JPH03505724A - マクロファージ活性化用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 マクロファージ活性化用組成物 発明の分野 本発明は、改良された抗腫瘍効果を冑する新規な脂肪親和性二接類−トリペブチ ド化合物および該化合物を含有するリポソーム被包組成物を提供する。

発明の背景 無傷の微生物薬物は、実験的に誘発された悪性疾叡およびヒト悪性疾患の両方に おいて抗腫瘍効果を有することが知られている。ペプチドグリカン細胞壁骨格お よびトレハロース・シミコレートからなっている活性成分は、ミコバクテリアか ら単離された。これらの活性成分は、特に鉱油またはスクアレンに結合しでいる 場合、無傷の微生物薬物と同様に活性であることが知られている。例えば、イー ・リビら（Ｅ、Ｒｉｂｉ、　ｅｔ　ａｌ、）、アナルス・オブ・ニューヨーク・ アカデミ−・オブ・サイエンス・ニー・ニス・ニー（Ａｎｎ、　ＮＹ参照。

ノカルジア・ルブラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｒｕｂｒａ）　　（Ｎ−ＣＷＳ）の細 胞壁骨格もまた、マクロファージを活性化することが知られている。

静脈内投与によって、オイル−結合Ｎ−ＣＷＳは、実験的肺動脈転移を有するラ ットを治療することができる。例えば、ニス・ソンら（Ｓ、５ｏｎｅ　ｅｔ　ａ ｌ、）、キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ　Ｉ　ｍｍ ｕｎｏｌｏｇｙ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）、１２，２０３−２０９（１ ９８２）参照。小さい細胞壁ペプチドグリカンの水溶性単一ユニットは、アジュ バント活性であることを示す。アジュバントは、ヒトまたは他の哺乳動物の免疫 システムの非特異的刺激を生起させ、その結果、抗体の形成を増加させ、例えば 感染に対する生物の保護反応を増強する化合物である。このような単一ユニット は、例えばルイス肺癌またはＭＣＡ乳癌に罹っているマウスにおいて、静脈内投 与すると、抗腫瘍活性も示す。例えば、サバ、ジーら（Ｓａｖａ、Ｇ。

ｅｔ　ａｌ、）、キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（ＣａｎｃｅｒＩ 　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）、旦、８４′８６　（ １９８３）参照。

これらの生物の活性成分を単離し、精製し、合成した。これらの成分は、糖部分 およびペプチド部分を含む広範囲の有機化合物からなるグリコペプチド類である 。細胞中に見いだされるグリコペプチド類は、抗体応答を増大させる能力によっ て証明されるようなアジュバント活性を保持しているだけではなく、マクロファ ージを活性化して細胞毒性としかつ腫瘍細胞を破壊する能力によって証明される ような抗腫瘍活性を有していることも知られている。例えば、ムラミル・ジペプ チド（ＭＤＰ）、（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イング ルミン）および多数のＭＤＰ誘導体は、抗腫瘍マクロファージ活性特性を有する ことが知られている。

この無傷の微生物薬物および多くのＭＤＰ化合物は、両方共、望ましくないレベ ルの毒性を示す。フロインドアジュバントのような、単独または水中油エマルシ ョン中で使用される無傷の微生物薬物は、ヒスタミンに対する感受性の増大、肝 臓および膵臓の肉芽腫形成および過形成を生起させることができる。あるＭＤＰ 化合物の投与による毒性反応は、発熱を含んでおり、繰り返し投与すると、脈管 炎を発生する。

大する。免疫原性および／または抗腫瘍薬物の脂肪親和性誘導体は公知であり、 マクロファージを標的とし、細胞毒状態に対してマクロファージを活性化するた めにリポソーム中に有用な薬物を効果的に一体化するのに有用である。

したがって、アジュバントおよび／または抗腫瘍活性を改良し、リポソームと容 易に一体化され、予想された効果的なヒト投与量に対して適当に過剰の投与量に おいて非毒性である新規グリコペプチド化合物が必要である。

発明の趣旨 本発明は、公知の基本化合物ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）の新規脂肪親和性三 糖類−トリベブチド誘導体を提供する。本発明化合物は、好ましくは、例えばホ スファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールから形成され得る多ラメ ラリポソーム中に被包される。該化合物は、ヒト単核細胞を活性化し、その結果 、腫瘍細胞を破壊するのに効果的である。該化合物は、予想されたヒト投与量に 対して適当に過剰の投与量において非毒性でもある。

本発明化合物は、式［Ｉコニ Ｕ式中、Ｒ１は（Ｃ，〜Ｃ５）アルキルてあり、Ｒ２は（Ｃ，−ＣＳ）アルキル であり、Ｒ３およびＲ４は、各々、約０〜４つの二重結合を含んでいる（Ｃ，〜 Ｃ，。）アルキル基である」で示される。Ｘは、ペプチジル残基であり、例えば 、一般式：で示されるアミノ残基である。好ましくは、Ｘは、式：ＣＨ。

−ＮＨ−ＣＨ−Ｃ− で示されるＬ−アラニン残基である。該本発明化合物の医薬的に許容される塩、 および上記式で示される化合物からなるリポソームも、本発明の範囲内である。

多少のものを除いて、天然に生じる蛋白は、その成分アミノ酸のし一鏡像異性体 だけを含有しているが、本発明組成物において、アミノ酸のＤＬ−混合物として 可能である場合、Ｄ−鏡像異性体も使用し得る。

本発明化合物（化合物■）は、公知の基本化合物ムラミルジペプチド（ＭＤＰ） の新規な脂肪親和性三糖類−トリペプチド誘導体である。

化合物Ｉは、窒素原子に約２〜６個の炭素原子を結合しているアシル基を有する グルコサミン（Ｇ　ｌｃ）誘導体を含む。好ましくは、該アシル基は炭素原子２ 個を有しており（アセチル）、Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｇ　１ｃＮ　Ａ　ｃ ）を形成する。

Ｎ−アシルグルコサミン部分は、Ｎ−アシルムラミル部分に結合している。ムラ ミル基の窒素原子に結合しているアシル官能基は、約２〜６個の炭素原子、好ま しくは２個の炭素原子を有しており、Ｎ−アセチルムラミル基を形成する。別の 三糖類Ｇ　１ｃＮ　Ａ　ｃ　−Ｍ　ｕｒＮＡｃは、天然に生じる三糖類であり、 高分子性グリコペプチドの部分として細菌細胞壁中に見いだされる。米国特許第 ４，３９５，３９９号参照。

化合物Ｉの三糖類部分Ｎ−アシルグルコサミン−Ｎ−アシルムラメートは、ムラ ミル基の３位でラクチルエーテル結合ヲ介シてトリペプチド部分のＮ−末端と結 合する。トリペプチド部分は、ジペプチド、Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン を含んでおり、これは細菌性ペプチドグリカン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−ア ラニン−Ｄ−イソグルタミンの単一ユニットを天然に生じることが分かつている 。上記化合物Ｉの式中Ｘで表されたトリペプチド部分の第３のアミノ酸は、任意 のペプチジル残基であり、好ましくはＬ−アラニンである。したがって、好まし いトリペプチド部分は、Ｌ−アラニン−Ｄ−イソグルタミン−Ｌ−アラニン（Ｌ 　−Ａ　ｌａ　−Ｄ　−１ｓｏＧ　Ｉｎ　−Ｌ−Ａｌａ）である。新規化合物の 三糖類−トリベプチド部分は、Ｎ−アシルグルコサミニルーＮ−アシルムラミル −トリペプチドと称してもよい。

本発明化合物の脂肪親和性末端は、各々、７〜３１個の炭素原子、好ましくは１ ２〜２３個の炭素原子および約Ｏ〜４つの二重結合、好ましくは約Ｏ〜１つの二 重結合を有する２つのアシル基で置換されているグリセロールの誘導体からなる 。好ましくは、両アシル基は、１６個の炭素原子［Ｃ，、］を有しており、ジパ ルミトイル−グリセロール誘導体を形成する。グリセロールの残存しているーＯ Ｈは、トリペプチド部分の末端アミノ酸、ＸのＣ−末端に結合する。

本発明の新規化合物は、一般的に、Ｎ−アシルグルコサミニル−Ｎ−アシルムラ ミル−トリペプチド−ジアシル−グリセロール化合物と記すことができる。好ま しくは、該化合物は、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ −アラニン−Ｄ−イソグルタミン−Ｌ−アラニン−ジパルミトイルグリセロール （ＧｌｃＮＡｃＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧＩｎ−Ｌ−ＤＰＧまた はＧＭＴＰ−ＤＰＧ）である。

化合物Ｉは、上記式で示される医薬的に許容される塩としても使用され得る。こ のような塩としては、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ｐ−トル エンスルホン酸などのような有機酸および塩酸、硫酸、リン酸などのような無機 酸からの誘導体であるアミン塩が挙げられる。硫酸（低級）アルキルおよびハロ ゲン化（低級）アルキルのような塩も使用することができる。該化合物の単離ま たは精製に関して、医薬的に許容・されない塩を使用してもよい。しかしながら 、医薬的に許容される非毒性塩だけが治療学的に使用することができ、したがっ て、好ましい。

リポソーム リポソームは、通常、リン脂質または他の脂肪物質から得られ、単一または多ラ メラ水化液晶から形成される。これらは、通常、水性担体媒質中の分散体として 使用される。リポソームと化合物■を一緒に使用すると、アジュバントおよび抗 腫瘍活性が増大する。また、しばしば、体液および／または細胞介在免疫応答の 増大がみられる。したがって、化合物■は、好ましくは、リポソームに含まれて いる。

リポソームを形成するための多くの慣用方法がある。非毒性で、生理学的に許容 され、代謝可能な、リポソームを形成することができる脂質を使用することがで きる。最もありふれた脂質は、リン脂質であり、顕著なものは、天然および合成 のホスファチジルコリン（レシチン）である。リン脂質は、例えば、ホスファチ ジル−セリン、ホスファチジルーイノシチドまたはスフィンゴミエリンを使用す ることもできる。例えば、ダブリュ・アール・ハーグリーブス（Ｗ、Ｒ。

Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ）およびディー０ダブリユ３デイーマー（Ｄ、Ｗ、　Ｄｅ ａｍｅｒ）［カンファレンス・オン・リポソームズ・アンド・ゼア・ユージズ・ イン・バイオロジー・アンド・メディスン（Ｃｏｎｆ’ｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｌ 　ｉｐｏ−ｓｏｍｅｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｕｓｅｓ　ｉｎ　Ｂ　ｉｏｌｏｇ ｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、１９７７年９月１４〜１６日、ニューヨーク ・アカデミイー・オブ・サイエンス（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ 、）］によって、およびバイオケミスト他の脂質を使用することもできる。

本発明のリポソームを形成するのに慣用技術および装置を使用することができる 。これらの技術は、例えば、デビット・エム・ブレスコツト（Ｄａｖｉｄ　Ｍ、 　Ｐ　ｒｅｓｃｏｔｔ）によって編集された研究題“メソッズ・イン・セル・バ イオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）”の第１Ｖ章 ［第Ｘ■巻、１９７６、アカデミツク・プレス、ニューヨーク、第３３頁および それに続く頁］に開示されている。

リポソーム中に活性化合物Ｉを被包する他の方法としては、有機溶媒中、溶液か らの蒸発によって（充填した脂質を有するかまたは有しない）リン脂質のフィル ムを鋳造し、次いで、適当な水性媒質中に該フィルムを分散させることが挙げら れる。脂質−可溶性で生物学的に活性な化合物、すなわち、リポソームの水性層 よりも脂質層と関連する化合物の場合、該化合物は、通常、一般的な有機溶媒を 用いて、リン脂質と一緒にフィルムとして鋳造される。水−可溶性で生物学的に 活性な化合物の場合、該化合物は、代表的には、該化合物の水溶液によって鋳造 リン脂質フィルムを分散させることによってリポソーム中に被包される。次いで 、被包された化合物を、遠心分離、クロマトグラフィーまたは他の適切な方法に よって遊離化合物と分離する。

化合物Ｉの脂肪親和性末端は、そのリポソーム中への一体化を増強する。化合物 ■は、好ましくは、本質的に、重量比約５〜１：１、好ましくは約７＝３の１− バルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン（ｐ　ｃ）およびジオレ オイルホスファチジルグリセロール（Ｐ　Ｇ）からなる二層膜を有するリポソー ム中に一体化される。これらの化合物は、アラバマ、ペラムのアバンテイ・ポー ラ−・リピノズ（Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏ１ａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ）から市販品として 入手可能である。

リポソーム中に化合物Ｉを被包するのに使用することができる好ましい方法は、 米国特許第４．３７０．３４９号に開示されており、本明細書に引用記載する。

該方法は、（１）適当な溶媒中に必要な物質を溶解し、次いで、該溶液を凍結乾 燥させ、得られた凍結乾燥混合物を貯蔵し、所望により、水性リポソーム製剤を 再調製すること、または（２）公知の方法によって水性リポソーム製剤を調製し 、該製剤を凍結乾燥さゼることのいずれかからなる。所望により、該凍結乾燥生 成物は、水性リポソーム製剤中に調製することもできる。該凍結乾燥混合物は、 水性媒質と一緒に振盪する場合に容易に分散し、該凍結乾燥リポソームを使用す ると、鋳造フィルムを分散させることによって得られる対応する製剤よりも狭い サイズ分布を有するリポソーム製剤が得られる。これは、リポソーム製剤の治療 学的効果の予備生産可能性に関する利点である。一般に、リポソームの形態の組 成物は、化合物Ｉに加えて、任意の成分二安定化剤、防腐剤、賦形剤、またはム ラミル−ペプチド化合物の投与に関して予め与えられた注射可能な溶液もしくは エマルション中で使用することかできる他の活性物質を含むことができる。

化合物■、好ましくはリポソーム中に一体化された化合物■は、アジュバントま たは抗腫瘍活性のために使用され得、経口または非経口的に、好ましくは注射に よって投与され得る。

本発明は、特に、化合物■および医薬的に許容される担体ビヒクルを含有してい る医薬アジュバントおよび抗腫瘍組成物に関する。

このタイプの組成物が特に好ましく、これは、有効量の本発明生成物を含有する 注射可能溶液によって構成されている。水、好ましくは食塩等張溶液またはグル コースの等張溶液のような等張液に入れた滅菌溶液が、この目的に有利に使用さ れる。蒸留水に入れた単一溶液を使用することもできる。油性相を含有している 注射媒質、特に油中水エマルションを使用することもできる。このようなエマル ションは、特に、仏画特許出願第７５−０４００３号に開示されているような代 謝可能な植物性油によって得られる。該仏国特許出願は、該仏画優先権特許出願 第７５−’０４００３号に基づいて１９７６年２月９日に出願されたオーディバ ート（Ａ　ｕｄｉｂｅｒｔ）らの米国継続特許出願第６５６，７３８号に対応す る。好ましい担体ビヒクルは、上記の凍結乾燥リポソームである。

本発明のアジュバントおよび抗腫瘍組成物は、この目的のたメｌこ、選択された 投与方法に対して適切なビヒクルを使用すること（こよって、種々の形態で投与 してもよい。例えば、単回投与形態は、経口投与のために、サシエ、打錠された 錠剤またはゼラチン硬もしくζま軟カプセルの形態で、あるいは、粘膜に適用す るために二−ロ゛／ルまたはゲルの形態で使用される。

該本発明組成物は、アジュバントおよび抗腫瘍組成物を即座番こ調製することが できるように凍結乾燥形態であってもより）。医薬的（こ有利な形態は、体表面 積１１１′あたり化合物約２００ｉ〜１０＋ｓ＋の単一投薬からなる。

贅填 化合物１１例えば、４−Ｃ）−［２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グ ルコビラノンル］−２−アセトアミド−２−デオキシ−３−０−［Ｄ−２−プロ ノｆノイルーＬ−アラニル−Ｄ−イ′ノグルタミニルーＬ−アラニン−２，３− ジパルミトイル−ｓｎ−’）”ノセロールコーＤ−グルコビラノース（ＧＩｃＮ ＡｃＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ−Ｌ−Ａｌａ−ＤＰＧ）は、 上記の９つの主要工程で、市販の入手可能な物質から製造され得る。該工程は、 以下の説明から明らかなように記載された順番で行う必要はない。

第１工程は、保護アミノ酸−ジアシルグリセロールの製造を含む。

これは、アミノ酸残基、Ｘ％好ましくはＬ−アラニン残基、のＣ−末端に結合し た化合物■の脂肪親和性部分である。例えば、好ましい具体例において、この残 基は、保護−Ｌ−アラニン−２，３−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロールであ る。

本合成において出発物質として用いられる保護アミノ酸またはペプチドは、保護 形態で市販品として入手可能であるかまたはペプチド化学の公知方法によって得 られる。容易に遊離され得る遮蔽基または保護基は、ペプチドおよび糖化学から 公知のものである。ヒドロキシ基に関して、以下のものが好適な例である：例え ばアセチルのような低級アルカノイル基の如きアシル基、ベンゾイルのようなア ロイル基、および特にベンジルオキシカルボニルもしくは低級アルコキシカルボ ニルのような炭酸誘導体から誘導された基、またはアルキル、特にｔｅｒＬ−ブ チル、場合によってニトロ、（低級）アルコキシまたはハロゲンによって置換さ れていてもよいベンジル、各々所望によってハロゲンまたはメトキシのような低 級アルコキシによって置換されていてもよいトリフェニルメチルもしくはテトラ ヒドロピラニル、あるいは４位および６位で酸素原子を結合している所望によっ て置換されていてもよいアルキリデン基。このようなアルキリデン基は、好まし くは、低級アルキリデン基であり、例えば、メチリデン、イソプロピリデンまた はプロピリデン基であり、あるいは、他方、所望によって置換されていてもよい ベンジリデン基である。

Ｃ−末端カルボキン基の遮蔽に関して、適当な部分としては、ｔｅｒｔ−ブチル 、ヘンシルまたはベンズヒドリルが挙げられる。遊離アミノ基の保護に関しては ％　ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニル基を使 用することができる。

これらの遮蔽基は、酸加水分解のような当技術分野で公知の手段で開裂させるこ とができる。ベンジルまたはベンジリデン基は、水素化分解によって、例えば、 パラジウムまたは白金触媒のような貴金属触媒の存在下で水素を用いて除去する ことができる。

本発明化合物の製造の第２工程は、アミノ酸から遮蔽基を除去して、Ｘ−ジアシ ル−グリセロール（ここで、Ｘは、上記のアミノ酸残基である）、好ましくはＬ −アラニンを形成することを含む。例えば、好ましい成分は、Ｌ−アラニン−２ ，３−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロール（Ｌ−Ａｌａ−ＤＰＧ）である。

第３工程は、好適な細菌、例えばミクロコツカス・リソデイクテイカス（Ｍｉｃ ｒｏｃｏｃｃｕｓ　１ｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）［乾燥細胞が、ミズリー、セ ントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓ　ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏ、）から市販品として入手可能である〕から三糖類部分を単離することを 含む。得られた三糖類は、Ｎ−アセナルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラメー トである。ミクロコツカス・リソデイクティカスは、公知であり、文献に開示さ れている。トリプシンおよびリゾチ−ムによってミクロコツカス・リソデイクテ ィカス（Ｍ　１ｃｒｏｃｏｃｃｕｓＩｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｔ）のバイオマス を酵素加水分解し、ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ”）　１．　Ｘ　８　（ＣＨ３Ｃ ＯＯ−型）２００〜４００メツシユを充填したカラム中でさらに精製することを 含む［ホシノ・オー（Ｈｏｓｈｉｎ。

Ｏ，）、ゼナピ・ニー（Ｚｅｎａｖｉ　ｔ］、）、シナイ・ビー（Ｓｉｎａｙ　 Ｐ、）、ジーンロズ・アール・ダブリュ（Ｊ　ｅａｎｌｏｚ　Ｒ，Ｗ、）、ジャ ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｎ、　ｑ肪Ｌ ）、２４７、Ｎｏ、２．３８１、（１９７２）：およびシャｏン・エヌ（Ｓｈａ ｒｏｎ　Ｎ、）、オサワ・ティー（Ｏｓａｗａ　Ｔ、）、フラワーズ・エイチ・ エム（Ｆ　ｌｏｗｅｒｓＨ，Ｍ、）、ジーンロズ・アール・ダブリ−Ｌ　（Ｊ　 ｅａｎｌｏｚ　Ｒ、Ｗ、）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー 、２４Ｌ　２２３（１９６８）］。さらに、本明細書で引用記載する米国特許第 ４．’４２７゜６５９号参照。

上記の単離した三糖類において、Ｒ１およびＲ″は、両方とも、−ＣＨ３であり 、ムラミルおよびゲルコサミル官能基上でアセチル基を形成している。Ｒ１およ びＲ２が個々にＣ２〜Ｃ８アルキル基である類似化合物は、当技術分野において 公知の方法によって製造することができる。例えば、アセチル基は、例えば、ピ ー・エイチ・グロス・アンド・アール・ダブリュ・ジーンロズ（Ｐ、Ｈ，Ｇｒｏ ｓｓ　ａｎｄＲ、Ｗ、　Ｊ　ｅａｎｌｏｚ）　［ジャーナル・オブ・オーガニッ ク・ケミストリー′（Ｊ、Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、）、１９６７．３２．２７６１ コに開示されているような強酸によって加水分解することができる。次いで、酸 無水物または塩化物のような、導入されることが望まれるＲ１またはＲ′に対応 するアシル化剤は、所望のＲ１またはＲ２をムラミルまたはグルコサミニル官能 基に結合させるのに使用してもよい。

次の工程は、両端が遮蔽されたジペプチドアラニン−イソグルタミンの製造を含 む。オハイオ、クリープランドのユナイテソド・ステート・バイオケミカル・カ ンパニー（ＵＳ’ＢＣ）から市販品として入手可能なり０Ｃ−Ｌ−アラニル−Ｄ −イソグルタミンは、当技術分野において公知の手段で処理してベンジルエステ ル（−０Ｂｎ）のような好適な遮蔽剤でＣ−末端イソグルタミン残基を末端処理 しなければならない。したがって、ＢＯＣ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ　− ０Ｂｎが形成されるのが好ましい。

次の工程は、公知の形成方法によってアラニンから遮蔽基を除去して、例えば、 Ｌ　−Ａ　Ｉａ　−Ｄ　−１ｓｏＧ　Ｉｎ　−ＯＢ　ｎを形成することを含む。

次の工程は、Ｎ−アシルグルコサミン−Ｎ−アシルムラミル官能基とアラニン− イソグルタミン部分とをカップリングさせることを含む。縮合反応は、不活性溶 媒媒質中、好ましくは、ウッドワードＴ１．ＭＫ　（Ｎ−エチル−５−フェニル インキサゾリウム−３°−スルホネート）のような縮合剤の存在下、約Ｏ′Ｃ〜 ２５°Ｃの温度で、一段階で行われる。米国特許第４．３９５，３９９号参照。

次の工程は、慣用手段によって遮蔽基を除去して、脱遮蔽二糖類−ジペプチド、 例えば、４−０−４２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノジ ルコー２−アセトアミド−２−デオキシ−３−０−［Ｄ−２−プロパノイル−し −アラニル−Ｄ−イソグルタミンＪ　−ｐ−グルコビラノース（ＧｌｃＮＡｃＭ ｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ　−１ｓｏＧ　Ｉｎ）を形成することを含む。

最終工程は、慣用技術によってＧ　］ｃＮ　Ａ　ｃＭｕｒＮ　Ａ　ｃ　−Ｌ−Ａ 　ｌａ−Ｄ　−１ｓｏＧ　Ｉｎとアミノ酸−ジアシルグリセロール成分とをカッ プリングさせて、化合物ｌを形成することを含む。

化合物■は、本明細書において前記したようにリポソーム中に被包させるのが好 ましい。本発明化合物とホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロー ルとを混合させるのが好ましい。代表的には、約１００ｍ９／ｉρの濃度でｔｅ ｒｔ−ブタノール中にリン脂質を溶解させる。ｔｅｒｔ−ブタノールに入れた適 当な量のＰＣおよびＰＧを混合して、重量比約７＝３とする。化合物Ｉを量り取 り、与えられた脂肪に添加して、例えば５順当たり約１ｊ！９の最終濃度にする 。

次いで、該物質を濾過器に通して、該組成物をバイアル中に調剤する。該バイア ルを、代表的には一２０°Ｃで冷凍し、次いで、代表的には約２０°Ｃで１８時 間凍結乾燥させる。次に、該バイアルをアルゴンのような不活性ガス下で密封す る。

以下の限定されていない実施例に゛よって、本発明をさらに説明する。

実施例Ｉ ＢＯＣ−Ｌ−Ａｌａ−ＤＰＧの調製 ２５ｉＮ）丸底７ラス：＋（ＲＢＦ）中に、ＢＯＣ−Ｌ−７う＝ン２０８．６４ ｘ９（１，１０３ミリモル）、１，２−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロール（ ジグ７（Ｓｉｇｍａ））５７０．０ｘ９（１，００２ミリモル）、４−ジメチル アミノピリジン（ＤＭＡＰ）（アルドリッチ・ケミカル・カンバ＝　−（Ａｌｄ ｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、ミルウォー牛−、ライスコンシン）６ ３．１４ｕおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ ミド・塩酸塩（ＥＤＣＩ）２３０．０４肩９（１゜２００ミリモル）を入れた。

ＢＯＣは、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、遮蔽基の略語である。塩化メチ レン（ＣＨｚｃ　Ｉｔ）を添加し、最終容量を１４２Ｑにした。該混合物を氷水 浴中で１時間、次いで、室温（ＲＴ）で−晩撹拌した。

一晩撹拌した後、吸引減圧下、回転エバポレーターで溶媒を除去し、白色固形物 を得た。これを酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）２０ｉρと水１０ｘ（ｌの間で分配し た。水層を別のＥｔＯＡｃ　２０ｘ（ｌで抽出した。有機層を合わせて、重炭酸 ナトリウム飽和水溶液２Ｘ２０Ｊ１７！で、次いで水２×２０ｍＱで処理し、次 いで、ＮａｚＳＯ＊で乾燥させた。回転エバポレーターで溶媒を除去し、白色固 体のＢＯＣ−Ｌ−Ａｌａ−ＤＰＧ　　６４８次９（８７％）を得た。

実施例２ Ｌ−Ａｌａ−ＤＰＧ ＣＨＪＬＱｔ　　１５Ｊｔ（２にＢＯＣ−Ｌ−Ａｌａ−ＤＰＧ　　６３０ｙ（０ ，８５ミリモル）を溶解し、これにトリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）５．　Ｏｘ Ｑを添加した。該溶液を室温で２時間撹拌し、次いで、回転エバポレーターで濃 縮乾固させて、黄褐色油状物を得た。これをヘキサン１０ｘＱに溶解し、回転エ バポレーターで濃縮乾固させた。この工程を２．３回繰り返し、最終痕跡量のＴ ＦＡを除去した。次に、この物質を高真空下で乾燥させ、オフホワイト色固体の トリフルオロ酢酸Ｌ−Ａｌａ−ＤＰＧ　　６０６．７ｚ９を得た。

実施例３ ミクロコツカス・リソデイクティカス（Ｍ　１ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　１ｙｓｏｄ ｅｉｋ−カンパニーから市販品として入手可能）１５．０９を、蒸留水２００畦 に懸濁させ、４°Ｃで９０分間、０．１ｘｘのガラスピーズ２５０９と一緒に高 速で撹拌することによって粉砕した。デカンテーションによってガラスピーズか ら細胞壁骨格（ＣＷＳ）を取り出し、次いで、１２００Ｘ９で３０分間遠心分離 した。ペレット（無傷細胞）から上澄み液を除去し、次いで、１０，０ＯＯＸ９ で５０分間遠心分離した。

上澄み液を除去し、得られたペレット（粗ＣＷＳ）を、蒸留Ｈ，０１００ｚＱで ３回洗浄し、１０，０ＯＯＸ９で７０分間遠心分離した。得られたペレットを蒸 留水１５０Ｊ１１２に懸濁させ、次いで、沸騰水浴中に３０分間装いた。

室温まで冷却させた後、得られたスラリーを１０，０ＯＯＸ９で遠心分離した。

上澄み液を除去し、ペレットをＯ，Ｏ’５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７， ６０）６０ｘ（ｌ中にスラリー化させた。得られたスラリーをブタ膵臓トリプシ ン（シグマ、１４，６００　　ＢＡＣユニット／ｘ９＞　１０．０ｘｇで処理し 、３７°Ｃで２０時間インキュベートした。蒸留Ｈ，Ｏで２．３回洗浄した後、 ＣＷＳベレットを０６０５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（Ｔ）　Ｈ６，３０）８０ ｘρ中にスラリー化させ、卵白リゾチーム（シグマ、５６，０００ユニツト／！ ９．１０．０ａｙ）で処理し、３７℃で１９時間インキュベートした。

粗調製物を透析して、酵素および未消化細胞壁を除去した。酢酸勾配液で溶離し てダウエックス−１（酢酸塩型）上でイオン交換クロマトグラフィーによって最 終精製を行った。ＵＶ吸光度および薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（シリカ ゲル、５０　：　３９　：　８　：　３ＣＨＣＣ３／ＣＨｓＯＨ／Ｈ，Ｏ／ＮＨ ，ＯＨ，５％Ｈ，ＳＯ，／ＥｔＯＨおよび加熱）によってカラム画分を溜めた。

ムラミン酸および全ヘキソースアミンの比色測定分析ならびに高速原子衝撃質量 分析によって、三糖類生成物の明らかな同定を得た。乾燥細胞１５９からＧｌｃ ＮＡｃＭｕｒＮＡｃ　１２０ｍｇを得た。

実施例４ ヘンシルアルコ−／ｌ／（７７，０２！９．０．７１　ミ’）　％ル）、Ｄ　Ｍ 　Ａ　、、Ｐ（３３，Ｏｘ９．０．２７　ミ’）モル）およびＢＯＣ−Ｌ−７ラ ニルーＤ　−イソグルタミン（１５９，Ｏ巧、０．５０ミリモル）をＣＨｔ　Ｃ Ｑ　ｔ　’５村およびＤＭＦ　　２ｚ（ｌに溶解した。この溶液を氷水浴中で４ °Ｃに冷却し、ＥＤＣＩ（１１８，０叩、０．６１ミリモル）で処理し、４℃で ３０分間、次いで室温で１５時間撹拌した。回転エバポレーターで溶媒を除去し た後、残留物をＥｔＯＡｃ　２０ｘＱと水Ｌｏｇρの間で分配した。層を分離し 、水層を別の酢酸エチル２０村で抽出した。有機画分を合わせて、逐次、飽和Ｎ ａＨＣＯ３（２Ｘ２０ｙ、のおよびＨ，Ｏ（２Ｘ　２０ｘＱ＞で抽出した。硫酸 ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を回転エバポレーターで除去し、ワックス状固 形物が残った。

これをＥｔＯＡｅ−石油エーテルから再結晶して、白色綿毛状固体のＢＯＣ−Ｌ −Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ−ＯＢｎ　１４１ｍ９（６９％）を得た。

実施例５ Ｌ−Ａｈａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ−ＯＢｎの調製ＢＯＣ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏ Ｇ１ｎ−ＯＢｎ（１２０ｚ’ｉｌ、０．２９４ミリモル）をＩＮ　ＨＣｌ２／Ｈ ＯＡｃ　１０ｘＱで処理し、得られた溶液をＲＴで２時間撹拌した。次いで、溶 媒を回転エバポレーターで除去し、無色油状物を得、これをメチルアルコール３ ｘＱに取り、次いで、ジエチルエーテル２０ｉ１２を滴下して沈澱させた。ＲＴ で１時間撹拌した後、生成物を濾過器によって回収し、エーテルで洗浄し、次い で、高真空下で乾燥させて、白色固体のＬ　−Ａ　ｌａ　−Ｄ　−１ｓｏＧ　Ｉ ｎ　−０Ｂｎの塩酸塩８８翼９を得た。

実施例６ Ｇ　］ｃＮ　Ａ　ｃＭｕｒＮ　Ａ　ｃ（分子量４９６．４７．０．４０５ミリモ ル）２００ｍｇを全部、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１５ｘ（２に溶解し、 次いで、ＤＭＦ（０，４０３ミリモル）にトリエチルアミン（ＴＥＡ）４２　、 ９４１９／Ｌ（ｌを含む溶液０．９５ｍ（で処理した。該溶液を水浴中で磁気撹 拌しながら冷却し、次いで、ウッドワード試薬に１３９．６３ｊ！９（純度９５ ％、０．５２４ミリモル）で処理した。次に、スラリーを氷水浴中で１時間撹拌 し、次いで、室温で１０分間撹拌した。

次に、ＤＭＦ　　８．ＯｘＱにＬ　−Ａ　ｌａ　−Ｄ　−１ｓｏＧ　Ｉｎ　−Ｏ Ｂ　ｎのＨＣｆｆ塩１５２．３靜（０，４４３ミリモル）を含む溶液に、ＴＥＡ ／ＤＭＦ溶液１．０５ｚ＆（０，４４，３ミリモル）を添加し、これを、１０分 間かけて均圧漏斗を介して添加した。該溶液をＲＴで１８時間撹拌し、次いで、 さらに９６時間放置した。この間、反応をＴＬＣによって追跡し、完了するまで 行った。

２５℃で、高真空下（約５０ミクロン）、回転エバポレーターでＤＭＦを除去し 、赤味がかった油状物を得て、これをさらに高真空下で乾燥させた。

該油状物をＨ，０５ｘＱ中に取り、ダウエックス　１．Ｘ８（２００〜４００メ ツシユ、酢酸塩型）の１．７Ｘ７ｃｚカラムに入れた。該カラムをＨ＝０５０ｘ Ｑで洗浄し、完全に無色の溶出液をアンバーライト（ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＲ）　 　Ｉ　Ｒ−１２０Ｐ樹脂（１６〜２０メツシユ、Ｈ゛型）の１．７ＸＴｃｘカラ ムに入れた。該カラムをＨ，０５０ｘ（で洗浄し、溶出液および洗液を合わせた 。この物質を２５°Ｃで吸引真空下、回転エバポレーターで乾固させて無色油状 物を得た。これを高真空下（５０〜７５ミクロン）で−晩乾燥させ、この間にガ ラス状固形物に固化した。これをＨ，０２０１（！に取り、凍結乾燥させ、純白 綿毛状固体のＧＩｃＮＡｃＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ−ＯＢ ｎ　１８１ｍｇを得た。

実施例７ ＧｌｃＮＡｃＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎの調製実施例６て調 製した保護物質１７０Ｒ９をＨｔ　Ｏ（３０ｘＱ＞および酢酸（１，Ｏ好）の溶 液に溶解した。５００ｘＱのバール（Ｐ　ａｒｒ）水素添加ボトル中、該溶液を ５％Ｐｄ／Ｃ（パラジウムの重量％、Ｃは粉末木炭である；オハイオ、ノーウッ ドのマセソン・コルマン・アンド・ベル（Ｍａｔｈｅｓｏｎ、　Ｃｏｌｅｍａｎ 、　ａｎｄ　Ｂｅ１ｌ）から入手）１００ｚｇに添加し、２０ｐｓｉｇで２４時 間水素添加した。触媒を除去し、水（３Ｘ１０ｘ（１）で洗浄し、濾液および洗 液を併せて、凍結乾燥させ、白色固体のＧｌｃＮＡｃＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ −Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ　１５０ｚｙ（１００％）を得た。該生成物を高真空下で４ ８時間さらに乾燥させ、次いで、しっかりとキャップをし、４℃で貯蔵した。

実施例８ Ｇ］ｃＮＡｃＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ−Ｌ−Ａｌａ−ＤＰ Ｇを得るためのＧ　］ｃＮ　Ａ　ｃＭｕｒＮ　Ａ　ｃ　−Ｌ　−Ａ　ｌａ　−Ｄ −イソグルタミンのＬ−Ａｌａ−ＤＰＧへのカップリング１−ヒドロ＋シヘンソ ）　’）　７ソール（ＨＯＢＴ）（３１，３５ｘｇ、０゜２３２ミリモル）およ びＥＤＣＩ（４４，２６＋９．０．２３１　ミ’Ｊモル）を５０ｍＱ（ＤＲＢ　 Ｆ　ニ入しタ。コレニ、ＤＭＦ　　７ｘ（！およびＣＨ，Ｃ（。

５峠に実施例７で調製した三糖類ジペプチド（１３９，１３Ｎ、０゜２０ミリモ ル）を含む溶液を添加した。得られた溶液をＲＴで３０分間撹拌した。

ＤＭＦ　１．：ＴＥ　Ａ　２０２ｘ９（０，２８ｘｆｆ）を溶解し、最終容量を １゜ｎ（ｌに調節して、トリエチルアミン溶液を調製した。

Ｌ−Ａｌａ−ＤＰＧ（１５０，８ｉｙ、０．２０ミリモル）をＣＨ，ＣＮ。

ｌＩｌ＋（！に溶解した。ＤＭＦ　（Ｉ　ＩＦのを添加し、次いで、ＴＥＡ溶液 １１ｉ２を添加した。得られた溶液を、活性化二接類ジペプチド溶液に添加し、 容器にしっかりとキャップし、７２時間撹拌した。

該反応をＴＬＣによって追跡し、７２時間で停止させた。次いで、反応混合物を 、１つは５　ｍ（１，他方は１０ｘ（ｌの２つの部分に分けた。

これらの試料を、高真空下、室温で、回転エバポレーターで濃縮乾固した。次い で、これらを、２４時間、デシケータ−中でさらに乾燥させた。この間に両試料 は乾燥されて黄−橙色固形物になった。

精製のために、少量の部分をＨ２Ｏ２５ｚ（とＥｔＯＡｃ　２５＊ｆ２との間で 分配した。層を分離し、有機層をＨ，０２Ｘ１０ｘｆ２で抽出し、水性層に洗液 を添加した。次いで水性画分をＥｔＯＡｃ　２５ｘρで洗浄し、層を分離し、有 機相を合わせた。水性層を回転エバポレーターで半分の容量に濃縮し、３Ｏ−３ ５ｐｓｉでアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　ＹＭ−５膜を介してＨ，Ｏに対して広範 囲に残留物を透析した。

内部透析物のＴＬＣ分析によって、単一スポットが示された。次に、この物質を ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎｌｌ）　１２紙を介して濾過し、凍結乾燥させて、 クリーム色の固形物３５次９を得た。

実施例９ ＧＭＴＰ−ＤＰＧの調製 ＢＯＣ−Ｌ−Ａｌａ−ＤＰＧ（ＩＩ）−塩化メチレン（ＣＨ７Ｃ１２２）５０酎 に１，２−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロール（シグマ、２．８４５ｇ、５． ０ミリモル）、ＢＯＣ−Ｌ−アラニン（ＵＳＢＣ，９６６１１９，５，１ミリモ ル）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（アルドリッチ、３５７ｙ 、２．９３ミリモル）を溶解した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミンプロ ピノリカルポジイミド・塩酸塩（ＥＤＣＩ）（シグマ、１．１７４９．６．１２ ミリモル）を添加し、該溶液を室温（ＲＴ）で１７時間撹拌した。回転エバポレ ーターで溶媒を除去した後、残留物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）１５０．１１１ ２とＨ２Ｃ７５皮（との間で分配し、層を分離し、有機層を重炭酸ナト１７ウム 飽和水溶液（３Ｘ５０ＪＩので抽出し、次イテ、Ｈ，Ｏ（３ｘ　７５ｚ（りテ抽 出した。硫酸ナトリウムで乾燥させた後、回転エバポレーターで溶媒を除去し、 高真空下で残留物をさらに乾燥させ、わずかにオフホワイト色の固体生成物３． ５９９（９７％）を得た。

生成物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（シリカ、ＣＨＣＣ３／ＣＨ，ＯＨ ／Ｈ，０，１３０：　４５　：　７　；　ＨＣρスプレィ、次いでニンヒドリン ）にかけると、Ｒｆ　Ｏ，９５の単一のスポットが示された。

Ｌ−Ａｌａ−ＤＰＧ（Ｉ［Ｉ）−ＣＨ，Ｃ（１，７５ｘ（ｌに保護アラニンエス テル（ｎ）（２，５０９，３，３８ミリモル）を溶解し、次いで、トリフルオロ 酢酸（ＴＦＡ）２５村で処理した。室温で２時間放置した後、回転エバポレータ ーで溶媒を除去すると、黄褐色油状物が残存し、これをヘキサン２０ｘＱに取り 、次いで、回転エバポレーターで濃縮乾固した。高真空下で広範囲に乾燥させた 後、トリフルオロ酢酸塩として化合物ｍ　　２．４４９（９５，７％）を得た。

ＢＯＣ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ−ＯＢｎ（ＩＶ）　−ＣＨ２Ｃ４ｆｆ１ ４０ｊ１１２およびＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｘ（ｌに、Ｂ ＯＣ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ（ＵＳＢＣ，１，５８７９，５，０ミリモ ル）、ヘンシルフルコール（５４０，７ｍｇ、５．０　ミ！Ｊ　モル）およびＤ ＭＡＰ（３０５２９，２，５ミリモル）を溶解し、得られた溶液を磁気撹拌しな がら氷水浴中で４°Ｃに冷却した。ＥＤＣＴ（１，１５０ｇ、６．００ミ’Ｊモ ル）を添加し、反応物を水浴中で１時間撹拌し、次いで、室温で１７時間撹拌し た。回転エバポレーターで溶媒除去した後、油状残留物をＨ，０５０ｍ（とＥｔ ＯＡｃ　１５０！ＩＱとの間で分配させ、層を分離し、有機層を重炭酸す）　＋ ７ウム飽和水溶液（３×５０　ｘＱ）およびＨ，Ｏ（３ｘ　５０ｙＱ＞でさらに 抽出した。硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を回転エバポレーターで除去し 、無色油状物を得て、これをさらに高真空下で乾燥させた。この間にワックス状 固形物に固化された。ＥｔＯＡｃ−へキサンから再結晶し、純白固体の化合物Ｉ Ｖ　　１．３１８１？（６５％）を得た。

生成物をＴＬＣ（シリカ；ＥｔＯＡｃ／ピリジン／酢酸／Ｈ，０，３０：２：０ ．６：１；Ｈ（Ｊスプレィ、次いでニンヒドリン）にかけると、Ｒｆｏ、９０の 単一スポットが示された。

Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧＩｎ−ＯＢｎ（Ｖ）　−ＩＮ　ＨＣ（！／酢酸ｉｏ。

好で保護ジペプチドエステルＩＶ（２，０８９，５，１０ミリモル）を処理し、 得られた溶液を室温で２時間放置した。回転エバポレーターで溶媒を除去し、高 真空下でさらに乾燥させた後、生成物をメタノール−エーテルから結晶化させ、 塩酸塩としＣ化合物Ｖ　　１．６８９（９５，８％）を得た。

ＧＩｃＮＡｃＭｕｒＮＡｃ（■）−乾燥細胞の形態の市販の入手可能な凍結乾燥 したミクロコツカス・リソデイクティカス（Ｍ　１ｃｒｏｃｏｃｃｕｓＩｙｓｏ ｄｅｉｋｔ　１ｃｕｓ）　（シグマ）を蒸留水に懸濁させ（２〜３％ｗ／ｗ）、 次いで、ミクロフルイディクス・コーポレイション・ラボラトリ−・ミクロフル イディクス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ”）（モデル（Ｍｏｄｅｌ）　Ｍ　 −１１０Ｙ）で粉砕した。これは８２ｐｓｉｇの通常操作空気圧でパワレックス （Ｐｏｗｅｒｅｘ”）　Ｇ　Ｉ　−２５エアーコンプレツサーによって操作され 、結果、１９，０００ｐｓｉｇの水圧となった。次に、細胞壁を差動遠心分離に よって単離し、実施例３に記載のようにトリプシンおよびリゾチームで連続的に 処理した。次に、得られた消化物を透析しくアミコンＰＭ−１０膜）、酵素およ び大きい分子量の不純物を除去し、酢酸勾配液による溶離によってダウエックス −１（酢酸塩型）上でイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。ＵＶ吸 光度およびＴＬＣ（シリカ：ＣＨＣＮ３／ＣＨ，ＯＨ／Ｈ，Ｏ／ＮＨ，ＯＨ，５ ０：　３９　：　８　：　３　；５％Ｈ，ＳＱ、／ＣＨ３ＣＨ，○Ｈおよび加熱 ）によってカラム画分を集めた。ムラミン酸および全ヘキソースアミンの比色測 定分析および高速原子衝撃質量分析（ｆａｂｓ）によって三糖類の明らかな同定 を得た。得られた収量は、乾燥細菌細胞２４０ｇから純粋なジサッカライド（化 合物Ｖｌ）２．５０ｇの範囲であった。

ＧｌｃＮＡｃＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ−ＯＢｎ（■）−使 用する前に、４膜分子ふるいによってＤＭＦを乾燥させ、次いで、ニンヒドリン から蒸留させた。水酸化ナトリウムペレットからトリエチルアミン（ＴＥＡ）を 蒸留させた。ＩＮＨＣρ　１５ｍＱに市販の物質（アルドリッチ）３．０９を溶 解し、ワット７７４２紙を介して濾過し、次いで、アセトン１２０ｉ（を添加し て沈殿させることによってウッドワード試薬Ｋを精製した。濾過およびアセトン １００ｍ（ｌによる洗浄の後、高真空下で数時間、試薬を乾燥させた。

三糖類化合物Ｖｌ（２，００９，４，０２８ミ’）　モル）をＤＭＦ　　１００ １１Ｑに溶解し、ＴＥＡ（０，６２ｍ（！、４４７．５Ｑ、４．４３１ミリモル ）で処理し、氷水洛中で４°Ｃ近くまで冷却し、次いて、つ、ドワード試薬Ｋ（ ９５％、１．３９７９．５．２４ミリモル）で処理した。得られたスラリーを氷 水洛中で１時間、次いで、室温で１０分間撹拌した。次に、ＤＭＦ５０Ｊ！ρ中 にジペプチドベンジルエステル（■）（１，５２３ｇ、４．４３ミリモル）およ びＴＥＡ（４４７，４２ｘ９．０゜６１ｆｆ１２）を含有する溶液を、均圧添加 漏斗を介して３０分間にわたって添加した。添加終了後、反応混合物を室温で合 計１２０時間撹拌し、その間に、反応の進行をＴＬＣ（シリカ、ＣＨＣＮ３／Ｃ Ｈ，ＯＨ／Ｈ，Ｏ／ＮＨ，ＯＨ，５０：　２５　：　４　：　２　；　５％Ｈ， Ｓｏ、／ＣＨ，ＣＨ，○Ｈ５加熱）によってモニターした。次に、溶媒を回転エ バポレーターで除去し、油状残留物を高真空下でさらに乾燥させた。次いで、こ れをｉ（，０５０ｆｆＱに取り、ダウエックス　ｌＸ８（２００〜４００メ／シ コ、酢酸塩型）の２．５Ｘ１７ｃｘカラムに入れ、Ｈ，０５００ｘ（ｌで溶離し た。全溶出液を約５０ｍＱに濃縮し、次いで、ダウエックス　５０Ｘ８（１００ メツシユ、トＩ十型）の２．５Ｘ１７ｃｚカラムに入れ、Ｈｔ０５００ｘρて溶 離した。溶出液を約５０ｘ（ｌに濃縮し、次いで、凍結乾燥して、純白色固体の 化合物■２．２５９（７１％）を得た。

ＧｌｃＮＡｃＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ（■）　　　ＨｔＯ １５０ＪＩＱおよび氷酢酸３．０ｘｆｆに三糖類ジペプチドベンジルエステル（ ■）（２，２０９，２，８０ミリモル）を溶解した。これに５％Ｐｄ／Ｃ３００ Ｒ９を添加し、得られたスラリーを室温および４０ｐｓｉｇで４０時間水素添加 した。次いで、セライトパッドを介して濾過することによって触媒を除去し、Ｈ ｔｏ　（３Ｘ　１０　ｘＱ）で洗浄し、濾液および洗液を合わせ、約５０村に濃 縮し、次いで、流速８　ｘ（１膜時でブトキシ−ゲル（Ｄｅｔｏｘｉ−ＧｅｌＲ ）（ピアス（Ｐ　１ｅｒｃｅ））のｌｘＱカラムを通過させた。該カラムをＨ２ Ｏ１０ｇ（ｌで洗浄し、溶出液および洗液を合わせ、次いで、凍結乾燥させて、 白色粉末の化合物■　１．８６９（９５，５％）を得た。

調製における記載のように精製した。三糖類ジペプチド■（１，５３１９，２， ２０ミリモル）をＤＭＦ７０ｘｇに溶解し、次いで、ＣＨ，Ｃｅ、５０ｄで希釈 した。次いで、これに１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（アルド リッチ、３８７．４ｘ９．２．５３ミリモル）およびＥＤＣＩ　（４８５ｘ９． ２．５３ミリモル）を添加し、得られた溶液を室温で１時間撹拌した。次に、Ｃ Ｈ２Ｃｌ２，２０ｘＱにエステル（ｎ）　１．６５９９（２，２ミリモル）およ びＴＥＡ２２５ｘ９（０，３１ｙＱ、　２．２０　ミ！Ｊモル）を含有する溶液 を、５分間にわたって滴下した。得られた溶液を室温で２４時間撹拌し、次いで 、さらにＥＤＣｌ　　１００！１９で処理し、さらに４８時間撹拌した。溶媒を 回転エバポレーターで除去し、油状残留物を高真空下で数時間さらに乾燥させ、 その間に黄色ワックス状物質に固化した。次いで、これをＥｔＯＡｃ　１５０ｘ Ｑ中に懸濁させ、２００Ｘ９で遠心分離することによって３回洗浄した。高真空 下で乾燥させた後、該ベレットを蒸留Ｈｔｏ　　１０００ｘＱに懸濁させ、次い で、アミコンＹＭ−１０膜を介してアミコン限外濾過セル中、蒸留Ｈ，Ｏに対し て広範囲に透析した。次いで、内部透析物を蒸留Ｈ，Ｏで２０００ＪＩ７＋まで 希釈し、３層の濾紙（ラブコンコ・コーポレーション（Ｌ　ａｂｃｏｎｃｏ　Ｃ ｏｒｐ、　）＃Ａ−７５４４４８）を介して濾過し、回転エバポレーターで約６ ００ｙｒＱに濃縮し、凍結乾燥させて、白色静電粉末の化合物■１．６０９を得 た。

最終精製ノタメニ、上記生成物５２．８ｍ９をＣＨＣＲ３／ＣＨ，ＯＨ／Ｈ２０ ，２：３：１　１．Ｏ＋（ｌに溶解し、次いで、同一溶媒中で膨潤され充填され たセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　ＬＨ−２０−１００樹脂の０．７Ｘ２ ９ｃｚカラムに入れた。該カラムを流速０．３３！（！／分で溶離し、溶出液の 画分を集め、ＴＬＣ（シリカ、ＣＨＣｆｆ３／ＣＨ３０Ｈ／Ｈ，０／ＮＨ，ＯＨ ，５０：　２５　：　４　：　２　；　５％Ｈ，ＳＯ。

／ＣＨ、ＣＨ、ＯＨ、加熱）によって測定した。適切な画分を合わせて、バイオ ラッド・セレソクス（ＢｉｏＲａｄ、　Ｃｅ１ｌｅｘ）　Ｄ樹脂（酢酸塩）のｌ Ｘ５ＣＪＩＩカラムに直接入れた。次いで、このカラムを溶媒３０Ｆ１１２で洗 浄し、合わせた溶出液および洗液を回転エバポレーターでほぼ乾固するまで濃縮 し、Ｈｚ　Ｏ７５ｚＩ２で処理し、凍結乾燥させて白色粉末状のＧｌｃＮＡｃＭ ｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ−Ｌ−Ａｌａ−ＤＰＧ（ＧＭＴＰ− ＤＰＧ）３５ｍ９を得た。

二水和物の生成物の分析： Ｃ，、Ｈ，、、Ｎ、Ｏ，、・２Ｈ，０ 理論値：　　Ｃ５７，８７；Ｈ８，９３；Ｎ　　６゜２１測定値：　　Ｃ５７， ８９；Ｈ８，５８；Ｎ　　５．９１ＦＡＢ−ＭＳＳｍ／’ｃ　１３４０（’Ｍ＋ ２３）、１３１８Ｍ（Ｍ＋１）、１３００（Ｍ−１８＋１） 実施例１０ リポソームの調製 ＧＭＴＰ−ＤＰＧ化合物（ＩＸ）を以下の製造方法を用いてリポソーム中に被包 させた。実施例９で製造したＧＭＴＰ−ＤＰＧ　　１ｏ９を１−バルミトイル− ２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＣ）１７５３１１？および１，２−ジ オレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＧ）７５ｏ（両方とも、アラバマ、 ベラムのアバンテイ・ポーラ−・リピ、ズから市販品として入手可能）と混合し た。脂質１００＋ｙｇ／ｘＱの濃度でｔｅｒｔ−ブタノールにＰＣおよびＰＧを 予め溶解し、したがって、ｔｅｒｔ−ブタノール中のＰＣ：　ＰＧの重量比７゛ ３となった。

次いで、ＧＭＴＰ−ＤＰＧ　　１ｔ９、ＰＣ１７５ｕ、ＰＧ　　７５次９にｔｅ ｒｔ−ブタノールを添加して、最終容量を５．０畦にした。Ｇ　Ｍ　ＴＰ−ＤＰ Ｇおよび脂質混合物を無菌ミリポア０．２２μフイルターに通して、存在する全 ての不純物を除去した。濾液を清潔な無菌の丸底フラスコ中に集め、充填後、こ れにアルミホイルでキャップした。ＧＭＴＰ−ＤＰＧ　　１ｘ９を含有する濾過 混合物５ｘ（２を１０好バイアル中に分配した。該バイアルに充填した後、無菌 ゴム血清栓で被覆した。各栓は、凍結乾燥および栓をする間、バイアルに空気を 出し入れすることができるように一方向にスリットがある。該バイアルを無菌ア ルミホイルで覆い、このバイアルを凍結乾燥器のトレイ乾燥室に移した。次に、 ｔｅｒｔ−ブタノール脂質混合物が凍結するまで（約３０〜６０分）−２０°Ｃ に冷却した。次いで、解凍し、トレイ加熱器を１０°Ｃにセットした。次に、該 バイアルを１８時間凍結乾燥させた。バイアルを含む凍結乾燥器を濾過した無菌 アルゴンで浄化し、３回排気した。次いで、バイアルを含む凍結乾燥器をアルゴ ンで再度浄化し、大気圧でアルゴン下、バイアルに栓をした。

実施例１１ 粒状抗原と混合した抗体産生細胞における食塩水中の薬物のアジュバント活性 誘発抗体応答における本発明化合物の効果を、最適投与量以下の免疫原を用いて 、老いたＢａ１ｂ／ｃマウスおよび正常マウスを用いて免疫無防備状態モデルで 評価した。

免疫欠損動物を代表する老いたＢａ１ｂ／ｃマウス（１８力月齢）を、単独また はＭＤＰｏ、１ａ＋９もしくは化合物］Ｘ０．１１９と混合した１ｘ１０ｇヒツ ジ赤血球（ＳＲＢＣ）の最適接種物で腹腔内的に免疫化した。４日目に肺臓を取 り出し、プラーク形成ユニットについて検査した。

結果（第１表）、対照に関しては、肺臓当たり６６Ｘ１０’プラーク形成ユニツ ト（Ｐ　Ｆ　Ｕ）であり、ＭＤＰｏ、１ｕと混合した５ＲＢＣを投与されたマウ スに関しては、肺臓当たり１９８Ｘ１０３ＰＦＵであり、本発明のＧＭＴＰ−Ｄ ＰＧの化合物０．１ｘｔｉと混合した５ＲＢＣを投与されたマウスに関しては、 ４−４２Ｘ　］、Ｏ’ＰＦＵであった。同様に、若いＢａ１ｂ／ｃマウスを、食 塩水に入れた最適投与量以下の５ＲＢＣ（ＩＸ　１０’細胞）またはこれを０． ０１ｇ９または０．１ｍｇのＭＤＰまたはＧＭＴＰ−ＤＰＧと混合して、腹腔内 的に免疫化した。

結果（第１表）、重量的に、ＧＭＴＰ−ＤＰＧはＭＤＰよりも３〜１０倍効果的 であった。

第１表 ＭＤＰとＧＭＴＰ−ＤＰＧ（ＩＸ）とのアジュバント活性の比較１８力月　　ｌ Ｘｌ０”　　　０．１　　　　　　　　　　　　　　　　　１９８３力月　ｌＸ ｌ０’　　　０．０１　　　　　　　　　　　　　　１００３カ月　］、Ｘ１０ ７　０．１　　　　　　　　　　　　　　１４４３力月　ｌＸｌ０’−ｍ−０， ０］、　　　　　１８４実施例１２ ＭｅｔｈＡ肉腫における食塩水中ＧＭＴＰ−ＤＰＧの抗腫瘍活性７週齢のＢａ１ ｂ／ｃ雌性マウスに、ｌ　Ｘ　１０６Ｍｅｔｈ　Ａ腫瘍細胞を皮下注射した。８ 日後、この動物に食塩水（対照）または化合物■１．１０または１００μりを静 脈内投与した。各グループは、４匹の動物からなっていた。２日毎に１０日間、 腫瘍測定を行い、治癒するか腫瘍によって死亡するまで、６０日間、該マウスを 追跡した。

結果、化合物■　１〜１０μ９を一回投与する処置の後、６日目に腫瘍の大きさ の１０〜１５％減少を示した。さらに多い１００μ９の投与は、４匹の動物のう ち１匹について、処置後、６日目で腫瘍　　、の増殖の５０％減少を示し、腫瘍 の完全な後退を示した。

実施例１３ ＧＭＴＰ−ＤＰＧおよびリポソーム被包ＧＭＴＰ−ＤＰＧによる殺腫瘍性状態に 対するヒト末梢血単核細胞の活性単核細胞膜腫瘍活性は、フォグラー・アンド・ アイドラ−（Ｆｏｇｌｅｒａｎｄ　Ｆ　１ｄｌｅｒ）の方法（フォグラー・ダブ リュ・イー（Ｆｏｇｌｅｒ　Ｗ、　Ｅ、）およびアイドラー・アイ・ジェイ（Ｆ 　１ｄｌｅｒ　Ｉ　、　Ｊ、）、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ工り一脛 止）、↓洛６　：　２３１１〜２３１７．１．９８６）によって測定した。すな わち、４６％パーフル（Ｐｅｒｃｏｌｌ）上で重力遠心分離によってヒト末梢血 単核細胞を単離した。次いで、ｌＸｌ０”単核細胞／ＩＣで、化合物■　１．５ μ９／雇を含むかまたは含まない５％ヒト血清を含有するＲＰＭｌ　　１６４０ 培地中で１８時間慧濁させて培養した。インキュベーション後、単核細胞を洗浄 し、１×１０５または５Ｘ１０’単核細胞を９６ウエルマイクロプレートのウェ ルに１時間付着させ、該プレートを洗浄して、非付着細胞を除去し、これに、１ ×１０′″ｌ　１２５標識Ａ−３７５腫瘍細胞を添加した。単核細胞を腫瘍細胞 と一緒に７２時間培養した。７２時間の共培養の最後に、プレートを洗浄して、 非付着−非生存可能腫瘍細胞を除去し、残存する付着生存可能１１ｆｆｉ５標識 腫瘍細胞を、ドデシル硫酸ナトリウムで該細胞を溶解し、ガンマカウンターで放 射能活性を計数することによって測定した。

重量比７：３の１−バルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリンと１， ２−ジオレオイルホスファチジルグリセロールとからなるリポソームを用いるこ とによって、化合物■を含有するリポソームによるヒト末梢血単核細胞の活性を 測定した。

実施例１２に記載の試験を用いて、化合物■のｉｎ　ｖｉｔｒｏ効果をＭＤＰと 比較した。効果器：標的細胞比は１０：１であった。培養物は、最終濃度１．０ μ９／ｒＱのＭＤＰ、化合物■またはリポソーム中化合物■を含有した。これら の試験の結果（第２表）、食塩水懸濁液として使用した場合またはリポソーム中 に被包させた場合、化合物■は、ＭＤＰよりも効果的であることが分かった。

第２表 実施例　　　　ＭＤＰ’　　　　化合物■３　　　化合物■４１　　　　３８％ 　　　５９％　　　　　７３％２　　　　２７％　　　３７％　　　　　４４％ 胞を有するウェル中のＣＰＭであり、Ｂは、処置した単核細胞を有するウェルの ＣＰＭである）。

’ＭＤＰはカルーバイオケム（Ｃａｌ　−Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ）から購入した。

’　１ｘ９／ｘ（ｌの濃度の化合物■は、０．０６内毒素ユニツト／ｘρの感受 性を有するＬＡＬ測定法によって測定すると検出可能な内毒素を有していなかっ た。

４２３μ９／畦の濃度のリポソーム中化合物■は、０．Ｇ６内部毒素ユニｙト／ １ｉｔＱの感受性を有するＬＡＬ測定法によって測定すると検出可能な内毒素を 有していなかった。

５リポソームは１９モル比７：３のホスファチジルコリン；ホスファチジルグリ セロールからなっていた。

実施例１４ ７〜８週齢のＢａ１ｂ／ｃマウスにＭｅｔｈＡ肉腫（Ｉ　Ｘ　１０１１細胞）を 皮下注射し、８日目に単独または１〜１０μｇのＭＤＰもしくは化合物■と混合 したニス・チフィムリウム（Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）　ＲｅＧ３０／２１ 由来のリポ多糖類１０μ９で静脈内的に処置した。治療の６日後、腫瘍の増殖を 比較した。

該動物を追跡し、注射の後、６００日目治癒率を測定した。

第３表に示す結果は、粗化合物よりも効果的であるリポ多糖類にによる化合物の 付加的効果を示した。

第３表 マウスにおける腫瘍の増殖に対するリポ多糖類によるＧＭＴＰ−ＧＤＰの効果 処置後６日目の 平均腫瘍面積　　　６００日目 グループ１　　　　　　　　　　変化率　　　　　　完全な後退対照　　　　　 　　　　　　　１９１％　　　　　　　　０％ＬＰＳ、。　　　　　　　　　　

１６５％　　　　　　　　Ｏ％ＬＰＳ、、ＭＤＰ、ｏ　　　　　　　２２％　　 　　　　　３３％Ｌ　Ｐ　Ｓ　、、化合物ＩＸ、、、　　　　　−５６％　　　 　　　５０％ＬＰＳ、、ＭＤＰ、ｓ　　　　　　　−５６％　　　　　　　７５ ％Ｌ　Ｐ　Ｓ　、、化合物■、。　　　　　−６７％　　　　　　１００％ｌ下 付の数字は、化合物の量をμ９で表す。

実施例１５ マウスおよびギニアブタにおける急性毒性１７〜２２９の体重の２匹のマウスと ４００９未満の体重の２匹のギニアブタに、５Ｊ１０当たり化合物ｌＸ１ｍｇ、 １−バルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン１，７４０ｇおよびジ オレオイルホスファチジルグリセロール’７６０ｍｇを含有する最終臨床製剤０ ゜５３１１２および５ｘ＆を１回腹腔内注射した。該動物の体重および窮迫の臨 床学的徴候を毎日観察した。結果、ギニアブタにおいて、まず体重減少がみられ 、その後、７日目に体重増加がみられた。マウスは、体重を維持しており、７日 目に増加を示した。

実施例１６ マウスにおける亜急性毒性 １０匹のマウスのグループに、体重１にｇ当たり１，３２０μ９の投与量で、週 に２回、４週間、静脈内注射した。これを計算すると、１１当たり４１１ｇの予 測最大ヒト投与量の１０倍と同一である。１からに９に変換する場合、通常の体 表面積１．７３ｍ２当たり７０に９の等価に代えて、体表面積１．７３ｘ２当た り６０ｋｇの等価を使用し、結果、毒性研究に関して多少高い投与量となった。

結果、試験の４週間にわたって、体重減少が示されなかった。

実施例１７ ウサギにおける亜急性毒性 １４日間、毎日、体重１にｇ当たりリポソーム中化合物■　１３２μこの投与量 で３匹のウサギを静脈内的に処置した。１５日口に、臨床実験に関して心臓穿刺 によって血液を得、毒性の組織学的証拠に関して完全に剖検を行った。３匹のウ サギの耳静脈および心臓穿刺によって血液を得た。

この研究の結果、毒性の病理学的証拠は見られなかった。対照と比較して、処置 したウサギ由来の血液化学の観察によって、クレアチニンホスホキナーゼの有意 な増大を有する１匹のウサギが見いだされた。この異常値は、心臓穿刺後の対照 動物におけるクレアチニンホスホキナーゼの増大によって証明されるように、心 臓穿刺の外傷に関連すると思われている。

本発明は、種々の特定の、および好ましい具体例および技術に関して記載されて いる。しかし、本発明の意図および範囲内である限り、多（の変形および変更が 行われることは理解されるべきである。

国際調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）式［Ｉ］： ▲数式、化学式、表等があります▼［Ｉ］［式中、Ｒ１は（Ｃ１〜Ｃ８）アルキ ルであり、Ｒ２は（Ｃ１〜Ｃ５）アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は、各々、約 ０〜４つの二重結合を含んでいる（Ｃ８〜Ｃ３０）アルキル基であり、Ｘは、任 意のペプチジル残基である］ で示される化合物およびその医薬的に許容される塩。
2. （２）Ｒ１がＣＨ３である請求項（１）記載の化合物。
3. （３）Ｒ２がＣＨ３である請求項（２）記載の化合物。
4. （４）ＸがＬ−アラニン残基である請求項（１）記載の化合物。
5. （５）Ｒ３およびＲ４が、各々、約０〜１つの二重結合を含んでいる（Ｃ１２〜 Ｃ２３）アルキル基である請求項（１）記載の化合物。
6. （６）Ｒ３がＣ１５アルキル基である請求項（５）記載の化合物。
7. （７）Ｒ４がＣ１５アルキル基である請求項（６）記載の化合物。
8. （８）Ｒ１およびＲ２がＣＨ３である請求項（５）記載の化合物。
9. （９）効果的な免疫調節量の請求項（１）記載の化合物と医薬的に許容される液 体ビヒクルとからなる組成物。
10. （１０）さらにリポ多糖類を含有する請求項（９）記載の組成物。
11. （１１）式［Ｉ］： ▲数式、化学式、表等があります▼［Ｉ］［式中、Ｒ１は（Ｃ１〜Ｃ８）アルキ ルであり、Ｒ２は（Ｃ１〜Ｃ５）アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は、各々、約 ０〜４つの二重結合を含んでいる（Ｃ８〜Ｃ３０）アルキル基であり、Ｘは、任 意のペプチジル残基である］ で示される化合物およびその医薬的に許容される塩からなるリボソーム。
12. （１２）本質的に、リボソームが、本質的に重量比約５：１〜１：１の１−バル ミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリンとジオレオイルホスファチジ ルコリンからなる２層膜および式［Ｉ］：▲数式、化学式、表等があります▼［ Ｉ］［式中、Ｒ１は（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルであり、Ｒ２は（Ｃ１〜Ｃ５）アル キルであり、Ｒ３およびＲ４は、各々、約０〜４つの二重結合を含んでいる（Ｃ ８〜Ｃ３０）アルキル基であり、Ｘは、任意のペプチジル残基である］ で示される化合物およびその医薬的に許容される塩を有するリポソームからなる 組成物。
13. （１３）重重比が約７：３である請求項（１２）記載の組成物。
14. （１４）有効量の請求項（１）または（１２）記載の組成物および医薬的に許容 されるビヒクルを投与することからなる哺乳動物の免疫応答を刺激する方法。