JPH0334920A - リポソームに結合及至組合わされた生物活性化合物及びそれを含有する医薬 - Google Patents

リポソームに結合及至組合わされた生物活性化合物及びそれを含有する医薬

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JPH0334920A
JPH0334920A JP2105579A JP10557990A JPH0334920A JP H0334920 A JPH0334920 A JP H0334920A JP 2105579 A JP2105579 A JP 2105579A JP 10557990 A JP10557990 A JP 10557990A JP H0334920 A JPH0334920 A JP H0334920A
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JP2105579A
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Sutorasuman Gideon
ギデオン ストラスマン
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Original Assignee
Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分軒 本発明は、生物活性化合物、例えば、トランスフォーミ
ンググ口ウスファクター乃至はトランスフォーミング成
長因子(jtanslorming  growthf
actor) タイプβ(以下rTGF−β」という)
及びコロニー刺激因子、例えばマクロファージコツ 0ニー刺激因子(以下rM−CSFJという)を用いて
患者を治療する方法に関する。更に、本発明は、リポソ
ームと結合乃至組合わされた生物活性化合物、例えば、
リポソームと結合乃至組合わされたTGF−βやリポソ
ームと結合乃至組合わされたM−C3Fなどの組成物に
も関する。より詳しくは、本発明は、患者への投与のた
めの薬学的に許容される担体と共にイオン的に電荷を有
するリポソームと結合乃至組合わされた生物活性化合物
を含有する医薬に関する。その様な医薬は、リポソーム
と結合乃至組合わされたTGF−βやリポソームと結合
乃至組合わされたM−CSFであり得る。
従来の技術 生物活性化合物、例えば、TGF−βやM−CSFなど
は、各種の疾病の治療に投与することができる。しかし
ながら、斯かる生物活性化合物の投与は、その眼られた
生物学的利用率により妨げられている。−旦、生物学的
物質(biologicaagent)が、血流に吸収
され又は注射されると、初期分布の速度、程度およびパ
ターンは、とりわけ該薬物の物理化学的特性により決定
される。生理学的pHにおいて電荷を示す化合物は、目
標とする領域に少ない量でしか到達しないであろう。例
えば、TGF−βは、その正電荷により、細胞膜例えば
血管膜に付着し、或いは血漿蛋白例えばアルブミン、そ
の他部t1M、中の他の成分に付着し、その半減期及び
生物学的活性が減少してしまう。同様に、M−CSFの
負電荷もその目標とする部位に到達する能力を損なう。
血液システムを通して投与することにより生物学的利用
率の減少が更に悪化する。なぜならば、血流中の化合物
は生体の浄化機構(Clearingmechanis
m)の影響を受けやすいからである。近年、リポソーム
中に各種の生物学的活性物質を包み込むこと(entr
apment)により、その様なホス)・の浄化機構か
ら保護する目的でリポソームか使用されている。
しかしながら、リポソーム中に生物学的活性物質(bi
ologically active agents)
を包み込むには、大量の該物質を必要とする。これは、
TGF−βのように製造費が高く且つ非常に少量しか製
造できないペプチドについては、問題である。例えば、
従来の単離方法に比し回収率が5倍になると記載されて
いる改良されたTGF−β製造法であっても、収量はヒ
ト血小板単位当たりわずか2.5μgでしかない。コー
ン(Cone)ら、”血小板から0’) l□ ランス
フォーミング成長因子タイプβの改良された精製法”、
アナリティカル バイオケミストリー(Analyti
cal Biochemistry)  168 : 
7174 (1988)。リポソームに包み込まれた生
物学的物質の製造時に比較的大量の生物学的活性物質が
水層に分散してしまうので、この方法は、TGF−βの
ように容易に大量入手できないペプチドに適用するには
適切ではない。
加えて、リポソーム中に生物学的物質を包み込むことは
、細胞膜」二のレセプターにまず粘合することにより作
用するTGF−βやM−C3Fなどの生物学的物質をリ
ポソーム表面に結合乃至組合わせること比し、劣ってい
る。なぜなら、リポソームの水層内に取り込まれた物質
は細胞レセプターに接近できないからである。近年の研
究によれば、TGF−β及びM−C3Fは、事大、広い
範囲の各種細胞タイプ上に見出だされる細胞レセプター
に結合することが示されている。ウェイクフィールド、
エル、エム、  (Wakefield、  L、M、
)  ら、トランスフォーミング成長因子βに対する細
胞レセプターの分布及びモジュレーション“  J、 
 Cel 1.Bio、105:965−975 (1
987)。スタンレー、イー、アール、  (Slan
leyE、 R,)  ら、”コロニー刺激因子による
マクロファージ産生の調節” 「モノニュークリアー 
ファコ1 サイツ − ファンクショナルアスペクッ(Mono−
nuclear Phagocytes −Funct
ional Aspects)J、Part l、アー
ル、ヴアン ファース(R4an Furth)編(1
980);バイリーン、ピー、ヴイー(Byrene、
  P、 V、 )ら、“ネズミ組織におけるコロニー
刺激因子(C3F−1)に対するレセプターを有する細
胞のこの分布” J、Ce11.Biol。
91 : 848 (1981)。この様に、TGFβ
及びM−CSFをリポソーム中に包み込むことにより、
これら生物活性物質(bioacjive agent
s)の生物学的活性が損なわれ得る。
従って、TGF−β及びM−CSFのような生物活性物
質を患者に投与する方法であって、目標部位に到達する
生物活性物質の量を最大にし、生体のIP化機(111
から生物活性物質を保護し、且つ生物活性物質の生物学
的活性を維持し、しかも少量でしか得られないペプチド
に関して使用するのに適切である方法の開発が望まれて
いる。また、そ2 の様な方法に使用できる化合物及び組成物の開発も要請
されている。
発叩の開示 本発明は、生物活性物質を使用して患者を処置する方法
を提供することにより従来技術の問題点および障害事項
を解決するものである。この方法では、生物活性物質と
リポソームとが結合乃至組合わされて集合体を構成して
おり;該集合体は、外表面を有するリポソームと生物活
性物質とからなっており;生物活性物質は、該集合体の
薬理的有効量を患者に投与した場合に生物学的活性が実
質的に低下しないように、リポソームの外表面と結合乃
至組合わされており;そして、該集合体を患者に投与す
るという構成からなっている。
本発明は、TGF−βにより患者を処置する方法をも提
供する。この方法では、TGF−βとリポソーl、と力
性1i合乃至組合わされて集合体を1114成しており
;該集合体は、外表面を有するリポソームとTGF−β
とからなっており;該集合体の薬理的有効量を患者に投
与した場合に生物学的活性が実質的に低下しないように
、TGF−βは、リポソームの外表面と結合乃至組合わ
されており;そして、該集合体を患者に投与するという
構成からなっている。
本発明は、TGF−βにより患者を処置する方法の好ま
しい実施態様をも提供する。この態様においては、マイ
ナスに帯電したリポソームが、TGF−βとリポソーム
とが結合乃至組合わされて集合体を形成する様に、使用
される。
さらに、本発明は、TGF−βとリポソームとが結合乃
至組合わされた集合体からなる組成物又は材料をも提供
する。
本発明は、さらに、TGF−βとリポソームとが結合乃
至組合わされた集合体の薬理的有効量と薬理的に許容さ
れるキャリアーとからなる医薬組成物をも提供する。
本発明は、さらに、M−C3Fにより患者を処置する方
法をも提供する。この方法では、M−CSFとリポソー
ムとが結合乃至組合わされて集合体を構成しており;該
集合体は、外表面を有する有するリポソームとM−C3
Fとからなっており該集合体の薬理的有効量を患者に投
与した場合に生物学的活性が実質的に低下しないように
、MCSFは、リポソームの外表面と結合乃至組合わさ
れており;そして、該集合体を患者に投与するという構
成からなっている。
本発明は、M−CSFにより患者を処置する方法の好ま
しい実施態様をも提供する。この態様においては、プラ
スに帯電したリポソームが、MC3Fとリポソームとが
結合乃至組合わされて集合体を形成する様に、使用され
る。
さらに、本発明は、M−CSFとリポソームとが結合乃
至組合わされた集合体からなる組成物又は飼料をも提供
する。
5 本発明は、さらに、M−3CFとリポソームとが結合乃
至組合わされた集合体の薬理的有効量と薬理的に許容さ
れるキャリアーとからなる医薬組成物をも提供する。
本発明のその他の目的および利点は、一部は以下の記載
に明記されており、また一部は以下の記載に基いてもし
くは本発明の実施により知り得るところである。また、
本発明の目的および利点は、特に特許請求の範囲に記載
された手法および組み合わせにより、実現され、達成さ
れる。
また、上記の一般的記述および下記の詳細な記述は、い
ずれも例示的な説明を行なうためのものであり、特許請
求の範囲に規定された本発明を限定するものではない。
以下に、添付図面を参照しつつ、本発明の好ましい実施
態様を詳細に説明する。
本川細書において、生物活性物質とは、患者に投与され
た集合に、細胞応答を引き起こすペプチ6 F類、ポリペブチF類、蛋白質類および糖蛋白質類を意
味する。生物活性物質の使用により観察される細胞応答
は、増殖的効果、非増殖的効果、分化から、さらには、
免疫グロブリンの分泌抑制、副腎ステロイド産生抑制な
どの他の効果にまで及ぶ。特に好ましい生物活性物質は
、TGF−βおよびM−CSFであるが、本発明は、こ
れらの特定の物質の使用に限定されるものではない。
本川細書において、TGF−βとは、l・ランスフォー
ミング グロウス ファクター、タイプベータとして知
られるホルモン的に活性なポリペプチドを意味する。仔
か数年前に発見されて以来、TGF−βを同定し、構造
的に特徴イ1けるために、多くの進展がなされている。
TGF−βは、ジスルフィド結合により結ばれた2本の
同一のポリペプチド鎖(M r 12.500)からな
っている。原分子の活性は、ジスルフィド基の還元より
、失なわれる。
TGF−βは、正常な組織中のみならず、トランスフオ
ームされた細胞中にも存在するありふれた分子である。
特に、血小板は、比較的大量のTGF−β(細胞1個当
たりのTGF−β分子約1500)を含んでいる。この
ことは、TGF−βが傷の治癒に一定の役割を果たして
いるとの見解を裏イマ1けるものである。
しかしながら、TGF−βは、多機能の成長因子である
ことが見出された。例えば、TGF−βは、線維非細胞
および骨芽細胞に対して増殖的効果を示すのに対し、線
維非細胞、」二皮細胞、Tリンパ球および骨芽細胞に対
して反増殖的効果を示す。さらに、TGF−βは、増殖
に関連しない効果をも示す。すなわち、TGF−βは、
免疫グロブリンの分泌および副腎ステロイド産生を抑制
することが見出された[スポーソおよびロバーツ(Sp
orn and Roberts )、“ペプチド成長
因子は多機能である”、ネイチャー (Nature)
 3 B 2 :217−219 (1988年3月1
7日)。成長型子作用の性質は、他の物質の行在に依行
するかも知れないとの説か提出されている。すなわち、
TGF−βは、血小板に出来する成長因子の存在下には
、線維芽細胞を刺激するが、」二皮成長因子の存在下に
は、線維芽細胞の成長を抑制するというものである。
さらに、TGF−βは、脂質生成、筋発生、・円形成お
よび」二皮性分化の諸プロセスの発現の強力なレギュレ
ーターであると信じられている。研究者達は、これらの
多細胞作用の生化学的基礎の少なくとも一部は、TGF
−βが細胞外マトリクスの構造を変化させる能力を有し
ていることによるものとの説を提案している。[例えば
、ジョーンマツザグ(Joan Massague )
による“ザ トランスフォーミング グロウス ファク
タース”およびジョン L、ウアングおよびイエンーミ
ンスー(Jolin L、Wang and Yen−
Ming l1su)による] 9 “ネガティブ レギュレーターズ オブ グロウス“参
照。これらは、“オンコジーンズ アンドグロウス フ
ァクター 、ラルフ A、ブラッドショウおよびステイ
ープ プレンティス(Ralph A、Bradsha
w and S[eve Prentis)編(198
7)に記載されている]。
本発明に特に関連するTGF−βの機能の一つは、その
免疫系制御能力である。最近の研究によれば、T −I
Jンパ球の抑制剤として、TGF−βは、ペプチドであ
るンクロスボリンAに比して、モルベースで少なくとも
104倍も強力であることが示されている[前出のスポ
ーソおよびロバーツを参照]。この抑制効果は、リュー
マチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性糖
尿病、自己免疫性甲状腺炎、多発性硬化症およびその他
の自己免疫疾患の如き症状の活魚に際して、TGF−β
を有用なものとする可能性を与えるものである。さらに
、TGF−βは、同種移植を容易な0 ものとし、且つある柿の腫瘍細胞を抑制する。
セイエディンら(Seyedin et at )、 
“カーティラージ−インデユースト ファクターB イ
ズア ユニーク プロテインズ ストラクチュラリアン
ド ファンクショナリー リレイテッドトウ トランス
フォーミング グロウス ファクター−β” 、J、o
f Biol、Chem、  262 (5)  :1
946−49 (1987)に示される様に、生理的p
 Hにおいて、TGF〜βのprは9.5なので、TG
F−βは、全体としてプラスのチャージを有している。
本明細書においては、“全体としてプラスのチャージ”
とは、ポリペプチドのプラスのイオン化状態を意味して
いる。ポリペプチド類は、特定のp Hで一定のチャー
ジを右するアミノ酸により構成されているので、個々の
414戊成分のイオン化状態は、ポリペプチドに全体と
してプラスのチャージまたはマイナスのチャージを与え
る。TGF−βのアミノ酸紹成は、全体とじてマイナス
のチャージを与えるものとなっている。
本明細書において、“M−C3F”なる用語は、特定タ
イプのコロニー刺激因子(colony−slimul
ating factor)に関連している。コロニー
刺激因子は、造血細胞の産生を制御する糖蛋白質類であ
る。少なくとも4種の明確に相違するコロニー刺激因子
が、造血細胞前駆体からの顆粒球および/またはマクロ
ファージの堆殖および分化を制御している。
特に好ましい物質は、マクロファージ コロニー刺激因
子(M−CSFSC3F−1としても知られている)で
ある。これは、単核性食細胞系(mononuclea
r phagocyte lineage cells
 )の生存、増殖および分化を選択的に刺激するもので
ある。また、他の研究によれば、M−C3Fは、成熟し
た単球のエフェクター機能、例えば、抗菌活性、リンホ
カインにより誘起される肝癌消滅活性などをも刺激する
ことが示されている。これらについては、下記の文献を
参照されたい。
*スタンリーおよびガルバー1− (Sjanley、
E、Rand Gulberl、 L、 T、、“メソ
ッド フォー ザ ピュリフィケーション、アッセイ、
キャラクタライゼイション アンド ターゲット セル
 バインディング オブ コロニー−スティミュレイテ
ィング ファクター[C3F−1]”、ジャーナルオブ
 イミュノロジック メソラス 42:253−284
 (1981); *カルパッジら(Karbassi A、、et al
 )、“エンハンス)・ キリング オブ カンディダ
 アルビカンス バイ ムーリン マクロファージズ 
トリーティド ウィズ マクロファージ コロニスティ
ミュレイティング ファクタm:エビデンス フォー 
オーグメンティッド エクスプレッション オブ マン
ノース レセプターズ“ジャーナル オブ イミュノロ
ジー139:417−4.21 (1987); 3 *メトカーフ(Melcalf D )、“ザ モレキ
ュラバイオロシー アンド ファンクンヨンズオブ ザ
′ グラニュロザイト マクロファージコロニー−ステ
ィミュレイティング ファクターズ”、ブラッド 67
 : 257 (1986);*ラルフおよびナコイン
ズ(Ralph、P andNakoinz、 I )
、“スティミュレイション オブマクロファージ チュ
ーモリサイダル アクティビティ−バイ グロウス ア
ンド ディファレンシエイション ファクター C3F
−1”、セルラー イミュノロジー 105 : 27
0279 (1987)。
本発明は、すべての形態のM−CSF、すなわち、M−
CSF全体そのものならびに標準的な生化学的或いは組
替え技術により切断されもしくは他の方法で加工された
M−CSFを包含する。この点については、1989年
2月10に高橋らによりなされた米国特許出願第07/
304.692号(発明4 のη称:ヒューマン コロニー−スティミュレイティン
グ ファクターズ)を参照されたい。
研究によれば、生理的なp Hにおいては、ヒトのM−
CSFは、pI4.8および全体としてマイナスのチャ
ージを示すことが明らかになっている。同様に、切断さ
れた形態のヒトM−C3Fは、pI4,8を呈すること
が示されている。
この様な組替え手法は、1989年2月1目になされた
高橋らの米国特許出願第07/304.692号(発明
の名称:ヒユーマン コロニー−スティミュレイティン
グ ファクターズ)に開示されている。
本明細書にいう“全体としてマイナスのチャージ”とは
、該物質のマイナスのイオン化状態を意味する。“全体
としてプラスのチャージ”に関して上記に述べた様に、
全体のチャージは、全体を構成するアミノ酸類により決
まるものである。糖蛋白質の少なくとも一部を11′4
成するアミノ酸は、該糖蛋白質に特定のチャージを与え
る。
本明細書にいう“集合体(aggregate )“と
は、複数の単位または粒子が集合して、一つの単一体(
body) 、塊(mass)或いはその他のグループ
体を構成していることを意味する。本発明は、本発明の
集合体を形成する単位の数により限定されるものではな
い。
本明細書にいう“結合乃至組合わせ(associa−
tion)”とは、結合乃至組合わせ体の部分間の如何
なる柿類の関係をも意味する。
これらの部分は、接近により組合わせられていて、これ
らの部分間に真の接触が存在していなくとも良い。さら
に、これらの部分は、表面−表面接触のような外面的な
接触であっても良い。結合は、より近接した接触からな
っていて、組合わせの一方の成分が、部分的にまたは完
全に、組合わせの他方の成分に埋め込まれて(embe
dde+I)いても貝い。
本明細書にいう゛リポソーム“は、広い意味に解釈され
るべきものである。脂質小胞(lipidvesicl
e )とも呼ばれるリポソームは、脂質二重層により閉
じ込められた水性コンパートメント有し、その形状は、
球形から長さ方向にのびたものにまでに及ぶ。
リポソームは、水性媒体中に適切な脂質を懸濁させるこ
とにより、形成される。次いで、この混合物を振盪し、
粒径が非常に均一に揃ったリポソームの分散液を得る。
或いは、エタノール中に脂質を含む溶液と水とを急速に
混合することによっても、製造される。この方法は、脂
質を細い針穴から射出することによって、実施できる。
リポソーム製造のために選択した方法が、得られるリポ
ソームの形状を規定する要素の一つとなる。本発明は、
大きな一重膜小胞(large unilamelta
rvesicle ) 、微細な一重膜小胞(smal
l unilameltar vesicle )およ
び多重膜の小胞(multilamefar vesi
cle )を含む全ての形態のリポソームの7 使用を包含するものである。
オリゴラメラ−小胞(oligolamellar v
esicle )とも呼ばれる多重膜小胞は、公知の任
意の方法により、例えば、ロータリー真空蒸発器を使用
する方法により、製造できる。詳細は、スナモトら(S
unamoto, J, et al)、′ア ニュー
リー デイベロップト イミュノリポソームーアン エ
ラグホスファチジル コリン リポソーム コーテッド
 ウィズ プルラン ベアリング ボースコレステロー
ル モイエティー アンド IgMS フラグメンI+
″、Biochem, Biophys, Acta8
98 : 323−330 (1987)を参照された
い。
大ぎな一重膜小胞は、神山し法の様な公知の任意の方法
によっても製造できる。例えば、ホープら(Hope,
M. J.、 et at )、“プロダクション オ
ブラージ ユニラメラ− ベシクルズ バイ アラピッ
ド イクストルージョン ブロシーデュ8 アー、キャラクタライゼイション オブ ザイズ、ディ
ストリビューションズ、トラップ)・ ポリュウムズ 
アンド アビリティ− トウ メインティン ア メン
ブレン ポテンシャル”Biochem.Biophy
s.Acfa  812:55−65(1987)を参
照されたい。或いは、小さな一重膜小胞は、音波法の如
き常法により、製造することができる。小さな一重膜小
胞の好ましい製造方法を下記に詳述する。
一般に、リポソームは、例えば、ホスファチジル コリ
ン、卵レシチン、コレステロールおよびステリルアミノ
などを代表例とする多種の脂質刊料から製造することが
できる。ホスファチジルコリンの様な脂質桐材から製造
されたリポソームは、電気的に中性である。しかしなが
ら、本発明では、マイナスに帯電したリポソームを形成
する脂質類から製造したリポソー1、かより好ましい。
特に限定されるものではないが、ホスファチジルセリン
、ジセチル ホスフェートおよびシミリストイル ホス
ファチジン酸が、好ましいマイナス帯電リポソームを形
成する脂質制料の例である。
任意の帯電脂質材料が使用可能であるが、特に好ましい
実施態様においては、ホスファチジル コリン(P C
)とホスファチジルセリン(P S)とが、マイナス帯
電リポソームを形成するために併用される。PCとPS
との配合比は、任意である。
特に好ましい実施態様では、PCとPSとの配合割合は
、モル比で1:]、である。
或いは、ステアリルアミンの様な脂質材料を使用して、
プラスに帯電したリポソームを形成させても良い。
脂質成分は、クロロホルムと混合し、窒素気流下に乾燥
して、薄いフィルムとしても良い。乾燥した脂質材料は
、次いで再水和される。本発明の脂質材料は、好ましく
は室温で30分間にわたりリン酸塩で緩衝された食塩水
(pH7.2、Ca ”またはM g 2”なし)を添
加することにより、再度水和される。本発明のリポソー
ムは、再水和された脂質材料の溶lffを物理的に振盪
し、小さな一重膜小胞を形成させることにより、得られ
る。
機械的或いは超音波振盪法も採用可能であるが、本発明
の好ましい態様においては、小さな一重膜小胞タイブの
リポソームは、音波振盪機中での1時間にわたる音波処
理および/または溶液の光学的クリアランスが認められ
なくなるまでの音波処理により、形成される。
本発明の一実施態様では、リポソームの外表面は、TG
F−βまたはM−C3Fの様な生物活性物質と結合乃至
組合わされている。前述のごとく、この結合乃至組合わ
せは、組合わせ体を形成する成分間の如何なる種類の関
係をも意味する。リポソームの外表面は、TGF−βま
たはM−CSFへの接近により組合わされていてもよく
、この集合には、両者間に真の接触が存在していなくて
も1 良い。或いは、リポソームの外表面は、極く表面的な接
触によりTGF−βまたはM−CSFに組合わされてい
てもよく、この場合には、リポソームの外表面は、TG
F−βまたはM−CSFと接触している。また、他の実
施例においては、リポソームの外表面は、TGF−βま
たはM−CSFと極めて緊密に組合わされており、この
場合には、TGF−βまたはM−CSFは、部分的にま
たは全体的にリポソーム中に嵌まり込んでいる。
TGF−βまたはM−CSFとリポソームの外表面との
結合乃至組合わせの程度がどのようなものであれ、粘合
体乃至組合せ体は、TGF−βまたはM−CSFをリポ
ソームの水層に完全に包み込むことが実質−にないこと
を理解すべきである。
また、TGF−βまたはM−C3Fとリポソームとの間
の結合乃至組合わせは、共有結合以外の手段によって達
成されることをも理解すべきである。非具有粘合の利点
は、まず第1に生物活性物質2 質の最大限の生物学的活性が要求されること、第2に粘
合が単純な手段で達成されることである。
加えて非共有結合は、結合乃至組合わされたペプチドが
リポソームからより容易に解離しうる点でも有利である
リポソームとペプチドとの結合乃至組合わせは、幾つか
の点で有利である。リポソームは、長時間循環する性質
を示すので、リポソームに結合乃至組合わされた物質(
agen+)は、はとんどの遊離の薬物に比べて血流中
でより長く循環するであろう。
事実、系からのクリアランスの時間定数は、数分から1
日以上であることが報告されている。ジステアロイルフ
ォスファチジルコリンとスフィンゴミエリンを用いて得
られる小さい小胞について、より長い時間が報告されて
いる。ジェイ、エヌ。
ウニインスタイン(J、 N、 Weinsfein)
、”癌の診断と治療におけるリポソーム“  「リポソ
ームスフロム バイオフィジックス ツー セラピュテ
ィックス(Liposomes From Bioph
ysics to Therapeutics)j 、
マーク ジェイ、 オスl−o(MarcJ、 0sl
ro)編(1987)。
更に、生物活性物質をリポソームと結合乃至組合わせる
ことにより、該生物活性物質の生物学的利用率が向上し
得る。本発明の固体用小胞は、液体小胞に比べ、細胞表
面に吸着(absorb)する傾向が高く、該生物活性
物質の目標細胞に対する提示(presentalio
n)を増大させる。
本発明の好ましい実施態様は、負に帯電したリポソーム
が細胞表面」二の膜レセプターにより捕捉される性質を
利用するものである。即ち、これらのリポソームは、非
食作用細胞(non−phagocyticcells
)及び食作用細胞(phagocylic cells
)の双方へのデリバリ−に有効である。
本発明の他の利点は、生物活性物質をリポソームとレソ
合乃至組合わせることにより、ホストの酔素その他の生
理学的浄化機h’/iから当該坐物活性物質を保護し得
ることである。このような保護により、当該生物活性物
質の生物学的利用率が向」二し得る。
本発明では、TGF−βとリポソームとの集合体及びM
−CSFとリポソームとの集合体はいずれち、生物学的
活性を示した。本川細書において、生物学的活性とは、
生物活性物質が細胞機能を阻害又は1曽進じ、その他何
等かの影響を与えることを指す。既述のごとく、成る状
況下では、TGFβは、増殖性及び抗増殖性効果並びに
増殖とは無関係の効果を発揮する。TGF−βの生物学
的活性は、他のアッセイでも試験できるが、生物学的活
性の指標としては、TGF−βの細胞地殖を]Sd害す
る外質か好ましい。特に、TGF−βの生物学的活性は
、前記コーン(Cone)らにより記載されたミンク肺
」1皮細胞アッセイによって、41す定することかでき
る。このアッセイは、ミンク11市」二皮細胞の単層J
−j/7殖がTGF−βの存在下で阻害され5 るという観察結果に基づくものである。その詳細を、後
記実施例3に示す。
同様に、記述のごとく、M−CSFの生物学的活性とは
、M−C3Fが細胞機能を阻害又は増進し、その他何等
かの影響を与えることを指す。本発明のM−C3Fの活
性は、数種の方法により測定できるが、M−CSFの細
胞1曽殖を向上させる能力が好ましい。特に、M−CS
Fの生物学的活性は、ストラスマン(Slrassma
nn、 G、 )  ら、1タイプβ)・ランスフォー
ミング増殖蛭子によるコロニー刺激因子1−依存性マク
ロファージプリカーザー増殖“、ジャーナル・オブ・イ
ミュノロジー(Journal of 1mmunol
ogy)  140 (8)  : 2645−265
1 (1988)に記載のアッセイにおいてC3H/H
eJネズミ骨髄細胞を用いてiuす定できる。
本川細書において、「薬学的に有効な量」なる用語は、
細胞機能を阻害又は堆進し、その他何等6 かの影響を与えるのに有効な生物活性物質の開を意味す
る。従って、該用語は、次の疾病に限定されるものでは
ないが、たとえば、リウマチ様関節炎、全身紅斑性狼瘉
、自己免疫性糖尿病、自己免疫性甲状腺炎、多発性硬化
症その他の疾病の治療に有効な量を包含するものである
。生物活性物質は、成熟単球のエフェクター機能、例え
ば抗真菌活性(Antilungal activit
y) 、リンホカイン−誘発性殺肺瘍性活性を刺激する
のにも使用できる。
加えて、生物活性物質は、血液単球の−1−昇を必要と
する病気、例えば白血球減少症の治療にも使用できる。
生物活性物質が使用できる他の状態としては、例えば、
同種移植の容易化、肺癌細胞の抑制等が例示できる。
当業者であれば、公知の方法を用いて、本発明の生物活
性物質の投与量を決定することができる。
そのような方法としては、例えば、グツドマン(Goo
dman)及びギルマン(Gilman)、ザ・ファー
マコロジカル・ベイシス・オブ・セラピュティックス(
The Pharmacological Ba5is
 ol Therapeutics)第5版(1975
)に記載されている。投与量は、確立されたアッセイ及
び慣用的な用量一応答研究を用いて確認できる。治療の
ための適切な投与量を更に細かく検討することは、当業
者によりルーチンで行われており、過度の実験を行うこ
となく通常行われている範囲の作業として行うことがで
きる。
本明細書に記載の組成物乃至化合物とともに適当な薬学
的に許容される担体、希釈剤及びアジュバント類を用い
て、患者の治療用に使用される所望の組成物を製造でき
することができる。本発明の医薬組成物は、上記生物学
的活性物質を、固体またはl皮体の薬学的に許容される
無毒性担体と共に含有する。斯かる薬剤学的担体として
は、殺菌llk体、例えば水及び浦が挙げられ、該油と
しては、石油、動物、植物または合成起源のもの、例え
ばピーナツl由、大豆油、鉱抽、1liJ1麻油などを
例示できる。医薬組成物が静脈内投与される場合、水が
好ましい担体である。生理食塩水溶l皮、デキストロー
ス及びグリセロールの水溶t&も液体担体、特に注則溶
液用の担体として使用できる。適当な賦形剤としては、
澱粉、グルコース、ラフ)・−ス、スクロース、ゼラチ
ン、モルト、コメ、小麦粉、■粉、シリカゲル、炭酸マ
グネシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸
すトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、
塩化すl・リウム、乾燥スキムミルク、グリセロールプ
ロピレングリコール、水、エタノールなどを例示できる
。またこれら組成物は、溶/lk % !NJ’:濁液
、錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、徐放性製剤等の形態を
取り得る。適当な薬剤学的担体は、イー、ダブリュ。
マーチン(E、W、 Martin)、による「レミン
トンズ・ファーマス−ティカル・サイエンシス(Rem
ingtons Pharmaceutical 5c
iences) Jに記載されてい3つ る。斯かる組成物は、患者に投与するのに適切な形態と
なるように、適当な量の担体と有効な治療量の活性成分
を含有する。静脈内注射が最も有効な投与方法であるが
、他の方法例えば注射、経口または非経口投与も採用で
きる。
本発明の化合物は、患者の治療に使用できる。
ここに、「患者」はその最も広い意味で使用するものと
し、ヒ)・を含む哺乳類を意味し、さらには、各種実験
動物例えば犬、猫、モルモット、マウス、ラットなどを
包含する。
実施例 以下、本発明を下記実施例により、更に詳しく説明する
が、これら実施例は本発明を例示するためのみのもので
ある。
実施例1 リポソーム、TGF−β及びTGF−β−リポソーム集
合体の製造 0 小さい一重膜小胞タイブリポソームを、卵La−レシチ
ン(フオスファチジルコリン、pc)及び脳フォスファ
チジルセリン(ps)  [アヴアンティ・ポーラ−・
リピズ・インコーホレーテッド(^vanti Po1
arLipids、  Inc、、Pelham、Al
abama)から胴入]、及び放射標識されたフオスフ
ァチジルコリン、L−α−[ジパルミトイル−114C
]フオスフアチジルコリン(107m  Ci/mMo
1)[ニュー・イングランド・ニュウクリアー(New
 Englan+I Nuclear)からUK入コを
用いて製造した。中性リポソームは、PCを単独で用い
て調製した。マイナスに帯電したリポソームは、PCと
PSとを1=1モル比で混合することにより調製した。
PC及びP C/P Sの双方の脂質成分をクロロホル
ムと混合し、窒素気流下薄膜となるまで乾燥した。次い
で、これら二つの混合物を1時間意字下に置き、痕跡量
の残留有機溶媒を除去した。次いで、双方の混合物に、
燐酸緩衝生理食塩水(PB S )  ((:a+を及
びMg−2を含まない)をpH7,2で添加して水和し
、5分間渦振動させ、室温で30分間膨潤させた。次い
で、該混合物双方をラボラトリ−・サブライズ社(La
boratorySupplies、 l1ickvi
lle、 New York)製の浴音波処理機中で音
波処理を1時間または溶液の光学的クリアランスがそれ
以上観察されなくなるまで施した。
次いで、このリポソーム組成物を、0.2ミクロンのポ
リカーホネートフィルターで濾過して滅菌した。いくつ
かの実験では、痕跡量の放射標識されたPC1シバルミ
1ヘイル】4Cフオスフアチジルコリン[デュポン([
)uponl)社製]を加えて、双方のタイプの放射標
識リポソームを形成した。
B、トランスフォーミング成長因子の製造期限切れのヒ
ト血小板から、コーン(Cone)ら、血小板からのト
ランスフォーミング成長因子βの改良された精製法”、
アナリティカル バイオケミスドリー(Analyli
cal Biochemistry)  168 :7
1−74 (1988)に記載の方法の改良方法に従い
、TGF−βを精製した。上記文献に記載の方法の精製
の最終工程に引き続き、アセトニトリル中のTGF−β
を、2回シリコーン処理(siliconize)され
たガラスチューブ中に分配し、使用するまで凍粘保存し
た。
C,TGF−βのリポソームへの粘合乃至組合せTGF
−βを含有する2回シリコーン処理されたガラスチュー
ブを、15分間凍結乾燥してアセトニトリル量を減少さ
せた。2つのタイプのリポソーム組成物すなわち中性の
ものおよびマイナスに帯電したものを、蛋白質に対する
脂質の比を変化させて、総(its、2mlとなるよう
に添加した。
いくつかの実験では、放射活性のあるTGF−β、12
51−TGF−β[バイオメディカル チクノロシーズ
 インコーホレーテッド(BiomedicaTech
nologies、  Inc、  Sloughfo
n、 MA)から入手]3 を加えた。次いで、双方の混合物を、穏やかな攪拌下に
4℃にて1時間インキュベートした。
実施例2 TGF−β−リポソーム集合体の特性 A、脂質/蛋白質比の選択 リポソームに対するTGF−βの最大結合を得るための
脂質/蛋白質比を決定するために、18:1.55:1
.167:1および500:1(W/W)の脂質/蛋白
質比を用いた。第1図に示すように、集合体中に存在す
る1251−TGF−βの%濃度は、比が18:1の時
は60%で、比が167:1の時に約71.5%に増加
した。
167 : 1より大きい脂質/蛋白質比では、リポソ
ームに対するTGF−βの結合の有意なljQ加は観察
されなかった。従って、脂質/蛋白質比500 : 1
をTGF−βとリポソームとの結合に選択した。
4 TGF−βとリポソームとの結合の効率および条件を決
定するために、脂質:蛋白質比500:1の調製試料を
、SV/−60回転子を使用するベックマン式超遠心分
離機により、38000 +pmにて16時間、不連続
的ショ糖密度勾配で遠心分離に供した。
125■の存在について、ガンマ−計数管で、放射活性
を1i11定した。コーン(Cone)ら(上記)が記
載するように、指示物質としてミンク)沖」1皮細胞(
CCL64)を用いる阻害4Iり定により、TGF−β
を測定した。
第1表に示すように、”’ I−TGF−βの泳動パタ
ーンは、TGF−βとP C/P Sリポソームとの結
合を示した。中性PCリポソームの調製試料における+
25 I−TGF−βの泳動パターンは、脂質が存在し
ない調製試料(以下“N0NE”とする)における12
5 I−TGF−βの泳動パターンに類似していた。こ
のことは、TGF−βが中性PCリポソームと結合して
泳動するよりも、密度勾配中を非結合の蛋白質として泳
動したことを示す。反対に、負にチャージされたP C
/P Sリポソーム調製試料を用いた場合、TGF−β
は、タイトなHght)泳動パターンを示し、ショ糖濃
度5%、10%および20%中に泳動した。これらの各
濃度における生物学的に活性なTGF−βの存在を、ミ
ンク祁上皮細胞(CCL−64)アッセイにより測定す
ると、94.5ngよりも大きかった。反対に、TGF
−βおよびPCリポソームを用いる場合、密度勾配にお
けるどのバンドにも21ngを」1回るTGF−β活性
は観察されなかった。これらの結果は、125 I−T
GF−βの存在が、P C/P S調製試料中の増加し
たTGFβ活性に対応することを示唆する。
P C/P Sリポソームと結合したTGF−βは、不
連続ショ糖密度勾配においてタイトな泳動パターンを示
したことに加えて、PCリポソームと桔合したTGF−
βまたは非結合TGF−βに比べると、超遠心分離管に
対する非特異的N’ S性を殆んど示さなかった。特に
、第1表の下部に示されるように、PCリポソームまた
はTGF−βのみの存在において、1251.TGF−
βは僅か8%であった。従って、TGF−β分子の付着
性は、P C/P Sリポソームと結合した場合、可成
り減少すると思われた。
7 8 C,ショ糖密度勾配におけるTGF−βリポソームの分
布 2番目の実験において、バクスター−バガード(Bax
ler−Baggard)の方法、“ショ糖密度勾配の
大規模な調製のための簡便法(A Simple Me
thod 1orthe Large−5cale P
reparation of 5ucroseGrad
ienls)” 、F E B Sレターズ(FEBS
 Letters)20 (1)、117−119 (
1972年1月)に従って、連続ショ糖勾配を用いた。
PBS中の20%ショ糖の凍結および解凍を3回行ない
、勾配を調製した。TGF−βリポソーム約300μl
を勾配溶液4mlに加え、次いで100000g、4℃
にて18時間超遠心分離した。
遠心分離の終了時に、フラクションを0. 2mlずつ
勾配のトップから採取した。l皮体シンチレーション計
数管で14Cについて、ガンマ計数管で125■につい
て、放射活性をi’1lll定した。コーンらの記載す
る方法(」1記)に従って、指示物質としてミンク肺上
皮細胞を用い、標準として既知量のTGF−βを用いる
阻害llす定により、各々のフラクション中の生物学的
に活性なTGF−βの量を測定した。
第2図および第3図は、PC/PS脂質で製造されたリ
ポソーム調製試料に対するTGF−βの結合およびPC
リポソームでのみ製造されたリポソーム調製試料に対す
るTGF−βの非結合を示す。
両図において、各フラクションについて3種の測定を実
施した: 14C−PC:リポソームのPC成分の存在を示す;1
25I−TGF−β:TGF−βの存在を示す;TGF
−β活性:TGF−βの存在を確認し、TGF−βの生
物活性を示す。
第2図において、リポソーム構成成分としてPCのみを
用いた場合、TGF−βの存在および活性は、リポソー
ムの存在とは無関係であった。全ての土0のフラクショ
ン(こおいて、TGF−βの存在は10〜14cpm 
X 10’であり、TGFβの活性は0〜75ng/フ
ラクションであった。
逆に、第3図において、負にチャージされたPC/PS
リポソームを用いた場合、TGF−βの存在およびTG
F−βの活性は、P C/P Sリポソームの存在に大
きく関連した。詳しくは、フラクション4は、最高濃度
の負にチャージされたリポソームを含有し、また最高濃
度のTGF−β(25X 103cpm)を含有し、最
大のTGF−β活性(約925 ng)を示した。従っ
て、TGFβは、負にチャージされたP C/P Sリ
ポソームと結合し、中性PCリポソームとは結合しない
ことがわかる。
実施例3 インビトロにおける生物活性の/11す定TGF−βは
、ミンク肝」1皮細胞の刺激を抑制することが知られて
いるので、この作用をイン上5] l・口で生物活性を測定するために利用した。上記ミン
ク肺」1皮細胞は、MV−1−LU細胞(アメリカン 
タイプ カルチャー コレクション CCL−64細胞
)と称され、以下これをCCL64細胞とする。詳しく
は、TGF−βおよびリポソームに結合したTGF−β
の活性について、上記細胞の増殖阻害能を評価した。阻
害程度を、l・リチウム化されたチミジンの取り込みに
より測定した。
ダルベツコ修飾イーグル培地(GIBCO社製、以下“
DMEM”とする)+10%牛脂児血清(HyC1on
e社製)中に維持されたミンク肛上皮細胞(CCL−6
4)が、l・リプシンにより分泌されることは、知られ
ている。1ml当たり2XIO4個の細胞を含有する培
地0. 1mlを96ウ工ル組織培養プレートに植えた
。次いで、アッセイすべきTGF−βの標準または試料
の一部をプレートに加えた。5%Co2雰囲気下に37
°C2 で24時間培養した後、40μCi/mlのトリチウム
化したチミジンにュー イングランド ヌクレア(Ne
w England Nuclear)社製、6.7C
i/mM)25μlでパルスした。約16時間後、DM
EMでウェルを3回洗浄し、)・リプシンとともに15
〜20分間培養して、細胞を分泌させた。
次いで、半自動細胞採取機(スカトロン(Skat+o
n)製)によりガラス紙」二に細胞を集めた。同様のバ
イオアッセイにより、既知の量のTGF−βの標準+1
1線を作成した。標準1.lII線で得られた阻害と比
較して、試料中の活性TGF−βの量を測定した。
第2表に示すように、3種の処理、即ちPC/PSリポ
ソームのみ、PC/PSリポソームと1111合したT
GF−βおよびTGF−βのみについてFIN害率(%
)を測定した。第2表中の一定の存在(constan
t presence)の欄に示すように、3種の溶液
を組織培養プレートに直接分注してそのまま一定の存在
量を保った場合、TGF−βおよびリポソームと結合し
たTGF−βは、それぞれ82%および90%の高い阻
害率を示したが、リポソームのみの場合は0%の阻害率
を示した。従って、リポソームと結合したTGF−βの
生物活性は、TGF−βのみの生物活性に対応する。
細胞による吸収に及ぼすTGF−βとリポソームとの結
合の効果を試験するために、次いで細胞を順次移動させ
た。この実験において、それぞれ3種の処理を施された
同一の細胞培養物を、30分毎に新しい組織培養プレー
トに順次移した。
リポソームのみで処理された細胞は、各移動後阻害を示
さなかった。しかしながら、TGF−βのみおよびリポ
ソームと結合したTGF−βで処理された細胞の阻害パ
ターンは変化した。TGFβのみで処理された細胞では
、最初の移動後の阻害率は、移動していない時の阻害率
と本質的に同じであった。しかしながら、2度目の移動
で1(11書率は有意に低下した。即ち、TGF−βで
のみ処理された細胞は、最初の移動で83%の阻害率を
示したが、2度目の移動では僅か35%の阻害率を示し
た。3番目、4番目、5番目および最後の移動で、それ
らの細胞は阻害を示さなかった。
従って、最初の移動および2番目の移動で、細胞がTG
F−β分子を吸収して、それ以降の移動により、細胞は
抗増殖作用を示すのに十分なTGFβを含有しなかった
逆に、リポソームと結合したTGF−βて処理された細
胞は、別の阻害パターンを示した。最初の移動後、細胞
は54%の阻害率を示したが、これは細胞からのTGF
−βの漏出によるものと思われる。最後の移動で、細胞
は有意な阻害率を示した。この最総移動後の阻害率81
%は、TGFβで処理された細胞の一定の存在時の阻害
率に類似していた。従って、TGF−βが順次移動され
、最後の移動でその抗増殖効果を発揮するよう5 に、リポソームがTGF−βの細胞への結合を阻害する
しのと考えられる。
第2表 TGF−βリポソームは、血清中の 刺激されたCCL−64細胞の非吸 収性負のシグナルを排出する 対照−57081CPM 丈施例4 6 インビボでコリネバクテリウム パーブム(Cparv
un+)への免反反応にり・1するTGF−βリポソー
ム集合体の抑制能 肝臓はa■液を清適する働きをするため、バクテリア感
染は、肝臓の±1を大および肝臓中の白血球数の増加を
もたらす非特異的亜急性の肺炎を惹起することが多い。
リポソームと結合したTGF−βの活性についてのイン
ビボのアッセイとして、細菌感染により刺激された)j
キ臓細胞の増殖に対するTGF−βの阻害能を1itl
l定した。
このアッセイにおいて、C57B L / 6として知
られるマウス柿に、加熱殺菌されたコリネバクテリウム
 パーブム(CoBnebaclerium pa+v
um)(ウェルカム リザーチ ラボラトリーズfWe
lcome Re5earch Laboratori
es)  リザーチトライアングル バーク(Rese
arch TriangleP2rk)、ノース カロ
ライナから人手した)0.7または1mgを含−6fす
るPB30.2mlを腹腔内に接種した。24時間後、
(a)TGF−β1t1g、(b)PC/PSリポソー
ム0. 5mgまたは(c)PC/PSリポソーム0.
 5mgと結合したTGF−β(1,:500)  1
μgを含有するPB30゜2mlをマウスに静脈内投与
した。これらの溶液には、ショ糖密度勾配を実施しなか
った。上記の処理を1日間隔で3回繰り返した。
バクテリアで免疫化して6から8回目後、マウスを犠牲
死させた。肝臓の重量を測定し、単一細胞懸濁l夜を分
析して、バクテリアに対する免疫応答の程度を測定した
。得られた結果を第3表に示す。
TGF−βの抗増殖作用に基づいて、P C/PSリポ
ソーム0. 5mgと結合したTGF−β1μgを投与
されたマウスの肝臓は、肝臓の増大も白血球細胞の増加
も示さないであろうことが予期された。逆に、TGF−
β1 tt gまたはP C/P Sリポソーム0.5
mgを投与されたマウスのBDl’臓は、肝臓の増大お
よび免疫応答増大による白血球細胞の増加を示すであろ
うことが予期された。
尖験■において、リポソームと結合したTGFβで処理
されたマウスは、平均肺臓重量ユ09±12mgで、肝
臓中の白血球細胞2B2X106個であった。これらの
データは、免疫応答阻害率82%に対応した。逆に、リ
ポソームと粘合していないTGF−βを投与されたマウ
スは、肝臓重量165±30mgで、肝臓中の白血球細
胞308×106個であった(阻害率44%)。リポソ
ームのみを投与されたマウスは、肝臓重量224±10
mgで、肝臓中の白血球細胞440x106個であった
(阻害率は僅か10%であった)。
実験Hにおいて、リポソームと結合したTGF−βで処
理されたマウスは、平均肝臓重量139±18mgで、
肝臓中の白血球細胞227X106個であった。これら
のデータは、免疫応答増大率92%に対応した。この阻
害率の値は、TGF5つ βを投与されたマウスの場合(肺臓重量172±57m
gで、j1キ臓中の白血球細胞342x106個であっ
た(阻害率36%))の約3倍であった。
0 実施例5 リステリア菌(Lisle+ia monocytog
enesis)に対する遅延型過敏性(DTH) コーフマン(Kaulmann)およびバーン(Hah
n)、“インビボおよびインビトロにおける細胞内バク
テリアであるリステリア菌に対して特異性を有するTセ
ルラインの生物学的機能(BiologicalFun
cjions of T−Cell Lines wi
th 5pecificityfor the Int
racellular Bacterium List
eriamonocyfogenes In−VN+o
 and In−Vivo) ” 、ジャーナル オブ
 エクスセルブタ メゾイカ(JEXJl、 Med、
)、155.1754−1765  (1982年6月
)で記載されるように、リステリア菌により感染された
マウスの実験モデルは、バクテリアに対するいる。2重
盲検試験において、C57B1/6として知られている
マウス稲に5X10’濃度で生菌を注射した。5〜60
後、これらのマウスの牌臓を摘出して、単一細胞懸濁液
を調製した。粘盾性細胞を除いた後、同系の受容マウス
(即ち、免疫応答に関し、最初の注射されたマウスと逍
伝的に同一であるマウス)に対して25X106の濃度
で非粘着性肺細胞を静注した。16時間後、後で注射さ
れたこれらのマウスを3または4群に分けた。第1群は
TGF−β1μgを含有するPBSo、2mlを投与さ
れ、第2群はP C/P Sリポソー1.0. 5mg
を含有するPBSを投与され、第3群はP C/P S
リポソーム0.5mgと結合したTGF−β(1:50
0)  1Fgを投与され、第4群はPBSo、2ml
のみを投与された。
1時間後、各マウスの右後肢肉H+l:に加熱殺菌され
たリステリア菌5X107個を念むPBS501t1を
注射し、対照として、左後肢にPB350μlを注8・
Jシた。24時間後、マイクロメーターで後肢の腫脹を
fllll定した。リステリア菌投与の後肢肉に+1.
とPBS投与0後肢肉卸、の厚みの差0.0]mm3 を1DTH単位とした。
DTH単位で示される後肢肉M+I−の1庫脹の差は、
TGF−βの免疫応答に及ぼす影響に対応する。
即ち、TGF−βの抗土曽殖効果は、後肢内証の腫脹の
減少およびDTH単位数の低下として示される。第4図
および第5図に示すように、TGFβと結合したリポソ
ームの存在は、後肢の腫脹の有意な減少を惹起した。す
なわち、リポソームのみ(L I P) 、TGF−β
のみ(TGF−β)または対照(CONT)と比較する
と、リポソームと結合したTGF−β(L T )では
、有意に低下したDTH単位を示した。第4図および第
5図の両方において、TGF−βリポソーム(L T)
のD T H単位の′減少は、統計学的に有意な(pr
o、 01)免疫応答の50%低下を示す。従って、リ
ポソームと結合したTGF−βは、インビボでの免疫応
答の低下を示した。
実施例6 4 リポソーム、M−CSFおよびM−CSF−リボソー1
、集合体の調製 A、正にチャージされたリポソームの調製アウ゛アンテ
ィ ポーラ−リピズ社(AvanliPolar Li
pids、  Inc、)  (ペルハム、アラバマ州
)から閘大した卵り一α−レシチン(ポスファチジルコ
リン;PC)10mg、0. 5μCi放射標識された
ホスファチジルコリン、L−α−(シバルミ1〜イル−
114C)−ホスファチジルコリン(1,07mC1/
mMo1)  にニー イングランド ヌクレア(Ne
w Englan+I Nuclear)から附人)お
よびシグマ社から購入したステアリルアミン2. 5m
gを用いて、小型−重膜小胞タイプのリポソームを製造
した。
ステアリルアミンを用いない以外は−に記と同様にして
、中性リポソーム(対照として)を調製しノこ。
ガラス管内で脂質成分をクロロホルムと混合して、窒素
気流下に薄いフィルムに乾燥した。次いで、2fQ′i
の混合物を30分間凍結乾燥して、残留する微量の有機
溶媒を除去した。次いで、リン酸緩衝生理食塩水(PB
SSCa++およびMg”+を含有しない)を添加する
ことにより両混合物を水和して、pH7,2で5 mg
/液体1−mlの濃度に調整した。次いで、5分間渦巻
攪拌し、室温で30分間膨脹させた。その後、両混合物
をバスソニヶータ(bath 5onicajor) 
 (ラポラ)・ソー ザブライズ(Laborator
y 5upplies) 、ヒックスビル(Hicks
ville)、−ニーヨーク)で、室温で各回20分間
ずつ3回音波処理した。次いで、リポソーム調製試料を
0,2ミクロンのポリカーボネートフィルターで濾過滅
菌した。
B、マクロファージ コロニー刺激因子の調製M−CS
Fは、大腸菌中て発現されたヒI−M −C3F断片の
再生および精製により得られた。
1、構築および発現 2秤のシストロン発現システムを用いて、ヒトM−CS
Fの切片の発現を実施した。pcDhMSCFII−)
85と呼称されるCO3発現プラスミドを制限酵素Sc
a 1およびBamHiで消化した。このCO8発現プ
ラスミドは、554個のアミノ酸のM−CSF前駆体の
N末端の185個のアミノ酸残基をコードする。内部S
D配列、第1シス(・ロンをコードする終結コドンおよ
び第2ンストロンをコードする開始コドンを有する合成
リンカーで、得られたフラグメント(約450bp)を
連結させた。連結させたフラグメントをprepIL−
2D8のXbalザイトとB a m l−1tザイト
との間に押入した。得られたプラスミド、ptrpll
 −2X  M−C3FIOIは、MC3Fの151個
のアミノ酸配列をコードしており、これは、CaCl2
法により大腸菌内に形質転換された。この様な組換技術
は、係属中の米国特許出廟第07/304,692号、
1989年7 2月10出願、“ヒトコロニー刺激因子(lluman
Colony−5timulating Factor
s)″、エム、タカハシ(M、 Takahashi)
らにより開示されている。
2、再生(Renaluration)形質転換された
大腸菌細胞を、アンピシリンをも含む補足されたM9培
地ψで振盪した。細胞を集め、ペレット状に成形し、ト
リ)・ンX−100で洗浄した。j&終のベレットは、
切断されたMCSFを含有する封入体を有していた。7
,0M塩酸グアニジンおよび25mM2−メルカプトエ
タノール中に、室温で4時間攪拌下に該ベレットを溶解
した。グルタチオン溶液2000m(50mM)リス/
塩酸r111こ0.5mM還元グルタチオン、0.1m
M酸化グルタチオンおよび2.0M尿素を含む、pH8
,5)に、激しく攪拌しつつ、上記溶解したベレットを
ゆっくりと滴下した。溶を夜を4°Cで48時間保持し
た。
再生した溶lfklOmlをアミコン膜で500μ18 に濃縮した後、速度0. 7ml/分で5hodexW
S−803カラム(こかけて、ゲル?濾過した。
該カラムは、0.3M塩化すl・リウムを含有する40
mMリン酸ナトリウム(pH6,8)で予め平衡化して
おいた。フラクションを集めて、M−CSF活性を測定
した。
3、精製 再生した溶液を遠心分離し、上澄を、5 Q m Mト
リス/塩酸(pH8,5)で予め平衡化したQAE−Z
eTA  Prep  カートリッジ100(ファルマ
シアーL K B製)に供して、0.5M塩化すトリウ
ムの50 m M l□リス/塩酸溶液(pH8,5)
で溶離させた。
硫酸アンモニウムで沈殿させた後、4QmMリン酸すト
リウム(p H7゜4)で予め平衡化されており、且つ
硫酸アンモニウム飽和溶液を含有するT S K−ゲル
 フェニル−5PW  HPLCカラム(1・−ソー(
Toso)、 21.5 X 1500mm)に」二l
登を供した。6〜3%硫酸アンモニウムで活性フラグメ
ントが得られ、濃縮され、40mMリン酸すトリウム(
pH7,4)で交換した。
40mMリン酸すトリウム(p H7,4)で予め平衡
化されたTSK−ゲルDEAE  SPWカラム(トー
ソー(Toso)、 21.5 X 150mm1に濃
縮した試料を供し、NaCA!勾配により流速3m17
分で溶離した。
C,リポソームM−C3F集合体の調整下記第4表に示
すリポソームとM−CSFとの組合わ・せを−銘に混合
し、渦巻攪拌し、室温で5分間インキュベートした。
71 実施例7 M−C3Fリポソ一ム集合体の特性 A、シヨ糖勾配の調製 ショ糖勾配を調製するために、20%ショ糖溶液1ml
をポリアロマ−試験管1〜7の底部に添加した。各層の
トップに、10%、5%および2.5%シヨ糖溶液]1
mlずつを注意して重層して、各々の試験管中の最終容
量が4mlとなるようにした。
」1記実施例6の0項で得られたリポソーム−MC3F
混合物を適当に番号付けされたショ糖勾配のトップに重
層した。5W−60回転子にて400001pmで16
時間、これらの試験管をベックマン式超遠心分離機にか
けた。遠心分離の終了時、ショ糖勾配のトソブから0.
2mlずつフラクションを集め、14cおよび]25 
Iについて放射活性を測定した。14 C4直は、フラ
クション中のリポソームの相対濃度を示すものである。
同様に、】25 I僅は、フラクション中のM−C3F
’の相対2 濃度を示すものである。フラクションを濾過滅菌した後
、前記アッセイのM−C3F標準曲線から、各フラクシ
ョン中のM−C3F活性をalll定した。
B、M−CSF活性の41り定 M−C3Fに応答して増殖するマウス骨髄細胞C3H/
HeJを用いて、M−C3F活性を711り定した。平
底マイクロタイターブレー1− (コースタ−社製、ケ
ンブリッジ、M a )中に、I X 105の濃度で
細胞を植えた。リポソームとM−C3Fとの混合物を順
次希釈して、最終容量が0. 2mlとなるようにプレ
ートに加えた。
細胞を3日間培養した。培養期間終了の8時間前に、1
−μCiの[メチル−3H]TdR(6,7Ci /m
mol、ニューインクランド ヌクレア ボストン、M
 a )で細胞をパルスした。半自動細胞採取機(スカ
)・ロン、スターリング、■a)を用いて細胞を集めた
後、標準液体シンチレーション計数法に従って、[メチ
ル−3H]TdRの細胞内への取込みを測定した。
得られたフラクション中の増殖程度は、同じ条件で作成
されたM−CSF容量dll線から外挿された。ジー、
ストラスマン(G、  Strassman)ら、“β
型形質転換成長因子によるコロニー刺激因子1依存性マ
クロフアージ前駆体の増殖の制御(Regulatio
n ol Colony−5timulaling F
actor 1−dependenj Macroph
age Precursor Prolifera−t
:on by Type  βTransformin
g Growth Factor)″、ジャーナル オ
ブ イムノロジー(Journal olImmuno
logy)、14.0 (8) 、2645−2651
 (1988);アール、エヌ、ムーア(R,NMoo
reJ  ら、“コロニー刺激因子により惹起されたイ
ンターフェロンによるマクロファージ増殖性膨脂の細胞
内制御(Endogenous Regulation
 ofMacrophage Prolilerati
ve Expansion by Colony−5l
imulting factor−induced I
nterferon)” 、ザイエンス(Scienc
e)、223.178 (1984):およびニス、グ
ー。プレン(S、 K、 Put fen)ら、“イン
ビトロで分化する間の内因性の形質転換されたクラスI
IMHC遺伝子の骨髄出来マクロファージの発現(Bo
ne Marrow−derived Macroph
ageExpression of Endogeno
us and T+ans[ectedClass I
I MHCGenes during Difle+e
ntia[1onIn Vilro)  、ジャーナル
 オブ イムノロジ−137,1359(1986)。
C1結合の効率および条件 下記の第5表に示すように、125Iの泳動パターンは
、M−CSFと正にチャージされたリポソームとの結合
を示す。中性PCリポソーム調製試料(試験管4および
5のP(、−M−C3F)中のM−C3Fの泳動パター
ンは、リポソームを含有しない調製試料(試験管7のM
−CS F)中のMC3Fにより示されたパターンに類
似していた。
このことは、M−C3Fが中性リポソームと結合して泳
動したというよりも、M−CSFは、全勾5 配を通じて非結合の蛋白質として泳動していたことを示
す。逆に、正にチャージされたPC/Sリポソーム調製
試料(試験管1および2のP C/3M−CSF)を用
いる場合、M−C3Fは、タイトな泳動パターンを示し
、フラクション2〜6に極めて多く含まれた(同じフラ
クション中にPC/Sリポソームが多く含まれた)。試
験管1および2にはM−C3Fが存在し、試験管3(’
PC/Sのみ)にはM−C3Fが存在しなかった。
また、この実験は、生物活性M−CSFが正にチャージ
されたリポソームと結合したことを示した。」1記のマ
ウス骨髄細胞C3H/HeJを用いて、各フラクション
における生物学的に活性なMCSFの存在を測定した。
M−CSFのみの調製試料(試験管7)および中性PC
と結合したMCSFの調製試料(試験管4および5)に
おいて、フラクション6〜9は生物活性M−CSFを含
有していた。中性リポソームのイj在は生物学的6 に活性なM−CSFの存在に影響を与えないようにみえ
た。逆に、正にチャージされたリポソームとM−C3F
との調製試料(試験管1および2のP C/S −M−
CS F)において、リポソームが多く含まれるフラク
ションとM−CSFの存在および活性が最大であるフラ
クションは同じであった。従って、正にチャージされた
リポソームの存在は生物学的に活性なM−CSFの泳動
に影響し、M−C3Fは正にチャージされたリポソーム
と選択的に結合するものと考えられる。
7つ 本願叩細書に記載される発叩の趣旨および槽底から、そ
の他の実施態様が可能であることは、当業者にとって自
明であることは言うまでもない。
特許請求の範囲に示される本願の趣旨および目的の範囲
内で、ここに記載される実施態様は単なる例にすぎず、
本願はこれらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
第1図は、TGF−βとマイナスに帯電したリポソーム
との組合わせ乃至結合に及ぼす脂質/蛋白質比の効果を
示すグラフである。 第2図は、TGF−βと中性のリポソームとの組合わせ
乃至結合の程度を示すグラフである。 第3図は、TGF−βとマイナスに帯電したリポソーム
との祁合わせ乃至結合の程度を示すグラフである。 第4図は、リステリアに対する遅延型過敏性応答に及ば
ずリポソーム結合TGF−βの効果を示0 すグラフである。 第5図は、リステリアに対する遅延型過敏性応答に及ぼ
すリポソーム粘合TGF−βの効果を示すグラフである
。 (以   」二) 特開平3 34920 (22) 特開平3−34920 (23) 第 4 図 TGF−β T 手続、?0j正1:(自発) 平成2年6月20日 1f件の表示 平成2年特許願第105579号 補正をする者 事件との関係 特許出願人 大塚製薬株式会社

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 リポソームとこれに結合乃至組合わされた生物活性
    物質との集合体を含有する組成物であって、該集合体が
    、 (a)外表面を有する複数のリポソーム;及び(b)複
    数の生物活性物質 を含むものであり、該生物活性物質が、患者に上記集合
    体を薬学的有効量で投与した場合に、生物学的活性が実
    質的に低下しないように、リポソームの外表面に結合乃
    至組合わされていることを特徴とする組成物。 2 生物活性物質が、TGF−β及びM−CSFよりな
    る群から選ばれるものである請求項2に記載の組成物。 3 リポソームが、小さい一重膜小胞、大きい一重膜小
    胞及び多重膜小胞よりなる群から選ばれるものである請
    求項2に記載の組成物。 4 リポソームが、小さい一重膜小胞である請求項3に
    記載の組成物。 5 小さい一重膜小胞が、フォスファチジルコリンとフ
    ォスファチジルセリンとから構成されている請求項4に
    記載の組成物。 6 フォスファチジルコリンとフォスファチジルセリン
    とのモル比が、1:1である請求項5に記載の組成物。 7 小さい一重膜小胞が、フォスファチジルコリンとス
    テアリルアミンとから構成されている請求項4に記載の
    組成物。 8 (a)薬学的に有効な量の請求項1に記載の組成物
    及び(b)薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。 9 (a)薬学的に有効な量の請求項2に記載の組成物
    及び(b)薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。 10 (a)薬学的に有効な量の請求項3に記載の組成
    物及び(b)薬学的に許容される担体を含む医薬組成物
    。 11 (a)薬学的に有効な量の請求項4に記載の組成
    物及び(b)薬学的に許容される担体を含む医薬組成物
    。 12 (a)薬学的に有効な量の請求項5に記載の組成
    物及び(b)薬学的に許容される担体を含む医薬組成物
    。 13 (a)薬学的に有効な量の請求項6に記載の組成
    物及び(b)薬学的に許容される担体を含む医薬組成物
    。 14 (a)薬学的に有効な量の請求項7に記載の組成
    物及び(b)薬学的に許容される担体を含む医薬組成物
    。 15 リポソームとこれに結合乃至組合わされた生物活
    性物質との集合体を含有する組成物であって、該集合体
    が、 (a)外表面を有する複数の帯電リポソーム;及び (b)該リポソーム上の電荷の相手方(comple−
    ment)である電荷を有する複数の生物活性物質を含
    むものであり、該生物活性物質が、患者に上記集合体を
    薬学的有効量で投与した場合に、生物学的活性が実質的
    に低下しないように、リポソームの外表面に結合乃至組
    合わされていることを特徴とする組成物。 16 リポソームがマイナスに帯電しており、生物活性
    物質がプラスに帯電している請求項15に記載の組成物
    。 17 生物活性物質が、TGF−βである請求項16に
    記載の組成物。 18 リポソームがプラスに帯電しており、生物活性物
    質がマイナスに帯電している請求項15に記載の組成物
    。 19 生物活性物質が、M−CSFである請求項18に
    記載の組成物。 20 帯電リポソームが、小さい一重膜小胞、大きい一
    重膜小胞及び多重膜小胞よりなる群から選ばれるもので
    ある請求項15に記載の組成物。 21 リポソームが、小さい一重膜小胞である請求項2
    0に記載の組成物。 22 小さい一重膜小胞が、フォスファチジルコリンと
    フォスファチジルセリンとから構成されている請求項2
    1に記載の組成物。 23 フォスファチジルコリンとフォスファチジルセリ
    ンとのモル比が1:1である請求項22に記載の組成物
    。 24 小さい一重膜小胞が、フォスファチジルコリンと
    ステアリルアミンとから構成されている請求項21に記
    載の組成物。 25 (a)薬学的に有効な量の請求項15に記載の組
    成物及び(b)薬学的に許容される担体を含む医薬組成
    物。 26 (a)薬学的に有効な量の請求項16に記載の組
    成物及び(b)薬学的に許容される担体を含む医薬組成
    物。 27 (a)薬学的に有効な量の請求項17に記載の組
    成物及び(b)薬学的に許容される担体を含む医薬組成
    物。 28 (a)薬学的に有効な量の請求項18に記載の組
    成物及び(b)薬学的に許容される担体を含む医薬組成
    物。 29 (a)薬学的に有効な量の請求項19に記載の組
    成物及び(b)薬学的に許容される担体を含む医薬組成
    物。 30 (a)薬学的に有効な量の請求項20に記載の組
    成物及び(b)薬学的に許容される担体を含む医薬組成
    物。 31 (a)薬学的に有効な量の請求項21に記載の組
    成物及び(b)薬学的に許容される担体を含む医薬組成
    物。 32 (a)薬学的に有効な量の請求項22に記載の組
    成物及び(b)薬学的に許容される担体を含む医薬組成
    物。 33 (a)薬学的に有効な量の請求項23に記載の組
    成物及び(b)薬学的に許容される担体を含む医薬組成
    物。 34 (a)薬学的に有効な量の請求項24に記載の組
    成物及び(b)薬学的に許容される担体を含む医薬組成
    物。
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EP0393707A3 (en) 1992-03-18
EP0393707A2 (en) 1990-10-24
KR920010710B1 (ko) 1992-12-14

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