DE68919225T2

DE68919225T2 - Zusammensetzung für makrophag-aktivierung.

Info

Publication number: DE68919225T2
Application number: DE68919225T
Authority: DE
Inventors: Dennis Cornelius; Karl Swenson; Gerald Vosika
Original assignee: ImmunoTherapeutics Inc
Current assignee: ImmunoTherapeutics Inc
Priority date: 1988-07-08
Filing date: 1989-01-24
Publication date: 1995-03-30
Anticipated expiration: 2009-01-25
Also published as: JPH03505724A; WO1990000396A1; JP2724338B2; ATE113476T1; HK1006539A1; DE68919225D1; US4950645A; EP0426667A1; EP0426667B1; CA1338948C; EP0426667A4

Description

Die vorliegende Erfindung stellt eine neue lipohile Disaccharidtripeptid-Verbindung bereit, die eine verbesserte Antitumorwirksamkeit besitzt, sowie eine in Liposom eingekapselte Zusammensetzung, die diese Verbindung enthält.
Von intakten mikrobiellen Mitteln ist bekannt, daß sie Antitumorwirkungen sowohl bei experimentell induzierten als auch bei menschlichen bösartigen Tumoren haben. Die aktiven Komponenten, die aus Peptidoglykan-Zellwandgerüst und Trehalosedimykolat bestehen, sind aus Mykobakterien isoliert worden. Diese aktiven Komponenten, insbesondere wenn sie an Mineralöl oder Squalen gebunden sind, sind bekanntlich so aktiv wie die intakten mikrobiellen Mittel. Siehe zum Beispiel E. Ribi, et al., Ann. NY Acad. Science, USA, 277, 228-236 (1976).
Von dem Zellwandgerüst von Nocardia rubra (N-CWS) ist auch bekannt, daß es Makrophagen aktiviert. Intravenös verabreicht, kann ölgebundenes N-CWS einige Ratten mit experimentellen Lungenmetastasen heilen. Siehe zum Beispiel S. Sone, et al., Cancer Immunology Immunotherary, 12, 203-209 (1982). Kleinere, wasserlösliche monomere Einheiten von Zellwandpeptidoglykanen zeigten, daß sie adjuvansaktiv sind. Adjuvantien sind Verbindungen, die eine nicht spezifische Stimulation des Immunsystems eines Menschen oder von anderen Säugern bewirken, was zu einer erhöhten Bildung von Antikörpern und einer Erhöhung der Schutzreaktion des Organismus, z.B. gegen Infektion, führt. Solche monomeren Einheiten haben auch Antitumoraktivität gezeigt wenn sie intravenös verabreicht werden, zum Beispiel Mäusen, die an dem Lewis Lungenkarzinom oder dem MCA Mammakarzinom leiden. Siehe zum Beispiel, Sava, G. et al., Cancer Immunology Immunotherapy, 15, 84-86 (1983).
Die aktiven Komponenten dieser Organismen sind isoliert, gereinigt und synthetisiert worden. Diese Komponenten sind Glykopeptide, die eine breite Klasse von organischen Verbindungen bilden, die einen Zuckerteil und einen Peptidteil aufweisen. Von in den Zellen gefundenen Glykopeptiden ist bekannt, daß sie nicht nur die Adjuvansaktivität behalten, wie durch ihre Kähigkeit gezeigt wurde, die Antikörperantwort zu erhöhen, sondern auch Antitumoraktivität besitzen, wie durch ihre Fähigkeit gezeigt wurde, Makrophagen zu aktivieren, cytotoxisch zu werden und Tumorzellen zu zerstören. Zum Beispiel ist von Muramyldipeptiden (MDP), (z.B. N-Acetylmuramyl- -alanyl-D-isoglutamin) und einer großen Zahl von MDP-Derivaten bekannt, daß sie Antitumor- Makrophagen aktivierende Eigenschaften haben.
Sowohl intakte mikrobielle Mittel als auch viele MDP-Verbindungen haben ein unerwünschtes Maß an Toxizität gezeigt. Intakte mikrobielle Mittel, die allein oder in einer Öl-in- Wasser-Emulsion, wie z.B. Kreundsches Adjuvans, verwendet werden, können eine erhöhte Empfindlichkeit gegen Histamin, Granulombildung und Hyperplasie der Leber und Milz verursachen. Toxische Reaktionen als Folge der Verabreichung von bestimmten MDP-Verbindungen haben Fieber und allgemeine Gefäßentzündung umfaßt, wenn sie in wiederholten Dosen verabreicht werden.
Beides, die in vitro und in vivo Antitumoraktivität, vieler Mono- und Disaccharidpeptide wird durch ihre Einarbeitung in Liposomen erhöht. Lipophile Derivate von immunisierenden Mitteln und/oder Antitumormitteln sind bekannt und sind geeignet für die wirksame Einarbeitung nützlicher Mittel in Liposomen, zum Zielen auf Makrophage und Aktivieren von Makrophagen zum cytotoxischen Zustand. Zum Beispiel stimulierte ein lipophiles Derivat von MDP, Muramyldipeptid-glyceryldipalmitat (MDP-GDP), die Makrophagenaktivität in vitro, wenn es in Liposomen eingebettet war. Siehe N. C. Phillips et al., Cancer Research, 45, 128-134 (1985).
Daher besteht ein Bedarf an einer neuen Glykopeptid-Verbindung, die verbesserte Adjuvans und/oder Antitumoraktivität besitzt, die leicht in Liposomen eingearbeitet wird und die nicht toxisch ist in Dosierungen, die deutlich über vorbekannten wirksamen menschlichen Dosierungen liegen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues lipophiles Disaccharidtripeptid-Derivat der bekannten Basisverbindung Muramyldipeptid (MDP) bereit. Die erfindungsgemäße Verbindung ist vorzugsweise in multilaminaren Liposomen eingekapselt, die beispielsweise aus Phosphatidylcholin und Phosphatidylglycerin gebildet werden können. Die Verbindung ist bei der Aktivierung menschlicher Monocyten mit anschließender Zerstörung von Tumorzellen wirksam. Die Verbindung ist auch in Dosierungen nicht toxisch, die deutlich über bekannten menschlichen Dosierungen liegen.
Die erfindungsgemäße Verbindung hat die Formel (I):
in der R¹ (C&sub1;-C&sub5;)Alkyl-, R² (C&sub1;-C&sub5;)Alkyl-, R³ und R&sup4; einzeln (C&sub6;-C&sub3;&sub0;)Alkylgruppen sind, die etwa 0 bis 4 Doppelbindungen enthalten. X ist ein Peptidylrest, z.B. ein Aminosäurerest der allgemeinen Formel:
-NH- H- -
Vorzugsweise ist X ein -Alaninrest der Formel:
Deren pharmazeutisch akzeptablen Salze sowie ein Liposom, das eine Verbindung der obigen Formel enthält, liegen auch im erfindungsgemäßen Bereich. Obwohl mit wenigen Ausnahmen natürlich vorkommende Proteine nur die -Enantiomorphe der Aminosäuren, aus denen sie aufgebaut sind, enthalten, können in den vorliegenden Zusammensetzungen auch -Enantiomorphe ebenso wie -Mischungen der Aminosäuren verwendet werden.
Die erfindungsgemäße Verbindung (Verbindung I) ist ein neues lipophiles Disaccharidtripeptid-Derivat der bekannten Basisverbindung Muramyldipeptid (MDP).
Die Verbindung I umfaßt ein Glucosaminderivat (Glc) mit einer Acylgruppe mit etwa 2 bis 6 an den Stickstoff gebundenen Kohlenstoffen. Vorzugsweise hat die Acylgruppe zwei Kohlenstoffe (Acetyl) unter Bildung von N-Acetylglucosamin (GlcNAc).
Der N-Acylglucosaminteil ist an einen N-Acylmuramylteil gebunden. Die Acylfunktionalität, die an den Stickstoff der Muramylgruppe gebunden ist, hat etwa 2 bis 6 Kohlenstoffatome, vorzugsweise zwei Kohlenstoffe unter Bildung einer N-Acetylmuramylgruppe. Das alternierende Disaccharid GlcNAc- MurNAc ist ein natürlich vorkommendes Disaccharid, das in Bakterienzellwänden als Teil eines polymeren Glycopeptids gefunden wurde. Siehe US-Patent Nr. 4 395 399.
Der Disaccaridteil der Verbindung I N-Acylglucosamin-N-acylmuramat ist an das N-Ende eines Tripeptidteils durch die Lactyletherbindung an die 3-Stellung der Muramylgruppe gebunden. Der Tripeptidteil enthält das Dipeptid L-Alanyl- - isoglutamin, das in der natürlich vorkommenden monomeren Einheit des Bakterienpeptidoglykans N-Acetylmuramyl- -alanyl- -isoglutamin gefunden wird. Die dritte Aminosäure des Tripeptidteils, in der Formel der Verbindung I oben mit X bezeichnet, ist irgendein Peptidylrest und ist vorzugsweise -Alanin. Somit ist der bevorzugte Tripeptidrest L-Alanin- -isoglutamin- -alanin ( -Ala- -isoGln- -Ala). Der Disaccharidtripeptidteil der neuen Verbindung kann als N-Acylglucosaminyl-N-acylmuramyl-tripeptid bezeichnet werden.
Das lipophile Ende der erfindungsgemäßen Verbindung besteht aus einem Glycerinderivat, das mit zwei Acylgruppen substitutiert ist, die einzeln zwischen 7 und 31 Kohlenstoffe, vorzugsweise 12 bis 23 Kohlenstoffe, und etwa 0 bis 4 Doppelbindungen, vorzugsweise etwa 0 bis 1 Doppelbindungen, aufweisen. Vorzugsweise haben beide Acylgruppen 16 Kohlenstoffe C&sub1;&sub6; unter Bildung eines Dipalmitoylglycerinderivats. Die verbleibende OH-Gruppe des Glycerins ist an das C-Ende der endständigen Aminosäure, X, des Tripeptidteils gebunden.
Die neue erfindungsgemäße Verbindung kann allgemein als eine N-Acylglucosaminyl-N-acylmuramyl-tripeptid-diacylglycerin- Verbindung beschrieben werden. Vorzugsweise ist die Verbindung N-Acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl- -alanin- -isoglutamin- -alanin-dipalmitoylglycerin (GlcNAcMurNAc- -Ala-D-isoGln- -DPB oder GMTP-DPG).
Die Verbindung I kann auch als ein pharmazeutisch akzeptables Salz der obigen Formel verwendet werden. Solche Salze umfassen die Aminsalze, die sich von organischen Säuren, wie z.B. Citrat, Lactat, Hydroxysuccinat, Methansulfonat, p-Toluolsulfonat und ähnliche, ableiten, ebenso wie von anorganischen Säuren, wie z.B. Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und ähnliche Salze, wie z.B. (niedrige) Alkylsulfate und Halogenide, können auch verwendet werden. Zur Isolierung oder Reinigung der Verbindung können auch pharmazeutisch nicht akzeptable Salze verwendet werden. Jedoch können therapeu -isch nur die pharmazeutisch akzeptablen, nicht toxischen Salze verwendet werden, und sie sind daher bevorzugt.
Die Liposomen werden im allgemeinen aus Phospholipiden oder anderen Lipidsubstanzen hergestellt und werden aus mono- oder multilamellaren, hydratisierten, flüssigen Kristallen gebildet. Sie werden gewöhnlich in Dispersionen in einem wäßrigen Trägermedium verwendet. Die Verwendung von Liposomen, die Verbindung I eingebaut enthalten, liefern einen Anstieg in der Adjuvans- und Antitumoraktivität. Häufig wird auch ein Anstieg in den humoralen und/oder zellvermittelten Immunantworten beobachtet. Daher ist die Verbindung I bevorzugt in Liposomen eingeschlossen.
Es gibt eine Anzahl von konventionellen Verfahren, um Liposomen zu bilden. Irgendein nicht toxisches, physiologisch akzeptables und abbaufähiges Lipid, das Liposomen bilden kann, kann verwendet werden. Die üblichsten Lipide sind die Phospholipide und insbesondere die Phosphatidylcholine (Lecithine), sowohl die natürlichen als auch die synthetischen Phospholipide können auch verwendet werden, zum Beispiel die Phosphatidylserine, die Phosphatidylinositide oder die Sphingomyeline. Andere Lipide können auch verwendet werden, die zum Beispiel von W.R. Hargreaves und D.W. Deamer beschrieben wurden (Conference on Liposomes and Their Uses in Biology and Medicine, Sept. 14-16, 1977 New York Acad. Sci.) und in Biochem., 18, 3759, (1978).
Traditionelle Techniken und Apparaturen können verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Liposomen zu bilden. Diese Techniken sind zum Beispiel in Kapitel IV des Werks mit dem Titel "Methods in Cell Biology", herausgegeben von David M. Prescott, Band XIV, 1976, Academic Press, New York, Seite 33 und folgende.
Ein anderes Verfahren zum Einkapseln der aktiven Verbindung I in ein Liposom beinhaltet das Gießen eines Phospholipidfilms (mit oder ohne ein geladenes Lipid) durch Verdampfen aus einer Lösung in einem organischen Lösemittel und dann das Dispergieren des Films in einem geeigneten wäßrigen Medium. Im Fall von lipidlöslichen, biologisch aktiven Verbindungen, das heißt denjenigen, die mit den Lipidschichten eher assoziieren als mit der wäßrigen Phase der Liposomen, wird die Verbindung üblicherweise als ein Film zusammen mit einem Phospholipid gegossen unter Verwendung eines üblichen organischen Lösemittels. Im Fall von wasserlöslichen, biologisch aktiven Verbindungen wird die Verbindung typischerweise in die Liposomen eingekapselt durch Dispergieren eines gegossenen Phospholipidfilms mit einer wäßrigen Lösung der Verbindung. Die eingekapselte Verbindung wird dann durch Zentrifugieren, Chromatographie oder irgendein anderes geeignetes Verfahren von der freien Verbindung getrennt.
Das lipophile Ende der Verbindung I erhöht seine Einarbeitung in die Liposomen. Die Verbindung I wird vorzugsweise in ein Liposom mit einer Zweischichtmembran eingearbeitet, die im wesentlichen aus 1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin (PC) und Dioleoylphosphatidylglycerin (PG) in einem Gewichtsverhältnis von etwa 5 bis 1:1, vorzugsweise 7:3 besteht. Diese Verbindungen sind im Handel von Avanti Polar Lipids, Pelham, Alabama erhältlich.
Bevorzugte Verfahren, die zum Einkapseln der Verbindung I in ein Liposom verwendet werden können, sind in dem US-Patent Nr. 4 370 349 beschrieben, das durch Nennung Teil der Beschreibung ist. Die Verfahren beinhalten entweder (1) das Lösen der notwendigen Substanzen in einem geeigneten Lösemittel und dann das Gefriertrocknen der Lösung, Lagerung der resultierenden gefriergetrockneten Mischung und, falls erwünscht, ihre Rückbildung in eine wäßrige Liposomzubereitung, oder (2) die Herstellung einer wäßrigen Liposomzubereitung durch irgendein bekanntes Verfahren und Gefriertrocknung der Zubereitung. Falls gewünscht, kann das gefriergetrocknete Produkt zu einer wäßrigen Liposomzubereitung gemacht werden. Die gefriergetrockneten Mischungen dispergieren leicht, wenn sie mit einem wäßrigen Medium geschüttelt werden, und die Verwendung der gefriergetrockneten Liposomen führt zu Liposomzubereitungen mit engerer Teilchengrößeverteilung als eine entsprechende Zubereitung, die durch Dipergieren eines gegossenen Films erhalten wurde. Dies ist für die Reproduzierbarkeit der therapeutischen Wirkung der Liposomzubereitungen vorteilhaft. Im allgemeinen können die Zusammensetzungen in Form von Liposomen zusätzlich zur Verbindung I alle möglichen Bestandteile enthalten: Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Arzneistoffmittelträger oder andere aktive Substanzen, die in injizierbaren Lösungen oder Emulsionen verwendet werden können, die früher für die Verabreichung von Muramylpeptid-Verbindungen vorgeschlagen wurden.
Die Verbindung I, vorzugsweise in Liposomen eingearbeitet, kann wegen ihrer Adjuvans oder Antitumoraktivität verwendet werden und kann oral oder parenteral, vorzugsweise durch Injektion verabreicht werden.
Die Erfindung betrifft insbesondere medizinische Adjuvans und Antitumorzubereitungen, die Verbindung I zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält. Zubereitungen dieser Art, die besonders bevorzugt sind, bestehen aus injizierbaren Lösungen, die eine wirksame Dosis des erfindungsgemäßen Produkts enthalten.Sterile Lösungen in einer wäßrigen, vorzugsweise isotonischen Flüssigkeit, wie z.B. isotonische Salzlösungen oder isotonische Glucoselösungen, werden vorteilhafterweise für diesen Zweck verwendet. Eine einfache Lösung in destilliertem Wasser kann auch verwendet werden. Es ist auch möglich, Injektionsmedien zu verwenden, die eine ölige Phase enthalten, insbesondere Wasser-in-Öl-Emulsionen.
Solche Emulsionen werden insbesondere mit abbaubaren, pflanzlichen Ölen erhalten, wie sie z.B. in der FR-A-2 313 078 beschrieben sind, die der US-A-4 125 603 entspricht. Der bevorzugte Träger sind die oben beschriebenen gefriergetrockneten Liposomen.
Die erfindungsgemäßen Adjuvans und Antitumorzubereitungen können auch in verschiedenen Formen verabreicht werden, indem für diesen Zweck Vehikel verwendet werden, die für das gewählte Verabreichungsverfahren geeignet sind. Zum Beispiel werden Dosierungseinheiten verwendet werden in Form von Kachets, gepreßten Tabletten oder harten oder weichen Gelatinekapseln zur oralen Verabreichung und Aerosole oder Gele für die Verabreichung an Schleimhäuten.
Die Zubereitungen können auch in lyophilisierter Form vorliegen, so daß die unvorbereitete Herstellung der Adjuvans- und Antitumorzubereitungen möglich ist. Eine pharmazeutisch vorteilhafte Form umfaßt Dosiseinheiten von etwa 200 Mikrogramm bis 10 Milligramm der Verbindung I je Quadratmeter Körperoberfläche.
Verbindung 1, zum Beispiel 4-O-[2-Acetamido-2-desoxy-β- - glucopyranosyl]-2-acetamido-2-desoxy-3-O-[ -2-propanoyl- - alanyl- -isoglutaminyl- -alanin-2,3-dipalmitoyl-sn-glycerin]- D-glucopyranose, (GlcNAcMurNAc- -Ala- -isoGln- -Ala-DPG), kann aus im Handel erhältlichen Materialien hergestellt werden in etwa neun Hauptstufen. Die Stufen müssen nicht notwendigerweise in der beschriebenen Reihenfolge durchgeführt werden, wie sich aus der folgenden Beschreibung ergeben wird.
Die erste Stufe beinhaltet die Herstellung eines geschützten Aminosäure-diacylglycerins. Dies ist der lipophile Teil der Verbindung I, der an das endständige C des Aminosäurerestes, X, gebunden ist, der vorzugsweise ein L-Alaninrest ist. Zum Beispiel würde in einer bevorzugten Ausführungsform dieser Rest geschütztes -2,3-dipalmitoyl-sn-glycerin sein.
Die als Ausgangsmaterialien für die Systhese verwendeten geschützten Aminosäuren oder Peptide sind entweder im Handel in geschützter Form erhältlich oder werden nach bekannten Verfahren der Peptidchemie erhalten. Blockierungsgruppen oder Schutzgruppen, die leicht abgespalten werden können, sind diejenigen, die aus der Peptid- und Zuckerchemie bekannt sind. Für Hydroxylgruppen sind die folgenden geeignete Beispiele: Acylreste, zum Beispiel niedrigere Alkanoylreste, wie Acetyl-, Aroylreste, wie Benzoyl, und insbesondere von Carbonsäurederivaten abgeleitete Reste, wie Benzyloxycarbonyl oder niedrigere Alkoxycarbonyl, oder Alkyl, insbesondere tert.-Butyl, Benzyl, ggf. substituiert mit Nitro, (niedrigeres) Alkoxy oder Halogen, Triphenylmethyl oder Tetrahydropyranyl, jedes ggf. mit Halogen oder niedrigerem Alkoxy, wie Methoxy, substituiert oder ggf. substituierte Alkylidenreste, die die Sauerstoffatome in der 4- und 6- Stellung binden. Solche Alkylidenreste sind bevorzugt ein niedrigerer Alkylidenrest, z.B. die Methyliden-, Isopropyliden- oder Propylidenreste, oder alternativ ein ggf. substituierter Benzylidenrest.
Geeignete Reste zum Blockieren von am Ende der C-Kette stehenden Carboxygruppen umfassen tert.-Butyl, Benzyl oder Benzhydryl. Zum Schutz von freien Aminogruppen können tert.-Butyloxycarbonyl- oder Benzyloxycarbonylgruppen verwendet werden.
Diese Schutzgruppen können nach einer im Stand der Technik bekannten Art, wie Säurehydrolyse, abgespalten werden. Benzyl- oder Benzylidenreste können auch entfernt werden durch Hydrogenolyse, zum Beispiel unter Verwendung von Wasserstoff in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators, wie einem Palladium- oder Platinkatalysator.
Der zweite Schritt bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung beinhaltet die Entfernung der Schutzgruppe von der Aminosäure unter Bildung von X-Diacylglycerin, worin X ein Aminosäurerest ist, wie oben beschrieben, vorzugsweise -Alanin. Zum Beispiel ist eine bevorzugte Verbindung -Alanin-2,3-dipalmitoyl-sn-glycerin ( -Ala-DPG).
Der dritte Schritt beinhaltet die Isolierung des Disaccharidteils aus einem geeigneten Bakterium, zum Beispiel Micrococcus lysodeikticus (getrocknete Zellen sind im Handel von Sigma Chemical Co., St. Louis MO) erhältlich. Das erhaltene Disaccharid ist N-Acetylglucosaminyl-N-acetylmuramat. Die Isolierung dieses Disaccharids aus einer Biomasse von Micrococcus lysodeikticus ist bekannt und in der Literatur beschrieben. Sie umfaßt die enzymatische Hydrolyse der Biomasse von Micrococcus lysodeikticus mit Hilfe von Trypsin und Lysozym und eine weitere Reinigung in einer Säule gepackt mit Dowex 1x8 (CH&sub3;COO&supmin; Form) 200-400 mesh (Hoshino O., Zenavi U., Sinay P., Jeanloz R.W., J. Biol. Chem. 247, Nr. 2, 381 (1972); und Sharon N., Osawa T., Flowers H. M., Jeanloz R. W. J. Biol. Chemistry, 241, 223 (1966). Siehe auch US-Patent Nr. 4 427 659, das durch Nennung Teil der Beschreibung ist.
In dem oben isolierten Disaccharid sind R¹ und R² beide -CH&sub3;, die Acetylgruppen an beiden funktionellen Gruppen des Muramyls und des Glucosamyls bilden. Die analogen Verbindungen, in denen R¹ und R² einzeln C&sub2; bis C&sub6; Alkylgruppen sind, können nach im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel kann die Acetylgruppe mit einer starken Base hydrolysiert werden, zum Beispiel wie in P.H. Gross und R.W. Jeanloz (J. Org. Chem. 1967, 32, 2761) beschrieben. Dann kann ein Acylierungsmittel, das dem gewünschten einzuführenden R¹ oder R² entspricht, wie ein Säureanhydrid oder -chlorid, verwendet werden, um die gewünschte Gruppe R¹ oder R² an die funktionellen Gruppen des Muramyls oder Glucosaminyls zu binden.
Der nächste Schritt beinhaltet die Herstellung des Dipeptids Alanin-isoglutamin, das an beiden Enden geschützt ist. BOC- - alanyl-D-isoglutamin, im Handel von United State Biochemical Co. Cleveland, Ohio (USBC) erhältlich, muß in einer im Stand der Technik bekannten Art behandelt werden, um den am Ende der C-Kette stehenden Isoglutaminrest mit einem geeigneten Schutzgruppenmittel, wie einem Benzylester (-OBn) abzuschließen. BOC bedeutet N-tert.-Butoxycarbonyl. Somit wird vorzugseise BOC- -Ala- -isoGln-OBn gebildet.
Der nächste Schritt beinhaltet das Entfernen der Schutzgruppe vom Alanin durch ein bekanntes Verfahren, um zum Beispiel -Ala- -isoGln-OBn zu bilden. Der nächste Schritt umfaßt das Verbinden der funktionellen Gruppe des N-Acylglucosamin-N- acylmuramyls mit dem Alanin-isoglutaminteil. Die Kondensationsreaktion wird in einem inerten Lösemittel durchgeführt, vorzugsweise in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie Woodward's Reagent K (N-Ethyl-5-phenyl-isoxazolium-3'- sulfonat) bei einer Temperatur von etwa 0º bis 25ºC in einer Stufe. Siehe US-Patent Nr. 4 395 399.
Der nächste Schritt ist die Entfernung der Schutzgruppe mit konventionellen Mitteln unter Bildung des ungeschützten Disaccharid-dipeptids, zum Beispiel 4-O-[2-Acetamido-2- desoxy-β- -glucopyranosyl]-2-acetamido-2-desoxy-3-O-[ -2- propanoyl- -alanyl- -isoglutamin]- -glucopyranose (GlcNAcMurNAc- -Ala- -isoGln).
Der abschließende Schritt ist das Verbinden des GlcNAcMurNAc- -Ala- -isoGln mit der Aminosäure-diacylglycerin-Komponente durch herkömmliche Techniken unter Bildung der Verbindung I.
Die Verbindung I ist vorzugsweise in Liposomen eingekapselt, wie oben beschrieben. Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße Verbindung mit Phosphatidylcholin und Phosphatidylglycerin kombiniert. Typischerweise sind die Phospholipide in tert.- Butanol mit einer Konzentration von etwa 100 mg pro ml gelöst. Geeignete Mengen von PC und PG in tert.-Butanol werden so gemischt, um ein Gewichtsverhältnis von etwa 7:3 zu ergeben. Die Verbindung I wird ausgewogen und zu einem gegebenen Volumen der Lipide zugefügt unter Bildung einer Endkonzentration von zum Beispiel etwa 1 mg pro 5 ml. Das Material wird dann durch ein Filter laufen gelassen und die Zusammensetzung in Glasfläschchen verteilt. Die Glasfläschchen werden gefroren, typischerweise bei -20ºC und dann lyophilisiert, typischerweise bei 20ºC 18 Stunden. Die Glasfläschchen werden dann unter einem inerten Gas, wie Argon, abgedichtet.
Die vorliegende Erfindung wird an Hand der folgenden nicht einschränkenden Beispiele weiter beschrieben.

Beispiel 1

Herstellung von BOC- -Ala-DPG

In einen 25 ml Rundkolben (RK) wurden 208,64 mg (1,103 mMol) BOC- -alanin, 570,0 mg (1,002 mMol) 1,2-Dipalmitoyl-sn- glycerin (Sigma), 63,14 mg (0,517 mMol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) und 230,04 mg (1,200 mMol) 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDCl) gegeben. BOC ist die Abkürzung für N-tert.-Butoxycarbonyl, eine Schutzgruppe. Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) wurde zugegeben, wodurch das Endvolumen auf 14 ml gebracht wurde. Die Mischung wurde in einem Eiswasser-Bad 1 Stunde gerührt, dann bei Raumtemperatur über Nacht.
Nach dem Rühren über Nacht wurde das Lösemittel an einem Rotationsverdampfer unter Saugvakuum entfernt unter Bildung eines weißen Feststoffes, der zwischen 20 ml Ethylacetat (EtOAc) und 10 ml Wasser verteilt wurde. Die Wasserschicht wurde mit weiteren 20 ml EtOAc extrahiert. Die organischen Fraktionen wurden vereinigt und mit 2 x 20 ml gesättigtem wäßrigem Natriumhydrogencarbonat, gefolgt von 2 x 20 ml Wasser behandelt und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösemittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt unter Bildung von 648 mg (87 %) BOC- -Ala-DPG als weißer Feststoff.

Beispiel 2

Herstellung von -Ala-DPG

630 mg (0,85 mMol) BOC- -Ala-DPG wurden in 15 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst, zu dem 5,0 ml Trifluoressigsäure (TFE) gegeben wurden. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt, dann zur Trockne am Rotationsverdampfer konzentriert unter Bildung eines dunkelgelben Öls, das in 10 ml Hexan gelöst und am Rotationsverdampfer zur Trockne konzentriert wurde. Das Verfahren wurde mehrere Male wiederholt, um die letzten Spuren von TFE zu entfernen. Dieses Material wurde dann unter starkem Vakuum getrocknet unter Bildung von 606,7 mg -Ala-DPG-trifluoracetat als nicht ganz weißer Feststoff.

Beispiel 3

Herstellung von GlcNAcMurNAc

15,0 Gramm getrocknete Zellen von Micrococcus lysodeikticus (im Handel erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.) wurden in 200 ml destilliertem Wasser suspendiert und durch Rühren bei hoher Geschwindigkeit mit 250 g 0,1 mm Glasperlen 90 Minuten bei 4ºC zerrissen. Die Zellwandgerüste (ZWG) wurden von den Glasperlen durch Dekantieren entfernt und dann bei 1200 x g 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde von dem Pellet (intakte Zellen) entfernt, dann wurde bei 10000 x g 50 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und der resultierende Pellet (rohes ZWG) wurde 3 mal gewaschen durch Suspendieren in 100 ml destilliertem Wasser und bei 10000 x g 70 Minuten zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in 150 ml destilliertem Wasser suspendiert und dann in ein kochendes Wasserbad 30 Minuten gestellt.
Nach Kühlung auf Raumtemperatur wurde die resultierende Aufschlämmung bei 10000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet in 60 ml 0,05 M Ammoniumacetatpuffer (pH 7,60) aufgeschlämmt. Die resultierende Aufschlämmung wurde mit 10,0 mg Schweinepankreastrypsin (Sigma, 14600 BAC Einheiten/mg) behandelt und bei 37ºC 20 Stunden inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit destilliertem H&sub2;O wurde das ZWG-Pellet in 60 ml 0,05 M Ammoniumacetatpuffer (PH 6,30) aufgeschlämmt, mit Hühnereiweißlysozym (Sigma, 56000 Einheiten/mg, 10,0 mg) behandelt und bei 37ºC 19 Stunden inkubiert.
Das Rohprodukt wurde dialysiert, um die Enzyme und die nicht abgebauten Zellwände zu entfernen. Die Endreinigung wurde durch Ionenaustauschchromatographie auf Dowex -1 (Acetatform) erreicht durch Eluieren mit einem Essigsäuregradienten. Die Säulenfraktionen wurden zusammengefaßt auf Basis von UV-Absorption und Dünnschichtchromatographie (DC) (Kieselsäuregel, 50:39:8:3 CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/H&sub2;O/ NH&sub4;OH, 5 % H&sub2;SO&sub4;/EtOH und Erwärmen). Die positive Identifikation des Disaccharidproduktes wurde durch kolorimetrische Analyse der Muraminsäure und gesamten Hexosaminen und Massenspektometrie mit schnellem Atombeschuß erhalten. Die Ausbeuten waren 120 mg GlcNAcMurNAc aus 15 g getrockneten Zellen.

Beispiel 4

Herstellung von BOC- -Ala- -isoGln-OBn

Benzylalkohol (77,0 mg, 0,71 mMol), DMAP (33,0 mg, 0,27 mMol) und BOC- -alanyl- -isoglutamin (159,0 mg, 0,50 mMol) wurden in 5 ml CH&sub2;Cl&sub2; und 2 ml DMK gelöst. Diese Lösung wurde in einem Eiswasserbad auf 4ºC gekühlt, mit EDCl (118,0 mg, 0,61 mMol) behandelt und bei 4ºC 30 Minuten gerührt, dann bei Raumtemperatur 15 Stunden. Nach Entfernen der Lösemittel im Rotationsverdampfer wurde der Rückstand zwischen 20 ml EtOAc und 10 ml Wasser verteilt. Die Schichten wurden getrennt und die wäßrige Schicht mit weiteren 20 ml Ethylacetat extrahiert. Die organischen Fraktionen wurden vereinigt, dann nacheinander mit gesättigtem NaHCO&sub3; (2 x 20 ml) und H&sub2;O (2 x 20 ml) extrahiert. Nach Trocknung über Natriumsulfat wurde das Lösemittel am Rotationsverdampfer entfernt, wobei ein wachsartiger Feststoff zurückblieb, der aus EtOAc- Petrolether umkristallisiert wurde unter Bildung von 141 mg (69 %) BOC- -Ala- -isoGln-OBn als weißer, flockiger Feststoff.

Beispiel 5

Herstellung von -Ala- -isoGln-OBn

BOC- -Ala- -isoGln-OBn (120 mg, 0,294 mMol) wurde mit 10 ml 1N HCl/HOAc behandelt und die resultierende Lösung bei RT 2 Stunden gerührt. Das Lösemittel wurde dann am Rotationsverdampfer entfernt unter Bildung eines farblosen Öls, das in 3 ml Methylalkohol aufgenommen wurde, dann durch tropfenweise Zugabe von 20 ml Diethylether gefällt wurde. Nach einstündigem Rühren bei RT wurde das Produkt auf einem Filter gesammelt, mit Ether gewaschen, dann unter hohem Vakuum getrocknet unter Bildung von 88 mg des Hydrochloridsalzes von -Ala- -isoGln-OBn als weißer Keststoff.

Beispiel 6

Verbinden von GlcNAcMurNAc mit -Ala- -IsoGln-OBn

Insgesamt 200 mg GlcNAcMurNAc (MG 496,47, 0,405 mMol) wurden in 15 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst und dann mit 0,95 ml einer Lösung behandelt, die 42,94 mg/ml Triethylamin (TEA) in DMF (0,403 mMol) enthielt. Die Lösung wurde unter magnetischem Rühren in einem Eisbad gekühlt und dann mit 139,63 mg (95 % rein, 0,524 mMol) Woodward's Reagent K behandelt. Die Aufschlämmung wurde dann in einem Eiswasserbad 1 Stunde gerührt, dann bei Raumtemperatur 10 Minuten. Dann wurde eine Lösung, die 152,3 mg (0,443 mMol) des HCl-Salzes des -Ala- -isoGln-OBn in 8,0 ml DMK enthielt, zu der 1,05 ml (0,443 mMol) der TEA/DMF Lösung gegeben waren, über einen Druckausgleichtrichter während eines Zeitraums von 10 Minuten zugesetzt. Die Lösung wurde bei RT 18 Stunden gerührt, und dann wurde sie für weitere 96 Stunden stehengelassen. Die Umsetzung wurde während dieser Zeit durch DC verfolgt und möglichst vollständig ablaufen gelassen.
Das DMF wurde in einem Rotationsverdampfer unter hohem Vakuum (annähernd 50 Mikron) bei 25ºC entfernt unter Bildung eines rötlichen Öls, das weiter unter hohem Vakuum getrocknet wurde.
Das Öl wurde in 5 ml H&sub2;O aufgenommen und auf eine 1,7 x 7 cm Säule mit Dowex 1 x 8 (200-400 mesh, Acetatform) gegeben. Die Säule wurde mit 50 ml H&sub2;O gewaschen und das gesamte farblose Eluat auf eine 1,7 x 7 cm Säule mit Amberlite IR-120 P Harz (16-20 mesh, H&spplus; Form) gegeben. Die Säule wurde mit 50 ml H&sub2;O gewaschen, und das Eluat und die Waschlösungen wurden vereinigt. Dieses Material wurde zur Trockne in einem Rotationsverdamper unter Saugvakuum bei 25ºC gebracht unter Bildung eines farblosen Öls. Dieses wurde unter hohem Vakuum (50-75 Mikron) über Nacht getrocknet, während dieser Zeit verfestigte es sich zu einem glasartigen Feststoff. Dieser wurde in 20 ml H&sub2;O aufgenommen und lyophilisiert unter Bildung von 181 mg GlcNAcMurNAc- -Ala- -isoGln-OBn als schneeweißer, flockiger Feststoff.

Beispiel 7

Herstellung von GlcNAcMurNAc- -Ala- -isoGln

170 mg des in Beispiel 6 hergestellten geschützten Materials wurden in einer Lösung von H&sub2;O (30 ml) und Essigsäure (1,0 ml) gelöst. Die Lösung wurde zu 100 mg 5 % Pd/C (Gewichtsprozent des Palladiums, C ist pulverisierte Holzkohle, von Matheson, Coleman und Bell, Norwood, Ohio) in einer 500 ml Parr Hydrierungsflasche gegeben und bei 20 psig 24 Stunden hydriert. Der Katalysator wurde entfernt und mit Wasser gewaschen (3 x 10 ml), und das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt und lyophilisiert unter Bildung von 150 mg (100 %) GlcNAcMurNAc- -Ala- -isoGln als weißer Feststoff. Das Produkt wurde weiter unter hohem Vakuum 48 Stunden getrocknet, dann dicht verschlossen und bei 4ºC gelagert.

Beispiel 8

Verbinden von GlcNAcMurNAc- -Ala- -Isoglutamin mit -Ala-DPG unter Bildung GlcNAcMurNAc- -Ala- -isoGln- -Ala-DPG

1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) (31,35 mg, 0,232 mMol) und EDCl (44,26 mg, 0,231 mMol) wurden in einen 50 ml RK gegeben. Dazu wurde eine Lösung gegeben, die das in Beispiel 7 hergestellte Disacchariddipeptid (139,13 mg, 0,20 mMol) in 7 ml DMF und 5 ml CH&sub2;Cl&sub2; enthielt. Die resultierende Lösung wurde bei RT 30 Minuten gerührt.
Es wurde eine Triethylaminlösung hergestellt, indem 202 mg (0,28 ml) TEA in DMF gelöst wurden und ein Endvolumen von 10 ml eingestellt wurde.
-Ala-DPG (150,8 mg, 0,20 mMol) wurden in 1 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst. DMF (1 ml) wurde zugegeben, gefolgt von 1 ml der TEA- Lösung. Die resultierende Lösung wurde zu der aktivierten Disacchariddipeptidlösung gegeben, das Gefäß wurde sicher verschlossen und 72 Stunden gerührt.
Die Umsetzung wurde mit DC verfolgt und nach 72 Stunden gestoppt. Die Reaktionsmischung wurde dann in zwei Teile geteilt, einer mit 5 ml, der andere mit 10 ml. Diese Proben wurden an einem Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur unter hohem Vakuum zur Trockne konzentriert. Sie wurden dann weiter in einem Exsikkator 24 Stunden getrocknet, während dieser Zeit trockneten beide Proben zu orangegelben Feststoffen.
Zur Reinigung wurde der kleinere Teil zwischen 25 ml H&sub2;O und 25 ml EtOAc verteilt. Die Schichten wurden getrennt, und die organische Schicht wurde mit 2 x 10 ml H&sub2;O extrahiert und die Waschlösungen zu der wäßrigen Schicht gegeben. Die wäßrige Fraktion wurde dann mit 25 ml EtOAc gewaschen, die Schichten wurden getrennt und die organischen Fraktionen vereinigt. Die wäßrige Schicht wurde an einem Rotationsverdampfer auf das halbe Volumen konzentriert und der Rest ausgiebig gegen H&sub2;O durch eine Amicon YM-5 Membran bei 30 - 35 psi dialysiert.
Die DC-Analyse des inneren Dialysats zeigte einen einzigen Fleck. Dieses Material wurde dann durch ein Whatman # 2 Papier filtriert, dann lyophilisiert unter Bildung von 35 g eines cremefarbigen Feststoffs.

Beispiel 9

Herstellung von GMTP-DPG

BOC- -Ala-DPG (II):

1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerin (Sigma, 2,845 g, 5,0 mMol), BOC- -alanin (USBC, 966 mg, 5,1 mMol) und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) (Aldrich, 357 mg, 2,93 mMol) wurden in 50 ml Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) gelöst. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDCl) (Sigma 1,174 g, 6,12 mMol) wurde zugegeben, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur (RT) 17 Stunden gerührt. Nach Entfernung des Lösemittels am Rotationsverdampfer wurde der Rückstand zwischen 150 ml Ethylacetat (EtOAc) und 75 ml H&sub2;O verteilt, die Schichten getrennt und die organische Schicht mit gesättigtem wäßrigem Natiumhydrogencarbonat (3 x 50 ml), dann mit H&sub2;O (3 x 75 ml) extrahiert. Nach Trocknung über Natriumsulfat wurde das Lösemittel am Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand weiter unter hohem Vakuum getrocknet unter Bildung von 3,59 g (97 %) Produkt als nicht ganz weißer Feststoff.
Eine Dünnschichtchromatographie (DC) (Kieselsäure; CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/H&sub2;O, 130:145:7; HCl Spray, dann Ninhydrin) des Produktes ergab einen Kleck von Rf 0,95.

-Ala-DPG (III):

Der geschützte Alaninester (II) (2,50 g, 3,38 mMol) wurde in 75 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst, dann mit 25 ml Trifluoressigsäure (TFE) behandelt. Nach zweistündigem Stehen bei Raumtemperatur wurden die Lösemittel am Rotationsverdampfer entfernt unter Bildung eines dunkelgelben Öls, das wiederholt in 20 ml Hexanteilen aufgenommen wurde, dann am Rotationsverdampfer zur Trockne konzentriert. Nach ausgiebigem Trocknen unter hohemVakuum wurden 2,44 g (95,7 %) der Verbindung (III) als ihr Trifluoracetatsalz erhalten.

BOC- -Ala- -isoGln-OBn (IV):

BOC- -Ala- -isoGln (USBC , 1,587 g, 5,0 mMol), Benzylalkohol (540,7 mg, 5,0 mMol) und DMAP (305 mg, 2,5 mMol) wurden in 40 ml CH&sub2;Cl&sub2; und 10 ml N,N-Dimethylformamid (DMK) gelöst, und die resultierende Lösung wurde in einem Eiswasserbad auf 4ºC unter magnetischem Rühren gekühlt. EDCl (1,150 g, 6,00 mMol) wurde zugefügt und die Reaktionsmischung in dem Eisbad 1 Stunde gerührt, dann bei Raumtemperatur 17 Stunden. Nach Entfernen der Lösemittel am Rotationsverdampfer wurde der ölige Rückstand zwischen 50 ml H&sub2;O und 150 ml EtOAc verteilt, die Schichten getrennt und die organische Schicht weiter mit gesättigtern wäßrigem Natriumhydrogencarbonat (3 x 50 ml) und H&sub2;O (3 x 50 ml) extrahiert. Nach Trocknung über Natriumsulfat wurde das Lösemittel am Rotationsverdampfer entfernt unter Bildung eines farblosen Öls, das weiter unter hohem Vakuum getrocknet wurde, wobei es sich zu einem wachsartigen Keststoff verfestigte. Umkristallisieren aus EtOAc-Hexan ergab 1,318 g (65 %) der Verbindung (IV) als schneeweißer Feststoff.
Eine DC (Kieselsäure; EtOAc/Pyridin/Essigsäure/H&sub2;O, 30:2:0,6:1; HCl Spray, dann Ninhydrin) des Produktes ergab einen einzelnen Fleck von Rf 0,90.

-Ala- -isoGln-OBn (V):

Der geschützte Dipeptidester (IV) (2,08 g, 5,10 mMol) wurde mit 100 ml 1 N HCl/Essigsäure behandelt, und die resultierende Lösung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden stehengelassen. Nach Entfernen der Lösemittel am Rotationsverdampfer und weiterem Trocknen unter hohem Vakuum wurde das Produkt aus Methanol-Ether auskristallisiert unter Bildung von 1,68 g (95,8 %) der Verbindung V als ihr Hydrochloridsalz.

GlcNAcMurNAc (VI):

Im Handel erhältlicher lyophilisierter Micrococcus lysodeikticus (Sigma) in Form getrockneter Zellen wurde in destilliertem Wasser suspensiert (2-3 Gew.-%), dann mit einem Microfluidics Corporation Laboratory Microfluidizer (Modell M-110Y) zerrissen. Dieser wurde mit einem Powerex GI-25 Luftkompressor bei einem normalen Arbeitsluftdruck von 82 psig angetrieben, was einen hydraulischen Druck von 19000 psig ergibt. Die Zellwände wurden dann durch differentielles Zentrifugieren isoliert, dann aufeinander folgenden Behandlungen mit Trypsin und Lysozym, wie in Beispiel 3 beschrieben, unterworfen. Das resultierende ausgelaugte Produkt wurde dann dialysiert (Amicon PM-10 Membran), um Enzyme und hochmolekulare Verunreinigungen zu entfernen, dann mit Ionenaustauscherchromatography auf Dowex -1 (Acetatform) durch Eluieren mit einem Essigsäuregradienten gereinigt. Die Säulenfraktionen wurden vereinigt auf der Basis von UV Absorption und DC (Kieselsäure; CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/H&sub2;O/NH&sub4;OH, 50:39:8:3; 5 % H&sub2;SO&sub4;/CH&sub3;CH&sub2;OH und Erwärmen). Die positive Identifizierung des Disaccharids wurde durch kolorimetrische Analyse der Muraminsäure und aller Hexosamine und durch Massenspektrometrie mit schnellem Atombeschuß (fast atom bombardmend mass spectrometry, fabs) erhalten. Die vorliegenden Ausbeuten liegen im Bereich von 2,50 g des reinen Disaccharids (Verbindung VI) aus 240 g getrockneten Bakterienzellen.

GlcNAcMurNAc- -Ala- -isoGln-OBn (VII):

Vor der Verwendung wurde das DMF über 4A Molekularsieben getrocknet, dann vom Ninhydrin abdestilliert. Das Triethylamin (TEA) wurde von Natriumhydroxidpellets abdestilliert. Woodward's Reagent K wurde gereinigt, indem 3,0 g des im Handel erhältlichen Materials (Aldrich) in 15 ml 1 N HCl gelöst, durch ein Whatman # 2 Papier filtriert und dann durch Zugabe von 120 ml Aceton gefällt wurden. Nach Filtration und Waschen mit 100 ml Aceton wurde das Reagens unter hohem Vakuum mehrere Stunden getrocknet.
Die Disaccharidverbindung (VI) (2,00 g, 4,028 mMol) wurde in 100 ml DMF gelöst, mit TEA (0,62 ml, 447,5 mg, 4,431 mMol) behandelt, in einem Eiswasserbad auf annähernd 4ºC gekühlt, dann mit Woodward's Reagent K (95 %, 1,397 g, 5,24 mMol) behandelt. Die resultierende Aufschlämmung wurde in dem Eiswasserbad 1 Stunde gerührt, dann bei Raumtemperatur 10 Minuten. Dann wurde eine Lösung, die den Dipeptidbenzylester (V) (1,523 g, 4,43 mMol) und TEA (447,42 mg, O,6i6 ml) in 50 ml DMF enthielt, über einen Druckausgleichszugabetrichter während eines Zeitraums von 30 Minuten zugegeben. Nach beendeter Zugabe wurde die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur insgesamt 120 Stunden gerührt, während der das Fortschreiten der Reaktion durch DC (Kieselsäure; CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/H&sub2;O/NH&sub4;OH, 50:25:4:2 5 % H&sub2;SO&sub4;/CH&sub3;CH&sub2;OH, Erwärmen) überwacht wurde. Das Lösemittel wurde dann am Rotationsverdamper entfernt, und der ölige Rückstand wurde weiter unter hohem Vakuum getrocknet. Der wurde dann in 50 ml H&sub2;O aufgenommen, dann auf eine 2,5 x 17 cm Säule mit Dowex 1 x 8 (200-400 mesh, Acetatform) gebracht und mit 500 ml H&sub2;O eluiert. Das gesamte Eluat wurde auf ca. 50 ml konzentriert, dann auf eine 2,5 x 17 cm Säule mit Dowex 50 x 8 (100 mesh, H&spplus;-Form) gebracht und mit 500 ml H&sub2;O eluiert. Das Eluat wurde auf ca. 50 ml konzentriert, dann lyophilisiert unter Bildung von 2,25 g (71 %) der Verbindung VII als schneeweißer Feststoff.

GlcNAcMurNAc- -Ala- -isoGln (VIII):

Der Disacchariddipeptidbenzylester (VII) (2,20 g, 2,80 mMol) wurde in 150 ml H&sub2;O und 3,0 ml Eisessig gelöst. Dazu wurden 300 mg 5 % Pd/C gegeben, und die resultierende Aufschlämmung wurde bei Raumtemperatur und 40 psig 40 Stunden hydriert. Der Katalysator wurde dann durch Filtration durch ein Celite Kissen entfernt, mit H&sub2;O (3 x 10 ml) gewaschen, und das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt, auf ca. 50 ml konzentriert, dann durch eine 1 ml Säule mit Detoxi-Gel (Pierce) passiert mit einer Fließrate von 8 ml/h. Die Säule wurde mit 10 ml H&sub2;O gewaschen, und das Eluat und die Waschlösungen wurden vereinigt, dann lyophilisiert unter Bildung von 1,86 g (95,5 %) der Verbindung VIII als weißes Pulver.

GlcNAcMurNAc- -Ala- -isoGln- -Ala-DPG (IX):

Die bei dieser Herstellung verwendeten DMF und TEA wurden gereinigt, wie bei der Herstellung von VII beschrieben. Das Disacchariddipeptid VIII (1,531 g, 2,20 mMol) wurde in 70 ml DMF gelöst, dann mit 50 ml CH&sub2;Cl&sub2;verdünnt. Dazu wurden dann 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) (Aldrich, 387,4 mg, 2,53 mMol) und EDCl (485 mg, 2,53 mMol) gegeben, und die resultierende Lösung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Dann wurde eine Lösung, die 1,659 g (2,2 mMol) des Esters (II) und 225 mg (0,31 ml, 2,20 mMol) TEA in 20 ml CH&sub2;Cl&sub2; enthielt, tropfenweise während eines Zeitraums von 5 min zugegeben. Die resultierende Lösung wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt, dann mit zusätzlichen 100 mg EDCl behandelt und weitere 48 Stunden gerührt. Die Lösemittel wurden am Rotationsverdampfer entfernt, und der ölige Rückstand wurde weiter unter hohem Vakuum einige Stunden getrocknet, während der er sich zu einem gelben wachsartigen Material verfestigte. Dieses wurde dann dreimal gewaschen durch Suspendieren in 150 ml Teilen EtOAc und Zentrifugieren bei 200 x g.
Nach dem Trocknen unter hohem Vakuum wurde das Pellet in 1000 ml destilliertem H&sub2;O suspendiert, dann ausgiebig gegen destilliertes Wasser in einer Amicon Ultrafiltrationszelle durch eine Amicon YM-10 Membran dialysiert. Das innere Dialysat wurde dann auf 2000 ml mit destilliertem H&sub2;O verdünnt, durch ein dreilagiges Papier (Labconco Gorp. A-754448) filtriert, auf ca. 600 ml am Rotationsverdampfer konzentriert und lyophilislert unter Bildung von 1,60 g der Verbindung IX als weißes, elektrostatisches Pulver.
Für die abschließende Reinigung wurden 52,8 mg des obigen Produktes in 1,0 ml CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/H&sub2;O, 2:3:1 gelöst, dann auf eine 0,7 x 29 cm Säule mit Sephadex LH-20-100 Harz gebracht, das gequollen und in demselben Lösemittel gepackt worden war. Die Säule wurde mit einer F-ließrate von 0,33 ml/min eluiert, und die Fraktionen des Eluatswurden gesammelt und durch DC (Kieselsäure, CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/H&sub2;O/NH&sub4;OH, 50:25:4:2; 5 % H&sub2;SO&sub4;/CH&sub3;CH&sub2;OH, Wärme) überprüft. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, dann direkt auf eine 1 x 8 cm Säule mit BioRad Cellex D Harz (Acetatform) gebracht. Diese Säule wurde dann gewaschen mit 30 ml Lösemittel, und das mit Waschlösungen vereinigte Eluat wurde nahezu zur Trockne am Rotationsverdampfer konzentriert, mit 75 ml H&sub2;O behandelt und lyophilisiert unter Bildung von 35 mg GlcNAcMurNAc- -Ala- -isoGln- -Ala-DPG (GMTP-DPG) als weißes Pulver.
Analyse für das Produkt als Dihydrat:
C&sub6;&sub5;H&sub1;&sub1;&sub6;N&sub6;O&sub2;&sub1; 2H&sub2;O
Berechnet: C 57,67 H 8,93 N 6,21
Gefunden: C 57,89 H 8,58 N 5,91
FAB-MS, m/c 1340 (M + 23), 1318M (M + 1), 1300 (M-18 +1)

Beispiel 10

Herstellung der Liposomen

Die GMTP-DPG Verbindung (IX) wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens in Liposomen eingekapselt. Ein mg des in Beispiel 9 hergestellten GMTP-DPG wurde mit 175 mg 1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin (PC) und 75 mg 1,2-Dioleoyl-phosphatidylglycerin (PG) vereinigt, beide im Handel von Avanti Polar Lipids, Pelham, Alabama erhältlich. Das PC und PG wurden vorher in tert.-Butanol gelöst in einer Konzentration von 100 mg Lipid pro ml, wobei sich ein 7:3 Gewichtsverhältnis von PC:PG in tert.-Butanol ergab. Tert.- Butanol wurde dann zu dem einen mg GMTP-DPG, 175 mg PC, 75 mg PG gegeben, wobei ein Endvolumen von 5,0 ml entstand. Die GMTP-DPG- und Lipidmischung wurde durch ein steriles Milliporen 0,22 u Filter laufen gelassen, um alle anwesenden Verunreinigungen zu entfernen. Das Filtrat wurde in einem sauberen, sterilen Rundkolben gesammelt, der mit Aluminiumfolie nach dem Füllen verschlossen wurde. Fünf ml der filtrierten Mischung, die 1 mg GMTP-DPG enthielt, wurde in 10 ml Glasfläschchen verteilt. Nachdem die Glasfläschchen gefüllt waren, wurden sie mit sterilen Gummiserumstopfen bedeckt. Jeder der Stopfen enthält einen Schlitz an einer Seite, so daß Luft eintreten und aus dem Glasfläschchen entweichen kann während der Gefriertrocknung und des Zustöpselns. Eine sterile Aluminiumfolie wurde über die Glasfläschchen gelegt, und die Glasfläschchen wurden in die trogförmige Trockenkammer des Gefriertrockners überführt. Die Glasfläschchen wurden dann auf -20ºC gekühlt bis die tert.-Butanol-Lipid-Mischung gefroren war (ungefähr 30 bis 60 Minuten). Die Kühlung wurde dann abgestellt und das Trogheizgerät auf 10ºC gestellt. Die Glasfläschchen wurden dann 18 Stunden lyophilisiert. Der Gefriertrockner, der die Glasfläschchen enthielt, wurde mit gefiltertem sterilem Argon gespült und dreimal evakuiert. Der die Glasfläschchen enthaltende Gefriertrockner wurde dann wieder mit Argon gespült und die Glasfläschchen unter Argon bei Atmosphärendruck zugestöpselt.

Beispiel 11

Adjuvansaktivität des Agens in Salzlösung auf Antikörper bildende Zellen in Kombination mit Partikelantigen.

Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindung bei der Induzierung der Antikörperantwort wurde in einem angenäherten Immunomodell beurteilt unter Verwendung von alten Balb/c Mäusen und bei normalen Mäusen, wobei eine suboptimale Dosis des Immunogens verwendet wurde.
Alte Balb/c Mäuse (18 Monate alt), die ein Tier mit unzureichender Immunität repräsentieren, wurden intraperitoneal mit einem optimalen Impfmaterial von 1 x 10&sup9; roten Blutzellen vom Schaf (SRBC) entweder allein oder gemischt mit 0,1 mg MDP oder 0,1 mg der Verbindung IX immunisiert. Die Milz wurde am vierten Tag entfernt und auf plaquebildende Einheiten untersucht.
Die Ergebnisse (Tabelle 1) zeigten insgesamt 66 x 10³ plaquebildende Einheiten (PFU) pro Milz bei Kontrollen, 198 x 10³ PFU pro Milz bei Mäusen, die SRBC gemischt mit 0,1 mg MDP bekommen hatten, und 442 x 10³PFU für Mäuse, die SRBC gemischt mit 0,1 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung GMTP-DPG bekommen hatten. Ahnlich wurden junge Balb/c Mäuse intraperitoneal mit einer suboptimalen Dosis SRBC (1 x 10&sup7; Zellen) in Salzlösung oder gemischt mit 0,01 oder 0,1 mg MDP oder GMTP-DPG immunisiert.
Die Ergebnisse (Tabelle 1) zeigen, daß auf einer Gewichtsbasis GMTP-DPG 3 bis 10 mal wirksamer war als MDP. Tabelle 1 Vergleich der Adjuvansaktivität von MDP und GMTP-DPG (IX) Alter der Mäuse SRBC Impfmaterial MDP (mg/Maus) GMTP-DPG (mg/Maus) 18 Monate 3 Monate

Beispiel 12

Antitumoraktivität von GMTP-DPG in Salzlösung bei dem Meth A Sarkoma

Balb/C weibliche Mäuse, Alter 7 Wochen, wurden subkutan mit 1 x 10&sup6; Meth A Tumorzellen injiziert. Acht Tage später wurden die Tiere intravenös entweder mit Salzlösung (Kontrolle) oder mit Verbindung IX mit einer Dosis von 1, 10 oder 100 Mikrogramm (ug) behandelt. Jede Gruppe bestand aus 4 Tieren. Tumormessungen wurden alle 2 Tage während 10 Tagen vorgenommen, und die Mäuse wurden 60 Tage beobachtet, bis sie geheilt waren oder der Tod als Folge des Tumors eintrat.
Die Ergebnisse zeigten eine 10 bis 15 %ige Abnahme der Tumorgröße am sechsten Tag nach der Therapie mit einer einzigen Dosis von 1 bis 10 ug der Verbindung IX. Eine größere Dosis von 100 ug ergab eine 50 %ige Abnahme der Tumorgröße am sechsten Tag nach der Therapie, wobei bei einem der vier Tiere sich eine vollständige Rückbildung des Tumors zeigte.

Beispiel 13

Aktivierung der menschlichen peripheren Blutmonozyten zum tumoriziden Zustand durch GMTP-DPG und in Lipsomen eingekapselten GMTP-DPG.

Die tumorizide Aktivität bei Monozyten wurde durch das Verfahren von Fogler und Fidler bestimmt (Fogler W.E. und Fidler I.J., J. Immunol., 136: 2311-2317, 1986). Mit kurzen Worten, menschliche periphere Blutmonozyten wurden durch Gradientenzentrifugation auf 46 % Percoll isoliert. Die Monozyten wurden dann in Suspension 18 Stunden in RPMI 1640 Medium kultiviert, das 5 % menschliches Serum mit oder ohne 1,5 ug/ml der Verbindung IX bei 1 x 10&sup6; Monozyten/ml enthielt. Nach der Inkubation wurden die Monozyten gewaschen, und 1 x 10&sup5; oder 5 x 10&sup4; Monozyten ließ man an Vertiefungen einer 96-Vertiefung Mikroplatte 1 Stunde aufziehen, dann wurde die Platte gewaschen, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen; zu dieser wurden 1 x 10&sup4; mit I¹²&sup5; markierte A-375 Tumorzellen gegeben. Die Monozyten wurden mit den Tumorzellen 72 Stunden kultiviert. Am Ende der 72 Stunden der gemeinsamen Kultivierung wurden die Platten gewaschen, um nicht anhaftende, nicht lebensfähige Tumorzellen zu entfernen, und die verbleibenden anhaftenden, lebensfähigen, mit I¹²&sup5; markierten Tumorzellen wurden bestimmt, indem die Zellen mit Natriumdodecylsulfat aufgelöst wurden und die Radioaktivität in einem Gamma Counter gezählt wurde.
Die Aktivierung der menschlichen peripheralen Blutmonozyten durch die Verbindung IX enthaltende Liposomen wurde bestimmt durch Verwendung von Liposomen, die aus 1-Palmitoyl-2-oleoyl- phosphatidylcholin und 1,2-Dioleoyl-phosphatidylglycerin in einem Gewichtsverhältnis von 7:3 zusammengesetzt waren.
Unter Verwendung der in Beispiel 12 beschriebenen Tests wurde die in-vitro Wirksamkeit der Verbindung IX mit MDP verglichen. Das Effektor : Targetzellen Verhältnis betrug 10 : 1. Die Kulturen enthielten eine Endkonzentration von 1,0 ug/ml MDP, Verbindung IX oder Verbindung IX in Liposomen. Die Ergebnisse dieser Versuche (Tabelle 2) zeigen, daß Verbindung IX wirksamer als MDP war, wenn sie als Suspension in einer Salzlösung oder eingekapselt in Liposomen verwendet wurde. Tabelle 2 Prozent Cytotoxizität¹ Versuch MDP² Verbindung IX³ Verbindung IX&sup4; in Liposomen&sup5;
¹Prozent Cytotoxizität = A-B/A x 100, worin
A CPM in Vertiefungen mit Kontrollmonocyten;
B CPM in Vertiefungen mit behandelten Monocyten.
²MDP bezogen von Cal-Biochem.
³Verbindung IX bei einer Konzentration von 1 mg/ml hatte kein nachweisbares Endotoxin, wenn durch LAL Assay mit einer Empfindlichkeit von 0,06 Endotoxineinheiten pro ml bestimmt wurde.
&sup4;Verbindung IX in Liposomen bei einer Konzentration von 23 ug/ml hatte kein nachweisbares Endotoxin, wenn durch LAL Assay mit einer Empfindlichkeit von 0,06 Endotoxineinheiten pro ml bestimmt wurde.
&sup5;Liposomen zusammengesetzt aus Phosphatidylcholin: Phosphatidylglycerin im Molverhältnis von 7:3.

Beispiel 14

Erhöhte Wirkung von GMTP-DPG mit Lipopolysaccharid in-vivo

Balb/C Mäuse, 7 bis 8 Wochen alt, wurden subkutan mit Meth A Sarkoma (1 x 10&sup6; Zellen) injiziert und intravenös am achten Tag mit 10 ug Lipopolysaccharid von S. typhimurium ReG 30/21 allein oder zusammen mit 1 oder 10 ug MDP oder Verbindung IX behandelt. Das Tumorwachstum wurde am sechsten Tag nach der Therapie verglichen.
Die Tiere wurden beobachtet und der Prozentsatz an geheilten Tieren am 60. Tag nach der Injektion bestimmt.
Die in Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse zeigen den mehr als additiven Effekt der Verbindung mit Lipopoplysaccharid, die wirksamer ist als die Grundverbindung. Tabelle 3 Wirkung von GMTP-DPG mit Liposaccharid auf das Wachstum von Tumoren bei Mäusen Gruppe¹ Prozentuale Änderung im durchschnittlichen Tumorbereich 6 Tage nach Behandlung Vollständige Rückbildung am 60. Tag Kontrolle LPS&sub1;&sub0;Verbindung IX1,0 LPS&sub1;&sub0;Verbindung IX&sub1;&sub0;
¹Die tiefstehenden Zahlen beziehen sich auf die Menge der Verbindungen in Mikrogramm.

Beispiel 15

Akute Toxizität bei Mäusen und Meerschweinchen

Zwei Mäusen, die zwischen 17 und 22 Gramm wogen, und zwei Meerschweinchen, die weniger als 400 Gramm wogen, wurde eine einzige intraperitoneale Injektion von 0,5 ml und 5,0 ml einer fertigen klinischen Formulierung verabreicht, die aus insgesamt 1 mg der Verbindung IX, 1740 mg 1-Palmitoyl- 2-oleoyl-phosphatidylcholin und 760 mg Dioieoyl-phosphatidylglycerin pro 5 ml bestand. Die Tiere wurden täglich auf Gewicht und klinische Zeichen von Qual hin beobachtet. Die Ergebnisse zeigten einen anfänglichen Gewichtsverlust, gefolgt von einer Gewichtszunahme nach 7 Tagen bei Meerschweinchen. Die Mäuse behielten ihr Gewicht und zeigten eine Zunahme nach 7 Tagen.

Beispiel 16

Subakute Toxizität bei Mäusen

Eine Gruppe von 10 Mäusen wurde zweimal pro Woche vier Wochen lang mit einer Dosis von 1320 ug pro kg Körpergewicht intravenös injiziert. Berechnet ist dies äquivalent mit zehnmal einer bekannten maximalen menschlichen Dosis von 4 mg pro Quadratmeter. Bei der Umwandlung von einer Quadratmeter- zu einer Kilogrammbasis wurde eine Äquivalenz von 60 Kilogramm je 1,73 Quatratmeter Körperoberfläche verwendet anstatt der üblichen Äquivalenz von 70 kg Körpermasse für 1,73 Quadratmeter Körperoberfläche, um eine etwas höhere Dosis für die Toxizitätsstudien zu erhalten. Die Ergebnisse zeigten keinen Gewichtsverlust während der vier Wochen des Testes.

Beispiel 17

Subakute Toxizität bei Kaninchen

Drei Kaninchen wurden mit einer Dosis von 132 ug pro Kilogramm der Verbindung IX in Lipsomen pro Kilogramm intravenös täglich 14 Tage lang behandelt. Durch Herzpunktur erhaltenes Blut für klinische Studien und vollständige Autopsien für histologische Anzeichen von Toxizität wurden am 15. Tag durchgeführt. Blut wurde aus der Ohrvene und durch Herzpunktur an drei Kontrollkaninchen erhalten.
Die Ergebnisse dieser Studie zeigten keine pathologischen Anzeichen von Toxizität. Die Überprüfung der Blutwerte von behandelten Kaninchen im Vergleich zu den Kontrolltieren ergab ein einziges Kaninchen mit einem signifikanten Anstieg bei Kreatininphosphokinase. Es wird angenommen, daß dieser abnormale Wert auf das Trauma der Herzpunktur zurückzuführen ist, wie durch den Anstieg der Kreatininphosphakinase bei den Kontrolltieren nach der Herzpunktur bewiesen wurde.
Die Erfindung ist mit Bezug auf verschiedene spezifische und bevorzugte Ausführungsformen und Techniken beschrieben worden.

Claims

1. Verbindung der Formel

in der R¹ (C&sub1;-C&sub9;)Alkyl-, R² (C&sub1;-C&sub5;)Alkyl- und R³ und R&sup4; einzeln (C&sub6;-C&sub3;&sub0;)Alkylgruppen sind, die etwa 0 bis 4 Doppelbindungen enthalten, X irgendein Peptidrest ist, und deren pharmazeutisch akzeptable Salze.

2. Verbindung nach Anspruch 1, in der R¹ CH&sub3; ist.

3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, in der R² CH&sub3; ist.

4. Verbindung nach Anspruch 1, 2 oder 3, in der X ein Aminosäurerest der allgemeinen Formel:

-NH- H- -

ist.

5. Verbindung nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, in der X ein natürlich vorkommender Aminosäurerest oder ein Enantiomorph davon ist.

6. Verbindung nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, in der X ein L-Alaninrest ist.

7. Verbindung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, in der R³ und R&sup4; einzeln (C&sub1;&sub2;-C&sub2;&sub3;)Alkylgruppen sind, die etwa 0 bis 1 Doppelbindungen enthalten.

8. Verbindung nach Anspruch 7, in der R³ eine C&sub1;&sub5;Alkylgruppe ist.

9. Verbindung nach Anspruch 7 oder 8, in der R&sup4; eine C&sub1;&sub5;Alkylgruppe ist.

10. Verbindung nach Anspruch 7, 8 oder 9, in der R¹ und R² CH&sub3; sind.

11. Stoffzusammensetzung, die eine wirksame immunomodulierende Menge der Verbindung nach einem der vorausgehenden Ansprüche zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen flüssigen Träger enthält.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, die außerdem ein Lipopolysaccharid enthält.

13. Liposom, das die Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 enthält.

14. Stoffzusammensetzung, die im wesentlichen aus einem Liposom mit einer Zweischichtmembran, die im wesentlichen aus 1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin und Dioleoyi-phosphatidylcholin in einem Gewichtsverhältnis von etwa 5 : 1 bis 1 : 1 besteht, und der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 besteht.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, in der das Gewichtsverhältnis etwa 7 : 3 ist.