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Beschreibung
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Die Erfindung betrifft Liposomen mit einem Gehalt eines Sperma-Antigen-Peptids,
deren Herstellung sowie Verwendung zur Fertilitätskontrolle gemäß den Ansprüchen
1-16.
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Im Durchschnitt liegt bei 10 - 15 % aller Ehen eine Sterilität vor,
die verschiedenste Ursachen haben kann, wie z.B. Veränderungen an den Eileitern,
Störungen des ovariellen Zyklus, zervikale Faktoren oder durch (Auto)antikörperbildung
gegen Spermien. In den letzten Jahren wurden immunologische Faktoren bei der Sterilität
eingehend untersucht (E. Mettler Fortschritte der Fertilitätsforschung Bd. IV, 1977),
wobei versucht wurde, Sperma-Antigen zu isolieren und für die Fertilitätskontrolle
einzusetzen.
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Die Sperma-Antigene zeigen jedoch keine ausreichende Stabilität und
zuverlässige Wirksamkeit.
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Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, definierte Sperma-Antigen-Peptide
zu isolieren und sie zu Präparaten zu verarbeiten, die eine hohe Wirksamkeit gewährleisten.
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Es wurde nun überraschend gefunden, daß man stabile Spermatozoen-Peptide
mit hoher immonogen Potenz erhalten kann, indem man die Peptide in Liposome einkapselt.
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Spermatozoen-Antigen-Präparation: - Gewinnung: Zur Ablösung der Spermotozoen-Peptide
werden 100 ml Sperma zentrifugiert (10 Minuten, 150 x g) und dreimal bei 40C mit
PBS gewaschen. Die gewaschenen Spermatozoen werden dann in 50 ml PBS suspendiert
und 180 Minuten bei 370C nach Zugabe von 10 mM Calciumchlorid-Lösung inkubiert.
Dann folgt eine erneute Zentrifugation bei
5000 x g über 10 Minuten.
Der Uberstand wird lyophylisiert und abgebaut. Das Sediment wird lichtmikroskopisch
bei einer Vergrößerung von 2 x 200 analysiert.
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- Reinigungsverfahren und Analyse der Peptide - Gel-Filtrations-Chromatographie
400 mg des lyophylisierten Spermatozoenextraktes werden in 4 ml einer 1 %igen Essigsäure-Lösung
aufgelöst und auf eine Sephadex G-25-Säule aufgetragen. Die Säule wird equilibriert
und das Peptidgemisch mit einer 1 %igen Essigsäure-Lösung in 4 ml Fraktionen aufgetrennt.
Zur Molekulargewichtsbestimmung werden als Marker Bradykinin (1090 Dalton), Bacitracin
(1450 Dalton) und Garamicidin (2000 Dalton) verwendet.
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Dünnschichtchromatographie Die Gelchromatographie-Fraktionen von niederem
Molekulargewicht werden gepoolt, lyophylisiert und in 200 pl H2O gelöst. Die Proben
werden dann auf eine präparative Dünnschichtchromatographie-Platte aufgetragen und
mit folgendem Lösungsmittelsystem die aufsteigende DSC durchgeführt: Essigsäure/Pyridin/Butanol/H20
(3:10:15:12). Nach dem Lauf wird ein schmaler Streifen im Zentrum der Platte mit
Ninhydrin besprüht und die korrespondierenden Bänder werden mit 1 %iger Acid-Essigsäure-lösung
herausgelöst.
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- Dünnschichtelektrophorese Die in der DSE eluierten Banden werden
lyophylisiert und je zur Hälfte für den Immuno-Protein-Assay sowie für die DSE verwendet.
Die DSE-Proben werden auf Ze11-400-Platten ungefähr 6 cm von der Anode aufgetragen,
die Plattenwerden mit Elektrophoresepuffer befeuchtet (Pyridin/ Essigsäure/H20/Aceton
/ 5:10:197, 5:37,5) bei pH 4,4. Die angefeuchtete Platte wird dann 90 Minuten bei
10 Volt/cm elektrophoresiert. Nach Beendigung des Laufes werden die Peptide eluiert.
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Die erhaltenen Peptide haben u.a. folgende Sequenz Asp-Pro-Trp-Trp-Cys-Phe-Asp-Lys-Phe-Glu
bzw.
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Asp-Pro-Trp-Trp-Cys-Phe-Asp-Lys-Phe-Glu Asp-Pro-Trp-Trp-Cys-Phe-Asp-Lys-Phe-Glu
Die Aktivität der Peptide kann gesteigert werden durch Kopplung mit Prolin-Tripeptiden
nach an sich bekannten Verfahren.
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Die erhaltenen Peptide haben die allg. Formel
worin n = 1 oder 2 und R = H oder (-Pro-Pro-Pro)n bedeuten.
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Weitere Peptide haben u.a. folgende Sequenz: Cys-Gly-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Trp-Trp-Cys
Der Immunspezifische Nachweis der Spermatozoen-Peptide kann wie
folgt durchgeführt'werden: - Markierung des Protein-A Die 125I-Markierung des Proteins
erfolgt durch das BOLTON-HUNTER-Reagenz (N-Succinimidylester der H-Parahydroxyphenyl-3,5-di-125I,Propion-Säure)
150 p1 des BOLTON-HUNTER-Reagenz (200 yCi) werden unverdampft und mit 50 ug Protein-A
(Deutsche Pharmazie) in 0,1 ml einer 0,05 M Phosphatpufferlösung bei pH 8 inkubiert
(15 Minuten bei 20"C). Die Protein-Jodierung wird durch das Zufügen von 0,1 ml einer
je 0,1 molaren Lösung von Glycin/Alanin und Lysin gestoppt. Nach 30minütiger Inkubation
bei 200C füge man 0,05 ml PBS hinzu und chromatographiert das Reaktionsgemisch an
einer Sephadex G-25-Säule..
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Die Säule wird mit 0,06 molarem Phosphatpuffer auf pH 7,4 equilibriert
und das markierte Protein-A-Gemisch in eine Markierungseffizienz bei 110 Ci/mm Protein-A
bestimmt.
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- Peptid-Koppelung 100 ul Sepharose 4B Gel mit einer Bindungskapazität
von 5-7 umol Glycyl-deucin/ml gequollenem Gel wird zur Koppelung mit 100 ul DSE-Peptid-Gemisch
2 Std. inkubiert (2 Std. 250C und 2 Std. 4"C). Das Gel wird dreimal mit Tris-HCl-Puffer
0,05 molar bei pH 4,5 und HCl-Puffer 0,05 molar bei pH 8 gewaschen,'um die nicht
reagierenden Bindungsstellen zu blockieren. Die gewaschenen Antiseren werden in
einer Menge von 150 mikrol zugegeben.
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Die Peptid-Koppelung kann auch direkt an Nylonkügelchen (3,2 mm)
durch Inkubation (24 h, 4 "C) erfolgen (Kapazität ca. 1 pg/Kügelchen) - Antigen-Nachweis
Sperm-agglutinierende, sperm-immobilisierende Seren und Seren ohne Sperma-Antikörperaktivität
werden in 150 pl-Portionen dem gekoppelten Peptid zugegeben und 2 Std.
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bei Zimmertemperatur und 24 Std. bei 4"C inkubiert.
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Anschließend dreimal waschen mit Puffer und Messen des
gebundenen
Protein-A im Gammazähler. Bei jedem Versuch finden dreifache Bestimmungen statt.
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Die Bestimmung der am Gel gebundenen Peptidkonzentration wird wie
folgt durchgeführt.
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100 p1 der an Sepharose gekoppelten Peptide werden in 250 p1 H2O suspendiert
und mit 500 p1 Ninhydrin-Reagenz im kochenden Wasserbad 20 Minuten inkubiert. Nach
Abkühlung des Gemisches wird die optische Dichte bei 578 pm gemessen.
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Als Standard-Kontrolle dient das Dipeptid-Glycyl-deucin.
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Zur Reduktion der unspezifischen optischen Dichte durch vom Gel hydrolysierte
Estergruppen wird für jede Bestimmung eine neue Charge des aktivierten Sepharose
4B-Gels verwendet. Die spezifische Aktivität der Spermatozoen-Peptide wird als gebundenes
Protein-A (cpm), geteilt durch gekoppeltes Peptid angegeben.
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- Liposomen-Inkorporation Um die Spermatozoen-Peptide immunogen zu
machen, erfolgte eine Liposomen-Inkorporation. Die Liposome bewirken eine Erhöhung
der lokalisierten Antigen-Konzentration.
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Zur Testung wurden Liposome mit Spermatozoen-Peptiden und Liposome
ohne Spermatozoen-Peptide eingesetzt.
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- Immunisierung von BALB-C-Mäusen Für den Versuch wurden 2 Gruppen
mit je 5 geschlechtsreifen weiblichen Mäusen im Alter von 6 Wochen einmal pro Woche
mit dem in Liposomen eingekapselten Spermatozoen-Peptid intraperitoneal immunisiert.
In der Kontrollgruppe wurden die Spermatozoen-Peptid-freien Liposome eingesetzt.
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Die Immunisierung dauerte 9 Wochen. Pro Injektion wurden 100 p1 Liposomenpräparation,
aufgelöst in sterilem PBS, eingesetzt.
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Jedes Tier erhielt insgesamt eine Dosis von 5 pg liposominkorporiertem
Peptid oder 5 pg reines Peptid pro Gramm Körpergewicht. 4 Tage nach jeder Injektion
wurden die Mäuse im retrobarbitalen Plexus punktiert und der Mikrosperm-Agglutinations-
und Mikrosperm-Immobilisationstest zur Ermittlung der Titer gegen die Spermatozoen-Peptide
festgestellt.
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- Immuabsorptionstest Zum Nachweis der Sperma-Spezifität der Mäuse-Immunseren
wurden mit den gepoolten Seren folgende Immunabsorptionsteste durchgeführt: 1. 50
p1 gepooltes Antiserum wurde mit 1 x 107 Humanspermatozon erschöpfend absorbiert;
2. Absorption von 50 yl gepooltem Antiserum mit 5 pg reinen Liposomen; 3. Absorption
von 50 p1 mit 108 Staphylococcus aureus Zellen (COWEN-Stamm)t 4. Absorption mit
5 pg in Liposomen inkorporiertem Spermatozoen-Peptid.
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Die Absorption erfolgte 3 x 12 Std. bei 40C.
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Das Experiment der Immunisierung von geschlechtsreifen Mäusen mit
in Liposomen-inkorporierten Spermatozoen-Peptiden ergab bei den immunierten Tieren
von der Dauer der Immunisierung abhängige Anstiege der Titer.
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Die längste Immunisierung ging über 8 Wochen.
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Als Kontrolle wurden Mäuse mit reinen Liposomen immunisiert, dabei
wurde während des gesamten Immunisierungsverlaufes nur ein geringer Anstieg des
Immunisierungsverlaufes erzielt.
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Eine signifikante Erhöhung der sperm-immobilisierenden Titer ergibt
sich weitaus früher als eine der sperm-agglutinierenden Titer : Sperm-Immobilisation
- deutlicher Titer-Anstieg nach 2 Wochen, Sperm-Agglutination - deutlicher Titer-Anstieg
nach 4 Wochen; maximaler Titer-Anstieg in beiden Gruppen 1:16.000. Auch 3 Monate
nach der letzten Booster-Injektion wurden anhaltend hohe Titer gefunden.
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Bei in früheren Experimenten durchgeführten laimunisierungen mit ganzen
Spermatozoen unter Zusatz von Freud's Adjuvans-Zusatz konnten immer nur maximale
Titer-Erhöhungen von 1:2,048 erreicht werden.
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Die Spezifität der gewonenen Antiseren wurden durch erschöpfende Immunabsorption
mit ganzen Spermatozoen gebracht. Die Absorptionstests mit Staphylococcus aureus
zeigten, daß die verantwortlichen Anti-Spermatozoen-Antikörper in der Subklasse
IgG2a, IgG2b und/oder IgG3 fällt.
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Mit Liposomen allein sowie mit in Liposomen inkorporierten Spermatozoen-Peptide
konnte keine Immunabsorption nachgewiesen werden.
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Die Tatsache deutet auf eine vollkommene Abkapselung der Peptide in
der wässrigen Phase des Liposoms.
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Zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten, insbes.
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zur parenteralen Verabreichung, wurden die Sperma-Antigen-Peptide
in Liposomen eingekapselt.
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Liposome sind pharmazeutische Zusammensetzungen, in welchen die Wirkstoffe
in Teilchen enthalten sind, die am wässrigen und Lipidschichten in konzentrischer
Anordnung bestehen. Der Wirkstoff kann sowohl in der wässrigen als auch in der Lipidschicht
enthalten sein.
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Die Lipidschicht besteht im allgemeinen aus einem Phospholipid, wie
z.B. Phosphatidylcholin, ggf. einem Stearin, wie z.B. Cholesterin, und ggf. einer
ionischen grenzflächenaktiven Substanz, wie Dicetylphosphat, Phosphatidsäure, Stearylamin
oder Stearylaminacetat.
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Zur Herstellung der Liposome werden die Phospholipide in einem geeigneten
Lösungsmittel wie Ether, Ester oder Kohlenwasserstoffe, insbesondere jedoch in organischen
Lösungsmitteln, wie Diethylether, Chloroform, Tetrahydrofuran, I sopropyl ether
oder Mischungen dieser Lösungsmittel gelöst.
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Als Phospholipide kommen ein oder mehrere natürliche oder synthetische
Phospholipide aus der Gruppe Phosphatidylcholin, hydriertem Phosphatidylcholin,
Phosphatidylethanolamin, N-Acylphosphatidylethanolamin, Phosphatidylinosit, Phosphatidylserin,
Lysophosphatide, Phosphatidylgylcerol, Phosphatidsäure oder Gemische aus mehreren
solcher Phospholipide, wie z.B. Gemische aus Phosphatidylcholin und Phosphatidylglycerol
oder Phosphatidylcholin mit Phosphatidsäure und Phosphatidylethanolamin oder sonstige
Phosphatidylcholin-Mischungen mit 20-98 % Phosphatidylcholin-Anteil in Frage. Auch
können den Phospholipiden noch andere Lipide, wie z.B. Sphingomyclin, Kardiolipin,
Glycolipide, Ganglioside, Cereproside oder Steroide wie Cholesterin, Tocopherol
oder Gallensäuren wie Cholsäure, Desoxycholsäure, Taurocholsäure, Ursocholsäure
oder Desoxyursocholsäure oder Fettsäuren, Stearylamine, langkettige Alkohole udgl.
zugegeben werden. Zu den gelösten Phospholipiden wird eine wässrige Zubereitung
des Peptids gegeben.
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Vorzugsweise wird die wässrige Phase durch Pufferung auf einen pH-Wert
gebracht, bei dem das Peptid stabil ist. Das Gemisch aus in organischen Lösungsmitteln
gelösten Phospholipiden und wässriger Zubereitung des Peptides wird mit geeigneten
Emulgiergeräten emulgiert, bevorzugt mittels Ultraschallbestrahlung bei Temperaturen
von ca. -100C bis 60"C, bevorzugt bei 0-20"C. Die Beschallung wird ca, 2-12 Minuten
durchgeführt, anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen.
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Erhalten wird ein Konzentrat, welches das Peptid in Phospholipid-Kügelchen
vom Durchmesser von ca. 200-4000 A
eingeschlossen enthält. Das
Konzentrat kann bei Bedarf in Wasser gelöst bzw. dispergiert angewendet werden.
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Das Peptid kann auch in die Phospholipide eingeschlossen werden, indem
man die Phospholipide in Wasser emulgiert bzw. dispergiert, ggfs. unter Anwendung
von Ultraschall.
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Dazu wird dann das Peptid direkt eingerührt oder unter vorheriger
Auflösung in Wasser zugegeben. Diese Mischung wird anschließend bei -10°C bis -50°C,
insbesondere bei -100C bis -300C eingefroren. Danach kann die aufgetaute Mischung
mit der notwendigen Menge Wasser oder einer Zuckerlösung wie z.B. Glucose verdünnt
und angewendet werden.
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Das Peptid kann auch mit den Phospholipiden im wässrigen Medium gemischt
werden und anschließend einer Ultraschallbehandlung unterworfen werden.
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Beispiel 1 73,5 mg Phosphatidylcholin werden in 100 ml bidest. Wasser
dispergiert. Man gibt 1 ml dieser Dispersion in ein Reagenzglas mit 105 pg des Peptides
und lyophilisiert die Lösung. Der Rückstand wird erneut in 1 ml bidest. Wasser aufgelöst
und im Ultraschallbad 10 Minuten behandelt. Das erhaltene Präparat kann zur parenteralen
Anwendung eingesetzt werden.
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Beispiel 2 Eine 10 %ige Phosphatidylcholin-Lösung wird im Ultraschallbad
10 Minuten behandelt und dann mit bidest. Wasser auf eine Konzentration von 0,735
mg pro ml verdünnt. Man gibt 1 ml dieser Lösung in ein Reagenzglas, welches 105
pg Peptid enthält und löst durch kurzes Schütteln.
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Beispiel 3 105 pg peptid werden mit 1 ml einer Phosphatidylcholin-Lösung
(147 mg auf'100 ml Wasser) versetzt, lyophilisiert, 0,5 ml 0,3 m Glucose-Lösung
zugegeben und 10 Min. im Ultraschallbad behandelt.
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Beispiel 4 Eine 10 geige Phosphatidylcholin-Lösung wird im Ultraschallbad
10 Minuten behandelt. Die Lösung wird mit Wasser auf 1,47 mg pro ml verdünnt. 105
pg Peptid werden mit 1 ml dieser Lösung versetzt, lyophilisiert und 0,5 ml 0,3 m
Glucose-Lösung zugegeben.
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Beispiel 5 73,5 mg Phosphatidylcholin 35,2 mg Cholesterin 8,0 mg Dicetylphosphat
105 pg Peptid werden in Chloroform/Methanol (1:1) gelöst. Die Lösung wird in einen
Kolben gegeben und im Rotationsverdampfer bei 370C zu einem dünnen Film eingedampft.
In den Kolben
werden ca. 20 ml eines 5 m Phosphatpuffer gegeben
und bei 65"C geschüttelt bis alles suspendiert ist. Die Suspension wird 2 x 20 sec
mit einem Stab beschallt und die Lösung 1 Std. stehengelassen. Die Lösung kann so
verwendet werden oder die Liposome können durch Zentrifugieren bei 300.000 g abgetrennt
werden.
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Beispiel 6 0,75 g Phosphatidylcholin, 0,2 g Phosphatidylethanolamin
und 105 pg Peptid werden in Ethanol gelöst. Die Mischung wird eingeengt in einen
Rundkolben, wobei sich an der Wand des Kolbens ein dünner Film bildet.
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30 ml Wasser werden in den Kolben gegeben und solange geschüttelt,
bis eine Suspension entsteht. Diese Lösung wird bei 10°C bei 20.000 psi durch eine
"French pressure cell" gedrückt. Dauer 8 min. Die resultierende Lösung enthält zu
91 e unilamellare Liposome, die kleiner als 200 A" im Durchmesser sind.