JPH0334920A - リポソームに結合及至組合わされた生物活性化合物及びそれを含有する医薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分軒 本発明は、生物活性化合物、例えば、トランスフォーミ
ンググ口ウスファクター乃至はトランスフォーミング成
長因子（ｊｔａｎｓｌｏｒｍｉｎｇ　　ｇｒｏｗｔｈｆ
ａｃｔｏｒ）　タイプβ（以下ｒＴＧＦ−β」という）
及びコロニー刺激因子、例えばマクロファージコツ ０ニー刺激因子（以下ｒＭ−ＣＳＦＪという）を用いて
患者を治療する方法に関する。更に、本発明は、リポソ
ームと結合乃至組合わされた生物活性化合物、例えば、
リポソームと結合乃至組合わされたＴＧＦ−βやリポソ
ームと結合乃至組合わされたＭ−Ｃ３Ｆなどの組成物に
も関する。より詳しくは、本発明は、患者への投与のた
めの薬学的に許容される担体と共にイオン的に電荷を有
するリポソームと結合乃至組合わされた生物活性化合物
を含有する医薬に関する。その様な医薬は、リポソーム
と結合乃至組合わされたＴＧＦ−βやリポソームと結合
乃至組合わされたＭ−ＣＳＦであり得る。

従来の技術 生物活性化合物、例えば、ＴＧＦ−βやＭ−ＣＳＦなど
は、各種の疾病の治療に投与することができる。しかし
ながら、斯かる生物活性化合物の投与は、その眼られた
生物学的利用率により妨げられている。−旦、生物学的
物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａａｇｅｎｔ）が、血流に吸収
され又は注射されると、初期分布の速度、程度およびパ
ターンは、とりわけ該薬物の物理化学的特性により決定
される。生理学的ｐＨにおいて電荷を示す化合物は、目
標とする領域に少ない量でしか到達しないであろう。例
えば、ＴＧＦ−βは、その正電荷により、細胞膜例えば
血管膜に付着し、或いは血漿蛋白例えばアルブミン、そ
の他部ｔ１Ｍ、中の他の成分に付着し、その半減期及び
生物学的活性が減少してしまう。同様に、Ｍ−ＣＳＦの
負電荷もその目標とする部位に到達する能力を損なう。

血液システムを通して投与することにより生物学的利用
率の減少が更に悪化する。なぜならば、血流中の化合物
は生体の浄化機構（Ｃｌｅａｒｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓ
ｍ）の影響を受けやすいからである。近年、リポソーム
中に各種の生物学的活性物質を包み込むこと（ｅｎｔｒ
ａｐｍｅｎｔ）により、その様なホス）・の浄化機構か
ら保護する目的でリポソームか使用されている。

しかしながら、リポソーム中に生物学的活性物質（ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ａｇｅｎｔｓ）
を包み込むには、大量の該物質を必要とする。これは、
ＴＧＦ−βのように製造費が高く且つ非常に少量しか製
造できないペプチドについては、問題である。例えば、
従来の単離方法に比し回収率が５倍になると記載されて
いる改良されたＴＧＦ−β製造法であっても、収量はヒ
ト血小板単位当たりわずか２．５μｇでしかない。コー
ン（Ｃｏｎｅ）ら、”血小板から０’）　ｌ□　ランス
フォーミング成長因子タイプβの改良された精製法”、
アナリティカル　バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　　１６８　：　
７１７４　（１９８８）。リポソームに包み込まれた生
物学的物質の製造時に比較的大量の生物学的活性物質が
水層に分散してしまうので、この方法は、ＴＧＦ−βの
ように容易に大量入手できないペプチドに適用するには
適切ではない。

加えて、リポソーム中に生物学的物質を包み込むことは
、細胞膜」二のレセプターにまず粘合することにより作
用するＴＧＦ−βやＭ−Ｃ３Ｆなどの生物学的物質をリ
ポソーム表面に結合乃至組合わせること比し、劣ってい
る。なぜなら、リポソームの水層内に取り込まれた物質
は細胞レセプターに接近できないからである。近年の研
究によれば、ＴＧＦ−β及びＭ−Ｃ３Ｆは、事大、広い
範囲の各種細胞タイプ上に見出だされる細胞レセプター
に結合することが示されている。ウェイクフィールド、
エル、エム、　　（Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ、　　Ｌ、Ｍ、
）　　ら、トランスフォーミング成長因子βに対する細
胞レセプターの分布及びモジュレーション“　　Ｊ、　
　Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏ、１０５：９６５−９７５　（１
９８７）。スタンレー、イー、アール、　　（Ｓｌａｎ
ｌｅｙＥ、　Ｒ，）　　ら、”コロニー刺激因子による
マクロファージ産生の調節”　「モノニュークリアー　
ファコ１ サイツ　−　ファンクショナルアスペクッ（Ｍｏｎｏ−
ｎｕｃｌｅａｒ　Ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ　−Ｆｕｎｃｔ
ｉｏｎａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ）Ｊ、Ｐａｒｔ　ｌ、アー
ル、ヴアン　ファース（Ｒ４ａｎ　Ｆｕｒｔｈ）編（１
９８０）；バイリーン、ピー、ヴイー（Ｂｙｒｅｎｅ、
　　Ｐ、　Ｖ、　）ら、“ネズミ組織におけるコロニー
刺激因子（Ｃ３Ｆ−１）に対するレセプターを有する細
胞のこの分布”　Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ。

９１　：　８４８　（１９８１）。この様に、ＴＧＦβ
及びＭ−ＣＳＦをリポソーム中に包み込むことにより、
これら生物活性物質（ｂｉｏａｃｊｉｖｅ　ａｇｅｎｔ
ｓ）の生物学的活性が損なわれ得る。

従って、ＴＧＦ−β及びＭ−ＣＳＦのような生物活性物
質を患者に投与する方法であって、目標部位に到達する
生物活性物質の量を最大にし、生体のＩＰ化機（１１１
から生物活性物質を保護し、且つ生物活性物質の生物学
的活性を維持し、しかも少量でしか得られないペプチド
に関して使用するのに適切である方法の開発が望まれて
いる。また、そ２ の様な方法に使用できる化合物及び組成物の開発も要請
されている。

発叩の開示 本発明は、生物活性物質を使用して患者を処置する方法
を提供することにより従来技術の問題点および障害事項
を解決するものである。この方法では、生物活性物質と
リポソームとが結合乃至組合わされて集合体を構成して
おり；該集合体は、外表面を有するリポソームと生物活
性物質とからなっており；生物活性物質は、該集合体の
薬理的有効量を患者に投与した場合に生物学的活性が実
質的に低下しないように、リポソームの外表面と結合乃
至組合わされており；そして、該集合体を患者に投与す
るという構成からなっている。

本発明は、ＴＧＦ−βにより患者を処置する方法をも提
供する。この方法では、ＴＧＦ−βとリポソーｌ、と力
性１ｉ合乃至組合わされて集合体を１１１４成しており
；該集合体は、外表面を有するリポソームとＴＧＦ−β
とからなっており；該集合体の薬理的有効量を患者に投
与した場合に生物学的活性が実質的に低下しないように
、ＴＧＦ−βは、リポソームの外表面と結合乃至組合わ
されており；そして、該集合体を患者に投与するという
構成からなっている。

本発明は、ＴＧＦ−βにより患者を処置する方法の好ま
しい実施態様をも提供する。この態様においては、マイ
ナスに帯電したリポソームが、ＴＧＦ−βとリポソーム
とが結合乃至組合わされて集合体を形成する様に、使用
される。

さらに、本発明は、ＴＧＦ−βとリポソームとが結合乃
至組合わされた集合体からなる組成物又は材料をも提供
する。

本発明は、さらに、ＴＧＦ−βとリポソームとが結合乃
至組合わされた集合体の薬理的有効量と薬理的に許容さ
れるキャリアーとからなる医薬組成物をも提供する。

本発明は、さらに、Ｍ−Ｃ３Ｆにより患者を処置する方
法をも提供する。この方法では、Ｍ−ＣＳＦとリポソー
ムとが結合乃至組合わされて集合体を構成しており；該
集合体は、外表面を有する有するリポソームとＭ−Ｃ３
Ｆとからなっており該集合体の薬理的有効量を患者に投
与した場合に生物学的活性が実質的に低下しないように
、ＭＣＳＦは、リポソームの外表面と結合乃至組合わさ
れており；そして、該集合体を患者に投与するという構
成からなっている。

本発明は、Ｍ−ＣＳＦにより患者を処置する方法の好ま
しい実施態様をも提供する。この態様においては、プラ
スに帯電したリポソームが、ＭＣ３Ｆとリポソームとが
結合乃至組合わされて集合体を形成する様に、使用され
る。

さらに、本発明は、Ｍ−ＣＳＦとリポソームとが結合乃
至組合わされた集合体からなる組成物又は飼料をも提供
する。

５ 本発明は、さらに、Ｍ−３ＣＦとリポソームとが結合乃
至組合わされた集合体の薬理的有効量と薬理的に許容さ
れるキャリアーとからなる医薬組成物をも提供する。

本発明のその他の目的および利点は、一部は以下の記載
に明記されており、また一部は以下の記載に基いてもし
くは本発明の実施により知り得るところである。また、
本発明の目的および利点は、特に特許請求の範囲に記載
された手法および組み合わせにより、実現され、達成さ
れる。

また、上記の一般的記述および下記の詳細な記述は、い
ずれも例示的な説明を行なうためのものであり、特許請
求の範囲に規定された本発明を限定するものではない。

以下に、添付図面を参照しつつ、本発明の好ましい実施
態様を詳細に説明する。

本川細書において、生物活性物質とは、患者に投与され
た集合に、細胞応答を引き起こすペプチ６ Ｆ類、ポリペブチＦ類、蛋白質類および糖蛋白質類を意
味する。生物活性物質の使用により観察される細胞応答
は、増殖的効果、非増殖的効果、分化から、さらには、
免疫グロブリンの分泌抑制、副腎ステロイド産生抑制な
どの他の効果にまで及ぶ。特に好ましい生物活性物質は
、ＴＧＦ−βおよびＭ−ＣＳＦであるが、本発明は、こ
れらの特定の物質の使用に限定されるものではない。

本川細書において、ＴＧＦ−βとは、ｌ・ランスフォー
ミング　グロウス　ファクター、タイプベータとして知
られるホルモン的に活性なポリペプチドを意味する。仔
か数年前に発見されて以来、ＴＧＦ−βを同定し、構造
的に特徴イ１けるために、多くの進展がなされている。

ＴＧＦ−βは、ジスルフィド結合により結ばれた２本の
同一のポリペプチド鎖（Ｍ　ｒ　１２．５００）からな
っている。原分子の活性は、ジスルフィド基の還元より
、失なわれる。

ＴＧＦ−βは、正常な組織中のみならず、トランスフオ
ームされた細胞中にも存在するありふれた分子である。

特に、血小板は、比較的大量のＴＧＦ−β（細胞１個当
たりのＴＧＦ−β分子約１５００）を含んでいる。この
ことは、ＴＧＦ−βが傷の治癒に一定の役割を果たして
いるとの見解を裏イマ１けるものである。

しかしながら、ＴＧＦ−βは、多機能の成長因子である
ことが見出された。例えば、ＴＧＦ−βは、線維非細胞
および骨芽細胞に対して増殖的効果を示すのに対し、線
維非細胞、」二皮細胞、Ｔリンパ球および骨芽細胞に対
して反増殖的効果を示す。さらに、ＴＧＦ−βは、増殖
に関連しない効果をも示す。すなわち、ＴＧＦ−βは、
免疫グロブリンの分泌および副腎ステロイド産生を抑制
することが見出された［スポーソおよびロバーツ（Ｓｐ
ｏｒｎ　ａｎｄ　Ｒｏｂｅｒｔｓ　）、“ペプチド成長
因子は多機能である”、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）
　３　Ｂ　２　：２１７−２１９　（１９８８年３月１
７日）。成長型子作用の性質は、他の物質の行在に依行
するかも知れないとの説か提出されている。すなわち、
ＴＧＦ−βは、血小板に出来する成長因子の存在下には
、線維芽細胞を刺激するが、」二皮成長因子の存在下に
は、線維芽細胞の成長を抑制するというものである。

さらに、ＴＧＦ−βは、脂質生成、筋発生、・円形成お
よび」二皮性分化の諸プロセスの発現の強力なレギュレ
ーターであると信じられている。研究者達は、これらの
多細胞作用の生化学的基礎の少なくとも一部は、ＴＧＦ
−βが細胞外マトリクスの構造を変化させる能力を有し
ていることによるものとの説を提案している。［例えば
、ジョーンマツザグ（Ｊｏａｎ　Ｍａｓｓａｇｕｅ　）
による“ザ　トランスフォーミング　グロウス　ファク
タース”およびジョン　Ｌ、ウアングおよびイエンーミ
ンスー（Ｊｏｌｉｎ　Ｌ、Ｗａｎｇ　ａｎｄ　Ｙｅｎ−
Ｍｉｎｇ　ｌ１ｓｕ）による］　９ “ネガティブ　レギュレーターズ　オブ　グロウス“参
照。これらは、“オンコジーンズ　アンドグロウス　フ
ァクター　、ラルフ　Ａ、ブラッドショウおよびステイ
ープ　プレンティス（Ｒａｌｐｈ　Ａ、Ｂｒａｄｓｈａ
ｗ　ａｎｄ　Ｓ［ｅｖｅ　Ｐｒｅｎｔｉｓ）編（１９８
７）に記載されている］。

本発明に特に関連するＴＧＦ−βの機能の一つは、その
免疫系制御能力である。最近の研究によれば、Ｔ　−Ｉ
Ｊンパ球の抑制剤として、ＴＧＦ−βは、ペプチドであ
るンクロスボリンＡに比して、モルベースで少なくとも
１０４倍も強力であることが示されている［前出のスポ
ーソおよびロバーツを参照］。この抑制効果は、リュー
マチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性糖
尿病、自己免疫性甲状腺炎、多発性硬化症およびその他
の自己免疫疾患の如き症状の活魚に際して、ＴＧＦ−β
を有用なものとする可能性を与えるものである。さらに
、ＴＧＦ−βは、同種移植を容易な０ ものとし、且つある柿の腫瘍細胞を抑制する。

セイエディンら（Ｓｅｙｅｄｉｎ　ｅｔ　ａｔ　）、　
“カーティラージ−インデユースト　ファクターＢ　イ
ズア　ユニーク　プロテインズ　ストラクチュラリアン
ド　ファンクショナリー　リレイテッドトウ　トランス
フォーミング　グロウス　ファクター−β”　、Ｊ、ｏ
ｆ　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　２６２　（５）　　：１
９４６−４９　（１９８７）に示される様に、生理的ｐ
　Ｈにおいて、ＴＧＦ〜βのｐｒは９．５なので、ＴＧ
Ｆ−βは、全体としてプラスのチャージを有している。

本明細書においては、“全体としてプラスのチャージ”
とは、ポリペプチドのプラスのイオン化状態を意味して
いる。ポリペプチド類は、特定のｐ　Ｈで一定のチャー
ジを右するアミノ酸により構成されているので、個々の
４１４戊成分のイオン化状態は、ポリペプチドに全体と
してプラスのチャージまたはマイナスのチャージを与え
る。ＴＧＦ−βのアミノ酸紹成は、全体とじてマイナス
のチャージを与えるものとなっている。

本明細書において、“Ｍ−Ｃ３Ｆ”なる用語は、特定タ
イプのコロニー刺激因子（ｃｏｌｏｎｙ−ｓｌｉｍｕｌ
ａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）に関連している。コロニー
刺激因子は、造血細胞の産生を制御する糖蛋白質類であ
る。少なくとも４種の明確に相違するコロニー刺激因子
が、造血細胞前駆体からの顆粒球および／またはマクロ
ファージの堆殖および分化を制御している。

特に好ましい物質は、マクロファージ　コロニー刺激因
子（Ｍ−ＣＳＦＳＣ３Ｆ−１としても知られている）で
ある。これは、単核性食細胞系（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａ
ｒ　ｐｈａｇｏｃｙｔｅ　ｌｉｎｅａｇｅ　ｃｅｌｌｓ
　）の生存、増殖および分化を選択的に刺激するもので
ある。また、他の研究によれば、Ｍ−Ｃ３Ｆは、成熟し
た単球のエフェクター機能、例えば、抗菌活性、リンホ
カインにより誘起される肝癌消滅活性などをも刺激する
ことが示されている。これらについては、下記の文献を
参照されたい。

＊スタンリーおよびガルバー１−　（Ｓｊａｎｌｅｙ、
Ｅ、Ｒａｎｄ　Ｇｕｌｂｅｒｌ、　Ｌ、　Ｔ、、“メソ
ッド　フォー　ザ　ピュリフィケーション、アッセイ、
キャラクタライゼイション　アンド　ターゲット　セル
　バインディング　オブ　コロニー−スティミュレイテ
ィング　ファクター［Ｃ３Ｆ−１］”、ジャーナルオブ
　イミュノロジック　メソラス　４２：２５３−２８４
　（１９８１）； ＊カルパッジら（Ｋａｒｂａｓｓｉ　Ａ、、ｅｔ　ａｌ
　）、“エンハンス）・　キリング　オブ　カンディダ
　アルビカンス　バイ　ムーリン　マクロファージズ　
トリーティド　ウィズ　マクロファージ　コロニスティ
ミュレイティング　ファクタｍ：エビデンス　フォー　
オーグメンティッド　エクスプレッション　オブ　マン
ノース　レセプターズ“ジャーナル　オブ　イミュノロ
ジー１３９：４１７−４．２１　（１９８７）； ３ ＊メトカーフ（Ｍｅｌｃａｌｆ　Ｄ　）、“ザ　モレキ
ュラバイオロシー　アンド　ファンクンヨンズオブ　ザ
′　グラニュロザイト　マクロファージコロニー−ステ
ィミュレイティング　ファクターズ”、ブラッド　６７
　：　２５７　（１９８６）；＊ラルフおよびナコイン
ズ（Ｒａｌｐｈ、Ｐ　ａｎｄＮａｋｏｉｎｚ、　Ｉ　）
、“スティミュレイション　オブマクロファージ　チュ
ーモリサイダル　アクティビティ−バイ　グロウス　ア
ンド　ディファレンシエイション　ファクター　Ｃ３Ｆ
−１”、セルラー　イミュノロジー　１０５　：　２７
０２７９　（１９８７）。

本発明は、すべての形態のＭ−ＣＳＦ、すなわち、Ｍ−
ＣＳＦ全体そのものならびに標準的な生化学的或いは組
替え技術により切断されもしくは他の方法で加工された
Ｍ−ＣＳＦを包含する。この点については、１９８９年
２月１０に高橋らによりなされた米国特許出願第０７／
３０４．６９２号（発明４ のη称：ヒューマン　コロニー−スティミュレイティン
グ　ファクターズ）を参照されたい。

研究によれば、生理的なｐ　Ｈにおいては、ヒトのＭ−
ＣＳＦは、ｐＩ４．８および全体としてマイナスのチャ
ージを示すことが明らかになっている。同様に、切断さ
れた形態のヒトＭ−Ｃ３Ｆは、ｐＩ４，８を呈すること
が示されている。

この様な組替え手法は、１９８９年２月１目になされた
高橋らの米国特許出願第０７／３０４．６９２号（発明
の名称：ヒユーマン　コロニー−スティミュレイティン
グ　ファクターズ）に開示されている。

本明細書にいう“全体としてマイナスのチャージ”とは
、該物質のマイナスのイオン化状態を意味する。“全体
としてプラスのチャージ”に関して上記に述べた様に、
全体のチャージは、全体を構成するアミノ酸類により決
まるものである。糖蛋白質の少なくとも一部を１１′４
成するアミノ酸は、該糖蛋白質に特定のチャージを与え
る。

本明細書にいう“集合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ　）“と
は、複数の単位または粒子が集合して、一つの単一体（
ｂｏｄｙ）　、塊（ｍａｓｓ）或いはその他のグループ
体を構成していることを意味する。本発明は、本発明の
集合体を形成する単位の数により限定されるものではな
い。

本明細書にいう“結合乃至組合わせ（ａｓｓｏｃｉａ−
ｔｉｏｎ）”とは、結合乃至組合わせ体の部分間の如何
なる柿類の関係をも意味する。

これらの部分は、接近により組合わせられていて、これ
らの部分間に真の接触が存在していなくとも良い。さら
に、これらの部分は、表面−表面接触のような外面的な
接触であっても良い。結合は、より近接した接触からな
っていて、組合わせの一方の成分が、部分的にまたは完
全に、組合わせの他方の成分に埋め込まれて（ｅｍｂｅ
ｄｄｅ＋Ｉ）いても貝い。

本明細書にいう゛リポソーム“は、広い意味に解釈され
るべきものである。脂質小胞（ｌｉｐｉｄｖｅｓｉｃｌ
ｅ　）とも呼ばれるリポソームは、脂質二重層により閉
じ込められた水性コンパートメント有し、その形状は、
球形から長さ方向にのびたものにまでに及ぶ。

リポソームは、水性媒体中に適切な脂質を懸濁させるこ
とにより、形成される。次いで、この混合物を振盪し、
粒径が非常に均一に揃ったリポソームの分散液を得る。

或いは、エタノール中に脂質を含む溶液と水とを急速に
混合することによっても、製造される。この方法は、脂
質を細い針穴から射出することによって、実施できる。

リポソーム製造のために選択した方法が、得られるリポ
ソームの形状を規定する要素の一つとなる。本発明は、
大きな一重膜小胞（ｌａｒｇｅ　ｕｎｉｌａｍｅｌｔａ
ｒｖｅｓｉｃｌｅ　）　、微細な一重膜小胞（ｓｍａｌ
ｌ　ｕｎｉｌａｍｅｌｔａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ　）およ
び多重膜の小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｆａｒ　ｖｅｓｉ
ｃｌｅ　）を含む全ての形態のリポソームの７ 使用を包含するものである。

オリゴラメラ−小胞（ｏｌｉｇｏｌａｍｅｌｌａｒ　ｖ
ｅｓｉｃｌｅ　）とも呼ばれる多重膜小胞は、公知の任
意の方法により、例えば、ロータリー真空蒸発器を使用
する方法により、製造できる。詳細は、スナモトら（Ｓ
ｕｎａｍｏｔｏ，　Ｊ，　ｅｔ　ａｌ）、′ア　ニュー
リー　デイベロップト　イミュノリポソームーアン　エ
ラグホスファチジル　コリン　リポソーム　コーテッド
　ウィズ　プルラン　ベアリング　ボースコレステロー
ル　モイエティー　アンド　ＩｇＭＳ　フラグメンＩ＋
″、Ｂｉｏｃｈｅｍ，　Ｂｉｏｐｈｙｓ，　Ａｃｔａ８
９８　：　３２３−３３０　（１９８７）を参照された
い。

大ぎな一重膜小胞は、神山し法の様な公知の任意の方法
によっても製造できる。例えば、ホープら（Ｈｏｐｅ，
Ｍ．　Ｊ．、　ｅｔ　ａｔ　）、“プロダクション　オ
ブラージ　ユニラメラ−　ベシクルズ　バイ　アラピッ
ド　イクストルージョン　ブロシーデュ８ アー、キャラクタライゼイション　オブ　ザイズ、ディ
ストリビューションズ、トラップ）・　ポリュウムズ　
アンド　アビリティ−　トウ　メインティン　ア　メン
ブレン　ポテンシャル”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｆａ　　８１２：５５−６５（１９８７）を参
照されたい。或いは、小さな一重膜小胞は、音波法の如
き常法により、製造することができる。小さな一重膜小
胞の好ましい製造方法を下記に詳述する。

一般に、リポソームは、例えば、ホスファチジル　コリ
ン、卵レシチン、コレステロールおよびステリルアミノ
などを代表例とする多種の脂質刊料から製造することが
できる。ホスファチジルコリンの様な脂質桐材から製造
されたリポソームは、電気的に中性である。しかしなが
ら、本発明では、マイナスに帯電したリポソームを形成
する脂質類から製造したリポソー１、かより好ましい。

特に限定されるものではないが、ホスファチジルセリン
、ジセチル　ホスフェートおよびシミリストイル　ホス
ファチジン酸が、好ましいマイナス帯電リポソームを形
成する脂質制料の例である。

任意の帯電脂質材料が使用可能であるが、特に好ましい
実施態様においては、ホスファチジル　コリン（Ｐ　Ｃ
）とホスファチジルセリン（Ｐ　Ｓ）とが、マイナス帯
電リポソームを形成するために併用される。ＰＣとＰＳ
との配合比は、任意である。

特に好ましい実施態様では、ＰＣとＰＳとの配合割合は
、モル比で１：］、である。

或いは、ステアリルアミンの様な脂質材料を使用して、
プラスに帯電したリポソームを形成させても良い。

脂質成分は、クロロホルムと混合し、窒素気流下に乾燥
して、薄いフィルムとしても良い。乾燥した脂質材料は
、次いで再水和される。本発明の脂質材料は、好ましく
は室温で３０分間にわたりリン酸塩で緩衝された食塩水
（ｐＨ７．２、Ｃａ　”またはＭ　ｇ　２”なし）を添
加することにより、再度水和される。本発明のリポソー
ムは、再水和された脂質材料の溶ｌｆｆを物理的に振盪
し、小さな一重膜小胞を形成させることにより、得られ
る。

機械的或いは超音波振盪法も採用可能であるが、本発明
の好ましい態様においては、小さな一重膜小胞タイブの
リポソームは、音波振盪機中での１時間にわたる音波処
理および／または溶液の光学的クリアランスが認められ
なくなるまでの音波処理により、形成される。

本発明の一実施態様では、リポソームの外表面は、ＴＧ
Ｆ−βまたはＭ−Ｃ３Ｆの様な生物活性物質と結合乃至
組合わされている。前述のごとく、この結合乃至組合わ
せは、組合わせ体を形成する成分間の如何なる種類の関
係をも意味する。リポソームの外表面は、ＴＧＦ−βま
たはＭ−ＣＳＦへの接近により組合わされていてもよく
、この集合には、両者間に真の接触が存在していなくて
も１ 良い。或いは、リポソームの外表面は、極く表面的な接
触によりＴＧＦ−βまたはＭ−ＣＳＦに組合わされてい
てもよく、この場合には、リポソームの外表面は、ＴＧ
Ｆ−βまたはＭ−ＣＳＦと接触している。また、他の実
施例においては、リポソームの外表面は、ＴＧＦ−βま
たはＭ−ＣＳＦと極めて緊密に組合わされており、この
場合には、ＴＧＦ−βまたはＭ−ＣＳＦは、部分的にま
たは全体的にリポソーム中に嵌まり込んでいる。

ＴＧＦ−βまたはＭ−ＣＳＦとリポソームの外表面との
結合乃至組合わせの程度がどのようなものであれ、粘合
体乃至組合せ体は、ＴＧＦ−βまたはＭ−ＣＳＦをリポ
ソームの水層に完全に包み込むことが実質−にないこと
を理解すべきである。

また、ＴＧＦ−βまたはＭ−Ｃ３Ｆとリポソームとの間
の結合乃至組合わせは、共有結合以外の手段によって達
成されることをも理解すべきである。非具有粘合の利点
は、まず第１に生物活性物質２ 質の最大限の生物学的活性が要求されること、第２に粘
合が単純な手段で達成されることである。

加えて非共有結合は、結合乃至組合わされたペプチドが
リポソームからより容易に解離しうる点でも有利である
。

リポソームとペプチドとの結合乃至組合わせは、幾つか
の点で有利である。リポソームは、長時間循環する性質
を示すので、リポソームに結合乃至組合わされた物質（
ａｇｅｎ＋）は、はとんどの遊離の薬物に比べて血流中
でより長く循環するであろう。

事実、系からのクリアランスの時間定数は、数分から１
日以上であることが報告されている。ジステアロイルフ
ォスファチジルコリンとスフィンゴミエリンを用いて得
られる小さい小胞について、より長い時間が報告されて
いる。ジェイ、エヌ。

ウニインスタイン（Ｊ、　Ｎ、　Ｗｅｉｎｓｆｅｉｎ）
、”癌の診断と治療におけるリポソーム“　　「リポソ
ームスフロム　バイオフィジックス　ツー　セラピュテ
ィックス（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　Ｆｒｏｍ　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃｓ　ｔｏ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）ｊ　、
マーク　ジェイ、　オスｌ−ｏ（ＭａｒｃＪ、　０ｓｌ
ｒｏ）編（１９８７）。

更に、生物活性物質をリポソームと結合乃至組合わせる
ことにより、該生物活性物質の生物学的利用率が向上し
得る。本発明の固体用小胞は、液体小胞に比べ、細胞表
面に吸着（ａｂｓｏｒｂ）する傾向が高く、該生物活性
物質の目標細胞に対する提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｌｉｏ
ｎ）を増大させる。

本発明の好ましい実施態様は、負に帯電したリポソーム
が細胞表面」二の膜レセプターにより捕捉される性質を
利用するものである。即ち、これらのリポソームは、非
食作用細胞（ｎｏｎ−ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃｃｅｌｌｓ
）及び食作用細胞（ｐｈａｇｏｃｙｌｉｃ　ｃｅｌｌｓ
）の双方へのデリバリ−に有効である。

本発明の他の利点は、生物活性物質をリポソームとレソ
合乃至組合わせることにより、ホストの酔素その他の生
理学的浄化機ｈ’／ｉから当該坐物活性物質を保護し得
ることである。このような保護により、当該生物活性物
質の生物学的利用率が向」二し得る。

本発明では、ＴＧＦ−βとリポソームとの集合体及びＭ
−ＣＳＦとリポソームとの集合体はいずれち、生物学的
活性を示した。本川細書において、生物学的活性とは、
生物活性物質が細胞機能を阻害又は１曽進じ、その他何
等かの影響を与えることを指す。既述のごとく、成る状
況下では、ＴＧＦβは、増殖性及び抗増殖性効果並びに
増殖とは無関係の効果を発揮する。ＴＧＦ−βの生物学
的活性は、他のアッセイでも試験できるが、生物学的活
性の指標としては、ＴＧＦ−βの細胞地殖を］Ｓｄ害す
る外質か好ましい。特に、ＴＧＦ−βの生物学的活性は
、前記コーン（Ｃｏｎｅ）らにより記載されたミンク肺
」１皮細胞アッセイによって、４１す定することかでき
る。このアッセイは、ミンク１１市」二皮細胞の単層Ｊ
−ｊ／７殖がＴＧＦ−βの存在下で阻害され５ るという観察結果に基づくものである。その詳細を、後
記実施例３に示す。

同様に、記述のごとく、Ｍ−ＣＳＦの生物学的活性とは
、Ｍ−Ｃ３Ｆが細胞機能を阻害又は増進し、その他何等
かの影響を与えることを指す。本発明のＭ−Ｃ３Ｆの活
性は、数種の方法により測定できるが、Ｍ−ＣＳＦの細
胞１曽殖を向上させる能力が好ましい。特に、Ｍ−ＣＳ
Ｆの生物学的活性は、ストラスマン（Ｓｌｒａｓｓｍａ
ｎｎ、　Ｇ、　）　　ら、１タイプβ）・ランスフォー
ミング増殖蛭子によるコロニー刺激因子１−依存性マク
ロファージプリカーザー増殖“、ジャーナル・オブ・イ
ミュノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　１ｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ）　　１４０　（８）　　：　２６４５−２６５
１　（１９８８）に記載のアッセイにおいてＣ３Ｈ／Ｈ
ｅＪネズミ骨髄細胞を用いてｉｕす定できる。

本川細書において、「薬学的に有効な量」なる用語は、
細胞機能を阻害又は堆進し、その他何等６ かの影響を与えるのに有効な生物活性物質の開を意味す
る。従って、該用語は、次の疾病に限定されるものでは
ないが、たとえば、リウマチ様関節炎、全身紅斑性狼瘉
、自己免疫性糖尿病、自己免疫性甲状腺炎、多発性硬化
症その他の疾病の治療に有効な量を包含するものである
。生物活性物質は、成熟単球のエフェクター機能、例え
ば抗真菌活性（Ａｎｔｉｌｕｎｇａｌ　ａｃｔｉｖｉｔ
ｙ）　、リンホカイン−誘発性殺肺瘍性活性を刺激する
のにも使用できる。

加えて、生物活性物質は、血液単球の−１−昇を必要と
する病気、例えば白血球減少症の治療にも使用できる。

生物活性物質が使用できる他の状態としては、例えば、
同種移植の容易化、肺癌細胞の抑制等が例示できる。

当業者であれば、公知の方法を用いて、本発明の生物活
性物質の投与量を決定することができる。

そのような方法としては、例えば、グツドマン（Ｇｏｏ
ｄｍａｎ）及びギルマン（Ｇｉｌｍａｎ）、ザ・ファー
マコロジカル・ベイシス・オブ・セラピュティックス（
Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａ５ｉｓ
　ｏｌ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）第５版（１９７５
）に記載されている。投与量は、確立されたアッセイ及
び慣用的な用量一応答研究を用いて確認できる。治療の
ための適切な投与量を更に細かく検討することは、当業
者によりルーチンで行われており、過度の実験を行うこ
となく通常行われている範囲の作業として行うことがで
きる。

本明細書に記載の組成物乃至化合物とともに適当な薬学
的に許容される担体、希釈剤及びアジュバント類を用い
て、患者の治療用に使用される所望の組成物を製造でき
することができる。本発明の医薬組成物は、上記生物学
的活性物質を、固体またはｌ皮体の薬学的に許容される
無毒性担体と共に含有する。斯かる薬剤学的担体として
は、殺菌ｌｌｋ体、例えば水及び浦が挙げられ、該油と
しては、石油、動物、植物または合成起源のもの、例え
ばピーナツｌ由、大豆油、鉱抽、１ｌｉＪ１麻油などを
例示できる。医薬組成物が静脈内投与される場合、水が
好ましい担体である。生理食塩水溶ｌ皮、デキストロー
ス及びグリセロールの水溶ｔ＆も液体担体、特に注則溶
液用の担体として使用できる。適当な賦形剤としては、
澱粉、グルコース、ラフ）・−ス、スクロース、ゼラチ
ン、モルト、コメ、小麦粉、■粉、シリカゲル、炭酸マ
グネシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸
すトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、
塩化すｌ・リウム、乾燥スキムミルク、グリセロールプ
ロピレングリコール、水、エタノールなどを例示できる
。またこれら組成物は、溶／ｌｋ　％　！ＮＪ’：濁液
、錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、徐放性製剤等の形態を
取り得る。適当な薬剤学的担体は、イー、ダブリュ。

マーチン（Ｅ、Ｗ、　Ｍａｒｔｉｎ）、による「レミン
トンズ・ファーマス−ティカル・サイエンシス（Ｒｅｍ
ｉｎｇｔｏｎｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃ
ｉｅｎｃｅｓ）　Ｊに記載されてい３つ る。斯かる組成物は、患者に投与するのに適切な形態と
なるように、適当な量の担体と有効な治療量の活性成分
を含有する。静脈内注射が最も有効な投与方法であるが
、他の方法例えば注射、経口または非経口投与も採用で
きる。

本発明の化合物は、患者の治療に使用できる。

ここに、「患者」はその最も広い意味で使用するものと
し、ヒ）・を含む哺乳類を意味し、さらには、各種実験
動物例えば犬、猫、モルモット、マウス、ラットなどを
包含する。

実施例 以下、本発明を下記実施例により、更に詳しく説明する
が、これら実施例は本発明を例示するためのみのもので
ある。

実施例１ リポソーム、ＴＧＦ−β及びＴＧＦ−β−リポソーム集
合体の製造 ０ 小さい一重膜小胞タイブリポソームを、卵Ｌａ−レシチ
ン（フオスファチジルコリン、ｐｃ）及び脳フォスファ
チジルセリン（ｐｓ）　　［アヴアンティ・ポーラ−・
リピズ・インコーホレーテッド（＾ｖａｎｔｉ　Ｐｏ１
ａｒＬｉｐｉｄｓ、　　Ｉｎｃ、、Ｐｅｌｈａｍ、Ａｌ
ａｂａｍａ）から胴入］、及び放射標識されたフオスフ
ァチジルコリン、Ｌ−α−［ジパルミトイル−１１４Ｃ
］フオスフアチジルコリン（１０７ｍ　　Ｃｉ／ｍＭｏ
１）［ニュー・イングランド・ニュウクリアー（Ｎｅｗ
　Ｅｎｇｌａｎ＋Ｉ　Ｎｕｃｌｅａｒ）からＵＫ入コを
用いて製造した。中性リポソームは、ＰＣを単独で用い
て調製した。マイナスに帯電したリポソームは、ＰＣと
ＰＳとを１＝１モル比で混合することにより調製した。

ＰＣ及びＰ　Ｃ／Ｐ　Ｓの双方の脂質成分をクロロホル
ムと混合し、窒素気流下薄膜となるまで乾燥した。次い
で、これら二つの混合物を１時間意字下に置き、痕跡量
の残留有機溶媒を除去した。次いで、双方の混合物に、
燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢ　Ｓ　）　　（（：ａ＋を及
びＭｇ−２を含まない）をｐＨ７，２で添加して水和し
、５分間渦振動させ、室温で３０分間膨潤させた。次い
で、該混合物双方をラボラトリ−・サブライズ社（Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙＳｕｐｐｌｉｅｓ、　ｌ１ｉｃｋｖｉ
ｌｌｅ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）製の浴音波処理機中で音
波処理を１時間または溶液の光学的クリアランスがそれ
以上観察されなくなるまで施した。

次いで、このリポソーム組成物を、０．２ミクロンのポ
リカーホネートフィルターで濾過して滅菌した。いくつ
かの実験では、痕跡量の放射標識されたＰＣ１シバルミ
１ヘイル】４Ｃフオスフアチジルコリン［デュポン（［
）ｕｐｏｎｌ）社製］を加えて、双方のタイプの放射標
識リポソームを形成した。

Ｂ、トランスフォーミング成長因子の製造期限切れのヒ
ト血小板から、コーン（Ｃｏｎｅ）ら、血小板からのト
ランスフォーミング成長因子βの改良された精製法”、
アナリティカル　バイオケミスドリー（Ａｎａｌｙｌｉ
ｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　　１６８　：７
１−７４　（１９８８）に記載の方法の改良方法に従い
、ＴＧＦ−βを精製した。上記文献に記載の方法の精製
の最終工程に引き続き、アセトニトリル中のＴＧＦ−β
を、２回シリコーン処理（ｓｉｌｉｃｏｎｉｚｅ）され
たガラスチューブ中に分配し、使用するまで凍粘保存し
た。

Ｃ，ＴＧＦ−βのリポソームへの粘合乃至組合せＴＧＦ
−βを含有する２回シリコーン処理されたガラスチュー
ブを、１５分間凍結乾燥してアセトニトリル量を減少さ
せた。２つのタイプのリポソーム組成物すなわち中性の
ものおよびマイナスに帯電したものを、蛋白質に対する
脂質の比を変化させて、総（ｉｔｓ、２ｍｌとなるよう
に添加した。

いくつかの実験では、放射活性のあるＴＧＦ−β、１２
５１−ＴＧＦ−β［バイオメディカル　チクノロシーズ
　インコーホレーテッド（ＢｉｏｍｅｄｉｃａＴｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ、　　Ｉｎｃ、　　Ｓｌｏｕｇｈｆｏ
ｎ、　ＭＡ）から入手］３ を加えた。次いで、双方の混合物を、穏やかな攪拌下に
４℃にて１時間インキュベートした。

実施例２ ＴＧＦ−β−リポソーム集合体の特性 Ａ、脂質／蛋白質比の選択 リポソームに対するＴＧＦ−βの最大結合を得るための
脂質／蛋白質比を決定するために、１８：１．５５：１
．１６７：１および５００：１（Ｗ／Ｗ）の脂質／蛋白
質比を用いた。第１図に示すように、集合体中に存在す
る１２５１−ＴＧＦ−βの％濃度は、比が１８：１の時
は６０％で、比が１６７：１の時に約７１．５％に増加
した。

１６７　：　１より大きい脂質／蛋白質比では、リポソ
ームに対するＴＧＦ−βの結合の有意なｌｊＱ加は観察
されなかった。従って、脂質／蛋白質比５００　：　１
をＴＧＦ−βとリポソームとの結合に選択した。

４ ＴＧＦ−βとリポソームとの結合の効率および条件を決
定するために、脂質：蛋白質比５００：１の調製試料を
、ＳＶ／−６０回転子を使用するベックマン式超遠心分
離機により、３８０００　＋ｐｍにて１６時間、不連続
的ショ糖密度勾配で遠心分離に供した。

１２５■の存在について、ガンマ−計数管で、放射活性
を１ｉ１１定した。コーン（Ｃｏｎｅ）ら（上記）が記
載するように、指示物質としてミンク）沖」１皮細胞（
ＣＣＬ６４）を用いる阻害４Ｉり定により、ＴＧＦ−β
を測定した。

第１表に示すように、”’　Ｉ−ＴＧＦ−βの泳動パタ
ーンは、ＴＧＦ−βとＰ　Ｃ／Ｐ　Ｓリポソームとの結
合を示した。中性ＰＣリポソームの調製試料における＋
２５　Ｉ−ＴＧＦ−βの泳動パターンは、脂質が存在し
ない調製試料（以下“Ｎ０ＮＥ”とする）における１２
５　Ｉ−ＴＧＦ−βの泳動パターンに類似していた。こ
のことは、ＴＧＦ−βが中性ＰＣリポソームと結合して
泳動するよりも、密度勾配中を非結合の蛋白質として泳
動したことを示す。反対に、負にチャージされたＰ　Ｃ
／Ｐ　Ｓリポソーム調製試料を用いた場合、ＴＧＦ−β
は、タイトなＨｇｈｔ）泳動パターンを示し、ショ糖濃
度５％、１０％および２０％中に泳動した。これらの各
濃度における生物学的に活性なＴＧＦ−βの存在を、ミ
ンク祁上皮細胞（ＣＣＬ−６４）アッセイにより測定す
ると、９４．５ｎｇよりも大きかった。反対に、ＴＧＦ
−βおよびＰＣリポソームを用いる場合、密度勾配にお
けるどのバンドにも２１ｎｇを」１回るＴＧＦ−β活性
は観察されなかった。これらの結果は、１２５　Ｉ−Ｔ
ＧＦ−βの存在が、Ｐ　Ｃ／Ｐ　Ｓ調製試料中の増加し
たＴＧＦβ活性に対応することを示唆する。

Ｐ　Ｃ／Ｐ　Ｓリポソームと結合したＴＧＦ−βは、不
連続ショ糖密度勾配においてタイトな泳動パターンを示
したことに加えて、ＰＣリポソームと桔合したＴＧＦ−
βまたは非結合ＴＧＦ−βに比べると、超遠心分離管に
対する非特異的Ｎ’　Ｓ性を殆んど示さなかった。特に
、第１表の下部に示されるように、ＰＣリポソームまた
はＴＧＦ−βのみの存在において、１２５１．ＴＧＦ−
βは僅か８％であった。従って、ＴＧＦ−β分子の付着
性は、Ｐ　Ｃ／Ｐ　Ｓリポソームと結合した場合、可成
り減少すると思われた。

７ ８ Ｃ，ショ糖密度勾配におけるＴＧＦ−βリポソームの分
布 ２番目の実験において、バクスター−バガード（Ｂａｘ
ｌｅｒ−Ｂａｇｇａｒｄ）の方法、“ショ糖密度勾配の
大規模な調製のための簡便法（Ａ　Ｓｉｍｐｌｅ　Ｍｅ
ｔｈｏｄ　１ｏｒｔｈｅ　Ｌａｒｇｅ−５ｃａｌｅ　Ｐ
ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｕｃｒｏｓｅＧｒａｄ
ｉｅｎｌｓ）”　、Ｆ　Ｅ　Ｂ　Ｓレターズ（ＦＥＢＳ
　Ｌｅｔｔｅｒｓ）２０　（１）、１１７−１１９　（
１９７２年１月）に従って、連続ショ糖勾配を用いた。

ＰＢＳ中の２０％ショ糖の凍結および解凍を３回行ない
、勾配を調製した。ＴＧＦ−βリポソーム約３００μｌ
を勾配溶液４ｍｌに加え、次いで１０００００ｇ、４℃
にて１８時間超遠心分離した。

遠心分離の終了時に、フラクションを０．　２ｍｌずつ
勾配のトップから採取した。ｌ皮体シンチレーション計
数管で１４Ｃについて、ガンマ計数管で１２５■につい
て、放射活性をｉ’１ｌｌｌ定した。コーンらの記載す
る方法（」１記）に従って、指示物質としてミンク肺上
皮細胞を用い、標準として既知量のＴＧＦ−βを用いる
阻害ｌｌす定により、各々のフラクション中の生物学的
に活性なＴＧＦ−βの量を測定した。

第２図および第３図は、ＰＣ／ＰＳ脂質で製造されたリ
ポソーム調製試料に対するＴＧＦ−βの結合およびＰＣ
リポソームでのみ製造されたリポソーム調製試料に対す
るＴＧＦ−βの非結合を示す。

両図において、各フラクションについて３種の測定を実
施した： １４Ｃ−ＰＣ：リポソームのＰＣ成分の存在を示す；１
２５Ｉ−ＴＧＦ−β：ＴＧＦ−βの存在を示す；ＴＧＦ
−β活性：ＴＧＦ−βの存在を確認し、ＴＧＦ−βの生
物活性を示す。

第２図において、リポソーム構成成分としてＰＣのみを
用いた場合、ＴＧＦ−βの存在および活性は、リポソー
ムの存在とは無関係であった。全ての土０のフラクショ
ン（こおいて、ＴＧＦ−βの存在は１０〜１４ｃｐｍ　
Ｘ　１０’であり、ＴＧＦβの活性は０〜７５ｎｇ／フ
ラクションであった。

逆に、第３図において、負にチャージされたＰＣ／ＰＳ
リポソームを用いた場合、ＴＧＦ−βの存在およびＴＧ
Ｆ−βの活性は、Ｐ　Ｃ／Ｐ　Ｓリポソームの存在に大
きく関連した。詳しくは、フラクション４は、最高濃度
の負にチャージされたリポソームを含有し、また最高濃
度のＴＧＦ−β（２５Ｘ　１０３ｃｐｍ）を含有し、最
大のＴＧＦ−β活性（約９２５　ｎｇ）を示した。従っ
て、ＴＧＦβは、負にチャージされたＰ　Ｃ／Ｐ　Ｓリ
ポソームと結合し、中性ＰＣリポソームとは結合しない
ことがわかる。

実施例３ インビトロにおける生物活性の／１１す定ＴＧＦ−βは
、ミンク肝」１皮細胞の刺激を抑制することが知られて
いるので、この作用をイン上５］ ｌ・口で生物活性を測定するために利用した。上記ミン
ク肺」１皮細胞は、ＭＶ−１−ＬＵ細胞（アメリカン　
タイプ　カルチャー　コレクション　ＣＣＬ−６４細胞
）と称され、以下これをＣＣＬ６４細胞とする。詳しく
は、ＴＧＦ−βおよびリポソームに結合したＴＧＦ−β
の活性について、上記細胞の増殖阻害能を評価した。阻
害程度を、ｌ・リチウム化されたチミジンの取り込みに
より測定した。

ダルベツコ修飾イーグル培地（ＧＩＢＣＯ社製、以下“
ＤＭＥＭ”とする）＋１０％牛脂児血清（ＨｙＣ１ｏｎ
ｅ社製）中に維持されたミンク肛上皮細胞（ＣＣＬ−６
４）が、ｌ・リプシンにより分泌されることは、知られ
ている。１ｍｌ当たり２ＸＩＯ４個の細胞を含有する培
地０．　１ｍｌを９６ウ工ル組織培養プレートに植えた
。次いで、アッセイすべきＴＧＦ−βの標準または試料
の一部をプレートに加えた。５％Ｃｏ２雰囲気下に３７
°Ｃ２ で２４時間培養した後、４０μＣｉ／ｍｌのトリチウム
化したチミジンにュー　イングランド　ヌクレア（Ｎｅ
ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）社製、６．７Ｃ
ｉ／ｍＭ）２５μｌでパルスした。約１６時間後、ＤＭ
ＥＭでウェルを３回洗浄し、）・リプシンとともに１５
〜２０分間培養して、細胞を分泌させた。

次いで、半自動細胞採取機（スカトロン（Ｓｋａｔ＋ｏ
ｎ）製）によりガラス紙」二に細胞を集めた。同様のバ
イオアッセイにより、既知の量のＴＧＦ−βの標準＋１
１線を作成した。標準１．ｌＩＩ線で得られた阻害と比
較して、試料中の活性ＴＧＦ−βの量を測定した。

第２表に示すように、３種の処理、即ちＰＣ／ＰＳリポ
ソームのみ、ＰＣ／ＰＳリポソームと１１１１合したＴ
ＧＦ−βおよびＴＧＦ−βのみについてＦＩＮ害率（％
）を測定した。第２表中の一定の存在（ｃｏｎｓｔａｎ
ｔ　ｐｒｅｓｅｎｃｅ）の欄に示すように、３種の溶液
を組織培養プレートに直接分注してそのまま一定の存在
量を保った場合、ＴＧＦ−βおよびリポソームと結合し
たＴＧＦ−βは、それぞれ８２％および９０％の高い阻
害率を示したが、リポソームのみの場合は０％の阻害率
を示した。従って、リポソームと結合したＴＧＦ−βの
生物活性は、ＴＧＦ−βのみの生物活性に対応する。

細胞による吸収に及ぼすＴＧＦ−βとリポソームとの結
合の効果を試験するために、次いで細胞を順次移動させ
た。この実験において、それぞれ３種の処理を施された
同一の細胞培養物を、３０分毎に新しい組織培養プレー
トに順次移した。

リポソームのみで処理された細胞は、各移動後阻害を示
さなかった。しかしながら、ＴＧＦ−βのみおよびリポ
ソームと結合したＴＧＦ−βで処理された細胞の阻害パ
ターンは変化した。ＴＧＦβのみで処理された細胞では
、最初の移動後の阻害率は、移動していない時の阻害率
と本質的に同じであった。しかしながら、２度目の移動
で１（１１書率は有意に低下した。即ち、ＴＧＦ−βで
のみ処理された細胞は、最初の移動で８３％の阻害率を
示したが、２度目の移動では僅か３５％の阻害率を示し
た。３番目、４番目、５番目および最後の移動で、それ
らの細胞は阻害を示さなかった。

従って、最初の移動および２番目の移動で、細胞がＴＧ
Ｆ−β分子を吸収して、それ以降の移動により、細胞は
抗増殖作用を示すのに十分なＴＧＦβを含有しなかった
。

逆に、リポソームと結合したＴＧＦ−βて処理された細
胞は、別の阻害パターンを示した。最初の移動後、細胞
は５４％の阻害率を示したが、これは細胞からのＴＧＦ
−βの漏出によるものと思われる。最後の移動で、細胞
は有意な阻害率を示した。この最総移動後の阻害率８１
％は、ＴＧＦβで処理された細胞の一定の存在時の阻害
率に類似していた。従って、ＴＧＦ−βが順次移動され
、最後の移動でその抗増殖効果を発揮するよう５ に、リポソームがＴＧＦ−βの細胞への結合を阻害する
しのと考えられる。

第２表 ＴＧＦ−βリポソームは、血清中の 刺激されたＣＣＬ−６４細胞の非吸 収性負のシグナルを排出する 対照−５７０８１ＣＰＭ 丈施例４ ６ インビボでコリネバクテリウム　パーブム（Ｃｐａｒｖ
ｕｎ＋）への免反反応にり・１するＴＧＦ−βリポソー
ム集合体の抑制能 肝臓はａ■液を清適する働きをするため、バクテリア感
染は、肝臓の±１を大および肝臓中の白血球数の増加を
もたらす非特異的亜急性の肺炎を惹起することが多い。

リポソームと結合したＴＧＦ−βの活性についてのイン
ビボのアッセイとして、細菌感染により刺激された）ｊ
キ臓細胞の増殖に対するＴＧＦ−βの阻害能を１ｉｔｌ
ｌ定した。

このアッセイにおいて、Ｃ５７Ｂ　Ｌ　／　６として知
られるマウス柿に、加熱殺菌されたコリネバクテリウム
　パーブム（ＣｏＢｎｅｂａｃｌｅｒｉｕｍ　ｐａ＋ｖ
ｕｍ）（ウェルカム　リザーチ　ラボラトリーズｆＷｅ
ｌｃｏｍｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）　　リザーチトライアングル　バーク（Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ　ＴｒｉａｎｇｌｅＰ２ｒｋ）、ノース　カロ
ライナから人手した）０．７または１ｍｇを含−６ｆす
るＰＢ３０．２ｍｌを腹腔内に接種した。２４時間後、
（ａ）ＴＧＦ−β１ｔ１ｇ、（ｂ）ＰＣ／ＰＳリポソー
ム０．　５ｍｇまたは（ｃ）ＰＣ／ＰＳリポソーム０．
　５ｍｇと結合したＴＧＦ−β（１，：５００）　　１
μｇを含有するＰＢ３０゜２ｍｌをマウスに静脈内投与
した。これらの溶液には、ショ糖密度勾配を実施しなか
った。上記の処理を１日間隔で３回繰り返した。

バクテリアで免疫化して６から８回目後、マウスを犠牲
死させた。肝臓の重量を測定し、単一細胞懸濁ｌ夜を分
析して、バクテリアに対する免疫応答の程度を測定した
。得られた結果を第３表に示す。

ＴＧＦ−βの抗増殖作用に基づいて、Ｐ　Ｃ／ＰＳリポ
ソーム０．　５ｍｇと結合したＴＧＦ−β１μｇを投与
されたマウスの肝臓は、肝臓の増大も白血球細胞の増加
も示さないであろうことが予期された。逆に、ＴＧＦ−
β１　ｔｔ　ｇまたはＰ　Ｃ／Ｐ　Ｓリポソーム０．５
ｍｇを投与されたマウスのＢＤｌ’臓は、肝臓の増大お
よび免疫応答増大による白血球細胞の増加を示すであろ
うことが予期された。

尖験■において、リポソームと結合したＴＧＦβで処理
されたマウスは、平均肺臓重量ユ０９±１２ｍｇで、肝
臓中の白血球細胞２Ｂ２Ｘ１０６個であった。これらの
データは、免疫応答阻害率８２％に対応した。逆に、リ
ポソームと粘合していないＴＧＦ−βを投与されたマウ
スは、肝臓重量１６５±３０ｍｇで、肝臓中の白血球細
胞３０８×１０６個であった（阻害率４４％）。リポソ
ームのみを投与されたマウスは、肝臓重量２２４±１０
ｍｇで、肝臓中の白血球細胞４４０ｘ１０６個であった
（阻害率は僅か１０％であった）。

実験Ｈにおいて、リポソームと結合したＴＧＦ−βで処
理されたマウスは、平均肝臓重量１３９±１８ｍｇで、
肝臓中の白血球細胞２２７Ｘ１０６個であった。これら
のデータは、免疫応答増大率９２％に対応した。この阻
害率の値は、ＴＧＦ５つ βを投与されたマウスの場合（肺臓重量１７２±５７ｍ
ｇで、ｊ１キ臓中の白血球細胞３４２ｘ１０６個であっ
た（阻害率３６％））の約３倍であった。

０ 実施例５ リステリア菌（Ｌｉｓｌｅ＋ｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇ
ｅｎｅｓｉｓ）に対する遅延型過敏性（ＤＴＨ） コーフマン（Ｋａｕｌｍａｎｎ）およびバーン（Ｈａｈ
ｎ）、“インビボおよびインビトロにおける細胞内バク
テリアであるリステリア菌に対して特異性を有するＴセ
ルラインの生物学的機能（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＦｕｎ
ｃｊｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅｓ　ｗｉ
ｔｈ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｉｎｔ
ｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｌｉｓｔ
ｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｆｏｇｅｎｅｓ　Ｉｎ−ＶＮ＋ｏ
　ａｎｄ　Ｉｎ−Ｖｉｖｏ）　”　、ジャーナル　オブ
　エクスセルブタ　メゾイカ（ＪＥＸＪｌ、　Ｍｅｄ、
）、１５５．１７５４−１７６５　　（１９８２年６月
）で記載されるように、リステリア菌により感染された
マウスの実験モデルは、バクテリアに対するいる。２重
盲検試験において、Ｃ５７Ｂ１／６として知られている
マウス稲に５Ｘ１０’濃度で生菌を注射した。５〜６０
後、これらのマウスの牌臓を摘出して、単一細胞懸濁液
を調製した。粘盾性細胞を除いた後、同系の受容マウス
（即ち、免疫応答に関し、最初の注射されたマウスと逍
伝的に同一であるマウス）に対して２５Ｘ１０６の濃度
で非粘着性肺細胞を静注した。１６時間後、後で注射さ
れたこれらのマウスを３または４群に分けた。第１群は
ＴＧＦ−β１μｇを含有するＰＢＳｏ、２ｍｌを投与さ
れ、第２群はＰ　Ｃ／Ｐ　Ｓリポソー１．０．　５ｍｇ
を含有するＰＢＳを投与され、第３群はＰ　Ｃ／Ｐ　Ｓ
リポソーム０．５ｍｇと結合したＴＧＦ−β（１：５０
０）　　１Ｆｇを投与され、第４群はＰＢＳｏ、２ｍｌ
のみを投与された。

１時間後、各マウスの右後肢肉Ｈ＋ｌ：に加熱殺菌され
たリステリア菌５Ｘ１０７個を念むＰＢＳ５０１ｔ１を
注射し、対照として、左後肢にＰＢ３５０μｌを注８・
Ｊシた。２４時間後、マイクロメーターで後肢の腫脹を
ｆｌｌｌｌ定した。リステリア菌投与の後肢肉に＋１．
とＰＢＳ投与０後肢肉卸、の厚みの差０．０］ｍｍ３ を１ＤＴＨ単位とした。

ＤＴＨ単位で示される後肢肉Ｍ＋Ｉ−の１庫脹の差は、
ＴＧＦ−βの免疫応答に及ぼす影響に対応する。

即ち、ＴＧＦ−βの抗土曽殖効果は、後肢内証の腫脹の
減少およびＤＴＨ単位数の低下として示される。第４図
および第５図に示すように、ＴＧＦβと結合したリポソ
ームの存在は、後肢の腫脹の有意な減少を惹起した。す
なわち、リポソームのみ（Ｌ　Ｉ　Ｐ）　、ＴＧＦ−β
のみ（ＴＧＦ−β）または対照（ＣＯＮＴ）と比較する
と、リポソームと結合したＴＧＦ−β（Ｌ　Ｔ　）では
、有意に低下したＤＴＨ単位を示した。第４図および第
５図の両方において、ＴＧＦ−βリポソーム（Ｌ　Ｔ）
のＤ　Ｔ　Ｈ単位の′減少は、統計学的に有意な（ｐｒ
ｏ、　０１）免疫応答の５０％低下を示す。従って、リ
ポソームと結合したＴＧＦ−βは、インビボでの免疫応
答の低下を示した。

実施例６ ４ リポソーム、Ｍ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦ−リボソー１
、集合体の調製 Ａ、正にチャージされたリポソームの調製アウ゛アンテ
ィ　ポーラ−リピズ社（ＡｖａｎｌｉＰｏｌａｒ　Ｌｉ
ｐｉｄｓ、　　Ｉｎｃ、）　　（ペルハム、アラバマ州
）から閘大した卵り一α−レシチン（ポスファチジルコ
リン；ＰＣ）１０ｍｇ、０．　５μＣｉ放射標識された
ホスファチジルコリン、Ｌ−α−（シバルミ１〜イル−
１１４Ｃ）−ホスファチジルコリン（１，０７ｍＣ１／
ｍＭｏ１）　　にニー　イングランド　ヌクレア（Ｎｅ
ｗ　Ｅｎｇｌａｎ＋Ｉ　Ｎｕｃｌｅａｒ）から附人）お
よびシグマ社から購入したステアリルアミン２．　５ｍ
ｇを用いて、小型−重膜小胞タイプのリポソームを製造
した。

ステアリルアミンを用いない以外は−に記と同様にして
、中性リポソーム（対照として）を調製しノこ。

ガラス管内で脂質成分をクロロホルムと混合して、窒素
気流下に薄いフィルムに乾燥した。次いで、２ｆＱ′ｉ
の混合物を３０分間凍結乾燥して、残留する微量の有機
溶媒を除去した。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
ＳＳＣａ＋＋およびＭｇ”＋を含有しない）を添加する
ことにより両混合物を水和して、ｐＨ７，２で５　ｍｇ
／液体１−ｍｌの濃度に調整した。次いで、５分間渦巻
攪拌し、室温で３０分間膨脹させた。その後、両混合物
をバスソニヶータ（ｂａｔｈ　５ｏｎｉｃａｊｏｒ）　
　（ラポラ）・ソー　ザブライズ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　５ｕｐｐｌｉｅｓ）　、ヒックスビル（Ｈｉｃｋｓ
ｖｉｌｌｅ）、−ニーヨーク）で、室温で各回２０分間
ずつ３回音波処理した。次いで、リポソーム調製試料を
０，２ミクロンのポリカーボネートフィルターで濾過滅
菌した。

Ｂ、マクロファージ　コロニー刺激因子の調製Ｍ−ＣＳ
Ｆは、大腸菌中て発現されたヒＩ−Ｍ　−Ｃ３Ｆ断片の
再生および精製により得られた。

１、構築および発現 ２秤のシストロン発現システムを用いて、ヒトＭ−ＣＳ
Ｆの切片の発現を実施した。ｐｃＤｈＭＳＣＦＩＩ−）
８５と呼称されるＣＯ３発現プラスミドを制限酵素Ｓｃ
ａ　１およびＢａｍＨｉで消化した。このＣＯ８発現プ
ラスミドは、５５４個のアミノ酸のＭ−ＣＳＦ前駆体の
Ｎ末端の１８５個のアミノ酸残基をコードする。内部Ｓ
Ｄ配列、第１シス（・ロンをコードする終結コドンおよ
び第２ンストロンをコードする開始コドンを有する合成
リンカーで、得られたフラグメント（約４５０ｂｐ）を
連結させた。連結させたフラグメントをｐｒｅｐＩＬ−
２Ｄ８のＸｂａｌザイトとＢ　ａ　ｍ　ｌ−１ｔザイト
との間に押入した。得られたプラスミド、ｐｔｒｐｌｌ
　−２Ｘ　　Ｍ−Ｃ３ＦＩＯＩは、ＭＣ３Ｆの１５１個
のアミノ酸配列をコードしており、これは、ＣａＣｌ２
法により大腸菌内に形質転換された。この様な組換技術
は、係属中の米国特許出廟第０７／３０４，６９２号、
１９８９年７ ２月１０出願、“ヒトコロニー刺激因子（ｌｌｕｍａｎ
Ｃｏｌｏｎｙ−５ｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ
ｓ）″、エム、タカハシ（Ｍ、　Ｔａｋａｈａｓｈｉ）
らにより開示されている。

２、再生（Ｒｅｎａｌｕｒａｔｉｏｎ）形質転換された
大腸菌細胞を、アンピシリンをも含む補足されたＭ９培
地ψで振盪した。細胞を集め、ペレット状に成形し、ト
リ）・ンＸ−１００で洗浄した。ｊ＆終のベレットは、
切断されたＭＣＳＦを含有する封入体を有していた。７
，０Ｍ塩酸グアニジンおよび２５ｍＭ２−メルカプトエ
タノール中に、室温で４時間攪拌下に該ベレットを溶解
した。グルタチオン溶液２０００ｍ（５０ｍＭ）リス／
塩酸ｒ１１１こ０．５ｍＭ還元グルタチオン、０．１ｍ
Ｍ酸化グルタチオンおよび２．０Ｍ尿素を含む、ｐＨ８
，５）に、激しく攪拌しつつ、上記溶解したベレットを
ゆっくりと滴下した。溶を夜を４°Ｃで４８時間保持し
た。

再生した溶ｌｆｋｌＯｍｌをアミコン膜で５００μ１８ に濃縮した後、速度０．　７ｍｌ／分で５ｈｏｄｅｘＷ
Ｓ−８０３カラム（こかけて、ゲル？濾過した。

該カラムは、０．３Ｍ塩化すｌ・リウムを含有する４０
ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）で予め平衡化して
おいた。フラクションを集めて、Ｍ−ＣＳＦ活性を測定
した。

３、精製 再生した溶液を遠心分離し、上澄を、５　Ｑ　ｍ　Ｍト
リス／塩酸（ｐＨ８，５）で予め平衡化したＱＡＥ−Ｚ
ｅＴＡ　　Ｐｒｅｐ　　カートリッジ１００（ファルマ
シアーＬ　Ｋ　Ｂ製）に供して、０．５Ｍ塩化すトリウ
ムの５０　ｍ　Ｍ　ｌ□リス／塩酸溶液（ｐＨ８，５）
で溶離させた。

硫酸アンモニウムで沈殿させた後、４ＱｍＭリン酸すト
リウム（ｐ　Ｈ７゜４）で予め平衡化されており、且つ
硫酸アンモニウム飽和溶液を含有するＴ　Ｓ　Ｋ−ゲル
　フェニル−５ＰＷ　　ＨＰＬＣカラム（１・−ソー（
Ｔｏｓｏ）、　２１．５　Ｘ　１５００ｍｍ）に」二ｌ
登を供した。６〜３％硫酸アンモニウムで活性フラグメ
ントが得られ、濃縮され、４０ｍＭリン酸すトリウム（
ｐＨ７，４）で交換した。

４０ｍＭリン酸すトリウム（ｐ　Ｈ７，４）で予め平衡
化されたＴＳＫ−ゲルＤＥＡＥ　　ＳＰＷカラム（トー
ソー（Ｔｏｓｏ）、　２１．５　Ｘ　１５０ｍｍ１に濃
縮した試料を供し、ＮａＣＡ！勾配により流速３ｍ１７
分で溶離した。

Ｃ，リポソームＭ−Ｃ３Ｆ集合体の調整下記第４表に示
すリポソームとＭ−ＣＳＦとの組合わ・せを−銘に混合
し、渦巻攪拌し、室温で５分間インキュベートした。

７１ 実施例７ Ｍ−Ｃ３Ｆリポソ一ム集合体の特性 Ａ、シヨ糖勾配の調製 ショ糖勾配を調製するために、２０％ショ糖溶液１ｍｌ
をポリアロマ−試験管１〜７の底部に添加した。各層の
トップに、１０％、５％および２．５％シヨ糖溶液］１
ｍｌずつを注意して重層して、各々の試験管中の最終容
量が４ｍｌとなるようにした。

」１記実施例６の０項で得られたリポソーム−ＭＣ３Ｆ
混合物を適当に番号付けされたショ糖勾配のトップに重
層した。５Ｗ−６０回転子にて４００００１ｐｍで１６
時間、これらの試験管をベックマン式超遠心分離機にか
けた。遠心分離の終了時、ショ糖勾配のトソブから０．
２ｍｌずつフラクションを集め、１４ｃおよび］２５　
Ｉについて放射活性を測定した。１４　Ｃ４直は、フラ
クション中のリポソームの相対濃度を示すものである。

同様に、】２５　Ｉ僅は、フラクション中のＭ−Ｃ３Ｆ
’の相対２ 濃度を示すものである。フラクションを濾過滅菌した後
、前記アッセイのＭ−Ｃ３Ｆ標準曲線から、各フラクシ
ョン中のＭ−Ｃ３Ｆ活性をａｌｌｌ定した。

Ｂ、Ｍ−ＣＳＦ活性の４１り定 Ｍ−Ｃ３Ｆに応答して増殖するマウス骨髄細胞Ｃ３Ｈ／
ＨｅＪを用いて、Ｍ−Ｃ３Ｆ活性を７１１り定した。平
底マイクロタイターブレー１−　（コースタ−社製、ケ
ンブリッジ、Ｍ　ａ　）中に、Ｉ　Ｘ　１０５の濃度で
細胞を植えた。リポソームとＭ−Ｃ３Ｆとの混合物を順
次希釈して、最終容量が０．　２ｍｌとなるようにプレ
ートに加えた。

細胞を３日間培養した。培養期間終了の８時間前に、１
−μＣｉの［メチル−３Ｈ］ＴｄＲ（６，７Ｃｉ　／ｍ
ｍｏｌ、ニューインクランド　ヌクレア　ボストン、Ｍ
　ａ　）で細胞をパルスした。半自動細胞採取機（スカ
）・ロン、スターリング、■ａ）を用いて細胞を集めた
後、標準液体シンチレーション計数法に従って、［メチ
ル−３Ｈ］ＴｄＲの細胞内への取込みを測定した。

得られたフラクション中の増殖程度は、同じ条件で作成
されたＭ−ＣＳＦ容量ｄｌｌ線から外挿された。ジー、
ストラスマン（Ｇ、　　Ｓｔｒａｓｓｍａｎ）ら、“β
型形質転換成長因子によるコロニー刺激因子１依存性マ
クロフアージ前駆体の増殖の制御（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏ
ｎ　ｏｌ　Ｃｏｌｏｎｙ−５ｔｉｍｕｌａｌｉｎｇ　Ｆ
ａｃｔｏｒ　１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｊ　Ｍａｃｒｏｐｈ
ａｇｅ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａ−ｔ
：ｏｎ　ｂｙ　Ｔｙｐｅ　　βＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎ
ｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ）″、ジャーナル　オ
ブ　イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｌＩｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ）、１４．０　（８）　、２６４５−２６５１
　（１９８８）；アール、エヌ、ムーア（Ｒ，ＮＭｏｏ
ｒｅＪ　　ら、“コロニー刺激因子により惹起されたイ
ンターフェロンによるマクロファージ増殖性膨脂の細胞
内制御（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
　ｏｆＭａｃｒｏｐｈａｇｅ　Ｐｒｏｌｉｌｅｒａｔｉ
ｖｅ　Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ｂｙ　Ｃｏｌｏｎｙ−５ｌ
ｉｍｕｌｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｉ
ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）”　、ザイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）、２２３．１７８　（１９８４）：およびニス、グ
ー。プレン（Ｓ、　Ｋ、　Ｐｕｔ　ｆｅｎ）ら、“イン
ビトロで分化する間の内因性の形質転換されたクラスＩ
ＩＭＨＣ遺伝子の骨髄出来マクロファージの発現（Ｂｏ
ｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｍａｃｒｏｐｈ
ａｇｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｎｄｏｇｅｎｏ
ｕｓ　ａｎｄ　Ｔ＋ａｎｓ［ｅｃｔｅｄＣｌａｓｓ　Ｉ
Ｉ　ＭＨＣＧｅｎｅｓ　ｄｕｒｉｎｇ　Ｄｉｆｌｅ＋ｅ
ｎｔｉａ［１ｏｎＩｎ　Ｖｉｌｒｏ）　　、ジャーナル
　オブ　イムノロジ−１３７，１３５９（１９８６）。

Ｃ１結合の効率および条件 下記の第５表に示すように、１２５Ｉの泳動パターンは
、Ｍ−ＣＳＦと正にチャージされたリポソームとの結合
を示す。中性ＰＣリポソーム調製試料（試験管４および
５のＰ（、−Ｍ−Ｃ３Ｆ）中のＭ−Ｃ３Ｆの泳動パター
ンは、リポソームを含有しない調製試料（試験管７のＭ
−ＣＳ　Ｆ）中のＭＣ３Ｆにより示されたパターンに類
似していた。

このことは、Ｍ−Ｃ３Ｆが中性リポソームと結合して泳
動したというよりも、Ｍ−ＣＳＦは、全勾５ 配を通じて非結合の蛋白質として泳動していたことを示
す。逆に、正にチャージされたＰＣ／Ｓリポソーム調製
試料（試験管１および２のＰ　Ｃ／３Ｍ−ＣＳＦ）を用
いる場合、Ｍ−Ｃ３Ｆは、タイトな泳動パターンを示し
、フラクション２〜６に極めて多く含まれた（同じフラ
クション中にＰＣ／Ｓリポソームが多く含まれた）。試
験管１および２にはＭ−Ｃ３Ｆが存在し、試験管３（’
ＰＣ／Ｓのみ）にはＭ−Ｃ３Ｆが存在しなかった。

また、この実験は、生物活性Ｍ−ＣＳＦが正にチャージ
されたリポソームと結合したことを示した。」１記のマ
ウス骨髄細胞Ｃ３Ｈ／ＨｅＪを用いて、各フラクション
における生物学的に活性なＭＣＳＦの存在を測定した。

Ｍ−ＣＳＦのみの調製試料（試験管７）および中性ＰＣ
と結合したＭＣＳＦの調製試料（試験管４および５）に
おいて、フラクション６〜９は生物活性Ｍ−ＣＳＦを含
有していた。中性リポソームのイｊ在は生物学的６ に活性なＭ−ＣＳＦの存在に影響を与えないようにみえ
た。逆に、正にチャージされたリポソームとＭ−Ｃ３Ｆ
との調製試料（試験管１および２のＰ　Ｃ／Ｓ　−Ｍ−
ＣＳ　Ｆ）において、リポソームが多く含まれるフラク
ションとＭ−ＣＳＦの存在および活性が最大であるフラ
クションは同じであった。従って、正にチャージされた
リポソームの存在は生物学的に活性なＭ−ＣＳＦの泳動
に影響し、Ｍ−Ｃ３Ｆは正にチャージされたリポソーム
と選択的に結合するものと考えられる。

７つ 本願叩細書に記載される発叩の趣旨および槽底から、そ
の他の実施態様が可能であることは、当業者にとって自
明であることは言うまでもない。

特許請求の範囲に示される本願の趣旨および目的の範囲
内で、ここに記載される実施態様は単なる例にすぎず、
本願はこれらに限定されるものではない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＴＧＦ−βとマイナスに帯電したリポソーム
との組合わせ乃至結合に及ぼす脂質／蛋白質比の効果を
示すグラフである。 第２図は、ＴＧＦ−βと中性のリポソームとの組合わせ
乃至結合の程度を示すグラフである。 第３図は、ＴＧＦ−βとマイナスに帯電したリポソーム
との祁合わせ乃至結合の程度を示すグラフである。 第４図は、リステリアに対する遅延型過敏性応答に及ば
ずリポソーム結合ＴＧＦ−βの効果を示０ すグラフである。 第５図は、リステリアに対する遅延型過敏性応答に及ぼ
すリポソーム粘合ＴＧＦ−βの効果を示すグラフである
。 （以　　　」二） 特開平３ ３４９２０　（２２） 特開平３−３４９２０　（２３） 第 ４ 図 ＴＧＦ−β Ｔ 手続、？０ｊ正１：（自発） 平成２年６月２０日 １ｆ件の表示 平成２年特許願第１０５５７９号 補正をする者 事件との関係　特許出願人 大塚製薬株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　リポソームとこれに結合乃至組合わされた生物活性
   物質との集合体を含有する組成物であって、該集合体が
   、 （ａ）外表面を有する複数のリポソーム；及び（ｂ）複
   数の生物活性物質 を含むものであり、該生物活性物質が、患者に上記集合
   体を薬学的有効量で投与した場合に、生物学的活性が実
   質的に低下しないように、リポソームの外表面に結合乃
   至組合わされていることを特徴とする組成物。 ２　生物活性物質が、ＴＧＦ−β及びＭ−ＣＳＦよりな
   る群から選ばれるものである請求項２に記載の組成物。 ３　リポソームが、小さい一重膜小胞、大きい一重膜小
   胞及び多重膜小胞よりなる群から選ばれるものである請
   求項２に記載の組成物。 ４　リポソームが、小さい一重膜小胞である請求項３に
   記載の組成物。 ５　小さい一重膜小胞が、フォスファチジルコリンとフ
   ォスファチジルセリンとから構成されている請求項４に
   記載の組成物。 ６　フォスファチジルコリンとフォスファチジルセリン
   とのモル比が、１：１である請求項５に記載の組成物。 ７　小さい一重膜小胞が、フォスファチジルコリンとス
   テアリルアミンとから構成されている請求項４に記載の
   組成物。 ８　（ａ）薬学的に有効な量の請求項１に記載の組成物
   及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。 ９　（ａ）薬学的に有効な量の請求項２に記載の組成物
   及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。 １０　（ａ）薬学的に有効な量の請求項３に記載の組成
   物及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物
   。 １１　（ａ）薬学的に有効な量の請求項４に記載の組成
   物及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物
   。 １２　（ａ）薬学的に有効な量の請求項５に記載の組成
   物及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物
   。 １３　（ａ）薬学的に有効な量の請求項６に記載の組成
   物及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物
   。 １４　（ａ）薬学的に有効な量の請求項７に記載の組成
   物及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物
   。 １５　リポソームとこれに結合乃至組合わされた生物活
   性物質との集合体を含有する組成物であって、該集合体
   が、 （ａ）外表面を有する複数の帯電リポソーム；及び （ｂ）該リポソーム上の電荷の相手方（ｃｏｍｐｌｅ−
   ｍｅｎｔ）である電荷を有する複数の生物活性物質を含
   むものであり、該生物活性物質が、患者に上記集合体を
   薬学的有効量で投与した場合に、生物学的活性が実質的
   に低下しないように、リポソームの外表面に結合乃至組
   合わされていることを特徴とする組成物。 １６　リポソームがマイナスに帯電しており、生物活性
   物質がプラスに帯電している請求項１５に記載の組成物
   。 １７　生物活性物質が、ＴＧＦ−βである請求項１６に
   記載の組成物。 １８　リポソームがプラスに帯電しており、生物活性物
   質がマイナスに帯電している請求項１５に記載の組成物
   。 １９　生物活性物質が、Ｍ−ＣＳＦである請求項１８に
   記載の組成物。 ２０　帯電リポソームが、小さい一重膜小胞、大きい一
   重膜小胞及び多重膜小胞よりなる群から選ばれるもので
   ある請求項１５に記載の組成物。 ２１　リポソームが、小さい一重膜小胞である請求項２
   ０に記載の組成物。 ２２　小さい一重膜小胞が、フォスファチジルコリンと
   フォスファチジルセリンとから構成されている請求項２
   １に記載の組成物。 ２３　フォスファチジルコリンとフォスファチジルセリ
   ンとのモル比が１：１である請求項２２に記載の組成物
   。 ２４　小さい一重膜小胞が、フォスファチジルコリンと
   ステアリルアミンとから構成されている請求項２１に記
   載の組成物。 ２５　（ａ）薬学的に有効な量の請求項１５に記載の組
   成物及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成
   物。 ２６　（ａ）薬学的に有効な量の請求項１６に記載の組
   成物及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成
   物。 ２７　（ａ）薬学的に有効な量の請求項１７に記載の組
   成物及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成
   物。 ２８　（ａ）薬学的に有効な量の請求項１８に記載の組
   成物及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成
   物。 ２９　（ａ）薬学的に有効な量の請求項１９に記載の組
   成物及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成
   物。 ３０　（ａ）薬学的に有効な量の請求項２０に記載の組
   成物及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成
   物。 ３１　（ａ）薬学的に有効な量の請求項２１に記載の組
   成物及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成
   物。 ３２　（ａ）薬学的に有効な量の請求項２２に記載の組
   成物及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成
   物。 ３３　（ａ）薬学的に有効な量の請求項２３に記載の組
   成物及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成
   物。 ３４　（ａ）薬学的に有効な量の請求項２４に記載の組
   成物及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成
   物。