DE3836006C2 - Monophosphoryllipid-A-Derivate, Verfahren zur Herstellung von Monophosphoryllipid-A-Derivaten und Verwendung von Monophosphoryllipid-A-Derivaten - Google Patents
Monophosphoryllipid-A-Derivate, Verfahren zur Herstellung von Monophosphoryllipid-A-Derivaten und Verwendung von Monophosphoryllipid-A-DerivatenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft Monophosphoryllipid-A-Derivate. Es
handelt sich dabei insbesondere um Monophosphoryllipid-A-Derivate,
die eine oder mehrere substituierte oder unsubstituierte
Aminogruppen enthalten.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung
von Monophosphoryllipid-A-Derivate.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung von Monophosphoryllipid-
A-Derivaten.
In der Literatur sind bereits zahlreiche Veröffentlichungen
erschienen, welche die Umsetzung von Lipopolysaccharid (LPS)
mit cyclischen Anhydriden, insbesondere Phthal- und Bernsteinsäureanhydrid,
beschreiben. Nur in einer dieser Veröffentlichungen
wird jedoch vorgeschlagen, Monophosphoryllipid-A
(MPL) mit diesen oder anderen Anhydriden zu
kombinieren.
In dem Artikel von A. Hasegawa et al., im J. Carbohydrate
Chem. 5: 371 ist die kovalente Kopplung von Muramyldipeptid
(MDP) mit einem Lipid-A-Derivat entsprechend dem nicht-
reduzierenden Glucosaminrest offenbart. Dieses Lipid-A-Derivat,
das in dieser Veröffentlichung als GLA-27 bezeichnet ist,
war sowohl am Phosphat als auch an allen anderen Stellen,
die möglicherweise hätten reagieren können, geschützt, jedoch
nicht an der Hydroxygruppe, an welcher angekoppelt werden
sollte, d. h. der primären Hydroxygruppe am C-6. Zu der
in dieser Veröffentlichung angewandten Koppelungsstrategie
gehörte die Einführung einer freien Carboxylgruppe in GLA-27
am C6 über Bernsteinsäureanhydrid und einer freien Aminogruppe
in MDP. Anschließend wurde eine Amidbindung zwischen
diesen beiden Gruppen gebildet. Der Hauptunterschied zwischen
der Lehre dieser Veröffentlichung und der erfindungsgemäßen
Lehre besteht darin, daß das Lipid-A-Derivat vollständig
geschützt bzw. blockiert sein mußte, um Nebenreaktionen
während der Kondensation (d. h. Bildung von Amidbindungen)
zu vermeiden. Erfindungsgemäß wird diese Schwierigkeit dadurch
vermieden, daß eine freie Aminogruppe in MPL eingeführt
wird. Man kann MPL dann an andere Komponenten koppeln,
indem man Reagentien bzw. Mittel zur Anwendung bringt, die
spezifisch mit Aminen (beispielsweise Aldehyde) reagieren.
Man kann auch auf andere Weise eine geeignete Gruppe an der
anderen Komponente vor der Kombination mit dem Amino-MPL
aktivieren.
Eine Acylierung von Lipopolysacchariden durch cyclische
Anhydride findet wahrscheinlich in den O-Antigen-Regionen
und in den Kernregionen (core regions) statt, die beim
Monophosphoryllipid-A fehlen. Die Acylierung von LPS in den
erschienenen Veröffentlichungen dient dem Zweck, dessen
Toxizität abzuschwächen, wobei keine funktionelle Gruppe
eingeführt werden sollte, die kovalente Konjugate mit anderen
Materialien bilden sollte.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Monophosphoryllipid-
A-Derivate und ein Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen,
wobei es insbesondere nicht erforderlich sein
soll, alle funktionellen Gruppen zu blockieren, um die
gewünschten Gruppen in das Monokül einführen zu können.
Weiterhin sollen Derivate bereitgestellt werden, welche Konjugate
von Monophosphoryllipid-A mit biologisch aktiven Materialien
beispielsweise Antigenen, Antikörpern, Immunomodulatoren
darstellen. Auch sollen Konjugate dieser Derivate mit
biologischen Verbindungen, wie Antigenen bereitgestellt
werden, welche eine verstärkte biologische Aktivität
besitzen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sollen die Monophosphoryllipid-A-
Derivate in verhältnismäßig reiner Form anfallen.
Es sollen im wesentlichen keine ungewünschten Reaktionsnebenprodukte
auftreten.
Ferner ist Aufgabe der Erfindung, eine Verwendung von Monophosphoryllipid-
A-Derivaten aufzuzeigen.
Diese Aufgabe wid durch Monophosphoryllipid-A-Derivate nach
Anspruch 1 gelöst.
Alternativ wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung
von Monophosphoryllipid-A-Derivaten nach Anspruch 6 und
durch die Verwendung von Monophosphoryllipid-A-Derivaten nach
Anspruch 8 gelöst.
Die erfindungsgemäßen Derivate stellt man zweckmäßigerweise
her, indem man Monophosphoryllipid-A mit einer Verbindung
umsetzt, welche eine Gruppe oder Gruppen enthält, die eine
Bindung mit einer Gruppen oder mit Gruppen, die in MPL vorhanden
ist bzw. sind, bilden kann bzw. können. Durch den Einsatz
einer
Verbindung, die vor der Umsetzung mit MPL aktiviert wird,
wird die Notwendigkeit vermieden, zuerst Schutzgruppen in
das MPL-Molekül einzuführen.
Monophosphoryllipid-A (MPL) ist eine Phosphor-enthaltende
polyheterocyclische Verbindung mit hängenden langkettigen
aliphatischen Ester- und Amidgruppen und wird als ein
endotoxischer Extrakt aus Enterobacteriaciae erhalten.
Diese Verbindung, die auch als MPL bezeichnet wird, stellt
man nach einer Arbeitsweise her, die in den US-Patenten
US-A 44 36 727 und 44 36 728 beschrieben ist, auf die hiermit
Bezug genommen wird. Endotoxinextrakte desjenigen
Typs, der hier als Ausgangsmaterial zur Herstellung von
MPL eingesetzt wird, kann man aus beliebigen Enterobacteriaciae
einschließlich der Ausgangsorganismen und
Mutanten erhalten. Die zuvor genannten Patentschriften
beschreiben denjenigen Typ des Mikroorganismus, den man
zur Herstellung des Ausgangsmaterials zur Anwendung bringen
kann. Es sind dort auch verschiedene Verfahren zur Herstellung
des Ausgangsmaterials beschrieben. Man kann MPL
auch nach synthetischen Techniken und gemäß Genetic-
engineering-Techniken herstellen. Das derzeit bevorzugte
Verfahren zur Herstellung des endotoxischen Extrakts ist
dasjenige, das von Chen et al, J. Infect. Dis. 128, 543
(1973) beschrieben ist.
MPL ist eine Zusammensetzung, die sich dadurch auszeichnet,
daß sie kein detektierbares 2-Keto-3-deoxyoctanoat enthält,
zwischen 350 bis 475 nmol/mg Phosphor und etwa
1700 bis etwa 2000 nmol/mg Fettsäuren besitzt. Obgleich
das Verfahren zur Herstellung raffinierten detoxifizierten
Endotoxins (MPL) in der oben genannten US-A 44 36 727 offenbart
und beansprucht ist, war die chemische Struktur zum
damaligen Zeitpunkt noch nicht vollständig bekannt. Es war
demgemäß erforderlich, MPL als Product-by-process zu beschreiben.
Die Gesamtstruktur der Hexacylform von MPL
(erhalten aus Lipopolysacchariden von Salmonella minnesota
R595) ist nun bekannt und nachstehend wiedergegeben:
MPL stellt eine wesentliche Verbesserung im Vergleich zu
endotoxischen Extrakten aus Enterobacteriaciae dar, da MPL
detoxifiziert ist und somit keine hochtoxischen Komponenten
enthält, welche die endotoxischen Extrakte für eine
therapeutische Anwendung ungeeignet gemacht haben, man vergleiche
Peptides as Requirements for Immunotherapy of
Guinea Pig Line-10 Tumor with Endotoxins, Ribi et al,
Cancer Immunol. Immunother., Bd. 7, S. 43-58, 1979 (auf die
entsprechende Offenbarung wird hiermit Bezug genommen).
Die vorteilhaften Effekte von MPL im Vergleich mit anderen
endotoxischen Extrakte sind beispielsweise beschrieben in
US-A 44 36 727 und 44 36 728 sowie in Ribi, E., Journal
of Biological Response Modifiers, Bd. 3, S. 1-9, 1984 (auf
die entsprechende Offenbarung wird hiermit Bezug genommen).
Aufgrund der Tatsache, daß Monophosphoryllipid-A nicht-toxisch
ist, wurde kürzlich gefunden, daß es als Adjuvans
für Vakzine bzw. Impfstoffe und in anderen pharmazeutischen
Zusammensetzungen eingesetzt werden kann, die bei der
Behandlung von verschiedenen Krankheiten Anwendung finden,
wozu beispielsweise Krebstumore in Warmblütern
zählen.
Die Wirksamkeit von MPL als Adjuvans für bestimmte Antigene
kann durch Koppeln von MPL direkt an diese Antigene verstärkt
werden. Außerdem können kovalente Konjugate, die aus MPL und
anderen immunpotenzierenden Verbindungen bestehen, biologische
Aktivitäten besitzen, welche stärker sind als die der freien
(nicht-konjugierten) Komponenten.
Die traditionellen Methoden zur Bildung kovalenter Konjugate
kann man in zwei Kategorien aufteilen, und zwar in Abhängigkeit
davon, ob die Moleküle bezüglich der Koppelung vor dem
Vermischen oder in situ nach dem Vermischen aktiviert werden.
Keine dieser Methoden ist für MPL aufgrund der strukturellen
Konfiguration geeignet. So führt man bei der vorherigen
Aktivierung eine Gruppe in eines der Moleküle ein, die mit
einer Gruppe leicht reagieren kann, welche lediglich im
zweiten Molekül vorhanden ist. Dazu zählen beispielsweise
eine Amino- oder eine Sulfhydrylgruppe. Diese Methode ist
für unmodifiziertes MPL nicht geeignet, da MPL keine funktionelle
Gruppe enthält, die aktiviert werden kann oder die mit
Gruppen leicht reagieren kann, welche zuvor an anderen
Molekülen aktiviert wurden. Auch die zweite Methode kann bei
MPL nicht eingesetzt werden, da bei den für eine in situ-
Aktivierung im allgemein angewandten Bedingungen MPL dazu
neigt, mit sich selber zu reagieren, so daß eine Vielzahl von
ungewünschten Nebenprodukten entsteht. Zudem wird die Ausbeute
an gewünschtem Konjugat beträchtlich reduziert. Es kann
sogar sein, daß überhaupt kein gewünschtes Konjugat erhalten
wird.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es jedoch möglich,
eine geeignete funktionelle Gruppe, beispielsweise
ein primäres Amin, in MPL zu inkorporieren. Man kann dann
übliche Koppelungsverfahren zur Anwendung bringen, um andere
Materialien an das erhaltene modifizierte MPL anzuknüpfen.
Zu den funktionellen Gruppen, welche MPL enthält, zählen
eine primäre Hydroxygruppe bei C-6′, zwischen 3 bis 6
sekundäre Hydroxygruppen und eine Phosphatgruppe bei C-4′.
Aufgrund der komplexen Konfiguration des Monophosphoryllipid-
A-Moleküls und um die Reaktionen einfacher darstellen
zu können, welche beim erfindungsgemäßen Verfahren stattfinden,
wird das Monophosphoryllipid-A-Molekül im Rahmen
der vorliegenden Unterlagen wie folgt wiedergegeben:
wobei die einzelne primäre Hydroxygruppe im oberen Bereich
gezeigt ist, eine repräsentative sekundäre Hydroxygruppe
im unteren Bereich dargestellt ist, die Phosphatgruppe als
OPO₃H₂ gezeigt ist und der Kreis den übrigen Rest des Monophosphoryllipid-
A-Moleküls darstellt.
Im allgemeinen werden MPL-Derivate - wie oben ausgeführt -
zweckmäßigerweise durch die folgende allgemeine
Formel (II) wiedergegeben:
worin Z für ein Wasserstoffatom oder die Gruppe
steht,
worin R eine divalente Gruppe bedeutet, die aus Kohlenstoff, Wasserstoff und gewünschtenfalls einem oder mehreren Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatomen aufgebaut ist und 2 bis 60 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 20 Kohlenstoffatome enthält,
A eine divalente Koppelungsgruppe bedeutet, welche in der Lage ist, die Gruppe R über mindestens zwei unabhängige funktionelle Gruppen an den Rest Y zu koppeln, und worin A 2 bis 60 Kohlenstoffatome und gewünschtenfalls ein oder mehrere Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatome enthält,
Y ein biologisch aktives Material, beispielsweise Antigene, Antikörper und Immunomodulatoren, darstellt und
n für 0 oder 1 steht.
worin R eine divalente Gruppe bedeutet, die aus Kohlenstoff, Wasserstoff und gewünschtenfalls einem oder mehreren Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatomen aufgebaut ist und 2 bis 60 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 20 Kohlenstoffatome enthält,
A eine divalente Koppelungsgruppe bedeutet, welche in der Lage ist, die Gruppe R über mindestens zwei unabhängige funktionelle Gruppen an den Rest Y zu koppeln, und worin A 2 bis 60 Kohlenstoffatome und gewünschtenfalls ein oder mehrere Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatome enthält,
Y ein biologisch aktives Material, beispielsweise Antigene, Antikörper und Immunomodulatoren, darstellt und
n für 0 oder 1 steht.
Gegenstand einer Ausführung der vorliegenden Erfindung sind
die Derivate der oben wiedergegebenen allgemeinen Formel,
worin Z ein Wasserstoffatom bedeutet. Diese Monophosphoryllipid-
A-Derivate enthalten eine Esterseitenkette, die an
das Kohlenstoffatom des Lipids-A gebunden ist, welches die
primäre Hydroxygruppe (d. h. das C-6′-Kohlenstoffatom) trägt.
Diese Verbindungen entsprechen der folgenden allgemeinen
Formel (III)
worin R generell eine Gruppe bedeutet, die zusammengesetzt ist aus
Kohlenstoff-, Wasserstoff- und gewünschtenfalls Sauerstoff-,
Stickstoff- und/oder Schwefelatomen und die 2 bis 60 Kohlenstoffatome,
vorzugsweise 2 bis 20 Kohlenstoffatome, enthält.
Im allgemeinen kann jede Art funktioneller Gruppe in MPL
oder verwandte Materialien mit Hilfe des erfindungsgemäßen
Verfahrens eingeführt werden, mit der Maßgabe, daß die
funktionelle Gruppe Teil eines Moleküls ist, das eine
Carboxyl-Gruppe enthält, die vor der
Kombination mit MPL zum Zwecke der Herstellung einer
Esterbindung aktiviert werden kann. Funktionelle Gruppen,
die nach diesem Verfahren eingeführt werden können, sind
beispielsweise (diese Aufzählung ist nicht abschließend):
Amine, Thiole, Aldehyde, Carboxylgruppen, N-Hydroxyimidoester,
Iminoester, Arylazide, Maleimide, Pyridyldisulfide
und aktive Halogenatome.
Das Erfordernis der Aktivierung vor der Kombination mit
MPL ist von ausschlaggebender Bedeutung aufgrund der
zahlreichen Nebenreaktionen, die stattfinden können, falls
MPL den Aktivierungsbedingungen direkt ausgesetzt wird.
Als Beispiel einer derartigen Aktivierung sei die Umsetzung
von MPL mit Bernsteinsäureanhydrid näher ausgeführt, welche
zur Einfügung einer freien Carboxylgruppe in MPL führt.
Derivate, wie die der Formel (IV), worin R gemäß der
Formel (III) als Endgruppe eine freie Carboxylgruppe besitzt
und über die Estergruppe an das MPL-Molekül mit Hilfe
einer aliphatischen, aromatischen oder heterocyclischen
Gruppe angeknüpft ist, kann man gemäß der erfindungsgemäßen
Lehre herstellen.
Es kann gegebenenfalls (muß aber nicht) erforderlich sein,
bestimmte funktionelle Gruppen des in MPL einzuführenden
Moleküls vor der Aktivierungsstufe zu schützen bzw. zu
blockieren. Führt man beispielsweise mit Hilfe des erfindungsgemäßen
Verfahrens eine Aminogruppe in MPL ein,
dann ist es erforderlich, das Amin einer geeigneten Aminosäure
vor der Aktivierung der Carboxylgruppe zur Herstellung
der Esterbindung zu schützen. Bei dem oben erläuterten,
mit Hilfe von Bernsteinsäureanhydrid durchgeführten Beispiel
sind die Erfordernisse des Blockierens
und der zuvorigen Aktivierung durch Bildung des cyclischen
Anhydrids erfüllt. Geeignete Verfahren
zum Blockieren und Deblockieren sind dem
Fachmann gut bekannt und beispielsweise beschrieben in:
Theodora W. Green, "Protective Groups in Organic Synthesis",
John Wiley & Sons, New York, 1981, S. 349.
Bevorzugte Verbindungen, die nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren hergestellt werden können, sind Amine und substituierte
Amine der folgenden allgemeinen Formel (V):
worin R³ eine divalente, Kohlenstoff-, Wasserstoff- und
gewünschtenfalls Sauerstoff-, Stickstoff- und/oder Schwefelatome
enthaltende divalente Kette und R¹ und R² unabhängig
voneinander ein Wasserstoffatom oder eine niedrige Alkylgruppe
bedeuten oder worin einer der Reste R¹ und R² den
Rest eines organischen Substrats oder eines Trägers einschließlich
Liposome, oder ein biologisches Material, beispielsweise
ein Antigen, einen Immunomodulator und einen Antikörper,
bedeuten kann.
Besonders bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel
(V) sind solche, worin R¹ und R² ein Wasserstoffatom bedeuten
und R³ einen divalenten Rest mit 2 bis 60, vorzugsweise
mit 2 bis 20, Kohlenstoffatomen bedeutet und aufgebaut
ist aus Kohlenstoff, Wasserstoff und gewünschtenfalls
Sauerstoff-, Stickstoff- und/oder Schwefelatomen. Zu diesen
Derivaten zählen solche, worin R³ eine geradkettige oder
verzweigte Kohlenwasserstoffkette ist sowie Polypeptide.
Bei den erfindungsgemäßen Derivaten besteht R³
aus einem Bernsteinsäurerest oder kann auch
eine oder mehrere wiederkehrende Amidgruppen, beispielsweise
Di- und Tripeptide von Glycinderivaten von MPL, bedeuten.
Zu den Derivaten nach der Erfindung
gehören ferner solche Verbindungen, bei denen
eine Aminosäure an der C-6′-Stellung in MPL eingeführt ist
und demzufolge MPL-Derivate darstellen, die eine Seitenkette
besitzen, welche eine primäre Amingruppe als Endgruppe besitzt.
Typische Verbindungen dieses Typs sind diejenigen
der nachstehend gezeigten allgemeinen Formel (VI):
worin x irgendeinen Wert von 1 bis etwa 20 und höher annehmen
kann. Als Beispiel sei eine Verbindung angeführt,
bei der x für 5 steht; in diesem Fall handelt es sich dann
um den Ester von 6-Aminocapronsäure. Diese Verbindung ist
als CAP-MPL bezeichnet. Deren Synthese ist in den Beispielen
1 bis 3 näher erläutert.
Weiterhin von Interesse ist dasjenige Derivat, bei dem
MPL in Form eines Esters an die freie Carboxylgruppe von
Peptiden gebunden ist, die aus Glycin oder verwandten
α-Aminosäuren bestehen. So besteht beispielsweise die nachfolgend
gezeigte Verbindung aus MPL, das in Form eines Esters
an ein Tripeptid aus Glycin gebunden ist:
Demzufolge kann eine Vielzahl von MPL-Derivaten aus bekannten
Aminosäuren hergestellt werden. Alternative Aminosäuren,
die in das MPL-Molekül mit Hilfe des erfindungsgemäßen
Verfahrens eingeführt werden können, sind unter
anderem Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin, Valin,
Norvalin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tyrosin,
Cystein, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Hydroxyglutaminsäure,
Arginin, Lysin, Cystin, Histidin, Prolin, Hydroxyprolin,
Tryptophan, Asparagin und Glutamin. Es kann erforderlich
sein, geeignete Verfahren zum Blockieren und
Deblockieren einzusetzen,
die dem Fachmann gut bekannt sind, wenn diese Aminosäuren
oder Kombinationen davon mit Hilfe des erfindungsgemäßen
Verfahrens an MPL gebunden werden sollen.
MPL-Derivate, bei denen eine primäre Aminogruppe nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren eingeführt wird, können
weiter modifiziert werden, so daß sie an andere interessante
Verbindungen, beispielsweise Antigene, Antikörper und
Immunomodulatoren, auf einfache Weise gekoppelt werden
können. Derartige MPL-Derivate besitzen im allgemeinen
folgende allgemeine Formel:
worin R¹ und R³ die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
R² eine Gruppe darstellt, die aus Kohlenstoff-, Wasserstoff-
und gewünschtenfalls Sauerstoff-, Stickstoff- und/
oder Schwefelatomen aufgebaut ist und 1 bis 60 Kohlenstoffatome,
vorzugsweise 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält,
und R⁴ eine Gruppe bedeutet, die in der Lage ist,
eine kovalente Bindung zu bilden, entweder selektiv mit
Aminen oder Sulfhydrylverbindungen, oder nicht-selektiv
mit einer Vielzahl von Gruppen, und die aufgebaut ist
gewünschtenfalls aus Kohlenstoff-, Wasserstoff-, Stickstoff-,
Sauerstoff- und/oder Schwefelatomen. Der als R⁴-
R² bezeichnete Rest steht beispielsweise für N-Succinimidylsuberoyl,
6-(4′-Azido-2′-nitrophenyl)hexanoyl,
3-(2-Pyridyldithio)propionyl und m-Maleimidobenzoyl.
Im Beispiel 4 ist die Herstellung der folgenden Verbindung
beschrieben:
worin R₄-R₂ für N-Succinimidylsuberoyl steht und R¹ und
R³ der in der Formel (VIII) gezeigten Bedeutung entsprechen,
wobei X = 5 ist.
Danach setzt man das Derivat, das MPL und eine Kopplungsgruppe
enthält, welche an MPL über eine Aminogruppe gebunden
ist, beispielsweise das oben gezeigte SSC-MPL-
Derivat, mit einem Peptid weiter um, das eine primäre
Aminogruppe enthält, um folgendes Konjugat zu bilden:
Das erfindungsgemäße Verfahren, das nachstehend näher erläutert
ist, stellt eine einzigartige Methode zur Einführung
einer oder mehrerer funktioneller Gruppen in
Monophosphoryllipid-A und verwandte Verbindungen dar. Diese
funktionellen Gruppen können einen Anknüpfungspunkt für
eine kovalente Koppelung von MPL und verwandten Verbindungen
mit anderen interessierenden Materialien darstellen. Das
Verfahren umfaßt folgende Stufen:
- (1) man blockiert erforderlichenfalls die weitere funktionelle Gruppe oder die weiteren funktionellen Gruppen einer geeigneten Carbonsäure,
- (2) man aktiviert die freie Carboxylgruppe der blockierten Verbindung bezüglich der Bildung einer Esterbindung,
- (3) man setzt die aktivierte Verbindung mit Monophosphoryllipid- A um und
- (4) man deblockiert erforderlichenfalls das erhaltene MPL-Derivat.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachstehend durch die
dort gezeigte Reaktionsfolge näher erläutert, bei der
man ein Amino-MPL-Derivat des in der Formel (IV) gezeigten
Typs herstellt. Bei dieser Folge steht t-BOC-ON für
t-Butoxycarbonyloxyimino-2-phenylacetonitril, während MPL
die oben gezeigte Bedeutung besitzt:
(1) Blockieren
(2) Aktivierung
(3) Umsetzung mit MPL
(4) Deblockierung
Obwohl man in der Stufe (1) t-BOC-ON für die dort gezeigte
Umsetzung als Blockierungsmittel einsetzt, können
auch andere Agentien eingesetzt werden. Typische
Blockierungsagentien sind (diese Aufzählung ist
nicht abschließend) Benzylchlorformiat, 9-Fluorenylmethylchlorformiat
und 2,2,2-Trichlormethylchlorformiat.
Die Umsetzung zum Schützen der Aminosäuren oder anderer Verbindungen
führt man in einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise
Wasser, Ethanol oder Dioxan, bei einer Temperatur
von etwa 0°C bis etwa 30°C je nach der Natur des eingesetzten
Schutzreagens durch. Die Aktivierung der geschützten
Säure in der Stufe (2) zur Herstellung des Anhydrids kann
man unter Anwendung einer Verbindung, beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid
oder weiterer Verbindungen, wie 1-Ethyl-3-
(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid und Ethylchlorformiat,
durchführen. Diese Stufe führt man in Anwesenheit eines
inerten Lösungsmittels, beispielsweise Chloroform oder Dichlormethan
und bei einer Temperatur von etwa 0°C bis 30°C
in Abhängigkeit von dem eingesetzten Reagens durch.
Die Umsetzung des Anhydrids mit MPL in der dritten Stufe
führt man in einem Lösungsmittelgemisch, beispielsweise
Pyridin : Chloroform (1 : 1; V : V), bei einer Temperatur von
etwa 0°C bis etwa 30°C durch.
Zum Deblockieren der Aminosäure oder
weiterer Verbindungen, die in das MPL-Molekül eingeführt
wurden, kann man ein Deblockierungsagens, wie die Trifluoressigsäure
oder Chlorwasserstoff(Gas) in einem geeigneten
Lösungsmittel bei Temperaturen von etwa -15°C bis etwa
0°C zur Anwendung bringen.
Wie bereits oben dargelegt, ist diese Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Verfahrens besonders nützlich und stellt
eine einzigartige Methode zur Einführung freier Aminogruppen
in Monophosphoryllipid-A und verwandte Verbindungen dar, bei
denen andere funktionelle Gruppen die direkte Verwendung von
Standardkoppelungsmittel, wie Carbodiimiden, unmöglich machen.
So enthält MPL beispielsweise eine Phosphatgruppe, eine
primäre Hydroxygruppe und verschiedene sekundäre Hydroxygruppen.
In Anwesenheit von Carbodiimiden oder anderen
Kondensationsmitteln würden Nebenreaktionen stattfinden, die
zu Phosphorsäureanhydriden, Phosphatestern und anderen
Materialien führen würden. Beim erfindungsgemäßen Verfahren
werden derartige Nebenreaktionen ausgeschlossen. Mit dem
erfindungsgemäßen Verfahren könnnen somit die gewünschten
Derivate in verhältnismäßig reiner Form erhalten werden.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
betrifft Monophosphoryllipid A-Derivate, bei denen ein
Koppelungsagens an die Verbindung der allgemeinen Formel
(III) gebunden worden ist, so daß ein Derivat der
folgenden allgemeinen Formel (IX) erhalten wird:
worin R die oben angegebenen Bedeutungen besitzt und A
eine Koppelungsgruppe darstellt, über die eine Anknüpfung
an die Y-Gruppe wie zuvor erläutert vollzogen werden kann.
Als derartige A-Gruppen kann man erfindungsgemäß (diese
Aufzählung ist nicht abschließend) die N-Succinimidylsuberoylgruppe,
die 6-(4′-Azido-2′-nitrophenyl)-hexanoylgruppe,
die 3-(2-Pyridyldithio)propionyl-Gruppe, und die
m-Maleimidobenzoylgruppe nennen.
Die Umsetzung der Koppelungsagentien mit den Verbindungen
der allgemeinen Formel (III) kann man nach üblichen Verfahren
durchführen. Die Wahl der Reaktionsbedingungen hängt
von den eingesetzten Reaktanten ab.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden Monophosphoryllipid-
A-Derivate bereitgestellt, welche die oben gezeigte
Verbindung (III) enthalten, die über die divalenten A-Gruppen
an biologisch aktiven Materialien gekoppelt ist. Diese
Derivate werden im Rahmen der vorliegenden Unterlagen als
Konjugate bezeichnet und besitzen die folgende allgemeine
Formel (X)
worin A und R die oben angegebenen Bedeutungen besitzen
und Y ein biologisch aktives Material darstellt. Derartige
Verbindungen vereinigen in einem Molekül die Eigenschaften
sowohl des biologischen Materials als auch des Monophosphoryllipids-A.
Als biologische Materialien, die an das MPL-Derivat der
Formel (III) mit Hilfe eines Koppelungsreagens bzw.
Koppelungsagens gekoppelt werden können, sind beispielsweise
(diese Aufzählung ist nicht abschließend): Immunopotentiatoren,
wie Tuftsin, Muramyldipeptid, Zellwandskelett
und Trehalosedimycolat; Cytokine,
wie Interleukine, Interferone, granulocyt-monocyt-
aktivierender Faktor und Tumornekrosefaktor;
Antigene, wie solche, die bei infektiösen Erkrankungen
eine Rolle spielen; tumor-spezifische Antikörper; Membranen,
wie Phosphorlipidmembranen, einschließlich Membranen darstellende
Strukturen, wie Liposome, und Carrier, Träger,
wie Latexkügelchen, Dextran und Celluloseharze.
Bei dem oben sowie in den Beispielen aufgeführten Immunopotentiator,
Tuftsin, handelt es sich um die Verbindung
L-Threonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-arginin.
L-Threonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-arginin.
Dessen pharmakologisch verträglichen Salze und Derivate
und bestimmte seiner optischen Isomere sind zur Stimulierung
und Inhibierung von Phagocytose oder Pincytose bei
Säugern nützlich. Weitere therapeutisch nützliche, nichtantigene
Polypeptide sind beispielsweise:
L-Thr-L-Lys-L-Pro-L-Arg-L-Thr-L-Lys-L-Pro-L-Arg,
D-Thr-L-Lys-L-Pro-D-Arg-D-Thr-L-Lys-L-Pro-D-Arg,
D-Thr-L-Lys-L-Pro-L-Arg-L-Thr-L-Lys-L-Pro-Arg
und die pharmakologisch verträglichen Salze und Derivate davon.
L-Thr-L-Lys-L-Pro-L-Arg-L-Thr-L-Lys-L-Pro-L-Arg,
D-Thr-L-Lys-L-Pro-D-Arg-D-Thr-L-Lys-L-Pro-D-Arg,
D-Thr-L-Lys-L-Pro-L-Arg-L-Thr-L-Lys-L-Pro-Arg
und die pharmakologisch verträglichen Salze und Derivate davon.
Die Koppelung der biologischen aktiven Komponente an das
MPL-Derivat der Formel (IX) kann man nach Verfahren durchführen,
die in der Literatur beschrieben sind. In einigen
Fällen und in Abhängigkeit von der an der R-Einheit verfügbaren
funktionellen Gruppen kann es möglich sein, die
biologisch aktive Komponente Y direkt an R zu binden. In
einem solchen Fall steht n in der allgemeinen Formel
(X) für O.
Wie bereits oben dargelegt, stellt Monophosphoryllipid-A
ein Immunostimulanz dar und kann den daran angekoppelten,
wünschenswerte biologische Eigenschaften besitzenden weiteren
Verbindungen eine verstärkte biologische Aktivität vermitteln.
So kann beispielsweise die Wirksamkeit von MPL als
Adjuvans für Antigene verstärkt werden, wenn man das
Antigen unter Anwendung der erfindungsgemäßen Derivate an
MPL koppelt. Diese Konjugate können als potentere immunopotentierende
Verbindungen, als bessere Adjuvantien für
relativ nicht-immunogene Antigene und als Mittel für die
immunologische Forschung eingesetzt werden. Die Konjugate
der oben gezeigten Formel sind somit bei der Detektion verschiedener
biologischer Komponenten, die in Körperflüssigkeiten,
wie Blut oder Urin, enthalten sind, und auch für die
biologische Forschung nützlich, Konjugate, wie
diejenigen von Phosphoryllipid-A, das an Immunopotentiatoren
oder Cytokine konjugiert ist, sind bei der Stimulierung eines
spezifischen oder nicht-spezifischen Immmunansprechens
nützlich. Konjugate, bei denen Antikörper an MPL gekoppelt
sind, sind bei der Stimulierung eines spezifischen Immunansprechens,
in der Affinitätschromatographie, in Immunoassays,
bei der cellulären Absorption an Festkörperträger
und dergleichen nützlich. Konjugate, bei denen Antikörper
an MPL gekoppelt sind, sind auch bei der Stimulierung eines
spezifischen Immunansprechens nützlich. Man kann MPL auch
an Carrier bzw. Träger zur Anwendung in der biologischen
Forschung und in Untersuchungsverfahren konjugieren. Die
folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Herstellung
der erfindungsgemäßen Derivate.
N-t-Butoxycarbonyl-6-aminocapronsäure (t-BOC-CAP) stellt man
aus t-Butoxycarbonyloxyimino-2-phenylacetonitril (BOC-ON)
und 6-Aminocapronsäure gemäß dem Verfahren von W.J. Paleveda,
F.W. Holly, D.F. Veber, Organic Syntheses 63, 171 (1984)
her. 100 mg (4,32 × 10-4 Mol) der erhaltenen t-BOC-CAP überführt
man durch Behandeln mit 50 mg (2,42 × 10-4 Mol)
Dicyclohexylcarbodiimid in trockenem CHCl₃ in das Anhydrid.
Nach üblichen Aufarbeitungsverfahren und Umkristallisation aus
Diethylether/Hexan erhält man 76 mg t-BOC-CAP-Anhydrid (IR:
3480, 1821, 1751, 1719 cm-1; ¹H-NMR - keine Carboxylprotonen).
In einem 100 ml-Rundkolben gibt man 410 mg (etwa 2,7 × 10-4
Mol) Monophosphoryllipid-A, in Chloroform : Methanol (4 : 1;
V/V) gelöst. Man entfernt das Lösungsmittel durch Entspannungsverdampfen
und beläßt den Kolben über Nacht auf einer
Lyophilisierungsvorrichtung, um letzte Spuren von Lösungsmittel
und Feuchtigkeit zu entfernen. Zum getrockneten Rückstand
gibt man 171 mg t-BOC-CAP-Anhydrid (3,84 × 10-4 Mol) und
12 ml jeweils von Chloroform und Pyridin, wobei man die
beiden letzteren über Molekularsieb (4 Å) zuvor getrocknet
hat. Man rührt die Reaktionsmischung unter Stickstoffgas.
Man überwacht den Fortgang der Reaktion dünnschichtchromatographisch
(thin layer chromatography; TLC) auf
Silikagel 60® TLC-Platten (EM), wobei man ein Lösungsmittelsystem
zur Anwendung bringt, das aus Chloroform : Methanol :
Wasser : Ammoniumhydroxyd (50 : 31 : 6 : 2; V/V) besteht. Entwickelte
TLC-Platten macht man durch Ansprühen mit 5% Phosphomolybdat
in Ethanol und anschließendes Verkohlen bei 150°C "sichtbar".
Die Umsetzung scheint nach 24 h vollständig zu sein. Man
stoppt die Umsetzung nach 52 h, indem man 30 ml 0,10 M
Na₂CO₃ (pH 10) zugibt und 30 Min. lang heftig rührt. Man
überführt die Mischung dann in einen Schütteltrichter, gibt
12 ml jeweils Chloroform und Methanol zu und schüttelt den
Trichter. Man entnimmt die organische Phase und extrahiert
die wäßrige Phase erneut mit einer weiteren Portion Chloroform:
Methanol (2 : 1; V/V). Man vereinigt die organischen Phasen
und wäscht mit 1M HCl, bis man in der wäßrigen Phase einen
sauren pH-Wert erhält (erfordert 210 ml). Man wäscht die
organische Phase einmal mit Wasser, sprühevaporiert dann und
trocknet sie schließlich auf einer Lyophilisierungsvorrichtung.
Das Gewicht des erhaltenen Restes beträgt 491 mg.
468 mg t-BOC-CAP-MPL trocknet man in einem 50-l-Rundkolben
unter Verwendung einer Lyophilisiervorrichtung, um letzte
Spuren an Lösungsmittel und Feuchtigkeit zu entfernen. Man
stattet den Kolben dann mit einem Magnetrührstab aus und
stellt ihn in ein Trockeneis/Ethylenglykolbad (-15°C). Man
gibt dann 20 ml kalte Trifluoressigsäure (TFA) in den
Kolben, die man zuvor durch Abdestillieren über P₂O₅ im
Vakuum getrocknet hat (Destillationskolben bei -15°C,
Aufnahmekolben bei -77°C). Man rührt die Reaktionslösung
20 Min. lang heftig und destilliert danach die TFA ab.
Letzte Spuren von TFA entfernt man mit Chloroform. Man erhält
450 mg eines glasartigen, rötlich-bräunlichen Rückstandes.
Die rohe Produktmischung fraktioniert man durch Ionenaustauschchromatographie
auf einer 2,5 × 20 cm Säule von DEAE-
Cellulose in der Acetatform (Indion-HA-3®). Nach Beschicken
mit 447 mg rohem CAP-MPL spült man die Säule mit 220 ml
von jeweils Chloroform : Methanol (4 :1; V/V) und Chloroform :
Methanol : Wasser (2 : 3 : 1; V/V). Anschließend eluiert man mit
einem linearen Salzgradienten, zusammengesetzt aus 900 ml
Chloroform : Methanol : Wasser (2 : 3 : 1; V/V) gegen 900 ml
Chloroform : Methanol : 0,2 M Ammoniumacetat (2 : 3 : 1; V/V). Man
erhält insgesamt 312 mg mono-substituiertes CAP-MPL in den
4 : 1 und 2 : 3 : 1 Vorläufen. Weitere 116 mg des Materials, das
vorwiegend nicht-umgesetztes MPL darstellt, gewinnt man
während der Salzgradienten-Elution.
Man führt eine weitere Fraktionierung von CAP-MPL in die
einzelnen Komponenten an Silikagel (BioSil HA®) durch, indem
man einen linearen Gradienten von 1000 ml Chloroform gegen
1000 ml Chloroform : Methanol : Wasser (590 : 400 :10; V/V) zur
Anwendung bringt. Die Fraktionen, welche dem Hexaacylhomologen
von CAP-MPL entsprechen, vereinigt man und unterwirft
sie einer weiteren Reinigung an preparativen TLC-
Platten (500 µm Silikagel H®), wobei man Chloroform :
Methanol : Wasser : Ammoniumhydroxyd (50 : 31 : 6 : 2; V/V) als
Entwicklungslösungsmittel einsetzt. Eine Massenspektrumsanalyse
des erhaltenen gereinigten Hexaacyl-CAP-MPL zeigt
eine einzelne Komponente mit m/e von 1830; dies entspricht
der erwarteten Masse für Hexaacyl-MPL, das mit einer
6-Aminocaproylgruppe kombiniert ist.
In eine 4-ml-Ampulle mit einer Schraubkappe gibt man
14,8 mg Hexaacyl-CAP-MPL (8,09 × 10-6 Mol). Man füllt
1,0 ml trockenes Chloroform in die Ampulle, welches man
zuvor über Molekularsieb (4 Å) gelagert hat. Zu der Chloroformlösung
von CAP-MPL gibt man 12,6 mg Di-(N-Succinimidyl)
suberat (3,23 × 10-5 Mol) und anschließend
1,0 ml Pyridin (Molekularsieb 4 Å) und einen
Rührstab. Man verschließt die Ampulle dicht und rührt dann
bei Raumtemperatur (24°C) mehrere Stunden, bis die Umsetzung
im Dünnschichtchromatogramm vollständig ist (das
Produkt wandert mit einem, Rf-Wert von etwa 0,49 bei den
im Beispiel 2 angegebenen dünnschichtchromatographischen
Bedingungen). Zu diesem Zeitpunkt entfernt man das
gesamte Lösungsmittel durch Entspannungsverdampfung unter
Verwendung eines Aspirators, um Chloroform zu entfernen,
und unter Verwendung einer Vakuumpumpe, um Pyridin abzuführen.
Man hält die Temperatur zu allen Zeitpunkten unter
40°C. Man überführt den erhaltenen Rest in ein 30 ml-Corexröhrchen,
wobei man eine minimale Menge Chloroform verwendet.
Man präzipitiert das Produkt dann durch Zugabe von 20 ml
Aceton, wobei man mit einem Vortextrührer rührt. Das
Präzipitat pelletiert man durch 20-minütiges Zentrifugieren
bei 12 000 g. Man suspendiert das Pellet in 20 ml Aceton
und zentrifugiert dann wiederum 20 Min. bei 12 000 g. Die
Pelletfraktion ergibt nach Verdampfen der letzten Lösungsmittelspuren
10,7 mg Produkt (IR: 1780 (w), 1810 (w)
CM-1, TLC - Rf = 0,49 an Silikagel-60® unter Verwendung
von Chloroform : Methanol : Wasser : Ammoniumhydroxyd (50 : 31 : 6 : 2).
Man trocknet 10,1 mg teilweise gereinigtes SSC-MPL in
einem 5-ml-Rundkolben, wobei man einen dünnen, klaren Film
erhält. Man löst 16,7 mg Tuftsin (3,34 × 10-5 Mol)
in 1,37 ml 100 cm HEPES-Puffer bei pH 7,85, den man zuvor
durch Titrieren der freien Säureform von HEPES mit
Triethylamin hergestellt hat. Man gibt die Gesamtmenge der
wäßrigen Tuftsinlösung und einen 10 × 3 ml-Magnetrührstab
in den Kolben und rührt die Lösung dann über Nacht kräftig.
Man beschallt die Lösung gelegentlich kurz (ca. 10 Sek.
lang) in einem Ultraschallbad, um das Aufbrechen des SSC-
MPL-Films zu begünstigen. Nach 24 h überführt die Lösung
in einen Dialysesack (Cutoff® 6000 bis 8000 MW) und
dialysiert ausgiebig gegen destilliertes Wasser. Man
lyophilisiert das erhaltene Dialysat und erhält am Ende
12,3 mg eines weißen Pulvers (TLC - Rf = 0,12, 0,21 (Hauptanteil)
und 0,45 (Nebenanteil) an Silikagel-60®, entwickelt
mit Chloroform : Methanol : Wasser (65 : 25 : 4); SSC-MPL wandert
bei Rf = 0,53 in diesem TLC-System).
Man fraktioniert die rohe Produktmischung mittels
präparativer Dünnschichtchromatographie an präparativen
Platten (500 µ Silikagel H®) unter Verwendung
des Lösungsmittelsystems (50 : 31 : 6 : 2), um die Platten zu entwickeln.
Die Banden macht man im Gegenlicht sichtbar. Die
Produkte gewinnt man gemäß üblicher Techniken. Man erhält
zwei relativ reine Produktbanden, entsprechend Rf = 0,12
(2,3 mg) und Rf = 0,21 (4,5 mg) im 65 : 25 : 4 TLC-System.
In eine 2,0 ml Ampulle mit einer Schraubkappe gibt man eine
Chloroform : Methanol-Lösung (4 : 1; V/V), die 29 mg (1,68 ×
10-5 Mol) Hexaacyl-MPL enthält. Man zieht das gesamte
Lösungsmittel ab und entfernt letzte Spuren mit Hilfe einer
Lyophilisiervorrichtung. Man wiegt 3,4 mg (3,36 × 10-5 Mol)
Bernsteinsäureanhydrid in die Ampulle ein und gibt einen
Rührstab hinzu. Anschließend gibt man jeweils 0,2 ml
Chloroform und Pyridin zu (jeweils gereinigt durch Lagern
über Molekularsieb 4 Å). Man rührt die Lösung 5 h, überführt
sie dann in ein 15 ml Corex-Zentrifugenröhrchen und quencht
durch Rühren mit 1,0 ml 0,1 M Na₂CO₃ (pH 10,0) während eines
Zeitraumes von 30 Min. Man gibt 2 ml Chloroform und 1 ml
Methanol zur gequenchten Umsetzung und zentrifugiert dann
10 Min. bei 3000 min-1, um die Phasen zu trennen. Man wäscht
die organische Schicht 2 × mit 1N HCl, einmal mit Wasser und
verdampft dann unter einem Stickstoffstrom, wobei man 27,4 mg
eines glasartigen Rückstandes erhält. Dünnschichtchromatographisch
unter Verwendung von Silikagel (man vergleiche das
oben erläuterte Beispiel 2) stellt man fest, daß dieses
Material aus 50% Mono-Succinyl-MPL, 20% Di-Succinyl-MPL
und 30% nicht-umgesetztem MPL besteht.
Claims (8)
1. Monophosphoryllipid-A-Derivate der allgemeinen Formel
worin R den Rest einer Aminosäure, ausgewählt aus Glycin,
Alanin, Serin, Threonin, Methionin, Valin, Norvalin,
Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tyrosin, Cystein,
Asparaginsäure, Glutaminsäure, Hydroxyglutaminsäure, Arginin,
Lysin, Cystin, Histidin, Prolin, Hydroxyprolin,
Tryptophan, Asparagin, und Glutamin, oder Di- und Tripeptide
von Glycinderivaten oder den Rest
worin x = 1-20 ist, oder einen Bernsteinsäurerest bedeutet.
2. Verbindung nach Anspruch 1, worin x gleich 5 ist.
3. Verbindungen nach Anspruch 1, worin der alpha-Aminosäurerest
aus der Gruppe, die aus Glycin, Alanin, Methionin,
Valin, Norvalin, Leucin, Isoleucin, Phenylanalin
und Lysin besteht, ausgewählt ist.
4. Verbindung nach Anspruch 1, worin der alpha-Aminosäurerest
Glycin ist.
5. Verbindung nach Anspruch 1, worin der alpha-Aminosäurerest
Lysin ist.
6. Verfahren zur Herstellung von Monophosphoryllipid-A-Derivaten
nach Anspruch 1, wobei man
- 1) die Aminogruppe bzw. -gruppen einer Aminosäure mit einer Aminschutzgruppe schützt,
- 2) die geschützte Aminosäure durch Überführen zum entsprechenden Säureanhydrid aktiviert,
- 3) das Säureanhydrid mit Phosphoryllipid-A umsetzt,
- 4) die Schutzgruppe bzw. -gruppen abspaltet und
- 5) das Monophosphoryllipid-A-Derivat gewinnt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
man als Aminschutzgruppe t-Butoxycarbonyloxyimino-2-phenylacetonitril,
Benzylchloroformiat, 9-Fluorenylmethylchlorformiat
oder 2,2,2-Trichlormethylchlorformiat und
als Mittel zum Abspalten der Aminschutzgruppe Trifluoressigsäure
oder Chlorwasserstoff einsetzt und daß man
als Aminosäure Glycin, Alanin, Serin, Methionin, 6-Aminocapronsäure
oder Tyrosin zum Einsatz bringt.
8. Verwendung von Monophosphoryllipid-A-Derivaten gemäß den
Ansprüchen 1-5 zur Herstellung von Monophosphoryllipid-
A-Konjugaten mit Liposomen, Antigenen, Immunomodulatoren
und Antikörpern.
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