TW400236B - Stable protein: phospholipid compositions and methods - Google Patents
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Description
經濟部中央楯準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（1 ) 發明背景 本發明是有關蛋白質：磷脂結構，其可用於穩定可轉化成 熔融球蛋白狀態之蛋白質二及三級結構。更特別地，本發 明是有關G-CSF:磷脂及MGDF:磷脂組成物，其具有增加 之穩定性，呈現増加之貯架期，且可用於高溫調和物及充 作新顆的遞送賦形劑。 許多蛋白質已示出可轉化成熔融狀之球蛋白狀況（MGS) Van der Goot, F. G., Nature 354· 408-410 (1991)。呈融熔 狀之蛋白質呈現二級結構，其可比得上天然蛋白質然而缺 乏剛性的三級結構。Pitsyn et al.，FEBS Letters 262:1. 20-24 (1990)。在某些例子，轉化成比狀沉係伴隨曝於蛋白質先前 潛藏之疏水性區域。經由嚴格疏水性殘基之曝露，可 爲蛋白質凝集及沉澱中之中間物。MGS之構型可由遠UV 區之圓二色性與芳族侧鏈之光譜比較（近UV圓二色性及勞 光）而測知。熔融狀球蛋白狀態在缺乏遠UV圓二色性變化 中呈現芳族光譜變化，Bychkova et al.，FEBS Letters 2M:231_234 (1988)，且可涉及某些蛋白質之膜滲透， Bychkova et al., FEBS Letters 238:231-234 (1988); Van der Goot, F.G. Nature 354. 408-410 (1991)。 已知粒性細胞集落刺激因子（g-csf)爲可在凝集前轉化 成MGS的一種蛋白質》人類重組體G-CSF可選擇性刺激嗜 中性球，一種用於對抗感染之白血球細胞。目.前， Filgrastim—種重組體G-CSF可應用於治療上。G-CSF在各 種狀況下之結構已被充份研究之Lu et al·，J. Biol. Chem, -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 打 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _________B7 五、發明説明（2 ) ' 一~
Vol· 1^1，8770-8777 (1992)。由於其疏水性特性，g_Csf 難以調和以延長貯架期。某些疏水性蛋白質在長期貯存下 可由於二聚體及更高級數之凝集數之形成（巨範園）而喪失 活性。其他化學變化，如脱胺化作用及氧化作用也可於辟 存時發生。此外，G-CSF調和者必須保護以免變性，且特 別是指望可維持蛋白質之二及三級結構之穩定性。 人類GM-CSF是一種22kDa糖蛋白，爲巨噬細胞及粒性 細胞先祖細胞試管内増殖所不斷需要的。其也可控制這些 先祖細胞不可逆之託付以形成粒性細胞及巨噬細胞。其他 的生物活性可包括調控成熟細胞型式之功能活性；G〇Ugh et al.，Nature，IQiU 763-767 (1984)，並增加對已確認化學吸引 劑之趨化性；Williams et al_, Hematology, 4th ed. (1990) 〇 GM-CSF也可刺激單核細胞之產生，且因此可用於治療單核 球疾病，如單核球過少症。 人類G Μ · C S F可由許多來源獲得及純化。重組體人類 GM-CSF 之產製步驟先前已由 Burgess et al., Blood，69:1. 43-51 (1987))描述。美國專利案5,〇47,5〇4(Boone)在此列爲 參考，已可產製呈未糖基化型式之GM-CSF且爲商品化规 模之含量’並爲原核動物宿主細胞表現之產物。 M G D F，或巨核細胞生長及分化因子爲近來選殖的細胞 動素，其似乎是循環血小板層次之主要調控物。見Bartley， T.D. et al., Cell 77:1117-1124 (1994); Lok, S, et al., Nature 369:565-568 (1994); de Sauvage，F.J. et al·，Nature 369:533-538 (1994); Miyazake, H. et al.? Exp. Hematol. 22.:838 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局舅工消費合作社印製 A7 _B7__ 五、發明説明（3 ) (1994); and Kuter, D. J. et al.? DNAS USA, 91:11104-11108 (1994)。MGDF也稱之爲促血栓生成素（TPO)，mpl-配體及 促巨細胞生成素。成熟的人類MGDF爲共有332個胺基酸 之蛋白質。此蛋白質之序列及相當的cDN A示於此中圖29 由中國倉鼠卵（CHO)及大腸捍菌細胞產生之重组體 MGDF已証明於老鼠、大鼠及猴子之活體内有特異刺激或 增加巨核細胞及/或血小板之生物活性。見如H u n t，P . e t al·，Blood 84_( 1 0 ) : 3 9 0 A ( 1 9 9 4 ” 人類 M G D F 分子已被 截斷，故延長至少151個胺基酸，由圖29中胺基酸1位置開 始，於活體内保有生物活性。也可將人類序列M G D F蛋白 質Ν -末端前6個胺基酸移去且仍保有生物活性。因此，生 物活性似乎保留在圖29所示人類MGDF或熟胺基酸序列的 7-151 (包括二者）胺基酸之内。 自然生成的MGDF爲一種糖基化的分子。天然MGDF之 糖基化作用型式和見於MGDF的二個關鑑性區域有關。人 類ΜGDF前面約1 5 1胺基酸序列，相當於分子之活性部份 ，與促紅血球生成素（ΕΡΟ)有顯著的同質性，其爲一種可 刺激紅血球產製之細胞動素，且稱之爲人類M G D F之”類一 ΕΡΟ"區域《成熟蛋白質之其餘胺基酸組成所謂的„Ν_键結 之碳水化合物"區域，因爲若非全部其也包括了 Ν -鏈結糖基 化作用的大部份位置。於人類MGDF中，有6個與Ν-鏈結 之糖基化作用位置，均含於N -鏈結之糖基化作用區域中。 二區域内均含有〇 -鏈綽之糖基化作用位置。據估計在分子 -6 - $氏張ϋ適财關家標準（CNS) A4規格（21G x 297公慶） -—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
A7 B7 五、發明説明（4 ) 中有12 14個〇 -鏈結之糖基化作用鏈。以人類 DNA重組表現於CHO細胞之實驗証據顯示，於類一 Ep〇區 域中至少有二個〇_鏈結的位置被糖基化，於1(8^)及37 (Thr)位置。 雖然蛋白質如G-CSF及MGDF可在某些明確條件下穩定 ，但仍有必要由穩定蛋白質之二及三級結構而延長這些及 其他蛋白質之貯架期。過去這些蛋白質曾嘴試的—個方式 是使用脂質體。脂質體爲完全密閉的脂雙層，由水不溶性 之極性脂質所形成，特別是磷脂類。脂質體小囊可有單膜 之雙層（單層的）或可有多膜之雙層（多層的）。雙層是由具 親水性（極性）”頭"區及疏水性（非極性），，尾”區之二個脂質 單層所組成，其中疏水性尾部之方向對著雙層之中心，而 親水性頭部面對著水相。脂質體之穩定性，剛性，及滲透 力可變化磷脂組成，變化溫度，包括有固醇或納入荷電之 親兩性物而改變之。脂質體的基本結構可由技藝中已知之 各種技術製成。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ----------— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於其形成脂質體之過程中，在水道内可截入水性溶質並 以各種速率釋放。一旦發現脂質體可將酵素引入細胞内且 改變其代謝（Gregoriadis，New Engl. J. Med. 295. 704-710, 705-770 (1976))，脂質體可預知爲探求標的藥物遞送之解答 。結果，在藥物工業中有許多的發展研究，其中涉及使用 脂質體爲缓釋之貯存所供隱避於腊質體疏水性層或疏水性 核心内之藥物，維生素及蛋白質之用。 脂質體充作藥物載劑之成功使用有所限制，因爲研究者 -7- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（5) 在嚐試此用途上遭遇到許多間題。如，已知脂質體可作爲 有用的免疫佐物以截陷抗原，且當酵素或其他異種源之蛋 白質截陷在脂質體時應小心運作。同時藥物的擴散速率十 分難以控制。此爲脂質體固有不穩定性之函數關係，且某 些血液組价之存在可有助某些藥物之擴散。此外，由於其 本質，某些物質不易截陷在脂質體内且因此可快速擴散於 循環中。最後，對於對準肝或脾以外的任何細胞或器官此 中仍有問題存在。關於脂質體，可納入脂質體内之物質之 極佳總覽，及與脂質體充作藥物載劑使用有關之間題，可 見於 Gregory Gregoriaidis的."Liposomes"，於Drug Carriers in Biolgy and Medicine, Chapter 14, 287-341 (Academic Press, N.Y., 1979)。 雖然關於脂質體充作藥物載劑已有許多報告，但基於由 穩定肽及/或蛋白質之結構而增加治療性肽或蛋白質之貯架 期之目的而使用脂質體方面則少有揭示。於 PCT/US90/05 163，標題爲"Therapeutic Peptides and Proteins"中，Hostetler等人揭示使用空脂質體爲藥學上可 接受之稀釋劑來溶解多肽及/或蛋白質，以避免多肽及/或 蛋白質在空氣/水界面之累積，及避免多肽及/或蛋白質吸 附在容器表面。Hostetler等人揭示負電荷之蹲脂可加入達約 5 0莫耳百分率，且磷脂醯膽鹼（一種中性磷脂）爲較佳的脂 質體。Hostetler等人並未揭示可穩定多肽及/或蛋白質結構 之稀釋劑。 於 PCT/US91/07694 ，標題爲"Preparation and 本紙張尺度適用中國國家標準(~cNsTa4W ( 21 OX 297公釐） -{-In n^i an n>— HBl 1^1 ^^1? m I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 #丨丨lit· A7 B7 五、發明説明（6).
Characterization of Liposomal Formulations of Tumor Necrosis Factor"中，Hung等人描述一種親脂性經修飾之腫 瘤壞死因子（TNF)分子，並加上表面或包膠在脂質體内。 據報告脂質體親脂性TN F分子具有加強的活體内穩定性。 所謂穩定性是指TNF—脂質體將TNF洩漏至活體内系統有 所減低或有減低之傾向。較佳的脂質體是中性脂質。Hung 等人並未揭tt^TNF組成物’其中賦形劑對於蛋白質結構有 穩定作用》 關於蛋白質，如G-CSF或MGDF與負電荷之脂質小囊接 觸之文獻t無法結論出什麼，由是直接穩定蛋白質使拮抗 熱謗導之凝集作用，變性作用，活性喪失及二級結構之伸 展6關於此組成物是有存在之必要，其對於在調和步驟中 需高溫之狀況（如G-CSF及/或MGDF納入聚合物）是有益的 ’以及可充作新穎的遞送載劑（如聚乙二醇化之g_csf之口 服）。本發明則是提出此種組成物。 發明要點 本發明是有關添加疏水性賦形劑，如溶血磷脂或其他脂 質體，至融熔球蛋白狀況下之蛋白質令，可直接穩定蛋白 質之二及三級結構，由是保護蛋白質拮抗熱誘生之凝集作 用，變性及活性喪失。特言之，本發明是有關穩定的G_ CSF:磷脂及MGDF:磷脂組成物。令人驚訝地，較佳的〇_ CSF··磷脂&MDGF:磷脂組成物可在i〇_9”c間循環數次 ，並於一旦冷卻時可完全恢復蛋白質之二級結構。組成物 可用於需高溫之調和步驟中，〃及可充作新穎的遞送溶媒 - 9- 本紙Ik尺度適用中國國家標準（cm ) ，二; ------ HMH 0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 __ B7 ------------------- 五、發明説明（7 ) 。此外，與蛋白質單獨時比較，组成物呈現延長之貯架期 ，且蛋白質與磷脂小囊之交互作用可避免蛋白質吸附在玻 璃小瓶上。 於一個較佳的具體實例，蛋白質：嶙脂複合物包括有負電 荷之脂質體，其選自： 二油醯基磷脂醯基甘油（DOPG)， 二肉.豆蔬醯基磷脂醯基甘油（DMPG)， 二棕櫚醯棊磷脂醯基甘油（DPPG)， 卵鱗脂醯基甘油， 二油醯基磷脂醯基乙醇胺（DOPE)， 卵磷脂醯基乙醇胺， 二油醯基鱗脂酸（DOPA)， 二肉豆蔻醯基嶙脂酸（DMPA)， 二棕搁醯基磷脂酸（DPPA)， 二油醯基磷脂醯基弱胺酸（DOPS)， 二肉豆寇醯基磷脂醯基弱胺酸（DMPS)， 二棕櫚醯基磷脂醯基弱胺酸（DPPS)， 卵磷脂醯基弱胺酸， 溶血磷脂醯基甘油， 溶血磷脂醯基乙醇胺， 溶血磷脂醯基弱胺酸， DDPG，負電荷之不飽和嶙脂爲尤佳者。本發明進—步包 括維持在3.0-7.5範園内之pH，及至少ι〇:1之脂質：蛋白質 比例。 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X：297公釐） (請先閱讀背面之注意事if再填寫本買〕
A7 B7 經濟部十央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（8 ) 可提供本發明較佳具體實例的額外要件包括使用在蛋白 質.嶙如複θ物中經化學修飾之蛋白質，以及使用下列一者 以上：等滲性之調節劑；缓衝物質；pH調節劑。精藝者應 了解’本發明包括有這些額外要件各種组合的穩定的蛋白 質：磷脂組成物。 附圖説明 圖1市出在DOPG+囊存在（曲線1)及不存在下（曲線2)， rhG-CSF之螢光發射光譜。rhGCSF之濃度爲〇 2毫克，毫 升。DOPG:rhG-CSF比例（曲線1)爲ι〇〇:ι(莫耳：莫耳）。 圖2 τκ出増加脂質二蛋白質比例對MrhG_CsF螢光上之 影響° 爲最初之螢光（無脂質），且ρ指加入脂質後以達成 脂質：rhG-CSF所示莫耳濃度比例後之螢光。圖2(a)示出 F/F〇(_)&DOPG:rhG-CSF混合物最大發射波長（△) /圖 2(b)示出D〇PC:rhG-CSF之F/F0(_)及最大發射波長（△) 圖3示出/無（·）及有（〇)I)OPG小囊胞以κι中止rhG_ C S F螢光之stern-Volmer作圖。中止實驗加入一份ΚΙ至 rhG-CSF (0.2 毫克 / 毫并）及 DOPG:rhG-CSF (100:1 莫
耳濃度）而進行D 圖4示出一旦加入芘癸酸時，rhG-CSF色胺酸螢光之中 止。發射波長爲327毫微米。DOPG:rhG-CSF比例爲 100:1(莫耳濃度）〇 圖5示出於各種脂質無及有存在下，rhG-CSF F強度變 化之比較。於各例中，脂質：蛋白質比例爲1 0 0 : 1 (莫耳濃度 11- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1.;~~II9衣II (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂·
A7 ___ B7_ 五、發明説明（9 ) ” 圖6示出於各種脂質無及有存在下，rhG-CSF最大發射 下之位移比較。在各例中，脂質：蛋白質比例爲1 〇〇 : 1 (莫耳 濃度）。 圖7示出DMPC(曲線2)，DMPG(曲線3)及DMPA(曲線 4)在rhG-CSF CD上（曲線1)之影響。在各例中，脂質：蛋 白質比例爲50:1(莫耳濃度）於水，pH 6.0。 圖8示出增加溫度在rhG-CSF(曲線1)或DO PG:rhG-CSF (140:1莫耳濃度）（曲線2)CD上之影響。rhG-CSF濃 度爲8〇微克/毫升於水，pH 6.0。溫度以l〇〇aC/小時之速 率由10-90°C掃描。 圖 9 示出對於 rhG-CSF(曲線 1)及 DOPG:rhG-CSF(45:l 莫耳濃度）（曲線2)之差別掃描量熱溫度記綠圖樣品中 rhG-CSF濃度爲1毫克/毫升η 7.0於水）。掃描速率爲 9 0 eC /小時。 圖10示出溫度循環在rhG-CSF(曲線1)及DOPG:rhG-CSF(140: 1莫耳濃度）（曲線2)cd上之影響。樣品快速加 熱至956C，並如箭頭所示冷卻至10-C β樣品中rhG_cSF濃 度爲80微克/毫升，pjj 6.0。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閣讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖1 1示出溫度循環在！*hG-CSF(曲線1 )及DMPG:rhG-CSF (150:1莫耳濃度）（曲線2)上之影響。樣品加熱至95 6C並冷卻至i〇°C。樣品中rhG-CSF濃度爲80微克/毫升， pH 6.0。 圖12示出溫度循環，rhG_CSF(;曲線1)及DMPG:ΓhG- -12- 本S^iiϊ^ϊϊiSίT^T^S~ΰiό^^i^ ' 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（10 ) CSF ( 1 5〇_· 1莫耳濃度）（曲線2)上之影響。樣品加熱至95 〇並冷卻至10°C。樣品中rhG-CSF濃度爲80微克/毫升， pH 6.0 〇 圖13示出各種脂質在冷凍乾燥中穩定rhG_cSF之能力。 在各例中，脂質：蛋白質比例爲i 〇 0 : i。穩定性以在骨髓分 析中之試管内活性之保留爲依據。單獨的rhG_CSF無法在 冷乘乾燥過程中存活，如此所採用之對照組爲在脂質不存 在下之未經處理的rhG-CSF。 圖14示出各種脂質▲rhG.csF活體内活性上之影響。在 皮下注射倉鼠後偵測活性（W BC數）。rh G-C S F劑量爲1 00 微克/公斤，有1 〇 〇 : 1之脂質：蛋白質比例。 圖15示出各種脂質.rhG-CSF活體内活性上之影響。於 皮下注射倉鼠後偵測活性（WBC數）。rhG-CSF劑量爲100 微克/公斤，有5 0 : 1脂質：蛋白質比例。 圖16示出於變化pH下於DOPG無及有中CHO-G-CSF對 於F強度變化之比較。於各例中，脂質：蛋白質比例爲 100:1(莫耳濃度）。 圖17示出在變化pH下於DOPG無及有中，CHO-G-CSF 最大發射下位移之比較。在各例中，脂質：蛋白質比例爲 100:1(莫耳濃度）。 圖 18示出溫度循環在PEG-G-CSF(-)&DMPG:PEG-G-CSF (17:1莫耳濃度）（- —-)CD上之影響。樣品加熱至90 °0並冷卻至i〇°C。 圖19示出：（a)溫度循環對於GM-CSF於PBS，pH 7.0之 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐) ^ ； 0-IT (讀先k讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ___^_B7 五、發明説明（η ) CD中之影響。比較在i〇°C下之GM-CSF(-)與加熱至90 °C再冷卻至1〇 °C之GM-CSF( ——）；（b)溫度循環在 DPPG:PEG-G-CSF (17:1莫耳濃度）CD上之影響。比較 在10°C下之DPPG:GM-CSF( — )與加熱至90°C再冷卻至 10〇C 之DPPG:GM-CSF(…）。 圖20示出：（a)在DOPG無及有存在下，rhG-CSF十二指 腸内輸注對總WBC反應之結果》rhG-CSF劑量爲750微克 /公斤，且脂質：蛋白質比例爲1 0 〇 : 1 ; ( b )於D Ο P G無及有 存在下，PEG-G-CSF十二指腸内輸注對總WBC反應之結 果。PEG-G-CSF劑量爲750微克/公斤，且脂質：蛋白質比 例爲1 0 0 : 1。 圖21示出於十二指腸内泵注後，DOPG在PEG-G-CSF 血清水平上之影響。PEG-G-CSF劑量爲750微克/公斤， 且脂質：蛋白質比例爲100:1。 圖22示出於DMPG小囊有及無下，MGDF螢光發射光譜 。MGDF之濃度爲0.1毫克/毫升。MGDF爲大腸桿菌衍生 之MGDF 1-163 °DMPG:MGDF 比例爲 100:1(莫耳：莫耳 )° 圖23示出增加脂質：蛋白質比例對MGDF螢光之影響》 MGDF爲大腸桿菌衍生之MGDF 1-163。示出在pH 5.0 (-Ο-)及pH 7.0 (-0-)下，DMPG:MGDF混合物之最大發 射波長。 圖24示出在DMPG小囊無（〇）及有（·）下，以KI中止 MGDF螢光之Stern-Volmer作圖。MGDF爲大腸桿菌衍生之 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ΓΑ4规格（210X297公釐) ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（12). MGDF 1-163。中止實驗之進行係加一份κι至MDGF(0.1 毫克/毫升）及DMPG:MGDF(l〇〇:i莫耳濃度）。 圖25示出溫度循環在MGDF(〇)及DMPG:MGDF (100:1莫耳濃度）（^)CD上之影響。MGDF爲大腸桿菌衍 生之MGDF 1-163。留下的螺旋度0/〇係指於各循環後在1〇 Ό下測及之C D量（一個循環：樣品快速加熱至9 5 °C再冷卻至 io°c)。 圖26示出於尿素各種濃度存在下，MGDF (土 DMPG)變 性之程度。示出MGDF(-〇-)及DMPG:MGDF(-#-)之圓 二色性MRE，以及MGDF(-o-)及 DMPG:MGDF(-·-)螢 光發射最大値。MGDF爲大腸样菌衍生之MGDF 1-16 3。 DMPG:MGDF比例爲1〇〇:1(莫耳：莫耳）。 圖 27 示出 MGDF(土 DMPG)及 PEG-MGDF(土 DMPG) 之最大螢光發射。MGDF爲大腸桿菌衍生之MGDF 1-16 3 ，且PEG-MGDF爲單聚乙二醇化之大腸桿菌衍生之mgDF 1-163。DMPG:MGDF 與 DMPG:PEG-MGDF 比例爲 100:1(莫耳：莫耳）。 圖28示出在各種PEG-MGDF濃度下，PEG-MGDF (土 DMPG)吸附至玻璃小瓶上之程度。MGDF爲大腸桿菌衍生 之MGDF 1-163，且PEG-MGDF是單聚乙二醇化之大腸 样菌衍生之MGDF 1-163。在於室溫下培育18小時後之玻 璃小瓶内計數可回收之經放射標記之M G D F含量，可分析 PEG-MGDF(-o-)及DMPG:PEG-MGDF(-〇-)之回收率 % 〇 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 ip A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（13 ) 圖29示出人類MGDF之DNA及胺基酸序列（SEQ ID N〇s:l及2)。包括訊號肽（胺基酸-21至-1)及成熟的胺基 酸序列（1-332)。 圖30示出在Ν -末端殘基之泛-胺基上位置一特異的 MGDF還原性烷化作用之實例，利用單一甲氧基一聚乙二 醇醛生成實質上單聚乙二醇化之產物。 圖31示出於正常老鼠中之DMPG:MGDF及DMPG: PEG-MGDF之活體内活性，以血小板計數計。MGDF爲大 腸捍菌衍生；MGDF 1-163，且PEG-MGDF爲單-聚乙二 醇化之大腸样菌衍生之MGDF 1-163 e_DMPG:MGDF及 DMPG:PEG-MGDF劑量爲1〇〇微克/公斤及3〇〇微克/公斤 ，且脂質：蛋白質比例爲1 〇 〇 : i。 詳細説明 本發明組成物詳述於下文討論申，且由以下之實例説明 ’示出之實例爲本發明的各方面，且包括各種蛋白質：嶙脂 組成物穩定性及生物活性試驗的結果。令人驚訝的，蛋白 質與脂質小囊之交互作用可直接穩定蛋白質之結構，由是 即使在無脂質下造成蛋白質變姓之條件下也可在蛋白質上 呈現穩定作用。 此中也描述口服經化學修飾tG_CSF:嶙脂組成物，利用 G-CSF(如上述）其中則已粘附有聚乙二醇。 於本發明實行中企圖使用的是可轉化成融料蛋白狀錢 的各種蛋白質。意欲示範的蛋白質爲細胞動素，包括各種 造血因子，如上述的G_CSF，〇Μ__，MeDF，m_ -16- 本紙張尺度適用中國國家檩準（CNS ) M規棒（2丨〇><297公翁） 看I (諸先閱讀背面之注意Ϋ項再填寫本頁) 訂 —ml.
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（]4 CSF’干擾素（£" ’点及"，間白素(1-11)，促紅血球生 成素（EPO)，纖維母細胞生長因子，幹細胞因子，神經生 長因子BDNF，NT3，血小板衍生之生長因子，及腫瘤 生長因子（π，点）。其他蛋白質可評估其轉化成皿〇!§之能 力。若对論中之蛋白質可轉化成]^(}8，討論中之蛋白質可 與負電荷之脂質體小囊接觸並評估穩定作用。 一般而言，用於實行本發明之G_CSF可以是自哺乳動物 有機體中以純型式分離之天然型式，或另外可爲化學合成 步驟之產物，或由基因體或cDNA選殖或經基因合成所得 之異種DNA序列之原核或眞核宿主表現之產物。適合的原 核動物宿主包括各種細菌（如大腸桿菌）細胞。適合的眞核 動物宿主包括酵母（如穰酒酵母）及哺乳動物細胞（如中國倉 鼠卵，猴子）細胞。依據所應用之宿主，G-CSF表現產物可 以哺乳動物或其他眞核細胞碳水化合物所糖基化，或也可 不被糖基化。本發明包括使用任一及所有此型式之G-CSF ，然而以重組體G-CSF，尤其是由大腸桿菌衍生的就最大 商業實行性理由而言爲較佳的。 欲化學修飾以應用於本發明之G-CSF也可爲天然的人類 G-CSF(nhG-CSF)或重組核酸過程之產物，如原核或眞核 宿主細胞表現。一般而言，化學修飾意指將化學部份粒附 至G-CSF分子本身。描述蛋白質修飾及融合蛋白質之總覽 文拿可見：Francis, Focus on Grounth Factors 3_:4-l〇. (May 1992)(由 Mediscript，Mountview Court，Friern Barnet Lane, London N20 OLD, υκφ 版）。如，見EP 0 401 384,標題爲 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ____B7 五、發明説明（15 ) "Chemically Modified Granulocyte Colony Stimulating Factor"其中描述G-CSF之製備材科及方法，並粘附有聚乙 二醇分子。粘附作用可以經由键結，直接至蛋白質或至一 部份其充作橋接至活性作用物上。共價键結爲粘附最穩定 之方式。化學修飾可提供G-CSF受控的，持續的或延長的 作用。此點之作用如可控制經化學修飾之G _ c S F達到循環 之時間。化學修飾劑的一個實例爲聚乙二醇组成物，包括 其衍生物。 於本發明實行時可使用的有任何經化學修飾之G_CSF製 劑，其一旦投藥即具效力。效力可以已知方法決定，由精 藝者決定。以聚乙二醇化之G-CSF，尤其是聚乙二醇化之 大腸桿菌衍生之G-CSF，且特別是參-肆聚乙二醇化之大腸 捍菌衍生之G-CSF爲較佳。 據報告Ο-CSF在酸性條件下最爲穩定，估不論在25_ 5.0 pH範圍下會發生構型之變化，其中涉及三級結構之變 黎散及增加汉螺旋含量。Narhi et al·, J. Protein Chem. 10^ 359-367，（1991)。此構型的變化爲融熔狀球蛋白狀況 (MGS)之特色。因此，關於調和者以可轉化成MGS之其他 蛋白質來進行時，以G-CSF進行之調和者應保護蛋白質使 免於二及三級結構由熱謗生之伸展以避免凝集及變性。 用於本發明之GM-CSF可爲由哺乳動物有機體以純型式 分離之天然型式，或爲由基因體或cDN A選殖或經基因分 析所得之異種DNA序列之原核或眞核宿主表現產物。適合 的原核宿主包括各種細菌（如大腸桿菌）細胞。適合的眞核 -18- 本紙張从關家樣準（CNS ) A4規格（21Gx297公羡） " (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) I、玎-----1¾--! A7 B7 五、發明説明（】6 細胞宿主包括酵母（如釀酒酵母）及哺乳動物（如中國倉鼠卵 ’猴子）細胞。依據所應用之宿主，GM-CSF表現產物可以 哺乳動物或其他眞核碳水化合物糖基化，或其也可未糖基 化。本發明意欲包括任一及所有此型GM-CSF之使用，然 而基於最大商業實行性理由以重組體GM-CSF，尤其是由 大腸桿菌衍生的爲較佳。 所謂的"MGDF”，如此中所用的包括自然生成的MGDF， 自然生成的MGDF之截斷型，以及具有自然生成MGDF胺 基酸序列及足以複製之糖基化作用之非自然生成的多肽， 使可具有特異刺激巨核細胞及/或血小板生長，發展及/或 產製之生物活性。 於較佳的具體實例中，MGDF爲已被轉感至眞核或、原核 宿主細胞内之異種DN A序列之表現產物，即在較佳的具體 實例中MGDF爲"重組體MGDF”。較佳的眞核細胞是哺乳 動物’特佳爲C Η Ο細胞，且較佳的原核宿主爲細菌，特別 是大腸捍菌。重组體MGDF可依此中所述的步驟有益地產 製，且可依此中所示關於MGDF選殖及表現之文獻進行。 某些額外較佳的MGDF分子，具有以下的胺基酸序列， 以依圖2 9爲準： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 MGDF 1-332 MGDF 1-19 1 MGDF 1-183 MGDF 1-174 MGDF 1-163 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖29之胺基酸1-332 圖29之胺基酸1-191 圖29之胺基酸1-183 圖29之胺基酸1-174 圖29之胺基酸1 -1 63 19- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） A7 B7 五、發明説明（17) MGDF 1-153 圖29之胺基酸1-153 MGDF 1-152 圖29之胺基酸1-1 52 MGDF 1-15 1 圖29之胺基酸1-1 5 1 MGDF 7-332 圖29之胺基酸7-332 MGDF 7-191 圖29之胺基酸7-1 9 1 MGDF 7-183 圖29之胺基酸7-1 83 MGDF 7-174 圖29之胺基酸7-174 MGDF 7-163 圖29之胺基酸7- 1 63 MGDF 7-153 圖29之胺基酸7-1 53 MGDF 7-152 圖29之胺基酸7-152 MGDF 7-151 圖29之胺基酸7-1 5 1 (請先閾讀背面之注意事3¾再缜寫本頁j 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 在上例中，Met-Lys可進一步包括在其N-末端内》 本發明也可使用的是MGDF的各種同系物。如此中所用 的"MGDF同系物"係指在MGDF胺基酸序列中有—個以上 變化之MGDF，其造成型式（N-或〇-鏈結的），數目或供碳 水化合物粘附之位置所在之變化。M G D F同系物保有至少 和天然序列MGDF相當的生物活性（如人類MGDF)，且可 能具有實質上更高的活性，此係在生物活性分析中測知的 。所造成之同系物可有較少或更多（較好是更多）於天然人 類/重組體M G D F之碳水化合物鏈。 也包括在本發明同系物内的是具有自MGDF羰基末端伸 展一個以上胺基酸之同系物，其中羧基末端之伸展可提供 至少一個額外的碳水化合物位置。MGDF之羧基末端可依 所使用MGDF之特殊型式而變化（如MGDF 1-332胺基酸 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210父297公羞)’ .1、玎------mII丨—idI-1 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（u) ，或MG DF 1-163胺基酸）。額外的碳水化合物位置可由 胺基酸加至羧基末端而加至MGDF上，此胺基酸含有一個 以上的N _或Ο -鏈結之糖基化作用位置。 本發明也可廣泛地包括經化學修飾之MGDF組成物。一 般而言，意欲化學修飾的是MGDF產物，其中該MGDF蛋 白質鏈結至至少一個聚乙二醇分子上（即聚乙二醇化之 MGDF)。MGDF之聚乙二醇化作用可由技藝中已知的任一 聚乙二醇化反應來進行。如見：F〇cus on Growth Factors 1(2):4-10 (1992) ; EP 0 154 316; EP 0 401 384 ;及和聚乙二 醇化作用有關的此中所示其他文獻。較好聚乙二醇係經由 反應性聚乙二醇之醯化作用反應或烷化作用反應來進行（或 是利用類似的反應性水溶性聚合物）。 經由醯化作用之聚乙二醇化作用通常涉及聚乙二醇 (PEG)之活性酯衍生物與MGDF蛋白質之反應。任何已知 的或接下來發現的反應性PEG分子均可用來進行MGDF之 聚乙二醇化作用。較佳的活化P E G酯是P E G酯化成N -羥基 琥珀醯亞胺（"NHS")。如此中所用的"醯化作用"包括下列 型式但不限於此，如MGD F及水溶性聚合物間之鏈結，如 PEG:醯胺，胺基甲酸酯，胺基甲酸乙酯等〇見 Bioconjugate Chem· 1:133-140 (1994)。反應條件可自聚乙二 醇化作用技藝十已知之任一者或接下來發展的中間加以選 擇，但應避免會使欲修飾之MGDF失去活性之溫度，溶劑 ，及ρ Η値。 經由醯化作用之聚乙二醇化作用通常會造成聚-聚乙二醇 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、τ
A7 __.__B7 ___ 五、發明説明i： W ) 化之MGDF產物，其中賴胺酸之一胺基經由醢基鏈結基而 聚乙二醇化。較好，連接之鍵結是醯胺。也較妤，生成的 產物是實質上僅（如言95%)單一、二或三-聚乙二醇化。然 而，有較高度聚乙二醇化的某些種類（多至MGDF賴胺酸之 一胺基之最大數目加上在MGDF胺基末端處的一個胺基 )通常其形成量依所使用之特異反應條件而定。若欲求時， 可自混合物中分離出較純化之聚乙二醇種類，特別是未反 應的種類，利用標準純化技術進行，包括透析，鹽析，超 速過濾，離子交換層析，凝膠過濾層析及電泳。 經由燒化作用之聚乙二醇化作用通常涉及將peg之末端 醛衍生物與蛋白質反應，如MGDF，並在還原劑存在下進 行。經烷化作用之聚乙二醇化作用也會造成聚-聚乙二醇化 之MGDF。此外，吾等可操作此中所述之反應條件以利聚 乙二醇化作用僅在MGDF N-末端之π ·胺基上（即單-聚乙 二醇化種類）。與MGDF進行之還原性烷化作用反應生成單 聚乙二醇化產物之實例示於圖30中。在單聚乙二醇或聚聚 乙二醇化作用之任一例子中，PEG基較好經由_cH2-NH-基粘附至蛋白質上。特別參照-C Η2-基，此型式之鏈結在 此稱爲”烷基"鏈結。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經由還原性烷化作用產生單聚乙二醇化產物之衍生化作 用係利用於MGDF衍生化作用中可運用之一級胺基（賴胺酸 對N-末端）不同型式之差別反應性。反應進行之pH値（見下 )使吾等可利用賴胺酸殘基之ε -胺基及蛋白質N—末端殘基 沈-胺基間之pKa差異。經由此選擇性衍生化作用，將含有 -22 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) 規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ______B7 五、發明説明（2〇 ) 反應性基團如骚之水溶性聚合物枯附至蛋白質於是可被控 制：聚合物之共軛作用主要發生在蛋白質tN-末端，且其他 反應性基團並無顯著的修飾作用，如賴胺酸制鏈胺基。 因此’在較佳方面，本發明是有關聚乙二醇化之MGDF ’其中P E G基圏經由醯基或烷基粘附。如上文所討論的， 此種產物可被單-聚乙二醇化或聚-聚乙二醇化（如含有2_6 ’較好2-5個PEG基）。PEG基通常粘附至胺基酸之或ε 胺基上，但PEG也可粘附至與蛋白質有所粘附的任何胺基 上’其具足夠反應性而可在適合的反應條件下粒附至peg 基上。 於醯化作用及烷化作用方式中可使用的聚合物分子可自 水溶性聚合物或其混合物中選擇。所選擇之聚合物應具水 溶性如此其所枯附之蛋白質才不會於水性環境中沉澱，如 生理環境下。經選擇之聚合物應予以修飾以具單一的反應 基，如供醯化作用之活性酯或供烷化作用之醛，較好，聚 合作用可如本發明所提供的予以控制。較佳的反應性peg 越是聚乙二醇丙醛，其是水溶性的，或其單燒氧基 或芳氧基衍生物（見美國專利案5,252,714)。聚合物可以是 分支的或未分支的。較好基於終產物製劑之治療用途，聚 合物是蘖學上可接受的。水溶性聚合物可自下列中選擇， 如聚乙二醇，單甲氧基-聚乙二醇，右旋糖，聚（N_乙缔基 吡咯啶酮）聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚氧化丙缔/氧化乙 燒共聚物，聚氧乙缔化之多元醇（如甘油）及聚乙烯醇。於 酿化作用反應’所選擇之聚合物應有單一反應性酿基。闕 -23 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2i〇X297公釐） 」 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標率局員工消費合作社印製 A7 _____B7___ 五、發明説明（21 ) 於本還原性烷化作用，所選擇之聚合物應有一個單一的反 應性醛基。通常，水溶性聚合物不自自然生成之葡糖基殘 基中選擇，因爲其由哺乳動物重組體表現系統可更合宜地 製備。聚合物可具任何的分子量，且可爲分支的或未分支 的0 此t所用的特佳的水溶性聚合物爲聚乙二醇，縮寫成 PEG。如此中所用的聚乙二醇包括peg任一型式，其已被 用於衍生化其他蛋白質，如單_(C1-CIO)烷氧基或芳氧基_ 聚乙二醇。製備聚乙二醇化MGDF之方法通常包括以下步 驟：（a)將MGDF多肽與聚乙二醇反應（如PEG之反應性酯或 醛衍生物）在條件下使MGDF可粘附至一個以上的PEG基團 上，及（b)獲得反應產物。一般而言，醯化作用反應之最佳 反應條件，可依據已知變數及欲求的結果一比例決定。如 ，PEG:蛋白質之比例愈大，聚—聚乙二醇化產物之百分率 愈高。 另一重要的考量是聚合物之分子量。一般而言，聚合物 之分子量愈高，可粘附至蛋白質之聚合物分子數愈少。類 似地’當欲使變數更臻完善時應考慮聚合物之分支狀況。 通常，分子量愈大（或分支愈多）則聚合物：蛋白質比例愈高 。一艇而舌，如此中之聚乙二醇化反應，較佳的平均分子 量爲約2 kDa至約1〇〇 kDa(，，约，，表示土 1 kDa)。較佳的 平均分子量爲約5 kDa至約50 kDa，特佳的爲約12. kDa 至約25 kDa，且更好是約20 kDa。水溶性聚合物對 MGDF蛋白質之比例通常在1:1至1〇〇:1範園内，較好（於 -24- 本紙張尺度適用中國國) A4規格（210x297公釐]-—- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明说明（22), 聚聚乙二醇化作用）1:1至20:1及（對單聚乙二醇化作用 )1 : 1 至 5 : 1。 利用上示之條件。可提供還原性燒化作用以選擇性粘附 聚合物至在胺基末端具有沈-胺基之任何MGDF蛋白質，且 提供實質上均質的單聚合物/MGDF蛋白質共軛物之製劑。 此中所謂的”單聚合物/ MGDF蛋白質共軛物，，表示含有單_ 聚合物分子粘附至MGDF蛋白質分子之組成物。單聚合物 /MGDF蛋白質共軛物較好在N-末端上有一個聚合物分子， 但非在賴胺酸胺基侧鏈上。製劑較好大於9〇%單聚合物 /MGDF蛋白質共軛物，且較好大於95〇/〇單聚合物訄(}1)1?蛋 白質共軛物，而其餘可觀察到之分子係未反應的（即無聚合 物部份之蛋白質）。提出以下實例，其製劑中至少约9〇%單 聚合物/蛋白質共軛物，及約1 〇 %未反應的蛋白質。單聚合 物/蛋白質共軛物具有生物活性〇 本發明組成物中可用的脂質小囊爲可以輿討論中之蛋白 質交互作用之具負電荷之脂質體。意欲使用之特殊脂質體 包括二油醯基鱗脂醯基甘油（DOPG)， 二肉豆蔻醯基磷脂醯基甘油（DMPG)， 二棕櫚醯基鱗脂醯甘油（DPPG)， 卵磷脂醯甘油， 二油醯基磷脂醯乙醇胺（DOPE)， 卵磷脂醯乙醇胺，二油醯基磷脂酸（DOPA)， 二肉豆蔻磷脂酸（DMPA)， 二棕櫚醯基磷脂酸（DPP A)， -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)
A7 ___;_ B7_ 五、發明説明（23) 二油醯基璘脂醯基弱胺酸（DOPS)， 二肉豆蔻酿基轉脂醯基弱胺酸（DMPS)， 二棕櫚醯基磷脂醯基弱胺酸（DPPS)， 卵璘脂醯基弱胺酸，溶血磷脂醯基甘油，溶血磷脂醯基乙 醇胺，溶血磷脂醯基弱胺酸。依據所利用之特殊脂質體， 脂質體之量可予以變化。 蛋白質：磷脂組成物中較好包括有緩衝作用物，以維持溶 液之pH値在欲求的範園内。較佳的作用物包括醋酸鈉，嶙 酸鈉，及檸檬酸鈉。這些缓衝劑之混合物也可使用。用於 組成物中緩衝作用物之量大部份依據所使用之特殊緩衝物 質及溶液之pH値而定。如，醋酸鹽在pH 5較在pH 6爲較 有效之缓衡物質，故在pH 5溶液中醋酸鹽之用量少於在PH 6。本發明组成物較佳的p Η範園爲j> Η 3 · 0 - 7.5。 本發明的組成物可進一步包括等滲性調節劑，使溶液呈 等滲性且更可與注射相容。最佳的作用物是氯化鈉，在〇_ 150 mM濃度範園内。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明包括的尚有藥學組成物，含有有效劑量的本發明 之多肽產物加上藥學上可接受之稀釋劑，保藏劑，助溶劑 ，乳化劑，佐劑及/或載劑。此種組成物可影響蛋白質之物 理狀况’穩定性及生物利用率。如見，Remingt〇ns Pharmaceutical Science, 18th Edition, 1435-1712 (Mack Publishing Co·, Easton, PA., 1990)在此已列爲參考。在特定 例子中可提供蛋白質有效劑量是依各種因子而定，此是有 知識之參與者應考慮的，包括欲求之治療結果，受治療狀 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部十央標準局員工消費合作社印製 A7 ___ B7 五、發明説明（24 ) 況或疫病之嚴重程度，個體之身體狀況等等。 於涉及大腸桿菌衍生之rhGM-CSF較佳具體實例中，所 用的脂質體小囊爲D Ο P G，具5 0 : 1之D Ο P G : G - C S F比例 ，pH 4.5，含有10 mM醋酸鈉。 於涉及大腸桿菌衍生之rhG-CSF較佳具體實例中，所用 的脂質體小囊是DMPG，具有17:1的DMPG:GM-CSF比 例，pH 7.0，於磷酸鹽缓衝之合鹽水中。 於涉及大腸桿菌衍生之rhG-CSF較佳具體實例中，其且 已經過化學修飾（聚乙二醇化），rhG-CSF是參·肆聚乙二醇 化，所使用的脂質體小囊爲DMPG ，具17:1之 DMPG:PEG-G-CSF 比例，在 PH 4.5 下。 於涉及大腸样菌衍生之MGDF 1-163較隹具體實例中， 所用的脂質體小囊是DMPG，具有l〇0:1 dmpg:MGDF 比例，p Η 5 0，於1 〇 m μ醋酸鈉5 %山梨醇中。 於涉及大腸桿菌衍生之MG£>F 1-163較佳具體實例中， 其已經化學修飾，M G D F是經還原性燒化作用單_聚乙二醇 化（2 0 kDa)，所使用的脂質體小囊是dmpG，具有1〇〇:1 的DMPG:MGDF比例，pH 5.0，在10 mM醋酸鈉5〇/〇山梨 醇中。 於涉及CHO衍生之MGDF 1-332較佳具體實例中，所使 用之脂質體小囊爲〇从卩〇，具有io〇:1 dmpg:Mgdf& 例，在p Η 5 . 〇下，於！ 0 m M醋酸鈉5 0/〇山梨醇中。 雖然就特殊蛋白質：脂質組成物及治療方法本發明已描述 及説明，但精藝者應很明m不偏離本發明範固則有 -27- 本紙張尺度it财@ ϋ家標準（CNS ) Α4Μ ( 210X297^ ) (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（25 ) 各樣相闕之組成物及治療方法存在。 以下實例可更詳盡説明本發明各方面。 實例1 進行最初實驗以檢查將重組體人類G-CSF(rhG-CSF)納 入脂質小囊之可行性。rhG-CSF利用重組體DNA技術產生 ’其中大腸桿菌以编碼人類G-CSF之DNA轉感，如美國專 利案]^〇.4,810,643中8〇112汪所述。|'11〇-€8?製備成4毫克/毫 升溶液於稀HC1中，pH 4·0。所有的脂質均得自av anti
Polar Lipids (Alabaster，Ala)且貯在氮氣下_2〇°C 中，終 濃度爲100毫克/毫升於氯仿中。 G-CSF:麟脂複合物之製傭 爲製備可與G - C S F組合之脂質小囊，將3 〇微莫耳的逋合 的脂質分裝至玻璃管中，再利用氮氣流乾燥至薄膜狀。脂 質薄膜在眞空下乾燥至少2小時以移去任何痕量的氯仿。脂 質薄膜再於1毫升經蒸饀之去離子水（ddH20)，磷酸鹽緩衝
之合鹽水，pH 7.2(Gibco/ BRL "D-PBS")或 150 mM
NaCl中水化成1毫升。樣品再於浴式震盪槽内震盪 (Laboratory Supplies，Hicksville，Ν.Υ)。音波震盪繼續直到 樣品在視覺上是澄清的爲止（通常歷丨〇 _ i 5分）。樣品貯放 於4C之氮氣下直到使用爲止。最終脂質濃度爲3〇瓜撾。 另外，脂質小囊可由300微莫耳脂質如上述在氮下乾燥及 保乾而製備。經乾燥之脂質薄膜在10毫升適合的水溶液中 如上述般水化。樣品再於實驗枱規模之乳化器内 (Microfluidics Model 110S, MicroflllidicS5 Inc Cambridge (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)
-28- 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（26 ) MA)以1〇,〇〇〇 Psi操作而微流化。樣品再經儀器循環1〇次。 微流化之樣品再如上述般貯於4°C下。 將G-CSF(如上述）輿特殊脂質（如上述）混合製成g_csf: 磷脂複合物。混合由渦旋，攪拌，或緩和震盪來完成。製 備脂質：G-CSF各種莫耳濃度比例以評估蛋白質之膜嵌入及 穩定性。如，製成3毫升樣品（於水中）’其爲〇·2毫克/毫升 G-CSF並在脂質：G-CSF 40:1莫耳比例下，取150微升G_ CSF貯液混合以44微升脂質（3 0 mM貯液，由震歲法製備 於水令）’再加水至3毫升之最終樣品體積。建議有5分鐘之 培育（但並非必要），且在樣品使用或分析前進行。 G - C S F也可混合以水化的脂質再微流化。接下來，如上 述般微流化混合物以將G - C S F納入脂質膜内。 分析G-CSF:磷脂複合物 1.色胺酸發射光譜 在rhG-CSF中存在有二個色胺酸殘基，其對局部環境狀 況十分敏感。因此當rhG-CSF與脂質體接觸時，進行分析 以決定rhG-CSF色胺酸之螢光。由最大螢光發射中之藍色 位移可推測色胺酸係處在較疏水性之環境下，因此rh G _ C S F係包埋在脂質膜内。關於色胺酸螢光分析極佳之總覽 可見 Principles of Fluorescence Microscopy, by J. Lakowicz, chap 11 (Plenum Press, New York, 1983) 0 將樣品在2 8 0毫微米下激發而分析G-C S F :脂質複合物（ 如上述）之色胺酸螢光，並以1毫微米之增加幅度在i毫微米 /秒速率下掃播285毫微米至420毫微米之發射。樣品體積 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（2i〇X297公釐） I:-------..¾j (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 經濟部中央襟準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（27 ) 是3毫升，且G-CSF最終濃度是0.2毫克/毫升（所有樣品如 此）。變化脂質：G-CSF比例《所有的螢光偵測均利用PTI Alphascan勞光計來進行（South Brunswick，NJ)。所有的測度 在25 C下進行，且在使用水一加套之石英管握器連接至循 環水浴中間均維持在此溫度下。收集發射光譜並利用ρτι 提供之數據軟體分析。 rhG-CSF之螢光光譜，於由DOPG组成之小的單層小囊 存在或不存在下之結果示於圖1中。在DOPG小囊不存在下 ’ rhG-CSF於334毫微米有最大的發射。於DOPG以 1 〇0 : 1脂質：蛋白質比例存在下，rhG-CSF色胺酸螢光在至 327毫微米之最大榮光發射中呈現藍色位移，旦在螢光強 度上有劇烈的增加。由DOPG存在下螢光發射之低波長可 推測色胺酸所在之環境較天然蛋白質更爲疏水性。如圖2所 註明的，螢光位移依DOPG:G-CSF莫耳比例而定，且一旦 達到10:1 DOPG:G-CSF比例即可測及膜之嵌入。 2.碘化物驟冷實驗 碘化物爲色胺酸螢光有效的碰撞騍冷劑，但無法穿透脂 質膜。因此，由破化物有效驟冷色胺酸螢光顯示，當蛋白 質色胺酸自水性溶劑中螯合走時，殘基可曝於大團水溶劑 下同時保護之免於蛾化物之驟冷。在這些實驗中，G-CSF 及DOPG: G-CSF組成物（100: 1脂質•蛋白質比例）被使用 。於樣品最初讀値（F 〇 )掃取及記綠後，加入增量的蜗/化_ (KI)(5M貯液）偵測螢光強度。樣品及κΐ溶液均製成含有i mM Na2S03(終濃度），如 Lee et al.，所述之 Biochem. -30- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ---------— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 __B7_ 五、發明説明（28 )
Biophys. Acta. 984:174-182 (1989)及 Le Doan et al.,
Biochem. Biophys. Acta, 858:1-5 (1986)。添加 N a2 S 03 可避 免I2之形成，其可滲入蛋白質及膜之非極性區域。以Stern-Volmer方程式（F〇/F = l + KKI[KI])分析數據，其中F〇及F 爲樣品在KI濃度[KI]有或無下之螢光強度。Κκι爲G-CSF 色胺酸殘基ΚΙ驟冷中之Stern-Volmer驟冷常數；Lehrer，S., Biochemistry 10:3254-3263 (1979) 0 數據之Stern-Volmer作圖示於圖3。於DOPG小囊缺泛下， rhG-CSF螢光可爲KI有效地驟冷。於DOPG存在下，數據 之Stern-Volmer作圖爲線型，顯示峨化物不易接近二色胺酸 。數據顯示在DOPG缺乏下爲破化物-可接近之色胺酸殘基 ，於DOPG存在下變成姨化物-不易接近的。因此，含有此 色胺酸之rhG-CSF部份必定包埋在DOPG雙層之内。 3.能量轉移測度 如先前所示，能量轉移可發生在色胺酸供者及脂溶性螢 光受者之間，如芘癸酸，因爲此探針之激發光譜可與色胺 酸之發射光譜顯著地重叠。Friere et al,，Biochemistry， 22； 1675-1680 (1983)。若蛋白質嵌入脂質膜内，由色胺酸至 芘之能量轉移會造成色胺酸螢光之驟冷。在此實驗中，备 種脂質：G-CSF複合物於各種芘癸酸劑量（30微克/毫升於四 氫呋喃之貯液）加入前（F 〇 )及之後（ρ )記綠色胺酸發射強度 。在芘癸酸加入中繼續攪拌樣品以促進芘癸酸及樣品間之 混合。F/F〇之比例和發生在G-CSF色胺酸及疏水性能量接 受體芘癸酸間之能量轉移量呈比例。 -31- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（2丨0'〆297公黎）_ ~ - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T M濟部中夬檩隼局負工消費合作衽印製 A7 _____B7_ 五、發明説明（29) 圖4示出於DOPG存在下（100 : 1脂質··蛋白質比例），呈所 加入芘癸酸函數關係之rhG-CSF驟冷概圖。驟冷在芘癸酸 極低濃度時（<1莫耳％)發生，因此螢光探針在膜結構及行 爲上之影響最小。由於預期芘癸酸可快速分佈至脂質雙層 内，本數據顯示rhG-CSF包埋在DOPG膜内且足夠深使可 由色胺酸有效能量轉移至受體。在rhG-CSF存在與否下， 檢查芘癸酸一標記之DOPG小囊之激發光譜可証實能量之 轉移。 上示分析顯示rhG-CSF可與類未飽和磷脂之D〇pG緊密 交互作用。於DOPG小囊存在下，可保護rhG-CSF色胺酸 免於水溶性螢光驟冷劑，但經由能量轉移至疏水性螢光探 針易感受驟冷。合起來説，數據顯示rhG-CSF可嵌入由 D Ο P G組成之膜内。一旦達到1 〇 : 1比例（脂質：_ c S F )可 測及膜之嵌入’且此數目可代表包園蛋白質嵌入部份之脂 質數目。 實例2 在此實例中，利用F/F〇強度及發射最大値之比較決定 rhG-CSF與其他嶙脂交互作用之能力。在各例中，脂質 :rhG-CSF之莫耳比例是ι〇〇:ι β 圖5示出各種脂質有或無存在下rhG-CSF之F/F0數據。 圖6示出相同組成物之發射最大數據。於圖5及6中之數據 証明，除了 DOPG外，rhG-CSF可嵌入DMPG，DPPG及 較無效率的磷脂醯基乙醇胺（PE's)及磷脂釀基弱胺酸 (PS’s)。此外，頃發現NG-DOPE(DOPE樣品中PE頭基較 -32- 本€張尺度適财酬家縣(~CNS ) A视格（21GX_29_7公釐) ~ - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 具陰性）可提供rhG-CSF較DOPE更爲改善之嵌入。 DOPC，DMPC及DPPC均爲中性脂質，且這些小囊對於 rhG-CSF之最大發射或螢光強度並無作用，顯示與這些嶙 脂並無交互作用發生（見圖5及6及圖7曲線2)。 上述數據証明，可轉化至融熔狀球蛋白狀況之蛋白質可 嵌入各種脂質小囊内。然而，此rhG-CSF:脂質之交互作用 僅當使用負電荷之脂質小囊時才發生。在負電荷之脂質小 囊中，具較大負電荷之小囊似乎可提供較強的rhG-CSF:脂 質交互作用。 實例3 在此實例中，決定DOPG:rhG-CSF交互作用影響和其與 蛋白質穗定性之關係。在裝置有P eltier式熱怪溫小池握器 及磁性攪拌器之Jasco J-720儀器中進行圓二色性偵測。圓 二色性在222毫微米下利用80微克/毫升，PH 6.0之rhG-C S F最終濃度測度。利用Microcal MC-2量熱器進行差別掃 描量熱測度。rhG-CSF(l毫克/毫升，於水）或DOPG: rhG-CSF (45:1莫耳/莫耳，於水）樣品以90°C/小時掃描 。利用Microcal软體辟存及分析數據。 G-CSF β螺旋中因溫度謗生之變化，可由圓二色性偵知 (222毫微米），呈增加溫度之函數關係。rhG-CSF pH 6.0 下因熱謗生之伸展示於圖8中。曲線顯示在- 60-70 °C會發 生相當敏銳的轉化而造成β螺旋之喪失。在此轉化之後， rhG-CSF可自溶液中不可逆地沉殿。伸展之溫度範園和 rhG-CSF在pH 7.0之槔化溫度相似，由差別掃描量熱法決 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（2丨0X297公釐） —,·---7----彎—丨 (請先闖讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ______B7 五、發明説明（31 ) 定，如圖9所示。 相反的，DOPG:rhG-CSF樣品隨著溫度增加π螺旋會逐 漸喪失，且和rhG-CSF單獨時不同的，D〇PG:rhG-CSF 因溫度謗生之伸展似乎不是協同的（見圖8)。此結論也可由 差別掃描量熱法（圖9)所示之熔化轉化之缺乏來証明。顯著 地’ DOPG:rhG-CSF樣品在加熱至95°C後可恢復α螺旋 ，且一旦冷卻可重覆在95t：l1(rc間循環並完全恢復螺旋 (見圖10)。在這些狀況下，單獨會不可逆地伸 展並自溶液中沉澱。 也檢查DMPG及DPPG在G-CSF圓二色性中之影響。使 用150:1之脂質〔rhG-CSF比例，和DOPG » DMPG及 DPPG例一般也可穩定rhG-CSF之二級結構（圖11-13)。 這些數據註明，rhG-CSF與DOPG，DMPG及DPPG之 交互作用可加強rhG-CSF單獨時不穩定狀況下蛋白質之穩 定性。交互作用可直接穩定rhG-CSF之二級及三級結構。 實例4 在此實例中，決定rhG-CSF:DOPG交互作用影響和 rhG-CSF生物活性之關係。利用鼠骨髓細胞對[3h]-胸苷 之G-CSF依賴性攝入分析rhG-CSF之試管内活性，如 Zsebo et al., Immunobiology 172:175-184 (1986)所述。所有 活性分析均進行三次。皮下注入倉鼠（rhG-CSF劑量爲100 微克/公斤）及估計白血球（W B C)叙目來決定活體内之活性 0 1.試管内活性 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） !·譬·------1T (請先閱讀背面之注意事項再填寫本買) A7 B7 五、發明説明（32 A。 決定DOPG有或無下’ rhG-CSF之比活性。也測試 經熱處理之rhG-CSF及DOPG:rhG-CSF樣品。結果綜合 於表1。 表1 樣品 rhG-CSF rhG-CSF(加熱過）a DOPG:rhG-CSFb (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 比活性（單位/毫夫/蛋白質、 0.66 土 0.09 未測及 0.6 1 土 0 1 1 DOPG:rhG-CSFb(加熱過）a 〇·52 土 0 08 a樣品在85t水浴中培育10分鐘，再進行分析 bDOPG:rhG-CSF50:l之比例（莫耳/莫耳） 如表1所示，嵌入DOPG雙層並不會不良地影 CSF之生物活性。經加熱至85 °C 10分鐘後，rhG-CSF有未 可測及之活性，且蛋白質會沉澱。經類似的處理後， DOPG:rhG-CSF保有未加熱rhG-CSF~85%活性，且一旦 冷卻即可完全恢復二級結構。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B. 也研究在冷凍乾燥中，各種脂質穩定rhG-CSF之能力 。rhG-CSF組合各種脂質之樣品冷凍乾燥（如上述）再作活 性之分析。DOPG，DMPG及DPPG當與rhG-CSF混合時 於冷康乾燥後可令rhG-CSF生物活性有1〇〇 之保留（圖 14)。單獨的rhG-CSF無法自冷凍乾燥過程中存活。 2.活體内活性 決定在脂質有或無下，rhG-CSF之活性（WBC計數）。在 第0天，皮下注射後（rhG-CSF劑量爲1〇〇微克/公斤）偵測 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（33 ) 活性。分析5種不同的脂質：rJlG_CSF複合物，並於各例中 脂質：rhG-CSF複合物均可保有活體内活性（圖丨5及16)。 上述之研究ΪΕ明嵌入負電荷之脂質雙層不會有害地影響 rhG-CSF之生物活性。另外，脂質之保護作用似乎可在冷 凍乾燥過程中保護rhG-CSF。 實例5 在此實例中，以眞核宿主細胞表現產物（c Η 〇 _ g - C S F ) 獲得之G-CSF及經化學修飾之g-CSF(聚乙二醇化之G-CSF (PEG-G-CSF))測試其與負電荷脂質小囊交互作用之 能力。於CHO-G-CSF，利用F/F〇強度及最大發射（如實例 1所述）比較進行決定。於各例中，脂質：蛋白質之莫耳比例 爲100:1。於PEG-G-CSF，依圓二色性分析進行決定。 所使用4CHO-G-CSF爲利用重組DNA技術所產生的， 其中中國倉鼠卵（CHO)細胞以編碼人類g-CSF之DNA序列 轉感，如美國專利案No. 4,810,643 Souza所述。CHO-G-CSF製成〇,6毫克/毫升於PBS pH 7.0之溶液。已示出 CHO-G-CSF可與DOPG以類似rhG-CSF之方式交互作用 ’且各樣品在DOPG存在下顯示增強之螢光強度，且在 DOPG·存在下之最大發射中有藍色的位移（圖η及;[g)。因 此’ DOPG交互作用並非因G-CSF重組型式的某些特性所 致0 用於實驗中之PEG-G-CSF爲參-肆聚乙二醇化之大腸样
菌竹生之 G-CSF(利用 PEG 6000)。DMPG:PEG-G-CSF (17:1莫耳/莫耳）樣品利用上述的步驟製備。頃發現DMpG -36- 奉紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 B7 五、發明説明（34 ) :PEG-G-CSF樣品於加熱後可完全恢復二級結構（圖19)。 除了 PEG分子之存在，經衍生化之蛋白質可與脂質以如天 然蛋白質之相同方式交互作用。 上述數據顯示，與G-CSF與負電荷脂質小囊交互作用有 關之穩定作用，並非原核宿主細胞表現產物所得之rhG_ CSF獨特的。可轉化成MGS之經化學修飾之蛋白質，且其 可輿脂質體小囊接觸，在此是PEG-G-CSF:DMPG，也呈 現穩定作用。 實例6 在此實例中，研究DMPG及DPPG在GM-CSF上之作用 。GM-CSF爲重組體人類GM-CSF，如美國專利案！^。 5，047,5 04 Boone所述，製成1毫克/毫升在磚酸鹽缓衝食鹽 水（PBS)，pH 7.0中之溶液。使用17: 1脂質：GM-CSF比 例，並以如上述之圓二色性分析偵測熱穩定性。DMPG及 DPPG可造成GM-CSF更佳之熱穩定性，即於加熱係恢復 二級結構（圖20a & 20b)。 這些數據提供蛋白質另一實例，可轉化成融熔之球蛋白 狀況，與負電荷脂質小囊交互作用以提供蛋白質更佳之熱 穗定性。 實例7 於此實例中’使用DOPG:PEG-G-CSF複合物評估於經 腸投藥後增加至G-CSF治療反應之可能性。在此實驗中， 如實例1般製備DOPG，且如實例5般製備PEG_G_CSF。 1〇〇微莫耳脂質（797微升）在眞空下乾燥，再加1毫升mim -37- 衣紙張又度.適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（35) Q水使成1 0 0 m Μ的脂質溶液。此溶液於音波震靈水浴中 (Modei G 112SP1T 來自 Lab, Supply Inc，HicksviUe， NY)中震盪5分鐘，或直到脂質溶液澄清爲止。加9微莫耳 DOPG溶液（90微升）至90毫微莫耳天然的1：11〇_(：!8?或 PEG-G-CSF於1 mM HC1中。溶液渦旋並以j mM HC1使 達到2毫升終體積。於十二指腸内投予至大鼠，材料置於滲 透泵，其再植入動物内。材科之釋放在24小時發生。 在有或無脂質下，接受rhG-CSF及PEG-G-CSF動物之 總WBC分析結果示於圖21中。圖21&示出天然G-CSF之輸 注無法刺激W B C反應，此與僅有溶媒下比較而言。此加入 對於動物對rhG-CSF之治療反應少有衝擊。 大鼠對聚乙二醇化G-CSF之反應示於圖21b中。吾等可 見單獨的PEG-G-CSF可刺激WBC反應。WBC之上升在回 至基線前持續48小時。以DOPG調和之PEG-G-CSF也可 刺激WBC反應，且此反應幾乎是單獨peG-G-CSF的2倍 強。這些結果可由輸注後測及之PEG-G-CSF血清水平予以 証實（圖22)。 這些數據証明在PEG-G-CSF之口服調和物中包括陰離子 性脂質，如D Ο P G，似乎可增加由所衍生化蛋白質所謗出 之治療反應。所涉及之機制目前尚未了解。 實例8 在此實例中，研究DMPG於MGDF上之影響。MGDF爲 重组體人類大腸桿菌衍生之MGDF 1-163，製成1.〇毫克1 毫升於10 mM醋酸鈉.，5%山梨醇，pH 5.0之溶液中。 -38- 本紙張尺度適用中國國家^準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐1 ' 1^~|I----豐！ (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _ -___B7 五、發明説明（36) DMPG:MGDF複合物依實例1所述地製備。 分析DMPG:MGDF複合物 1·色胺酸發射光譜. 於M GDF中有一個色胺酸殘基（51位置），其可用於追踪 MGDF與DMPG囊之交互作用。如實例1所述般分析 DMPG:MGDF複合物之色胺酸螢光，利用〇· 1毫克/毫升之 MGDF濃度。於由DMPG組成之小且單層之小囊存在或不 存在下MGDF螢·光光譜示於圖22。於DMPG小囊不存在下 ’ MGDF於336毫微米下有最大發射。於DMPG以1〇〇:1 脂質：蛋白質比例存在下，MGDF色胺酸螢光在螢光最大發 射至328毫微米下可呈現藍色的位移。於DMPG存在時榮 光射出之低波長推測色胺酸所在的環境較天然蛋白質更具 疏水性。且如圖23所証明的，螢光位移依DMPG:MGDF 莫耳比例而定，一旦達到8-30:1莫耳之DMPG:MGDF即 可測及膜之嵌入。螢光變化在ΐ 1 0 0 : 1莫耳比例時達最大 ，且當pH値由pH 7.0降至pH 5.0時，MGDF可呈現對 D Μ P G小囊明顯較高之親和力。此推測某些胺基酸之滴定（ 如組胺酸）可用於加強或減缓交互作用。 2 ·碘化物驟冷實驗. 在這些實驗中，使用MGDF及DMPG:MGDF組成物 (100:1 DMPG:MGDF)於實例1所述之碘化物驟冷實驗D 數據之Stern-Volmer作圖示於圖24。於無DMPG小囊下， MGDF螢光可由KI有效地驟冷。相反的，於DMPG存在下 ，色胺酸無法接近蛾化物，顯示含有此色胺酸的MGDF部 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) 格（210X297公釐） (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（37) 份必定包埋在DMPG雙層内。 上文的分析顯示，就如同G-CSF及GM-CSF例一般， MGDF可與如DMPG之不飽和磷脂緊密地交互作用。於 DMPG小囊存在下，MGDF色胺酸被保護免於水溶性螢光 驟冷劑之作用。合起來説，數據顯示MGDF可嵌入由 DMPG組成之膜内。一旦達到8:1比例（DMPG:MGDF)即 可測及膜之嵌入，且此數目可代表包園在蛋白質嵌入部份 之脂質數目。 實例9 在此實例中，決定DMPG:MGDF交互作用和蛋白質穩定 性之關係。也評估MGDF(土DMPG)之熱穩定性，於尿素 存在下之穩定性及貯架期穩定性。於各研究中，使用 100: 1莫耳比例之dmpg:mgdf。 1.熱穗定性· 追縣單獨的M G D F或納入D Μ P G小囊後之圓二色性（C D 在222毫微米下），爲95°C及l〇°C間熱循環之函數關係，如 實例3，圖1 0所述。留下的C D %係指和所示組成物未加熱 樣品之CD比較下，於各循環後（1個循環是10。(： 一 —;>1(TC)所測及之CD量（於i(TC下）。當3個熱循環後， MGDF失去7〇%以上之螺旋度，在相同條件下， DMPG:MGDF卻可完全保有其原先之汉螺旋度（見圖25)。 2 .於尿素存在下之穩定性 尿素是一種可伸展及變性蛋白質之離液序列高之試劑。 以螢光追踪MGDF(土 D Μ P G )之平衡變性，即偵測三級結構 -40- 不紙诋人反遇州〒國國家標準（CNS ) Α4規格（ (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)
五 、發明説明丨38) A7 B7 . · 及經由圓二色性，即偵測二級結構。如圖2 6所示，當蛋白 質三級結構失去時，色胺酸殘基更曝於水相下，且MGDF 之發射波長移至更長之波長；且當二級結構失去時，平均 殘基橢圓性（M R E )於泛螺旋失去時會變成較非負値。於 E>MPG缺乏時，在約3Μ尿素左右發生三級結構50%之喪失 ’而在DMPG存在下爲達到結構50%喪失需有8M尿素。類 似地，於DMPG缺乏下MGDF MRE 50%喪失需7M尿素 ’與DMPG存在下之9M尿素比較。 3.貯架期穩定性 在表2所示之條件下貯存大腸桿菌〗_163( 士 DMPG)，再 以大小排阻層析（SEC)檢查，利用Toso-Haas G3000SWXL 管柱’加上1 0 〇 m Μ嶙酸鹽緩衝溶液，1 〇 〇/0乙醇，〇 2 % Tween-2〇, pH 6·9之移動相。樣品以乙醇及Tween_2〇稀釋 至如移動相般之相同濃度，且每次流程注入1〇 2〇微克樣 昨。管柱溫度維持在4(TC。任何形成之凝集的MGDF可較 未凝集之蛋白質先溶離，並偵測凝集物峰及單體峰曲線下 之面積定量之。數據係指於凝集物峰中之總MGDF% » 表2 以SEC偵測之凝鏖％ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
樣品MGDF 逆度 -8〇°C 4°C 3 7〇C DMPGrMGDF - 8 0 °C 4°C 37〇C 如表2所示， 5週 1 1週 〇 0.2 〇·4 0.6 18 39.2 〇 0.14 〇 0 1·9 2.5 旦貯存時D Μ P G可劇烈地減少凝集物之形 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-41- 經濟部中知標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明丨39 ) 成。因此可使用DMPG來加強MGDF之貯架期。 這些數據証明，MGDF與DMPG小囊之交互作用可加強 單獨MGDF不穩定之條件下蛋白質之穩定性。交互作用可 直接穩定變性劑如尿素存在下M G D F之二級及三級結構， 且可顯著地改進各種溫度下MGDF之貯架期。 實例1 0 在此實例中，測試經化學修飾之MGDF 1-163 (單-聚乙二 醇化之（20 kDa) MGDF 1-163 (PEG-MGDF))與負電荷脂質小 囊交互作用之能力。關於PEG-MGDF，利用F/F。強度及發 射最大値之比較（如實例1及8所述）進行決定。於各例中， 脂質：蛋白質之莫耳比例爲i 〇 〇 : i。 於這些實驗中所用的PEG-MGDF爲單-聚乙二醇化之（20 kDa)大腸桿菌衍生（MGDf 1-163，係經由還原性烷化作用 利用單甲氧基-聚乙二醇醛peg)(平均分子量2〇 kDa) 。以硫故十一酿納聚丙缔醯胺凝膠電泳決定peg-MGDF共 軏物之均質性，利用4_2〇%預成型之梯度凝膠進行 (NOVEX)。顯示出相當於μ 9 kDa蛋白質位置之一個主臀 〇 再利用上述步驟製備DMPG:PEG-MGDF (100:1莫耳/莫耳） 樣品。頃發現DMPG:PEG-MGDF樣品於加熱後可完全恢 復二級結構（圖2 7)。估不論PEG分子之存在，衍生化之蛋 白質可與脂質以如天然蛋白質之相同方式般交互作用。 此數據顯示，*MGDF與負電荷脂質小囊交互作用有關 之最大發射位移，並非以原核宿主細胞表現產物型式獲得 -42- 本紙張尺度適财關家標準（⑽> Μ規公釐)_ (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁)
A7 B7 五、發明説明（40 ) ~ 之M G D F所獨特的。如同以化學修飾之r h 〇 _ c s f所明示的 ’ DMPG:PEG-MGDF也可呈現發射位移，且數據顯示經 化學修飾之MGDF可嵌入由DMPG組成之膜中。 實例1 1 在此實例中，評估DMPG:PEG-MGDF交互作用和 MGDF吸附至玻璃小瓶之間題之關係。約微微克/毫升的 [25I]-PEG-MGDF混合以各種濃度之未經標記的PEG-MGDF以達到所示之最終Peg_mGDF濃度（見圖28)。如 所示’ DMPG包括於稀釋液中（見圖27)。1毫升的製劑量 於3毫升玻璃小瓶内（Kimble)。分析P E G - M G D F之回收率％ ，係於室溫下1 8小時培育後計數可回收自玻璃小瓶之經放 射標記之MGDF含量。如圖28所示，PEG-MGDF可容易 地吸附至玻璃容器，此當蛋白質濃度降低時，且在〇1_5〇 微克/毫升範園中吸附作用尤其高。相反的，dmpg:peg-MGDF在0.1-50微克/毫升peG-MGDF範圍中，顯出幾乎 無吸附作用。 實例1 2
在此實例中，決定DMPG:MGDF 1-163及DMPG: PEG-MGDF 1-163 交互作用和 MGDF 1-163 及 PEG-MGDF 1-163生物活性之關係^MGDF 1-163爲大腸桿菌 衍生的，且脂質：蛋白質比例爲1 〇 〇 : 1。偵測經1 〇 〇微克/公 斤及300 微克 / 公斤 MGDF，PEG-MGDF，DMPG:MGDF 或 DMPG:PEG-MGDF處理過之老鼠之血小板數，且結果示於 圖31。將各型式所示濃度皮下投予至正常、雌性之Baib/C -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -—J— n IJ1 --------0ΐ (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 老鼠t，每天一次共8天。於最後一劑注射後2 4小時收集 採自尾靜脈侧口之血樣，以Sysmex電子血球分析儀（Baxter Dragnostics，Inc. Irvine, CA)進行血液細胞分析。數據以4隻 動物之決定値平均，土標準偏差，來表示。其他血液細胞 變數，如總白血球數或紅血球數並不受這些處理影響（數據 未示出）。結果顯示，大腸桿菌MGDF 1-163之聚乙二醇 化作用可增加分子之活體内活性。更重要的，上文研究証 明嵌入負電荷之脂質雙層，並不會有害各種MGDF型式之 生物活性。 序列表 (1) 一般資料： (i) 申請人:AMGEN INC. (ii) 發明題目：安定之蛋白質磷脂組合物及方法 (iii) 序列數:2 (iv) 通信住址： (A) 收信人：Amgen Inc. (B) 街：1840 Dehavilland Drive (C) 市：Thousand Oaks (D)州：加州 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
(E) 國：USA (F) ZIP:91320-1789 (v) 電腦可讀型式： (A) 媒體型式：軟式磁碟 (B) 電腦：IBM PC可相容 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 五、發明説明（42).
(C) 操作系統:PC-DOS/MS-DOS (D) 軟體：Paten In Release '#1.0, Version #1.25 (vi)目前申請資料 (A) 中請案號 (B) 立檔曰期 (C) 分類 (2) SEQ ID No: 1 資料 (i) 序列特性 ， (A) 長度:1342鹼基對 (B) 型式:核酸 (C) 股性：單股 (D) 拓捷學：線型 (ii) 分子型式:cDNA (ix)特色
(A) 名稱/索引：CDS (B) 位置:99..621 (xi)序列説明：SEQ ID No:l CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG 60 TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT 113
Ser Pro Ala Pro Pro 1 5 GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC 161
Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val 10 15 20 CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA 209
Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr 25 30 35 CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC ^TTG GGA GAA TGG AAA ACC 257
Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr 40 45 50 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） —f^i ϋ^— ϋ— mj- · (讀先閩讀背面之注意事項再填寫本頁) •Itr----- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 、發明说明（43 ) ^ —----------------------"
CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT
Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp lie Leu Gly Ala Val Thr Leu 55 60 · 65 .
CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC
Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys
70 75 80 BS
CTC TCA TCC CTC CTC GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT
Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu 90 95 100
GGG GCC CTC CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG
Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg 105 110 115
ACC ACA GOT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC
Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala lie Phe Leu Ser Phe Gin His 120 125 130
CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT -GTA GGA GGG TCC ACC
Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr 135 140 145 CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 150 155 160 165 TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC C CAAACAGGAC TTCTGGATTG 641
Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu 170 TTGGAGACAA ACTTCACTGC CTCAGCCAGA ACTACTGGCT CTGGGCTTCT GAAGTGGCAG 701 CAGGGATTCA GAGCCAAGAT TCCTGGTCTG CTGAACCAAA CCTCCAGGTC CCTGGACCAA 761 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) ATCCCCGGAT ACCTGAACAG GATACACGAA CTCTTGAATG GAACTCGTGG ACTCTTTCCT 821 GGACCCTCAC GCAGGACCCT AGGAGCCCCG GACATTTCCT CAGGAACATC AGACACAGGC 881 TCCCIXSCCAC CCAACCTCCA GCCTGGATAT TCTCCTTCCC CAACCCATCC TGCTACTGGA 941 CAGTATACGC TCTTCCCTCT TCCACCCACC TTGCCCACCC CTGTGGTCCA GCTCCACCCC 1001 CTGCTTCCTG ACCCTTCTGC TCCAACGCCC ACCCCTACCA GCCCTCTTCT AAACACATCC 1061 TACACCCACT CCCAGAATCT GTCTCAGGAA GGGTAAGGTT CTCAGACACT GCCGACATCA 1121 GCATTGTCTC GTGTACAGCT CCCTTCCCTG CAGGGCGCCC CTGGGAGACA ACTGGACAAG 1181 ATTTCCTACT TTCTCCTGAA ACCCAAAGCC CTGGTAAAAQ GGATACACAG GACTGAAAAG 1241 GGAATCATTT TTCACTGTAC ATTATAAACC TTCAGAAGGT ATTTTTTTAA GCTATCAGCA 1301 ATACTCATCA GAGCAGGTAG CTCTTTGGTC TATTTTCTGC A 1342 -46 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 五、發明説明（44) A7 B7 (2) SEQ ID No:2 資料 (i) 序列特性 (A) 長度:174個胺基酸 (B) 型式:胺基酸 (D)拓撲學:線型 (ii) 分子型式：蛋白質 (xi)序列播述：S EQ ID No:2. Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1 5 ’ 10 ， 15 Arg Asp Ser His Val Leu His Sert Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val 20 25 30 » - His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu 35 40 45 Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp He Leu 50 55 60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin 65 70 75 80
Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin 85 90 95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leii Leu Gly Thr Gin Leu 100 105 110 Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala lie Phe 115 120 * 125
Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys, Val Arg Phe Leu Met Leu 130 135 140 ---1----鬢 I—(請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製
Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 145 150 .155 160 Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu 165 * 170 -47； 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）
Claims (1)
- 第 85U2i69 逮專丨:t A8 中文申凊專利範圍修正本(88年1 ί月） — ____— . _________— [)8 1 1 - ·六、申請專利範圍 1. —種組合物’其含有與預成完整磷脂脂質體小囊混合之 MGDF ’該脂質體小囊由負電荷之磷脂組成，其中該組 合物具至少25 : 1 (莫耳：莫耳）比例之脂質體：MGDF， 以形成脂質體-蛋白質複合物，其中M G D F僅一部份嵌入 脂質體小囊之脂質部份，其中脂質體-M G D F複合物可直 接穩定以對抗M G D F二級結構之伸展，且該組合物具有 改良之上架壽命。 2. 根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物具有 pH 3.0-7.5。 3. 根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該脂質體小囊選 自下列包括： 二油醯基磷脂醯基甘油（D 〇 p G)， 二肉豆蔻醯基磷脂醯基甘油（D Μ P G)， 二棕櫚醯基磷脂醯基甘油（D P P G)， 卵鱗脂酿基甘油， 二油醯基磷脂醯基乙醇胺（D Ο Ρ Ε )， 卵磷脂醯基乙醇胺，二油醯基磷脂酸（D 〇 P A)， 二肉豆蔻醯基磷脂酸（DMPA)， 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 二棕櫚醯基磷脂酸（DPPA)， 二油醯基磷脂醯基絲胺酸（D Ο P S )， 二肉豆蔻醯基磷脂醯基絲胺酸（DMPS)， 二棕櫚醯基磷脂醯基絲胺酸（D P P S )， 卵鱗脂酿基絲胺酸，溶血鱗脂酿基甘油， 溶血磷脂醯基乙醇胺，及 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) ΑΊ規格（210X297公釐） 六、申請專利範圍 溶血磷脂醯基絲胺酸。/ 4. 根據申請專利範圍第1項之組合物’其中MGDF是天然的 人類MGDF，或呈原核或真核宿主細胞表現產物般獲得 〇 5. 根據申請專利範圍第4項之組合物，其中MGDF具有之胺 基酸序列包括下列SEQ ID Nos: 1及2之胺基酸卜1 63 : SEQ ID NO：1： CAGGGAGCCA « CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA _ TTGCTCCTCG 60 TGGTCATGCT ， rCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT 113 Ser Pro Ala Pro Pro 1 5 GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC 161 Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val 10 15 20 CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA 209 Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr . 25 30 35 CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC 257 Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr 40 45 50 CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT 305 Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp lie Leu Gly Ala Val Thr Leu 55 60 65 CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC 353 Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys 70 75 80 85 CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT 401 Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu 90 95 100 GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG 449 Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg 105 110 115 ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC 497 Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala lie Phe Leu Ser Phe Gin His 120 125 130 -2 - I ____ I . ' ·. 國國家標準(CNS ) A40Ji- { 22^X29;·^« ) A8 B8 C8 D8 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC 545 Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr 135 140 145 CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC 593 Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 150 155 160 165 TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC C CAAACAGGAC TTCTGGATTG 641 Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu 170 TTGGAGACAA ACTTCACTGC CTCAGCCAGA ACTACTGGCT CTGGGCTTCT GAAGTGGCAG 701 ' CAGGGATTCA GAGCCAAGAT TCCTGGTCTG CTGAACCAAA CCTCCAGGTC CCTGGACCAA 761 ATCCCCGGAT ACCTGAACAG GATACACGAA CTCTTGAAIXS GAACTCGTGG ACTCTTTCCT 821 / \ GGACCCTCAC GCAGGACCCT AGGAGCCCCG GACATTTCCT CAGGAACATC AGACACAGGC 881 TCCCTGCCAC CCAACCTCCA GCCTGGATAT TCTCCTTCCG CAACCCATCC TCCTACTGGA 941 CAGTATACGC TCTTCCCTCT TCCACCCACC TTGCCCACCC CTGTGGTCCA GCTCCACCCC 1001 CTGCTTCCTG ACCCTTCTGC TCCAACGCCC ACCCCTACCA GCCCTCTTCT AAACACATCC 1061 TACACCCACT CCCAGAATCT GTCTCAGGAA GGGTAAGGTT CTCAGACACT GCCGAGATCA 1121 GCATTGTCTC GTGTACAGCT CCCTTCCCTG CAGGGCGCCC CTGGGAGACA ACTGGACAAG 1181 • · :·:·· ATTTCCTACT TTCTCCTGAA ACCCAAAGCC CTGGTAAAAG GGATACACAG GACTGAAAAG 1241 . / GGAATCATTT TTCACTGTAC ATTATAAACC TTCAGAAGCT ATTTTTTTAA GCTATCAGCA 1301 ATACTCATCA GAGCAGCTAG CTCTTTGGTC TATTTTCTGC A 1342 SEQ ID N0:2: Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1 5 10 15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val 20 25 30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu 35 40 45 Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp lie Leu 50 55 60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin 65 70 75 80 -3- 本紙张準;CNS ) Α4· (2)0乂297公簸） (#先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 A8 B8 C8 ___ D8 穴、申清專利範圍 Leu Gly Pr〇 Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin 85 90 95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu 100 105 110 Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala lie Phe 115 120 125 Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu 130 - 135 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 145 150 155 160 Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu 165 170 6.根據申請專利範圍第4項之組合物，其中MGDF具有之胺 基酸序列包括根據申請專利範圍第5項所定義之s EQ ID Nos:l及2之胺基酸卜163 ° 經濟部中央標準局貝工消費合作社印^ 7根據申請專利範圍第1項·之組合物，其中MGDF是經化學 修飾之MGDF。 8.根據申請專利範圍第7項之組合物’其中經化學修飾之 MGDF 是聚乙二醇化之 MGDF(PEG-MGDF)。 9根據申請專利範圍第8項之組合物’其中P E G · M G D F係 以聚乙二醇聚乙二醇化的。 -4- 六、申請專利範圍 一 10·根據申請專利範圍第9項之组合物，其中p E G - M G D F是 單-聚乙二醇化之MGDF (mPEG-MGDF)。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} η·根據申請專利範圍第1 0項之組合物，其中PE G基團係枯 附至其Ν -末端。 12. 根據申睛專利範圍第1項之組合物，其中該組合物含有藥 學上可接受之載劑。 13. 根據申s青專利範圍第1項之組合物，其中該蛋白質係由大 腸桿菌衍生之MGDF，其包括根據申請專利範圍第5項所 定義之SEQ ID Nos: 1及2之胺基酸1 - 1 6 3，其中該脂質體 小囊是DMPG，且其中該組合物具有dmPG:MGDF 1 0 0 : 1比例’且p Η 5 · 0並含有1 〇 m Μ醋酸鈉，5 Q/〇山梨醇 〇 14. 根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該蛋白質是單_ 聚乙二醇化之大腸桿菌衍生的MGDF (mPEG-MGDF)， 其中該脂質體小囊是DMPG，且其中該組合.物具有 DMPG:mPEG-MGDF 100:1 比例，且pH 5.0 亦含有 10 mM酷酸納，5%山梨醇。 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 15_根據申請專利範圍第1項之组合物，其中該蛋白質是由 CHO·衍生之MGDF，其包括根據申請專利範圍第5項所 定義之SEQ ID Nos: 1及2之胺基酸1-163，其中該脂質體 小囊是DMPG，且其中該組合物具有DMPG:MGDF 1 0 0 : 1比例，具有p Η 5 · 0且含有1 〇 m Μ醋酸鈉，5 %山梨 醇。 16.—種製備脂質體-蛋白質組合物之方法，此方法包括將 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公着） 、申請專利範圍 B8 C8 D8 經濟部令央標隼局員工消費合作社印製 MGDF與預成之完整磷脂脂質體小囊混合，其中該脂質 體小囊係負電之磷脂組成，其中該組合物具至少2 5 : i ( 莫耳：莫耳）比例之脂質體：MGDF，以形成脂質體-蛋 白質複合物，其中MGDF僅一部份嵌入脂質體小囊之脂 質部份，其中脂質體-MGDF複合物可直接穩定以對抗 MGDF二級結構之伸展，且該组合物具有改良之上架壽 命’並得到此脂質體-蛋白質组合物。 Π.根據申請專利範圍第i 6項之方法，4中該組合物具有 PH30-7.5。 18.根據申請專利範圍第丨6項之方法，其中該脂質體小囊係 製備自選自下列之脂質，包括 二油醯基磷脂醯基甘油（D Ο P G)， 二肉豆蔻醯基磷脂醯基甘油（DMPG)， 二棕櫚醯基磷脂醯基甘油（D P P G)， 卵鱗脂酿基甘油， 二油醯基磷脂醯基乙醇胺（D Ο P E)， 卵磷脂醯基乙醇胺，二油醯基磷脂酸（D Ο P A)， 二肉豆蔻醯基磷脂酸（DMPA)， 二棕榈醯基磷脂酸（DPPA)， 二油醯基磷脂醯基絲胺酸（DOPS)， 二肉豆蔻醯基磷脂醯基絲胺酸（D Μ P S)， 二棕櫚醯基磷脂醯基絲胺酸（D P P S )， 卵磷脂醯基絲胺酸，溶血磷脂醯基甘油， i谷血鱗脂酿基.乙醉胺》及 6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閣讀背面之注意事項再填寫本頁) t- 、ya Γ 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A8 BS C8 __ _____ D8 六、申請專利範圍 ^ 〉谷血鱗脂驢基絲胺酸。 19. 根據申請專利範圍第16項之方法，其中mgdf是天然人 類MGDF或得自原核或真核宿主細胞表現之產物。 20. 根據申請專利範圍第19項之方法，其中mgdf具有之胺 基酸序列包括根據申請專利範圍第5項所定義之s EQ m Nos:l及2之胺基酸1-163。 21. 根據申請專利範圍第丨9項之方法，其中M G D F具有之胺 基酸序列包括根據申請專利範圍第5項所定義之s eq id Nos:l及2之胺基酸1-163。 22. 根據申請專利範圍第丨6項之方法，其中M G D F係經化學 修飾之MGDF ^ 23. 根據申請專利範圍第2 2項之方法，其中經化學修飾之 MGDF 是聚乙二醇化之 MGDF (PEG-MGDF)。 24. 根據申請專利範圍第2 3項之方法，其中p e g - M G D F係以 聚乙二,醇的聚乙二醇化的。 25. 根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中的ρ ε G - M G D F是 單-聚乙二醇化之MGDF (mPEG-MGDF)。 26. 根據申請專利範園第2 5項之方法，其中p e G基團係粘附 至其N -末端。 27. 根據申請專利範圍第2 5項之方法，其中該組合物含有藥 學上可接受之載劑。 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS )八4規格（210x297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
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