PL163888B1

PL163888B1 - Sposób wytwarzania odmian pochodnej glicerolu PL PL PL PL

Info

Publication number: PL163888B1
Application number: PL90285842A
Authority: PL
Inventors: Louis Chedid; Peter Dukor; Pierre Lefrancier; Peter Stuetz
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1990-06-28
Publication date: 1994-05-31
Also published as: HU205147B; HU903880D0; EP0406175A3; IL94885A; JPH0737479B2; PT94517A; DE69023559D1; JPH03135998A; HUT54180A; IE902345A1; ATE130313T1; IE902345L; FI903232A0; US5210072A; IL94885A0; DE69023559T2; MY105727A; NZ234270A; AU5787590A; EP0406175A2

Abstract

1. Sposób wytwarzania odm ian pochod- nej glicerolu o wzorze 1, w którym atom wegla oznaczony gwiazdka () m a konfiguracje R albo, odpowiednio, konfiguracje S, znamienny tym, ze usuwa sie grupy zabezpieczajace z odpowiedniego zwiazku o wzorze 2 , w którym atom wegla oznaczony gwiazdka * ma konfi- guracje jak wyzej zdefiniow ano, a R 1 do R4 niezaleznie oznaczaja grupy zabezpieczajace grupe hydroksylowa. Wzór 1 Wzór 2 PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania odmian pochodnej glicerolu.

Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania odmian pochodnej 3-0-[Nacetylomuramylo-D-izoglutaminylo]-1,2-di-O-palmitoilo-sn-glicerolu, o wzorze 1, w którym atom węgla zaznaczony gwiazdką * (w dalszej części niniejszego opisu przytaczany w skróceniu jako „C-*“) ma konfigurację R albo, odpowiednio, konfigurację S. Związek o wzorze 1 w dalszej części niniejszego opisu przytaczany jest w skróceniu jako „związek wytwarzany sposobem według wynalazku.

W przypadku, gdy C* ma konfigurację R, wtedy odpowiednia reszta aminokwasowa stanowi L-treonyl, natomiast gdy C* ma konfigurację S, stanowi ona L-allo-treonyl. Korzystną odmianą związku wytwarzanego sposobem według wynalazku jest ta odmiana, w której C* ma konfigurację R. Jak się to okazuje ze wzoru 1, związek występuje w dwu odmianach anomerycznych.

Związki o podobnej strukturze i zbliżonej aktywności są znane, np. z ANVAREP 165 123. Podany tam na str.4 wzór obejmuje związek wytwarzany sposobem według wynalazku. Jednakże związek wytwarzany sposobem według wynalazku nie jest nigdzie specyficznie ujawniony, ani też sugerowany w dotychczasowym stanie techniki. Wykazuje on niezmiernie korzystniejsze właściwości aniżeli związki z dotychczasowego stanu techniki.

Związek wytwarzany sposobem według wynalazku można także nazwać L-treonylo-MDPGDP i, odpowiednio, L-allo-treonylo-MDP-GDP.

Sposób według wynalazku wytwarzania odmian pochodnej glicerolu o wzorze 1 polega na tym, że usuwa się grupy zabezpieczające z odpowiedniego związku o wzorze 2, w którym ma konfigurację jak wyżej zdefiniowano, a R 2 do R4 niezależnie oznaczają grupy zabezpieczające grupę hydroksylową.

Sposób według wynalazku można zrealizować z wykorzystaniem zwykłej metody odszczepiania grup zabezpieczających grupę hydroksylową. Materiałem wyjściowym może być a- lub /5glikozydowy anomer lub ich mieszanina. Usunięcia grup zabezpieczających można dokonać w reakcji jednoetapowej lub kilku etapowej. Związek o wzorze 1 zazwyczaj otrzymuje się jako mieszaninę obydwu odmian anomerycznych. Można je rozdzielić, jeżeli jest to pożądane. Proces ten można przeprowadzić np. na drodze redukcji, korzystnie z udziałem wodoru i katalizatora palladowego na węglu, przy użyciu np. kwasu octowego jako rozpuszczalnika. Można użyć

163 888 jakiejkolwiek typowej grupy zabezpieczającej grupę hydroksylową podatnej na hydrogenację, np. grupy benzyloksykarbonylowej lub benzylowej. R1 i R 2 mogą razem utworzyć również wspólną grupę zabezpieczającą, taką jak grupa benzylidenowa. Usunięcie grup zabezpieczających można też przeprowadzić np. w warunkach kwasowych. Korzystną grupą zabezpieczającą do usunięcia w warunkach kwasowych jest np. grupa tert-butoksykarbonylowa (BOC).

Substancje wyjściowe można wytworzyć w zwykły sposób, np. zgodnie ze schematem, w którym Ct*, R1 do R4 mają wyżej zdefiniowane znaczenie, R' oznacza zabezpieczającą grupę aminową, X oznacza kwas karboksylowy w postaci zaktywowanej, BOP oznacza ugrupowanie heksafluorofosforanu benzotriazol-1-iloksytris-(dimetyloamino)fosfoniowego i BOC oznacza grupę tert-butoksykarbonylową.

Odszczepienia R' korzystnie dokonuje się w warunkach kwasowych. X korzystnie oznacza -OC( = O)-O-alkil, taki jak -OC( = O)-OCH 2CH(CH3)2. R' korzystnie oznacza grupę benzyloksykarbonylową.

Związek wytwarzany sposobem według wynalazku wykazuje doskonałą aktywność farmakologiczną. Wskazane jest więc jego użycie jako farmaceutyku.

W szczególności, stwierdzono, że posiada on wyraźną aktywność immunomodulującą. Aktywność tę można wykazać rozmaitymi testami wyjaśnionymi bardziej szczegółowo w dalszej części niniejszego opisu.

Użyte skróty mają następujące znaczenie.

Substancja A - odmiana związku z przykładu I; substancja B - odmiana związku z przykładu II; ABC - haptenowo swoiste komórki tworzące przeciwciała; BPO-BSA - benzylopenicyloilobydlęca albumina surowicza; BPO-KLH - benzylopenicyloilo-hemacyjanina z mięczaków; BSA -bydlęca albumina surowicza; CMI - odporność komórkowa; ConA - konkanawalina A; CSF -czynnik stymulujący kolonizację; CY - cyklofosfamid: DTH - nadwrażliwość typu opóźnionego; ELISA -immunosorpcyjny test z wiązaniem enzymów; FIA - niekompletny adiuwant Freunda; HI -odporność humoralna; IFN-y-interferon y; IL-l/IL-β - interleukina-1 (interleukina-1 β); LAF -czynnik aktywujący limfocyty; LPS - lipopolisacharyd; MDP - dipeptyd muramylowy; MDPGDP - 3-o-[N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo]-1,2-di-O-palmitoilo-sn-glicerol (związek z przykładu I w ANVAR EP 165 123); NBT - błękit nitrotetrazoliowy; PBL - limfocyty krwi obwodowej; PEC - komórki wysięku otrzewnowego; PMA - mirystyno.octan forbolu; PMN -komórki polimorfonuklearne; TNF - czynnik nekrotyzujący nowotwory; PHA - fitohemaglutynina.

A) Stwierdzono, że związek wytwarzany sposobem według wynatezku zkurahteryzuje się znacznie słabszymi działaniami ubocznymi w porównaniu ze strukturalnie podobnymi związkami, takimi jak MDP-GDP, jest więc lepiej tolerowany. Ta szczególnie korzystna właściwość została udowodniona np. w następujących badaniach:

1) Pirogenność u królika.

Metoda badania jest opisana w literaturze, np. w US Pharmacebeia. Otrzymane wyniki są jak następuje (tabela 1):

Tabela 1 Pirogenność u królika

Substancja	Najwyższa dawka niUbiregenna (pg/kg^	Najniższa dawka progen^ (pg/kg)*
1	2	3
A	1000	5000
B	20	50
MDP-GDP	10	20

W tabeli 1 użyto następującego oznaczenia. * dozylnie

2) Toksyczny synergizm z LPS.

163 888

W badaniu tym myszy Swiss otrzymują dożylnie LPS oraz albo MDP-GDP, albo substancję A we wskazanych dawkach (tabela I bis):

Tabela 1 bis

Nieobecność toksycznego synergizmu z LPS

Substancja	Działanie	Śmiertelność kumulatywna (padłe/całość)
Kontrola + LPS25 pg 0/18 MDP-GDP (3010 pg) + LPS 25 pg 17/18 A (300 pg) + LPS 25 pg 3/18 Wszystkie myszy otrzymały 25 pg LPS S cr^tt^n<^^^ dożylnie .samego lub z MDP-GDP, względnie z substancją A. Wyniki otrzymano w 3 identycznych badaniach stosując 6 myszy/grupę

Wyniki otrzymane w powyższych dwóch badaniach (pirogenność i toksyczny synergizm, tabela 1 i 1 bis) pokazują znaczne polepszenie w stosunku do działań ubocznych w porównaniu z MDP-GDP.

Dalsze metody badania są np. jak następuje:

a) Indukcja TFN w hodowlach mysich komórek szpiku, w króliczych PBL (bez preaktywacji IFN-y) i ludzkich PBL.

Badanie to jest szczegółowo opisane w: T. J. Sayers i in., J. Immunol., 136,2935-2940 (1986). Aktywność TNF mierzy się na podstawie aktywności litycznej wobec komórek L929. Wyniki zreasumowano w tabeli 2 i ukazują one, że obydwie odmiany A i B związku wytwarzanego sposobu według wynalazku są bardzo słabymi induktorami TFN i wobec tego przedstawiają znacznie niższy potencjał endotoksyczny niż związki odnośnikowe. Wyniki te odpowiadają również dobrze wynikom otrzymanym w przypadku substancji A przy użyciu ludzkich lub króliczych krwinek jednojądrzastych, do wyodrębniania których zastosowano Ficoll (tabele 3 i 4).

Tabela 2

Indukcja TFN w hodowlach mysich komórek szpiku i makrofagach

Substancja	Stężenie (pg/ml)	TNF (jednostki międzynarodowe)
bez IFN-y	IFN-y (100 jedn międz.)
A	i	<5	<5
	10	<5	25
B	1	<5	99
	10	<5	40
MDP-GDP	1	<5	205
	10	<5	276
LPS	0,01	375	2,245
Salmonella abort. equi	0,001	17	119
Sam rozpuszczalnik	-	<5	<5

Tabela 3

Indukcja TFN w króliczych obwodowych krwinkach jednojąrzastych (bez preaktywacji IFN-y)

TNF (jednostki międzynarodowe)

Substancja	Stężenie (pg/ml)	Eksperyment pierwszy	Eksperyment drugi
Królik 1	Królik 2	Królik 3	Królik 4
A	1	<8	<8	39	28
	10	44	76	204	163
MDP-GDP	1	233	328	196	157
	10	571	687	643	724
LPS	0,01	989	1198	1002	637
Salmonella	0,001	361	680	318	230
abort. equi				9
Sam rozpuszczalnik	-	<8	<8	14	20
Samo podłoże	<8	<8	27	26

163 888

Tabela 4

Indukcja TFN w ludzkich obwodowych krwinkach JuOneJąOrzastrah

Substancja	Stężenie (pg/ml)	TNF (pg/ml)
Eksperyment 1 Eksperyment 2
Donor 1	Donor 2	Donor 3
A	1	27	82	63
	10	248	196	163
	20	291	225	198
MDP-GDP	1	493	107	-
	10	654	94	59
LPS	0,01	26	1000	538
Salmonella abort.	0,001	18	1195	699
equi
Sam rozpuszczalnik	-	0	0	0
Samo podłoże wzrostowe	-	0	0	0

b) Indukcja IL-1

Aktywność IL-1 β lub, odpowiednio, LAF, bada się metodami J. Ger^ego i in. J. Exp. Med., 136,128 -142 (1972) i J. Opbunheimai in., Cellular Immunol., 50,71 - 81 (1980). Wyniki (tabela 5) wskazują, że proliferacja wzmaga się znacznie jedynie przy najwyższym stężeniu wynoszącym 50 pg/ml w porównaniu z samym rozpuszczalnikiem.

Tabela 5

Indukcja LAF/IL-1e(w mysich makrefagaah wydzielonych z płynu otrzewnowego

Substancja	Stężenie (pg/ml)	Aktywność (impulsy/minutę) Rozciem 1.4 Rozc^ń 1:8
1	2	3	4
A	1	446	361
	10	1014	1267
	50	2338	2701
MDP-GDP	1	691	391
	10	1220	380
	50	4491	1106
LPS	10	5809	3096
Salmonella abort	1	329	326
equi
Samo podłoże wzrostowe	-	427	-
Sam supernata^	-	513	374
Sam rozpuszczalnik	10%	1546	1645

c) Indukcja toksyczności makrofagów (mysie PEC) wobec komórek nowotworowych (P 815).

Na myszy działa się wstępnie za pomocą dootrzewnowego podania 15 ml 2,9% bulionu tioglikolanowego (Merck-Darmostadt, RFN). Po upływie 4 dni makrofagi zostają wydzielone do jamy otrzewnowej i zebrane przez płukanie. Po wydzieleniu, przylegające mysie makrofagi hoduje się wspólnie z komórkami nowotworowymi, LPS lub substancjami immunostymulującymi, które mogą aktywować makrofagi, z doprowadzeniem do lizy lub zahamowania wzrostu komórek nowotworowych. Tę aktywację można następnie wzmocnić dodatkiem IFN-y. Ilość komórek przeżywających po 24-godzinnej hodowli oznacza się za pomocą pomiaru włączenia [3H]tymidyny. Porównanie z kontrolą negatywną i kontrolą pozytywną (LPS) daje pomiar aktywności litycznej lub aytotokorcznej w % dla danego stężenia substancji badanej (tabela 6):

163 888

Tabela 6

Indukcja crtoteksrazneśai makrofagów wobec komórek nowotworowych

Substancja	Stężeniu (pg/ml)	bez IFN-y	% zahamowania komórek nowotworowych P815
IFN-y*	IFN-y**·
1	2	3	4	5
A	1	55	41	94
	10	28	99
MDP-GDP	1	71	40	99
	10	62	62	99
LPS	0,01	77	98	99
Salmonella abort equi	0,001	84	60	99
Sam rozpuszczalnik	-	5	10	10
Samo podłożu wzrostowe	-	0	10	10

W tabeli 6 użyto następujących oznaczeń· * 1 jednostka: ** 5 jednostek,

d) Indukcja aktywności LAF w mysich PEC po l^godzinnej inkubacji (badanie tymocytów, kostymulacja PHA 1:50).

W badaniu tym J. Exp. MuO., 136,128-155 (1972) substancje A i B wykazują profil aktywności podobny do profilu MDP-GDP.

u) Stwierdzono, że związek wytwarzany sposobem według wynalazku wykazuje dalszą aktywność o dużym znaczeniu w luczuniu nowotworów, a to przy użyciu do badań gryzoni poddanych wstępnemu działaniu cyklofeofamidem lub napromienianiem rentgenowskim, a mianowicie wykazuje zależne od dawki stymulowaniu proliferacji lub różnicowania się mieloblastów do dojrzałych limfocytów w szpiku.

f) Prolifuratywna odpowiedź komórek szpiku myszy poddanych działaniu coklofoofamidu.

Myszy otrzymały dootrzewnowo 5 mg ayklofosfamiOu w dniu następnym po podziałaniu

MDP-GDP lub substancją A. Komórki zebrano czwartego dnia po podziałaniu coklefosfamiOem i inkubowano w obecności kondycjonowanego podłoża albo komórek L929 („L“) zawierającego CSF-1 [E. R. Stanley i L. G. Guilbert, J. Immunol. Muthods, 42, 253 (1981)], albo płuc myszy poddanych działaniu LPS (GM-CSF „płucny:), [jak opisali Sheridan i Metcalf, J. Cull Phosiologo, 81,11 (1973)], w rozmaitych rozaiuńczeniaah. Odpowiudź komórek na CSF lub GM-CSF miurzy się jako włączanie [³H]-tomiOrny, w porównaniu z kontrolami. Wyniki wskazują, żu w przeciwieństwie do MDP-GDP, substancja A możu przywrócić prelifuratowną odpowiedź komórek na działanie CSF (patrz fig. 1).

Objaśniunie figury 1: Prolifuratowna odpowiedź komórek szpiku myszy poddanych działaniu CY dnia 0 i MDP-GDP (300pg) lub substancji A (300pg) dnia-1.

( : kontrola + komórki L zawierające CSP lub, odpowiednio, kontrola + GM-CSF płucny; : MDP-GDP + komórki L zawierające CSF, albo, odpowiednio, kontrola + Gm-CSF płucny; : substancja A + komórki L zawierające CSF albo, odpowiednio, substancja A + GM-CSF płucny).

g) Wzmożeniu niuswoistuj oporności myszy na zakażenie.

Zdolność substancji A do wzmagania oporności myszy na zakażeniu oceniono u myszy na modelu zakażenia bakteryjnego. Na myszy Swiss podziałano dożylnie MD-GDP lub substancją A. Po upływie 24 godzin myszy poddano lutalnej prowokacji Klubsiella pneumoniae (8 X 10⁴ organizmów) (tabula 7).

163 888

Tabela 7

Ochrona myszy przed zakażeniem Klebsiella

Substancja	Działanie doz dnia-1 (pg/mysz)	Przeżycie
1	2	3
Nie podano	-	1/32
MDP-GDP	30	14/24 (p<0.01)
	100	19/24 (p<0,01)
A	30	10/24 (p<0,01)
	100	14/24 (p<0,01)
Myszom Swiss podano związki dnia-1 drogą dożylną. Pro-
wokacji zostały poddane tą samą drogą	w postaci 8X104 bakte-
ru Padnięcia rejestrowano po upływie 3 tygodni od prowokacji.

Na podstawie tabeli 7 można stwierdzić, że w porównaniu z kontrolami, na które nie podziałano, MDP-GDP oraz substancja A znacznie wzmagają nieswoistą oporność na zakażenie u myszy.

h) Aktywność adiuwacyjna.

Oceniono zdolność substancji A do indukowania odpowiedzi komórkowej i wzmagania swoistej odpowiedzi humoralnej na antygen. Kontrolne i badane świnki morskie samce Hartley o wadze 300 g otrzymywały w poduszeczkę tylnej łapy całkowitą dawkę 1 mg owoalbuminy w 0,2 ml emulsji typu woda w oleju (niekompletny adiuwant Freunda, FIA). Grupie badanej dodano do emulsji adiuwant w dawce 0,1 mg.

W celu oceny swojej odporności komórkowej (CMI) zwierzęta poddano badaniu skórnemu 21 dnia przez śródskórne wstrzyknięcie 0,1 mg owoalbuminy w roztworze soli. Reakcje skórne sprawdzono po upływie 6,24 i 48 godzin i wyniki wyrażono jako średnicę stwardnienia po upływie 48 godzin. W celu oceny ich odporności humoralnej (HI) zwierzęta skrwawiono za pomocą nakłucia serca 24 dnia. Miana przeciwciał przeciw owoalbuminie mierzono z zastosowaniem ELISA w standardowych warunkach. Podano indywidualne miana i średnie. W tabeli 8 przedstawiono, że substancja A stymuluje nawet silniej niż MDP-GDP swoistą odpowiedź, tak CMI jak i HI.

Tabela 8

Aktywność adiuwacyjna wobec odpowiedzi immunologicznej komórkowej oraz humoralnej.

Substancja	DTH¹¹ (średnice) (mm stwardnienia)	Odpowiedź humoralna 2’ (miano ELISA)
Kontrole	0 (6)	8000 - 21000 - 21500 - 37000 - 65000 - 95000 - (41250)
MDP-GDP	8- 14- 15- 17-(13,5)	247000 - 295000 - 641000 - 325000 -(377000)
A	15 - 15- 18 - 20-20-25 -(18,5)	100000 - 172000 - 780000 - 850000 - 472000 - 330000 - (450000)

Wyniki wyrażono średnicą stwardnienia po upływie 48 godzin Podano wyniki indywidualnych pomiarów i średnie arytmetyczne (w nawiasach) ²¹ Miano przeciwciała przeciw owoalbuminie mierzono stosując ELISA w standardowych warunkach. Podano indywidualne miana i średnie.

i) Wpływ na odpowiedź króliczych limfocytów krwi obwodowej na mitogeny.

Substancję A wstrzyknięto królikom dożylnie w dawce 100 pg. Przed i po trzech godzinach po tym podaniu zebrano próbki krwi. Przeprowadzono badania transformacji limfoblastycznej stosując komórki jednojądrzaste, które inkubowano z ConA lub PHA. Wpływ mitogenny mierzono przez wzmaganie włączania [^{i) * 3}H] - tymidyny i wyrażono jako ilość impulsów na minutę (cpm). Wyniki przedstawiono w tabeli 9.

163 888

Tabela 9

Transformacja blastyczna mitogenami in vitro po działaniu in vivo substancją A

Króliki	Roztwór soli	Inkubacja in vivo z.
ConA	PHA
(1ug/ml)	(10ug/ml)	(1 ug/ml)	(10ug/ml)
Kontrolny 1	TO 1086	3782	6190	3078	2423
	T3 1612	5570	6844	6880	5905
Kontrolny 2	TO 577	3354	2459	3316	1610
	T3 383	5194	428	2095	1206
A-	TO 2926	3132	5204	2479	2591
poddany działaniu 1	T3 983	22241	39469	16754	30270
A-	TO 412	6342	2778	10149	2936
poddany działaniu 2	T3 324	10721	118597	15734	91434
A-	TO 487	15521	6917	10020	12482
poddany działaniu 3	T3 239	55690	50572	32228	37538
A	TO 732	951	1287	600	569
	T3 1327	9252	6493	4570	2648

Na podstawie tabeli 9 można stwierdzić, że komórki królików nie poddanych in vivo działaniu substancji A wykazują znacznie wzmożoną zdolność limfocytów do odpowiedzi in vitro na suboptymalne dawkowanie mitogenu.

j) Odpowiedź krwinek polimorfonuklearnych (PMN) po działaniu in vitro lub in vivo.

Odpowiedź oksydatywną i moc kandydobójczą oceniono metodami klasycznymi. Oczyszczone PMN z krwi człowieka lub świnki morskiej hodowano w obecności substancji A przed pomiarem wybuchu oddechowego w odpowiedzi na PMA lub komórki C, albicans w ciągu godziny, albo wzrostu C, albicans w ciągu 18 godzin. Wyniki (tabela 10) wskazują na stymulujący wpływ substancji A na te komórki niezależnie od ich pochodzenia (od człowieka czy świnki morskiej).

Tabela 10

Wpływ preinkubacji z substancją A na odpowiedź PMN człowieka lub świnki morskiej

Krwinki	Preinkubacja⁰¹z substancją A (ug/ml)	Odpowiedź oksydatywna⁰¹	Moc kandydobójcza°l
PMA (20 nm)	na komórki drożdży (stosunek 30.1)	30:1 (PMN:drozdze)	1001 (PMNdrożdze)
PMN człowieka	bez	30,3	4,2	2,5	58,1
	0,1	-	-	0	47,6
	1	-	-	3,3	75,6
	10	69,2	29,7	21,2	92,9
PMN świnki morskiej	bez	42,9	18,9	-	42,4
	0,1	-	-	-	61,8
	1	-	-	-	84,9
	10	52,6	24,3	-	93,3

⁰¹ Preinkubacja w ciągu godziny,^bl Wyrażono jako procent komórek redukujących NBT po godzinie od dodania PMA do komórek C. albicans; ^c> Procentowe zahamowanie wzrostu C albicans mierzone jako zmniejszenie włączania [³H] - glukozy przez komórki drożdży.

k) Badania ex vivo na świnkach morskich poddanych działaniu, z użyciem substancji A, drogą podskórną (500 ug/kg) w terminie 3 lub 18 godzin przed zebraniem krwi za pomocą nakłucia serca. Odpowiedź oczyszczonych PMN krwi określono bezpośrednio in vitro po dodaniu PMA lub komórek C. albicans. Jak przedstawiono na tabeli 11 działanie wstępne na świnki morskie 18 godzin wcześniej indukuje silniejszą odpowiedź PMN eksponowanych następnie na PMA lub komórki C. albicans, podczas gdy działanie wstępne na zwierzęta 3 godziny przed zebraniem komórek było nieefektywne.

163 888

Tabela 11

Wpływ działania wstępnego substancją A (500pg/kg) na reakcję PMN świnki morskiej.

Działaniu wstępne	PMA (20 nM)	Odpowiedź okor0strwns na komórki drożdżya	Moc kan0r0obÓJazs ^wprzy stosunku
(stosunek 30.1)	30:1	100.1
Roztwór soli	55,8	33,3	17,2	25,6
Substancja A (h-3)	61,1	35,2	15	17,2
Substancja A (h-18)	84,9	62,7	60,1	82,1

Wyrażono jako procent komórek redukujących NBT według E. Picka i in. J ReticuleunOothulisl Soc , 30, 581 (1981) po godzinie po dodaniu PMA lub komórek C albicans w stosunku 30.1 (PMN· komórki drozdty).

b Procentowe zahamowaniu wzrostu C. albicans mierzone jako zmniejszenie włączania [³H] - glukozy przez komórki drożdży

Na podstawie wyników badań zamieszczonych wyżej w pkt. A) można wnosić, że ogólnie związek wytwarzany sposobem według wynalazku wykazuje znacznie bardziej korzystną aktywność farmakologiczną aniżeli strukturalnie podobne związki, takie jak MDP-GDP.

Związek wytwarzany sposobem według wynalazku jest wskazany do użycia jako modulator nieswoistej oporności przeciw-bakteryjnej do układowego wzmagania odpowiedzi immunologicznej i oporności nieswoistej.

Jugo użycie jest więc wskazane w działaniu leczniczym lub w działaniu wspomagającym (to jest łącznie z dalszym leczeniem swoistym lub wspomagającym) na stany z obniżoną odpornością immunologiczną, to jest stany z obniżoną komórkową i humoralną odpowiedzią immunologiczną, oraz stany z obniżoną reakcją nadwrażliwości typu opóźnionego oraz, dalej, w leczeniu, ogólnie, stanów, w których pożądana just modulacja odpowiedzi immunologicznej.

Związek wytwarzany sposobem według wynalazku jest szczególnie wskazany w działaniu leczniczym lub wspomagającym na stany patalogiczne związane z pierwotnym niedoborem odpornościowym, albo z niedoborem odpornościowym typu spotykanego u pacjentów geriatrycznych lub pacjentów z ciężkimi oparzeniami lub zakażeniami uogólnionymi. Dalej, wskazane jest użycie w działaniu leczniczym lub wspomagającym na zakażenie wirusowe, takie jak rozsiana opryszczka pospolita, rozsiana ospa wietrzna oraz na chorobę Ho0gkina i inne nowotwory złośliwe.

W powyższych wskazaniach dawkowanie będzie oczywiściu zależeć od charakteru i ciężkości choroby, która ma być leczona, sposobu podawania i postaci użytego leku. Dla dużych osobników odpowiednia dawka pozajelitowa wynosi od około 0,1 do około 70 mg, podawana jednorazowo w celu osiągnięcia, działania adiuwacyjnego, np. w leczeniu wspomagającym, lub dziennie. Dogodnie można prowadzić dawkowanie powtarzane, np. dwa do czterech razy dziennie, albo w postaci retard. Wskazane dawki jednostkowe obejmują od około 0,025 do około 35 mg związku wytwarzanego sposobem według wynalazku w przypadku powtarzanego podawania i do około 70 mg, gdy pożądane jest podanie jednorazowe w przypadku działania adiuwacyjnego.

B) Aktywność immunomedulacojna powoduje, że, dalej, wskazane jest użycie związku wytwarzanego sposobem według wynalazku w charakterze adiuwanta w szczepionkach. Do tego sposobu zastosowania, wskazane dawkowanie dzienne wynosi od około 0,1 do około 50 mg, korzystnie od około 0,5 do około 10 mg, zwłaszcza około 7 mg, przy podaniu w dniu szczepienia. Dogodnie przeprowadza się drugie podanie przy tym samym dawkowaniu 2 do 4 tygodni później.

C) Dalej, stwierdzono, że związek wytwarzany sposobem według wynalazku modyfikuje haptenowo swoistą immunoglebulinewe-izotopową odpowiedź u myszy. Aktywność tę stwierdza się w badaniu przewidzianym do oznaczenia ilości haptunowo swoistych komórek tworzących przeciwciała (ABC). Schemat immunizacji jest następujący. Myszy Balb/c otrzymują dootrzewnowe wstrzyknięcia 10pg BPO-KLH w 0,2 żelu wodorotlenku glinowego w dniach 0, 21 i 42. Następnie myszy dzieli się na dwie grupy: pierwszej grupie podaje się doustnie związek według wynalazku (substancja A) w ilości 10pg/mysz, w dniach 44 i 45, a druga grupa (kontrolna) otrzymuje roztwór soli. Zwierzęta uśmierca się w dniach 46, 51 i 70 oraz ekstrahuje limfocyty z ich kępek Peyera, krezkowych gruczołów limfatycznych i śledziony. Zbiera się komórki od 6 myszy i

163 888 oznacza ilość ABC ex vivo w badaniu Elispot z zastosowaniem łysinek nawarstwionych BPO-BSA. Otrzymane wyniki są wskazane w tabeli 12.

Tabela 12

Haptenowo swoista immunoglobulino-izotypowa odpowiedź u myszy

Dzień uśmiercenia	Narząd	Haptenowo swoiste komórki tworzące przeciwciała (ABC)107 komórek
IgM Kontr.	A	Kontr.	IgG A	IgE Kontr.	A K	Lontr.	IgA A
46	PP	1	1	1	1	1	1	1	1
	ML	211	218	181	315	315	1	104	89
	SP	303	410	395	485	288	1	143	123
51	PP	1	1	1	1	1	1	1	1
	ML	197	320	273	362	286	5	98	111
	SP	630	795	718	812	193	15	77	94
70	PP	1	1	1	1	1	1	1	1
	ML	187	174	235	347	133	111	62	53
	SP	1316	918	943	1012	188	164	84	77

PP = kępki Peyera; ML = krezkowe gruczoły limfatyczne, SP = śledziona; kontr = fizjologiczny roztwór sob.

Powyższe wyniki wykazują, że po immunizacji myszy wskazanym sposobem, można znaleźć ABC wszystkich immunoglobulinowych klas izotypowych w krezkowych gruczołach limfatycznych i śledzionie. Ilość komórek tworzących IgM i IgG była wyraźnie wyższa wśród komórek śledziony aniżeli komórek krezkowych gruczołów limfatycznych, podczas gdy w przybliżeniu podobną ilość znajduje się w obu narządach w odniesieniu do ABC IgA i IgE. Działanie związkiem wytwarzanym sposobem według wynalazku (substancją A) według powyższego schematu daje w rezultacie w obydwóch narządach zwiększoną ilość ABC IgG, podczas gdy ilość ABC tworzących IgE jest zmniejszona. Efekt ten jest, jak się wydaje, przejściowy.

W dniu 46 nie znaleziono ABC tworzących IgE w żadnym z tych dwóch narządów, w dniu 51 zawartość była wciąż bardzo niska. W dniu 70 nie można było oznaczyć różnicy z kontrolami. Wskazuje to na hamujące działanie związku według wynalazku w chorobach alergicznych.

W przypadku powtórzenia powyższego badania jak wyżej opisano, ale z podaniem badanej substancji w dniu 44 i z uśmierceniem zwierząt w dniach 45, 46, 58 i 70, otrzymano wyniki następujące (tabela 13).

Tabela 13

Zmniejszenie ilości ABC tworzących IgE w mysiej śledzionie.

Dzień uśmiercenia	Dawka _ substancji badanej substancja A (mg/kg)	Ilość (na 107 komórek)
ABC tworzące IgE	ABC tworzące IgA
Próba 1	Próba 2	Próba 1	Próba 2
1	2	3	4	5	6
45	bez	317	239	139	131
	0,1	251	215	207	93
	1	264	231	66	111
	10	270	201	170	106
	100	253	216	202	119
46	bez	313	291	156	166
	0,1	177	115	103	191
	1	70	94	158	202
	10	82	64	217	289
	100	54	72	140	218
58	bez	277	189	93	56
	0,1	201	152	88	76
	1	196	155	73	90
	10	138	119	61	81
	100	56	64	78	43
70	bez	166	108	34	112
	0,1	136	95	122	74
	1	144	92	99	85
	10	153	121	130	105
	100	129	113	108	101

163 888 11

W świetle powyższej aktywności związek według wynalazku jest wskazany jako czynnik hamujący tworzenie IgE, zwłaszcza w leczeniu alergii typu I i atopowych zapaleń skóry.

We wskazaniach tych pożądane dzienne dawkowanie pozajelitowe wynosi od około 3 pg/kg, do około 20 pg/kg przy dogodnym podawaniu 2 - 3 X dziennie, albo, korzystnie, w postaci retard w odstępach 2-dniowych lub większych. Całkowite dawkowanie dzienne wynosi od około 4 do około 60 mg.

D) Dalej, stw ietdzono, ne w bad aniu indukcdi CSF u myszy przyjednodzesnym podawdniu substancji A i LPS, związek wytwarzany sposobem według wynalazku, w prreciwiońetwle do MDP-GDP wywiem w pewnym stopniu spnergistycrne działanie z LPS.

Korzystny w powyższych wskazaniach jest związek z przykładu I, to jest substancja A, to znaczy związek o wzorze I, w którym C() ma konfigurację R, a mianowicie 3-Z-[N-αcetzlwmuramylo-L-treonylw-D-izoglutaminylw]-1,2-di-O-palmitoilo-sn-glicerol.

Środki farmaceutyczne zawierające związek wytwarzany sposobem według wynalazku łącznie z co najmniej jednym farmaceutycznie dozwolonym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. Można je wytwarzać w zwykły sposób, np. zgodnie ze sposobem postępowania obejmującym mieszanie związku według wynalazku jak zdefiniowano powyżej, to jest związku o wzorze 1, w którym C(r ma konfigurację R albo, odpowiednio, konfigurację S, z farmaceutycznie dozwolonym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem.

Środkami farmaceutycznymi, które są wskazane, są środki w postaci liposomów i mieszanych miceli, np. z lizofosfatydylocholiną, n-wktylogldkorą lub deoksycholanem. Środki te można wytwarzać w zwykły sposób, np. w postaci roztworów do wstrzykiwania.

Wynalazek objaśniają następujące przykłady. Wszystkie wartości temperatury podane są w °C.

Użyte skróty mają znaczenie następujące: BOC = tort-butoksykαrbonyl; Bzl = benzyl; alloThr = L-allw-trewnyl; Thr = L-treonyl; Z-D-iGln = karbobenzwkey-D-lrwglutamlna; Pd/C = pallad na węglu; tBDMS = tert-bdtylodimetyls>silil.

Przykład I. 3-O-[N-Acetplomdramylw-L-troonyl-D-lrwgldtaminzlw]-1,2-di-0-palmitoilosn-glicerol. (C* ma konfigurację R).

120 mg 3-0-[ 1-α-0-benzylo-4,6-0-benzylideno-N-acetylomdrαmylo-0-benzylo-L-treonylo-Dizwglutnmlnylw]-1,2-di-0-palmitollo-sn-glicerwId rozpuszcza się w 20 ml 100% kwasu octowego i poddaje reakcji ze wstępnie hydrogenowanym katalizatorem [90 mg 1O%o Pd/C, 15 mg chlorku palladu (PdCh) w 20 ml 100% kwasu octowego, hydrogenowanie w ciągu 45 minut wodorem]. Mieszaninę miesza się w ciągu 2 godzin w atmosferze wodoru, odsącza się katalizator, roztwór zatęża i odparowuje do sucha trzykrotnie z toluenem. Pozostałość poddaje się chromatografii na żelu krzemionkowym, z użyciem do elucji układu dichlorometan (metanol) eter diizwproaylowp 4:1:1. Otrzymany w wyniku tego produkt poddaje się chromatografii na Sephadex LH-20, z użyciem do e^cji układu dichlorometan/metanol 1:1. Otrzymany roztwór odparowuje się do sucha i poddaje liofilizacji z kwasu octowego, w wyniku czego otrzymuje się związek tytułowy jako mieszaninę obu anomerów. 1H-NMR: 0,90 (t, J = 7,6H); 1,22 (d, J = 7,3 H); 1,25 (s,48 H); 1,41 (d, J = 7,3 H); 1,64 (m, 4 H); 2,00 (m, 3 H); 2,22 (m, 1 H); 2,34 (m, 4 H); 2,48 (m, 2 H); 3,40 - 3,98 (m, 6 H); 4,12 - 4,60 (m, 8 H); 5,20 (d, J = 3,1 H); 5,26 (m, 1 H).

Związek wyjściowy wytwarza się w sposób następujący.

a) 740 mg Z-D- iGln rozpuszcpu sic w s nd m izszontny sunyego herno tylofozmfmi0n i tetdahodrofuranu 1:1 i poddaje reakcji (bez dostępu światła) z 1,46g heksafldwrofosfwrand benrwtriarol-1llwksptris-(dimetyloamino)fosfonlwwemo i 365 μΐ N-metylomorfoliny. Po upływie 30 minut dodaje się 1,14g 1,2-dipalmltoilw-sn-gllnerwlu i 270mg imidazolu, po czym otrzymaną mieszaninę reakcyjną miesza się w dalszym ciągu bez dostępu światła przez 4 dni. Po odparowaniu mieszaniny rozpuszczalników otrzymaną pozostałość poddaje się chromatografii na żelu krzemionkowym z dżpnitm do elucji układu dichlorometan/metanol 20:1, w wyniku czego otrzymuje się 3-0[benzyloksykarbonylo-D-izoglutaminylo]-1,2-di-0-palmitoilo-sn-glicerol. 1H-NMR: 0,89 H); 1,28 (s, 48 H); 1,62 (m, 4 H); 1,95 (m, 1 H); 2,15 (m, 1 H); 2,34 (m, 4 H); 2,46 (m, 2 H); 4,25 (m, 5 H); 5,12 (s, 2H); 5,27 (m, 1 H); 7,35 (s, 5 H).

163 888

b) 400 mg związku wytworzonego w p. a) powyżej rozpuszcza się w 20 ml 100% kwasu octowego i poddaje reakcji z 40 mg Pd/C (10%). Mieszanie prowadzi się w ciągu 2 godzin w atmosferze wodoru, po czym odsącza się katalizator i otrzymaną pozostałość odparowuje z toluenem trzykrotnie do sucha. Otrzymaną pozostałość rozpuszcza się w 8 ml dichlorometanu przy dodaniu 60 pl N-metolomorfeliny ( = roztwór A).

160 mg BOC-Thr(Bzl)-OH rozpuszcza się w 8 ml dichlorometanu razem z 233 pl Nmetylomerfolino i 73pl estru izobutylewege kwasu chloromrówkowugo, po czym otrzymaną mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej w ciągu 54 minut ( = roztwór B).

Roztwór B oziębia się do temperatury 4°C, po czym dodaje się do niugo roztwór A. Otrzymaną mieszaninę miesza się w ciągu 18 godzin w temperaturze pokojowej, a następnie odparowuje się rozpuszczalnik i przeprowadza się oczyszczanie za pomocą chromatografii na żelu krzemionkowym, z użyciem do elucji układu dichlorometan/metanol 100:1 do 100:3, w wyniku czego otrzymuje się 3-0-[teΓt-butoksokarbonolo-0-benzolo-L-tΓeonrlo-D-izoglutammolo]-1,2-di-O-palmiteilesn-glicerol. ^-NMR: 0,88 (t, J = 7,6 H); 1,26 (s, 48 H); 1,47 (s, 9 H); 1,60 (m,4H); 1,94 (m, 1 H); 2,14 - 2,58 (m, 7 H); 4,10 - 4,34 (m, 6 H); 4,45 (m, 2 H); 4,60 (d, 2 H); 5,15 (m, 1 H); 5,23 (m, 1 H); 5,40 (m, 1 H); 6,35 (m, 1 H); 7,13 (m, 1 H); 7,30 (m, 5 H).

c) 580 mg związku wytworzonego w p. b) powyżej poddaje się reakcji, w temperaturze 4°C, z 20 ml kwasu trifluoreoatowege i mieszaninę miesza się w ciągu 30 minut. Następnie roztwór zatęża się i odparowuje do sucha dwukrotnie z toluenem. Pozostałość poddaje się reakcji z 10 ml dichlorometanu i 65 pl N-metolemorfolino ( = roztwór A).

278 mg kwasu a-0-benzylo-4,6-benzylideno-N-aceiylomu-raminewege rozpuszcza się w 10 ml dichlorometanu razem z 259 pl N-metylomorfelino i 81 pl estru izebutylowego kwasu chloromrówkowugo, po czym otrzymaną mieszaninę miesza się w ciągu 35 minut w temperaturze pokojowej ( = roztwór B).

Roztwór A wkrapla się w temperaturze 4°C do roztworu B i otrzymaną mieszaninę odstawia się na 2 dni w temperaturze pokojowej. Po odparowaniu rozpuszczalnika otrzymaną pozostałość poddaje się chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem do elucji układu dichlorometan/metanol od 100:1 do 10:1, w wyniku czego otrzymuje się 3-0-[1-α-0-benzolo-4,6-0-benzylideno-Nαaetylomuramylo-0-benzylo-L-treonolo-D-izoglutaminolo]-1,2-di-0-palιmteilo-sn-glicerel.lH-NMR: 0,88 (t, J = 7,6 H); 1,22 (d, J = 7,3 H); 1,37 (d, J = 7,3 H); 1,60 (m, 4 H); 1,98 (s, 3 H); 2,02 (m, 1 H); 2,30 (m, 4 H); 2,44 (m, 4 H); 3,66 - 3,94 (m, 4 H); 4,06 - 4,46 (m, 10 H); 4,90 (d, J = 4,1 H); 5,25 (m, 1 H); 5,60 (s, 1 H); 6,78 (d, 1 H); 7,10 (d, 1 H); 7,40 (m, 10 H); 7,60 (d, 1 H).

Przykład II. 3-0-[N--Acety lo m uramy lo-L-allo-treony Io-D-iz.ogl u tammy^]-1,2-di-0-palmitollo-sn-gliaerol. (Cx ma konfigurację S).

Związek tytułowy wytwarza się sposobem analogicznym do sposobu opisanego w powyższym przykładzie I, z tą różnicą, że jako związku wyjściowego używa się odpowiedniego związku L-allo-treonolowego: 1H-NMR: 0,88 (t, J = 7,6 H); 1,25 (s, 48 H); 1,40 (d, J = 7,3 H); 1,64 (m, 4 H); 2,00 (m, 3 H); 2,24 (m, 1 H); 2,35 (m, 4 H); 2,48 (m, 2 H); 3,40 - 3,98 (m, 6 H); 4,10 - 4,60 (m, 8 H); 5,23 (d, J = 3,1 H); 5,26 (m, 1 H).

Związek L-allo-treonrlowo stosowany tu jako związek wyjściowy wytwarza się w sposób następujący.

a) 3-0-[Benzyloksyltarbenolo-D-izoglutaminolo]-1,2-dl-0-palmitoίlo-sn-g]icerol wytwarza się sposobem opisanym w przykładzie I, etap a).

b) 3-0-[Benzyloksykarbenole-0-tert-butrlodimetrlosilil-L-allo-treenolo-D-izoglutammylo]1,2-0i-0-palmitoile-sn-glicerol wytwarza się sposobem analogicznym do sposobu opisanego w powyższym przykładzie I, etap b), z tą różnicą, że zamiast BOC-Thr(Bzl)-OH stosuje się Bzl-alloThr(tBDMS)-OH. 1H-NMR: 0,02 (s, 3 H); 0,04 (s, 3 H); 0,93 (m, 15 H); 1,16 (d, J = 7,3 H); 1,25 (m, 48 H); 1,67 (m, 4 H); 1,90 (m, 1 H); 2,07 (m, 1 H); 2,28 (m, 4 H); 2,42 (m, 2 H); 4,03 - 4,40 (m, 7 H); 5,08 (m, 2 H); 5,13 (m, 1 H); 7,30 (m, 5 H); 7,46 (d, 1 H).

c) ' 3-0-[1-α-0-Benzyle-4,6-0-benzylideno-N-acetrlomuramylo-0-turt-butolodimetylosililo-Lallo-treonylo-D-izoglutaminylo]-1,2-di-0-palmiteilo-sn-glicerol wytwarza się sposobem analogicznym do sposobu opisanego w powyższym przykładzie I, etap c): 1H-NMR: 0,88 (s, 3 H); 0,10 (s,

163 888

H); 0,88 (m, 15 H); 1,17 (d, J = 7,3 H); 1,25 (m, 48 H); 1,3-7 (d, J = 7,3 H); 1,64(m, 4 H); 1,95 (m, 1 H); 1,97 (s, 3 H); 2,13 (m, 1 H); 2,34 (m, 4 H); 2,46 (m, 2 H); 3,65 (m, 4 H); 3,98 - 4,40 (m, 10 H); 4,66 (dd, J = 13,40, 1H); 5,15 (d, J = 3,1 H); 5,25 (m, 1 H); 5,60 (s, 1H); 7,25 - 7,53 (m, 10 H); 8,23 (d, 1 H).

1/640 1/320 1/160 1/80 1/40 1/20 1/10 rozcieńczenie fig. 1

Wzór 2

R'-N\d Η O

H OH ♦ ΗΟ'^γ^ O.CO.(CH₂)_U.

nh₂ ♦ BOP ^\mu. O.CO.(CH₂)_u‘.CH₃

CHć

cr NH₂

O.CO.(CH₂)_u ,ch₃O.CO.(CH₂)_u.CH₃

1) +H₂/Pd-C

2) ♦ BOC.HNxlxCOX

,. ΠΓ» \LZCUA HoC^OR, | 3)+CF₃.COOH

O.CO.(CH₂)_u.CH₃O.CO.(CH₂)_u.CH₃

RjO.

^ch3V°<——Λ T mu'

COX

NH ^0R3 I

COCH ‘3 związki o wzorze 2

Schemat 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania odmian pochodnej glicerolu o wzorze 1, w którym atom węgla oznaczony gwiazdką * ma konfigurację R albo, odpowiednio, konfigurację S, znamienny tym, że usuwa się grupy zabezpieczające z odpowiedniego związku o wzorze 2, w którym atom węgla oznaczony gwiazdką * ma konfigurację jak wyżej zdefiniowano, a Ri do R4 niezależnie oznaczają grupy zabezpieczające grupę hydroksylową.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako związek o wzorze 2 stosuje się związek, w którego wzorze atom węgla oznaczony gwiazdką * ma konfigurację R.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako związek o wzorze 2 stosuje się związek, w którego wzorze atom węgla oznaczony gwiazdką * ma konfigurację S.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że usunięcia grup zabezpieczających dokonuje się na drodze hydrogenacji.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako związek o wzorze 2 stosuje się związek, w którego wzorze R1 i R2 razem oznaczają grupę benzylidenową, R 3 oznacza grupę benzylową, a R4 oznacza grupę benzylową lub tert-butylodimetylo-sililową.