DE69834808T2

DE69834808T2 - Multiple,kohlenhydrathaltige glycopeptid-antigene, daraus entwickelte impfstoffe sowie deren verwendung

Info

Publication number: DE69834808T2
Application number: DE69834808T
Authority: DE
Inventors: Sylvie Bay; Danièle CANTACUZENE; Claude Leclerc; Richard Lo-Man
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1997-03-27
Filing date: 1998-03-27
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2018-03-28
Also published as: WO1998043677A1; US20070098730A1; US7696326B2; ATE328611T1; AU6832398A; ES2265162T3; DE69834808D1; EP0969873A1; CA2285018C; CA2285018A1; PT969873E; DK0969873T3; EP0969873B1

Description

TECHNISCHER HINTERGRUND
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf das Gebiet der Immuntherapie und genauer auf ein Glykokonjugat, eine dieses umfassende Zusammensetzung und Vakzin und deren Verwendung zum Verstärken der Immunantwort und insbesondere bei der Krebstherapie und der Therapie einer Infektion gerichtet, die durch ein Pathogen verursacht wurde, gegen das eine humorale oder zelluläre Immunantwort notwendig ist. Die Erfindung bezieht sich auch auf einen Diagnosekit und die Diagnose von Krebs.
2. Stand der Technik/relevante Literatur
Als Ergebnis einer anomalen Glykosylierung werden mit Krebs verbundene Kohlenhydrat-Antigene auf der Oberfläche von Tumorzellen freigelegt, wogegen sie in normalen Zellen verborgen sind (Ref. 1). Kürzliche Fortschritte bei der Immunologie und der Identifizierung tumorspezifischer Antigene haben das Interesse an der Entwicklung von Krebsvakzinen erneuert und diese freigelegten glykosidischen B-Zellenepitope sind von Longenecker (Ref. 2) als lohnende Ziele für eine „aktive spezifische Immuntherapie" (ASI) genannte Immuntherapie angesehen worden. Dieser Weg umfaßt die Immunisierung mit einem definierten Antigen zum Hervorbringen einer auf dieses Antigen spezifischen Immunantwort und könnte eine Alternative zu herkömmlichen Krebstherapien darstellen.
Unter der großen Zahl bekannter Tumormarker sind die Tn-(a-GalNAc-Ser/Thr), die T*-(b-Gal-(1→3)-a-GalNAc-Ser/Thr) und die Sialosyl-Tn-Antigene (a-NeuAc-(2→6)-a-GalNAc-Ser/Thr) ausgedehnt untersucht worden, da sie durch die Mehrheit der Adenokarzinome auf Glykoproteinen des Mucintyps exprimiert werden (Ref. 3). Tatsächlich haben mehrere Untersuchungen einen gewissen Schutz gegen Tumoren nach der Immunisierung mit diesen glykosidischen Antigenen bei experimentellen oder klinischen Untersuchungen gezeigt. Diese tumorassoziierten Kohlenhydrate sind wichtige Marker für die Krebsdiagnose und -prognose (Ref. 34). Unter Verwenden desialylierter roter Blutzellen, die reich an T- und Tn-Determinanten sind, beobachtete Springer einen wirkungsvollen Langzeitschutz gegen das Wiederauftreten des humanen Brustkarzinoms (Ref. 3c, Ref. 4). Eine andere Gruppe untersuchte das Potential der ASI mit desialyliertem Mucin aus dem Schafunterkiefer (d-OSM), das eine hohe Dichte des Tn-Epitops aufweist; ihre Untersuchungen zeigten, daß dieses Antigen bei Mäusen mit Brustkrebs einen guten Schutz und Langzeitüberleben liefert (Ref. 5). Zum Teil ergab d-OSM auch einen wirksamen Schutz gegen humanen Darmkrebs (Ref. 6). Ratcliffe et al. waren die ersten, die ein synthetisches, tumorassoziiertes Antigen, ein T-Antigen-Protein-Konjugat, zum Stimulieren einer wirksamen Immunantwort bei Kaninchen verwendeten (Ref. 7). Danach untersuchte Longenecker ausgedehnt ähnliche synthetische Kohlenhydrat-Hapten-Konjugate und fand, daß sie ein erhöhtes Überleben bei Mäusen, auf die Brustkrebszellen transplantiert worden waren (Ref. 8), und bei Patienten mit Eierstockkrebs (Ref. 9) hervorriefen. Ähnliche Untersuchungen derselben Gruppe haben weiter nach der Verabreichung von Sialosyl-Tn- beziehungsweise GM2-Gangliosid-Protein-Konjugaten einen erhöhten Schutz von an Brustkrebs (Ref. 10) oder Melanom (Ref. 11) leidenden Patienten gezeigt. Zum anderen erzeugten Toyokuni et al. bei Mäusen nach der Immunisierung mit einem Tn-Antigen, das entweder an OSA (Schafserumalbumin) oder an ein synthetisches Lipopeptid (Ref. 12) gekoppelt war, eine Antitumor-Antikörperantwort. Dieses letzte Ergebnis war deshalb interessant, weil es das erste Beispiel eines kleinen synthetischen Kohlenhydrat-Antigens war, das eine Immunantwort gegen ein tumorassoziiertes Kohlenhydrat-Antigen ohne die Verwendung eines makromolekularen Trägers oder Arzneimittelhilfsstoffen erzeugt.
Diese Untersuchungen legten nahe, daß Kohlenhydrat-Antigene geeignete Kandidaten für die Entwicklung eines Antitumor-Vakzins sind. Kohlenhydrat-Antigene besitzen jedoch kein T-Zellenepitop und lösen deshalb nur eine schwache T-Zellen-unabhängige Antikörperantwort aus. Mehrere Wege zum Erhöhen der Immunogenität derartiger Kohlenhydrate sind untersucht worden. Die Verwendung biologischen Materials, das Cluster aus Antigenen auf ein Proteingerüst (wie desialylierte rote Blutzellen oder OSM) exprimiert, ist eine Möglichkeit. Der weitverbreitetste Weg ist aber das Konjugieren des Kohlenhydrats mit einem Trägerprotein wie etwa Rinderserumalbumin (BSA) oder Schlüssellochschnecken-Hämocyanin (KLH).
Obschon diese Immunogene gewisse Aussichten gezeigt haben, weisen Protein träger bedeutende Nachteile auf. Das verpflanzte Epitop stellt nur einen kleinen Teil des gesamten Konjugats dar und ist auf der Trägeroberfläche wahllos verteilt. Immunantworten auf das Trägermolekül können deshalb zu einem niedrigen Gehalt der gewünschten Antikörper verglichen mit der Gesamtmenge an erzeugten Antikörpern führen. Weiterhin zeigen diese Konjugate sowohl in der Zusammensetzung als auch Struktur eine Unklarheit und sie lösen nicht immer eine reproduzierbare Immunantwort aus. Kürzliche Fortschritte bei der Totalsynthese durch Tumorzellen exprimierter Oligosaccharide (Ref. 35, Ref. 36) eröffnen neue Möglichkeiten für ein derartiges Ergebnis. Haptenmoleküle wie etwa Kohlenhydrate erfordern jedoch zum Stimulieren von Immunantworten ihre Assoziation in komplexeren Strukturen. Die Verwendung herkömmlicher Proteinkonjugate wirft das Problem der Hapten-spezifischen Unterdrückung (Ref. 37, Ref. 38) auf und ihre schlecht definierte chemische Zusammensetzung und Struktur kann ihre Wirksamkeit einschränken.
Bis jetzt sind, was chemische definierte Strukturen betrifft, dendrimere Polylysin-Gerüste, die später in der vorliegenden Beschreibung genauer beschrieben werden, weitverbreitet zum Präsentieren von Peptiden verwendet worden (Ref. 14). Nach unserer Kenntnis gibt es jedoch nur einen vorläufigen Versuch ihrer Verwendung zum Präsentieren von Kohlenhydraten dem Immunsystem (Ref. 16). Dieses letzte Zitat lehrt die Synthese dreier sialylierter, multipler Antigenpeptide mit Tetanustoxin-T-Zellenepitopen. Es wurde jedoch nur eine Antwort gegen das T-Zellenepitop, nicht jedoch gegen das B-Zellenepitop erhalten. Eine ähnliche Strategie wurde auch kürzlich veröffentlicht (Ref. 17), als die Autoren Gemische aus Streptococcus und Saccharomyces erhaltener natürlicher Polysaccharide mit einem multiplen antigenen Peptidsystem kuppelten.
Es besteht damit noch immer ein Bedürfnis nach einem neuen Konjugat, das die vorstehend angeführten Nachteile der Konstrukte des Standes der Technik verhindert, das eine chemisch definierte Struktur aufweist und sowohl die Antikörperantwort als auch die T-Antwort stimuliert, wenn des dem menschlichen oder tierischen Körper verabreicht wird, während unerwünschte Immunantworten vermieden werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG/BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Dementsprechend ist die vorliegende Erfindung allgemein auf ein Kohlenhydrat-Peptid-Konjugat gerichtet, umfassend:
einen Träger, der ein dendrimeres Polylysin umfaßt, das es ermöglicht, daß mehrere Epitope kovalent daran gebunden werden,
wenigstens ein Peptid, das ein T-Epitop oder mehrere identische oder verschiedene T-Epitope umfaßt,
wenigstens einen Kohlenhydratrest, der ein B-Epitop, mit der Maßgabe, daß es kein Sialosid ist, oder mehrere identische oder verschiedene Epitope enthält.
Das das (die) T-Epitop(e) umfassende Peptid kann an ein Lysin des Trägers als eine B-Epitop(e) enthaltende Kohlenhydrat-Struktureinheit gebunden sein.
Dieser Weg zum Präsentieren von Epitopen wird hierin als multiples Antigenglykopeptid (MAG) bezeichnet. Das Konjugat der vorliegenden Erfindung ist zum Verstärken der Antikörperantwort bei einem menschlichen oder tierischen Körper, dem es insbesondere als Vakzin verabreicht wurde, besonders nützlich.
Da weiterhin von einem multiplen, O-verknüpften Glykopeptid (MAG) gemäß der vorliegenden Erfindung, das zum Beispiel das mit einem CD4⁺-T-Zellenepitop assoziierte Kohlenhydrat-Tn-Antigen trägt, gezeigt wurde, das es Anti-Tn-IgG-Antikörper induzieren kann, die humane Tumorzellinien erkennen können, betrifft die vorliegende Erfindung entsprechend auch eine Zusammensetzung, die das Überleben eines Tumor-tragenden Menschen oder Tiers verlängern kann. Eine mit diesem totalsynthetischen Immunogen ausgeführtes therapeutisches Immunisierungsprotokoll verlängerte das Überleben Tumor-tragender Mäuse.
Genauer ist die vorliegende Erfindung auf ein Kohlenhydrat-Peptid-Konjugat gerichtet, umfassend:

– wenigstens 3 aneinander kovalent gebundener Lysinreste,
– wenigstens ein Peptid, das ein T-Epitop umfaßt, das an einen Lysinrest gebunden ist, und
– wenigstens eine gegebenenfalls substituierte Kohlenhydrat-Struktureinheit, die ein Epitop B enthält, das an das Ende des Peptids, das dem Lysin gegenüberliegt, kovalent gebunden ist, mit der Maßgabe, daß die Kohlenhydrat-Struktureinheit kein Sialosidrest ist.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Konjugat:

– wenigstens ein ein T-Epitop oder mehrere identische oder verschiedene T-Epitope umfassendes Peptid und
– wenigstens eine ein B-Epitop oder mehrere identische oder verschiedene Epitope enthaltende Kohlenhydrat-Struktureinheit oder ein Derivat davon, vorausgesetzt sie (es) kein Sialosid ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Konjugat der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vakzin, das das Konjugat der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das Verstärken der Immunantwort eines menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere von B- und/oder T-Zellantworten, wobei das Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung an den menschlichen oder tierischen Körper verabreicht werden soll.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung zum Auslösen von B-Zellantworten gegen Saccharidepitope in einem menschlichen oder tierischen Körper, wobei das erfindungsgemäße Konjugat an den menschlichen oder tierischen Körper verabreicht werden soll.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung zum Impfen eines menschlichen oder tierischen Körpers, wobei das Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung an den menschlichen oder tierischen Körper verabreicht werden soll.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Diagnosekit, der Antigen-spezifische Antikörper umfaßt, die durch Immunisierung eines menschlichen oder tierischen Körpers mit einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung hervorgebracht wurden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Diagnose von Krebs, wobei eine biologische Probe mit wenigstens einem dieser Antikörper in Kontakt gebracht werden soll und wobei man die Bildung von Komplexen zwischen diesem Antikörper und Molekülen bestimmt, die die Probe umfaßt.
Noch ein weiterer Gegenstand ist eine wie hierin vorstehend beschriebene Zusammensetzung, die eine Immunantwort gegen eine durch ein Pathogen wie etwa Hepatitisvirus, HIV oder CMV verursachte Virusinfektion hervorbringen kann.
Die vorliegende Erfindung wird nun in der folgenden Beschreibung unter Bezug auf die nachstehenden Zeichnungen genau erläutert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung von MAG-Verbindungen (B4-T4-M, B8-T8-M, B2-T2-M und B4-T4-M (mit unterschiedlicher Organisation der T- und B-Epitope) (a bis d), Tri-Tn (e) und Hexa-Tn (f) gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 stellt das Tn-Antigen und seine Derivate dar.
3 zeigt die Erkennung von B4-T4-M durch zwei monoklonale Anti-Tn-Antikörper.
4a zeigt die T-Antigenität von B4-T4-M in vitro.
4b veranschaulicht die Anti-T-Antwort von B4-T4-M in vivo.
5a, 5b und 5c zeigen die Induktion des Anti-Tn-Antikörpers durch die Tn-MAG-Verbindung bei BALB/c-, SJL/J- beziehungsweise DBA/1-Mäusen.
6 veranschaulicht die Induktion von Antikörperantworten durch die das Tn-Antigen und Poliovirusepitop T, CD4⁺, enthaltende Tn-MAG-Verbindung in BALB/c-Mäusen.
7 veranschaulicht die Ergebnisse des durch die Tn-MAG-Verbindung hervorgerufenen Schutzes gegen das Tn-Antigen exprimierende Maus- Adenokarzinom TA3/Ha bei belastungsinjizierten BALB/c-Mäusen.
8A und 8B veranschaulichen die Ergebnisse der Immunisierung von BALB/C-Mäusen mit dem TT1-Peptid oder B-T-TT₁-Glykopeptid, die mit CFA (8A) beziehungsweise Alaun (8B) aktiviert worden waren.
GENAUE BESCHREIBUNG
Definitionen und Abkürzungen:
Antigene:
Die Ausdrücke Kohlenhydrat-B-Antigen, B-Epitop, B-Zellenantigen, B-Zellenepitop werden hierin verwendet, um allgemein glykosidische Antigene zu bezeichnen, die eine B-Zellenantwort hervorbringen können, wobei die aus Sialosiden bestehenden Antigene ausgenommen sind.
Unter T-Antigen oder T-Epitop, T-Zellenantigen, T-Zellenepitop wird ein Antigen im allgemeinen peptidischer Natur verstanden, das eine T-Zellenantwort hervorbringen kann.
Die synthetischen Verbindungen B-T, M, B4-M, T4-M und B4-T4-M wurden ebenfalls als Antigene verwendet (siehe nachstehende Tabelle).
Die hierin verwendete Abkürzung M ist ein Beispiel eines MAP (multiples Antigenpeptid) und bezeichnet die folgende Struktur:
Gegebenenfalls wurde hierin der universelle Ein-Buchstaben-Kode für Aminosäuren (K für Lysin usw.) verwendet.
Andere Abkürzungen werden in der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet:
BSA: Rinderserumalbumin; OSA: Schafserumalbumin; Ova: Ovalbumin; OSM: Schafunterkiefermucin; d-OSM: desialyliertes Schafunterkiefermucin; ES MS: Elektrospray-Massenspektrometrie; Fmoc: Fluoren-9-yl-methoxycarbonyl; PBS: phosphatgepufferte Kochsalzlösung.
Der Ausdruck „Antikörperantwort" oder „B- oder B-Zellenantwort" wird hierin unterschiedslos verwendet. Dasselbe trifft auf „Zellantwort" und „T- oder T-Zellenantwort" zu.
Die vorliegende Erfindung ist in ihrem Hauptaspekt auf ein Kohlenhydrat-Peptid-Konjugat gerichtet, umfassend:
einen geeigneten Träger auf der Grundlage eines dendrimeren Polylysins, das es ermöglicht, daß mehrere Epitope kovalent daran gebunden werden,
wenigstens ein Peptid, das ein T-Epitop oder mehrere identische oder verschiedene T-Epitope umfaßt,
wenigstens eine Kohlenhydrat-Struktureinheit, die ein B-Epitop, vorausgesetzt, es ist kein Sialosid, oder mehrere identische oder verschiedene B-Epitope enthält.
Mehrere identische T- oder B-Epitope bedeutet zwischen zwei und acht desselben Epitops.
Mehrere verschiedene T-Epitope bedeutet zwischen zwei und acht T-Epitope verschiedenen Ursprungs.
Mehrere verschiedene B-Epitope bedeutet zwischen zwei und acht B-Epitope verschiedenen Ursprungs.
Der Polylysinkern des vorliegenden Konjugats wird Dendrimer genannt, da er als Stern (1) mit mehreren Verzweigungen, die im wesentlichen alle identisch sind, dargestellt werden kann.
Wie früher festgestellt, ist ein multiples Antigenpeptidsystem 1988 durch Tam (Ref. 13) beschrieben worden, das ebenfalls auf einer bestimmten dendrimeren Struktur beruht, bei der ein peptidisches Antigen kovalent mit den Verzweigungen des letzten konjugiert ist.
Beispiele geeigneter Träger umfassen die mit einer Struktur auf der Grundlage eines Polylysinkerns, der einen mehrfach verzweigten Stern wie etwa zum Beispiel einen Stern mit 8 oder 4 Ästen bildet.
So ist die vorliegende Erfindung in einer ihrer bevorzugten Ausführungsformen auf ein Konjugat gerichtet, das eine dendrimere Struktur auf der Grundlage eines einen Stern mit 4 Ästen bildenden Polylysinkerns mit einem Epitop T umfaßt, das kovalent an jeden Ast gebunden und mit einer ein Epitop B enthaltenden Kohlenhydrat-Struktureinheit (vorausgesetzt, sie ist kein Sialosidrest) assoziiert ist.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das multiple Antigen-Glykopeptid (MAG), das das Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung bildet, wenigstens 3 Lysin- und bis zu 15 kovalent aneinander gebundene Lysinreste. Am bevorzugtesten umfaßt das vorliegende Konjugat 3 Lysine.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist an das NH₂-Ende jedes Lysinrests wenigstens ein Peptid gebunden, das ein an ein Lysin gebundenes Epitop T und wenigstens einen gegebenenfalls substituierten Kohlenhydratrest umfaßt, der kein Sialosid, der an das Ende des Peptids, das dem Lysin gegenüberliegt, kovalent gebunden ist und ein B-Epitop bildet.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist an das NH₂-Ende jedes Lysinrests wenigstens ein gegebenenfalls substituierten Kohlenhydratrest, der kein Sialosid ist und ein an ein Lysin gebundenes B-Epitop bildet, und wenigstens ein Peptid gebunden, das ein T-Epitop umfaßt, das an das Ende des Kohlenhydrats, das dem Lysin gegenüberliegt, kovalent gebunden ist.
Die MAG-Struktur, auf die hier Bezug genommen wird, wird unter Bezug auf 1 besser verstanden.
In 1 werden schematisch Beispiele eines Sterns mit 4 bis 8 Ästen dargestellt, der 3 bis 7 Lysine umfaßt, die 4 bis 8 an gewünschte Epitope (Epitope B, die gegebenenfalls mit einem Peptid und Epitopen T substituiert sind) gebundene Aminogruppen trägt. Diese Struktur liefert eine hohe Dichte der Antigene an der Oberfläche des Lysinkerns.
Weiterhin bietet diese Struktur mehrere Vorteile. Erstens ist der Kohlenhydratgehalt bei dem MAG-System viel höher (üblicherweise über 90%) als bei den herkömmlichen Proteinkonjugaten. Diese Struktur von Glykopeptid-Antigenen hoher Dichte löst höhere Antikörperantworten aus, was die frühere Beobachtung beim Vergleichen eines MAP-Systems mit denselben, kovalent an ein Trägerprotein gebundenen Antigenen (Ref. 13b, Ref. 14) bestätigt.
Ein weiterer Vorteil des MAG ist, daß die Kernmatrix, die nur einen untergeordneten Teil des gesamten Konstrukts darstellt, eine niedrige Immunogenität aufweist und so unerwünschte Immunantworten (Ref. 13a) vermeidet.
Ein weiterer Vorteil des vorliegenden Konstrukts ist, daß das sich ergebende synthetische Immunogen eine gut definierte chemische Struktur aufweist.
Das Vorhandensein von sowohl Kohlenhydrat-B-Epitopen als auch T-Epitopen auf dem Glykokonjugat der vorliegenden Erfindung macht das letzte zu einem wirkungsvollen Immunogen, wie später im experimentellen Abschnitt gezeigt wird.
Die das Epitop B des Konjugats gemäß der vorliegenden Erfindung enthaltende Kohlenhydrat-Struktureinheit kann zum Beispiel aus Tumor-(Krebs-)Glykosid-Antigenen aus

– der Glykolipidklasse einschließlich eines sauren Glykolipids wie etwa zum Beispiel die Ganglioside GD2, GD3 und GM3 (Melanom) und neutrale Glykolipide wie etwa zum Beispiel die Lewis^y-(Le^y)(Brust, Prostata, Eierstock) und die Globo-H-Antigene (Brust, Prostata, Eierstock), wobei die dieser Klasse angehörenden sialylierten Derivate ausgeschlossen sind;
– der Klasse der O-Glykosylpeptide (oder Aminosäure) wie etwa zum Beispiel das Tn-Antigen (αGalNAc-Ser oder αGalNAc-Thr), T*-Antigen (β-Gal-(1-3)-α-GalNac-Ser oder βGal(1-3)αGal-NAc-Thr), zwei Tumormarker, die häufig in Karzinomen, aber üblicherweise nicht in normalen Geweben vorhanden sind [Springer G. F., Science 224, 1198-1206 (1984)] (Eierstock, Brust, Lunge) oder Di-Tn (αGalNAc-Ser/Thr)₂, Tri-Tn(αGalNac-Ser/Thr)₃ oder Hexa-Tn(αGalNAc-Ser/Thr)₆ stammen.

Das Epitop B des Konjugats gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch aus kapselförmigen bakteriellen Polysacchariden aus zum Beispiel Neisseria meningitis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae und der Streptococcus-Gruppe mit Ausnahme der sialylierten Polysaccharide stammen.
Die Polysaccharide sind durch synthetische Verfahren erhaltene Kohlenhydratreste.
Das Epitop B des vorliegenden Konjugats kann auch aus einem Pilz stammen, wie etwa zum Beispiel ein aus der Hefe Saccharomyces isoliertes.
Das B-Epitop des Konjugats gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein Tumormarker wie etwa zum Beispiel Tn- und T*-Antigene.
Die bevorzugte Kohlenhydrat-Struktureinheit, die das B-Epitop des Konjugats gemäß der vorliegenden Erfindung bildet, kann einen Galactosylrest oder ein Derivat davon umfassen, wobei sie aber nicht sialyliert ist.
Sie kann aus der Gruppe ausgewählt sein, die Tn-, Di-Tn-, Tri-Tn-, Hexa-Tn- oder T*-Antigene umfaßt.
Somit bezieht sich die Erfindung in einer ihrer bevorzugten Ausführungsformen auf ein Kohlenhydrat-Peptid-Konjugat, umfassend:

– wenigstens 3 kovalent aneinander gebundene Lysinreste,
– wenigstens ein Peptid, das ein an einen Lysinrest gebundenes T-Epitop umfaßt, und
– wenigstens einen gegebenenfalls substituierten Galactosylrest, der mit dem Peptid kovalent verknüpft ist und ein Epitop B bildet, mit der Maßgabe, daß die Kohlenhydrat-Struktureinheit kein Sialosidrest ist.

Bei einem verwandten Aspekt dieser Ausführungsform ist der Galactosylrest durch einen weiteren Glykosylrest substituiert.
Bei einem verwandten Aspekt umfaßt das Konjugat der vorliegenden Erfindung 3 Lysinreste, wenigstens 4 Epitope des T-Typs, die gleich oder verschieden sein können und mit den NH₂-Enden zweier Lysinreste verknüpft sind, und 4 α-Galactosyl-Nacetyl-Serinreste.
Die Kohlenhydrat-Struktureinheit des Konjugats der vorliegenden Erfindung kann weiter in Kombination mit einem oder mehr peptidischen CD3⁺-Zellepitopen, die durch tumorspezifische zytotoxische T-Zellen erkannt werden, auf die dendrimere Struktur gepfropft sein. Diese als Tumormarker erkannten, peptidischen CD3⁺-T-Zellenepitope können aus der Gruppe ausgewählt sein, bestehend aus:
MUC-1-Peptiden (Pankreas, Brust),
MAGE 1 und 3 (Melanom, Lunge) (T. Boon et al. (1995), Immunology Today, Bd. 16, Nr. 7, S. 334-336)
pme117/gp 100 (Melanom)
Tyrosinase (Melanom)
BAGE (Melanom)
GAGE (Melanom)
LB-33-B (Melanom)
CDK4
p185^HER (Brust, Eierstock)
CEA
MART1/Melan-A (Melanom)
oder aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus bei A. Van Pel et al. (1995) Immunological Reviews, Nr. 145, S. 229-250, oder bei P. G. Coulie (1995), Stem Cells, 13, S. 393-403, beschriebenen Tumorantigenen besteht.
Wie früher angeführt ist bei dem Konjugat der vorliegenden Erfindung ein CD4⁺-T-Epitop mit einem vorstehend beschriebenen Kohlenhydrat-B-Epitop zum Hervorbringen einer wirkungsvollen Immunantwort konjugiert.
Ein derartiges Epitop kann zwischen nahezu 5 und 50 Aminosäuren umfassen.
Ein derartiges bevorzugtes T-Epitop ist das CD4⁺,T-Epitop, das das synthetische Peptid ist, das der Sequenz 103-115 des VP1-Proteins aus dem Poliovirus Typ 1 entspricht, oder es kann wahlweise ein das CD4⁺,T-Epitop umfassende Peptid sein, das aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend:

– Fragmente des Tetanustoxins wie etwa zum Beispiel:
– Sequenz 830-844 des Tetanustoxins (QYIKANSKFIGITEL),
– Sequenz 947-967 des Tetanustoxins (FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE),
– Sequenz 1273-1284 des Tetanustoxins (GQIGNDPNRDIL),
– Fragmente durch C. C. A. M. Peeters (1991) in The Journal of Immunology, 146, 4309-4314, beschriebener Pneumokokken-Typ-4-Polysaccharid- und Oligosaccharid-Tetanustoxoid-Konjugate,
– durch A. F. M. Verheul (1991) in Detection and Immunity, Bd. 59, Nr. 10, S. 3566-3573, beschriebene Meningokokken-Liposaccharide.

Diese peptidischen T-Epitope binden typischerweise an eine Mehrzahl humane und murine MHC-Moleküle (Haupthistokompatibilitätskomplex) der Klasse II, wodurch in der Folge bei der CD4⁺,T-Zellenantwort angetroffenen Restriktionsprobleme, die mit dem zwischen Individuen bestehenden Polymorphismus der MHC-Moleküle verbunden sind, vermieden werden. Weiterhin sollte die Verwendung von Tetanustoxinpeptiden die Immunogenität auf dem Konjugat der vorliegenden Erfindung vorhandener Antigene als Ergebnis der Impfung zahlreicher Individuen mit dem Tetanustoxoid erhöhen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Konjugat: wenigstens ein Peptid, das ein T-Epitop oder mehrere identische oder verschiedene T-Epitope umfaßt, und
wenigstens eine ein B-Epitop enthaltende Kohlenhydrat-Struktureinheit oder ein Derivat davon, vorausgesetzt, daß sie (es) kein Sialosid ist.
Das Konjugat kann Tn3-T sein, wobei T ein Poliovirus- oder Tetanusantigen sein kann. Es kann auch Tn6-T sein, wobei T ein Poliovirusantigen mit der folgenden Sequenz ist: KFLAVWKITYKDT.
Die Formel von Tn6-T ist somit:
(Tn₃-G)₂-KFLAVWKITYKDT, worin Tn₃ ein lineares Trimer von (αGalNAc Ser) oder (αGalNAc Thr) ist.
Sie können durch Peptidsynthese erhalten werden, wobei eine Peptidbindung zwischen dem glykosylierten Serin oder Threonin und dem Peptid T erzeugt wird.
Wie früher angeführt wird, ist die vorliegende Erfindung auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung gerichtet, die ein Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt. Eine derartige Zusammensetzung umfaßt eine wirksame Menge des vorliegenden Konjugats zum Beispiel in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und kann in Form einer Flüssigkeit oder Emulsion in Gegenwart eines oder keines Arzneimittelhilfsstoffs (einschließlich Aluminiumhydroxid und Zytokine) vorliegen. Der Verabreichungsweg der Zusammensetzung kann jeder üblicherweise verwendete Weg (einschließlich einer intratumoralen Verabreichung wie etwa Injektion) sein. Die immunogene Zusammensetzung, die wenigstens ein Kohlenhydrat-Peptid-Konjugat umfaßt, wobei das Konjugat verschiedene Kohlenhydratantigene umfaßt, kann zum Auslösen einer wirkungsvolleren Antitumorimmunität gegen Krebs verwendet werden.
Die Konjugatmenge kann zwischen 10 μg und 1 ng umfassen.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Vakzin gerichtet, das ein Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung zum Verstärken der Immunantwort eines menschlichen oder tierischen Körpers, besonders der T- und/oder B-Zellen-vermittelten Antwort, insbesondere gegen Bakterien, wobei das Konjugat der vorliegenden Erfindung an den menschlichen oder tierischen Körper verabreicht werden soll.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Verwendung zum Auslösen einer B-Zellenantwort in einem menschlichen oder tierischen Körper, wobei wenigstens ein erfindungsgemäßes Konjugat verabreicht werden soll.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Verwendung zum Auslösen einer B- Zellenantwort in einem Wirt, dadurch gekennzeichnet, daß bei dem Wirt wenigstens ein Kohlenhydrat-Peptid-Konjugat verabreicht werden soll, umfassend:

– wenigstens 3 Lysinreste, die kovalent miteinander gebunden sind,
– wenigstens ein Peptid, das ein mit einem Lysinrest verknüpftes T-Epitop umfaßt, und
– wenigstens eine gegebenenfalls substituierte Kohlenhydrat-Struktureinheit, die kein Sialosid ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Impfung eines menschlichen oder tierischen Körpers, wobei ein Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung an den menschlichen oder tierischen Körper verabreicht werden soll.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Diagnosekit, der antigenspezifische Antikörper umfaßt, die durch Immunisierung eines menschlichen oder tierischen Körpers mit einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung hervorgebracht werden.
Derartige Antikörper werden auch als Gegenstände der vorliegenden Erfindung angesehen. Sie können bei einem Verfahren zur Diagnose von Krebs verwendet werden, das das In-Kontakt-Bringen wenigstens eines dieser Antikörper mit einer biologischen Probe und Bestimmen der Bildung von Komplexen zwischen diesem Antikörper und in dieser Probe enthaltenen Molekülen umfaßt.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele genauer veranschaulicht.
BEISPIELE
BEISPIEL 1:
Synthese des erfindungsgemäßen Glykokonjugats
Die Strategie zum Aufbau des MAG-Konjugats umfaßte zuerst die Synthese des Tn-Antigens, das das B-Zellenepitop darstellt. Dieser glykosidische Tumormarker wurde anschließend mit einem Polylysinkern (M) in Verbindung mit dem peptidischen CD4⁺,T-Zellenepitop unter Ergeben des vollständigen Konstrukts B4-T4-M konjugiert. Außerdem wurden die Bezugsverbindungen, die zu den immunologi schen Tests notwendig sind, synthetisiert (B, T, B-T, B4-M, T4-M, M).
Die Synthese des Tn-Antigens 2 (2) wurde durch klassische Verfahren (Ref. 19, Ref. 20) ausgehend von Tri-O-acetyl-D-galactal (Ref. 21) ausgeführt. N-(Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-serin-tert-butylester (Ref. 22) wurde für die Koenigs-Knorr-Reaktion mit 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-b-D-galactopyranosylchlorid (Ref. 23) unter Ergeben des geschützten Derivats 1 verwendet. Das abschließende Entschützen von Acetyl und des t-Butylesters lieferte das zur Peptidsynthese geeignet geschützte Tn-Antigen 2.
B4-T4-M4 wurde durch die herkömmliche Festphasen-Peptidmethodik (Ref. 40) unter Anwenden der Fmoc-Chemie, die mit der Glykopeptidsynthese vereinbar ist, zusammengebaut. Nach dem Anbringen der β-Alanyl-Abstandsgruppe an dem Wang-Harz wurde der Lysinkern durch aufeinanderfolgendes, zweistufiges Kuppeln von FmocLys (Fmoc)OH, das vier Aminogruppen lieferte (Ref. 13b), aufgebaut. Der Lysinkern wurde durch die geeignet geschützten Aminosäuren der Poliovirus-T-Epitop-Sequenz (KLFAVWKITYKDT) weiter verlängert, wobei vier Kopien derselben Aminosäure nacheinander angefügt wurden. Schließlich wurde 2 in das dendrimere Peptid als Baustein eingebaut.
Der Einbau des Tn-Antigenderivats 2, der mit dem vollständig entschützten Zucker erreicht werden konnte, war von Interesse. Dies ist sehr vorteilhaft, da er mögliche Nebenreaktionen (Racemisierung und/oder b-Eliminierung), die mit der abschließenden Deacetylierung des Zuckerrests verbunden sind, vermeidet. Einige Beispiele der Verwendung ungeschützter glykosidischer Einheiten sind bereits mitgeteilt worden (Ref. 24). Nach Abschluß der Synthese wurde das MAG 4 mit wäßriger Trifluoressigsäure (95%) aus dem Harz freigesetzt und die Peptidseitenketten wurden gleichzeitig entschützt. Während einer Reaktionszeit von 1,5 Stunden wird üblicherweise keine Glykosidspaltung beobachtet (Ref. 25). Einem ähnlichen Verfahren wurde bei den Bezugsverbindungen gefolgt. Alle Peptide und Glykopeptide wurden durch Aminosäureanalyse und Elektrospray-Massenspektrometrie charakterisiert.
Allgemeine Verfahren:
Zur Synthese von 2 wurden die Reagenzien von Aldrich oder Sigma erworben.
Alle Lösungsmittel waren hochrein und trocken. CH₂Cl₂ wurde über CaH₂ und Toluol über Natrium mit Benzophenon vor Gebrauch destilliert. Die Fmoc-geschützten Aminosäurederivate und Wang-Harz zur Peptidsynthese wurden von Bachem oder Novabiochem erhalten. Die Seitenkette der Aminosäuren wurde durch eine t-Butylgruppe geschützt, ausgenommen Tryptophan und die Lysinreste des T-Epitops, die durch eine t-Butyloxycarbonylgruppe (Boc) geschützt wurden. DMF und Acetonitril zur HPLC wurden von Merck erworben. Die Endverbindungen wurden durch Umkehrphasen-Hochleistungschromatographie (HPLC) mittels eines Perkin-Elmer-Pumpensystems mit einem UV-Detektor (230 oder 280 nm) gereinigt. Eine Säule (250 × 10 mm) mit Nucleosil C₁₈ (5 mm, 300 Å) wurde verwendet und die Produkte wurden mit einem Gradienten aus MeCN/0,1% Trifluoressigsäurepuffer während 20 min (Fließgeschwindigkeit 6 ml/min) eluiert. ¹H-NMR-Spektren (300,134 MHz, 3-(Trimethylsilyl)propionsäure-natriumsalz als Standard für Spektren in D₂O) wurden auf einem Bruker-Instrument aufgezeichnet. Massenspektren wurden durch Beschuß mit schnellen Atomen oder durch Elektrospray gemessen. Aminosäureanalysen wurden mittels eines Analysengeräts Beckman 6300 nach der Hydrolyse der Peptide mit 6 N HCl (0,2% Phenol wurden zugesetzt, wenn das Peptid einen Tyrosinrest erhält) 20 h bei 110°C in verschlossenen Glasröhren erhalten.
Festphasensynthese, allgemeines Verfahren:
Die Festphasen-Peptid- und Glykopeptidsynthesen wurden manuell unter Anwenden der Standardvorschrift für die Fmoc-Chemie (Ref. 40) an einem mit p-Benzyloxybenzylalkohol funktionalisierten Polystyrolharz (Wang-Harz) ausgeführt. Mit Ausnahme des C-terminalen b-Alaninrests wurden die N^a-Fmoc-Aminosäuren (die Standardseitenkettenschutzgruppen trugen) und der glykosylierte Baustein 2 (3 Äquiv.) unter Verwenden von TBTU als Aktivierungsmittel und DMF als Lösungsmittel in die Peptidkette eingebaut. Alle Kupplungen wurden durch den Kaiser-Test (Ref. 29) überwacht und waren üblicherweise in 1 h abgeschlossen. Alle Fmoc-Spaltungen wurden durch Behandlung des Harzes mit 20% Piperidin in DMF durchgeführt. Auf jedes Entschützen folgend wurde das Harz nacheinander mit DMF, CH₂Cl₂, DMF gewaschen. Am Ende der Synthese wurde das Harz ausgedehnt mit DMF und CH₂Cl₂ gewaschen, getrocknet und 2 h mit einer wäßrigen TFA-Lösung behandelt. Nach der Filtration des Harzes wurde die Lösung eingeengt und das rohe Produkt wurde mit Diethylether gefällt. Der Niederschlag wur de filtriert, in Wasser gelöst und lyophilisiert. Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC (die Elutionsbedingungen sind nachstehend für jede Verbindung angegeben) gereinigt und durch Aminosäureanalysen und Elektrospray-Massenspektrometrie charakterisiert.
N^a-(Fluoren-9-ylmethoxycarbonyl)-3-O-(2-acetamido-2-desoxy-a-D-galactopyranosyl)-L-serin 2:
N^a-(Fluoren-9-ylmethoxycarbonyl)-3-O-(2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-desoxy-a-D-galactopyranosyl)-L-serin-tert-butylester 1 wurde wie zuvor beschrieben (Ref. 23) durch Glykosylierung von N^a-(Fluoren-9-ylmethoxycarbonyl)-L-serin-tert-butylester (Ref. 22) mit 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-b-D-galactopyranosylchlorid (aus Tri-O-acetyl-D-galactal erhalten) (21) mittels Ag₂CO₃/AgClO₄ als Katalysatoren, gefolgt von der Reduktion und Acetylierung der 2-Stellung (Ref. 19) hergestellt. Der t-Butylester von 1 (2 g, 2,8 mMol) wurde anschließend in Ameisensäure (76 ml) entschützt (Ref. 20). Die Lösung wurde 10 h gerührt und verdampft. Der Rückstand wurde in MeOH (200 ml) gelöst und die Acetylgruppen der Zuckerstruktureinheit wurden durch tropfenweises Zufügen einer Lösung von 1% MeONa (pH 11) (Ref. 46) entfernt. Nach 15 h wurde das Medium durch Dowex 50WX8 (H⁺)-Harz neutralisiert und das Endprodukt 2 wurde an einer Umkehrphasensäule (C₁₈) unter Anwenden eines Gradienten Wasser/MeCN: 1,27 g (Ausbeute 79%) gereinigt.
Bezugsverbindungen:
M: Die MAG-Synthesen erfordern eine niedrige Substitution des Harzes. Das vorgebildete symmetrische Anhydrid von N^a-Fmoc-bAla-OH (0,25 mMol) (30) wurde mit dem Wang-Harz (1 g, 0,96 mMol/g) 1 h umgesetzt, was eine durch die UV-Analyse einer Harzprobe (Ref. 31) abgeschätzte Funktionalisierung von ungefähr 0,12 mMol/g lieferte. Nach der Acetylierung der restlichen Hydroxygruppen durch Ac₂O in DMF wurde der Lysinkern durch aufeinanderfolgende Kupplungen von 0,48 und 0,96 mMol N^a-Fmoc-Lys-(Fmoc)-OH zusammengebaut. Die Spaltung des Peptids aus dem Harz wurde durch TFA/Wasser (95/5, 16 ml) durchgeführt. Die Reinigung des Rohprodukts durch HPLC (Gradient von 0% bis 25%, 7,2 min Retentionszeit) ergab M (94 mg). ¹H-NMR:
(D₂O), d, 4.24, 4.03, 3.93 (3 CH a Lys), 3.54, 3.42 (CH₂-NH b-Ala), 3.22, 3 (CH₂ e Lys), 2.62 (CH₂-COOH b-Ala), 1.97-1.85 (2 CH₂ b Lys), 1.78-165 (2 CH₂ d, CH₂ b Lys), 1.58-1.3 (3 CH₂ g, CH₂ d Lys); ESMS 473,2 (Ber. 473,33).
T: Die Synthese des T-Epitops wurde an 0,21 g Harz (0,15 mMol) durch das allgemeine Verfahren ausgeführt. Spaltung des harzgebundenen Peptids (TFA/Wasser/Ethandithiol: 95/2,5/2,5, 45 ml) und Reinigung durch HPLC (Gradient von 0% bis 65%, 12,6 min Retentionszeit) lieferten T (31 mg). FABMS:
[M + H]⁺ 1613 (Ber. 1611,19). Aminosäureanalyse: Ala 1,16 (1), Asp 1,03 (1), Ile 0,96 (1), Leu 1,01 (1), Lys 2,92 (3), Phe 1 (1), Thr 1,84 (2), Tyr 0,99 (1), Val 0,94 (1).
B-T: Die weitere Verlängerung der T-Peptid-Kette (0,22 g Harz, 0,14 mMol, wie vorstehend synthetisiert) wurde mit 2 als Baustein erreicht. Das Glykopeptid wurde aus dem Harz freigesetzt (TFA/Wasser/Ethandithiol: 95/2,5/2,5, 50 ml) und das rohe Produkt wurde durch HPLC (Gradient von 10% bis 60%, 11,2 min Retentionszeit) unter Ergeben von B-T (63 mg) gereinigt. ESMS: 1903 (ber. 1903,22). Aminosäureanalyse: Ala 1 (1), Asp 1,05 (1), Ile 1,0 (1), Leu 1,05 (1), Lys 3,12 (3), Phe 1,05 (1), Ser 0,94 (1), Thr 1,97 (2), Tyr 1,06 (1), Val 1,0 (1).
B4-M: 2 wurde mit dem wie vorstehend beschrieben synthetisierten Polylysinkern (M) (0,83 g Harz, 0,1 mMol) konjugiert. Nach der Abspaltung des Glykopeptids aus dem Harz (TFA/Wasser: 95/5, 25 ml) und Reinigung durch HPLC (Gradient von 0% bis 10%, 10,2 min Retentionszeit) wurde B4-M (36 mg) erhalten. ESMS: 1633,9 (ber. 1633,78). Aminosäureanalyse: Lys 3 (3), Ser 4,06 (4).
T4-M: Der Lysinkern M (0,25 g Harz, 0,03 mMol, wie vorstehend synthetisiert) wurde durch die T-Epitopsequenz weiter verlängert. Die Abspaltung des Peptids aus dem Harz (TFA/Wasser/Ethandithiol: 95/2,5/2,5, 25 ml) und seine Reinigung durch HPLC (Gradient von 12% bis 45%, 16,5 min Retentionszeit) ergab T4-M (67 mg). ESMS: 6852,08 (ber. 6853,35). Aminosäureanalyse: Ala 4 (4), Asp 4,4 (4), Ile 4 (4), Leu 4,1 (4), Lys 15,8 (15), Phe 4 (4), Thr 8,2 (8), Tyr 4,3 (4), Val 3,8 (4).
Multiples Antigen-Glykopeptid B4-T4-M 4:
Die Synthese von B4-T4-M wurde schließlich durch Kuppeln von 2 an T4-M (0,25 g Harz, 0,03 mMol) erreicht, das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde. Die Spaltung des Glykopeptids wurde mit TFA/Wasser/Ethandithiol (95/2,5/2,5, 30 ml) bewerkstelligt. Nach der Reinigung durch HPLC (Gradient von 10% bis 65%, 11,9 min Retentionszeit) wurde das Zielglykopeptid (25 mg) erhalten. ESMS:
8014,09 (ber. 8014,45). Aminosäureanalyse: Ala 4 (4), Asp 4,78 (4), Ile 4,09 (4), Leu 4,15 (4), Lys 16,31 (15), Phe 4 (4), Ser 3,81 (4), Thr 8,58 (8), Tyr 4,5 (4), Val 3,63 (4).
BEISPIEL 2
Immunologische Ergebnisse: Antigenität und Immunogenität des T,CD4+-Epitops und des Tn-Antigens innerhalb des erfindungsgemäßen Glykokonjugats MAG
Materialien und Verfahren:
Mäuse
Sechs bis acht Wochen alte, weibliche Inzuchtmäuse wurden bei allen Versuchen verwendet. BALB/c-Mäuse wurden von Iffa Credo (L'Abresle, Frankreich) erhalten.
Antigenpräsentationstest:
Zu den Dosis-Reaktion-Tests wurden 10⁵ T-Zellenhybridome 45G10 (spezifisch für das Polioviruspeptid 103-115) je Näpfchen mit 10⁵ A20-Zellen (ATCC, TIB-208 Rockville, MD) mit verschiedenen Antigendosen 24 h in mit 10% fetalem Kälberserum, Antibiotika, 2 mM L-Glutamin und 5 × 10^-5 M 2-Mercaptoethanol ergänztem RPMI-1640-Medium kultiviert. Nach 24 h wurden die Überstände mindestens 2 h bei –70°C eingefroren. 10⁴ Zellen/Näpfchen der IL-2-abhängigen CTLL-Zellinie wurden mit einer aliquoten Menge von 100 μl Überstand in 0,2 ml Endvolumen kultiviert. Zwei Tage später wurde [³H]-Thymidin (0,3 µCi/Näpfchen; AS = 1 Ci/mMol) zugesetzt und die Zellen wurden 18 h später mit einem automatischen Zellernter geerntet. Das eingebaute Thymidin wurde durch Szintillationszählung nachgewiesen.
T-Zellenproliferationstest
Mäuse wurden mit 10 µg in komplettem Freundschem Adjuvans emulgierten T-, B-T-, T4-MAP-, B4-MAP- oder B4-T4-MAP-Verbindungen subkutan immunisiert. Zehn Tage später wurden Lymphknotenzellen (LN) entnommen und es wurden Einzelzellensuspensionen hergestellt und in mit 2 mM L-Glutamin ergänztem HL-1-Medium (Hycor) kultiviert. 10⁶ LN-Zellen/Näpfchen wurden auf 96-Näpfchen-Mikrotiterplatten (TPP, Trasadingen, Schweiz) mit 10 µg/ml des angegebenen Antigens oder nur Medium plattiert. Nach 3 Tagen bei 37°C wurden die Zellen 18 h mit ³H-TdR (NEN, Boston, MA) gepulst und anschließend auf Glasfaserfiltern (Wallac Oy, Turku, Finnland) mit einem automatischen Zellernter geerntet. Die eingebaute Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung gemessen. Die Ergebnisse sind als cpm-Mittel aus Doppel- oder Dreifachkulturnäpfchen ausgedrückt. Die Standardabweichungen waren im Mittel kleiner als 15%.
ELISA-Tests:
Desialyliertes OSM wurde wie in einer früheren Veröffentlichung (Ref. 32) beschrieben hergestellt und wurde freundlicherweise von Dr. A. Babino zur Verfügung gestellt.
a-GalNAc-Ser (im nachstehenden Syntheseabschnitt als 3 bezeichnet) wurde gemäß einem bekannten Verfahren (Ref. 33) unter Verwenden von Glutaraldehyd (Sigma) kovalent an Ovalbumin (Sigma, St. Louis, MO) gebunden.
96-Näpfchen-Mikrotiterplatten (Nunc, Roskilde, Dänemark) wurden mit 10 µg je ml verschiedenen Antigenen in 50 mM Carbonatpuffer pH 9,6 überzogen und über Nacht bei d-OSM, Ovalbumin und dem Ova-Tn-Glykokonjugat bei 4°C oder bei Peptiden und MAG-Konstrukten bei 37°C inkubiert. Nach dem Waschen mit 0,1% Tween 20 enthaltendem PBS wurden der 83D4-(IgM) oder der MLS128-(IgG) anti-Tn-mAbs in Puffer (PBS plus 0,1% Tween 20, 1% BSA) verdünnt und zu 2,5 µg/ml beziehungsweise 40 µg/ml 1 h bei 37°C plattiert. Nach drei Waschvorgängen wurden die Näpfchen 1 Stunde bei 37°C mit Ziege-anti-Maus-IgM oder Anti-IgG-Peroxidasekonjugat (Sigma, St. Louis, Mo) behandelt und o-Phenylendiamin/H₂O₂ wurde anschließend als Substrat zugesetzt. Die Platten wurden in einem ELISA-Autoreader (Dynatech, Marnes la Coquette, Frankreich) bei 492 nm photometrisch ausgelesen.
Analyse der Antikörperantwort:
BALB/c-Mäuse (5 je Gruppe) wurden intraperitoneal mit 20 µg T-, B-T-, T4-MAP-, B4-MAP- oder B4-T4-MAP-Verbindung in Aluminiumhydroxid (Alaun) an Tag 0, 20, 42 und 63 immunisiert. Man entnahm den Mäusen 10 Tage nach jeder Immunisierung Blut und das gesammelte Serum wurde durch einen vorstehend beschriebenen ELISA unter Verwenden mit d-OSM überzogener Platten einzeln auf Anti-Tn-Antikörper getestet. Die Seren wurden seriell verdünnt und auf den Anti-Tn-IgM- und IgG-Gehalt getestet. Die negative Kontrolle bestand aus 100fach verdünntem naivem Mausserum. Die ELISA-Antikörpertiter wurden durch lineare Regressionsanalyse unter Auftragen der Verdünnung gegen die Absorption bei 492 nm bestimmt. Die Titer wurden als log10 der höchsten Verdünnung berechnet, die die doppelte Absorption normalen, 1/100 verdünnten Serums ergab. Die Titer sind als arithmetisches Mittel ± SA der log10-Titer angegeben. Die statistische Analyse wurde durch den Student-t-Test ausgeführt. Kleinere P-Werte als 0,05 wurden als signifikant erachtet.
1) In-vitro-Antigenität von B4-T4-M
Die Erkennung des B4-T4-M in vitro durch ein für das Poliovirus-103-115-Epitop T spezifisches T-Hybridom wurde in Gegenwart des Lymphoms B,A20 als Antigen-präsentierende Zelle ermittelt.
4a veranschaulicht die Stimulation eines für das Polioviruspeptid 103-115 T spezifischen T-Hybridoms mit unterschiedlichen, dieses Peptid enthaltenden Verbindungen:
10⁵ bei 37°C in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von B, T, B-T, B4-MAP, T4-MAP und B4-T4-MAP inkubierte Lymphom-B,A20-Zellen (H-2^d) wurden zum Stimulieren von 10⁵ Zellen des für das Polioviruspeptid 103-115 spezifischen T,45G10-Hybridoms (R. Lo-Man et al. (1994), 152:5660-5669) verwendet und durch I-A^d-Moleküle geschnitten. Nach 24 h wurden von den Kulturüberständen Proben genommen, anschließend wurde das IL-2 durch das Ausmaß der Proliferation der IL-2-abhängigen CTLL-Zellinie bestimmt. Nach drei Tagen Kultur wurde die Proliferation der CTLL-Zellen durch den Einbau tritiierten Thymidins gemessen. Die Ergebnisse sind in cpm ausgedrückt.
Wie aus 4a zu ersehen stimuliert die B4-T4-MAP-Verbindung die IL-2- Produktion durch das für das T-Epitop spezifische T-Hybridom sehr. Verglichen mit den anderen, ebenfalls das Epitop T enthaltenden Verbindungen T, B-T und T4-MAP ist die Antigenität des Konjugats der vorliegenden Erfindung, Verbindung B4-T4-MAP, 100 bis 1000 Mal höher. Die B- und B4-MAP-Verbindungen, die frei von dem Poliovirus-Epitop T sind, stimulieren das T-Hybridom nicht.
Anschließend wurde die T-Immunogenität in vivo des Epitops T des Konjugats der vorliegenden Erfindung, B4-T4-MAP, in BALB/c-Mäusen bestimmt. Nach der Immunisierung von Mäusen mit dem B4-T4-MAP oder mit einer Kontrollverbindung (T, B-T, B4-MAP, T4-MAP) wurde die Proliferation von Lymphknotenzellen in vitro nach der erneuten Stimulierung mit das T-Epitop allein oder in Kombination mit dem B-Epitop enthaltenden Verbindungen (T- und B-T-Verbindungen) gemessen.
4b veranschaulicht das Auslösen einer auf das 103-115-Peptid (T-Verbindung) spezifischen Proliferationsantwort nach der Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit der B4-T4-MAP-Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung. BALB/c-Mäuse (H-2^d) wurden subkutan mit 10 µg T, B-T, B4-MAP, T4-MAP und B4-T4-MAP in Gegenwart von Freundschem komplettem Adjuvans immunisiert. Zehn Tage später wurden ableitende Lymphknotenzellen in Gegenwart nur des Mediums kultiviert oder wurden in vitro mit 10 µg/ml einer das 103-115-Epitop enthaltenden Verbindung (Verbindung T oder B-T) erneut stimuliert. Vier Tage später wurde die Proliferation der LN-Zellen durch Einbau tritiierten Thymidins gemessen. Die Ergebnisse sind in cpm ausgedrückt.
Wie aus 4b zu ersehen ist lösen die MAP-, B4-T4-MAP- und T4-MAP-Verbindungen sowie die das T-Epitop enthaltenden T- und B-T-Verbindungen in vivo eine für dieses T-Epitop spezifische proliferative T-Antwort aus. Die Spezifität der beobachteten T-Antwort wird durch die Abwesenheit der Proliferation von T-Zellen gezeigt, die aus mit der T-Epitop-freien B4-MAP-Verbindung immunisierten Mäusen nach der erneuten Stimulierung mit T- oder B-T-Verbindungen stammen.
Es war auf diese Weise möglich, durch die Analyse der T-Immunogenität des Konjugats gemäß der vorliegenden Erfindung (die B4-T4-MAP-Verbindung) zu zeigen, daß das in dieser Verbindung vorhandene Poliovirus-T-Epitop sowohl in vitro als auch in vivo für dieses T-Epitop spezifische T-Zellen zu stimulieren vermag. Weiterhin wird eine große Zunahme der Antigenität des T-Epitops beobachtet, wenn das letzte mit dem Kohlenhydratepitop innerhalb der B4-T4-MAP-Struktur kombiniert wird.
2) Antigenität der MAG-Struktur

2.1 Zum Bestimmen der Antigenität des Tn-Antigens in dem erfindungsgemäßen Glykokonjugat-MAG-System haben wir zwei verschiedene, gut charakterisierte monoklonale Antikörper (mAbs) verwendet, die das Tn-Antigen erkennen. 3 zeigt die Bindungsfähigkeit der monoklonalen Antikörper Anti-Tn-83-D4 (IgM) (Ref. 26) und MLS 128 (IgG) (Ref. 27) an die verschiedenen MAG-Konstrukte mittels eines ELISA-Tests. Dieses Binden wird mit dem Binden verglichen, das mit dem mit einem Proteinträger (Ovalbumin) konjugierten Tn-Antigen 3 erhalten wird.

Totalsynthetische multiple antigene Glykoproteine erlauben in einem gewissen Maß die Abstoßung eines implantierten Tumors, der abweichende Glykosylierungen trägt. Zum Induzieren einer wirkungsvolleren Antitumorimmunität gegen Krebs sollte sich die Entwicklung derartiger Immunogene jedoch nicht auf ein einzelnes Kohlenhydratantigen konzentrieren, sondern muß verschiedene Kohlenhydratziele für Antikörper kombinieren. Die Verwendung eines vorgegebenen Th-Zellenepitops in Verbindung mit Kohlenhydraten ist ein Erfordernis zum Hervorbringen starker Antikörperantworten, sie kann aber seine Wirksamkeit in Anbetracht des bei der menschlichen Bevölkerung beobachteten MHC-Polymorphismus beschränken. Zum Vermeiden dieses Nachteils müssen MAG-Strukturen mehrere T-Zellenepitope mit einem besonderen Augenmerk auf vermischte MHC-Bindungssequenzen einschließen, wie etwa die für Tetanustoxin beschriebenen (Ref. 41, Ref. 42), wofür Einzelpersonen bereits aktiviert sind (Ref. 43). Der Einbau von CTL-Epitopen in MAG-Strukturen, wie etwa von MUC-1 abgeleitete Peptide (Ref. 44) für Epithelkrebs, kann ebenfalls leicht erreicht werden, um das Spektrum der Antitumor-Immunantwort zu erweitern. Hier haben wir die Verwendung eines schwachen Arzneimittelhilfsstoffs, Alaun, bevorzugt, der bei gesunder menschlicher Bevölkerung zugelassen ist, was zeigt, daß zum Auslösen Anti-Kohlenhydrat-spezifischer Immunantworten durch die MAG- Strategie keine starken Arzneimittelhilfsstoffe erforderlich sind. Dieser letzte Punkt kann von großer Bedeutung beim Ausdehnen der Anwendung dieser Strategie auf bakterielle Oligosaccharide (Ref. 45) zum Impfen einer gesunden Bevölkerung sein.
Es ist zu erkennen, daß das B4-T4-M-System der Erfindung sowie das desialylierte OSM oder das Ovalbumin-Tn-Konjugat (Ova-Tn) durch die beiden mAbs 83 D4 und MLS 128 wirkungsvoll, während M, B4-M, T4-M, B-T (im letzten Fall wurde nur ein mAb getestet) und Ovalbumin selbst nicht erkannt wurden. Von dem durch den monoklonalen Antikörper MLS 128 erkannten d-OSM-Fragment wurde gezeigt, daß es drei aufeinanderfolgende a-GalNAc-Ser/Thr-Reste (Ref. 28) enthält, was anzeigen könnte, daß B4-T4-M, nicht aber B4-M die wiederholte glykosylierte Serineinheit nachahmen kann.
Diese Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße B4-T4-M-Konstrukt das Tn-Antigen korrekt präsentieren kann.

2.2 Eine weitere Untersuchung der Immunogenität von Tn-MAG-Konjugaten der Erfindung bei Mäusen wurde zuerst an BALB/c-Mäusen durchgeführt, die mehrere Male mit den Tn-MAG-Konjugaten oder mit den Kontrollverbindungen B-T, B4-MAP oder T4-MAP in Gegenwart von Aluminiumhydroxid (Alaun) immunisiert wurden. Der Nachweis für das Tn-Antigen spezifischer IgM- (5a) und IgG-Antikörper (5b) wurde durch einen ELISA ausgeführt, wobei die Erkennung des d-OSM gemessen wurde.

Wie aus 5a und 5b zu erkennen ist, wurden nach zwei Immunisierungen mit der erfindungsgemäßen B4-T4-MAP-Verbindung für das Tn-Antigen spezifische IgM-Antikörper in BALB/c-Mäusen anders als bei den Verbindungen B-T, B4-MAP oder T4-MAP induziert, die keine Anti-Tn-Antikörper induzieren konnten. Die mit B4-T4-MAP induzierte Menge Anti-Tn-IgM blieb nach einer dritten und vierten Immunisierung unverändert. Bei BALB/c-Mäusen schien es, daß die Antikörperantwort auf durch B4-T4-MAP induziertes Tn durch die Gegenwart von IgM-Antikörpern und die Abwesenheit von IgG-Antikörpern gekennzeichnet war.

2.3 Eine weitere Untersuchung der Induktion von Anti-Tn-Antikörpern unter denselben Bedingungen wurde an einem anderen Mäusestamm des H2^S-Haplotyps (der auf das T-Epitop anspricht), nämlich SLJ/J-Mäusen ausgeführt und führte zur Induktion beider Klassen IgM- und IgG-Antikörper auf Tn (5b). Somit war die B4-T4-MAP-Verbindung (Tn-MAG) der vorliegenden Erfindung in der Lage, verschiedenen Isotypen angehörende Antikörper auf Tn zu induzieren. Der Grund, weshalb in Abhängigkeit von dem getesteten Mäusestamm Unterschiede bei der Anti-Tn-Antikörperklasse bestehen, wird noch untersucht.

Die CD4⁺-T-Zellenabhängigkeit der Immunogenität der Tn-MAG-Verbindung B wurde ebenfalls untersucht. Wie vorstehend angegeben sprechen BALB/c-Mäuse auf das Poliovirus-T-Epitop an und erzeugen Antikörper auf Tn. Zum Bestimmen der T-Abhängigkeit der Produktion von Anti-Tn-Antikörpern testeten wir einen weiteren, auf das Poliovirus-Epitop T ansprechenden Mäusestamm, und zwar den SLJ/J-Stamm und einen nicht auf das Poliovirus-Epitop T ansprechenden Mäusestamm, und zwar den DBA/1-Stamm auf ihre Fähigkeit, Antikörper auf Tn zu produzieren.
5b und 5c zeigen, daß die Immunisierung mit der Tn-MAG-Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung von SJL/J- (5b) und DBA/1-Mäusen (5c) nur bei dem SLJ/J-Stamm, der auf das Poliovirus-T-Epitop anspricht, zur Produktion von Anti-Tn-Antikörpern führt. Diese Daten zeigen, daß das in der Tn-MAG-Verbindung der vorliegenden Erfindung vorhandene CD4⁺,T-Epitop zur Produktion von Antikörpern auf Tn notwendig ist.

2.4 Wir untersuchten weiter die Induktion von Anti-Peptid-Antikörpern unter Verwenden der Tn-MAG-Verbindung der vorliegenden Erfindung.

Wie vorstehend angeführt enthält das Konjugat der vorliegenden Erfindung (Tn-MAG-Verbindung) vier Kopien der Sequenz 103-115 des VP1-Proteins des Poliovirus Typ 1 (T-Peptid), die mit dem Kohlenhydrat-Tn-Antigen verknüpft ist. Wir haben bei Mäusen die Fähigkeit der Tn-MAG-Verbindung getestet, auf das T-Peptid spezifische Antikörper zu produzieren. Wie in 6 dargestellt, induzierte die Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit dem Tn-MAG der vorliegenden Erfindung eine starke, für das T-Peptid (103-115) spezifische IgG-Antwort, wogegen sowohl die T4-M-Verbindung, der das Kohlenhydrat-Tn-Antigen fehlt, als auch die nur das Tn-Antigen enthaltende B4-M-Verbindung keine Anti-T-Peptid-Antikörperantwort hervorbringen konnten. Daher führt die Anwesenheit der Kohlenhydrat-Struktureinheit in dem Konjugat Tn-MAG der vorliegenden Erfindung zu einer starken Verstärkungswirkung auf die Induktion von Anti-Peptid-Antikörpern gegen das in der MAG-Verbindung enthaltene peptidische Poliovirus. Diese Daten legen nahe, daß ein derartiges Kohlenhydrat-Peptid-Konjugat allgemein zum Fördern einer Anti-Peptid-Antwort bei synthetischen MAP-Verbindungen, die aus einem Pathogen stammenden Peptidsequenzen enthalten, verwendet werden kann.
BEISPIEL 3:
Mit dem Konjugat der vorliegenden Erfindung (Tn-MAG-Verbindung) induzierter Schutz gegen das das Tn-Antigen exprimierende murine Adenokarzinom TA3/Ha bei BALB/c-Mäusen mit einer Belastungsinjektion
Zum Testen der Wirksamkeit der bei Mäusen mit der MAG-Verbindung induzierten Anti-Tn-B-Antwort wurde bei geimpften Mäusen eine Belastungsinjektion durchgeführt. 1000 Zellen je Maus der das Tn-Antigen exprimierenden murinen Adenokarzinomzelle TA3/Ha (P. Y. S. Fung et al. (1990), Cancer Research, 50:4308-4314) wurden BALB/c-Mäusen, die 4 Injektionen der B4-M- oder Tn-MAG-Verbindung erhalten hatten, intraperitoneal verabfolgt. 7 ist eine graphische Darstellung, die die Sterblichkeit gegen die Anzahl der Tage nach der Tumorbelastung veranschaulicht. BALB/c-Mäuse wurden an Tag 0, 21, 42 und 100 mit 20 µg B4-M- oder Tn-MAG-Verbindung in Gegenwart von Alaun immunisiert. 15 Tage danach erhielten die Mäuse eine Belastungsinjektion von 1000 TA3/Ha-Adenokarzinomzeilen. Die Sterblichkeit wurde während eines Zeitraums von 50 Tagen verfolgt. Wie aus 7 zu ersehen ist, überlebten nur 70% der Mäuse, wenn diese mit der B4-M-Verbindung immunisiert waren, die kein Induzieren eines Antikörpers auf Tn erlaubt. Im Gegensatz dazu überlebten 100% der Mäuse, die vier Injektionen des Konjugats der vorliegenden Erfindung erhalten hatten, an D50 nach der Tumorbelastung. Diese Daten zeigen, daß die mit der Tn-Verbindung der vorliegenden Erfindung induzierten Antikörper zu einem Erhöhen des Überlebens der Mäuse nach einer Tumorbelastung führen und eine mäßige Letalität verursachen.
BEISPIEL 4
Erkennung eines humanen Adenokarzinoms durch Antikörper, die aus einem Serum einer Maus stammen, die mit dem Konjugat der vorliegenden Erfindung (Tn-MAG-Verbindung) immunisiert worden war
Zum Ermitteln möglicher humaner Anwendungen des Konjugats der vorliegenden Erfindung wurde das Serum von Mäusen, die das letzte erhalten hatten, auf die Fähigkeit, eine humane Tumorzelle zu erkennen, untersucht. Zu diesem Zweck verwendeten wir die LS180-Zelle (ATCC CL-187), die aus einem Adenokarzinom eines Patienten stammte, der einen Darmkrebs entwickelt hatte. Eine Durchflußzytometrieanalyse der Erkennung der LS-180-Zelle durch ein Serum, das aus einer SLJ/J-Maus stammte, die drei Injektionen des vorliegenden Konjugats (Tn-MAG) erhalten hatte, zeigt, daß die induzierten Anti-Tn-Antikörper ein Tn-Antigen an der Oberfläche von LS-180-Zellen erkennen können.
BEISPIEL 5:
Synthese eines linearen Glykopeptids, das ein CD4+-T-Zellenepitop enthält, das mit einem Saccharidantigen zum Induzieren von Anti-Saccharid-Antikörpern assoziiert ist
Die Grundverbindung zum Induzieren von Anti-Saccharid-Antikörpern ist eine lineare Peptidsequenz, die ein mit einer Saccharidkette verknüpftes CD4+-T-Zellenepitop enthält. Die BT-Verbindung besteht aus der KLFAVWKITYKDT-Sequenz, die aus Poliovirus Typ 1 (CD4⁺T-Zellenepitop) stammt und am N-Terminus mit drei GalNac-Ser/Thr-Resten verknüpft ist (tumorassoziiertes Saccharid-Tn-Antigen). Die BT-Verbindung oder das Kontroll-PV-Peptid, KLFAVWKITYKDT-Sequenz) wurde mit Freundschem komplettem Adjuvans oder Alaun gemischt wie folgt in BALB/c-Mäuse injiziert.
BALB/c-Mäuse (5 je Gruppe) wurden in CFA oder Alaun entweder mit dem B-T-PV oder dem Kontrollpeptid-PV an Tag 0, 21, 42 und 63 immunisiert. Serum wurde 10 Tage nach der letzten Injektion gesammelt und in einem ELISA auf den Antikörpertiter gegen das B-T-TT1-Glykopeptid oder das TT1-Peptid getestet. Die Ergebnisse sind in 8 als mittlerer Titer ausgedrückt, der für fünf Mäuse in jeder Gruppe erhalten wurde.
Zum Nachweisen von Anti-Saccharidantikörpern (Anti-Tn) durch ELISA wurde eine am N-Terminus mit drei GalNac-Ser/Thr-Resten verknüpfte, bedeutungslose Peptidsequenz QYIKANSKFIIGITEL (BT-TT1) oder das nicht-glykosylierte YIKANSKFIIGITEL (TT1-Peptid) als negative Kontrolle verwendet. Wie in 8 dargestellt induziert das B-T-PV-Glykopeptid Anti-Tn-Antikörper, nicht aber das PV-Peptid, das die Spezifität der Antikörperantwort zeigt.
Diese Ergebnisse zeigen, daß ein ein Saccharid-B-Zellenepitop und ein CD4+-T-Zellenepitop enthaltendes, synthetisches, lineares Glykopeptid Anti-Saccharidantikörper induzieren kann.
Obschon nur bevorzugte Ausführungsformen hierin genauer veranschaulicht und beschrieben werden, versteht es sich, daß viele Modifikationen und Änderungen im Lichte der vorstehenden Lehren und innerhalb des Bereichs der folgenden angefügten Ansprüche, ohne vom Geist und beabsichtigten Umfang der Erfindung abzuweichen, möglich sind. TABELLE: Synthetische Verbindungen und Glykoproteine

* mehrere Kopien, Kopienzahl aber nicht bestimmt

ZITATE

1. a) Bhavanandan, V. P. (1991) Glycobiology 1, 493-503; b) Hakomori, S. (1989) Adv. Cancer Res. 52, 257-331; c) Fukuda, M. (1996) Cancer Res. 56, 2237-2244.
2. MacLean, G. D., Reddish, M. A., Bowen-Yacyshyn, M. B., Poppema, S., Longenecker, B. M. (1994) Cancer Invest. 12, 46-56.
3. a) Springer, G. F. (1984) Science 224, 1198-1206; b) Itzkowitz, S. H., Yuan, M., Montgomery, C. K., Kjeldsen, T., Takahashi, H. K., Bigbee, W. L., Kim, Y. S. (1989) Cancer Res. 49, 197-204; c) Springer, G. F. (1995) Crit. Rev. Oncogen. 6, 57-85; (d) Yamashita, Y., Chung, Y. S., Horie, R., Kannagi, R., Sowa, M. (1995) J. Natl. Cancer Inst. 87, 441-446.
4. Springer, G. F., Desai, P. R., Tegtmeyer, H., Carlstedt, S. C., Scanlon, E. F. (1994) Cancer Biother. 9, 7-15.
5. Singhal, A., Fohn, M., Hakomori, S. (1991) Cancer Res. 51, 1406-1411.
6. O'Boyle, K. P., Zamore, R., Adluri, S., Cohen, A., Kemeny, N., Welt, S., Lloyd, K. O., Oettgen, H. F., Old, L. J., Livingston, P. O. (1992) Cancer Res. 52, 5663-5667.
7. Ratcliffe, R. M., Baker, D. A., Lemieux, R. U. (1981) Carbohydr. Res. 93, 35-41.
8. Fung, P. Y. S., Madej, M., Koganty, R. R., Longenecker, B. M. (1990) Cancer Res. 50, 4308-4314.
9. MacLean, G. D., Bowen-Yacyshyn, M. B., Samuel, J., Meikle, A., Stuart, G., Nation, J., Poppema, S., Jerry, M., Koganty, R., Wong, T., Longenecker, B. M. (1992) J. Immunotherap. 11, 292-305.
10. Longenecker, B. M., Reddish, M., Koganty, R., MacLean, G. D. (1993) in Specific immunotherapy of cancer with vaccines (Bystryn, J. C., Ferrone, S., Livingston, P. Eds), Ann. N. Y. Acad. Sci. 690, 276-291.
11. Helling, F., Zhang, S., Shang, A., Adluri, S., Calves, M., Koganty, R., Longenecker, B. M. (1995) Cancer Res. 55, 2783-2788.
12. (a) Toyokuni, T., Hakomori, S., Singhal, A. K. (1994) Bioorg. Med. Chem. 2, 1119-1132; (b) Toyokuni, T., Dean, B., Cai, S., Boivin, D., Hakomori, S., Singhal, A. K. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116, 395-396; c) Toyokuni, T., Singhal, A.K. (1995) Chem. Soc. Rev., 231-242.
13. (a) Posnett, D. N., McGrath, H., Tam, J. P. (1988) J. Biol. Chem. 263, 1719-1725; (b) Tam, J. P. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5409-5413.
14. Tam, J. P. (1994) in Peptide antigens, A Practical Approach (Wisdow, G.B.
Eds), Oxford University Press, 83-115, und hierin zitierte Literaturstellen.
15. Leclerc, C., Deriaud, D., Mimic, V., Van der Werf, S. (1991) J. Virol. 65, 711-718.
16. Roy, R., Zanini, D., Romanowska, A., Meunier, S. J., Park, W. K. C., Gidney, M. A., Harrison, B., Bundle, D. R., Williams, R. E., Posterzusammenfassung, XIII. Internationales Kohlenhydratsymposium (17.-22. Juli 1994).
17. Lett, E., Klopfenstein, C., Klein, J-P., Schöller, M., Wachsmann, D. (1995) Infect. Immun. 63, 2645-2651.
18. Tam, J. P., Clavijo, P., Lu, Y., Nussenzweig, V., Nussenzweig, R., Zavala, F. (1990) J. Exp. Med. 171, 299-306.
19. (a) Paulsen, H., Hölck, J-P. (1982) Carbohydr. Res. 109, 89-107; (b) Paulsen, H., Schultz, M., Klamann, J-D., Waller, B., Paal, M. (1985) Liebigs Ann. Chem. 2028-2048.
20. Paulsen, H., Adermann, K. (1989) Liebigs Ann. Chem. 751-759.
21. Shafizadeh, F. (1963) Methods Carbohydr. Chem. 2, 409-410.
22. a) Vowinkel, E. (1967) Chem. Ber. 100, 16-22; b) Schultz, M., Kunz, H. (1993) Tetrahedron Assym. 4, 1205-1220.
23. (a) Lemieux, R. U., Ratcliffe, R. M. (1979) Can. J. Chem. 57, 1244-1251; (b) Ferrari, B., Pavia, A.A. (1980) Carbohydr. Res. 79, C1-C7.
24. (a) Filira, F., Biondi, L., Cavaggion, F., Scolaro, B., Rocchi, R. (1990) Int. 1. Peptide Protein Res. 36, 86-96; (b) Otvos, L., Urge, L., Hollosi, M., Wroblewski, K., Graczyk, G., Fasman, G. D., Thurin, J. (1990) Tetrahedron Lett. 31, 5889-5892.
25. a) Paulsen, H., Merz, G., Weichert, U. (1988) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 27, 1365-1367; b) Jansson, A. M., Meldal, M., Bock, K. (1990) Tetrahedron. Lett. 31, 6991-6994; c) Peters, S., Bielfeldt, T., Meldal, M., Bock, K., Paulsen, H. (1992) Tetrahedron Lett. 33, 6445-6448.
26. Pancino, G., Osinaga, E., Vorauher, W., Kakouche, A., Mistro, D., Charpin, C., Roseto, A. (1990) Hybridoma 9, 389-395.
27. Numata, Y., Nakada, H., Fukui, S., Kitagawa, H., Ozaki, K., Inoue, M., Kawasaki, T., Funakoshi, I., Yamashina, I. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 981-985.
28. Nakada, H., Numata, Y., Inoue, M., Tanaka, N., Kitagawa, H., Funakoshi, I., Fukui, S., Yamashina, I. (1991) J. Biol. Chem. 266, 12402-12405.
29. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. (1980) Anal. Bio chem. 34, 595-598.
30. Walker, B. (1994) in Peptide antigens (Wisdow, G.B. Eds), Oxford University Press, The Practical Approach Series, 27-81.
31. Meienhofer, J., Waki, M., Heimer, E. P., Lambros, T. J., Makofske, R. C., Chang, C. D. (1979) Int. J. Pept. Protein Res. 13, 35-42.
32. (a) Tettamanti, G., Pigman, W. (1968) Arch. Biochem. Biophys. 124, 41-50; (b) Osinaga, E., Babino, A., Grosclaude, J., Cairoli, E., Batthyany, C., Bianchi, S., Signorelli, S., Varangot, M., Muse, I., Roseto, A. (1996) Int. J. Oncol. 8, 401-406.
33. Leclerc, C., Sedlik, C., Lo-Man, R., Chariot, B., Rojas, M., Deriaud, E. (1995) Eur. J. Immunol. 25, 2533-2538.
34. Itzkowitz, S.H., et al. Sialosyl-Tn. A novel mucin antigen associated with prognosis in colorectal cancer patients. Cancer 66, 1960-6 (1990).
35. Deshpande, P.P. & Danishefsky, S.J. Total synthesis of the potential anticancer vaccine kh-1 adenocarcinoma antigen. Nature 387, 164-166 (1997).
36. Sames, D., Chen, X.T. & Danishefsky, S.J. Convergent total synthesis of a tumour-associated mucin motif. Nature 389, 587-591 (1997).
37. Herzenberg, L.A., Tokuhisa, T. & Herzenberg, L.A. Carrier-priming leads to hapten-specific suppression. Nature 285, 664-7 (1980).
38. Schutze, M.P., Leclerc, C., Jolivet, M., Audibert, F. & Chedid, L. Carrierinduced epitopic suppression, a major issue for future synthetic vaccines. J. Immunol. 135, 2319-22 (1985).
39. Kim, Y.J. & Varki, A. Perspectives on the significance of altered glycosylation of glycoproteins in cancer. Glycoconj. J. 14, 569-576 (1997).
40. Bay, S., et at. Preparation of a multiple antigen glycopeptide (MAG) carrying the Tn antigen – a possible approach to a synthetic carbohydrate vaccine. J. Pep. Res. 49, 620-625 (1997).
41. Panina-Bordignon, P., et al. Universal immunogenic T cell epitopes: promiscuous binding to human MHC class II and promiscuous recognition by T cells. Eur J. Immunol. 19, 2237-2242 (1989).
42. Reece, J.C., Geysen, H.M. & Rodda, S.J. Mapping the major human T helper epitopes of tetanus toxin. The emerging picture. J. Immunol. 151, 6175-6184 (1993).
43. Etlinger, H.M., et al. Use of prior vaccinations for the development of new vaccines. Science 249, 423-5 (1990).
44. Goydos, J.S., Elder, E., Whiteside, T.L., Finn, O.J. & Lotze, M.T. A phase I trial of a synthetic mucin peptide vaccine. Induction of specific immune reactivity in patients with adenocarcinoma. J. Surg. Res. 63, 298-304 (1996).
45. Chong, P., et al. A strategy for rational design of fully synthetic glycopeptide conjugate vaccines. Infect. Immun. 65, 4918-4925 (1997).
46. Meinjohanns, E., Vargas-Berenguel, A., Meldal, M., Paulsen, H. & Bock, K. Comparison of N-Dts and N-Aloe in the solid phase syntheses of O-GlcNAc glycopeptide fragments of RNA-polymerase II and mammalian neurofilaments. J. Chem. Soc. Perkin Trans I, 2165-2175 (1995).

Claims

Kohlenhydrat-Peptid-Konjugat, umfassend einen Träger, der ein dendrimeres Polylysin umfasst, welches es ermöglicht, dass mehrere Epitope kovalent an denselben gebunden werden, wenigstens ein Peptid, das ein T-Epitop oder mehrere identische oder verschiedene T-Epitope umfasst, wenigstens einen Kohlenhydrat-Rest oder ein Derivat desselben, der (das) B-Epitop, mit der Maßgabe, dass es kein Sialosid ist, oder mehrere identische oder verschiedene Epitope enthält.
Konjugat gemäß Anspruch 1, wobei das dendrimere Polylysin einen Stern mit 4 Ästen bildet, wobei ein Epitop T an jedes Lysin der Äste des Trägers kovalent gebunden ist.
Konjugat gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, das wenigstens 3 Lysine und bis zu 15 Lysine umfasst, die miteinander kovalent verbunden sind.
Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei an das NH₂-Ende wenigstens zweier Lysin-Reste wenigstens ein Peptid gebunden ist, das ein Epitop T umfasst, und wobei der Kohlenhydrat-Rest an das Ende des Peptids, das dem Lysin gegenüberliegt, kovalent gebunden ist.
Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei an das NH₂-Ende wenigstens zweier Lysin-Reste wenigstens ein Kohlenhydrat-Rest gebunden ist, der kein Sialosid ist und gegebenenfalls substituiert ist und ein B- Epitop bildet, und wobei das Peptid, das ein T Epitop umfasst, an das Ende des Kohlenhydrats kovalent gebunden ist.
Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Kohlenhydrat-Rest Galactosyl ist.
Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend 3 Lysin-Reste, wenigstens 4 Epitope des T-Typs, die identisch oder verschieden sein können und an die NH₂-Enden von 2 der Lysin-Reste kovalent gebunden sind, und 4 α-Galactosyl-N-acetyl-Serin-Reste.
Konjugat gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, wobei der Kohlenhydrat-Rest ein Galactosyl-Rest ist und mit einem anderen Glycosyl-Rest substituiert ist.
Konjugat gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, wobei das Kohlenhydrat ein Tumor-Antigen ist.
Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Epitop T das 103-115 Peptid des VP1 Proteins des Poliomyelitisvirus Typ 1 ist.
Konjugat gemäß den Ansprüchen 1 bis 10, wobei das Kohlenhydrat in Kombination mit einem Tumor-peptidischen CD8*-T-Zellen-Epitop gepfropft ist.
Konjugat gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 oder 11, wobei das Kohlenhydrat einen bakteriellen oder fungalen Ursprung aufweist.
Konjugat gemäß Anspruch 12, wobei das Kohlenhydrat aus kapselförmigen bakteriellen Polysacchariden stammt, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Neisseria meningitis, Haemophilus-Influenza, Streptococcus pneumonia und anderen Streptococcus-Spezies, mit Ausnahme von sialylierten Polysacchariden.
Konjugat gemäß Anspruch 1, wobei das Kohlenhydrat aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Tn-Antigen, Di-Tn-Antigen, Tri-Tn-Antigen, T*-Antigen und Hexa-Tn-Antigen.
Kohlenhydrat-Peptid-Konjugat, umfassend wenigstens ein Peptid, das ein T-Epitop oder mehrere identische oder verschiedene T-Epitope umfasst, und wenigstens einen Kohlenhydrat-Rest oder ein Derivat desselben, der (das) B-Epitop, mit der Maßgabe, dass es kein Sialosid ist, oder mehrere identische oder verschiedene Epitope enthält.
Kohlenhydrat-Peptid-Konjugat gemäß Anspruch 15, wobei der Kohlenhydrat-Rest aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Tn-Antigen, Di-Tn-Antigen, Tri-Tn-Antigen, Hexa-Tn-Antigen und T*-Antigen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 und einen geeigneten Träger und einen Hilfsstoff.
Impfstoff, umfassend das Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16.
Immunogene Zusammensetzung, die wenigstens ein Kohlenhydrat-Peptid-Konjugat gemäß den Ansprüchen 1 bis 16 umfasst, die befähigt ist, eine Immunreaktion gegenüber einer viralen Infektion auszuwählen, die durch einen Krankheitserreger, wie Hepatitis-Virus, HIV oder CMV, verursacht wird.
Immunogene Zusammensetzung, die wenigstens ein Kohlenhydrat-Peptid-Konjugat gemäß den Ansprüchen 1 bis 16 umfasst, wobei die Zusammensetzung befähigt ist, das Überleben eines Tumor-tragenden Menschen oder Tieres zu erhöhen.
Immunogene Zusammensetzung, die wenigstens ein Kohlenhydrat-Peptid-Konjugat gemäß Anspruch 20 umfasst, wobei das Konjugat verschiedene Kohlenhydrat-Antigene umfasst, um eine effizientere Antitumor-Immunität gegenüber Krebsarten zu induzieren.
Konjugat gemäß den Ansprüchen 1 bis 16, das als ein Immunogen verwendet werden soll.
Verwendung eines Konjugats gemäß den Ansprüchen 1 bis 16 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, um die Immunreaktion eines Menschen oder Tieres gegenüber Bakterien zu verstärken.
Verwendung eines Konjugats gemäß den Ansprüchen 1 bis 16 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, um eine Antikörperreaktion in einem menschlichen oder tierischen Körper gegenüber dem wenigstens einen Kohlenhydrat-Rest, der darin enthalten ist, zu induzieren.
Antikörper, der von biologischer Flüssigkeit oder Zellen von Organismen gereinigt ist und mit einem Konjugat gemäß den Ansprüchen 1 bis 16 verabreicht wird.
Diagnose-Kit, der Antigen-spezifische Antikörper umfasst, die durch Immunisierung eines menschlichen oder tierischen Körpers mit einem Konjugat gemäß den Ansprüchen 1 bis 16 hervorgebracht werden.
Verfahren zur Diagnose von Krebs, wobei eine biologische Probe mit wenigstens einem Antikörper gemäß Anspruch 25 in Kontakt gebracht wird und wobei man die Bildung von Komplexen zwischen diesem Antikörper und Molekülen bestimmt, die in der Probe enthalten sind.