ES2265162T3 - Carbohidrato glucopeptido de antigeno multiple, vacuna que comprende el mismo y su utilizacion. - Google Patents
Carbohidrato glucopeptido de antigeno multiple, vacuna que comprende el mismo y su utilizacion. Download PDFInfo
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Abstract
Un carbohidrato glucopeptídico conjugado que comprende: un soporte que contiene una polilisina dendrimérica, que permite la unión covalente de múltiples epitopos, al menos un péptido que comprenda un epitopo T o varios epitopos T, idénticos o diferentes, al menos una porción de carbohidrato o un derivado del mismo, que contenga epitopo B, que no sea un sialosido, o varios epitopos idénticos o diferentes. Utilización de este conjugado para inducir una respuesta inmunológica.
Description
Carbohidrato glucopéptido de antígeno múltiple,
vacuna que comprende el mismo y su utilización.
La presente invención se refiere al campo de la
inmunoterapia y más particularmente a un glucoconjugado, a una
composición y a una vacuna que comprende la misma y a la utilización
de la misma para potenciar la respuesta inmunitaria y de forma
acusada en la terapia del cáncer y en la terapéutica de la infección
causada por un agente patógeno contra el que es necesaria una
respuesta inmunitaria humoral o celular. La invención se refiere
también a un kit para diagnóstico y al diagnóstico del cáncer.
Como resultado de la glucosilación anormal, los
antígenos de carbohidratos asociados al cáncer están expuestos en la
superficie de las células tumorales mientras que están ocultos en
las células normales (Ref. 1). Los avances recientes en inmunología
y en la identificación de antígenos tumorales específicos han
renovado el interés para el desarrollo de vacunas contra el cáncer,
y estos epítopos glucosídicos de linfocitos B expuestos se han
considerado dianas atractivas para la inmunoterapia denominada
"inmunoterapia activa específica" (ASI) por Longenecker (Ref.
2). Este método implica la inmunización con un antígeno definido
para provocar una respuesta inmunitaria específica a este antígeno y
podría representar una alternativa a las terapias convencionales
contra el cáncer.
Entre el gran número de marcadores tumorales
conocidos, los antígenos Tn
(a-GalNAc-Ser/Thr), el T*
(b-Gal-
(1 \rightarrow 3)-a-GalNAc-Ser/Thr) y el sialosil-Tn (a-NeuAc-(2 \rightarrow 6)-a-GalNAc-Ser/Thr) se han estudiado extensamente ya que son expresados en glucoproteínas de tipo mucinas por la mayoría de los adenocarcinomas (Ref. 3). De hecho, varios estudios han demostrado alguna protección contra los tumores después de la inmunización con estos antígenos glucosídicos, en estudios experimentales o clínicos. Estos carbohidratos asociados al tumor son marcadores apropiados para el diagnóstico y el pronóstico del cáncer (Ref. 34). Utilizando glóbulos rojos desialilados, que son ricos en determinantes T y Tn, Springer observó una protección eficaz de larga duración contra la recaída del carcinoma de mama humano (Ref. 3c, Ref. 4). Otro grupo investigó el potencial de ASI con mucina submaxilar bovina desialilada (d-OSM) que contiene gran densidad de epítopo Tn; sus estudios demostraron que este antígeno proporcionaba una buena protección y una supervivencia de larga duración en los ratones con carcinoma de mama (Ref. 5). Parcialmente d-OSM también proporcionó protección eficaz contra el carcinoma de colon humano (Ref. 6). Ratcliffe et al. fueron los primeros en utilizar un antígeno asociado al tumor sintético, un conjugado de antígeno T-proteína, para estimular una respuesta inmunitaria eficaz en conejos (Ref. 7). A continuación Longenecker estudió extensamente conjugados de hapteno carbohidrato sintéticos similares y observó que producen un aumento de supervivencia de los ratones injertados con células de carcinoma de mama (Ref. 8) y de pacientes con cánceres de ovario (Ref. 9). Estudios similares del mismo grupo han demostrado además un aumento de la protección de los pacientes que padecen de cáncer de mama (Ref. 10) o melanoma (Ref. 11) después de la administración respectiva de conjugados de proteína con sialosil Tn o con gangliósido GM2. Por otra parte, Toyokuni et al. generó una respuesta antitumoral del anticuerpo en ratones después de la inmunización con un antígeno Tn acoplado a OSA (albúmina de suero bovino) o a un lipopéptido sintético (Ref. 12). Este último resultado era interesante ya que era el primer ejemplo de un antígeno carbohidrato sintético pequeño que genera una respuesta inmunitaria contra un antígeno carbohidrato asociado al tumor, sin la utilización de un vehículo macromolecular o adyuvantes.
(1 \rightarrow 3)-a-GalNAc-Ser/Thr) y el sialosil-Tn (a-NeuAc-(2 \rightarrow 6)-a-GalNAc-Ser/Thr) se han estudiado extensamente ya que son expresados en glucoproteínas de tipo mucinas por la mayoría de los adenocarcinomas (Ref. 3). De hecho, varios estudios han demostrado alguna protección contra los tumores después de la inmunización con estos antígenos glucosídicos, en estudios experimentales o clínicos. Estos carbohidratos asociados al tumor son marcadores apropiados para el diagnóstico y el pronóstico del cáncer (Ref. 34). Utilizando glóbulos rojos desialilados, que son ricos en determinantes T y Tn, Springer observó una protección eficaz de larga duración contra la recaída del carcinoma de mama humano (Ref. 3c, Ref. 4). Otro grupo investigó el potencial de ASI con mucina submaxilar bovina desialilada (d-OSM) que contiene gran densidad de epítopo Tn; sus estudios demostraron que este antígeno proporcionaba una buena protección y una supervivencia de larga duración en los ratones con carcinoma de mama (Ref. 5). Parcialmente d-OSM también proporcionó protección eficaz contra el carcinoma de colon humano (Ref. 6). Ratcliffe et al. fueron los primeros en utilizar un antígeno asociado al tumor sintético, un conjugado de antígeno T-proteína, para estimular una respuesta inmunitaria eficaz en conejos (Ref. 7). A continuación Longenecker estudió extensamente conjugados de hapteno carbohidrato sintéticos similares y observó que producen un aumento de supervivencia de los ratones injertados con células de carcinoma de mama (Ref. 8) y de pacientes con cánceres de ovario (Ref. 9). Estudios similares del mismo grupo han demostrado además un aumento de la protección de los pacientes que padecen de cáncer de mama (Ref. 10) o melanoma (Ref. 11) después de la administración respectiva de conjugados de proteína con sialosil Tn o con gangliósido GM2. Por otra parte, Toyokuni et al. generó una respuesta antitumoral del anticuerpo en ratones después de la inmunización con un antígeno Tn acoplado a OSA (albúmina de suero bovino) o a un lipopéptido sintético (Ref. 12). Este último resultado era interesante ya que era el primer ejemplo de un antígeno carbohidrato sintético pequeño que genera una respuesta inmunitaria contra un antígeno carbohidrato asociado al tumor, sin la utilización de un vehículo macromolecular o adyuvantes.
Estos estudios sugirieron que los antígenos
carbohidratos son candidatos apropiados para el desarrollo de la
vacuna antitumoral. Sin embargo, los antígenos de carbohidrato no
poseen epítopo de linfocito T y por lo tanto provocan solamente una
respuesta débil del anticuerpo independiente del linfocito T. Se han
explorado varios métodos para aumentar la inmunogenicidad de dichos
carbohidratos. La utilización de material biológico que expresa
grupos de antígenos en un eje central proteico (como glóbulos rojos
desialilados u OSM es una posibilidad). Pero el método más
ampliamente utilizado consiste en conjugar el carbohidrato con una
proteína portadora, tal como albúmina de suero bovina (BSA) o la
hemocianina de la lapa californiana (KLH).
Aunque estos inmunógenos han demostrado ser algo
prometedores, los vehículos proteicos presentan mayores
inconvenientes. El epítopo injertado representa solamente una
pequeña parte del conjugado total y está distribuido al azar en la
superficie del vehículo. Por consiguiente, las respuestas
inmunitarias a la molécula del vehículo pueden producir un nivel
bajo de anticuerpos deseados en comparación con la cantidad total de
anticuerpos producidos. Además, estos conjugados presentan
ambigüedad tanto en la composición como en la estructura y no
siempre producen respuesta inmunitaria reproducible. Los avances
recientes en la síntesis total de los oligosacáridos expresados por
las células tumorales (Ref. 35, Ref. 36) abren nuevas posibilidades
para dicho logro. Sin embargo, las moléculas hapténicas tales como
los carbohidratos requieren su asociación en estructuras más
complejas para estimular las respuestas inmunitarias. La
utilización de conjugados proteicos tradicionales aumenta el
problema de la supresión específica del hapteno (Ref. 37, Ref. 38) y
su composición química escasamente definida y la estructura puede
limitar su
eficacia.
eficacia.
\newpage
Hasta ahora, como para las estructuras definidas
químicamente, se han utilizado ampliamente ejes centrales de
polilisina dendrimérica, que se describirán con más detalle después
en la presente memoria, para presentar péptidos (Ref. 14). Sin
embargo, según nuestros conocimientos, existe únicamente un intento
preliminar de su utilización para presentar carbohidratos al sistema
inmunitario (Ref. 16). Esta última referencia da a conocer la
síntesis de tres péptidos de antígeno múltiple sialilados con
epítopos de linfocito T toxina del tétanos. Sin embargo, se obtuvo
únicamente una respuesta contra el epítopo de linfocito T, pero no
contra el epítopo de linfocito B. Una estrategia similar también se
publicó recientemente (Ref. 17) donde los autores acoplaron mezclas
de polisacáridos naturales obtenidos de Streptococcus y
Saccharomyces para un sistema peptídico antigénico
múltiple.
Por lo tanto, existe todavía necesidad de un
nuevo conjugado que solucione los inconvenientes mencionados
anteriormente de las construcciones de la técnica anterior que
presenta una estructura definida químicamente, que sea capaz de
estimular tanto la respuesta del anticuerpo como la respuesta de T
cuando se administra a un cuerpo humano o animal, incluyendo a la
vez las respuestas inmunitarias indeseables.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere generalmente a un conjugado de carbohidrato péptido que
comprende:
un vehículo que comprende una
poli-lisina dendrimérica que facilita epítopos
múltiples que están unidos por enlaces covalentes a ésta,
por lo menos un péptido que comprende un epítopo
T o varios epítopos T idénticos o diferentes,
por lo menos un epítopo B que contiene un grupo
carbohidrato, con la condición de que no sea un sialósido, o varios
epítopos B idénticos o diferentes.
El péptido que comprende el o los
epítopo(s) T puede estar unido a una lisina de dicho
vehículo, como el o los epítopo(s) B que contiene(n)
el grupo carbohidrato.
Este método de presentación de epítopos se
denomina en la presente memoria Glucopéptido Antígeno Múltiple
(MAG). El conjugado de la presente invención es especialmente útil
para potenciar la respuesta del anticuerpo en un cuerpo humano o
animal al que se ha administrado y en particular como vacuna.
Además, dado que un glucopéptido ligado al O
antigénico múltiple (MAG), según la presente invención, que lleva
por ejemplo el antígeno Tn del carbohidrato asociado a un epítopo de
linfocito T CD4^{+} se demostró que era capaz de producir
anticuerpos de IgG anti-Tn que reconocen líneas
celulares tumorales humanas, según la presente invención también se
refiere a una composición capaz de aumentar la supervivencia de un
ser humano o animal con tumor. Un protocolo de inmunización
terapéutico realizado con este inmunógeno completamente sintético
aumentó la supervivencia de los ratones con tumor.
Más particularmente la presente invención se
refiere a un conjugado de carbohidrato péptido que comprende:
- -
- por lo menos 3 restos de lisina unidos por enlaces covalentes entre sí,
- -
- por lo menos un péptido que comprende un epítopo T unido a un resto de lisina, y
- -
- por lo menos un epítopo B que contiene un grupo carbohidrato, opcionalmente sustituido, unido por enlace covalente al terminal de dicho péptido opuesto a la lisina, y con la condición de que dicho grupo carbohidrato no sea un radical sialósido.
Según otra forma de realización de la invención,
el conjugado comprende:
- -
- por lo menos un péptido que comprende un epítopo T, o varios epítopos T idénticos o diferentes, y
- -
- por lo menos un grupo carbohidrato, o un derivado del mismo, que contiene el epítopo B, con la condición de que no sea sialósido o varios epítopos idénticos o diferentes.
Otro objeto de la presente invención es una
composición farmacéutica que comprende el conjugado de la presente
invención.
Un objeto adicional de la presente invención es
una vacuna que comprende el conjugado según la presente
invención.
Un objetivo más todavía de la presente invención
consiste en potenciar la respuesta inmunitaria de un cuerpo humano o
animal, en particular las respuestas de linfocitos B y/o T, en la
que el conjugado según la presente invención debe administrarse a
dicho cuerpo humano o animal.
Otro objeto de la presente invención consiste en
una utilización para provocar respuestas de los linfocitos B contra
epítopos sacarídicos en un cuerpo humano o animal, en la que el
conjugado según la invención debe administrarse a dicho cuerpo
humano o animal.
Un objeto adicional todavía de la presente
invención consiste en la utilización para la vacunación de un cuerpo
humano o animal en la que el conjugado según la presente invención
debe administrarse a dicho cuerpo humano o animal.
Otro objeto de la presente invención consiste en
un kit de diagnóstico que comprende anticuerpos específicos contra
el antígeno producidos mediante inmunización de un cuerpo humano o
animal con una composición según la presente invención.
Un objeto adicional de la presente invención
consiste en un diagnóstico del cáncer en el que una muestra
biológica se pone en contacto con por lo menos uno de estos
anticuerpos y en el que se determina la formación de complejos entre
este anticuerpo y las moléculas comprendidas en dicha muestra.
Un objeto adicional todavía consiste en una
composición inmunógena como la descrita anteriormente, capaz de
provocar una respuesta inmunitaria contra una infección vírica
producida por un patógeno tal como el virus de la hepatitis, VIH o
VMC.
La presente invención se describirá a
continuación con detalle en la descripción siguiente con referencia
a los dibujos siguientes.
La Figura 1 es una representación esquemática de
compuestos MAG (B4-T4-M,
B8-T8-M,
B2-T2-M y
B4-T4-M (con diferente organización
de epítopos T y B) (a a d), tri-Tn(e) y
hexa-Tn(f) según la presente invención.
La Figura 2 representa el antígeno Tn y sus
derivados.
La Figura 3 presenta el reconocimiento de
B4-T4-M por dos anticuerpos
monoclonales anti-Tn.
La Figura 4a representa la antigenicidad T de
B4-T4-M in vitro.
La Figura 4b ilustra la respuesta
anti-T in vivo de
B4-T4-M.
Las Figuras 5a, 5b y 5c presentan la producción
en ratones BALB/c, SJL/J y DBA/1, respectivamente, de anticuerpo
anti-Tn por el compuesto Tn-MAG.
La Figura 6 ilustra la producción en ratones
BALB/c de respuestas del anticuerpo por el antígeno Tn que contiene
el compuesto Tn-MAG y el epítopo T, CD4^{+} del
poliovirus.
La Figura 7 ilustra los resultados de la
protección producida con el compuesto Tn-MAG contra
el adenocarcinoma TA3/Ha murino que expresa el antígeno Tn en
ratones BALB/c inyectados para la prueba de provocación.
Las Figuras 8A y 8B ilustran los resultados de
la inmunización de ratones Balb/C con el péptido TT1 o glucopéptido
B-T-TT_{1}, respectivamente
cebados con CFA (fig. 8A) y con alúmina (fig. 8B).
Las expresiones antígeno B carbohidrato, epítopo
B, antígeno de linfocito B, epítopo de linfocito B se utilizan en la
presente memoria para designar en general antígenos glucosídicos
capaces de provocar una respuesta del linfocito B, estando
constituidos los antígenos por sialósidos que están excluidos.
Antígeno T o epítopo T, antígeno de linfocito T,
epítopo de linfocito T significa un antígeno generalmente de
naturaleza peptídica capaz de provocar una respuesta del linfocito
T.
Los compuestos sintéticos B-T,
M, B4-M, T4-M y
B4-T4-M se utilizaron también como
antígenos (véase la Tabla más adelante).
\newpage
La abreviatura M tal como se utiliza en la
presente memoria es un ejemplo de MAP (péptido antígeno múltiple) y
designa la estructura siguiente:
Cuando procedía, en la presente memoria se
utilizó el código universal, de una letra para los aminoácidos (K
para lisina, etc.).
Otras abreviaturas se utilizan también en la
presente invención:
BSA, albúmina de suero bovino; OSA, albúmina de
suero ovino; OVA, ovoalbúmina, OSM, mucina submaxilar ovina;
d-OSM, mucina submaxilar ovina desialilada; ES MS,
espectrometría de masas con electroatomización; Fmoc,
fluoren-9-il-metoxicarbonilo;
PBS, solución salina tamponada con fosfato.
La expresión "respuesta al anticuerpo",
"respuesta a B o al linfocito B" se utilizan indistintamente en
la presente memoria. Lo mismo se aplica a "respuesta celular",
"respuesta a T o al linfocito T".
La presente invención se refiere en su aspecto
principal a un conjugado de carbohidrato péptido que comprende:
un vehículo apropiado a base de
poli-lisina dendrimérica que permite que los
epítopos múltiples se unan por enlace covalente a ésta,
por lo menos un péptido que comprende un epítopo
T o varios epítopo T idénticos o diferentes,
por lo menos un epítopo B que contiene un grupo
carbohidrato, con la condición de que no sea un sialósido o varios
epítopos B idénticos o diferentes.
Varios epítopos T o B idénticos significa entre
dos y ocho del mismo epítopo.
Varios epítopos T diferentes significan entre
dos y ocho epítopos T de diferentes orígenes.
Varios epítopos B diferentes significan entre
dos y ocho epítopos B de diferentes orígenes.
El núcleo de poli-lisina del
presente conjugado se denomina dendrímero porque puede estar
representado (Figura 1) como una estrella con ramas múltiples todas
sustancialmente idénticas.
Como se puso de manifiesto al principio, el
sistema múltiple de péptido antígeno ha sido descrito en 1988 por
Tam (Ref. 13) que está basado también en determinada estructura
dendrimérica en la que el antígeno peptídico está conjugado
covalentemente con las ramas de la última.
Ejemplos de vehículos adecuados comprenden los
que presentan una estructura basada en un núcleo de
poli-lisina que forma una estrella de ramas
múltiples, tal como, por ejemplo una estrella de 8 ó 4 ramas.
Por lo tanto, la presente invención en una de
sus formas de realización preferidas, se refiere a un conjugado que
comprende una estructura dendrítica basada en un núcleo de
polilisina que forma una estrella de 4 puntas, con un epítopo T
unido por enlace covalente a cada una de las ramas y asociado a un
grupo carbohidrato (con la condición de que no sea un radical
sialósido) que contiene un epítopo B.
Según una forma de realización adicional
preferida de la presente invención, el glucopéptido antígeno
múltiple (MAG) que forma el conjugado según la presente invención
comprende por lo menos 3 lisinas y hasta 15 restos de lisina unidos
por enlace covalente entre sí. Más preferentemente el presente
conjugado comprende 3 lisinas.
En una forma de realización preferida, al
terminal NH_{2} de cada resto de lisina se une por lo menos un
péptido que comprende un epítopo T unido a una lisina y por lo menos
un resto de carbohidrato, que no es un sialósido, óptimamente
sustituido, unido por enlace covalente al terminal de dicho péptido
opuesto a la lisina y que forma un epítopo B.
En otra forma de realización preferida, al
terminal NH_{2} de cada resto de lisina se une por lo menos un
resto de carbohidrato, que no es un sialósido, opcionalmente
sustituido y que forma un epítopo B unido a una lisina y por lo
menos un péptido que comprende un epítopo T unido por enlace
covalente al terminal de dicho carbohidrato opuesto a la lisina.
La estructura de MAG referida en la presente
memoria se entenderá mejor por referencia a la Fig. 1.
En la Fig. 1 están representados
esquemáticamente los ejemplos de una estrella de 4 a 8 ramas que
comprende de 3 a 7 lisinas que llevan 4 a 8 grupos amino unidos a
los epítopos deseados (epítopos B, opcionalmente sustituidos con un
péptido y epítopos T). Esta estructura proporciona una gran densidad
de los antígenos en la superficie del núcleo de lisina.
Además esta estructura ofrece varias ventajas.
En primer lugar, el contenido en carbohidratos es mucho mayor en el
sistema MAG (normalmente más del 90%) que en los conjugados
proteicos tradicionales. Esta estructura de gran densidad de
antígenos glucopéptidos producen respuestas del anticuerpo mayores
confirmando la observación anterior que compara un sistema MAP con
los mismos antígenos unidos por enlace covalente a una proteína
portadora (Ref. 13b, Ref. 14).
Una ventaja adicional del MAG es que la matriz
del núcleo, que representa una fracción del montaje total presenta
baja inmunogenicidad, impidiendo de este modo respuestas
inmunitarias indeseables (Ref. 13a). Otra ventaja del presente
montaje es que el inmunógeno sintético resultante presenta una
estructura química bien definida.
La presencia tanto de epítopos de carbohidrato B
como de epítopos T en el glucoconjugado de la presente invención
hace a este último un inmunógeno eficaz como se demostrará después
en el apartado experimental.
El grupo carbohidrato, que contiene el epítopo B
del conjugado según la presente invención, puede originarse, por
ejemplo, a partir de antígenos glucosídicos del tumor (cáncer)
de:
- -
- la clase de glucolípidos, incluyendo glucolípidos ácidos tales como, por ejemplo, gangliósidos GD2, GD3 y GM3 (melanoma) y glucolípidos neutros, tales como, por ejemplo, antígenos de Lewis^{y} (Le^{y}) (mama, próstata, ovario) y el Globo H (mama, próstata, ovario). Los derivados sialilados que pertenecen a esta clase están excluidos.
- -
- la clase de péptidos (o aminoácidos) de O-glucosilo tales como, por ejemplo, el antígeno Tn (\alphaGalNAc-Ser o \alphaGal NAc-Thr), antígeno T* (\beta-Gal-(1-3)-\alpha-GalNac-Ser o \betaGal(1-3)\alphaGal-NAc-Thr), dos marcadores tumorales frecuentemente presentes en carcinomas pero normalmente no en tejidos normales [Springer G. F. Science 224, 1198-1206 (1984)] (ovario, mama, pulmón) o di-Tn (\alpha GalNAc-Ser/Thr)_{2}, tri-Tn(\alpha GalNac-Ser/Thr)_{3} o hexa-Tn(\alphaGalNAc-Ser/Thr)_{6}.
El epítopo B del conjugado según la presente
invención puede originarse también a partir de polisacáridos
bacterianos capsulares de, por ejemplo, Neisseria meningitis,
Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, y del grupo
Streptococcus, a excepción de los polisacáridos
sialilados.
Los polisacáridos son restos de carbohidrato
obtenidos mediante procesos de síntesis.
El epítopo B del presente conjugado puede
también ser de origen micótico, tal como por ejemplo, el aislado de
la levadura Saccharomyces.
Los epítopos B del conjugado según la presente
invención son preferentemente marcadores tumorales, tales como, por
ejemplo, los antígenos Tn y T*.
El grupo carbohidrato preferido que forma el
epítopo B del conjugado según la presente invención puede estar
compuesto por un resto de galactosilo, o un derivado del mismo, que
no esté sialilado.
Puede seleccionarse del grupo constituido por
los antígenos Tn, di-Tn, tri-Tn,
hexa-Tn o T*.
De este modo en una de sus formas de realización
preferida la invención se refiere a un conjugado de carbohidrato
péptido que comprende:
- -
- por lo menos 3 restos de lisina unidos por enlace covalente entre sí,
- -
- por lo menos un péptido que comprende un epítopo T unido a un resto de lisina, y
- -
- por lo menos un resto de galactosilo, opcionalmente sustituido, unido por enlace covalente a dicho péptido y que forma el epítopo B con la condición de que dicho grupo carbohidrato no sea un radical sialó- sido.
En un aspecto relacionado de esta forma de
realización el resto galactosilo está sustituido por otro resto
glicosilo.
En un aspecto relacionado, el conjugado de la
presente invención comprende 3 restos de lisina, por lo menos 4
epítopos de tipo T, que pueden ser iguales o diferentes unidos a los
terminales NH_{2} de 2 de los restos de lisina y 4 restos
\alpha-galactosil-N-acetil-serina.
El grupo carbohidrato del conjugado de la
presente invención puede estar injertado además en la estructura
dendrimérica en combinación con uno o más epítopos de las células
CD3* peptídicos tumorales reconocidos por los linfocitos T
citotóxicos específicos para el tumor. Estos epítopos de linfocitos
T CD3^{+} peptídicos reconocidos como marcadores tumorales pueden
seleccionarse en el grupo constituido por:
- Péptidos MUC-1 (páncreas, mama)
- MAGE 1 y 3 (melanoma, pulmón) (T. Boon et al. (1995). Immunology Today, vol. 16 nº 7, págs. 334-336)
- pme117/gp 100 (melanoma)
- Tirosinasa (melanoma)
- BAGE (melanoma)
- GAGE (melanoma)
- LB-33-B (melanoma)
- CDK4
- p185^{HER} (mama, ovario)
- CEA
- MART1/Melan-A (melanoma)
o seleccionarse en el grupo constituido por los
antígenos tumorales descritos en A. Van Pel et al. (1995)
Immunological Reviews nº 145, págs. 229-250 o
en P. G. Coulie (1995), Stem Cells, 13, págs.
393-403.
Como se mencionó al principio, en el conjugado
de la presente invención un epítopo T CD4^{+} está conjugado con
un epítopo B de carbohidrato descrito anteriormente para provocar
una respuesta inmunitaria eficaz.
Dicho epítopo puede comprender entre casi 5 y 50
aminoácidos.
Uno de tales epítopos T preferidos es el epítopo
T, CD4^{+} que es el péptido sintético que corresponde a la
secuencia 103 a 115 de la proteína VP1 del poliovirus tipo 1 o
alternativamente puede ser un péptido que comprende el epítopo T,
CD4^{+} seleccionado entre el grupo constituido por:
- -
- fragmentos de la toxina del tétanos tales como, por ejemplo:
- -
- la secuencia 830 a 844 de la toxina del tétanos (QYIKANSKFIGITEL)
- -
- la secuencia 947 a 967 de la toxina del tétanos (FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE)
- -
- la secuencia 1273 a 1284 de la toxina del tétanos (GQIGNDPNRDIL)
- -
- fragmentos del polisacárido 4 de tipo pneumocócico y conjugados toxoides oligosacáridos del tétanos como describe C. C. A. M. Peeters (1991) en el Journal of Immunology, 146, 4309-4314.
- -
- liposacáridos meningocócicos como los descritos por A. F. M. Verheul (1991) en Detection and Immunity, vol. 59, nº 10, págs. 3566-3573.
Estos epítopos T peptídicos se unen típicamente
a una multitud de MHC (complejo de histocompatibilidad principal)
humanos y moléculas murinas de clase II que impiden en consecuencia
los problemas de restricción encontrados en la respuesta celular a
T, CD4^{+}, asociada al polimorfismo de las moléculas MHC que
existen entre individuos. Además la utilización de los péptidos de
la toxina del tétanos deberían aumentar la inmunogenicidad de los
antígenos presentes en el conjugado de la presente invención, como
resultado de la vacunación de numerosos individuos con la vacuna
contra el tétanos.
Según otra forma de realización de la presente
invención, el conjugado comprende: por lo menos un péptido que
comprende un epítopo T, o varios epítopos T idénticos o diferentes,
y
por lo menos un grupo carbohidrato, o un
derivado del mismo, que contiene el epítopo B, con la condición de
que no sea sialósido, o varios epítopos idénticos o diferentes.
Dicho conjugado puede ser Tn3-T,
en el que T puede ser un poliovirus o el antígeno del tétanos. Puede
ser también Tn6-T, en el que T es un antígeno de
poliovirus con la secuencia siguiente: KFLAVWKITYKDT.
La fórmula de Tn6-T es por lo
tanto:
(Tn_{3}-G)_{2} –
KFLAVWKITYKDT, en la que Tn_{3} es un trímero lineal de (\alpha
GalNAc Ser) o (\alpha GalNAc Thr).
Éstos pueden obtenerse por síntesis peptídica;
en la que se crea un enlace peptídico entre la serina glucosilada, o
la treonina, y el péptido T.
Como se hizo constar al principio la invención
también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un
conjugado según la presente invención. Dicha composición comprende
una cantidad eficaz del presente conjugado, por ejemplo, en un
vehículo farmacéuticamente aceptable y puede ser de forma líquida o
emulsión, en presencia o no de un adyuvante (incluyendo el hidróxido
de aluminio y las citocinas). La vía de administración de dicha
composición puede ser cualquiera de las vías utilizadas
habitualmente (incluyendo la administración intratumoral tal como la
inyección). Dicha composición inmunógena, que comprende por lo menos
un conjugado de péptido carbohidrato, en la que dicho conjugado
comprende varios antígenos de carbohidrato puede utilizarse para
producir una inmunicidad antitumoral más eficaz contra los
cánceres.
La cantidad de conjugado puede estar comprendida
entre 10 \mug y 1 ng.
La presente invención se refiere también a una
vacuna que comprende un conjugado según la presente invención.
Un objeto adicional de la presente invención
consiste en una utilización para potenciar la respuesta inmunitaria
de un cuerpo humano o animal, en particular la respuesta mediada por
linfocitos T y/o B, en particular contra bacterias, en la que el
conjugado según la presente invención debe administrarse a dicho
cuerpo humano o animal.
Otro objeto adicional todavía de la presente
invención se refiere a una utilización para provocar una respuesta
de los linfocitos B en un cuerpo humano o animal, en la que debe
administrarse por lo menos un conjugado según la invención.
La invención se refiere también a la utilización
para provocar una respuesta de linfocitos B en un huésped
caracterizada porque en dicho huésped debe administrarse por lo
menos un conjugado de carbohidrato péptido que
comprende:
comprende:
- por lo menos 3 restos de lisina unidos por enlace covalente entre sí,
- por lo menos un péptido que comprende un epítopo T unido a un resto de lisina, y
- por lo menos un grupo carbohidrato opcionalmente sustituido, que no sea un sialósido.
Otro objeto de la presente invención se refiere
a la vacunación de un cuerpo humano o animal en la que debe
administrarse el conjugado según la presente invención a dicho
cuerpo humano o animal.
Un objeto adicional aún de la presente invención
consiste en un kit de diagnóstico que comprende anticuerpos
específicos contra el antígeno producidos por inmunización de un
cuerpo humano o animal con una composición según la presente
invención.
Dichos anticuerpos se consideran también como
materias de la presente invención. Pueden utilizarse en un método de
diagnóstico del cáncer que comprende poner en contacto por lo menos
uno de estos anticuerpos con una muestra biológica y determinar la
formación de los complejos entre este anticuerpo y las moléculas
comprendidas en esta muestra.
La presente invención se ilustrará a
continuación con más detalle mediante los ejemplos siguientes.
La estrategia para la construcción del conjugado
MAG supuso en primer lugar la síntesis del antígeno Tn que
representa el epítopo del linfocito B. Este marcador tumoral
glucosídico se conjugó a continuación con un núcleo de
poli-lisina (M) junto con el epítopo del linfocito
T, CD4^{+} peptídico, dando la construcción completa
B4-T4-M. Además, se sintetizaron los
compuestos de referencia que son necesarios para los ensayos
inmunológicos (B, T, B-T, B4-M,
T4-M, M).
La síntesis del antígeno 2 de Tn (Figura 2) se
realizó por los métodos clásicos (Ref. 19, Ref. 20) partiendo del
tri-O-acetil-D-galactal
(Ref. 21). Se utilizó el éster terc-butílico de
N-(fluorenilmetoxicarbonil)-L-serina
(Ref. 22) para la reacción de Koenigs-Knorr con el
cloruro de
3,4,6-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxi-b-D-galactopiranosilo
(Ref. 23), proporcionando el derivado 1 protegido. La desprotección
final del acetilo y del éster t-butílico proporcionó
el antígeno Tn 2 protegido apropiadamente para la síntesis del
péptido.
Se montó el
B4-T4-M 4 por la metodología de
péptido en fase sólida convencional (Ref. 40) utilizando la química
del Fmoc que es compatible con la síntesis del glucopéptido. Después
de la unión del espaciador \beta-alanil en la
resina de Wang, se construyó el núcleo de lisina acoplando
sucesivamente dos niveles de FmocLys(Fmoc)OH,
proporcionando cuatro grupos amino (Ref. 13b). El núcleo de lisina
se alargó más por los aminoácidos protegidos de forma apropiada de
la secuencia del epítopo T (KLFAVWKITYKDT) del poliovirus,
añadiéndose sucesivamente cuatro copias del mismo aminoácido. Por
último se incorporó 2 al péptido dendrimérico como bloque de
construcción.
Fue interesante la incorporación del derivado 2
del antígeno Tn que pudo conseguirse con el azúcar totalmente
desprotegido. Esto presenta muchas ventajas ya que impide las
reacciones laterales eventuales (racemización y/o
b-eliminación) asociadas a la desacetilación final
del resto de azúcar. Unos pocos ejemplos de la utilización de
unidades glucosídicas no protegidas han sido ya publicados (Ref.
24). Una vez terminada la síntesis, se liberó el MAG 4 de la resina
con ácido trifluoroacético acuoso (95%) y las cadenas laterales
peptídicas se desprotegieron simultáneamente. No se observa
normalmente ninguna escisión glucosídica durante un tiempo de
reacción de 1,5 horas (Ref. 25). Se siguió un procedimiento similar
para los compuestos de referencia. Todos los péptidos y
glucopéptidos se caracterizaron por el análisis de aminoácidos y
espectrometría de masas con electroatomización.
Para la síntesis de 2, se adquirieron reactivos
en Aldrich o Sigma. Todos los disolventes eran de alta calidad y
anhidros. Se destiló CH_{2}Cl_{2} sobre CaH_{2} y tolueno
sobre sodio con benzofenona, antes de su utilización. Para la
síntesis de péptidos, se adquirieron derivados de aminoácidos
protegidos con Fmoc y resina de Wang en Bachem o Novabiochem. La
cadena lateral de aminoácidos se protegió mediante un grupo
t-butilo excepto para los restos de triptófano y lisina del
epítopo T que se protegieron mediante un grupo
t-butiloxicarbonilo (Boc). La DMF y el acetonitrilo para la
HPLC se adquirieron en Merck. Se purificaron los compuestos finales
por cromatografía de alta resolución en fase inversa (HPLC)
utilizando un sistema de bombeo de Perkin-Elmer con
un detector UV (230 ó 280 nm). Se utilizó una columna (250 \times
10 mm) de Nucleosil C_{18} (5 mm, 300 \ring{A}) se eluyeron con
un gradiente de MeCN/tampón de ácido trifluoroacético al 0,1%
durante 20 min. (caudal 6 ml/min). Los espectros ^{1}H RMN
(300,134 MHz, sal sódica del ácido
3-(trimetilsilil)propiónico como patrón para los espectros en
D_{2}O) se registraron en un instrumento de Broker. Se midieron
los espectros de masas mediante bombardeo con átomos rápidos o por
electroatomización. Los análisis de aminoácidos se obtuvieron
utilizando un analizador Beckman 6300, tras la hidrólisis de los
péptidos con HCl 6 N (se añadió fenol al 0,2% cuando el péptido
contiene un resto de tirosina) a 110ºC en tubos de vidrio sellados
durante 20 h.
La síntesis de péptidos y glucopéptidos en fase
sólida se realizó en manual utilizando el protocolo de la química de
Fmoc normalizado (Ref. 40) en una resina de poliestireno con grupos
funcionales de alcohol p-benciloxibencílico (resina de Wang).
A excepción del resto de b-alanina
C-terminal, los aminoácidos
N^{a}-Fmoc (que llevan grupos protectores de la
cadena lateral estándar) y el bloque 2 de construcción glucosilado
(3 equiv.) se incorporaron a la cadena peptídica utilizando TBTU
como agente de activación y DMF como disolvente. Todos los
acoplamientos se controlaron mediante la prueba de Kaiser (Ref. 29)
y se completaron normalmente en 1 h. Todas las escisiones de Fmoc se
realizaron mediante el tratamiento de la resina con piperidina al
20% en DMF. Después de cada desprotección, la resina se lavó
sucesivamente con DMF, CH_{2}Cl_{2} y DMF. Al final de la
síntesis, la resina se lavó extensamente con DMF y CH_{2}Cl_{2},
se secó y se trató con una solución acuosa de TFA durante 2 h. Tras
la filtración de la resina, se concentró la solución y se precipitó
el producto en bruto con éter dietílico. Se filtró el precipitado,
se disolvió en agua y se liofilizó. Se purificaron los péptidos en
HPLC de fase inversa (las condiciones de elución se indican a
continuación, para cada compuesto) y se caracterizaron mediante
análisis de aminoácidos y espectrometría de masas con
electroatomización.
N^{a}-(fluoren-9-ilmetoxicarbonil)-3-O-(2-acetamido-2-desoxi-a-D-galactopiranosil)-L-serina
2:
Se preparó el éster terc-butilico de
N^{a}-(fluoren-9-ilmetoxicarbonil)-3-O-(2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetil-2-desoxi-a-D-galactopiranosil)-L-serina
1 como se describió anteriormente (Ref. 23) por glucosilación del
éster terc-butílico de
N^{a}-(fluoren-9-ilmetoxicarbonil)-L-serina
(Ref. 22) con cloruro de
3,4,6-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxi-b-D-galactopiranosilo
(obtenido a partir del
tri-O-acetil-D-galactal)
(21) utilizando Ag_{2}CO_{3}/AgClO_{4} como catalizadores,
seguido de reducción y acetilación de la posición 2 (Ref. 19). El
éster t-butílico de 1 (2 g, 2,8 mmoles) se desprotegió a
continuación en ácido fórmico (76 ml) (Ref. 20). Se agitó la
solución durante 10 h. y se evaporó. Se disolvió el residuo en MeOH
(200 ml) y los grupos acetilo del grupo azúcar se eliminaron
añadiendo, gota a gota, una solución de MeONa al 1% (pH 11) (Ref.
46). Después de 15 h., se neutralizó el medio mediante una resina
Dowex 50WX8 (H^{+}) y se purificó el producto final 2 en una
columna (C_{18}) de fase inversa utilizando un gradiente de
agua/MeCN: 1,27 g (rendimiento del 79%).
M: Las síntesis de MAG requieren una sustitución
baja de la resina. Se hizo reaccionar el anhídrido simétrico
preformado de
N^{a}-Fmoc-bAla-OH
(0,25 mmoles) (30) con la resina Wang (1 g, 0,96 mmoles/g) durante 1
h., proporcionando una funcionalización de aproximadamente 0,12
mmoles/g como se estimó por análisis UV de una muestra de resina
(Ref. 31). Tras la acetilación de los grupos hidroxilo residuales
por Ac_{2}O en DMF, se montó el núcleo de lisina por acoplamientos
sucesivos de 0,48 y 0,96 mmoles de
N^{a}-Fmoc-Lys-(Fmoc)-OH.
La escisión del péptido de la resina se realizó mediante TFA/agua
(95/5, 16 ml). La purificación del producto en bruto por HPLC
(gradiente del 0% al 25%, tiempo de retención de 7,2 min.)
proporcionó M (94 mg). ^{1}H-RMN (D_{2}O), d,
4,24, 4,03, 3,93 (3 CH a Lys), 3,54, 3,42
(CH_{2}-NH b-Ala), 3,22, 3
\cdot (CH_{2} e Lys), 2,62 (CH_{2}-COOH
b-Ala), 1,97-1,85 (2 CH_{2} b
Lys), 1,78-165 (2 CH_{2} d, CH_{2} b Lys),
1,58-1,3 (3 CH_{2} g, CH_{2} d Lys); ESMS: 473,2
(calc. 473,33).
T: La síntesis del epítopo T se ha realizado en
0,21 g de resina (0,15 mmoles) por el procedimiento general. La
escisión del péptido fijado a la resina (TFA/agua/etanoditiol:
95/2,5/2,5, 45 ml) y purificación por HPLC (gradiente del 0% al 65%,
tiempo de retención de 12,6 min.) proporcionó T (31 mg). FABMS:
[M+H]^{+} 1613 (calc. 1611,9). Análisis de aminoácidos: Ala
1,16 (1), Asp 1,03 (1), Ile 0,96 (1), Leu 1,01 (1), Lys 2,92 (3),
Phe 1 (1), Thr 1,84 (2), Tyr 0,99 (1), Val 0,94 (1).
B-T: El alargamiento adicional
de la cadena del péptido T (0,22 g de resina, 0,14
mmoles, sintetizada como anteriormente) se consiguió con 2 como
bloque de construcción. Se liberó el glucopéptido de la resina
(TFA/agua/etanodi-
tiol: 92/2,5/2,5, 50 ml) y se purificó el producto en bruto por HPLC (gradiente del 10% al 60%, tiempo de retención 11,2 min.) proporcionando B-T (63 mg). ESMS: 1903 (calc. 1903,22). Análisis de aminoácidos: Ala 1 (1), Asp 1,05 (1), Ile 1,0 (1), Leu 1,05 (1), Lys 3,12 (3), Phe 1,05 (1), Ser 0,94 (1), Thr 1,97 (2), Tyr 1,06 (1), Val 1,0 (1).
tiol: 92/2,5/2,5, 50 ml) y se purificó el producto en bruto por HPLC (gradiente del 10% al 60%, tiempo de retención 11,2 min.) proporcionando B-T (63 mg). ESMS: 1903 (calc. 1903,22). Análisis de aminoácidos: Ala 1 (1), Asp 1,05 (1), Ile 1,0 (1), Leu 1,05 (1), Lys 3,12 (3), Phe 1,05 (1), Ser 0,94 (1), Thr 1,97 (2), Tyr 1,06 (1), Val 1,0 (1).
B4-M: Se conjugó 2 con el núcleo
(M) de polilisina sintetizado como se describió anteriormente (0,83
g de resina, 0,1 mmoles). Después de la escisión del glucopéptido de
la resina (TFA/agua: 95/5, 25 ml) y purificación por HPLC (gradiente
del 0% al 10%, tiempo de retención de 10,2 min.), se obtuvo
B4-M (36 mg). ESMS: 1633,9 (calc. 1633,78). Análisis
de aminoácidos: Lys 3 (3), Ser 4,06 (4).
T4-M: El núcleo M de lisina
(0,25 g de resina, 0,03 mmoles, se sintetizó como anteriormente) se
alargó más mediante la secuencia del epítopo T. La escisión del
péptido de la resina (TFA/agua/etanoditiol: 95/2,5/2,5, 25 ml) y su
purificación por HPLC (gradiente del 12% al 45%, tiempo de retención
de 16,5 min) proporcionó T4-M (67 mg). ESMS: 6852,08
(calc. 6853,35). Análisis de aminoácidos: Ala 4 (4), Asp 4,4 (4),
Ile 4 (4), Leu 4,1 (4), Lys 15,8 (15), Phe 4 (4), Thr 8,2 (8), Tyr
4,3 (4), Val 3,8 (4).
La síntesis de
B4-T4-M se consiguió acoplando
finalmente 2 a T4-M (0,25 g de resina, 0,03 mmoles)
que se obtuvo como se describió anteriormente. La escisión del
glucopéptido se realizó con TFA/agua/etanoditiol (95/2,5/2,5, 30
ml). Tras la purificación por HPLC (gradiente del 10% al 65%, 11,9
min. de tiempo de retención), se obtuvo el glucopéptido diana (25
mg). ES MS: 8014,09 (calc. 8014,45). Análisis de aminoácidos: Ala 4
(4), Asp 4,78 (4), Ile 4,09 (4), Leu 4,15 (4), Lys 16,31 (15), Phe 4
(4), Ser 3,81 (4), Thr 8,58 (8), Tyr 4,5 (4), Val 3,63 (4).
Se utilizaron ratones endogámicos hembra de seis
a ocho semanas en todos los experimentos. Los ratones BALB/c eran de
Iffa Credo (L'Abresle, Francia).
Para los ensayos de respuesta a la dosis, se
cultivaron 10^{5} hibridomas 45G10 de linfocitos T (específicos
para el péptido 103 a 115 del poliovirus) por pocillo con 10^{5}
células A20 (ATCC, TIB-208 Rockville, MD) con dosis
de antígeno diferentes durante 24 h. en medio RPMI 1640 enriquecido
con suero de ternero fetal al 10%, antibióticos,
L-glutamina 2 mM, 2-mercaptoetanol 5
\times 10^{-5} M. Después de 24 h., se congelaron los
sobrenadantes durante por lo menos 2 h. a -70ºC. Se cultivaron
10^{4} células/pocillo de la línea celular CTLL dependiente de
IL-2 con 10 \mul de alícuota sobrenadante 0,2 ml
de volumen final. Dos días después, se añadió [^{3}H] timidina
(0,3 \muCi/pocillo: AS = 1 Ci/mmol) y se recogieron las células 18
h. después con un recogedor de células automático. La timidina
incorporada se detectó por recuento de centelleo.
Se inmunizaron por vía subcutánea ratones con 10
\mug de compuestos T, B-T, T4-MAP,
B4-MAO o B4-T4-MAP
emulsionados en adyuvante completo de Freund. Diez días después, se
eliminaron las células de ganglio linfático (LN) y se prepararon
suspensiones de células aisladas y se cultivaron en medio
HL-1 (Hycor) enriquecido con
L-glutamina 2 mM. 10^{6} células LN/pocillo se
colocaron en placas de microvaloración de 96 pocillos (TPP,
Trasadingen, Suiza) con 10 \mug/ml del antígeno indicado o medio
solo. Después de 3 días a 37ºC, se pulsaron las células durante 18
h. con ^{3}H-TdR (NEN, Boston, MA) y a
continuación se recogieron en filtros de fibra de vidrio (Wallac Oy,
Turku, Finlandia) con un recogedor de células automático. Se inhibió
la radioactividad incorporada mediante recuento de centelleo. Los
resultados se expresaron en media de cpm de los pocillos del cultivo
por duplicado o triplicado. Las desviaciones estándar eran
inferiores al 15% de la media.
Se preparó OSM desialilado como se describe en
una publicación anterior (Ref. 32) y fue proporcionado gentilmente
por el Dr. A. Babino.
El a-GalNAc-Ser
(denominado 3 anteriormente en el apartado de síntesis) se unió por
enlace covalente a la ovoalbúmina (Sigma, St. Louis, MO) utilizando
glutaraldehído (Sigma) según un procedimiento conocido (Ref.
33).
Se cubrieron placas de microvaloración de 96
pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) con 10 \mug por ml de
diferente antígenos en tampón de carbonato 50 mM pH 9,6 y se
incubaron toda la noche a 4ºC para d-OSM,
ovoalbúmina y glucoconjugado Ova-Tn, o a 37ºC para
péptidos y montajes de MAG. Después del lavado con PBS que contenía
Tween 20 al 0,1%, la 83D4 (IgM) o los mAb anti-Tn de
MLS128 (IgG) se diluyeron en tampón (PBS más Tween 20 al 0,1%, BSA
al 1%) y se colocaron en placas respectivamente a razón de 2,5
\mug/ml y 40 \mug/ml durante 1 hora a 37ºC. Después de tres
lavados, los pocillos se trataron durante 1 hora a 37ºC con IgM
anti-ratón de cabra o conjugado de peroxidasa
anti-IgG (Sigma, St. Louis, Mo) y se añadió a
continuación O-fenilendiamina/H_{2}O_{2} como
sustrato. Se leyeron las placas fotométricamente a 492 nm en un
autolector ELISA (Dynatech, Marnes la Coquette, Francia).
Se inmunizaron por vía intraperitoneal ratones
BALB/c (5 por grupo) con 20 \mug de compuesto T,
B-T, T4-MAP, B4-MAP
o B4-T4-MAP en hidróxido de aluminio
(alúmina) los días 0, 20, 42 y 63. Se extrajo sangre a los ratones
10 días después de cada inmunización y se analizó en cada uno de los
sueros recogidos por ELISA los anticuerpos anti-Tn
como se describió anteriormente utilizando placas recubiertas con
d-OSM. Se diluyeron los sueros en serie y se analizó
el contenido en IgM anti-Tn e IgG. La referencia
negativa consiste en suero de mosca natural diluido 100 veces. Se
determinaron los títulos de anticuerpo del ELISA por análisis de
regresión lineal representando la dilución frente a la absorbancia a
492 nm. Se calcularon los títulos que resultaron ser el log10 de la
dilución mayor que proporcionó el doble de la absorbancia del suero
normal diluido 1/100. Se proporcionaron los títulos como la media
aritmética \pm S.D. del log10 de los títulos. El análisis
estadístico se realizó por la prueba t de Student. Los
valores P menores de 0,05 se consideraron significativos.
El reconocimiento in vitro del
B4-T4-M por un hibridoma T
específico para el epítopo T 103 a 115 del poliovirus se ensayó en
presencia de linfoma B, A20, como célula presentadora del
antígeno.
La Figura 4a ilustra la estimulación de un
hibridoma T específico para el péptido T 103 a 115 del poliovirus
con diferentes compuestos que contienen este péptido:
Se incubaron 10^{5} células de linfoma B,A20
(H-2^{d}) a 37ºC, en presencia de diferentes
concentraciones de B, T, B-T,
B4-MAP, T4-MAP y
B4-T4-MAP se utilizaron para la
estimulación de 10^{5} células de hibridoma T,45G10 (R.
Lo-Man et al. (1994), 152:
5660-5669) específico para el péptido 103 a 115 del
poliovirus y se restringieron por moléculas
I-A^{d}. Después de 24 h., se tomaron muestras de
los sobrenadantes del cultivo a continuación se analizó la
IL-2 mediante la medición de la proliferación de la
línea CTLL dependiente de IL-2. Después de tres días
de cultivo, se midió la proliferación de las células CTLL mediante
incorporación de timidina tritiada. Los resultados se expresan en
cpm.
Como puede apreciarse en la Figura 4a, el
compuesto B4-T4-MAP estimula en gran
medida la producción de IL-2 por el hibridoma T
específico para el epítopo T. En comparación con los demás
compuestos T, B-T, T4-MAP que
contienen también el epítopo T, la antigenicidad del conjugado de la
presente invención, compuesto
B4-T4-MAP, es 100 a 1.000 veces
mayor. Los compuestos B y B4-MAP que están exentos
de epítopo T del poliovirus no estimulan el hibridoma T.
A continuación se ensayó la inmunogenicidad T
in vivo del epítopo T del conjugado de la presente invención,
B4-T4-MAP, en ratones BALB/c.
Después de la inmunización de los ratones con el
B4-T4-MAP, o con un compuesto de
referencia (T, B-T, B4-MAP,
T4-MAP), la proliferación de las células del ganglio
linfático se midió in vitro después de la reestimulación con
compuestos que contienen el epítopo T solo o en combinación con el
epítopo B (compuestos T y B-T).
La Figura 4b ilustra la producción de una
respuesta proliferante específica para el péptido 103 a 115
(compuesto T) tras la inmunización de ratones BALB/c con el
compuesto B4-T4-MAP según la
presente invención. Se inmunizaron por vía subcutánea ratones BALB/c
(H-2^{d}) con 10 \mug de T, B-T,
B4-MAP, T4-MAP y
B4-T4-MAP en presencia de adyuvante
completo de Freund. Diez días después, las células escurridas del
ganglio linfático se cultivaron en presencia de medio solo o se
volvieron a estimular in vitro con 10 \mug/ml de un
compuesto que contenía el epítopo 103 a 115 (compuesto T o
B-T). Cuatro días después, se midió la proliferación
de las células LN mediante la incorporación de timidina tritiada.
Los resultados se expresaron en cpm.
Como puede apreciarse en la Figura 4b, los
compuestos MAP, B4-T4-MAP y
T4-MAP, así como los compuestos T y
B-T que contienen el epítopo T, provocan in
vivo una respuesta T proliferante específica para este epítopo
T. La especificidad de la respuesta T observada se demuestra por la
ausencia de proliferación de los linfocitos T que se originan en los
ratones inmunizados con el compuesto B4-MAP que está
exento del epítopo T, volviendo a estimular después con los
compuestos T o B-T.
Por lo tanto, fue posible demostar mediante los
análisis de inmunogenicidad T del conjugado según la presente
invención (el compuesto B4-T4-MAP)
que el epítopo T del poliovirus presente en este compuesto es capaz
de estimular tanto in vitro como in vivo los
linfocitos T específicos para este epítopo T. Además se observa un
gran aumento en la antigenicidad del epítopo T cuando este último se
combina con el epítopo carbohidrato en la estructura del
B4-T4-MAP.
2.1 Para evaluar la antigenicidad del antígeno
Tn en el sistema MAG glicoconjugado según la invención, los
solicitantes han utilizado dos anticuerpos monoclonales diferentes
bien caracterizados (mAbs) que reconocen el antígeno Tn. La Figura 3
presenta la capacidad de fijación de los anticuerpos monoclonales
anti-Tn 83 D4 (IgM) (Ref. 26) y MLS 128 (IgG) (Ref.
27) contra los montajes MAG diferentes utilizando un análisis ELISA.
Esta fijación se compara a la fijación obtenida con el antígeno Tn
conjugado 3 con un vehículo proteico (ovoalbúmina).
Los glucopéptidos antigénicos múltiples
completamente sintéticos permiten un determinado grado de rechazo de
un tumor implantado que lleva glucosilaciones anómalas. Sin embargo,
para producir inmunidad antitumoral más eficaz contra los cánceres,
el desarrollo contra dichos inmunógenos no debería centrarse en el
antígeno carbohidrato individual sino que debería combinar varios
carbohidratos dianas para los anticuerpos. La utilización de un
epítopo de células Tn dado juntamente con carbohidratos es un
prerrequisito para provocar respuestas fuertes del anticuerpo, pero
puede limitar su eficacia considerando el polimorfismo de MHC
observado en la población humana. Para evitar este inconveniente,
las estructuras de MAG han de incluir varios epítopos de linfocito T
con un determinado foco en las secuencias de fijación del MHC
promiscuas, tales como las descritas para la toxina del tétanos
(Ref. 41, Ref. 42) para las que los individuos humanos están ya
cebados (Ref. 43). La integración de los epítopos de CTL en las
estructuras de MAG, tal como los péptidos derivados de
MUC-1 (Ref. 44) para los cánceres epiteliales, puede
conseguirse también fácilmente al ensanchar el espectro de la
respuesta inmunitaria antitumoral. Aquí, los solicitantes han
primado la utilización de un adyuvante suave, la alúmina, que está
autorizada en las poblaciones humanas sanas, demostrando que no se
requieren adyuvantes fuertes para producir respuestas inmunitarias
específicas anti-carbohidrato mediante la estrategia
MAG. Este último punto puede ser de mayor importancia en la
extensión de la utilización de esta estrategia a los oligosacáridos
bacterianos (Ref. 45) para vacunar una población sana.
Puede apreciarse que el sistema
B4-T4-M de la invención así como el
OSM desialilado o el conjugado ovoalbúmina-Tn
(Ova-Tn) fueron reconocidos eficazmente por ambos de
los mAbs, 83 D4 y MLS 128, mientras que M, B4-M,
T4-M, B-T (en el último caso,
solamente se probó un mAb) y la propia ovoalbúmina no. El fragmento
d-OSM reconocido por el anticuerpo monoclonal MLS
128 demostró contener tres restos
a-GalNAc-Ser/Thr consecutivos (Ref.
28) que pueden indicar que B4-T4-M
pero no B4-M es capaz de simular la unidad de serina
glucosilada repetida.
Estos resultados demuestran que el montaje
B4-T4-M según la invención puede
presentar correctamente el antígeno Tn.
2.2 Otro estudio de inmunogenicidad en ratones
de los conjugados Tn-MAG de la invención se realizó
en primer lugar en ratones BALB/c que fueron inmunizados varias
veces con dichos conjugados Tn-MAG o con los
compuestos de referencia B-T, B4-MAP
o T4-MAP, en presencia de hidróxido de aluminio
(alúmina). La detección de los anticuerpos IgM (fig. 5a) e IgG (fig.
5b) específicos para el antígeno Tn se realizó por ELISA, midiendo
el reconocimiento del d-OSM.
Como puede apreciarse en las Figuras 5a y 5b,
después de dos inmunizaciones con el compuesto
B4-T4-MAP según la invención, los
anticuerpos IgM específicos para el antígeno Tn se produjeron en
ratones BALB/c, a diferencia de los compuestos B-T,
B4-MAP o T4-MAP que fueron incapaces
de producir anticuerpos anti-Tn. La cantidad de IgM
anti-Tn con
B4-T4-MAP permaneció inalterada
después de una tercera y una cuarta inmunización. Con los ratones
BALB/c parecía que la respuesta del anticuerpo a Tn producida por
B4-T4-MAP se caracterizaba por la
presencia de anticuerpos IgM y la ausencia de anticuerpos IgG.
2.3 Un estudio adicional de producción de
anticuerpos anti-Tn en las mismas condiciones se
realizó en otra cepa de ratones de haplotipo H2^{5} (que responden
al epítopo T) es decir ratones SLJ/J, y dio como resultado la
producción de ambos anticuerpos de clase IgM e IgG contra Tn (Fig.
5b). Por lo tanto el compuesto
B4-T4-MAP (Tn-MAG)
de la presente invención fue capaz de producir anticuerpos contra Tn
que pertenecen a diferentes isotipos, razón por la cual existen
diferencias en la clase de anticuerpo anti-Tn
dependiendo de la cepa de ratón analizada está todavía en
estudio.
Se estudió también la dependencia del linfocito
T CD4^{+} de la inmunogenicidad del compuesto B
Tn-MAG. Como se dijo anteriormente, los ratones
BALB/c son sensibles al epítopo T del poliovirus y generan
anticuerpos contra Tn. A fin de determinar la dependencia de T de la
producción de anticuerpos anti-Tn, los solicitantes
ensayaron su capacidad para producir anticuerpos contra Tn otra cepa
de ratón sensible al epítopo T del poliovirus, a saber la cepa
SLJ/J, y una no sensible a la cepa del epítopo T del poliovirus, es
decir la cepa DBA/1.
Las Figuras 5b y 5c demuestran que la
inmunización con el compuesto Tn-MAG, según la
presente invención, de ratones SLJ/J (5b) y DBA/1 (5c) dio como
resultado la producción de anticuerpos anti-Tn en la
cepa SLJ/J únicamente, que es sensible al epítopo T de poliovirus.
Estos datos demuestran que el epítopo T, CD4^{+} presente en el
compuesto Tn-MAG de la presente invención es
necesario para la producción de anticuerpos contra Tn.
2.4 Los solicitantes estudiaron además la
producción de anticuerpos anti-péptido utilizando el
compuesto Tn-MAG de la presente invención.
Como se expresó anteriormente el conjugado de la
presente invención (compuesto Tn-MAG) contiene
cuatro copias de la secuencia 103 a 115 de la proteína VP1 del tipo
1 de poliovirus (péptido T), unido al antígeno Tn del carbohidrato.
Los solicitantes han determinado en ratones la capacidad del
compuesto Tn-MAG para producir anticuerpos
específicos para el péptido T. Como se presenta en la Figura 6, la
inmunización de ratones BALB/c con el Tn-MAG de la
presente invención produjo una respuesta de IgG fuerte específica
para el péptido T (103 a 115), mientras que el compuesto
T4-M, que carece del antígeno Tn carbohidrato, así
como el compuesto B4-M que contiene únicamente el
antígeno Tn, fueron incapaces de provocar una respuesta del
anticuerpo del péptido anti-T. Por consiguiente, la
presencia del grupo carbohidrato en el conjugado
Tn-MAG de la presente invención, produce un efecto
potenciador fuerte en la producción de anticuerpos
anti-péptido contra el poliovirus peptídico
contenido en el compuesto MAG. Estos datos sugieren que dicho
conjugado del péptido carbohidrato puede utilizarse para activar la
respuesta del anti-péptido generalmente en
compuestos sintéticos MAP que contienen las secuencias peptídicas
del patógeno.
A fin de determinar la eficacia de la respuesta
de anti-Tn B producida en ratones con el compuesto
MAG, se realizó una prueba de provocación por inyección en los
ratones vacunados. 1.000 células por ratón de célula de
adenocarcinoma murino, TA3/Ha (P.Y.S. Fung et al. (1990)
Cancer Research, 50: 4308-4314), que expresan
el antígeno Tn, se administraron por vía intraperitoneal a ratones
BALB/c que han recibido 4 inyecciones de los compuestos
B4-M o Tn-MAG. La Figura 7 es un
gráfico que ilustra la mortalidad frente al número de días después
de la prueba de provocación en el tumor. Se inmunizaron ratones
BALB/c los días 0, 21, 42 y 100 con 20 \mug de compuesto
B4-M o Tn-MAG en presencia de
alúmina. 15 días después, los ratones recibieron una inyección de
provocación de 1.000 células TA3/Ha de adenocarcinoma. Se hizo el
seguimiento de la mortalidad durante un periodo de 50 días. Como
puede apreciarse en la Figura 7, solamente el 70% de los ratones
sobrevivió cuando éstos fueron inmunizados con el compuesto
B4-M que no permite producir un anticuerpo contra
Tn. Por el contrario, el 100% de los ratones que han recibido cuatro
inyecciones del conjugado de la presente invención sobrevivieron a
D50 después de la prueba de provocación en el tumor. Estos datos
demuestran que los anticuerpos producidos con el compuesto Tn de la
presente invención dan como resultado la mejora de la supervivencia
de los ratones después de una prueba de provocación en el tumor que
produce una letalidad moderada.
A fin de evaluar las posibles aplicaciones
humanas del conjugado de la presente invención, se determinó la
capacidad de los sueros de los ratones que han recibido este último
para reconocer una célula tumoral humana. Con este fin, los
solicitantes utilizaron la célula LS180 (ATCC
CL-187) que procedía de un adenocarcinoma de un
paciente que ha desarrollado un cáncer de colon. Un análisis de
citometría de flujo del reconocimiento de la células LS180 mediante
un suero que se origina en un ratón SLJ/J que ha recibido tres
inyecciones del presente conjugado (Tn-MAG)
demuestra que los anticuerpos anti-Tn producidos son
capaces de reconocer el antígeno Tn en la superficie de las células
LS180.
El compuesto básico para producir anticuerpos
anti-sacarídicos es una secuencia peptídico lineal
que contiene un epítopo de linfocito T CD4^{+} unido a una cadena
sacarídica. El compuesto BT se compone de la secuencia
KLFAVWKITYDKDT procedente del tipo 1 de poliovirus (epítopo de
linfocito T CD4^{+}) unido en el terminal N a tres restos
GalNac-Ser/Thr (antígeno Tn sacarídico asociado al
tumor). El compuesto BT o el péptido PV de referencia, secuencia
KLFAVWKITYKDT) se inyectó a ratones BALB/c mezclado con el adyuvante
completo de Freund o con alúmina de la forma siguiente.
Se inmunizaron ratones BALB/c (5 por grupo) en
CFA o alúmina con el B-T-PV o el
péptido PV de referencia los días 0, 21, 42 y 63. Se recogieron los
sueros 10 días después de la última inyección y se analizó en ELISA
el título de anticuerpo frente al glucopéptido
B-T-TT1 o el péptido TT1. Los
resultados se expresan en la Figura 8 en título medio obtenido para
cinco ratones en cada grupo.
Para detectar por ELISA los anticuerpos
anti-sacarídicos (anti-Tn), se
utilizó una secuencia peptídico irrelevante QYIKANSKFIIGITEL unida
en el terminal N a tres restos GalNac-Ser/Thr
(BT-TT1) o la secuencia YIKANSKFIIGITEL (péptido
TT1) no glucosilada como referencia negativa. Como se muestra en la
Figura 8, el glucopéptido B-T-PV
produce anticuerpos anti-Tn, pero no el péptido PV
que presenta la especificidad de la respuesta del anticuerpo.
Estos resultados demuestran que un glucopéptido
lineal sintético que contiene un epítopo del linfocito B sacarídico
y un epítopo de linfocito T CD4^{+} es capaz de producir
anticuerpos anti-sacarídicos.
Aunque solamente se ilustran y se describen las
formas de realización preferidas de manera específica en la presente
memoria, debe apreciarse que son posibles muchas modificaciones y
variaciones de la presente invención a la luz de lo que se ha dado a
conocer anteriormente y dentro del alcance de las reivindicaciones
adjuntas siguientes sin apartarse por ello del espíritu y del
alcance pretendido de la invención.
| Antígeno | Número de copias por molécula | |
| Denominación | \alphaGalNac-Ser | Péptido 103 a 115 |
| (antígeno Tn) | (epítopo T) | |
| T | 0 | 1 |
| B | 1 | 0 |
| B-T | 1 | 1 |
| M o MAP | 0 | 0 |
| B4-M | 4 | 0 |
| T4-M | 0 | 4 |
| B4-T4-M o | 4 | 4 |
| Tn-MAG | ||
| Ovoalbúmina | 0 | 0 |
| Ovoalbúmina-Tn | ++* | 0 |
| d-OSM | ++* | 0 |
| * varias copias, pero número de copias no determinado. |
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Claims (27)
1. Conjugado de carbohidrato péptido, que
comprende:
un vehículo que comprende una polilisina
dendrimérica que facilita epítopos múltiples que están unidos por
enlaces covalentes a ésta,
por lo menos un péptido que comprende un epítopo
T o varios epítopos T idénticos o diferentes,
por lo menos un grupo carbohidrato, o un
derivado del mismo, que contiene un epítopo B, con la condición de
que no sea un sialósido, o varios epítopos B idénticos o
diferentes.
2. Conjugado según la reivindicación 1, en el
que dicha polilisina dendrimérica forma una estrella de 4 ramas, con
un epítopo T unido por enlace covalente a cada lisina de las ramas
de dicho vehículo.
3. Conjugado según la reivindicación 1 ó 2,
que comprende por lo menos 3 lisinas y hasta 15 lisinas unidas por
enlaces covalentes entre si.
4. Conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el terminal NH_{2} de por lo
menos dos restos de lisina está unido a por lo menos un péptido que
comprende un epítopo T y en el que el grupo de carbohidrato está
unido por enlace covalente al terminal de dicho péptido opuesto a la
lisina.
5. Conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el terminal NH_{2} de por lo
menos dos restos de lisina está unido a por lo menos un resto de
carbohidrato que no es un sialósido, óptimamente sustituido y que
forma un epítopo B y en el que el péptido que comprende un epítopo T
está unido por enlace covalente al terminal de dicho
carbohidrato.
6. Conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el grupo de carbohidrato es el
galactosilo.
7. Conjugado según las reivindicaciones 1 a
4, que comprende 3 restos de lisina, por lo menos 4 epítopos de tipo
T, que pueden ser iguales o diferentes, unidos a los terminales
NH_{2} de 2 de los restos de lisina y 4 restos de
\alpha-galactosil-N-acetil-serina.
8. Conjugado según las reivindicaciones 1 a
7, en el que el grupo de carbohidrato es un resto galactosilo y está
sustituido por otro resto glucosilo.
9. Conjugado según las reivindicaciones 1 a
8, en el que el carbohidrato es un antígeno tumoral.
10. Conjugado según las reivindicaciones 1 a 9,
en el que el epítopo T es el péptido 103 a 115 de la proteína
VP-1 o del tipo 1 de poliovirus.
11. Conjugado según las reivindicaciones 1 a
10, en el que el carbohidrato está injertado en combinación con el
epítopo peptídico tumoral de linfocitos T CD8^{+}.
12. Conjugado según las reivindicaciones 1 a 8
u 11, en el que el carbohidrato es de origen bacteriano o
micótico.
13. Conjugado según la reivindicación 12, en el
que el carbohidrato es de polisacáridos bacterianos capsulares
seleccionados de entre el grupo constituido por Neisseria
meningitis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, y
otras especies de Streptococcus, a excepción de los
polisacáridos sialilados.
14. Conjugado según la reivindicación 1, en el
que el carbohidrato se selecciona de entre el grupo constituido por
antígeno Tn, antígeno di-Tn, antígeno
tri-Tn, antígeno T* y antígeno
hexa-Tn.
15. Conjugado de péptido carbohidrato, que
comprende:
- por lo menos un péptido que comprende un epítopo T, o varios epítopos T idénticos o diferentes, y
- por lo menos un grupo carbohidrato, o un derivado del mismo, que contiene el epítopo B, con la condición de que no sea sialósido o varios epítopos idénticos o diferentes.
16. Conjugado de péptido carbohidrato según la
reivindicación 15, en el que el grupo carbohidrato se selecciona de
entre el grupo constituido por antígeno Tn, antígeno
di-Tn, antígeno tri-Tn, antígeno
hexa-Tn y antígeno T*.
17. Composición farmacéutica que comprende el
conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y un
vehículo y adyuvante adecuados.
18. Vacuna que comprende el conjugado según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
19. Composición inmunógena que comprende por lo
menos un conjugado de péptido carbohidrato según las
reivindicaciones 1 a 16, capaz de seleccionar una respuesta
inmunitaria contra una infección vírica producida por un patógeno
tal como el virus de la hepatitis, VIH o CMV.
20. Composición inmunógena que comprende por
lo menos un conjugado de péptido carbohidrato según las
reivindicaciones 1 a 16, en la que dicha composición es capaz de
aumentar la supervivencia del ser humano o del animal que lleva el
tumor.
21. Composición inmunógena que comprende por lo
menos un conjugado de péptido carbohidrato según la reivindicación
20, en la que dicho conjugado comprende varios antígenos de
carbohidrato destinados a producir más inmunidad antitumoral eficaz
contra los cánceres.
22. Conjugado según las reivindicaciones 1 a
16, para su utilización como inmunógeno.
23. Utilización de un conjugado según las
reivindicaciones 1 a 16, para la preparación de una composición
farmacéutica destinada a potenciar la respuesta inmunitaria de un
ser humano o de un animal contra las bacterias.
24. Utilización de un conjugado según las
reivindicaciones 1 a 16, para la preparación de una composición
farmacéutica destinada a provocar una respuesta al anticuerpo en un
cuerpo humano o animal contra por lo menos un grupo carbohidrato
comprendido en la misma.
25. Anticuerpo purificado procedente de fluido
purificado o de células de organismos administrado con un conjugado
según las reivindicaciones 1 a 16.
26. Kit para diagnóstico que comprende
anticuerpos específicos para el antígeno producidos por inmunización
de un cuerpo humano o animal con un conjugado según las
reivindicaciones 1 a 16.
27. Método para el diagnóstico del cáncer, en
el que se pone en contacto una muestra biológica por lo menos con un
anticuerpo según la reivindicación 25 y en el que se determina la
formación de complejos entre este anticuerpo y las moléculas
comprendidas en dicha muestra.
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