PT94517A - Processco para a preparacao de derivados de muramil-dipeptideos - Google Patents

Description

1 -3- 1 -3-

Λ

Ο invento diz respeito às formas do derivado de 3-0-ZN-acetilmuramil-D-isoglutaminil7-l,2-di--O-palmitoil-sn-glicerol, de fórmula I

em que o átomo de carbono, marcado com um asterisco (daqui em diante referido, abreviadamente, como "o C*") tem a configuração R ou, respectivamente, S. Este derivado é, daqui em diante referido, abreviadamente, como "o composto do invento".

Quando o C tem a configuração R, o resíduo de amino-ácido correspondente é L-treonilo; quando ele tem a configuração S, o resíduo é L-alotreonilo. É prefe-rida a forma do composto do invento, em que o C tem a configuração R. Como é evidente a partir da fórmula anterior, o composto tem duas formas anoméricas.

Os compostos, com uma estrutura semelhante e com uma actividade afim, são 'conhecidos através de, por exemplo, ANVAR EP 165123; a fórmula, na página 4 dessa publicação, abrange o composto do invento em consideração. 0 composto do invento em consideração não é, contudo, divulgado

s especificamente, em qualquer documento, nem é sugerido pela técnica anterior. Ele possui propriedades imensamente mais benéficas do que os compostos da técnica. 0 composto do invento em consideração pode, também, ser designado por L-treonil-MDP-GDP e, respectivamente, por L-alotreonil-MDP-GDP. 0 presente invento compreende,

para além disso, um processo para a preparação do composto de fórmula I, que consiste na desprotecção de um composto correspondente de fórmula II

4$ ~ em que o C como anteriormente definido e, e a sao, m-dependentemente, um grupo de protecção de hidroxi. 0 processo do invento pode ser efectuado de uma maneira convencional, para remoção dos grupos de protecção de hidroxi. 0 material de partida pode ser o anó-mero de ^-ouJ3-glicosídeo, ou uma mistura dos dois. A desprotecção pode ser efectuada numa, ou em diversas, fases de reacção. 0 composto de fórmula I é, normalmente, obtido como uma mistu- -5- *

ra de ambas as formas anoméricas. Elas podem ser separadas, se for desejado, por processos convencionais. 0 processo pode, por exemplo, ser efectuado redutivamente, de preferência com hidrogénio, num catalisador de paládio sobre carvão vegetal, utilizando, por exemplo, o ácido como solvente. Qualquer grupo convencional de protecção de hidroxi, susceptível de hidroge-nação, pode ser empregado, por exemplo o benziloxicarbonilo ou o benzilo. R.^ e R2 podem também formar, em conjunto, um grupo de protecção comum, tal como o benzilideno. A desprotecção pode, também, ser efectuada, por exemplo, sob condições acídi-cas. Um grupo de protecção preferido, para a desprotecção,sob condições acídicas, é o terc-butoxicarbonilo (BOC).

Os materiais de partida podem, também, ser preparados de uma maneira convencional, por exemplo de acordo com o esquema de reacções, que se segue: -6-

Λ

0

Compostos de fórmula II %

No esquema anterior, o C e a são como anteriormente definido e R' é um grupo de protec- -7-

ção de amino, X é uma forma activada de ácido carboxílico, BOP é um grupo de hexafluorofosfato de benztriazol-l-iloxitris-(dimetilamino)fosfónico e BOC é terc.-butoxicarbonilo. A remoção de R1 é, de preferência, efectuada sob condições acídicas. R' é, de preferência, benzil-oxicarbonilo. X é, de preferência, -0C(=0)-0 alquilo, tal como -OC(=0)-och2ch(ch3)2.

Os exemplos, que se seguem, ilustram o invento. Todas as temperaturas são em graus Centígrados. As abreviaturas utilizadas têm o significado, que se segue: BOC é terc.-butoxicarbonilo,

Bzl é benzilo,

Alotre é L-alotreonilo,

Tre é L-treonilo, Z-D-iGln é carbobenzoxi-D-isoglutamina,

Pd/C é paládio sobre carvão vegetal, tBDMS é terc.-butildimetilsililo. EXEMPLO 1 3-0-/rN-Acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutaminil7-l ,2-di-0-pal-mitoíl-sn-glicerol

(C * tem a configuração R). -8-

120 mg de 3-0-/1 -cK-O-benzil-4,6--O-benziliden-N-acetilmuramil-0-benzil-L-treonil-D-isoglutami-nil.7-1,2-di-0-palmitoíl-sn-glicerol são dissolvidos em 20 ml de ácido acético a 100%, e são feitos reagir com um catalisador pré-hidrogenado /90 mg de Pd a 10%/C, 15 mg de cloreto de paládio (PdC^) em 20 ml de ácido acético a 100%, hidrogenado durante 45 minutos, com hidrogénio_7. A mistura é agitada, durante 2 horas, sob hidrogénio, o catalisador é separado por filtração, e a solução é concentrada e evaporada até a secura, por três vezes, com tolueno. O resíduo é cromatografado sobre gel de sílica, utilizando o diclorometano/metanol/éter di-iso-propílico, na proporção de 4:1:1, como eluente. O produto resultante é cromatografado sobre Sephadex LH-20 , utilizando o diclorometano/metanol, na proporção de 1:1, como o eluente. A solução é evaporada até a secura e é liofilizada a partir de ácido acético. É obtido o composto em epígrafe (mistura de ambos os anómeros): 1H-NMR: 0,90(t,J=7,6H); 1.22(d,J=7,3H); l,25(s,48H); 1.41(d,J=7,3H); 1.64(m,4H); 2.00(m,3H); 2,22(ra,lH); 2.34(m,4H); 2.48(m,2H); 3.40-3.98(m,6H); 4.12-4.60(m,8H); 5.20(d,J=3,lH); 5.26(m,lH). 0 material de partida é obtido, como se segue: a) 740 mg de Z-D-iGln são dissolvidos em 6 ml de uma mistura seca de dimetilformamida/tetra-hidrofu-rano, na proporção de 1:1, e feitos reagir, na escuridão, com 1,46 gramas de hexafluorofosfato de benztriazol-l-iloxitris--(dimetilamino)fosfónio e 365 ul de N-metilmorfolina. Depois de 30 minutos, são adicionados 1,14 gramas de 1,2-dipalmitoíl- -9-

-sn-glicerol e 270 mg de imidazole, e a mistura da reacção é agitada, além disso,.na escuridão, durante 4 dias. Depois da evaporação da mistura solvente, o resíduo é cromatografado sobre o gel de sílica, utilizando o diclorometano/metanol, na proporção de 20:1, como eluente. Obtém-se o 3-0-/benziloxicar-bonil-D-isoglutaminilJ-1,2-di-0-palmitoíl-sn-glicerol. 1H-NMR: 0.89(t,J=7,6H); 1.28(s,48H); 1.62(ra,4H); 1.95(m,lH)j 2.15(m,lH); 2.34(m,4H); 2.46(m,2H)j 4.25(m,5H); 5.12(s,2H); 5.2'7(m,lH); 7.35(s,5H>. b) 400 mg do composto, obtido ante-riormente, são dissolvidos em 20 ml de ácido acético a 100%, e feitos reagir com 40 mg de Pd a 10%/C. A agitação é prosseguida , durante 2 horas, sob uma atmosfera de hidrogénio, o catalisador é separado por filtração e o resíduo é evaporado, por três vezes, até a secura, com tolueno. O resíduo é dissolvido em 8 ml de diclorometano, com adição de 60 μΐ de N-metilmorfo-lina (solução A).

Dissolvem-se 160 mg de BOC-Tre (Bzl)-OH, em 8 ml de diclorometano, em conjunto com 233 pl de N-metilmorfolina e 73 jil de éster de isobutilo do ácido cloro-fórmico, e a mistura é agitada, à temperatura ambiente, durante 45 minutos (= solução B). A solução B é arrefecida até +4e, e solução A é adicionada a ela. A mistura é agitada, durante 18 horas, à temperatura ambiente, o solvente é evaporado e a purificação é efectuada pela cromatografia sobre gel de sílica, utilizando diclorometano/metanol, na proporção de 100:1 até 100:3, como o eluente; obtêm-se o 3-0-/\erc-butoxicarbonil-0--benzil-L-treonil-D-isoglutaminil7-l,2-di-O-palmitoíl-sn-gli- -10-

cerol; 1H-NMR: 0.88(t,J=7,6H); 1.26(s,48H); 1.47(s,9H); 1.60(m,4H); 1.94(m,lH); 2.14-2.58(m,7H); 4.10-4.34(m,6H); 4.45(m,2H); 4.60(d,2H); 5.15(m,lH); 5.23(m,lH); 5.40(m,lH); 6.35(m,lH); 7.13(m,1H); 7.30(m,5H). , c) 580 mg do composto, obtido ante- riormente em b), são feitos reagir a +4Q com 20 ml de ácido trifluoracético, e a mistura é agitada, durante 30 minutos. A solução é concentrada e é evaporada até a secura, por duas vezes, com tolueno. O resíduo é feito reagir com 10 ml de diclo-rometano e 65 ul de N-metilmorfolina (é a solução A). 278 mg de ácido ©í-0-benzil-4,6--benzilideno-N-acetilmurámico são dissolvidos em 10 ml de di-clorometano, em conjunto com 259 μΐ de N-metilmorfolina e 81 pl de éster de isobutilo do ácido clorofórmico, e a mistura é agitada, durante 35 minutos, à temperatura ambiente (é a solução B). A solução A é adicionada, gota a gota e lentamente, à solução B, a +4°, e a mistura é deixada a arrefecer, durante 2 dias, à temperatura ambiente. Depois da evaporação do solvente, o resíduo é cromatografado sobre gel de sílica, utilizando diclorometano/metanol, na proporção de 100:1 até 10:1, como eluente. Obtém-se o 3-0-/l-o(-benzil--4,6-0-benzilideno-N-acetilmuramil-0-benzil-L-treonil-D-iso-glutaminil^-l,2-di-0-palmitoíl-sn-glicerol:

1H-NMR: 0.88(t,J=7,6H); 1.22(d,J=7,3H)·, 1.37(d, J=7,3H); 1.60(m,4H); 1.98(s,3H); 2.02(m,lH); 2.30(m,4H); 2.44(m,4H); 3.66-3.94(m,4H); 4.06-4.46(m,10H); 4.90(d,J=4,1H)j 5.25(m,lH); 5.60(s,lH); 6.78(d,lH); 7.10(d,lH)} 7.40<m,10H); 7.60(d,lH). EXEMPLO 2 3-0-/N-Acetilmuramil-L-alotreonil-D-isoglutaminil7-l,2-di-0--palmitoíl-sn-glicerol (C tem a configuração S) 0 composto em epígrafe é obtido de uma maneira idêntica à do Exemplo 1, partindo do composto correspondente L-alotreonilo: 0.88<t,J,7,6H), 1.25(s,48H); l.A0(4,J.7,3B), ' f 2.24(m,lH); 2.35(m,4H); 2.48(m,2H); 3.40-3.98(m,6H); 4.10-4.60(1,8H); 5.23(d,J.3,lH); 5.26(m,lB). O composto de L-alotreonilo, empregado como material de partida, é obtido, como se segue: -12-

a) 0 3-0-^benziloxicarbonil-D-iso-glutaminil7-l,2-di-0-palmitoíl-sb-glicerol é preparado como se encontra descrito no Exemplo 1, passo a); b) O 3-0-/Benziloxicarbonil-0-tert- -butildimetilsilil-L-alotreonil-D-isoglutaminilJ-l,2-di-0-pal-mitoíl-sn-glicerol é preparado de uma maneira análoga à do Exemplo 1, passo b), utilizando Bzl-alotre(tBDMS)-0H, eiívez de BOC-Tre(Bzl)-OH; . ^H-NMR: 0.02(s,3H); 0.04(s,3H); 0.93(mf15H); 1.16(d,J=7,3H); 1.25(m,48H); 1.67(m,4H); 1.90(m,lH); 2.07(m,lH); 2.28(m,4H); 2.42(m,2H); 4.03-4,40(m,7H); 5.08(m,2H); 5.13(m,lH); 7.30(m,5H); 7.46(d,lH); c) O 3-0-£l-ô(-0-benzil-4,6-0-benzi- liden-N-acetilmuramil-O-tert-butil-dimetilsilil-L-alotreonil--D-isoglutaminilJ-l,2-di-0-palmitoíl-sn-glicerol é preparada de uma maneira análoga à do Exemplo 1, passo c): íH.-NMRí 0.08(s,3H); 0.10(s,3H); 0.88(m,15H); 1.17(d,J=7,3H)$ 1.25(m,48H); 1.37(d,J=7,3H); 1.64(m,4H); 1.95(m,lH); 1.97(s,3H);2.13(m,lH)5 2.34(m,4H); 2.46(m,2H); 3.65(m,4H); 3.98-4.40(m,10H); 4.66(dd,J=13.40,lH); 5.15(d,J=3,lH); 5.25(m,lH); 5.60(s,lH); 7.25-7.53(m,10H); 8.23(d,lH). O composto do invento possui uma excelente actividade farmacológica. Está, por isso, indicado para o emprego como um produto farmacêutico. -13- χ

Em particular, tem-se verificado que ele possui uma pronunciada actividade imunomodulador. Esta actividade pode ser demonstrada utilizando-se diversos métodos de teste, esclarecidos com mais detalha, mais adiante nesta Memória Descritiva.

As abreviaturas utilizadas têm os significados, que se seguem:

Substância A: forma do composto do Exemplo 1; Substância B: forma do composto do Exemplo 2; ABC BPO-BSA: BPO-KLH: BSA: células de formação de anticorpos específicos para hapteno; benzilpeniciloxi-albumina de soro bovino; benzilopeniciloil-hemocianina de lapa "buraco de fechadura"; albumina de soro bovino; CMI: ConA CSP: CY: DTH: imunidade mediada por células; Concanavalina-A factor de estimulação de colónias; ciclofosfamida; hipersensibilidade do tipo retardada; ELISA: ensaio imunosorvente ligado a enzimas; FIA: adjuvante incompleto de Freund; Hl: imunidade humoral; IFN-γ: interferão gama; IL-1 (IL-Ιβ): interleucina-1 (interleucina-1 Ji); -14- ν LAF: factor de activação de linfóêi-tos; LPS: lipopolisacarídeo; MDP: muramil-dipeptídeo; MDP-GDP: S-O-^N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil/--1,2-di-0-palmitoíl-sn-glicerol (composto do Exemplo 1, em ANVAR EP 165123); NTB: Azul Nitro-tetrazólio; PBL: leucócitos sanguíneos periféricos; PEC: células de exsudato peritonal; PHA: fito-hemaglutinina; PMA: acetato de miristato de forbol; PMN: células polimorfonucleares; TNF: factor de necrose tumoral; A) Tem sido verificado que o compos- to do invento é caracterizado por muito menos efeitos secundá rios quando comparado com os compostos estruturalmente semelhantes , tais como MDP-GDP; por isso, é muito melhor tolerado Esta propriedade, particularmente benéfica, pode ser evidenciada, por exemplo pelas experiências que se seguem: 1) Pirogenicidade em coelhos: o método de teste é como o descrito na bibliografia, por exemplo, na Farmacopeia dos Estados Unidos da América. Os resultados obtidos são os que se seguem (Tabela 1):

TABELA 1

Pirogenicidade, em coelhos

Substância Mais elevada dose não pirogénica (pg/kg i.v.) Mais baixa dose nica (pg/kg i.v pirogé-.) A 1.000 5.000 B 20 50 MDP-GDP 10 20 2) Sinergismo tóxico, com LPS: nesta experiência, ratinhos suiços receberam LPS, intravenosamente, e ou MDP-GDP ou a substância A, nas doses indicadas (Tabela 1 bis) : TABELA 1 bis

Inexistência de sinergismo tóxico, com LPS

Substância Tratamento Mortalidade acumulativa __mortos/total_

Controlo +LPS 25 pg 0 / 18 MDP-GDP (300 pg) +LPS 23 pg 17 / 18 A (300 pg) +LPS 25 pg 3 / 18

Todos os ratinhos receberam 25 ug de S. enteridis LPS i.v. , isoladamente, ou com MDP GDP ou com a substância A. Os resultados foram obtidos em 3 ensaios idên-ticos, utilizando 6 ratinhos/grupo._

Os resultados obtidos nas duas experiências precedentes (pirogenicidade e sinergismo tóxico, Tabelas 1 e 1 bis), revelam um aperfeiçoamento assinalado, nos efeitos secundários, quando comparados com MDP-GDP.

Outros métodos de teste são, por exemplo, os que se seguem:

a) Indução de TNF, em culturas de medula óssea de ratinhos, em PBLs de coelhos (sem a pré-activação com IFN-)r) e em PBLS humanos:

Este ensaio encontra-se descrito, em pormenor, em T.J. Sayers et al., J. Immunol. 136 (1986) 2935-2940. A actividade de TNF é medida a partir da actividade lítica sobre as células L 929. Os resultados estão resumidos na Tabela 2, e revelam que ambas as formasA e B do composto do invento são indutores muito fracos de TNF, e possuem, deste modo, um potencial endotóxico marcadamente inferior ao dos compostos de referência. Estes resultados adaptam-se, também, bem aos resultados obtidos com a substância A, utilizando células sanguíneas mononucleares, periféricas, humanas ou de coelhos, isolados com Ficoll (Tabelas 3 e 4)

TABELA 2

Indução de TNF, em culturas de medula óssea de macrófagos de murinos

Concentração TNF Unidades Internacion. IU) Substância (yg/ml) sem1 INF-y INF-γ (100 IU) A 1 < 5 < 5 10 < 5 25 B 1 < 5 99 10 < 5 40 MDP-GDP 1 < 5 205 10 < 5 276 LPS 0.01 377 2.245 Salmonella abort. equi 0.001 17 119 SÓ solvente < 5 < 5 TABELA 3

Indução de TNF, em células sanguíneas monocleares, periféricas de coelhos (sem a preactivação com IFN-Y). ~ ~ TNF (unidades internacion.iu)

Substância Concentração 1§. experiência 2§. experiência (ug/ml) Coelho 1 Coelho 2 Coelho 3 Coelho 4 A 1 < 8 < 8 39 28 10 44 76 204 163 MDP-GDP 1 233 328 196 157 10 571 687 643 724 LPS Salmonella abort. 0.01 989 1198 1002 637 equi 0.001 361 680 318 230 Só solvente - < 8 < 8 14 20 só meio < 8 < 8 27 26 TABELA 4

Indução de TNF, em células sanguíneas monocleares, humanas, __periféricas________

Substância Concentração (jjg/ml) TNF (pg/ml) 1~· experiência 2§. Coelho 1 Coelho 2 experiência Coelho 3 A 1 27 82 63 10 248 196 163 20 291 225 198 MDP-GDP 1 493 107 10 654 94 59 LPS Salmonella abort. 0.01 26 1000 538 equi 0.001 18 1195 699 SÓ solvente - 0 0 0 Só meio de cres-cimento_ 0 0 0 b) Indução de IL-1: A actividade de IL-lp ou de LAF, respectivamente, é ensaiada de acordo com os métodos de J.

Gery et al., J. Exp. Med. 136 (1972) 128-142, e de J. Oppenheim et al., Cellular Immunol, 50 (1980) 71-81. Os resultados (Tabela 5) indicam que a proliferação é aumentsida significativamente, unicamente à concentração mais elevada de 50 pg/ml, quando comparada com o solvente isolado: -19-

TABELA 5

Indução da actividade do LAF (IL-1J3) , em macrofagos peritonais, extraídos de murinos

Substância Coffi^S)a?âo Actividade Diluição 1:4 (cpm) ."Diluição 1:8 A 1 446 361 10 1014 1267 50 2338 2701 MDP-GDP 1 691 391 10 1220 380 50 4491 1106 LPS 10 5809 3096 Salmonella abort. equi 1 329 326 so meio de crescimento - 427 _ Só sobrenadante - 374 513 Só solvente 10 % 1546 1645 c) Indução de toxicidade de macrofagos (PECs de ratinhos), contra as células tumorais (P 815).

Os ratinhos são pré-tratados in-traperitonalmente, com 15 ml de caldo de tioglicolato a 2,9% (Merck-Darmstadt, FRG). Depois de 4 dias, os macrofagos são exsudados na cavidade peritonal, e são colhidos por lavagem. Quando extraídos, os macrofagos de ratinhos aderentes são co-cultivados com as células tumorais, LPS ou substâncias imunc-cstimuladoras, que podem activar os macrofagos, com lise resultante ou com a inibição do crescimento das células tumorais Esta activação pode ser, além disso, realçada pela adição de IFN-7*. 0 número das células sobreviventes, depois de 24 horas de cultivação, é determinada pela medida da incorporação de Z^Hj-timidina. A comparação, com um controlo negativo e com um controlo positivo de LPS, dá uma medida da actividade lítica, ou citotóxica, em percentagens, para uma concentração dada, da substância de teste (Tabela 6): TABELA 6

Indução da citotoxieidade de macrófagos, contra as células tumorais

Concentração % de inibição de células de tumor.P815 Substância (yg/ml) NenhumIFN-γ IFN-γ (1 U) IFN-γ (5 U) A 1 55 41 94 10 62 28 99 MDP-GDP 1 71 40 99 10 62 62 99 LPS Salmonella abort. 0.01 77 98 99 equi 0.001 84 60 99 Só solvente - 5 10 10 SÓ meio de crescimento 0 10 10 d) Indução da actividade do LAF, nas PECs de ratinhos, depois da incubação, durante 24 horas .(ensaio de timócitos, co-es-- \ timulação com PHA 1:50):

Neste ensaio (J. Exp. Med. 136 /1972/ 128-155), as substâncias A e B exibem um perfil de actividade semelhante à de MDP-GDP. -21- e) Uma outra actividade, de grande importância, na terapia de tumores, a qual se verificou ser possuída pelo composto do invento, utilizando roedores pre-tratados com a ciclofosfamida, ou com a irradiação de rais X, é uma estimulação da proliferação e diferenciação de mieloblastos, dependente da dose, em linfócitos maduros, na medula óssea. f) Reacção proliferativa das células da medula óssea, de ratinhos tratados com ciclofosfamida: ratinhos receberam, intra-peritonalmente, 5 mg de ciclofosfamida, um dia após um tratamento com MDP-GDP, ou com a substância A. As células foram colhidas, no dia 4 do tratamento com a ciclofosfamida, e foram incubadas na presença dum meio condicionado, quer de células L929 ("L") contendo CSF-1 (E.R. Stanley e L.G. Guilbert, J. Immunol Methods 42 ^l981j 253, quer de pulmões de ratinhos tratados com LPS (GM-CSF de "pulmão"), como se encontra descrito por Sheridan e Metcalf, J. Cell Physiology 81 /19 73J? 11, em diversas diluições. A reacção das células a CSF, ou a GM-CSF, é medida pela incorporação de H-timidina, como comparada com os controlos. Os resultados revelam que, em contraste com MDP--GDP, a substância A pode restaurar a reacção proliferativa das células a um tratamento de CSF (veja a Figura):

Explicação da Figura: A reacção proliferativa das células da medula óssea, de ratinhos tratados com CY, no dia 0 e com MDP-GDP (300 ug), ou com a substância A (300 jig) , no dia -1 V : controlo + células L contendo CSF, ou controlo + GM-CSF de pulmão; φ : MDP-GDP + células L contendo CSF, ou MDP-GDP + GM-CSF de pulmão, respectivamente; -22-

# : substância A + células L contendo CSF, ou substância A + GM-CSF de pulmão, respectivamente.

FIGURA CPM X 1θ7

DILUIÇÕES

DILUIÇÕES -24- -24-

g) Aumento da resistência não específica, de ratinhos, à infecção: A capacidade da substância A, em aumentar a resistência de ratinhos a infecção, tem sido avaliada, em ratinhos, num modelo de infecção bacteriana. Ratinhos suíços são tratados intravenosamente com MDP-GDP, ou com a substância A. Depois de 24 horas, eles recebem um desafio letal (8 x 104 organismos) de Klebsiella pneumoniae (Tabela 7): TABELA 7

Protecção contra a infecção de Klebsiella, em ratinhos

Substância Tratamento (i. v. no dia 1) (hg/ratinhos Sobrevivência Nenhuma - 1/32 MDP-GDP 30 14/24 (p<0.01) 100 19/24 (p<0.01) A 30 10/24 (p<0.01) 100 14/24 (p<0.01)

Sviss mice are administered on day -1 the compounds by the intravenous route. They are challenged by the same route with 8xl04 bactéria. Deaths are recorded for three veeks after the challenge. A ratinhos suíços, são administrados no dia -1, os compostos, por via intravenosa. Eles são desafiados, pela mesma via, com 8 x 104 bactérias. As mortes são registadas, durante três semanas, após o desafio. -25- -25-

·>*

Pode-se verificar, pela Tabela 7, que, quando comparados com os seus controlos não tratados, MDP-GDP e a substância A aumentam, dramaticamente, a resistência não específica dos ratinhos, à infecção. h) Actividade adjuvante: A capacidade da substância A, em originar imunidade mediada por células, e em aumentar as reacções específicas humorais, a um antigénio, tem sido avaliada. Porquinhos-da-India Hartley machos, de controlo e experimentais com o peso de 300 gramas, receberam, na sola da pata posterior, uma dose total de 1 mg de ovalbumina, em 0,2 ml duma emulsão de água em óleo (adjuvante incompleto de Freund, FIA). Para os grupos experimentais, o adjuvante foi adicionado, a uma dose de 0,1 mg, à emulsão.

Com a finalidade de se avaliar a sua imunidade mediada por células (CMI), os animais foram testados na pele, no dia 21, com uma injecção intradérmica de 0,1 mg de ovalbumina, em solução salina. As reacções dérmicas foram verificadas, depois de 6, 24 e 48 horas, e os resultados são expressos como diâmetros de endurecimento, depois de 48 horas. Com a finalidade de se avaliar a sua imunidade humoral (Hl), os animais foram sangrados, por punção cardíaca, no dia 24. Os títulos de anticorpos anti-ovalbumina foram medidos por ELISA, sob condições padrão. Os títulos individuais e médios são apresentados. Verifica-se, pela Tabela 8, que a substância A estimula, ainda mais do que MDP-GDP, tanto as reacções específicas de CMI, como as de Hl: -26-

TABELA 8 A actividade adjuvante, nas reacções humorais e imunes mediádos em células ____-_-

Reacção humoral^ (títulos de ELISA) DTíF)

Substâncias (diâmetros) (mm de endurecimento)

Controlos 0(6)

MDP-GDP A 8-14-15-17 (13.5) 15 - 15 - 18 - 20 20 - 25 (18.5) 8000 - 21000 - 21500 -37000 - 65000 - 95000 -(41250) 247000 - 295000 - 641000 -325000 (377000) 100000 - 172000 - 780000 -850000 - 472000 - 330000 -(450000) 1 * Results are expressed as diameters of induration after 48 hours. Individual measurements and arithmetical means (between brackets) are given. 2 1 Anti-ovalbumin antibody titers vere measured by ELISA under Standard conditions. Individual titers and means are given. 1) Os resultados são expressos como diâmetros de endurecimento depois de 48 horas. As medidas individuais e as médias aritméticos (entre parênteses) estão apresentados. 2) Os títulos de anticorpos anti-ovalbumina foram medidos por ELISA, sob condições padrão. Os títulos individuais e médios são apresentados. i) Influência, na resposta, dos linfócitos sanguíneos periféricos de coelhos, aos mitogénios. A substância A foi injectada, intravenosamente, em coelhos, a uma dose de 100 jig. Antes e três horas depois desta administração, foram recolhidas amostras do -27-

sangue. Os ensaios de transformantes linfoblástioa foram realizados , utilizando as células mononucleares, que foram incubadas com ConA ou PHA. O efeito mitogénico foi medido pelo aumen-to na incorporação de JH-timidina e é expresso como o número de contagem por minuto (cpm). Os resultados estão registados na Tabela 9: TABELA 9 A transformação linfoblástica, por mitogénios in vitro, depois de um tratamento in vivo . com a substância A 1 Coelhos Solução Salina Incubação in vivo com: ConA PHA (1 yg/ml) (10 yg/ml) (1 yg/ml) (10 yg/ml) Controb 1 TO 1086 3782 6190 3078 2423 T3 1612 5570 6844 6880 5905 Controb 2 TO 577 3354 2459 3316 1610 T3 383 5194 428 2095 1206 A TO 2926 3132 5204 2479 2591 Tratada 1 T3 983 22241 39469 16754 30270 A TO 412 6342 2778 10149 2936 Tratada 2 T3 324 10721 118597 15734 91434 A TO 487 15521 6917 10020 12482 Tratada 3 T3 239 55690 50572 32228 37538 A TO 732 951 1287 600 569 T3 1327 9252 6493 4570 2648 -28-

Pode verificar-se, pela Tabela 9, que, quando comparado com as células dos coelhos não tratados, o tratamento in vivo, com a substância A, tem -aumentado, notoriamente, a capacidade dos linfócitos, para reagir in vi-tro às dosagens sub-óptimas de mitogénio. J) Reacções das células polimorfonucleares (PMN) de sangue, depois de tratamento in vitro, ou de tratamento in vivo. A resposta oxidativa e a potência candidacidal foram avaliadas de acordo com os processos clássicos. PMN purificados do sangue humano, ou de porquinhos-da--India, foram cultivados, na presença da substância A, antes de se medir a explosão oxidativa, em reacção a PMA, ou às células C. albicans, dentro de uma hora, ou o crescimento de C. albicans, durante 18 horas. Os resultados (Tabela 10) revelam o efeito estimulante da substância A, nestas células, sem prestar atenção à sua origem (humana ou de porquinhos-da-India): I -29-

0) β3 Ο fc. to β β (Ο Λ 2 S cm β β β β 1) !0ου β β β β β β β β β •Η % 3 "2 % ιΗ > I • · β I Ο Η I ι—1 ΚΩ X <τ> 00 σ> 00 Ο X I #* * S % % Η % * 1—I 2 1 00 Ρ- X CN CN rH 00 2 1 CM 1 ι L0 r· σι ιχ C0 σι •Η U ο β I β Μ 1 β 11 0 ίβ > 1 ç> β 1 Μ Η 1 uo 00 CM Ο • · { ·» ·» ·* α ιΗ 2 1 CM Ο 00 Τ—\ ο ·· 2 1 CN β Ο Οι 1 Qj 00 β Λ Ν 1-1 * *β ο β 00 > β β β Η β ο Η C Μ CQ < «: β •Η ϋ β <β X β X β CQ βε ο υ β •Η β β Η I β β I β Ο XI β Η β σ Μ ο Οι

X β > -Η X β β •Η ο â 8° β β β ι β ο β !β Ο» w β s Cm

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β 1 00 CM σ X 1 * S κ Ο 1 Ο 1 ι σ CNJ 1 1 OJ CVJ 1 00 ΚΩ LO ο !β ο β X! β Ο β •Η I 'β β α β β β Ηυ β <β β χ β Η β < Ο ίβ β Ο -Η β Ο 8 8 ti 1 ·8 ^β βα3 β ι—Iε β β

ο ι—I I I β β β β β Η β γΗ 1 β β •ΗΕ Η I β βι 0 ι—Iο

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•Η1 a βχ 2 S CM Ο α β 0 β U β β -Η 0 ίβ β ο β •Η β 0 β ίβ Ο (0 •Η β β C CQ •Η -Η ε 0 Η α β β β β ι—1 β β β CM 0 X β β β β ε β β β ε Εί m « 2 β β β υ β •Η X 0 β ίβ β ο β • β υ β β β β 01 β β β β β β β > 0 β 01 X β β β β • β β β 01 ε β β β •Η "β β U β U υ 0) β * •Η β β β 01 X β β β β ι—1 υ Η 0 β β 'β X 0 U ε « β β β υ β Cn 0 β β β β ίβ β X X β ο β α »η Ν β β Μ X β β 0 β β β β β β β 0 β β β β 0 Ou β β *· 'β β I—1 0 0 υ β ίβ ε 1 ο 0 01 ε X β υ β β 00 X β Cn β β β β 0 οι β X β β 01 0 β -Η β β 0 1 β 0 ίβ 'β α «! β ο β X S β β Οι W Οι CM β β X 0 k) Ensaio ex vivo foram realizadas em porquinhos-da-índia, aos quais se ministrou a substância A, por via subcutânea (500 pg/kg), 3, ou 18 horas, antes de se colher o sangue, por punção cardíaca. A reacção das PMN de sangue purificado foi determinada, directamente, in vitro, depois da adição de PMN ou das células C. albicans. Como se verifica, pela Tabela 11, o pré-tratamento dos porquinhos-da-India, 18 horas antes, origina uma reacção mais forte das PMN, quando expostas, Subsequentemente, a PMA, ou às células C. albicans, enquanto o pré-tra-tamento dos animais, 3 horas antes de se reunirem as células, foi ineficiente. TABELA 11

Influência do pré-tratamento, com a substância A (500 ug/kg), na reacção das PMN dos porquinhos-da-India__ .Reacção oxidativa Potência^^candidacidaí, PMA jas células a) na proporção de

Pre-tratamento (20 nM) |(proporção 30:1) 30Π 100:1

Solução salina 55.8 33.3 17.2 25.6 Substância A (h-3) 61.1 35.2 15 17.2 Substância A (h-18) 84.9 62.7 60.1 82.1 a) Expressa como percentagem das células de redução de NBT, de acordo com E. Pick et al., J. Reticuloendothelial Soc. 30 /19817 518, uma hora depois da adição de PMA, ou das células de C. albicans, na proporção de 30:1 (PMN:células de levedura ). b) Percentagem de inibição do crescimento de C. albicans, medi- da pela diminuição da incorporação de H-glucose, nas células de levedura.

Pode, assim, concluir-se, na base dos resultados das experiências estabelecidas anterior-mente em A), que todo o composto do invento possui uma activi-dade farmacológica, muito mais benéfica do que os compostos estruturalmente semelhantes, tais como MDP-GDP. 0 composto do invento está indicado para utilização como um modulador da resistência antimi-crobiana não específica, para o melhoramento sistémico da reac-ção imune e da imunidade não específica.

Ele está, por isso, indicado, por exemplo, para o tratamento curativo, ou para o tratamento de manutenção (isto é, em conjunto com outras formas de terapia específicas, ou de manutenção) de estados de reacção imune diminuído , em particular de estados de reacção celular diminuída e imune humoral, e de estados de reacções de sobre-sensibilida-de diminuída do tipo retardada, e, além disso, no tratamento de estados de um modo geral nos quais se torna desejável uma modulação da reacção imune.

Ele está em particular indicado para o emprego no tratamento curativo, ou de manutenção, de doenças patológicas, relacionadas com as imunodeficiências idiopáticas ou com as imunodeficiências do tipo encontradas nos doentes geriátricos, ou nos doentes com queimaduras graves ou com infecções generalizadas.

Ele está ainda indicado para o emprego no tratamento curativo, ou suportável, de infecções virais, tais como as infecções disseminadas de Herpes e de as infecções disseminadas de varicela, e os tumores de Morbus -32- -32-

Hodgkin e outros tumores malignos.

Para as indicações precedentes, a dosagem a ser empregada dependerá, como é evidente, da natureza e da gravidade da doença a ser tratada, do modo da administração e da forma do composto a ser empregada. Para um objec-tivo mais amplo, uma dosagem parentérica adequada é cerca de 0,1 mg até 70 mg, administrada, por exemplo, uma vez, para a se conseguir um efeito adjuvante, por exemplo, no tratamento de manutenção, ou diariamente. A administração pode ser efec-tuada, convenientemente, duas a quatro vezes por dia, ou numa forma retardada. As formas de dosagem unitéria indicadas incluem cerca de 0 ,025 a cerca de 35 mg do composto do invento em situações de administração repetida, e até cerca de 70 mg, quando for desejada uma administração única, para o tratamento adjuvante. B) A sua actividade imunomoduladora torna, ainda, o composto do invento como indicado para o emprego como um adjuvante, em vacinas. Para esta modalidade de utilização, a dosagem diária indicada está compreendida entre cerca de 0,1 mg e cerca de 50 mg, de preferência entre cerca de 0,5 mg e cerca de 10 mg, especialmente cerca de 7 mg, administrada no dia da vacinação. Convenientemente, uma segunda administração, com a mesma dosagem, é efectuada 2 a 4 semanas mais tarde. 6) Tem-se verificado, ainda, que o composto do invento altera a reacção dos isotipos de imunoglo-bulina específicos para haptenos, em ratinhos. Esta actividade é posta em evidência, com uma experiência para a determinação da quantidade das células de formação de anticorpos específicos para haptenos (ABCs). O esquema da imunização é como se segue: Ratinhos de Balb/c recebem uma injecção intraperitonal de 10 g de BPO-KLH, em 0,2 ml de gel de hidróxido de alumínio, nos dias 0, 21 e 42. Os ratinhos são, em seguida, separados, em dois grupos: ao primeiro grupo dá-se 10 ug/ratinho do com-

posto do invento (substância A), por via oral, nos dias 44 e 45; o segundo grupo (de controlo) recebe solução salina. Os animais são mortos, nos dias 46, 51 e 70, e os linfócitos são extraídos das suas placas de Peyer, dos nodos de linfa mesen-térica e do baço. As células de 6 ratinhos são reunidas e o número de ABC ex vivo é determinado, numa experiência de Elispot, empregando-se placas reproduzidas com BPO-BSA. Os resultados obtidos encontram-se registados na Tabela 12: TABELA 12

Reacção dos isotipos de imunoglobulina específicos para haptenos

Dia da morte Orgão Células de formaç.de anticorp.espec.para haptenos IgM IgG r IgE1^ e IgA Co A Co A Co A Co (cél.de ABC/107 A 46 PP <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 ML 211 218 181 315 315 <1 104 89 SP 303 410 395 485 288 <1 143 123 51 PP <1 <1 <1 <1 <1 <1 - <1 <1 ML 197 320 273 362 286 5 98 111 SP 630 795 718 812 193 15 77 94 70 PP <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 ML 187. 174 235 347 133 111 62 53 SP 1316 918 943 1012 188 164 84 77 PP são placas de Peyer; ML são nodos de linfa mesentérica SP é o baço; Co é o controlo (solução salina fisiológica). -34-

Os resultados anteriores revelam que a seguir à imunização dos ratinhos, pela maneira indicada, as ABC de todas as classes de isotipos de Ig podem ser encontradas nos nodos das linfas mesentéricas e no baço. 0 número das células de formação de IgM e IgG foi nitidamente superior nas células do baço, do que nas células dos nodos das linfas mesentéricas, enquanto números aproximadamente semelhantes foram encontrados, em ambos os órgãos, no respeitante às ABC de IgA e de IgE. Um tratamento, com o composto do invento (substância A), de acordo com o esquema precedentes, resultou, em ambos cs órgãos, no aumento do conteúdo das ABC de IgG, ao passo que o número das ABC de formação de IgE foi reduzido. O efeito afigura-se ser transitório.

No dia 46, nenhuma ABC de formação de IgE pôde ser verificada, em qualquer um dos dois órgãos, e, no dia 51, o conteúdo era, ainda, muito reduzido. No dia 70, nenhuma diferença, com as substâncias de controlo, pôde ser verificada.

Isto é indicador de uma função reguladora do composto do invento, nas doenças alérgicas.

Quando as experiências precedentes foram repetidas, como se encontram descritas no precedente , mas com a administração da substância em experiência, no dia 44, e com a morte dos animais nos dias 45, 46, 58 e 70, obtiveram-se os resultados, que se seguem (Tabela 13): -35-

TABELA 13

Diminuição, nas ABC de formação de IgE, no baço dos ratinhos

IgA

Dia da Dosagem da experiên- Numero de morte cia (substância A) ABCs de formação de IgE ABCs de form.de (por IO7 células) mg/kg) Exper.1 Exper.2 Exper. 1 Exper.2 45 Nenhuma 317 239 139 131 0.1 251 215 207 93 1 264 231 66 111 10 270 201 170 106 100 253 216 202 119 46 Nenhuma 313 291 156 166 0.1 177 115 103 191 1 70 94 158 202 10 82 64 217 289 100 54 72 140 218 58 Nènhuma 277 189 93 56 0.1 201 152 88 76 1 196 155 73 90 10 138 119 61 81 100 56 64 78 43 70 Nenhuma 166 108 34 112 0.1 136 95 122 74 1 144 92 99 85 10 153 121 130 105 100 129 113 108 101

Tendo em vista a actividade precedente, o composto do invento está, ainda, indicado para o emprego como um agente de supressão da formação de IgE, particularmente para o tratamento das alergias do tipo I e das dermatites atópicas. -36-

Λ

Para estas indicações, a dosagem parenteral diária indicada é de cerca de 3 ug/kg até cerca de 20 ug/kg, administrada, convenientemente, duas a quatro vezes por dia, ou, de preferência, numa forma retardada, com intervalos de dois, ou mais, dias. As modalidades de dosagem unitária contêm cerca de 2 mg a cerca de 15 mg. A dosagem diária total é cerca de 4 mg a cerca de 60 mg. D) Além de mais, tem-se verificado, na experiência de indução do CSF, em ratinhos, por administração simultânea da substância A e de LPS,,que, em contraste com MDP-GDP, o composto do invento exerce um certo grau de actividade sinergística com LPS.

Preferido, nas indicações precedentes , é a forma do composto do Exemplo 1, isto é, a substân-cia A, isto é o composto de fórmula I, em que o C tem a configuração R, nomeadamente 3-0-/T>J-acetilmuramil-L-treonil-D--isoglutaminilj-l,2-di-0-palmitoíl-sn-glicerol.

As composições farmacêuticas, contendo o composto do invento, em conjunto com, pelo menos, um veículo, ou um diluente, farmacêuticamente aceitáveis, constituem, também, uma parte do invento em consideração. Elas podem ser preparadas, de uma maneira convencional, por exemplo , de acordo com um processo, compreendendo a mistura do composto do invento, tal como definido no precedente, isto é, o composto de fórmula I, em que o C tem a configuração R, ou S, respectivamente, com um veículo, ou um diluente, farmacêuticamente aceitável.

Outras composições farmacêuticas, que estão indicadas estão na forma de lipossomas e de micelas misturadas com, por exemplo, lisofosfatidil-colina, de n--octil-glicose ou desoxicolato. Tais composições podem ser preparadas de uma maneira convencional, e apresentarem-se, por exemplo, na forma de soluções injectáveis. Elas constituem, também, uma parte do invento em consideração. 37- 37-

0 invento inclui, além disso, um processo de tratamento, curativo ou de manutenção, de doenças , tais como as descritas no precedente, compreendendo a administração a um indivíduo, com necessidade de um tal tratamento de uma quantidade terapêuticamente eficaz do composto do invento.

Ele compreende, além disso, o composto do invento, para utilização nas condições precedentes, especialmente para emprego como um imunomodulador*; como um agente antiviral e como um agente antialérgico.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES: 1§. - Processo para a preparação das formas do composto de fórmula I HO HO- ---\

   0.C0.(CH2)14 .ch3 0-c0.(CH2)14.CH3 em que o átomo de carbono, marcado com um asterisco *, tem a configuração R, ou S, respectivamente, caracterizado por compreender a desprotecção de um composto correspondente de fórmula II

   em que o átomo de carbono, marcado com um asterisco *, é o que ficou estabelecido no precedente, e R^ a R^ são, independentemente um grupo de protecção de hidroxi. 2^. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar o composto em que o átomos de carbono marcado com um asterisco * tem a configuração R. 3ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar o composto em que o átomo de carbono marcado com um asterisco # tem a configuração S. 40-

   4§. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender desprotecção por hidrogenação. 5i. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na fórmula II, e , em conjunto, serem benzilideno, R3 ser benzilo e R4 ser benzilo ou terc.-butildimetilsililo. 6§. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, que contêm o composto de fórmula I, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a mistura do composto com pelo menos um veículo ou diluente farmacêuticamente aceitável. Lisboa, 27 de Junho de 1990

   J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficiai da Prspriadade Industrial RUA VICTGR CGRSON, 10-A, 1/ 1200 LISBOA