JP2724338B2 - マクロファージ活性化用組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、改良された抗腫瘍効果を有する新規な脂肪
親和性二糖類−トリペプチド化合物およい該化合物を含
有するリポソーム被包組成物を提供する。

発明の背景 無傷の微生物薬物は、実験的に誘発された悪性疾患お
よびヒト悪性疾患の両方において抗腫瘍効果を有するこ
とが知られている。ペプチドグリカン細胞壁骨格および
トレハロース・ジミコレートからなっている活性成分
は、ミコバクテリアから単離された。これらの活性成分
は、特に鉱油またはスクアレンに結合している場合、無
傷の微生物薬物と同様に活性であることが知られてい
る。例えば、イー・リビら（E.Ribi,et al.）、アナル
ス・オブ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエン
ス・ユー・エス・エー（Ann.NY Acad.Science,U.S.
A.）、277、228〜236（1976）参照。

ノカルジア・ルブラ（Nocardia rubra）（Ｎ−CWS）
の細胞壁骨格もまた、マクロファージを活性化すること
が知られている。静脈内投与によって、オイル−結合Ｎ
−CWSは、実験的肺動脈転移を有するラットを治療する
ことができる。例えば、エス・ソンら（S.Sone et a
l.）、キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ca
ncer Immunology Immunotherapy）、12、203〜209（198
2）参照。小さい細胞壁ペプチドグリカンの水溶性単一
ユニットは、アジュバント活性であることを示す。アジ
ュバントは、ヒトまたは他の哺乳動物の免疫システムの
非特異的刺激を生起させ、その結果、抗体の形成を増加
させ、例えば感染に対する生物の保護反応を増強する化
合物である。このような単一ユニットは、例えばルイス
肺癌またはMCA乳癌に罹っているマウスにおいて、静脈
内投与すると、抗腫瘍活性も示す。例えば、サバ，ジー
ら（Sava,G.et al.）、キャンサー・イムノロジー・イ
ムノセラピー（Cancer Immunology Immunotherapy）、1
5、84〜86（1983）参照。

これらの生物の活性成分を単離し、精製し、合成し
た。これらの成分は、糖部分およびペプチド部分を含む
広範囲の有機化合物からなるグリコペプチド類である。
細胞中に見いだされるグリコペプチド類は、抗体応答を
増大させる能力によって証明されるようなアジュバント
活性を保持しているだけではなく、マクロファージを活
性化して細胞毒性としかつ腫瘍細胞を破壊する能力によ
って証明されるような抗腫瘍活性を有していることも知
られている。例えば、ムラミル・ジペプチド（MDP）、
（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−
イソグルミン）および多数のMDP誘導体は、抗腫瘍マク
ロファージ活性特性を有することが知られている。

この無傷の微生物薬物および多くのMDP化合物は、両
方共、望ましくないレベルの毒性を示す。フロイントア
ジュバントのような、単独または水中油エマルション中
で使用される無傷の微生物薬物は、ヒスタミンに対する
感受性の増大、肝臓および膵臓の肉芽腫形成および過形
成を生起させることができる。あるMDP化合物の投与に
よる毒性反応は、発熱を含んでおり、繰り返し投与する
と、脈管炎を発生する。

多くの多糖類−および二糖類−ペプチドのin vitro
およびin vivoの両抗腫瘍活性は、リポソームと一体化
することによって増大する。免疫原性および／または抗
腫瘍薬物の脂肪親和性誘導体は公知であり、マクロファ
ージを標的とし、細胞毒状態に対してマクロファージを
活性化するためにリポソーム中に有用な薬物を効果的に
一体化するのに有用である。

したがって、アジュバントおよび／または抗腫瘍活性
を改良し、リポソームと容易に一体化され、予想された
効果的なヒト投与量に対して適当に過剰の投与量におい
て非毒性である新規グリコペプチド化合物が必要であ
る。

発明の趣旨 本発明は、公知の基本化合物ムラミルジペプチド（MD
P）の新規脂肪親和性二糖類−トリペプチド誘導体を提
供する。本発明化合物は、好ましくは、例えばホスファ
チジルコリンおよびホスファチジルグリセロールから形
成され得る多ラメラリポソーム中に被包される。該化合
物は、ヒト単核細胞を活性化し、その結果、腫瘍細胞を
破壊するのに効果的である。該化合物は、予想されたヒ
ト投与量に対して適当に過剰の投与量において非毒性で
もある。

本発明化合物は、式［Ｉ］： ［式中、R¹は（C₁〜C₅）アルキルであり、R²は（C₁〜
C₅）アルキルであり、R³およびR⁴は、各々、約０〜４つ
の二重結合を含んでいる（C₆〜C₃₀）アルキル基であ
る］ で示される。Ｘは、ペプチジル残基であり、例えば、一
般式： で示されるアミノ残基である。好ましくは、Ｘは、式： で示されるＬ−アラニン残基である。該本発明化合物の
医薬的に許容される塩、および上記式で示される化合物
からなるリポソームも、本発明の範囲内である。多少の
ものを除いて、天然に生じる蛋白は、その成分アミノ酸
のＬ−鏡像異性体だけを含有しているが、本発明組成物
において、アミノ酸のDL−混合物として可能である場
合、Ｄ−鏡像異性体も使用し得る。

発明の詳細な説明 新規化合物の化学構造 本発明化合物（化合物Ｉ）は、公知の基本化合物ムラ
ミルジペプチド（MDP）の新規な脂肪親和性二糖類−ト
リペプチド誘導体である。

化合物Ｉは、窒素原子に約２〜６個の炭素原子を結合
しているアシル基を有するグルコサミン（Glc）誘導体
を含む。好ましくは、該アシル基は炭素原子２個を有し
ており（アセチル）、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcN
Ac）を形成する。

Ｎ−アシルグルコサミン部分は、Ｎ−アシルムラミル
部分に結合している。ムラミル基の窒素原子に結合して
いるアシル官能基は、約２〜６個の炭素原子、好ましく
は２個の炭素原子を有しており、Ｎ−アセチルムラミル
基を形成する。別の二糖類GlcNAc−MurNAcは、天然に生
じる二糖類であり、高分子性グリコペプチドの部分とし
て細菌細胞壁中に見いだされる。米国特許第4,395,399
号参照。

化合物Ｉの二糖類部分Ｎ−アシルグルコサミン−Ｎ−
アシルムラメートは、ムラミル基の３位でラクチルエー
テル結合を介してトリペプチド部分のＮ−末端と結合す
る。トリペプチド部分は、ジペプチド、Ｌ−アラニル−
Ｄ−イソグルタミンを含んでおり、これは細菌性ペプチ
ドグリカン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニン−Ｄ
−イソグルタミンの単一ユニットを天然に生じることが
分かっている。上記化合物Ｉの式中Ｘで表されたトリペ
プチド部分の第３のアミノ酸は、任意のペプチジル残基
であり、好ましくはＬ−アラニンである。したがって、
好ましいトリペプチド部分は、Ｌ−アラニン−Ｄ−イソ
グルタミン−Ｌ−アラニン（Ｌ−Ala−Ｄ−isoGln−Ｌ
−Ala）である。新規化合物の二糖類−トリペプチド部
分は、Ｎ−アシルグルコサミニル−Ｎ−アシルムラミル
−トリペプチドと称してもよい。

本発明化合物の脂肪親和性末端は、各々、７〜31個の
炭素原子、好ましくは12〜23個の炭素原子および約０〜
４つの二重結合、好ましくは約０〜１つの二重結合を有
する２つのアシル基で置換されているグリセロールの誘
導体からなる。好ましくは、両アシル基は、16個の炭素
原子［C₁₆］を有しており、ジパルミトイル−グリセロ
ール誘導体を形成する。グリセロールの残存している−
OHは、トリペプチド部分の末端アミノ酸、ＸのＣ−末端
に結合する。

本発明の新規化合物は、一般的に、Ｎ−アシルグルコ
サミニル−Ｎ−アシルムラミル−トリペプチド−ジアシ
ル−グリセロール化合物と記すことができる。好ましく
は、該化合物は、Ｎ−アセチルグルコサミンル−Ｎ−ア
セチルムラミル−Ｌ−アラニン−Ｄ−イソグルタミン−
Ｌ−アラニン−ジパルミトイルグリセロール（GlcNAcMu
rNAc−Ｌ−Ala−Ｄ−isoGln−Ｌ−DPGまたはGMTP−DP
G）である。

化合物Ｉは、上記式で示される医薬的に許容される塩
としても使用され得る。このような塩としては、クエン
酸、乳酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエン
スルホン酸などのような有機酸および塩酸、硫酸、リン
酸などのような無機酸からの誘導体であるアミン塩が挙
げられる。硫酸（低級）アルキルおよびハロゲン化（低
級）アルキルのような塩も使用することができる。該化
合物の単離または精製に関して、医薬的に許容されない
塩を使用してもよい。しかしながら、医薬的に許容され
る非毒性塩だけが治療学的に使用することができ、した
がって、好ましい。

リポソーム リポソームは、通常、リン脂質または他の脂肪物質か
ら得られ、単一または多ラメラ水化液晶から形成され
る。これらは、通常、水性担体媒質中の分散体として使
用される。リポソームと化合物Ｉを一緒に使用すると、
アジュバントおよび抗腫瘍活性が増大する。また、しば
しば、体液および／または細胞介在免疫応答の増大がみ
られる。したがって、化合物Ｉは、好ましくは、リポソ
ームに含まれている。

リポソームを形成するための多くの慣用方法がある。
非毒性で、生理学的に許容され、代謝可能な、リポソー
ムを形成することができる脂質を使用することができ
る。最もありふれた脂質は、リン脂質であり、顕著なも
のは、天然および合成のホスファチジルコリン（レシチ
ン）である。リン脂質は、例えば、ホスファチジル−セ
リン、ホスファチジル−イノシチドまたはスフィンゴミ
エリンを使用することもできる。例えば、ダブリュ・ア
ール・ハーグリーブス（W.R.Hargreaves）およびディー
・ダブリュ・ディーマー（D.W.Deamer）［カンファレン
ス・オン・リポソームズ・アンド・ゼア・ユージズ・イ
ン・バイオロジー・アンド・メディスン（Conference o
n Liposomes and Their Uses in Biology and Medicin
e）、1977年９月14〜16日、ニューヨーク・アカデミイ
ー・オブ・サイエンス（New York Acad.Sci.）］によっ
て、およびバイオケミストリー（Biochem.）、18、375
9、（1978）に開示されている他の脂質を使用すること
もできる。

本発明のリポソームを形成するのに慣用技術および装
置を使用することができる。これらの技術は、例えば、
デビッド・エム・プレスコット（David M.Prescott）に
よって編集された研究題“メソッズ・イン・セル・バイ
オロジー（Methods in Cell Biology）”の第IV章［第X
IV巻、1976、アカデミック・プレス、ニューヨーク、第
33頁およびそれに続く頁］に開示されている。

リポソーム中に活性化合物Ｉを被包する他の方法とし
ては、有機溶媒中、溶液からの蒸発によって（充填した
脂質を有するかまたは有しない）リン脂質のフィルムを
鋳造し、次いで、適当な水性媒質中に該フィルムを分散
させることが挙げられる。脂質−可溶性で生物学的に活
性な化合物、すなわち、リポソームの水性層よりも脂質
層と関連する化合物の場合、該化合物は、通常、一般的
な有機溶媒を用いて、リン脂質と一緒にフィルムとして
鋳造される。水−可溶性で生物学的に活性な化合物の場
合、該化合物は、代表的には、該化合物の水溶液によっ
て鋳造リン脂質フィルムを分散させることによってリポ
ソーム中に被包される。次いで、被包された化合物を、
遠心分離、クロマトグラフィーまたは他の適切な方法に
よって遊離化合物と分離する。

化合物Ｉの脂肪親和性末端は、そのリポソーム中への
一体化を増強する。化合物Ｉは、好ましくは、本質的
に、重量比約５〜1:1、好ましくは約7:3の１−パルミト
イル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン（PC）お
よびジオレオイルホスファチジルグリセロール（PG）か
らなる二層膜を有するリポソーム中に一体化される。こ
れらの化合物は、アラバマ、ペラムのアバンティ・ポー
ラー・リピッズ（Avanti Polar Lipids）から市販品と
して入手可能である。

リポソーム中に化合物Ｉを被包するのに使用すること
ができる好ましい方法は、米国特許第4,370,349号に開
示されており、本明細書に引用記載する。該方法は、
（１）適当な溶媒中に必要な物質を溶解し、次いで、該
溶液を凍結乾燥させ、得られた凍結乾燥混合物を貯蔵
し、所望により、水性リポソーム製剤を再調製するこ
と、または（２）公知の方法によって水性リポソーム製
剤を調製し、該製剤を凍結乾燥させることのいずれかか
らなる。所望により、該凍結乾燥生成物は、水性リポソ
ーム製剤中に調製することもできる。該凍結乾燥混合物
は、水性媒質と一緒に振盪する場合に容易に分散し、該
凍結乾燥リポソームを使用すると、鋳造フィルムを分散
させることによって得られる対応する製剤よりも狭いサ
イズ分布を有するリポソーム製剤が得られる。これは、
リポソーム製剤の治療学的効果の予備生産可能性に関す
る利点である。一般に、リポソームの形態の組成物は、
化合物Ｉに加えて、任意の成分：安定化剤、防腐剤、賦
形剤、またはムラミル−ペプチド化合物の投与に関して
予め与えられた注射可能な溶液もしくはエマルション中
で使用することができる他の活性物質を含むことができ
る。

デリバリー 化合物Ｉ、好ましくはリポソーム中に一体化された化
合物Ｉは、アジュバントまたは抗腫瘍活性のために使用
され得、経口または非経口的に、好ましくは注射によっ
て投与され得る。

本発明は、特に、化合物Ｉおよび医薬的に許容される
担体ビヒクルを含有している医薬アジュバントおよび抗
腫瘍組成物に関する。このタイプの組成物が特に好まし
く、これは、有効量の本発明生成物を含有する注射可能
溶液によって構成されている。水、好ましくは食塩等張
溶液またはグルコースの等張溶液のような等張液に入れ
た滅菌溶液が、この目的に有利に使用される。蒸留水に
入れた単一溶液を使用することもできる。油性相を含有
している注射媒質、特に油中水エマルションを使用する
こともできる。このようなエマルションは、特に、仏国
特許出願第75−04003号に開示されているような代謝可
能な植物性油によって得られる。該仏国特許出願は、該
仏国優先権特許出願第75−04003号に基づいて1976年２
月９日に出願されたオーディバート（Audibert）らの米
国継続特許出願第656,738号に対応する。好ましい担体
ヒビクルは、上記の凍結乾燥リポソームである。

本発明のアジュバントおよび抗腫瘍組成物は、この目
的のために、選択された投与方法に対して適切なビヒク
ルを使用することによって、種々の形態で投与してもよ
い。例えば、単回投与形態は、経口投与のために、サシ
ェ、打錠された錠剤またはゼラチン硬もしくは軟カプセ
ルの形態で、あるいは、粘膜に適用するためにエーロゾ
ルまたはゲルの形態で使用される。

該本発明組成物は、アジュバントおよび抗腫瘍組成物
を即座に調製することができるように凍結乾燥形態であ
ってもよい。医薬的に有利な形態は、体表面積１m²あた
り化合物約200μｇ〜10mgの単一投薬からなる。

製造 化合物Ｉ、例えば、４−Ｏ−［２−アセトアミド−２
−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−アセト
アミド−２−デオキシ−３−Ｏ−［Ｄ−２−プロパノイ
ル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニ
ン−2,3−ジパルミトイル−sn−グリセロール］−Ｄ−
グルコピラノース（GlcNAcMurNAc−Ｌ−Ala−Ｄ−isoGl
n−Ｌ−Ala−DPG）は、上記の９つの主要工程で、市販
の入手可能な物質から製造され得る。該工程は、以下の
説明から明らかなように記載された順番で行う必要はな
い。

第１工程は、保護アミノ酸−ジアシルグリセロールの
製造を含む。これは、アミノ酸残基、Ｘ、好ましくはＬ
−アラニン残基、のＣ−末端に結合した化合物Ｉの脂肪
親和性部分である。例えば、好ましい具体例において、
この残基は、保護−Ｌ−アラニン−2,3−ジパルミトイ
ル−sn−グリセロールである。

本合成において出発物質として用いられる保護アミノ
酸またはペプチドは、保護形態で市販品として入手可能
であるかまたはペプチド化学の公知方法によって得られ
る。容易に遊離され得る遮蔽基または保護基は、ペプチ
ドおよび糖化学から公知のものである。ヒドロキシ基に
関して、以下のものが好適な例である：例えばアセチル
のような低級アルカノイル基の如きアシル基、ベンゾイ
ルのようなアロイル基、および特にベンジルオキシカル
ボニルもしくは低級アルコキシカルボニルのような炭酸
誘導体から誘導された基、またはアルキル、特にtert−
ブチル、場合によってニトロ、（低級）アルコキシまた
はハロゲンによって置換されていてもよいベンジル、各
々所望によってハロゲンまたはメトキシのような低級ア
ルコキシによって置換されていてもよいトリフェニルメ
チルもしくはテトラヒドロピラニル、あるいは４位およ
び６位で酸素原子を結合している所望によって置換され
ていてもよいアルキリデン基。このようなアルキリデン
基は、好ましくは、低級アルキリデン基であり、例え
ば、メチリデン、イソプロピリデンまたはプロピリデン
基であり、あるいは、他方、所望によって置換されてい
てもよいベンジリデン基である。

Ｃ−末端カルボキシ基の遮蔽に関して、適当な部分と
しては、tert−ブチル、ベンジルまたはベンズヒドリル
が挙げられる。遊離アミノ基の保護に関しては、tert−
ブチルオキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニ
ル基を使用することができる。

これらの遮蔽基は、酸加水分解のような当技術分野で
公知の手段で開裂させることができる。ベンジルまたは
ベンジリデン基は、水素化分解によって、例えば、パラ
ジウムまたは白金触媒のような貴金属触媒の存在下で水
素を用いて除去することができる。

本発明化合物の製造の第２工程は、アミノ酸から遮蔽
基を除去して、Ｘ−ジアシル−グリセロール（ここで、
Ｘは、上記のアミノ酸残基である）、好ましくはＬ−ア
ラニンを形成することを含む。例えば、好ましい成分
は、Ｌ−アラニン−2,3−ジパルミトイル−sn−グリセ
ロール（Ｌ−Ala−DPG）である。

第３工程は、好適な細菌、例えばミクロコッカス・リ
ソデイクティカス（Micrococcus lysodeikticus）［乾
燥細胞が、ミズリー、セントルイスのシグマ・ケミカル
・カンパニー（Sigma Chemical Co.）から市販品として
入手可能である］から二糖類部分を単離することを含
む。得られた二糖類は、Ｎ−アセチルグルコサミニル−
Ｎ−アセチルムラメートである。ミクロコッカス・リソ
デイクティカス（Micrococcus lysodeikticut）のバイ
オマスからこの二糖類の単離は、公知であり、文献に開
示されている。トリプシンおよびリゾチームによってミ
クロコッカス・リソデイクティカス（Micrococcus lys
odeikticut）のバイオマスを酵素加水分解し、ダウエッ
クス（Dowex^R）1X8（CH₃COO^-型）200〜400メッシュを充
填したカラム中でさらに精製することを含む［ホシノ・
オー（Hoshino O.）、ゼナビ・ユー（Zenavi U.）、シ
ナイ・ピー（Sinay P.）、ジーンロズ・アール・ダブリ
ュ（Jeanloz R.W.）、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、247、No.2、381、
（1972）；およびシャロン・エヌ（Sharon N.）、オサ
ワ・ティー（Osawa T.）、フラワーズ・エイチ・エム
（Flowers H.M.）、ジーンロズ・アール・ダブリュ（Je
anloz R.W.）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー、241、223（1966）］。さらに、本明細書で
引用記載する米国特許第4,427,659号参照。

上記の単離した二糖類において、R¹およびR²は、両方
とも、−CH₃であり、ムラミルおよびグルコサミル官能
基上でアセチル基を形成している。R¹およびR²が個々に
C₂〜C₆アルキル基である類似化合物は、当技術分野にお
いて公知の方法によって製造することができる。例え
ば、アセチル基は、例えば、ピー・エイチ・グロス・ア
ンド・アール・ダブリュ・ジーンロズ（P.H.Gross and
R.W.Jeanloz）［ジャーナル・オブ・オーガニック・ケ
ミストリー（J.Org.Chem.）、1967、32、2761］に開示
されているような強酸によって加水分解することができ
る。次いで、酸無水物または塩化物のような、導入され
ることが望まれるR¹またはR²に対応するアシル化剤は、
所望のR¹またはR²をムラミルまたはグルコサミニル官能
基に結合させるのに使用してもよい。

次の工程は、両端が遮蔽されたジペプチドアラニン−
イソグルタミンの製造を含む。オハイオ、クリーブラン
ドのユナイテッド・ステート・バイオケミカル・カンパ
ニー（USBC）から市販品として入手可能なBOC−Ｌ−ア
ラニル−Ｄ−イソグルタミンは、当技術分野において公
知の手段で処理してベンジルエステル（−OBn）のよう
な好適な遮蔽剤でＣ−末端イソグルタミン残基を末端処
理しなければならない。したがって、BOC−Ｌ−Ala−Ｄ
−isoGlu−OBnが形成されるのが好ましい。

次の工程は、公知の形成方法によってアラニンから遮
蔽基を除去して、例えば、Ｌ−Ala−Ｄ−isoGln−OBnを
形成することを含む。次の工程は、Ｎ−アシルグルコサ
ミン−Ｎ−アシルムラミル官能基とアラニン−イソグル
タミン部分とをカップリングさせることを含む。縮合反
応は、不活性溶媒媒質中、好ましくは、ウッドワード試
薬Ｋ（Ｎ−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−
３′−スルホネート）のような縮合剤の存在下、約０℃
〜25℃の温度で、一段階で行われる。米国特許第4,395,
399号参照。

次の工程は、慣用手段によって遮蔽基を除去して、脱
遮蔽二糖類−ジペプチド、例えば、４−Ｏ−［２−アセ
トアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル］
−２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−［Ｄ−２
−プロパノイル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン］
−Ｄ−グルコピラノース（GlcNAcMurNAc−Ｌ−Ala−Ｄ
−isoGln）を形成することを含む。

最終工程では、慣用技術によってGlcNAcMurNAc−Ｌ−
Ala−Ｄ−isoGlnとアミノ酸−ジアシルグリセロール成
分とをカップリングさせて、化合物Ｉを形成することを
含む。

化合物Ｉは、本明細書において前記したようにリポソ
ーム中に被包させるのが好ましい。本発明化合物とホス
ファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールと
を混合させるのが好ましい。代表的には、約100mg/mlの
濃度でtert−ブタノール中にリン脂質を溶解させる。te
rt−ブタノールに入れた適当な量のPCおよびPGを混合し
て、重量比約7:3とする。化合物Ｉを量り取り、与えら
れた脂肪に添加して、例えば5ml当たり約1mgの最終濃度
にする。次いで、該物質を濾過器に通して、該組成物を
バイアル中に調剤する。該バイアルを、代表的には−20
℃で冷凍し、次いで、代表的には約20℃で18時間凍結乾
燥させる。次に、該バイアルをアルゴンのような不活性
ガス下で密封する。

以下の限定されていない実施例によって、本発明をさ
らに説明する。

実施例１ BOC−Ｌ−Ala−DPGの調製 25mlの丸底フラスコ（RBF）中に、BOC−Ｌ−アラニン
208.64mg（1.103ミリモル）、1,2−ジパルミトイル−sn
−グリセロール（シグマ（Sigma））570.0mg（1.002ミ
リモル）、４−ジメチルアミノピリジン（DMAP）（アル
ドリッチ・ケミカル・カンパニー（Aldrich Chemical C
o.）、ミルウォーキー、ウィスコンシン）63.14mgおよ
び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド・塩酸塩（EDCI）230.04mg（1.200ミリモ
ル）を入れた。BOCは、Ｎ−tert−ブトキシカルボニ
ル、遮蔽基の略語である。塩化メチレン（CH₂Cl₂）を添
加し、最終容量を14mlにした。該混合物を氷水浴中で１
時間、次いで、室温（RT）で一晩撹拌した。

一晩撹拌した後、吸引減圧下、回転エバポレーターで
溶媒を除去し、白色固形物を得た。これを酢酸エチル
（EtOAc）20mlと水10mlの間で分配した。水層を別のEtO
Ac 20mlで抽出した。有機層を合わせて、重炭酸ナトリ
ウム飽和水溶液２×20mlで、次いで水２×20mlで処理
し、次いで、Na₂SO₄で乾燥させた。回転エバポレーター
で溶媒を除去し、白色固体のBOC−Ｌ−Ala−DPG 648mg
（98％）を得た。

実施例２ Ｌ−Ala−DPG CH₂Cl₂ 15mlにBOC−Ｌ−Ala−DPG 630mg（0.85ミリモ
ル）を溶解し、これにトリフルオロ酢酸（TFA）5.0mlを
添加した。該溶液を室温で２時間撹拌し、次いで、回転
エバポレーターで濃縮乾固させて、黄褐色油状物を得
た。これをヘキサン10mlに溶解し、回転エバポレーター
で濃縮乾固させた。この工程を２、３回繰り返し、最終
痕跡量のTFAを除去した。次に、この物質を高真空下で
乾燥させ、オフホワイト色固体のトリフルオロ酢酸Ｌ−
Ala−DPG 606.7mgを得た。

実施例３ GlcNAcMurNAcの調製 ミクロコッカス・リソデイクティカス（Micrococcus
lysodeikticus）の乾燥細胞（ミズリー州セントルイ
スのシグマ・ケミカル・カンパニーから市販品として入
手可能）15.0gを、蒸留水200mlに懸濁させ、４℃で90分
間、0.1mmのガラスビーズ250gと一緒に高速で撹拌する
ことによって粉砕した。デカンテーションによってガラ
スビーズから細胞壁骨格（CWS）を取り出し、次いで、1
200×ｇで30分間遠心分離した。ペレット（無傷細胞）
から上澄み液を除去し、次いで、10,000×ｇで50分間遠
心分離した。上澄み液を除去し、得られたペレット（粗
CWS）を、蒸留H₂O 100mlで３回洗浄し、10,000×ｇで70
分間遠心分離した。得られたペレットを蒸留水150mlに
懸濁させ、次いで、沸騰水浴中に30分間置いた。

室温まで冷却させた後、得られたスラリーを10,000×
ｇで遠心分離した。上澄み液を除去し、ペレット３を0.
05M酢酸アンモニウム緩衝液（pH7.60）60ml中にスラリ
ー化させた。得られたスラリーをブタ膵臓トリプシン
（シグマ、14,600 BAC ユニット/mg）10.0mgで処理し、
37℃で20時間インキュベートした。蒸留H₂Oで２、３回
洗浄した後、CWSペレットを0.05M酢酸アンモニウム緩衝
液（pH6.30）60ml中にスラリー化させ、卵白リゾチーム
（シグマ、56,000ユニット/mg、10.0mg）で処理し、37
℃で19時間インキュベートした。

粗調製物を透析して、酵素および未消化細胞壁を除去
した。酢酸勾配液で溶離してダウエックス−１（酢酸塩
型）上でイオン交換クロマトグラフィーによって最終精
製を行った。UV吸光度および薄層クロマトグラフィー
（TLC）（シリカゲル、50:39:8:3CHCl₃／CH₃OH／H₂O／N
H₄OH、５％H₂SO₄/EtOHおよび加熱）によってカラム画分
を溜めた。ムラミン酸および全ヘキソースアミンの比色
測定分析ならびに高速原子衝撃質量分析によって、二糖
類生成物の明らかな同定を得た。乾燥細胞15gからGlcNA
cMurNAc 120mgを得た。

実施例４ BOC−Ｌ−Ala−Ｄ−isoGln−OBnの調製 ベンジルアルコール（77.0mg、0.71ミリモル）、DMAP
（33.0mg、0.27ミリモル）およびBOC−Ｌ−アラニル−
Ｄ−イソグルタミン（159.0mg、0.50ミリモル）をCH₂Cl
₂ 5mlおよびDMF 2mlに溶解した。この溶液を氷水浴中で
４℃に冷却し、EDCI（118.0mg、0.61ミリモル）で処理
し、４℃で30分間、次いで室温で15時間撹拌した。回転
エバポレーターで溶媒を除去した後、残留物をEtOAc 20
mlと水10mlの間で分配した。層を分離し、水層を別の酢
酸エチル20mlで抽出した。有機画分を合わせて、逐次、
飽和NaHCO₃（２×20ml）およびH₂O（２×20ml）で抽出
した。硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を回転エバ
ポレーターで除去し、ワックス状固形物が残った。これ
をEtOAc−石油エーテルから再結晶して、白色綿毛状固
体のBOC−Ｌ−Ala−Ｄ−isoGln−OBn 141mg（69％）を
得た。

実施例５ Ｌ−Ala−Ｄ−isoGln−OBnの調製 BOC−Ｌ−Ala−Ｄ−isoGln−OBn（120mg、0.294ミリ
モル）を1N HCl/HOAc 10mlで処理し、得られた溶液をRT
で２時間撹拌した。次いで、溶媒を回転エバポレーター
で除去し、無色油状物を得、これをメチルアルコール3m
lに取り、次いで、ジエチルエーテル20mlを滴下して沈
澱させた。RTで１時間撹拌した後、生成物を濾過器によ
って回収し、エーテルで洗浄し、次いで、高真空下で乾
燥させて、白色固体のＬ−Ala−Ｄ−isoGln−OBnの塩酸
塩88mgを得た。

実施例６ Ｌ−Ala−Ｄ−isoGln−OBnとGlcNAcMurNAcのカップリン
グ GlcNAcMurNAc（分子量496.47、0.405ミリモル）200mg
を全部、ジエチルホルムアミド（DMF）15mlに溶解し、
次いで、DMF（0.403ミリモル）にトリエチルアミン（TE
A）42.94mg/mlを含む溶液0.95mlで処理した。該溶液を
氷浴中で磁気撹拌しながら冷却し、次いで、ウッドワー
ド試薬K 139.6mg（純度95％、0.524ミリモル）で処理し
た。次に、スラリーを氷浴中で１時間撹拌し、次いで、
室温で10分間撹拌した。次に、DMF 8.0mlにＬ−Ala−Ｄ
−isoGln−OBnのHCl塩152.3mg（0.443ミリモル）を含む
溶液に、TEA/DMF溶液1.05ml（0.443ミリモル）を添加
し、れこを、10分間かけて均圧漏斗を介して添加した。
該溶液をPTで18時間撹拌し、次いで、さらに96時間放置
した。この間、反応をTLCによって追跡し、完了するま
で行った。

25℃で、高真空下（約50ミクロン）、回転エバポレー
ターでDMFを除去し、赤味がかった油状物を得て、これ
をさらに高真空下で乾燥させた。

該油状物をH₂O 5ml中に取り、ダウエックス 1X8（200
〜400メッシュ、酢酸塩型）の1.7×7cmカラムに入れ
た。該カラムをH₂O 50mlで洗浄し、完全に無色の溶出液
をアンバーライト（Amberlite^R）IR−120 P樹脂（16〜2
0メッシュ、H⁺型）の1.7×7cmカラムに入れた。該カラ
ムをH₂O 50mlで洗浄し、溶出液および洗液を合わせた。
この物質を25℃で吸引真空下、回転エバポレーターで乾
固させて無色油状物を得た。これを高真空下（50〜75ミ
クロン）で一晩乾燥させ、この間にガラス状固形物に固
化した。これをH₂O 20mlに取り、凍結乾燥させ、純白綿
毛状固体のGlcNAcMurNAc−Ｌ−Ala−Ｄ−isoGln−OBn 1
81mgを得た。

実施例７ GlcNAcMurNAc−Ｌ−Ala−Ｄ−isoGlnの調製 実施例６で調製した保護物質170mgをH₂O（30ml）およ
び酢酸（1.0ml）の溶液に溶解した。50mlのパール（Par
r）水素添加ボトル中、該溶液を５％Pd/C（パラジウム
の重量％、Ｃは粉末木炭である；オハイオ、ノーウッド
のマセソン・コルマン・アンド・ベル（Matheson,Colem
an,and Bell）から入手）100mgに添加し、20psigで24時
間水素添加した。触媒を除去し、水（３×10ml）で洗浄
し、濾液および洗液を併せて、凍結乾燥させ、白色固体
のGlcNAcMurNAc−Ｌ−Ala−Ｄ−isoGln 150mg（100％）
を得た。該生成物を高真空下で48時間さらに乾燥させ、
次いで、しっかりとキャップをし、４℃で貯蔵した。

実施例８ GlcNAcMurNAc−Ｌ−Ala−Ｄ−isoGln−Ｌ−Ala−DPGを
得るためのGlcNAcMurNAc−Ｌ−Ala−Ｄ−イソグルタミ
ンのＬ−Ala−DPGへのカップリング １−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）（31.35m
g、0.232ミリモル）およびEDCI（44.26mg、0.231ミリモ
ル）を50mlのRBFに入れた。これに、DMF 7mlおよびCH₂C
l₂ 5mlに実施例７で調製した二糖類ジペプチド（139.13
mg、0.20ミリモル）を含む溶液を添加した。得られた溶
液をRTで30分間撹拌した。

DMFにTEA202mg（0.28ml）を溶解し、最終容量を10ml
に調節して、トリエチルアミン溶液を調製した。

Ｌ−Ala−DPG（150.8mg、0.20ミリモル）をCH₂Cl₂ 1m
lに溶解した。DMF（1ml）を添加し、次いで、TEA溶液1m
lを添加した。得られた溶液を、活性化二糖類ジペプチ
ド溶液に添加し、容器にしっかりとキャップし、72時間
撹拌した。

該反応をTLCによって追跡し、72時間で停止させた。
次いで、反応混合物を、１つは5ml、他方は10mlの２つ
の部分に分けた。これらの試料を、高真空下、室温で、
回転エバポレーターで濃縮乾固した。次いで、これら
を、24時間、デジケーター中でさらに乾燥させた。この
間に両試料は乾燥されて黄−橙色固形物になった。

精製のために、少量の部分をH₂O 25mlとEtOAc 25mlと
の間で分配した。層を分離し、有機層をH₂O 2×10mlで
抽出し、水性層に洗液を添加した。次いで水性画分をEt
OAc 25mlで洗浄し、層を分離い、有機相を合わせた。水
性層を回転エバポレーターで半分の容量に濃縮し、30〜
35psiでアミコン（Amicon）YM−５膜を介してH₂Oに対し
て広範囲に残留物を透析した。

内部透析物のTLC分析によって、単一スポットが示さ
れた。次に、この物質をワットマン（Whatman^R）＃２紙
を介して濾過し、凍結乾燥させて、クリーム色の固形物
35mgを得た。

実施例９ GMTP−DPGの調製 BOC−Ｌ−Ala−DPG（II）− 塩化メチレン（CH₂Cl₂）5
0mlに1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロール（シグ
マ、2.845g、5.0ミリモル）、BOC−Ｌ−アラニン（USB
C、966mg、5.1ミリモル）および４−ジメチルアミノピ
リジン（DMAP）（アルドリッチ、357mg、2.93ミリモ
ル）を溶解した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（EDCI）（シグ
マ、1.174g、6.12ミリモル）を添加し、該溶液を室温
（RT）で17時間撹拌した。回転エバポレーターで溶媒を
除去した後、残留物を酢酸エチル（EtOAc）150mlとH₂O
75mlとの間で分配し、層を分離し、有機層を重炭酸ナト
リウム飽和水溶液（３×50ml）で抽出し、次いで、H₂O
（３×75ml）で抽出した。硫酸ナトリウムで乾燥させた
後、回転エバポレーターで溶媒を除去し、高真空下で残
留物をさらに乾燥させ、わずかにオフホワイト色の固体
生成物3.59g（97％）を得た。

生成物を薄層クロマトグラフィー（TLC）（シリカ；C
HCl₃／CH₃OH／H₂O、130:45:7;HClスプレイ、次いでニン
ヒドリン）にかけると、Rf 0.95の単一のスポットが示
された。

Ｌ−Ala−DPG（III）− CH₂Cl₂ 75mlに保護アラニンエ
ステル（II）（2.50g、3.38ミリモル）を溶解し、次い
で、トリフルオロ酢酸（TFA）25mlで処理した。室温で
２時間放置した後、回転エバポレーターで溶媒を除去す
ると、黄褐色油状物が残存し、これをヘキサン20mlに取
り、次いで、回転エバポレーターで濃縮乾固した。高真
空下で広範囲に乾燥させた後、トリフルオロ酢酸塩とし
て化合物III 2.44g（95.7％）を得た。

BOC−Ｌ−Ala−Ｄ−isoGln−OBn（IV）− CH₂Cl₂ 40ml
およびN,N−ジメチルホルムアミド（DMF）10mlに、BOC
−Ｌ−Ala−Ｄ−isoGln（USBC、1.587g、5.0ミリモ
ル）、ベンジルアルコール（540.7mg、5.0ミリモル）お
よびDMAP（305mg、2.5ミリモル）を溶解し、得られた溶
液を磁気撹拌しながら氷水浴中で４℃に冷却した。EDCI
（1.150g、6.00ミリモル）を添加し、反応物を氷浴中で
１時間撹拌し、次いで、室温で17時間撹拌した。回転エ
バポレーターで溶媒除去した後、油状残留物をH₂O 50ml
とEtOAc 150mlとの間で分配させ、層を分離し、有機層
を重炭酸ナトリウム飽和水溶液（３×50ml）および₂O
（３×50ml）でさらに抽出した。硫酸ナトリウムで乾燥
させた後、溶媒を回転エバポレーターで除去し、無色油
状物を得て、これをさらに高真空下で乾燥させた。この
間にワックス状固形物に固化された。EtOAc−ヘキサン
から再結晶し、純白固体の化合物IV 1.318g（65％）を
得た。

生成物をTLC（シリカ;EtOAc/ピリジン／酢酸／H₂O、3
0:2:0.6:1;HClスプレイ、次いでニンヒドリン）にかけ
ると、Rf 0.90の単一スポットが示された。

Ｌ−Ala−Ｄ−isoGln−OBn（Ｖ）− 1N HCl/酢酸100ml
で保護ジペプチドエステルIV（2.08g、5.10ミリモル）
を処理し、得られた溶液を室温で２時間放置した。回転
エバポレーターで溶媒を除去し、高真空下でさらに乾燥
させた後、生成物をメタノール−エーテルから結晶化さ
せ、塩酸塩として化合物V 1.68g（95.8％）を得た。

GlcNAcMurNAc（VI）− 乾燥細胞の形態の市販の入手可
能な凍結乾燥したミクロコッカス・リソデイクティカス
（Micrococcus lysodeikticus）（シグマ）を蒸留水に
懸濁させ（２〜３％w/w）、次いで、ミクロフルイディ
クス・コーポレイション・ラボラトリー・ミクロフルイ
ダイザー（Microfluidics Corporation laboratory Mic
rofluidizer^R）（モデル（Model）Ｍ−110Y）で粉砕し
た。これは82psigの通常操作空気圧でパワレックス（Po
werex^R）GI−25エアーコンプレッサーによって操作さ
れ、結果、19,000psigの水圧となった。次に、細胞壁を
差動遠心分離によって単離し、実施例３に記載のように
トリプシンおよびリゾチームで連続的に処理した。次
に、得られた消化物を透析し（アミコン PM−10膜）、
酵素および大きい分子量の不純物を除去し、酢酸勾配液
による溶離によってダウエックス−１（酢酸塩型）上で
イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。UV吸
光度およびTLC（シリカ；CHCl₃／CH₃OH／H₂O／NH₄OH、5
0:39:8:3;5％H₂SO₄／CH₃CH₂OHおよび加熱）によってカ
ラム画分を集めた。ムラミン酸および全ヘキソースアミ
ンの比色測定分析および高速原子衝撃質量分析（fabs）
によって二糖類の明らかな同定を得た。得られた収量
は、乾燥細菌細胞240gから純粋なジサッカライド（化合
物VI）2.50gの範囲であった。

GlcNAcMurNAc−Ｌ−Ala−Ｄ−isoGln−OBn（VII）−
使用する前に、4A分子ふるいによってDMFを乾燥させ、
次いで、ニンヒドリンから蒸留させた。水酸化ナトリウ
ムペレットからトリエチルアミン（TEA）を蒸留させ
た。IN HCl 15mlに市販の物質（アルドリッチ）3.0gを
溶解し、ワットマン＃２紙を介して濾過し、次いで、ア
セトン120mlを添加して沈殿させることによってウッド
ワード試薬Ｋを精製した。濾過およびアセトン100mlに
よる洗浄の後、高真空下で数時間、試薬を乾燥させた。

二糖類化合物VI（2.00g、4.028ミリモル）をDMF 100m
lに溶解し、TEA（0.62ml、447.5mg、4.431ミリモル）で
処理し、氷水浴中で４℃近くまで冷却し、次いで、ウッ
ドワード試薬Ｋ（95％、1.397g、5.24ミリモル）で処理
した。得られたスラリーを氷水浴中で１時間、次いで、
室温で10分間撹拌した。次に、DMF 50ml中にジペプチド
ベンジルエステル（Ｖ）（1.523g、4.43ミリモル）およ
びTEA（447.42mg、0.61ml）を含有する溶液を、均圧添
加漏斗を介して30分間にわたって添加した。添加終了
後、反応混合物を室温で合計120時間撹拌し、その間
に、反応の進行をTLC（シリカ；CHCl₃／CH₃OH／H₂O／NH
₄OH、50:25:4:2;5％H₂SO₄／CH₃CH₂OH、加熱）によって
モニターした。次に、溶媒を回転エバポレーターで除去
し、油状残留物を高真空下でさらに乾燥させた。次い
で、これをH₂O 50mlに取り、ダウエックス IX8（200〜4
00メッシュ、酢酸塩型）の2.5×17cmカラムに入れ、H₂O
500mlで溶離した。全溶出液を約50mlに濃縮し、次い
で、ダウエックス 50X8（100メッシュ、Ｈ＋型）の2.5
×17cmカラムに入れ、H₂O 500mlで溶離した。溶出液を
約50mlに濃縮し、次いで、凍結乾燥して、純白色固体の
化合物VII 2.25g（71％）を得た。

GlcNAcMurNAc−Ｌ−Ala−Ｄ−isoGln（VIII）− H₂O 1
50mlおよび氷酢酸3.0mlに二糖類ジペプチドベンジルエ
ステル（VII）（2.20g、2.80ミリモル）を溶解した。こ
れに５％ Pd/C 300mgを添加し、得られたスラリーを室
温および40psigで40時間水素添加した。次いで、セライ
トパッドを介して濾過することによって触媒を除去し、
H₂O（３×10ml）で洗浄し、濾液および洗液を合わせ、
約50mlに濃縮し、次いで、流速8ml/時でデトキシ−ゲル
（Detoxi−Gel^R）（ピアス（Pierce））の1mlカラムを
通過させた。該カラムをH₂O 10mlで洗浄し、溶出液およ
び洗液を合わせ、次いで、凍結乾燥させて、白色粉末の
化合物VIII 1.86g（95.5％）を得た。

GlcNAcMurNAc−Ｌ−Ala−Ｄ−isoGln−Ｌ−Ala−DPG（I
X）− この調製において使用したDMFおよびTEAはVIIの
調製における記載のように精製した。二糖類ジペプチド
VIII（1.531g、2.20ミリモル）をDMF 70mlに溶解し、次
いで、CH₂Cl₂ 50mlで希釈した。次いで、これに１−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）（アルドリッチ、
387.4mg、2.53ミリモル）およびEDCI（485mg、2.53ミリ
モル）を添加し、得られた溶液を室温で１時間撹拌し
た。次に、CH₂Cl₂ 20mlにエステル（II）1.659g（2.2ミ
リモル）およびTEA 225mg（0.31ml、2.20ミリモル）を
含有する溶液を、５分間にわたって滴下した。得られた
溶液を室温で24時間撹拌し、次いで、さらにEDCI 100mg
で処理し、さらに48時間撹拌した。溶媒を回転エバポレ
ーターで除去し、油状残留物を高真空下で数時間さらに
乾燥させ、その間に黄色ワックス状物質に固化した。次
いで、これをEtOAc 150ml中に懸濁させ、200×ｇで遠心
分離することによって３回洗浄した。高真空下で乾燥さ
せた後、該ペレットを蒸留H₂O 1000mlに懸濁させ、次い
で、アミコン YM−10膜を介してアミコン限外濾過セル
中、蒸留H₂Oに対して広範囲に透析した。次いで、内部
透析物を蒸留H₂Oで2000mlまで希釈し、３層の濾紙（ラ
ブコンコ・コーポレーション（Labconco Corp.）＃Ａ−
754448）を介して濾過し、回転エバポレーターで約600m
lに濃縮し、凍結乾燥させて、白色静電粉末の化合物IX
1.60gを得た。

最終精製のために、上記生成物52.8mgをCHCl₃／CH₃OH
／H₂O、2:3:1 1.0mgに溶解し、次いで、同一溶媒中で膨
潤され充填されたセファデックス（Sephadex）LH−20−
100樹脂の0.7×29cmカラムに入れた。該カラムを流速0.
33ml/分で溶離し、溶出液の画分を集め、TLC（シリカ；
CHCl₃／CH₃OH／H₂O／NH₄OH、50:25:4:2;5％H₂SO₄／CH₃C
H₂OH、加熱）によって測定した。適切な画分を合わせ
て、バイオラッド・セレックス（BioRad Cellex）Ｄ樹
脂（酢酸塩）の１×8cmカラムに直接入れた。次いで、
このカラムを溶媒30mlで洗浄し、合わせた溶出液および
洗液を回転エバポレーターでほぼ乾固するまで濃縮し、
H₂O 75mlで処理し、凍結乾燥させて白色粉末状のGlcNAc
MurNAc−Ｌ−Ala−Ｄ−isoGln−Ｌ−Ala−DPG（GMTP−D
PG）35mgを得た。

実施例10 リポソームの調製 GMTP−DPG化合物（IX）を以下の製造方法を用いてリ
ポソーム中に被包させた。実施例９で製造したGMTP−DP
G 1mgを10パルミトイル−２−オレオイルホスファチジ
ルコリン（PC）175mgおよび1,2−ジオレオイルホスファ
チジルグリセロール（PG）75mg（両方とも、アラバマ、
ペラムのアバンディ・ポーラー・リピッズから市販品と
して入手可能）と混合した。資質100mg/mlの濃度でtert
−ブタノールにPCおよびPGを予め溶解し、したがって、
tert−ブタノール中のPC:PGの重量比7:3となった。次い
で、GMTP−DPG 1mg、PC 175mg、PG 75mgにtert−ブタノ
ールを添加して、最終容量を5.0mlにした。GMTP−DPGお
よび脂質混合物を無菌ミリポア0.22μフィルターに通し
て、存在する全ての不純物を除去した。濾液を清潔な無
菌の丸底フラスコ中に集め、充填後、これにアルミホイ
ルでキャップした。GMTP−DPG 1mgを含有する濾過混合
物5mlを10mlバイアル中に分配した。該バイアルに充填
した後、無菌ゴム血清栓で被覆した。各栓は、凍結乾燥
および栓をする間、バイアルに空気を出し入れすること
ができるように一方向にスリットがある。該バイアルを
無菌アルミホイルで覆い、このバイアルを凍結乾燥器の
トレイ乾燥室に移した。次に、tert−ブタノール脂質混
合物が凍結するまで（約30〜60分）−20℃に冷却した。
次いで、解凍し、トレイ加熱器を10℃にセットした。次
に、該バイアルを18時間凍結乾燥させた。バイアルを含
む凍結乾燥器を濾過した無菌アルゴンで浄化し、３回排
気した。次いで、バイアルを含む凍結乾燥器をアルゴン
で再度浄化し、大気圧でアルゴン下、バイアルに栓をし
た。

実施例11 粒状抗原と混合した抗体産生細胞における食塩水中の
薬物のアジュバント活性 誘発抗体応答における本発明化合物の効果を、最適投
与量以下の免疫原を用いて、老いたBalb/cマウスおよび
正常マウスを用いて免疫無防備状態モデルで評価した。

免疫欠損動物を代表する老いたBalb/cマウス（18カ月
齢）を、単独またはMDP 0.1mgもしくは化合物IX 0.1mg
と混合した１×10⁹ヒツジ赤血球（SRBC）の最適接種物
で腹腔内的に免疫化した。４日目に脾臓を取り出し、プ
ラーク形成ユニットについて検査した。

結果（第１表）、対照に関しては、脾臓当たり66×10
³プラーク形成ユニット（PFU）であり、MDP 0.1mgと混
合したSRBCを投与されたマウスに関しては、脾臓当たり
198×10³PFUであり、本発明のGMTP−DPGの化合物0.1mg
と混合したSRBCを投与されたマウスに関しては、442×1
0³PFUであった。同様に、若いBalb/cマウスを、食塩水
に入れた最適投与量以下のSRBC（１×10⁷細胞）または
これを0.01mgまたは0.1mgのMDPまたはGMTP−DPGと混合
して、腹腔内的に免疫化した。

結果（第１表）、重量的に、GMTP−DPGはMDPよりも３
〜10倍効果的であった。

実施例12 Meth A肉腫における食塩水中GMTP−DPGの抗腫瘍活性 ７週齢のBalb/c雌性マウスに、１×10⁶Meth A腫瘍細
胞を皮下に注射した。８日後、この動物に食塩水（対
照）または化合物IX1、10または100μｇを静脈内投与し
た。各グループは、４匹の動物からなっていた。２日毎
に10日間、腫瘍測定を行い、治癒するか腫瘍によって死
亡するまで、60日間、該マウスを追跡した。

結果、化合物IX 1〜10μｇを一回投与する処置の後、
６日目に腫瘍の大きさの10〜15％減少を示した。さらに
多い100μｇの投与は、４匹の動物のうち１匹につい
て、処置後、６日目で腫瘍の増殖の50％減少を示し、腫
瘍の完全な後退を示した。

実施例13 GMTP−DPGおよびリポソーム被包GMTP−DPGによる殺腫瘍
性状態に対するヒト末梢血単核細胞の活性 単核細胞殺腫瘍活性は、フォグラー・アンド・フィド
ラー（Fogler and Fidler）の方法（フォグラー・ダブ
リュ・イー（Fogler W.E.）およびフィドラー・アイ・
ジェイ（Fidler I.J.）、ジャーナル・オブ・イムノロ
ジー（J.Immunol.）、136:2311〜2317、1986）によって
測定した。すなわち、46％パーコル（Percoll）上で重
力遠心分離によってヒト末梢血単核細胞を単離した。次
いで、１×10⁶単核細胞/mlで、化合物IX 1.5μg/mlを含
むかまたは含まない５％ヒト血清を含有するRPMI 1640
培地中で18時間懸濁させて培養した。インキュベーショ
ン後、単核細胞を洗浄し、１×10⁵または５×10⁴単核細
胞を96ウエルマイクロプレートのウエルに１時間付着さ
せ、該プレートを洗浄にて、非付着細胞を除去し、これ
に、１×10⁴I¹²⁵標識Ａ−375腫瘍細胞を添加した。単核
細胞を腫瘍細胞と一緒に72時間培養した。72時間の共培
養の最後に、プレートを洗浄して、非付着−非生存可能
腫瘍細胞を除去し、残存する付着生存可能I¹²⁵標識腫瘍
細胞を、ドデシル硫酸ナトリウムで該細胞を溶解し、ガ
ンマカウンターで放射能活性を計数することによって測
定した。

重量比7:3の１−パルトミトイル−２−オレオイルホ
スファチジルコリンと1,2−ジオレオイルホスファチジ
ルグリセロールとからなるリポソームを用いることによ
って、化合物IXを含有するリポソームによるヒト末梢血
単核細胞の活性を測定した。

実施例12に記載の試験を用いて、化合物IIのin vitro
効果をMDPと比較した。効果器：標的細胞比は10:1であ
った。培養物は、最後濃度1.0μg/mlのMDP、化合物IXま
たはリポソーム中化合物IXを含有した。これらの試験の
結果（第２表）、食塩水懸濁液として使用した場合また
はリポソーム中に被包させた場合、化合物IXは、MDPよ
りも効果的であることが分かった。

実施例14 in vivoにおけるリポ多糖類によるGMTP−DPGの効果の増
大 ７〜８週齢のBalb/cマウスにMeth A肉腫（１×10⁶細
胞）を皮下注射し、８日目に単独または１〜10μｇのMD
Pもしくは化合物IVと混合したエス・チフィムリウム
（S.typhimurium）ReG30/21由来のリポ多糖類10μｇで
静脈内的に処置した。治療の６日後、腫瘍の増殖を比較
した。

該動物を追跡し、注射の後、60日目に治癒率を測定し
た。

第３表に示す結果は、親化合物よりも効果的であるリ
ポ多糖類による化合物の付加的効果を示した。

実施例15 マウスおよびモルモットにおける急性毒性 17〜22gの体重の２匹のマウスと400g未満の体重の２
匹のモルモットに、5ml当たり化合物IX 1mg、１−パル
ミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン1,740m
gおよびジオレオイルホスファチジルグリセロール760mg
を含有する最終臨床製剤0.5mlおよび5mlを１回腹腔内注
射した。該動物の体重および窮迫の臨床学的徴候を毎日
観察した。結果、モルモットにおいて、まず体重減少が
みられ、その後、７日目に体重増加がみられた。マウス
は、体重を維持しており、７日目に増加を示した。

実施例16 マウスにおける亜急性毒性 10匹のマウスのグループに、体重1kg当たり1,320μｇ
の投与量で、週に２回、４週間、静脈内注射した。これ
を計算すると、１m²当たり4mgの予測最大ヒト投与量の1
0倍と同一である。m²からkgに変換する場合、通常の体
表面積1.73m²当たり70kgの等価に代えて、体表面積1.73
m²当たり60kgの等価を使用し、結果、毒性研究に関して
多少高い投与量となった。結果、試験の４週間にわたっ
て、体重減少が示されなかった。

実施例17 ウサギにおける亜急性毒性 14日間、毎日、体重1kg当たりリポソーム中化合物IX
132μｇの投与量で３匹のウサギを静脈内的に処置し
た。15日目に、臨床実験に関して心臓穿刺によって血液
を得、毒性の組織学的証拠に関して完全に剖検を行っ
た。３匹のウサギの耳静脈および心臓穿刺によって血液
を得た。

この研究の結果、毒性の病理学的証拠は見られなかっ
た。対照と比較して、処置したウサギ由来の血液化学の
観察によって、クレアチニンホスホキナーゼの有意な増
大を有する１匹のウサギが見いだされた。この異常値
は、心臓穿刺後の対照動物におけるクレアチニンホスホ
キナーゼの増大によって証明されるように、心臓穿刺の
外傷に関連すると思われている。

本発明は、種々の特定の、および好ましい具体例およ
び技術に関して記載されている。しかし、本発明の意図
および範囲内である限り、多くの変形および変更が行わ
れることは理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スウェンソン，カール・イー アメリカ合衆国43230オハイオ州ガハン、 ビューグル・コート670番 (56)参考文献 特開 昭60−252497（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−126797（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−145696（ＪＰ，Ａ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式［Ｉ］： ［式中、R¹は（C₁〜C₅）アルキルであり、R²は（C₁〜
   C₅）アルキルであり、R³およびR⁴は、各々、約０〜４個
   の二重結合を含んでいる（C₆〜C₃₀）アルキル基であ
   り、Ｘは、ペプチジル残基である］ で示される化合物およびその医薬的に許容される塩。
2. 【請求項２】R¹がCH₃であり、R²がCH₃であり、ＸがＬ−
   アラニン残基であり、R³がR₁₅アルキル基であり、R⁴がC
   ₁₅アルキル基である請求項１記載の化合物。
3. 【請求項３】有効な免疫調節量の請求項１記載の化合物
   と医薬的に許容される液体ビヒクルとからなり、所望に
   より、リポ多糖類を含有していてもよい哺乳動物の免疫
   応答を刺激するための組成物。
4. 【請求項４】請求項１記載の化合物を含有してなるリポ
   ソーム。
5. 【請求項５】重量比5:1〜1:1の１−パルミトイル−２−
   オレオイル−ホスファチジルコリンおよびジオレオイル
   ホスファチジルグリセロールからなる２層膜を有する請
   求項４記載のリポソームからなる哺乳動物の免疫応答を
   刺激するための組成物。
6. 【請求項６】上記請求項のいずれかの組成物の有効量を
   医薬的に許容されるビヒクルと合することからなる哺乳
   動物における免疫応答刺激用医薬組成物の製造方法。