:1 do 20:1 a (pro monopegylaci) a od 1:1 do 5:1.
Při použití výše popsaných podmínek bude redukční alkylace poskytovat selektivní navázání polymeru na libovolný MGDF protein, který má na N-konci α-aminoskupinu, a poskytne v podstatě homogenní přípravu konjugátu monopolymeru v MGDF proteinu. Výraz „konjugát monopolymeru a MGDF proteinu“ označuje kompozici tvořenou jednou polymemí molekulovou navázanou na molekulu MGDF proteinu. Konjugát monopolymeru a MGDF proteinu bude mít výhodně polymemí molekulu situovanou na N-konci, ale nikoli na lysinové postranní aminoskupině. Přípravek bude výhodně tvořen z víře než 90 % konjugátem monopolymeru a MGDF proteinu a výhodně z více než 95 % tvořen konjugátem monopolymeru a MGDF proteinu, přičemž zbytek pozorovaných molekul bude tvořen nezreagované molekuly (tj. protein, postrádající polymemí zbytek). Níže uvedené příklady poskytují přípravek, který je přibližně alespoň z 90 % tvořen konjugátem monopolymeru a proteinu a přibližně z 10 % nezreagovaným proteinem. Tento konjugát monopolymeru a proteinu má biologickou účinnost.
Lipidovými vehikuly, použitelnými v kompozicích podle vynálezu, jsou záporně nabité liposomy, které jsou schopné vzájemně reagovat s příslušným proteinem. Mezi liposomy, o kterých lze uvažovat při použití v rámci vynálezu, patří například dioleoylfosfatidylglycerol (DOPG), dimyristoylfosfatidylglycerol (DMPG), dipalmitoylfosfatidylglycerol (DPG), vaječný fosfatidylglycerol, dioleoylfosfatidylethanolamin (DOPE), vaječný fosfatidylethanolamin, kyselina dioleoylfosfatidová (DOPA), kyselina dimyristoylfosfatidová (DMPA), kyselina dipalmitoylfosfatidová (DPPA), dioleoylfosfatidylserin (DOPS), dimyristoylfosfatidylserin (DMPS), dipalmitoylfosfatidylserin (DPPS), vaječný fosfatidylserin, lysofosfatidylglycerol, lysofosfatidylethanolamin a lysofosfatidylserin. V závislosti na konkrétním použitém liposomu by se mělo měnit množství použitého liposomu.
Protein: fosfolipidové kompozice výhodně zahrnují pufrovací činidlo pro udržení pH hodnoty roztoku v požadovaném rozmezí. Výhodnými pufrovacími činidly jsou například octan sodný, fosforečnan sodný a citrát sodný. Rovněž lze použít směsi těchto pufrovacích činidel. Množství pufrovacího činidla použitelného v kompozici závisí velkou měrou na konkrétně zvoleném pufru a pH hodnotě roztoku. Například octan je účinnějším pufrem při pH 5 až při pH 6, takže v roztoku s pH 5 je možné použít méně octanu než v roztoku s pH 6. Výhodným pH rozmezím pro kompozice podle vynálezu je pH 3,0 až 7,5.
Kompozice podle vynálezu mohou dále zahrnovat činidlo regulující isotonicitu, které dělá roztok isotonickým a vhodnějším pro injektování. Nej výhodnějším činidlem je chlorid sodný v koncentraci 0 mM až 150 mM.
Do rozsahu vynálezu rovněž spadají farmaceutické kompozice, které obsahují účinná množství polypeptidových produktů podle vynálezu společně s farmaceuticky přijatelnými ředidly, konzervačními látkami, solubilizátory, emulgačními činidly, adjuvansy a/nebo nosiči. Tyto kompozice budou ovlivňovat fyzikální stav, stabilitu a biologickou dostupnost proteinu. Viz například Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, 1435-1712 (Mack Publishing Co., Easton, PA., 1990). Účinné množství proteinu bude v konkrétních případech záviset na celé řadě různých faktorů, které musí odborný lékař vzít v úvahu. Mezi tyto faktory patří například požadovaný terapeutický výsledek, závažnost stavu nebo nemoci, která má být léčena, fyzický stav léčeného subjektu atd.
U výhodného provedení, zahrnujícího zE. coli odvozený rhG-CSF, je použitý liposomovým vehikulem DOPG při DOPG:G-CSF molámím poměru 50:1, pH 4,5, které obsahují 10 mM octanu sodného.
-11 CZ 292788 B6
U výhodného provedení, zahrnujícího zE. coli odvozený rhGM-CSF, je použitým liposomovým vehikulem DPMG při DMPG:GM-CSF molámím pornem 17:1, pH 7,0, ve fosfátem pufrovaném solném roztoku (PBS).
U výhodného provedení, zahrnujícího zE. coli odvozený rhG-CSF, který je chemicky modifikovaný (tri-tetra pegylovaný), je použitý liposomovým vehikulem DMPG při DMPG:PEG-G-CSF molámím poměru 17:1 a pH 4,5.
U výhodného provedení, zahrnujícího zE. coli odvozený MGDF 1-163, je použitým liposomovým vehikulem DMPG při DMPG:MGDF molámím poměru 100:1, pH 5,0 v 10 mM octanu sodného 5% sorbitolu.
U výhodného provedení, zahrnujícího zE. coli odvozený MGDF 1-163, který byl chemicky modifikován (mono pegylován (20 kDa) redukční alkylací), je použitý liposomovým vehikulem DMPG při DMPG:MGDF molámím poměru 100:1, při pH 5,0 v 10 mM octanu sodného 5% sorbitolu.
U výhodného provedení, zahrnujícího z CHO odvozený MGDF 1-332, je použitým liposomovým vehikulem DMPG při DMPG.MGDF molámím poměru 100:1, pH 5,0 v 10 mM octanu sodného 5% sorbitolu.
Ačkoli byl vynález popsán na příkladu specifických protein: lipidových kompozic a způsobů léčení, mělo by být odborníkovi v daném oboru zřejmé, že do rozsahu vynálezu rovněž spadá celá řada příbuzných kompozic a způsobů ošetření.
Následující příklad jsou pouze ilustrativního charakteru a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně stanoven přiloženými patentovými nároky.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Úkolem prvních experimentů bylo zjistit možnosti zabudování rekombinantního humánního G-CSF (rhG-CSF) do lipidového vehikula. K přípravě rhG-CSF se použila rekombinantní DNA technologie, při které se buňky E. coli transfektovaly DNA sekvencí kódující humánní G-CSF způsobem, popsaným v patentu US 4 810 643, Souza. rhG-CSF se připravily jako 4 mg/ml roztoku v naředěné HC1 při pH 4,0. Všechny lipidy, které poskytla společnost Avanti Polar Lipids (Alabaster, Ala) se skladovaly při -20 °C pod dusíkem při konečné koncentraci 100 mg/ml ve chloroformu.
Příprava G-CSF: fosfolipidových komplexů
Při přípravě lipidových vehikul, určených pro kombinování s G-CSF, se 30 pmolů příslušného lipidu zavedlo do skleněné zkumavky a vysušilo za použití proudu plynného dusíku, takže poskytlo tenkou fólii. Tyto lipidové fólie se sušily alespoň 2 hodiny za vakua a tím se zbavily všech zbytků chloroformu. Takto vysušené lipidové fólie se hydratovaly v 1 ml deionizované destilované vody (ddH2O), fosfátem pufrovaném roztoku, pH 7,2 (Gibco/BLR „D-PBS“) nebo 150 mM NaCl. Vzorky se následně sonifíkovaly v sonifíkátoru lázňového typu (Laboratory Supplies, Hicksville, N.Y.). V sonifikaci se pokračovalo dokud se vzorky opticky nevyčeřily (zpravidla 10 až 15 minut). Vzorky se až do použití skladovaly při 4 °C po dusíkem. Konečná koncentrace lipidů byla 30 mM. Alternativně lze lipidová vehikula připravit vysoušením 300 μιηοΐ lipidů pod dusíkem a vysušováním za vakua výše popsaným způsobem. Vysušené lipidové fólie se hydratovaly v 10 ml příslušného, výše uvedeného, vodného roztoku. Vzorky se
-12CZ 292788 B6 následně mikrofluidizovaly v laboratorním emulgátorů (Microfluidics Model 11 OS, Microfluidisc, lne. Cambridge, MA), pracujícím při 68,9 MPa. Každý vzorek se mikrofluidizoval v deseti cyklech. Mikrofluidizované vzorky se potom skladovaly při 4 °C výše popsaným způsobem.
G-CSF: fosfolipidové komplexy se připravily smísením G-CSF (výše popsaným) s příslušným lipidem (popsaným výše). K míchání se použilo víření, míchání nebo mírné protřepávání. Pro hodnocení membránové inzerce a stabilizace proteinu se použily různé molámí lipid:G-CSF poměry. Například při přípravě 3 ml vzorku (ve vodě), tvořeného 0,2 mg/ml G-CSF při molámím poměru lipid:G-CSF 40:1 se 150 μΐ G-CSF zásobního roztoku smísilo se 44 μΐ lipidu (30 mM zásobního roztoku, připraveného sonifíkací ve vodě) a vzorek se doplnil do 3 ml vodou. Před použitím nebo testováním vzorku se provedla doporučená pětiminutová inkubace (která není nezbytně nutná).
G-CSF lze rovněž sloučit s hydratovaným lipidem před mikrofluidizací. Následná mikrofluidizace směsí vede k zabudování G-CSF do lipidové membrány.
Analýza G-CSF: fosfolipidových komplexů
1. Tryptofanová emisní spektra
V rtG-CSF jsou dva tryptofanové zbytky, které jsou poměrně citlivé na místní okolní podmínky. Proto se provedla analýza, která měla stanovit rhG-CSF tryptofanovou fluorescenci v případě, kdy je rhG-CSF v kontaktu s liposomy. Modrý posun ve fluorescenčním emisním maximu dává tušit, že tryptofany se nachází v hydrofobnějším prostředí a rhG-CSF je tedy zapouzdřen v lipidových membránách. Skvělým přehledem tryptofanové fluorescenční analýzy je Principles of Fluorescence Microscopy, J. Lakowicz, kapitola 11 (Plenům Press, New York, 1983).
Tryptofanová fluorescence G-CSF: lipidových komplexů (které byly popsány výše) se určovala excitací vzorků při 280 nm a současným skenováním emise do 280 nm do 420 nm v lnm přírůstcích, prováděných rychlostí 1 nm/s. Objem vzorků byl 3 ml a konečná koncentrace G-CSF pro všechny vzorky byla 0,2 mg/ml. Poměry lipid:G-CSF se měnily. Všechny fluorescenční měření se prováděla na fluorometru TPI Alphascan fluorometer (South Brunswick, NJ). Všechna měření se prováděla při 25 °C a tato teplota se udržovala pomocí kyvetového držáku s vodním pláštěm, spojeným s cirkulující vodní lázní. Získaná emisní spektra se analyzovala pomocí software, který poskytla společnost PTI.
Fluorescenční spektrum rhG-CSF v přítomnosti a za absence malých unilamelámích vehikul tvořených DOPG je znázorněno na obr. 1. rhG-CSF měl emisní maximum při 334 nm při absenci DOPG vehikul. V přítomnosti DOPG se při lipid:proteinovém poměru 100:1, vykazovala rhG-CSF tryptofanová fluorescence modrý posun ve fluorescenčním emisním maximu na 327 nm a prudký vzrůst fluorescenční intenzity. Z nízké vlnové délky fluorescenční emise v přítomnosti DOPG vyplývá, že tryptofany jsou v prostředí, které je hydrofobnější než prostředí přirozeného proteinu. Jak ukazuje obr. 2, fluorescenční posun je závislý na molámím poměru DOPG:G-CSF a membránová inzerce je detekovatelná po dosažení DOPG:G-CSF molámím poměru 10:1.
2. Jodidové zmírňování fluorescence
Jodid je účinným kolizním činidlem, zmírňujícím tryptofanovou fluorescenci, které však nemůže pronikat lipidovými membránami, takže účinné zmírnění tryptofanové fluorescence jodidem indikuje pouze zbytky vystavené objemnému vodnému rozpouštědlu a nikoliv proteinové tiyptofany, které jsou maskovány před vodným rozpouštědlem a tak chráněny před jodidovým zmírněním. Při těchto experimentech se použila G-CSF a DOPG:G-CSF kompozice (lipid:proteinový poměr 100:1). Po počátečním odečtu (Fo) se fluorescenční intenzita měřila po přidání zvyšujících se množství jodidu draselného (ΚΙ) (5M zásobní roztok). Jak vzorek, tak KI roztoky se připravily
-13CZ 292788 B6 tak, aby obsahovaly 1 mM Na2SO3 (konečná koncentrace) způsobem, kteiý popsal Lee a kol., Biochem. Biophys. Acta, 984, 174-182 (1989) a Le Doan a kol., Biochem. Biophys. Acta, 858:1- (1986). Přidání Na2SO3 brání tvorbě I2, který se může rozdělit do nepolárních úseků proteinů a membrán. Získaná data se analyzovala pomocí Stem-Volmerov rovnice (Fo/F = 1 + Kki[KI]), ve které Fo a F znamenají fluorescenční intenzitu vzorku za absence, resp. v přítomnosti, KI, při koncentraci [KI]. Kri znamená Stem-Volmerovu tlumicí konstantu pro KI tlumící G-CSF tryptofanové zbytky; Lehrer, S., Biochemistry 10: 3254-3263 (1979).
Získaná data jsou vynesena ve Stem-Volmerových grafech zobrazených na obr. 3. V nepřítomnosti DOPG vehikul KI účinně tlumí rhG-CSF fluorescenci. V přítomnosti DOPG mají data, vynesená ve Stem-Volmerově grafu, lineární průběh, což naznačuje, že jodid má špatný přístup k oběma tryptofanům. Získaná data ukazují, že tryptofanový zbytek, který je v nepřítomnosti DOPG dostupný pro jodid se stává v přítomnosti DOPG pro jodid nedostupný. Část rhG-CSF, obsahující tento tryptofan, musí být tedy zapouzdřena v DOPG dvouvrstvě.
3. Měření energetického přenosu
Jak již bylo uvedeno, mezi tryptofanovými donory a lipidovými rozpustnými fluorescenčními akceptory, například kyselinou pyrendekanovou, může docházet k přenosu energie, protože excitační spektrum této sondy silně překrývá emisní spektrum tryptofanu. Friere a kol., Biochemistry 22: 1675-1680 (1983). Při vniknutí proteinu do lipidových membrán způsobí přenos energie z tryptofanu na pyren ztlumení tryptofanové fluorescence. Při tomto pokusu se tryptofanová emisní intenzita různých lipid:G-CSF komplexů zaznamenává před (Fo) a po (F) přidání různých množství kyseliny pyrendekanové (30 pg/ml zásobního roztoku v tetrahydrofuranu). Vzorky se během přidávání kyseliny pyrendekanové kontinuálně míchaly, čímž se podpořilo míchání mezi kyselinou pyrendekanovou a vzorkem. Mezi poměrem F/Fo a množstvím energie, přecházejícím mez G-CSF tryptofany a hydrofobním energetickým akceptorem, kterým je kyseliny pyrendekanové, je určitá úměra.
Obr. 4 znázorňuje profil útlumu pro rhG-CSF v přítomnosti DOPG (lipid:proteinový poměr 100:1) jako funkci přidané pyrendekanové kyseliny. K útlumu dochází již při velmi nízkých koncentracích pyrendekanové kyseliny (<1 mol. %), takže vliv fluorescenční sondy na strukturu a chování membrány je minimální. Vzhledem k tomu, že se dá očekávat, že pyrendekanové kyselina se rychle rozdělí do lipidových dvouvrstev, ze získaných dat vyplývá, že rhG-CSF je v DOPG membránách zapouzdřen dostatečně hluboko, aby umožnil účinný přesun energie z tryptofanu na pyrenový akceptor. Energetický přesun se potvrdil analyzováním excitačního spektra DOPG vehikul, značených pyrendekanovou kyselinou v přítomnosti a τλ absence rhG-CSF.
Výše popsaná analýza ukázala, že rhG-CSF může těsně reagovat s nenasyceným fosfolipidem, jakým je například DOPG. V přítomnosti DOPG vehikul je rhG-CSF tryprofan chráněn před vodou rozpustným činidlem tlumícím fluorescenci, ale je přístupný pro tlumení způsobené energetickým přenosem na hydrofobní fluorescenční sondu. Z výsledků obou analýz vyplývá, že rhG-CSF může pronikat do membrán tvořených DOPG. Membránová inzerce je detekovatelná po dosažení poměru 10:1 (lipid:G—CSF) a toto číslo může reprezentovat množství lipidů, které obklopují inzert proteinu.
Příklad 2
V tomto příkladu se schopnost rhG-CSF vzájemně reagovat s dalšími fosfolipidy určuje na základě porovnání výše popsané F/Fo intenzity a emisní maxim. V každém případě byl molámí poměr lipid:rhG-CSF 100:1.
Obr. 5 znázorňuje F/Fo údaje pro rhG-CSF v nepřítomnosti a v přítomnosti různých lipidů. Obr.
znázorňuje emisní maxima pro stejné kompozice. Z údajů na obr. 5 a obr. 6 vyplývá, že kromě
-14CZ 292788 B6
DOPG může rhG-CSF inzertovat do DMPG, DPPG a méně účinně do fosfatidylethanolaminů (PE) a fosfatidylserinů (PS). Kromě toho se zjistilo, že NG-DOPE (DOPE vzorek, ve kterém byla PE koncová skupina zápornější) poskytl zlepšenou inzerci rhG-CSF než DOPE.
DOPC, DMPC a DPPC jsou neutrální lipidy a tato vehikula mají malý, nebo vůbec žádný, vliv na emisní maxima a fluorescenční intenzitu rhG-CSF, z čehož vyplývá, že zde nedochází k žádné vzájemné reakci mezi těmito fosfolipidy (viz obr. 5 a 6 a obr. 7, křivka 2).
Zvýše uvedených údajů vyplývá, že protein, který je schopen přecházet do roztaveného glubulámího stavu může inzertovat v různých lipidových vehikulech. Nicméně tato reakce mezi rhG-CSF a lipidem proběhne pouze v případě, že se použije pouze záporně nabité lipidové vehikulum. Pokud jde o tato záporně nabitá vehikula zdá se, že vehikula se zápornějším nábojem poskytují pevnější rhG-CSF:lipidové interakce.
Příklad 3
V tomto případě se určoval vliv DOPG:rhG-CSF interakce na stabilitu proteinu. Měření cirkulárního dichroismu se provádělo na přístroji Jasco J-720, vybaveném Peltierovým typem kyvetového držáku opatřeného termostatem a magnetickým míchadlem. Cirkulámí dichroismus se měřil při 222 nm za použití konečné rhG-CSF koncentrace 80 pg/ml a při pH 6,0. Měření diferenční rastrovací kalorimetrie se prováděla na kalorimetru Microcal MC-2. Vzorky rhG-CSF (1 mg/ml ve vodě) nebo DOPG:rhG-CSF (45:1 mol/mol ve vodě) se skenovaly při rychlosti 90 °C/h. Data byla uložena a analyzována pomocí software Microcal.
Tepelně indukované změny v α-helicitě G-CSF lze sledovat měřením cirkulámího dicroismu (222 nm), v závislosti na zvyšující se teplotě. Tepelně indukované rozbalení rhG-CSF při pH 6,0 je znázorněno na obr. 8. Křivka vykazuje při teplotách přibližně 60 až 70 °C ostrý přechod, který vede ke ztrátě a helicity. Po tomto přechodu se rhG-CSF nevratně vysráží z roztoku. Teplotní rozmezí rozbalení se v podstatě shoduje s tavnou teplotu rhG-CSF při pH 7,0, stanovenou diferenční rastrovací kalorimetrií, jak ukazuje obr. 9.
DOPG:rhG-CSF vzorky naopak vykazují v závislosti na rostoucí teplotě postupnou ztrátu α-helicity a na rozdíl od samotného rhG-CSF není patrné tepelně indukované rozbalení DOPG:rhG-CSF (viz obr. 8). Tento závěr rovněž potvrzuje absence tavného přechodu, jak ukázaly výsledky diferenční rastrovací kalorimetrie (obr. 9). Za povšimnutí stojí, že DOPG:rhG-CSF vzorky mohou po ohřátí na 95 °C opět získat α-helicitu a lze je opakovaně cyklizovat mezi 95 °C a 10 °C, přičemž po ochlazení se v plném rozsahu obnoví jejich helicita (viz obr. 10). Samotný rhG-CSf se za těchto podmínek nevratně rozbalí a vysráží z roztoku.
Rovněž se zjišťoval vliv DMPG a DPPG na G-CSF cirkulámí dichroismus. Použil se lipid: rhG-CSF poměr 150:1 a stejně jako v případě DOPG, DMPG a DPPG stabilizovaly sekundární strukturu rhG-CSF (obr. 11 až 13).
Z výše uvedených údajů vyplývá, že vzájemná reakce mezi rhG-CSF a DOPG, DMPG a DPPG zvyšuje stabilitu proteinu za podmínek, při kterých je samotný rhG-CSF nestabilní. Tato interakce přímo stabilizuje sekundární a terciální strukturu rhG-CSF.
Příklad 4
V tomto příkladu se hodnotil vliv rhG-CSF:DOPG interakce na biologickou aktivitu rhG-CSF. In vitro aktivita rhG-CSF se zjišťovala pomocí G-CSF dependentního vyčerpání [3H]-thymidinu buňkami myší kostní dřeně způsobem, který popsal Zsebo a kol., Immunobiology 172:175-184
-15CZ 292788 B6 (1986). Každý test se prováděl třikrát. Při stanovování in vivo aktivity se určoval počet bílých krvinek (WBC) u křečků, kterým se subkutánně injektovalo 100 pg/kg rhG-CSF.
1. In vitro aktivita
A. Výsledné hodnoty pro specifickou aktivitu rhG-CSF v nepřítomnosti a v přítomnosti DOPG pro rhG-CSF a pro tepelně zpracované DOPG:rhG-CSF vzorky jsou shrnuty v níže uvedené tabulce 1:
Tabulka 1
Vzorek rhG-CSF rhG-CSF (ohřátý)3
DOPG: rhG-CSFb
DOPG: rhG-CSFb (ohřátý)3
Specifická aktivita (U/mg/protein
0,66 ± 0,09 nedetekovatelná
0,61 ±0,11
0,52 ± 0,08 3 Vzorek se před provedením testu inkuboval 10 minut při 85 °C ve vodní lázni b Poměr DOPG: rhG-CSF (mol/mol)
Jak ukazuje tabulka 1, inzerce do DOPR dvouvrstev nemá nežádoucí vliv na biologickou aktivitu rhG-CSF. Po desetiminutové inkubaci při 85 °C nebyla u vzorků rhG-CSF zjištěna specifická biologická aktivita a došlo k vysrážení proteinu. Vzorek DOPG:rhG-CSF si po obdobném ošetření zachoval přibližně 85 % původní aktivity a po ochlazení se opět zcela obnovila jeho sekundární struktura.
B. Rovněž se studovala schopnost různých lipidů stabilizovat rhG-CSF během vymrazování. Vzorky rhG-CSF v kombinaci s různými lipidy se vymrazovaly a u takto lyofilizovaných vzorků se určovala biologická aktivita (jak je popsáno výše). DOPG, DMPG a DPPG, pokud se smísily s rhG-CSF, umožnily po vymrazení zachovat přibližně 100% rhG-CSF biologické aktivity (obr. 14). Samotný rhG-CSF lyofilizační proces nepřežil.
2. In vivo aktivita
Určila se aktivita (počet WBC) rhG-CSF za nepřítomnosti a přítomnosti lipidu. Aktivita se měřila po aplikaci subkutánní injekce (rtG-CSf dávka 100 pg/kg) v den 0. Analyzovalo se pět různých lipidových:rhG-CSF komplexů a u každého lipid:rhG-CSF komplexu bylo zjištěno zachování in vivo aktivity (obr. 15 a 16).
Z výše uvedených studií vyplývá, že inzerce do záporně nabitých lipidových dvouvrstev nemá nežádoucí vliv na biologickou aktivitu rhG-CSF. navíc se zdá, že lipid chrání rhG-CSF během lyofilizačního procesu.
Příklad 5
V tomto příkladu se zjišťovala schopnost chemicky modifikovaného G-CSF (pegylovaného G-CSF (PEG-G-CSF)) a G-CSF, získaného jako produkt exprese eukaryotických hostitelských buněk (CHO-G-CSF), vzájemně reagovat se záporně nabitými lipidovými vehikuly. V případě CHO-G-CSF se pro stanovení této schopnosti použily srovnání F/Fo intenzity a emisní maxim (které bylo popsáno ve výše uvedeném příkladu 1). V případě PEG-G-CSF se použila analýza cirkulámího dichroismu. V obou případech se použil molámí lipid:proteinový poměr 100:1.
Použitý CHO-G-CSF se připravil pomocí rekombinantní DNA technologie, při které se do buněk vaječníku čínského křečka (CHO) transfektoval DNA sekvence kódující humánní G-CSF,
-16CZ 292788 B6 viz patent US 4 810 643 (Souza). CHO-G-CSF se připravil jako 0,6 mg/ml roztok v PBS, pH 7,0. Ukázalo se, že CHO-G-CSF reaguje s DOPG podobným způsobem jako rhG-CSF, přičemž každý vzorek vykazoval v přítomnosti DOPG zvýšenou fluorescenční intenzitu a rovněž modrý posun v emisním maximu (obr. 17 a 18). Každý DOPG interakce není důsledkem určité vlastnosti rekombinantní formy G-CSF.
Použitým PEG-G-CSF při těchto experimentech byl triterra pegylovaný, zE. coli odvozený G-CSF (pro úpravu se použil PEG 6000). DMPG:PEG-G-CSF (17:1 mol/mol) vzorky se připravily výše popsanými způsoby. Ukázalo se, že DMPG:PEG-G-CSF vzorky po ohřátí v celém rozsahu obnoví svoji sekundární strukturu (obr. 19). Navzdory přítomnosti PEG molekul byl derivatizovaný protein schopen vzájemně reagovat s lipidem stejným způsobem jako v případě přirozeného proteinu.
Výše popsaná data ukazují, že stabilizační účinky souvisící s G-CSF interakcí se záporně nabitým lipidovým vehikulem nejsou výsadou pouze rhG-CSF získaného expresí prokaryotických hostitelských buněk. Chemicky modifikovaný protein, který je schopen přecházet do MGS a kontaktovat se s liposomovým vehikulem, zde PEG-G-CSF:DMPG, rovněž vykazuje stabilizační účinky.
Příklad 6
Tento příklad se zabýval studiem účinků DMPG a DPMG na GM-CSF. GM-CSF byl rekombinantní humánní GM-CSF, popsaný v patentu US 5 047 504 (Boone) a připravený jako 1 mg/ml roztok ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS), pH 7,0. Použil se poměr lipid:GM-CSF 17:1 a tepelná stabilita se měřila pomocí výše popsané analýzy cirkulámího dichroismu. DMPG a DPPG mohou poskytnout GM-CSF lepší tepelnou stabilitu, tj. obnovit po ohřátí sekundární strukturu (obr. 20a a 20b).
Z výše uvedeného vyplývá, že DMPG a DPPG představují další příklady proteinů, které jsou schopny přecházet do roztaveného globulámího stavu a vzájemně reagovat se záporně nabitým lipidovým vehikulem s cílem poskytnout proteinu lepší tepelnou stabilitu.
Příklad 7
V tomto příkladu se pro hodnocení možnosti zvyšovat terapeutickou odezvu na G-CSF po enterálním podání použil komplex DOPG:PEG-G-CSF. Pro účely tohoto experimentu se DOPG připravil způsobem uvedeným v příkladu 1 a PEG-G-CSf způsobem popsaným v příkladu 5. 100 pmolů lipidu (797 μΐ) se vysušilo za vakua a k tomuto vzorku se následně přidal 1 ml milli Q vody, čímž se připravila lOOmM roztok lipidu. Tento roztok se 5 minut sonifikoval v sonifikační vodní lázni (Model G 112SP1T od společnosti Lab. Supply lne., Hicksville, NY) nebo dokud se lipidový roztok nevyčeřil. Do 90 molů přirozeného rhG-CSF nebo PEG-G-CSF vl mM HC1 se přidalo 9 pmolů DOPG roztoku (90 μΐ). Roztok se zvířil a 1 mM HC1 se doplnil do konečného objemu 2 ml. Pro účely intraduodenálního podání do těla krys se materiál umístil do osmatického čerpadla, které se implantovalo do těla zvířete. Testovaný materiál se uvolňoval v průběhu 24 hodin.
Výsledky celkové WBC analýzy prováděné u zvířat, kterým byl podán jak rhG-CSF tak PEG-G-CSF s lipidem a bez lipidu, jsou znázorněny na obr. 21. Obr. 21a ukazuje, že infúze přirozeného G-CSF nestimuluje WBC odpověď v porovnání s kontrolním vehikulem. Přidání má malý vliv na terapeutickou odpověď živočichů na rhG-CSF.
Odezva krys na pegylovaný G-CSF je znázorněna na obr. 21b. Je zřejmé, že samotný PEG-G-CSF stimuloval WBC odezvu. Zvýšení hladiny WBC trvalo 48 hodin a potom došlo
-17CZ 292788 B6 opět k postupnému snížení na normální hladinu. PEG-G-CSF formulovaný sDOPG rovněž stimuluje WBC odezvu a tato odezva je téměř dvakrát vyšší než v případě samotného PEG-GCSF. Tyto výsledky potvrdily hladiny PEG-G-CSF, naměřené v séru po infuzi (obr. 22).
Zvýše uvedených dat vyplývá, že zahrnutí aniontového lipidu, například DOPG, do orální formulace PEG-G-CSF, jak se zdá, zvyšuje terapeutickou odezvu na derivatizovaný protein. Mechanismu, kteiý se dosahuje tohoto zvýšení odezvy není doposud znám.
Příklad 8
Tento příklad se zabýval studiem účinků DMPG na MGDF. MGDF použitým při těchto studiích byl rekombinantní humánní zE. coli odvozený MGDF 1-163, připravený jako 1,0 mg/ml roztok ve lOmM octanu sodném, 5% sorbitolu při pH 5,0. Příprava DMPG:MGDF komplexů je popsána v příkladu 1.
Analýza DMPG:MGDF komplexů
1. Tryptofanové emisní spektrum
Pro monitorování interakce MGDF s DMPG vehikuly se použil tryptofanový zbytek v poloze 51 sekvence MGDF. Tryptofanová fluorescence DMPG:MGDF komplexů se určovala způsobem popsaným v příkladu 1, při koncentraci MGDF 0,1 mg/m. Fluorescenční spektrum MGDF v přítomnosti a za absence malých unilamelámích vehikul tvořených DMPG znázorňuje obr. 22. MGDF má při nepřítomnosti DMPG při lipid:proteinovém poměru 100:1 vykazuje MGDF tryptofanová fluorescence modrý posun ve fluorescenčním emisním maximu na 328 nm. Z nízké vlnové délky fluorescenční emise v přítomnosti DMPG vyplývá, že se tryptofany nachází v hydrofobnějším prostředí než je prostředí přirozeného proteinu a, jak ukazuje obr. 23, fluorescenční posuny závisí na molámím poměru DMPG:MGDF, přičemž membránová inzerce je detekovatelná po dosažení molámího DMPG:MGDF molámím poměru 8 až 30:1. Fluorescenční změna dosahuje maxima při molámích poměrech > 100:1 a MGDF vykazuje podstatně vyšší afinitu pro DMPG, jakmile pH hodnota klesne ze 7,0 na 5,0. Z toho vyplývá, že pro zesílení nebo zeslabení interakce lze použít titraci určitých aminokyselin (například histidinu).
2. Jodidové tlumení fluorescence
V těchto experimentech se pro testování jodidového tlumení, prováděného způsobem popsaným v příkladu 1, se použily MGDF a DMPG:MGDF kompozice (100:1 DMPG:MGDF). StemVolmerovy grafy jsou znázorněny na obr. 24. Za nepřítomnosti DMPG vehikul KI podstatným způsobem ztlumilo MGDF fluorescenci. V přítomnosti DMPG vyl tryptofan pod jod nepřítomný, což naznačuje, že část MGDF, která obsahuje tento tryptofan, musí být zapouzdřena v DMPG dvouvrstvě.
Výše uvedená analýza ukazuje, že stejně jako v případu G-CSF a GM-CSF může MGDF úzce reagovat s nenasyceným fosfolipidem, jakým je například DMPG. V přítomnosti DMPG vehikul je MGDF tryptofan chráněn před vodou rozpustným činidlem, tlumícím fluorescenci. Ze získaných výsledků vyplývá, že MGDF může inzertovat do membrán tvořených DMPG. Membránová inzerce je detekovatelná po dosažení DMPG:MGDF molámím poměru 8:1.
Příklad 9
V tomto příkladu se zjišťoval vliv DMPG:MGDF interakce na stabilitu proteinu. Hodnotila se tepelná stabilita MGDF (± DMPG), stabilita MGDF (± DMPG) v přítomnosti močoviny a
-18CZ 292788 B6 stabilita MGDF (± DMPG) při skladování. V každé studii se použil molámí poměr DPMG:MGDF 100:1.
1. Tepelná stabilita
Cirkulámí dichroismus (CD při 222 nm) samostatného MGDF nebo zavedeného do DMPG vehikula se monitorovala jako funkce tepelné cyklizace mezi 95 °C a 10 °C, popsané v příkladu 3 a znázorněné na obr. 10. Procenta zbývajícího CD označují množství CD detekovaného (při 10 °C) po každém cyklu (jeden cyklus je 10 °C ->95 °C -> 10 °C) v porovnání s CD neohřátého ío vzorku odpovídající kompozice. Zatímco MGDF ztrácí po třech ohřívacích cyklech více než % své α-helicity, DMPG.MGDF si za stejných podmínek zachovává svůj původní α-helicutu v celém rozsahu (viz obr. 25).
2. Stabilita v přítomnosti močoviny
Močovina je chaotropním reakčním činidlem, které může rozbalit a denaturovat proteiny. K monitorování rovnovážné denaturace MGDF (± DMPG) se použila fluorescence, tj. míra terciální struktury, a cirkulační dichroismus, tj. míra sekundární struktury. Jak ukazuje obrázek 26 se ztrátou proteinové terciální struktury jsou tryptofanové zbytky odkrytější pro působení 20 vodné fáze a emisní vlnová délka MGDF je posunuta k delším vlnovým délkám. Se ztrátou sekundární struktury se střední zbytková elipicita (MRE) stává méně zápornou. Při nepřítomnosti DMPG dochází k 50% ztrátě terciální struktury přibližně při 3M močovině, zatímco v přítomnosti DMPG je pro dosažení 50% ztráty terciální struktury zapotřebí 8M močovina. Podobně 50% ztráta MGDF MRE vyžaduje při nepřítomnosti DMPG 7M močovinu, zatímco 25 v přítomnosti DMPG je třeba pro dosažení 50% ztráty zapotřebí 9M močovina.
3. Stabilita při skladování
E. coli MGDF 1 = 163 (± DMPG) se skladoval za podmínek shrnutých v níže uvedené tabulce 2 30 a testoval se velikostně vylučující chromatografíí (SEC) na sloupci Toso-Haas G3000SWXL s mobilní fází, tvořenou lOOmM fosfátovým pufrem, 10% ethanolem, 0,2% Tweenem-20, pH 6,9. Vzorky se naředily ethanolem a Tweenem-20 na stejnou koncentraci jako v případě mobilní fáze a 10 až 20 pg vzorku a injektovaly se. Teplota sloupce se udržovala na 40 °C. Veškerý agregovaný MGDF, který se vytvořil, eluoval rychleji než neagregovaný protein a jeho množství se 35 určilo tak, že se změřila plocha pod křivkou agregátového píku a monomemího píku. Tento údaj je uveden jako procento celkového MGDF v agregátovém píku.
Tabulka 2
Vzorek Teplota % agregace naměřené SEC
5 týdnů 11 týdnů
MGDF -80 °C 0 0,2
4 °C 0,4 0,6
37 °C 18 39,2
DMPG:MGDF -80 °C 0 0,14
4°C 0 0
37 °C 1,9 2,5
Jak ukazuje tabulka 2, DMPG prudce snižuje tvorbu agregátů v důsledku skladování. DMPG lze tedy použít pro prodloužení doby skladování MGDF.
Z výše uvedených dat vyplývá, že interakce MGDF s DMPG vehikuly zvyšuje stabilitu proteinu 45 za podmínek, za kterých je samotný MGDF nestabilní. Interakce přímo stabilizuje sekundární a
-19CZ 292788 B6 terciální struktury MGDF v přítomnosti denaturačních činidel, jakým je na příklad močovina, a podstatně prodlužuje skladovatelnost MGDF při různých teplotách.
Příklad 10
V tomto příkladu se hodnotila schopnost chemicky modifikovaného MGDF 1-163 (mono pegylovaného (20kDa) MGDF 1-163 (PEG-MGDF)) vzájemně reagovat se záporně nabitými lipidovými proteiny. V případě PEG-MGDF se tato schopnost hodnotila na základě porovnání F/Fo intenzity a emisních maxim (jak je popsáno ve výše uvedených příkladech 1 a 8). V každém případě byl použitý molámí lipidiproteinovým poměrem poměr 100:1.
PEG-MGDF, použitým v těchto experimentech, byl zE. coli odvozený MGDF 1-163, mono pegylovaný (20kDa) redukční alkylací pomocí monomethoxypolyethylenglykolaldehydu (MePEG) (průměrná molekulová hmotnost 20 kDa). Homogenita PEG-MGDF konjugátu se stanovila gelovou elektroforézou v nátrium dodecylsulfátpolyakrylamidovém gelu za použití 4 až 20 % prefabrikovaných gradienčních gelů (NOVEX). Získal se jeden hlavní pás, odpovídající poloze 46,9 kDa proteinu.
DMPG:PEG-MGDF (100:1 mol/mol) vzorky se připravily výše popsaným způsobem. Zjistilo se, že DMPG:PEG-MGDF vzorky po zahřátí zcela obnovují svoji sekundární strukturu (obr. 27). Navzdory přítomnosti PEG molekul je derivatizovaný protein schopen vzájemně reagovat s lipidem stejným způsobem jako přirozený protein.
Výše uvedená data ukazují, že posuny emisního maxima, dávané do souvislosti s MGDF interakcí se záporně nabitým lipidovým vehikulem, nejsou pouze výsadou MGDF získaného expresí prokaryotických hostitelských buněk. Jak lze demonstrovat na modifikovaném rgG-CSF, DMPG:PEG-MGDF rovněž vykazoval emisní posuny, přičemž z těchto výsledků vyplývá, že chemicky modifikovaný MGDF může inzertovat do membrán tvořených DMPG.
Příklad 11
V tomto příkladu se hodnotil vliv DMPG:PEG-MGDF interakce na problematickou adsorpci MGDF na skleněné nádoby. 11 pg/ml [125I]-PEG-MGDF se zkombinoval s různými koncentracemi neoznačeného PEG-MGDF za vzniku konečných koncentrací PEG-MGDF, které jsou naznačeny na obr. 28. Tam, kde je to naznačeno, byl DMPG součástí naředění (rovněž viz obr. 27). 1 ml přípravků se umístil do 3 m3 skleněných lahviček (Kimble). Procento izolovaného PEG-MGDF se zjistilo sečtením radioaktivně značeného MGDF, izolovaného ze skleněných lahviček po osmnáctihodinové inkubaci při pokojové teplotě. Jak ukazuje obr. 28, při nižších koncentracích protein PEG-MGDF viditelně adsorbuje na skleněné nádobě a adsorpce je zvláště vysoká v rozmezí 0,1 až 50 pg/ml DMPG:PEG-MGDF vzorky se v tomto rozmezí, 0,1 až 50 pg/ml PEG-MGDF, na sklo většinou téměř neadsorbují.
Příklad 12
V tomto příkladu se hodnotil vliv DMPG:MGDF 1-163 a DMPG:PEG-MGDF 1-163 interakce na biologickou aktivitu MGDF 1-163 a PEG-MGDF 1-1643. MGDF 1-163 byl zE. coli odvozený MGDF 1-163 a lipid:proteinový poměr byl 100:1. Určil se počet krevních destiček myší, očekávaných 100 pg/kg a 300 pg/kg MGDF, PEG-MGDF, DMPG-MGDF nebo DMPG:PEG-MGDF, výsledky jsou znázorněny na obrázku 31. Naznačená koncentrace každé formy se jednou denně podala subkutánně po dobu osmi dní normálním samičkám Balb/c myší. Testované odběry se získaly z laterálního řezu v ocasní žíle, 24 hodin po poslední injekci. Pro analýzu krvinek se použil analyzer Sysmex elecronic blood cell (Baxter Diagnostics, Ins. Irvine,
-20CZ 292788 B6
CA). Uvedená data představují průměr výsledků, získaný ze čtyř zvířat +/- standardní chyba. Další parametry krve, například počet bílých krvinek nebo počet červených krvinek, nebyly tímto ošetřením ovlivněny (data nejsou uvedena). Výsledky naznačují, že pegylace zE. coli odvozené MGDF 1-163 zvyšuje in vivo aktivitu molekuly.
Důležitější je, že výše uvedené studie ukazují, že inzerce do záporně nabitých lipidových dvouvrstev nemá nežádoucí vliv na biologickou aktivitu různých forem MGDF.
Sekvenční protokol (1) údaje k SEQ IDNO:1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1342 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: LINEÁRNÍ (ii) DRUH MOLEKULY: Cdna (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POZICE: 99.:621 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:
CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG60
TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT113
Ser Pro Ala Pro Pro
GC.T TGT Ala Cys GAC CTC CGA GTC CTC Val Leu AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC 161
Asp Leu Arg 10 Ser Lys Leu 15 Leu Arg Asp Ser His Val 20
CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA 209
Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr
25 30 35
CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC 257
Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr
40 45 50
CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT 305
Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu
55 60 65
CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC 353
Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr cys
70 75 80 85
CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT 401
Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu
90 95 100
-21 CZ 292788 B6
GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG449
Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin GlyArg
105 110115
ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC497
Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe GinHis
120 125130
CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC AČC545
Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly- SerThr
135 140145
CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC593
Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser ArgThr
150 155 160165
TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC C CAAACAGGAC TTCTGGATTG641
Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu
170
TTGGAGACAA ACTTCACTGC CTCAGCCAGA ACTACTGGCT CTGGGCTTCT GAAGTGGCAG701
CAGGGATTCA GAGCCAAGAT TCCTGGTCTG CTGAACCAAA CCTCCAGGTC CCTGGACCAA761
ATCCCCGGAT ACCTGAACAG GATACACGAA CTCTTGAATG GAACTCGTGG ACTCTTTCCT821
GGACCCTCAC GCAGGACCCT AGGAGCCCCG GACATTTCCT CAGGAACATC AGACACAGGC881
TCCCTGCCAC CCAACCTCCA GCCTGGATAT TCTCCTTCCC CAACCCATCC TCCTACTGGA941
CAGTATACGC TCTTCCCTCT TCCACCCACC TTGCCCACCC CTGTGGTCCA GCTCCACCCC1001
CTGCTTCCTG ACCCTTCTGC TCCAACGCCC ACCCCTACCA GCCCTCTTCT AAACACATCC1061
TACACCCACT CCCAGAATCT GTCTCAGGAA GGGTAAGGIT CTCAGACACT GCCGACATCA1121
GCATTGTCTC GTGTACAGCT CCCTTCCCTG CAGGGCGCCC CTGGGAGACA ACTGGACAAG1181
ATTTCCTACT TTCTCCTGAA ACCCAAAGCC CTGGTAAAAG GGATACACAG GACTGAAAAG1241
GGAATCATTT TTCACTGTAC ATTATAAACC TTCAGAAGCT ATTTTTTTAA GCTATCAGCA1301
ATACTCATCA GAGCAGCTAG CTCTTTGGTC TATTTTCTGC A1342 (1) údaje k SEQ ID NO: 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 174 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:
-22CZ 292788 B6
Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu
1 5 10 15
Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val
20 25 30
His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu
35 40 45
Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp Ile Leu
50 55 60
Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin
65 70 75 80
Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin
85 90 95
Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu
100 105 110
Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe
115 120 125
Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu
130 135 140
Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala
145 150 155 160
Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu
165 170

Claims (40)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Farmaceutická kompozice, v y z n a č e n á tím, že obsahuje cytokin smísený s předem připraveným intaktním fosfolipidovým liposomovým vehikulem, které je tvořeno záporně nabitými fosfolipidy, v molámím poměru liposom:cytokin alespoň 25:1 ve formě liposom-cytokinového komplexu, ve kterém je pouze část cytokinu inzertována do lipidové části liposomového vehikula a liposom-cytokinový komplex je přímo stabilizovaný proti rozvinutí sekundární struktury cytokinu; a farmaceuticky přijatelný nosič.
  2. 2. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačená tím, že kompozice má pH 3,0 až 7,5
  3. 3. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačená tím, že se liposomové vehikulum zvolí ze skupiny tvořené dioleoylfosfatidylglycerolem, dimyristoylfosfatidylglycerolem, dipalmitoylfosfatidylglycerolem, vaječným fosfatidylglycerolem, dioleoylfosfatidylethanolaminem, vaječným fosfatidylethanolaminem, kyselinou dioleoylfosfatidovou, kyselinou dimyristoylfosfatidovou, kyselinou dipalmitoylfosfatidovou, dioleoylfosfatidylserinem, dimyristoylfosfatidylserinem, dipalmitoylfosfatidylserinem, vaječným fosfatidylserinem, lysofosfatidylglycerolem, lysofosfatidylethanolaminem a lysofosfatidylserinem.
    -23CZ 292788 B6
  4. 4. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačená tím, že cytokinem je hematopoietický faktor.
  5. 5. Farmaceutická kompozice podle nároku 4, vyznačená tím, že hematopoietický faktor se zvolí ze skupiny tvořené G-CSF, GM-CSF a MGDF.
  6. 6. Farmaceutická kompozice podle nároku 5, vyznačená tím, že hematopoietickým faktorem je G-CSF.
  7. 7. Farmaceutická kompozice podle nároku 6, vyznačená tím, že G-CSF je humánní G-CSF nebo produktem získaným expresí prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk.
  8. 8. Farmaceutická kompozice podle nároku 6, vyznačená tím, že G-CSF je chemicky modifikovaný G-CSF.
  9. 9. Farmaceutická kompozice podle nároku 8, vyznačená tím, že chemicky modifikovaným G-CSF je pegylovaný G-CSF.
  10. 10. Farmaceutická kompozice podle nároku 5, vyznačená tím, že hematopoietickým faktorem je MGDF.
  11. 11. Farmaceutická kompozice podle nároku 10, vyznačená tím, že MGDF je přirozeným humánním MGDF nebo produktem získaný expresí prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk.
  12. 12. Farmaceutická kompozice podle nároku 11, vyznačená tím, že MGDF má amimokyselinovou sekvenci obsahující 1-163 aminokyselin znázorněnou na obrázek 29.
  13. 13. Farmaceutická kompozice podle nároku 11, vyznačená tím, že MGDF má aninokyselinovou sekvenci obsahující 1-332 aminokyselin znázorněnou na obrázku 29.
  14. 14. Farmaceutická kompozice podle nároku 10, vyznačená tím, že MGDF je chemicky modifikovaný MGDF.
  15. 15. Farmaceutická kompozice podle nároku 14, vyznačená tím, že chemicky modifikovaným MGDF je pegylovaný MGDF.
  16. 16. Farmaceutická kompozice podle nároku 15, vyznačená tím, že pegylovaný MGDF je pegylovaný polyethylenglykolem.
  17. 17. Farmaceutická kompozice podle nároku 16, vyznačená tím, že pegylovaným MGDF je monopegylovaný MGDF.
  18. 18. Farmaceutická kompozice podle nároku 17, vyznačená tím, že pegylovaná skupina je navázána na N-konec MGDF.
  19. 19. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačená tím, že protein je z E. coli odvozený rhG-CSF, liposomový vehikulem je DOPG, kompozice má molámí poměr DOPG:rhG-CSF 50:1, pH 4,5 a obsahuje 10 mM octanu sodného.
  20. 20. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačená tím, že proteinem je z E. coli odvozený MGDF obsahující 1-163 aminokyselin, jejichž sekvence je znázorněna na obrázku
    -24CZ 292788 B6
    29, liposomovým vehikulem je DPMG, kompozice má molámí poměr DMPG:MGDF 100:1, pH 5,0 a obsahuje 10 mM octanu sodného a 5°/o sorbitol.
  21. 21. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačená tím, že proteinem je monopegylovaný z E. coli odvozený MGDF, liposomovým vehikulem je DMPG, kompozice má molámí poměr DMPG:mPEG-MGDF 100:1, pH 5,0 a obsahuje 10 mM octanu sodného a 5% sorbitol.
  22. 22. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačená tím, že protein je z CHO odvozený MGDF obsahující 1-332 aminokyselin, jejichž sekvence je znázorněna na obrázku 29, liposomovým vehikulem je DMPG, kompozice má molámí poměr DMPG:MGDF 100:1, pH 5,0 a obsahuje 10 mM octanu sodného a 5% sorbitol.
  23. 23. Způsob přípravy farmaceutické kompozice podle nároku 1, vyznačený tím, že se cytokin smísí s intaktním fosfolipidovým liposomovým vehikulem, které má záporný náboj, vmolámím pornem liposomxytokin alespoň 25:1, ve formě liposom-cytokinového komplexu, ve kterém je pouze část cytokinu inzertována do lipidové části liposomového vehikula a liposom-cytokinový komplex je přímo stabilizován proti rozvinutí sekundární struktury cytokinu; a s farmaceuticky přijatelným nosičem za vzniku liposom-cytokinové kompozice s prodlouženou skladovatelností.
  24. 24. Způsob podle nároku 23, vyznačený tím, žepH farmaceutické kompozice se pohybuje v rozmezí do 3,0 do 7,5.
  25. 25. Způsob podle nároku 23, vyznačený tím, že se liposomové vehikulum připraví z lipidu zvoleného ze skupiny tvořené dioleoylfosfatidylglycerolem, dimyristoylfosfatidylglycerolem, dipalmitoylfosfatidylglycerolem, vaječným fosfatidylglycerolem, dioleoylfosfatidylethanolaminem, vaječným fosfatidylethanolaminem, kyselinou dioleoylfosfatidovou, kyselinou dimyristoylfosfatidovou, kyselinou dipalmitoylfosfatidovou, dioleylfosfatidylserinem, dimyristoylfosfatidylserinem, dipalmitoylfosfatidylserinem, vaječným fosfatidylserinem, lysofosfatidylglycerolem, lysofosfatidylethanolaminem a lysofosfatidylserinem.
  26. 26. Způsob podle nároku 23, vyznačený tím, že cytokinem je hematopoietický faktor.
  27. 27. Způsob podle nároku 26, vyznačená tím, že hematopoietický faktor se zvolí ze skupiny tvořené G-CSF, GM-CSF a MGDF.
  28. 28. Způsob podle nároku 27, vyznačený tím, že hematopoietickým faktorem je G-CSF.
  29. 29. Způsob podle nároku 28, vyznačený tím, že G-CSF je přirozeným humánním G-CSF nebo produktem, získaným expresí prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk.
  30. 30. Způsob podle nároku 29, vyznačený tím, že G-CSF je chemicky modifikovaný G-CSF.
  31. 31. Způsob podle nároku 30, vyznačený tím, že chemicky modifikovaným G-CSF je pegylovaný G-CSF.
  32. 32. Způsob podle nároku 27, vyznačený tím, že hematopoietickým faktorem je MGDF:
    -25CZ 292788 B6
  33. 33. Způsob podle nároku 32, vyznačený tím, že MGDF je přirozeným humánním MGDF nebo produktem získaným expresí prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk.
  34. 34. Způsob podle nároku 33, vyznačený tím, že MGDF má aminokyselinovou sekvenci obsahující 1-163 aminokyselin znázorněnou na obrázku 29.
  35. 35. Způsob podle nároku 33, vyznačený tím, že MGDF má aminokyselinovou sekvenci obsahující 1-332 aminokyselin znázorněnou na obrázku 29.
  36. 36. Způsob podle nároku 34, vyznačený tím, že MGDF je chemicky modifikovaný MGDF.
  37. 37. Způsob podle nároku 36, vyznačený tím, že chemicky modifikovaným MGDF je pegylovaný MGDF:
  38. 38. Způsob podle nároku 37, vyznačený tím, že pegylovaný MGDF je pegylovaný polyethylenglykolem.
  39. 39. Způsob podle nároku 38, vyznačený tím, že pegylovaný MGDF je monopegylovaný MGDF.
  40. 40. Způsob podle nároku 39, vyznačený tím, že pegylovaná skupina je navázaná na N-konec MGDF.
CZ19972912A 1995-03-31 1996-03-28 Farmaceutická kompozice obsahující protein a fosfolipid a způsob její přípravy CZ292788B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/414,161 US5874075A (en) 1993-10-06 1995-03-31 Stable protein: phospholipid compositions and methods

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ291297A3 CZ291297A3 (cs) 1999-02-17
CZ292788B6 true CZ292788B6 (cs) 2003-12-17

Family

ID=23640216

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19972912A CZ292788B6 (cs) 1995-03-31 1996-03-28 Farmaceutická kompozice obsahující protein a fosfolipid a způsob její přípravy

Country Status (24)

Country Link
US (1) US5874075A (cs)
EP (1) EP0817614B1 (cs)
JP (1) JP3856471B2 (cs)
KR (1) KR100228415B1 (cs)
CN (1) CN1241548C (cs)
AT (1) ATE222096T1 (cs)
BR (1) BR9607999A (cs)
CA (1) CA2215534C (cs)
CZ (1) CZ292788B6 (cs)
DE (1) DE69623003T2 (cs)
DK (1) DK0817614T3 (cs)
EA (1) EA000415B1 (cs)
ES (1) ES2177781T3 (cs)
HK (1) HK1006079A1 (cs)
HU (1) HU224691B1 (cs)
IL (1) IL117690A0 (cs)
NO (1) NO318235B1 (cs)
NZ (1) NZ306156A (cs)
PT (1) PT817614E (cs)
SK (1) SK283596B6 (cs)
TW (1) TW400236B (cs)
UA (1) UA62911C2 (cs)
WO (1) WO1996029989A1 (cs)
ZA (1) ZA962483B (cs)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6001968A (en) 1994-08-17 1999-12-14 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and compositions
US6429290B1 (en) 1994-08-17 2002-08-06 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and derivatives
KR100408229B1 (ko) * 1996-10-04 2003-12-01 암겐 인코포레이티드 Ｍｐｌ 리간드를 함유하는 제약학적 조성물
ATE271376T1 (de) * 1998-02-23 2004-08-15 Cilag Ag Int Liposomale erythropoietin-dispersion
SK287491B6 (sk) 1998-10-16 2010-11-08 Biogen Idec Ma Inc. Fúzne proteíny interferónu- beta-1a a ich použitie
EA004789B9 (ru) * 1998-10-16 2017-05-31 Байоджен, Инк. Полимерные конъюгаты бета-1а-интерферона и их использование
CA2380640A1 (en) * 1999-08-18 2001-02-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Hair-growing agent
ATE269716T1 (de) 2000-02-29 2004-07-15 Pfizer Prod Inc Stabilisierter granulozyten-kolonie- stimulierender faktor
US6416745B1 (en) * 2001-05-03 2002-07-09 Block Drug Company, Inc. Dental composition for treating hypersensitive teeth
US7173003B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US7214660B2 (en) * 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
WO2004099231A2 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
AU2003210564B2 (en) * 2002-01-18 2008-10-23 Biogen Ma Inc. Polyalkylene glycol with moiety for conjugating biologically active compound
US20060193905A1 (en) * 2002-05-14 2006-08-31 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Direct cellular energy delivery system
NZ542094A (en) * 2003-03-14 2008-12-24 Neose Technologies Inc Branched polymer conjugates comprising a peptide and water-soluble polymer chains
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
WO2006127896A2 (en) * 2005-05-25 2006-11-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor ix
ES2307009T3 (es) * 2003-04-15 2008-11-16 Opperbas Holding B.V. Composicion farmaceutica que contiene proteinas y/o polipeptidos y particulas coloidales.
WO2005012484A2 (en) * 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
US8633157B2 (en) * 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) * 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
CN101072789B (zh) * 2004-01-08 2013-05-15 生物种属学股份公司 肽的o-连接的糖基化
US20070081986A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-12 Shunji Tomatsu Beta-glucuronidase with an attached short peptide of acidic amino acids
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
EP1799249A2 (en) * 2004-09-10 2007-06-27 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
EP1814573B1 (en) * 2004-10-29 2016-03-09 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
CA2593682C (en) * 2005-01-10 2016-03-22 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
DE102005012457B3 (de) 2005-03-18 2006-08-31 Basf Coatings Ag Epoxid- und Silangruppen enthaltende Oligomere und Polymere, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
US9187546B2 (en) * 2005-04-08 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
KR100770704B1 (ko) 2005-08-04 2007-10-29 삼성전자주식회사 픽쳐 스킵 방법 및 장치
US20070105755A1 (en) * 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
JP2009544327A (ja) * 2006-07-21 2009-12-17 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｏ−結合型グリコシル化配列によるペプチドのグリコシル化
EP2054521A4 (en) * 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
AU2007319657B9 (en) * 2006-10-04 2019-10-31 Novo Nordisk A/S Glycerol linked pegylated sugars and glycopeptides
KR20150064246A (ko) * 2007-04-03 2015-06-10 바이오제너릭스 게엠베하 글리코페길화 ｇ―ｃｓｆ를 이용하는 치료 방법
EP2162535A4 (en) * 2007-06-04 2011-02-23 Novo Nordisk As O-linked glycosylation using N-acetylglucosamine transferases
ES2551123T3 (es) * 2007-06-12 2015-11-16 Ratiopharm Gmbh Proceso mejorado para la producción de azúcares de nucleótido
ES2476915T3 (es) 2007-08-27 2014-07-15 Ratiopharm Gmbh Formulación líquida de conjugado de G-CSF
US8207112B2 (en) * 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
US8101565B2 (en) 2007-09-20 2012-01-24 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Sustained release of Apo A-I mimetic peptides and methods of treatment
US8044021B2 (en) * 2007-09-20 2011-10-25 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Sustained release of apo A-I mimetic peptides and methods of treatment
US7985727B1 (en) 2007-09-20 2011-07-26 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Apo A-I mimetic peptides and methods of treatment
US9173890B2 (en) * 2007-09-20 2015-11-03 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Sustained release of Apo A-I mimetic peptides and methods of treatment
US7985728B1 (en) 2007-09-20 2011-07-26 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Sustained release of Apo A-I mimetic peptides and methods of treatment
US20100286067A1 (en) * 2008-01-08 2010-11-11 Biogenerix Ag Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases
CN101965200B (zh) 2008-02-27 2013-06-19 诺沃-诺迪斯克有限公司 缀合的因子ⅷ分子
DK2767546T3 (en) 2011-02-07 2019-02-04 Cerenis Therapeutics Holding Sa Lipoprotein complexes and their preparation and uses
US9364542B2 (en) 2011-10-28 2016-06-14 Excelse Bio, Inc. Protein formulations containing amino acids
WO2013129935A1 (en) 2012-02-27 2013-09-06 Epitarget As Use of a particulate immunomodulator in cancer therapy

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4515736A (en) * 1983-05-12 1985-05-07 The Regents Of The University Of California Method for encapsulating materials into liposomes
US4744989A (en) * 1984-02-08 1988-05-17 E. R. Squibb & Sons, Inc. Method of preparing liposomes and products produced thereby
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4810643A (en) * 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
EP0366770B1 (en) * 1988-05-16 1994-02-09 Vestar, Inc. Liposomes coupled to hormones
JPH0334920A (ja) * 1989-04-21 1991-02-14 Otsuka Pharmaceut Co Ltd リポソームに結合及至組合わされた生物活性化合物及びそれを含有する医薬
WO1991004019A1 (en) * 1989-09-12 1991-04-04 The Regents Of The University Of California Therapeutic peptides and proteins
JPH03127622A (ja) * 1989-10-09 1991-05-30 Green Cross Corp:The ｐＨ感受性リポソーム
US5225212A (en) * 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
JPH0482839A (ja) * 1990-07-20 1992-03-16 Green Cross Corp:The 蛋白質類・脂質小体複合体
JPH06247842A (ja) * 1993-02-23 1994-09-06 Green Cross Corp:The リポソーム組成物の製造方法
NZ274705A (en) * 1993-10-06 1997-12-19 Amgen Inc Globular protein within a lipid vesicle

Also Published As

Publication number Publication date
NO318235B1 (no) 2005-02-21
EA199700197A1 (ru) 1998-04-30
EA000415B1 (ru) 1999-06-24
HUP9801370A2 (hu) 1998-10-28
MX9707137A (es) 1997-11-29
SK283596B6 (sk) 2003-10-07
JPH11502851A (ja) 1999-03-09
CA2215534C (en) 2003-05-20
DE69623003T2 (de) 2003-03-27
ATE222096T1 (de) 2002-08-15
US5874075A (en) 1999-02-23
IL117690A0 (en) 1996-07-23
DE69623003D1 (de) 2002-09-19
EP0817614A1 (en) 1998-01-14
HU224691B1 (hu) 2005-12-28
EP0817614B1 (en) 2002-08-14
SK126097A3 (en) 1999-06-11
HUP9801370A3 (en) 2000-10-30
AU688678B2 (en) 1998-03-12
PT817614E (pt) 2002-12-31
KR100228415B1 (ko) 1999-11-01
NO974323L (no) 1997-11-28
NO974323D0 (no) 1997-09-19
CZ291297A3 (cs) 1999-02-17
BR9607999A (pt) 1998-06-23
HK1006079A1 (en) 1999-02-12
AU5434196A (en) 1996-10-16
CN1241548C (zh) 2006-02-15
CA2215534A1 (en) 1996-10-03
CN1150756A (zh) 1997-05-28
TW400236B (en) 2000-08-01
DK0817614T3 (da) 2002-10-07
ZA962483B (en) 1996-10-03
WO1996029989A1 (en) 1996-10-03
UA62911C2 (en) 2004-01-15
JP3856471B2 (ja) 2006-12-13
NZ306156A (en) 1999-02-25
ES2177781T3 (es) 2002-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ292788B6 (cs) Farmaceutická kompozice obsahující protein a fosfolipid a způsob její přípravy
US7074755B2 (en) Erythropoietin conjugate compounds with extended half-lives
CA1283046C (en) Tumor necrosis factor formulation
ES2365000T3 (es) Nuevas composiciones químicamente modificadas de proteína que estimulan eritropoyetina y métodos.
US5900402A (en) Method of reducing side effects associated with administration of oxygen-carrying proteins
CA2150939C (en) Stable protein: phospholipid compositions and methods
TW201138831A (en) Modified granulocyte colony stimulating factor (G-CSF)
AU688678C (en) Stable protein:phospholipid compositions and methods
MXPA97007137A (en) Stable protein compositions: fosfolipidos ymeto
JP2004501975A (ja) ケモカイン結合体

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20090328