SK283596B6 - Lipozóm-cytokínová kompozícia a spôsob jej prípravy - Google Patents

Lipozóm-cytokínová kompozícia a spôsob jej prípravy Download PDF

Info

Publication number
SK283596B6
SK283596B6 SK1260-97A SK126097A SK283596B6 SK 283596 B6 SK283596 B6 SK 283596B6 SK 126097 A SK126097 A SK 126097A SK 283596 B6 SK283596 B6 SK 283596B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
mgdf
csf
liposome
cytokine
composition
Prior art date
Application number
SK1260-97A
Other languages
English (en)
Other versions
SK126097A3 (en
Inventor
David David Collins
Younsik Cha
David David Brems
Original Assignee
Amgen Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc. filed Critical Amgen Inc.
Publication of SK126097A3 publication Critical patent/SK126097A3/sk
Publication of SK283596B6 publication Critical patent/SK283596B6/sk

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/196—Thrombopoietin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/145—Colony stimulating factor

Abstract

Je opísaný spôsob prípravy stabilných kompozícií proteínov, v ktorom sa proteíny, ktoré sú schopné prechádzať do roztaveného globulárneho stavu, kontaktujú so záporne nabitým lipidovým vehikulom, čím sa proteín stabilizuje pred tepelne indukovanou agregáciou, denaturáciou a stratou aktivity. Proteín: fosfolipidový komplex priamo stabilizuje sekundárnu a terciárnu štruktúru proteínu a tieto kompozície sú použiteľné vo vysokoteplotných formuláciách a ako nové dopravné vehikulá. Sú opísané stabilné kompozície proteínov pripravené týmto spôsobom. ŕ

Description

Doterajší stav techniky
Ukázalo sa, že niekoľko proteínov prechádza do roztaveného globulárneho stavu (MGS). Van der Goot, F. G., Náture 354, 408 - 410 (1991). Proteíny v roztavenom globulámom stave majú sekundárnu štruktúru, ktorá je porovnateľná so štruktúrou prirodzeného proteínu, ktorému ešte chýba tuhá terciárna štruktúra. Pitsyn a koľ, FEBS Letters 262:1. 20 - 24 (1990). V niektorých prípadoch je prechod do tohto stavu sprevádzaný odkrytím už skrytých hydrofóbnych úsekov proteínu. Vďaka odkrytiu kritických hydrofóbnych zvyškov môže MGS tvoriť medzikrok pri agregácii a zrážaní proteínu. MGS konformáciu je možné detegovať porovnaním cirkulámeho dichroizmu v ďalekej UV oblasti so spektrom aromatických bočných reťazcov (cirkulárny dichroizmus blízkeho UV a fluorescencie). Roztavený globulámy stav má spektrálne zmeny aromatických skupín v neprítomnosti zmien cirkulámeho dichroizmu ďalekého UV; Bychkova a koľ, FEBS Letters 238: 231 - 234 (1988); a môže byť súčasťou prenikania určitých proteínov membránou; Bychkova a kol., FEBSLetters 238: 231 - 234 (1998); Van der Goot, F. G., Náture 354, 408 -410(1991).
Faktor, stimulujúci granulocytovú kolóniu (G-CSF), je jedným z proteínov, o ktorých je známe, že prechádza do MGS pred agregáciou. Humánna rekombinantná G-CSF selektívne stimuluje neutrofily, čo je typ bielych krviniek používaný na boj s infekciou. V súčasnosti je na tieto terapeutické ciele dostupný Filgrastin, čo je rekombinantný GCSF. Bolo uskutočnených mnoho štúdií zaoberajúcich sa určovaním štruktúry G-CSF pri rôznych podmienkach; Lu a kol., J. Biol. Chem. zv. 267, 8770 - 8777 (1992). Vzhľadom na jeho hydrofóbne vlastnosti je obtiažne formulovať G-CSF do formulácií, ktoré by bolo možné dlhodobo skladovať. Formulácie určitých hydrofóbnych proteínov strácajú počas dlhodobého skladovania svoju účinnosť v dôsledku vzniku dimérových a rádovo vyšších agregátov. Pri skladovaní môže takisto dochádzať k ďalším chemickým zmenám, napríklad deaminácii a oxidácii. Okrem toho je nutné G-CSF pri príprave formulácií chrániť proti denaturácii a predovšetkým dbať na udržanie stability sekundárnej a terciámej štruktúry proteínu.
Humánny GM-CSF predstavuje 22-kDa glykoproteín, ktorého prítomnosť je nepretržite potrená pre in vitro prolíferáciu makrofágu a granulocytárnych prekurzorových buniek. Tento glykoproteín takisto kontroluje nevratné prevedenie týchto buniek na granulocyty a makrofágy. Medzi jeho ďalšie biologické aktivity patrí napríklad regulácia funkčnej aktivity zrelých bunkových typov; Gough a kol., Náture 309, 763 - 767 (1984); a zvyšovanie chemotaxie k príslušným chemicky vábiacim činidlám; Williams a kol., Hematology, 4. vyd. (1990). GM-CSF takisto stimuluje produkciu monocytov a môže byť teda použitý pri liečení monocytárnych porúch, napríklad monocytopénie.
Humánny GM-CSF je možné získať a purifikovať z mnohých zdrojov. Spôsoby prípravy rekombinantného humánneho GM-CSF už opísal Burges a kol., Blood, 69:1, 43 - 51 (1987). Patent US 5 047 504 (Boone) opisuje spôsob výroby, ktorý umožňuje vyrábať GM-CSF v neglykozylátovej forme ako produkt expresie prokaryotických hostiteľských buniek v priemyselnom rozsahu.
Zdá sa, že MGDF, čiže megakaryocytový rastový a diferenciačný faktor, ktorým je nedávno klonovaný cytokín, je hlavným regulátorom hladín krvných doštičiek v obehovom systéme. Pozri Bartley, T. D. a kol., Celí 77: 1117 - 1124 (1994); Lok, S. a kol., Náture 369: 565 - 568 (1994); de Sauvage, F. J. a kol., Náture 369: 533 -538 (1994); Miyazake, H. a kol., Exp. Hematol. 22: 838 (1994); a Kuter, D. J. a kol., PNAS USA, 91.: 11104 - 11108 (1994). MGDF je takisto označovaný ako trombopoetín (TPO), mpl - ligand a megapoetín. Zrelý humánny MGDF je proteín, ktorý má celkovo 332 aminokyselín. Sekvencie tohto proteínu a zodpovedajúce cDNA sú znázornené na priloženom obr. 29.
Ukázalo sa , rekombinantný MGDF je produkovaný tak vo vaječníku čínskeho chrčka (CHO), ako aj v bunkách E. coli, je biologicky aktívny a špecificky stimuluje alebo zvyšuje hladinu megakaryocytov a/alebo krvných doštičiek in vitro v tele myši, potkanov a opíc. Pozri napríklad Hunt, P. a kol., Blood 84 (10): 390A (1994). Molekuly humánneho MGDF, ktoré boli upravené tak, že dosahovali aspoň 151 aminokyselín, počítané od aminokyselinovej polohy 1 (pozri obr. 29), si ponechali svoju biologickú aktivitu in vivo. Takisto je možné odstrániť prvých šesť aminokyselín z N-konca humánnej sekvencie MGDF proteínu bez toho, aby došlo k ovplyvneniu biologickej aktivity. Je teda zrejmé, že biologická aktivita je kódovaná aminokyselinami 7 až 15+ (vrátane zrelej aminokyselinovej sekvencie humánneho MGDF, znázornenej na obr. 29).
Prirodzene sa vyskytujúci MGDF má formu glykozylátovanej molekuly. Glykozylačný vzor prirodzeného MGDF je spájaný s dvoma kľúčovými doménami, ktoré sa nachádzajú v MGDF. Sekvencia prvých približne 151 aminokyselín humánneho MGDF, ktorá zodpovedá aktívnej časti molekuly, nesie značnú homológiu so sekvenciou erytroproteinu (EPO), čo je cytokín schopný stimulovať produkciu erytrocytov a je označovaný ako „EPO-podobná“ doména humánneho MGDF. Zvyšné aminokyseliny zrelého proteínu tvoria tzv. „N-naviazanú karbohydrátovú“ doménu, pretože zahrnujú väčšinu miest pre N-naviazanú glykozyláciu, ak nie všetky tieto miesta. V humánnom MGDF je šesť miest N-naviazanej glykozylácie a všetky tieto miesta sú obsiahnuté v doméne N-naviazanej glykozylácie. Obidve domény obsahujú miesta O-naviazanej glykozylácie. Bolo zistených 12-24 O-naviazaných glykozylačných reťazcov v molekule. Experimenty uskutočňované s DNA humánneho MGDF exprimovanou rekombinantne v CHO bunkách ukázali, že v EPO-podobnej doméne sú aspoň dve O-naviazané miesta glykozylátované a to v polohe 1 (Ser) a37 (Thr).
Aj keď je už možné proteíny, akými sú napríklad G-CSF a MGDF, pri určitých presne definovaných podmienkach, stabilizovať, stále pretrváva potreba predĺžiť čas skladovania týchto a ďalších proteínov stabilizáciou ich sekundárnej a terciárnej štruktúry. Jednou z ciest, ktorá bola v minulosti použitá na prácu s týmito proteínmi, je použitie lipozómov. Lipozómy sú úplne uzatvorené lipidové dvojvrstvové membrány, tvorené vodou nerozpustnými polárnymi lipidmi, predovšetkým fosfolipidmi. Lipozómové vehikulá môžu mať jedinú membránovú dvojvrstvu (unilamelárnu) alebo môžu mať týchto membránových dvoj vrstiev viac (multilameláme). Táto dvojvrstva sa skladá z dvoch lipidových monovrstiev, ktoré majú hydrofilnú (polárnu) oblasť „hlavy“ a hydrofóbnu (nepolámu) oblasť „päty“, pričom hydrofóbne päty sú orientované smerom do stredu dvojvrstvy, zatiaľ čo hydrofilné hlavy sú orientované smerom k vodnej fáze. Stabilita, tuhosť a priepustnosť lipozómov môže byť ovplyvnená vo fosfolipidovom zložení, zmenami teploty, zahrnutím sterolu alebo zabudovaním nabitého amfifilu. Bázická štruktúra lipozómov môže byť vytvorená mnohými technikami v danom odbore známych.
Pri procese vytvárania lipozómov môžu lipozómy zachytávať vo vodných kanálkoch látky rozpustené vo vode a potom ich rôznymi rýchlosťami uvoľňovať. Zistenie toho, že lipozómy môžu zavádzať enzýmy do buniek a meniť ich metabolizmus (Gregoriadis, New Engl. J. Med. 295, 704 -
- 710, 765 - 770 (1976) poskytlo odpoveď na otázku, ako cielene dopravovať účinné látky. Tento objav mal veľký podiel na rozvoji výskumu uskutočňovaného vo farmaceutickom priemysle a zaoberajúceho sa pomalým uvoľňovaním účinných látok, vitamínov a proteínov. Lipozómy sa používajú ako depoty pomaly uvoľňujúce účinné látky, vitamíny a proteíny, maskované v hydrofóbnych vrstvách alebo hydrofóbnom jadre lipozómu.
Úspešné použitie lipozómov ako nosičov účinnej látky je obmedzené, pretože testy zaoberajúce sa použitím týchto lipozómov odhalili niekoľko problémov. Je napríklad známe, že lipozómy pôsobia ako výkonné imunologické adjuvans na zachytené antigény a preto je potrebné sa v prírode, kedy sa v lipozómoch zachytia enzýmy alebo ďalšie proteíny xenogénneho pôvodu, chovať opatrne. Riadenie rýchlosti difúzie účinnej látky je takisto obtiažne. Tieto ťažkosti spôsobuje vlastná nestabilita lipozómov a prítomnosť určitých krvných zložiek, ktoré urýchľujú difiíziu určitých účinných látok. Navyše vďaka svojej povahe sú niektoré látky zle zachytiteľné v lipozómoch a difundujú teda rýchlejšie do obehu. Napokon existuje problém v prípade, že cieľom na pôsobenie účinnej látky má byť ľubovoľná bunka alebo orgán iný ako pečeň a slezina. Dokonalým prehľadom o lipozómoch, látkach, ktoré boli zabudované do lipozómov a problémoch spojených s použitím lipozómov ako nosičov účinných látok, je prehľad „Liposomes“ od Gregora Gregoriaidisa, ktorý je možné nájsť v publikácii Drug Carries in Biology and Medicíne, kapitola 14, 287 -
- 341 (Academic Press, N. Y., 1979).
Napriek tomu, že o pokusoch použitia lipozómov ako nosičov účinných látok bolo napísané už mnoho, málo publikácií sa zaoberá použitím lipozómov na ciele stabilizácie štruktúry peptidu a/alebo proteínu a predĺženia čas skladovateľnosti terapeutických peptidov. V PCT/US90/05163 s názvom „Therapeutic Peptides and Proteins“, Hostetler a kol. Opisuje použitie prázdnych lipozómov ako farmaceutický prijateľného riedidla na rozpúšťanie polypeptidov a/alebo proteínov, ktorého cieľom je chrániť tieto polypeptidy a/alebo proteíny pred akumuláciou na rozhraní vzduchu a vody a pred adsorpciou týchto polypeptidov a/alebo proteínov na povrchu nádoby. Hostetler a kol. uvádza, že záporne nabitý fosfolipid môže byť pridaný až do konečnej koncentrácie približne 50 molárnych % a že výhodným lipidom je fosfatidylcholín, čo je neutrálny fosfolipid. Hostetler a kol. neuvádza, že by riedidlo stabilizovalo štruktúru polypeptidu a/alebo proteínu.
V patente PCT/US91/07694 s názvom ..Preparahon and Characterizalion of Liposomal Formulations of Tumor Necrosis Factor“, Ilung a kol., je opísaná molekula lipofílne modifikovaného tumor nekrotizujúceho faktora (TNF), naviazaná na povrch lipozómu alebo zachytená vnútri lipozómu. Ako uvádza tento dokument, zistilo sa, že lipozómo vé a lipofilné TNF molekuly majú zvýšenú in vivo stabilitu. Stabilita súvisí so znížením tendencie TNF - lipozómu uvoľňovať TNF do systému in vivo. Ako výhodné lipozómy boli označené neutrálne lipidy. Hung a kol. neopisuje TNF kompozíciu, v ktorej by mala vehikula stabilizačný účinok na štruktúru proteínu.
Doteraz nebolo publikované nič, čo by sa týkalo kontaktovania proteínu, napríklad G-CSF alebo MGDF, so záporne nabitým lipidovým vehikulom, ktorého cieľom by bolo priamo stabilizovať proteín proti tepelne indukovanej agregácii, denaturácii, strate účinnosti a rozbaleniu sekundárnej štruktúry. Stále teda pretrváva potreba pripraviť také kompozície, ktoré by bolo možné použiť pri formulačných procesoch vyžadujúcich vysoké teploty (napríklad zabudovaní G-CSF a/alebo MGDF do polymérov) a ktoré by boli použiteľné ako nové dopravné vehikulá (napríklad na orálne podanie pegylátovaného G-CSF). Predložený vynález takéto kompozície poskytuje.
Podstata vynálezu
Vynález sa týka pridania hydrofóbnych vehikúl, napríklad lyzolfosfolipidov alebo ďalších lipozómov, k proteínu pri podmienkach, pri ktorých sa proteín nachádza v roztavenom globulárnom stave, pričom tieto vehikulá budú priamo stabilizovať sekundárnu a terciámu štruktúru proteínu a tak chrániť proteín pred tepelne indukovanou agregáciou, denaturáciou a stratou účinnosti. Vynález sa predovšetkým týka stabilných G-CSM: fosfolipidových a MGDF: fosfolipidových kompozícií. Prekvapivo sa zistilo, že výhodné G-CSM: fosfolipidové a MGDF: fosfolipidové kompozície je možné niekoľkokrát cyklovať medzi 10 - 95 °C a po ochladení opäť získať úplnú sekundárnu proteínovú štruktúru. Kompozíciu j c možné použiť pri formulačných postupoch, ktoré vyžadujú vysoké teploty a takisto ako nové dopravné vehikulá. Okrem toho tieto kompozície majú predĺžený čas skladovania v porovnaní so samotným proteinom a interakcia proteínu s fosfolipidovým vehikulom bráni adsorpcii proteínu na steny sklenenej nádoby.
Pri výhodnej realizácii proteín: fosfolipodový komplex obsahuje záporne nabitý lipozóm, ktorý sa zvolí z dioleoylfosfatidylglycerolu (DOPG), dimyristoylfosfatidylglycerolu (DMPG), dipalmitoylfosfatidylglycerolu (DPPG), vaječného fosfatidylglycerolu, dioleoylfosfatidylctanolamínu (DOPE), vaječného fosfatidyletanolamínu, kyseliny dioleoylfosfatidovej (DOPA), kyseliny dimyristoylfosfatidovej (DMPA), kyseliny dipalmitoylfosfatidovej (DPPA), dioleoylfosfatidylserínu (DOPS), dimyristoylfosfatidylserínu (DMPS), dipalmitoylfosfatidylserínu (DPPS), vaječného fosfatidylserínu, lyzofosfatidylglycerolu, lyzofosfatidyletanolamínu a lyzofosfatidylserínu. Veľmi výhodným je DOPG, záporne nabitý nenasýtený fosfolipid. Ďalšími znakmi vynálezu je udržanie pH hodnoty v rozmedzí od 3,0 do 7,5 a lipid : proteínového pomeru aspoň 10:1.
Ďalšími znakmi vynálezu, použitými vo výhodných realizáciách vynálezu, sú napríklad použitie chemicky modifikovaných proteínov v proteín: fosfolipidovom komplexe a takisto použitie aspoň jedného činidla regulujúceho izotonicitu, pufrovacieho činidla a/alebo činidla regulujúceho pH hodnotu. Vynález teda zahrnuje stabilné proteín: :fosfolipidové kompozície, ktoré obsahujú rôzne kombinácie týchto dodatočných znakov.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 znázorňuje fluorescenčné emisné spektrum rhG-CSF v prítomnosti (krivka 1) a pri absencii (krivka 2) DOPO vehikúl. Koncentrácia rhG-CSF bola 0,2 mg/ml. Pomer DOPG : rhG-CSF (krivka 1) bol 100 : 1 (molámy pomer). Obr. 2 znázorňuje vplyv veľkosti lipid: proteínového pomeru na rhG-CSF fluorescenciu. Fo označuje začiatočnú fluorescenciu (bez lipidov) a F označuje fluorescenciu po pridaní lipidu a po dosiahnutí označeného molárneho pomeru lipid : rhG-CSF. Obr. 2(a) znázorňuje F/Fo (plný štvorec) a maximálne vlnové dĺžky (prázdny trojuholník) pre zmesi DOPG : rhG-CSF. Obr. 2(b) znázorňuje F/Fo (plný štvorec) a maximálne vlnové dĺžky (prázdny trojuholník) pre zmesi DOPC : rhG-CSF.
Obr. 3 znázorňuje Stem - Volmerove grafy potlačenia rhG-CSF fluorescencie pridaním Kí pri absencii (plný kruh) a v prítomnosti (prázdny kruh) DOPG vehikula. Potlačenie fluorescencie sa uskutočňovalo pridaním alikvotných podielov KI k rhG-CSF (0,2 mg/ml) a pri molámom pomere DOPG-CSF (100: 1).
Obr. 4 znázorňuje potlačenie rhG-CSF tryptofánovej fluorescencie po pridaní pyréndekánovej kyseliny. Emisná vlnová dĺžka bola 327 nm a molámy pomer DOPG : rhG-CSFbol 100:1.
Obr. 5 znázorňuje graf, ktorý ukazuje porovnanie zmien F intenzity pre rhG-CSF v neprítomnosti a v prítomnosti rôznych lipidov. Vo všetkých prípadoch bol molárny lipid : proteínový pomer 100 : 1.
Obr. 6 znázorňuje graf, ktorý ukazuje porovnanie posunov emisných maxím pre rhG-CSF v neprítomnosti a v prítomnosti rôznych lipidov. Vo všetkých prípadoch bol molámy lipid : proteínový pomer 100 : 1.
Obr. 7 znázorňuje vplyv DMPC (krivka 2), DMPG (krivka 3) a DMPA (krivka 4) na CD rhG-CSF (krivka 1). Vo všetkých prípadoch bol molámy lipid-proteínový pomer 50 : 1 vo vode a pH hodnota 6,0.
Obr. 8 znázorňuje vplyv zvýšenia teploty na CD rhG-CSF (krivka 1) alebo DOPG : rhG-CSF (140 . 1 molárny pomer) krivka 2). Koncentrácia rhG-CSF bola 80 pg/ml vo vode a pH hodnota 6,0. Teplota sa rastrovala v rozsahu od 10 do 90 °C, rýchlosťou 100 °C/hod.
Obr. 9 znázorňuje termogramy diferenčnej rastrovacej kalorimetrie pre rhG-CSF (krivka 1) a DOPG : rhG-CSF (45 : 1 molámy pomer) (krivka 2). Koncentrácia rhG-CSF vo vzorkách bola 1 mg/ml vo vode a pH 7,0. Rastrovacia rýchlosť bola 90 °C/hod.
Obr. 10 znázorňuje vplyv teplotnej cyklizácie na CD rhG-CSF (krivka 1) a DOPG : rhG-CSF (140 : 1 molárny pomer) (krivka 2). Vzorky sa rýchlo ohriali na 95 °C a ochladili na 10 °C, ako označujú šípky. Koncentrácia rhG-CSF vo vzorkách bola 80 pg/ml a ph hodnota 6,0.
Obr. 11 znázorňuje vplyv teplotnej cyklizácie na CD rhG-CSF (krivka 1) a DMPG : rhG-CSF (150 : 1 molámy pomer) (krivka 2). Vzorky' sa rýchlo ohriali na 95 °C a ochladili na 10 °C, ako označujú šípky. Koncentrácia rhG-CSF vo vzorkách bola 80 pg/ml a pH hodnota 6,0.
Obr. 12 znázorňuje vplyv teplotnej cyklizácie na CD rhG-CSF (krivka 1) a DPPG : rhG-CSF (150 : 1 molámy pomer) (krivka 2). Vzorky sa rýchlo ohriali na 95 °C a ochladili na 10 °C, ako označujú šípky. Koncentrácia rhG-CSF vo vzorkách bola 80 pg/ml a pH hodnota 6,0.
Obr. 13 znázorňuje graf, ktorý ukazuje schopnosť rôznych lipidov stabilizovať rhG-CSF počas lyofilizácie. Lipid:proteínový pomer bol vo všetkých prípadoch 100 : 1. Stabilita sa stanovila na základe výsledkov testov kostnej drene, stanovujúcich zachovanie in vitro aktivity. Samotný rhG-CSF neprežil lyofilizačný proces, takže ako kontrolná vzorka sa použil neošetrený rhG-CSF v neprítomnosti lipidu.
Obr. 14 znázorňuje účinky rôznych lipidov na in vivo aktivitu rhG-CSF. Aktivita (WBC súčet) sa merala po subkutánnom injektovaní chrčkov. Dávka rhG-CSF bola 100 pg/kg a lipid: proteínový pomer bol 100 : 1.
Obr. 15 znázorňuje účinky rôznych lipidov na in vivo aktivitu rhG-CSF. Aktivita (WBC súčet) sa merala po subkutánnom injektovaní chrčkov. Dávka rhG-CSF bola 100 pg/kg a lipid:proteínový pomer bol 50:1.
Obr. 16 znázorňuje graf, ktorý ukazuje porovnanie zmien F intenzity pre CHO-G-CSF v neprítomnosti a v prítomnosti DOPG pri rôznych pH hodnotách. Vo všetkých prípadoch bol lipid:proteínový pomer 100:1 (molámy).
Obr. 17 znázorňuje graf, ktorý ukazuje porovnanie posunov emisných maxím pre CHO-G-CSF v neprítomnosti a v prítomnosti DOPG pri rôznych pH hodnotách. Vo všetkých prípadoch bol lipid:proteínový pomer 100 : 1 (molárny)·
Obr. 18 znázorňuje vplyv teplotnej cyklizácie na CD PEG-G-CSF (—-) a DMPG : PEG-G-CSF (17 : 1 molámy pomer) (-—). Vzorky sa ohriali na 90 °C a ochladili na 10 °c.
Obr. 19 znázorňuje: (a) vplyv teplotnej cyklizácie na CD GM-CSF v PBS pri pH 7,0; GM-CSF sa pri 10 °C (-—) porovnával s GM-CSF, ktorý sa ohrial na 90 °C a potom ochladil na 10 °C (—); (b) vplyv teplotnej cyklizácie na CD DPPG : PEG-G-CSF (17:1 molámy pomer). DPPG: GM-CSF pri 10 “C (-—) sa porovnával s DPPG-GM-CSF, ktorý sa ohrial na 90 °C a potom ochladil na 10 °C (-—).
Obr. 20 znázorňuje: (a) výsledky WBC odpovede na intraduodenálnu infúziu rhG-CSF pri absencii a v prítomnosti DOPG; rhG-CSF dávka bola 750 pg/kg a lipid:proteínový pomer bol 100 : 1; (b) výsledky celkovej WBC odpovede na intraduodenálnu infúziu PEG-G-CSF pri absencii a v prítomnosti DOPG; PEG-G-CSF dávka bola 750 pg/kg a lipid: proteínový pomer bol 100 : 1.
Obr. 21 znázorňuje vplyv DOPG na hladiny PEG-G-CSF v sére po intraduodenálnej infúzii; PEG-G-CSF dávka bola 750 pg/kg a lipid:proteínový pomer bol 100 : 1.
Obr. 22 znázorňuje fluorescenčné emisné spektrum MGDF v prítomnosti a pri absencii DMPG vehikúl. Koncentrácia MGDF bola 0,1 mg/ml. MGDF bol od E. coli odvodený MGDF 1-163. DMPG-MGDF pomer bol 100 : 1 (molárny pomer).
Obr. 23 znázorňuje vplyv zvýšenia lipid: proteínového pomeru na MGDF fluorescenciu. MGDF bol od E. coli odvodený MGDF 1-163. Obrázok ukazuje maximálne emisné vlnové dĺžky pre zmesi DMPG: MGDF pri pH 5,0 (prázdny kruh) a pH 7,0 (plný kruh).
Obr. 24 znázorňuje Stern - Volmerove grafy potlačenia MDGF fluorescencie pridaním KI pri absencii (prázdny kruh) a v prítomnosti (plný kruh) DMPG vehikúl. MGDF bol od E. coli odvodený MGDF 1-163. Potlačenie fluorescencie sa uskutočňovalo pridaním alikvotných podielov KI k MDGF (0,1 mg/ml) a pri molámom pomere DMPG : : MGDF (100: 1).
Obr. 25 znázorňuje vplyv teplotnej cyklizácie na CD MGDF (plný kruh) a DMPG : MGDF (100 : 1 molárny pomer) (plný kruh). MGDF bol od E. coli odvodený MGDF 1-163. Percento zvyšnej helicity označuje množstvo CD detegovaného pri 10 °C po každom cykle (jeden cyklus = vzorky sa rýchlo ohriali na 95 °C a ochladili na 10 °C).
Obr. 26 znázorňuje rozsah MGDF (+DMPG) denaturácie v prítomnosti rôznych koncentrácií močoviny. Obrázok ukazuje cirkulámy dichroizmus MRE pre MGDF (prázdny kruh) a DMPG: MGDF (plný kruh) a takisto MGDF (prázdny štvorec) a DMPG: MGDF (plný štvorec) fluorescenčné emisné maximá. MGDF bol z E. coli odvodený MGDF 1-163 a pomer DMPG : MGDF bol 100 : 1 (molárny pomer).
Obr. 27 graficky zobrazuje fluorescenčné emisné maximá pre MGDF (±DMPG) a PEG (±DMPG). MGDF bol od E. coli odvodený MGDF 1-163 a PEG-MGDF bol monopegylátovaný od E. coli odvodený MGDF 1-163. Pomer DMPG : MGDF a DMPG : PEG-MGDF bol 100 : 1 (molámy pomer).
Obr. 28 znázorňuje rozsah PEG-MGDF (±DMPG) absorpcie na povrch sklenených fľaštičiek pri rôznych koncentráciách PEG-MGDF. MGDF bol od E. coli odvodený MGDF 1-163 a PEG-MGDF bol monopegylátovaný od E. coli odvodený MGDF 1-163. Percento izolovaného PEG-MGDF (plný štvorec) a DMPG: PEG-MGDF (prázdny kruh) sa stanovilo sčítaním rádiologický značeného MGDF izolovaného zo sklenených fľaštičiek po osemnásťhodinovej inkubácii pri izbovej teplote.
Obr. 29 znázorňuje DNA a aminokyselinovú sekvenciu humánneho MGDF (SEQ ID NO:1 a 2) vrátane signálneho peptidu (aminokyseliny-21 až -1) a zrelej aminokyselinovej sekvencie (1-332).
Obr. 30 znázorňuje príklad miestne špecifickej MGDF redukčnej alkylácie na α-aminoskupine N-koncového zvyšku, uskutočňovanej pri použití monomctoxypolyetylénglykolaldehydov, ktorá poskytuje v podstate monopegylátovaný produkt.
Obr. 31 znázorňuje in vivo aktivitu DMPG: MGDF a DMPG: PEG-MGDF v tele normálnych myší, v zmysle počtu krvných doštičiek. MGDF bol od E. coli odvodený MGDF 1-163 a PEG-MGDF bol monopegylátovaný od E. coli odvodený MGDF 1-163. DMPG: MGDF a DMPG: PEG-MGDF dávka bola 100 pg/kg a 300 pg/kg a lipid proteínový pomer bol 100 : 1.
Kompozície podľa vynálezu opisuje podrobnejšie nasledujúca opisná časť a ilustračné príklady. Tieto príklady ukazujú rôzne aspekty vynálezu a zahrnujú výsledky testov, ktoré určujú stabilitu a biologickú aktivitu rôznych proteín: :fosfolipidových kompozícií. Prekvapivo sa zistilo, že interakcia proteínov s lipidovým vehikulom priamo stabilizovala proteínovú štruktúru, čím stabilizovala proteín pri podmienkach, ktoré by v neprítomnosti lipidu viedli k denaturácii proteínu.
Opisná časť takisto opisuje orálne podanie chemicky modifikovanej G-CSF: fosfolipidovej kompozície, pričom na modifikáciu G-CSF boli použité opísané polyetylénglykolové molekuly.
V rámci vynálezu je možné použiť mnohé rôzne proteíny, ktoré sú schopné prechádzať do roztaveného globulárneho stavu. Týmito použiteľnými proteínmi sú napríklad cytokíny, vrátane rôznych hematopoetických faktorov, napríklad uvedené G-CSF, GM-CSF, MGDF, M-CSF. Interferóny (α, β a τ), interleukíny (1-11), erytropoetín (EPO), fibroblastový rastový faktor, faktor kmeňovej bunky, nervový rastový faktor, BDNF, NT3, od krvnej doštičky odvodený rastový faktor a tumorový rastový faktor (α, β). Pre ďalšie proteíny je možné hodnotiť schopnosť prechádzať do MGS. Ak jc hodnotený proteín schopný prechádzať do MGS, potom môže byť uvedený do kontaktu so záporne nabitým lipozómovým vehikulom a môže sa určiť stabilizačný účinok.
G-CSF, ktorý sa používa v rámci vynálezu, má zvyčajne prirodzenú formu izolovanú a purifikovanú z cicavčích organizmov alebo predstavuje produkt chemických synte tických procesov alebo prokaryotickej, prípadne eukaryotickej, hostiteľskej expresie exogénnych DNA sekvencií, získaných genómových alebo cDNA klonovaním alebo génovou syntézou. Vhodnými prokaryotickými hostiteľmi sú rôzne bakteriálne (napríklad E. coli) bunky. Vhodnými eukaryotickými hostiteľmi sú napríklad kvasinky (napríklad S. cerevisiae) a cicavčie (napríklad vaječníka čínskeho chrčka, opičie) bunky. V závislosti od použitého hostiteľa sa G-CSF expresný produkt môže glykozylovať cicavčími alebo inými eukaryotickými uhľovodíkmi alebo môže zostať neglykozylátovaný. V rámci vynálezu je možné použiť všetky tieto formy G-CSF, aj keď z hľadiska najväčšieho komerčného využitia je najvýhodnejší rekombinantný G-CSF, predovšetkým odvodený od E. coli.
G-CSF, ktorý má byť chemicky modifikovaný na použitie v rámci vynálezu, môže takisto byť prirodzený humánny G-CSF (nhG-CSF) alebo produkt rekombinantných nukleokyselinových procesov, napríklad expresie prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských buniek. Použitou chemickou modifikáciou je zvyčajne naviazanie chemického zvyšku na samotnú molekulu G-CSF. Prehľadným článkom, opisujúcim modifikáciu proteínov a fúzne proteíny, je Francisov článok, Focus on Growth Factors 3:4-10 (máj 1992) (publikované v Mediscript, Mountview Court, Friern Bamet Lane, London N20, OLD, UK). Napríklad pozri EP 0 401 384 s názvom „Chemically, Modified Granulocyte Colony Stimulating FactoF, opisuje materiály a spôsoby prípravy G-CSF, na ktorom sú naviazané polyetylénglykolové molekuly. Naviazanie je možné viesť priamo na proteín alebo na zvyšok, ktorý pôsobí ako mostík pre účinnú látku. Vzhľadom na najvyššiu stabilitu je výhodné naviazanie kovalentnou väzbou. Chemická modifikácia môže prispieť ku kontrolovanému nepretržitému alebo dlhodobému účinku G-CSF. To môže mať napríklad vplyv na riadenie času, za ktorý chemicky modifikovaný G-CSF dosiahne krvný obeh. Príkladom chemického modifikačného činidla sú polyetylénglykolové kompozície, vrátane ich derivátov.
Na realizáciu tohto vynálezu je možné použiť ľubovoľné modifikované G-CSF prípravky, ktoré si po podaní zachovávajú svoju účinnosť. Účinnosť je možné stanoviť známymi metódami. Výhodný je predovšetkým pegylátovaný G-CSF, výhodnejší predovšetkým pegylátovaný od E. coli odvodený G-CSF a najvýhodnejší je tri-tctrapegylátovaný od E. coli odvodený G-CSF.
Zistilo sa, že G-CSF je najstabilnejší pri kyslých podmienkach napriek skutočnosti, že pri pH hodnotách 2,5 až 2,0 dochádza ku konformačným zmenám, medzi ktoré patrí strata terciárnej štruktúry a zvýšenie obsahu a-helikálnej štruktúry. Narhi a kol., J. Proteín Chem. 10, 359 - 367, (1991). Pre túto konformačnú zmenu je charakteristický roztavený globulámy stav (MGS). Takže rovnako ako v prípade, kedy sa na formulovanie použijú ďalšie proteíny schopné prechádzať do MGS, je potrebné pri práci s G-CSF tento proteín chrániť proti tepelne indukovanému rozbaľovaniu sekundárnej a terciárnej štruktúry a tým zabrániť denaturácii a agregácii.
GM-CSF, ktorý' sa používa v rámci vynálezu, má zvyčajne prirodzenú formu izolovanú a purifikovanú z cicavčích organizmov alebo predstavuje produkt chemických syntetických procesov, alebo prokaryotickej, prípadne eukaryotickej hostiteľskej expanzie exogénnych DNA sekvencií, získaných genómových alebo cDNA klonovaním, alebo génovou syntézou. Vhodnými prokaryotickými hostiteľmi sú rôzne bakteriálne (napríklad E. coli) bunky. Vhodnými eukaryotickými hostiteľmi sú napríklad kvasinky (napríklad S. cerevisiae) a cicavčie (napríklad vaječníka čínskeho chrčka, opičie) bunky. V závislosti od použitého hostiteľa sa GM-CSF expresný produkt môže glykozylovať cicavčími alebo inými eukaryotickými glycidmi, alebo môže zostať neglykozylátovaný. V rámci tohto vynálezu je možné použiť všetky tieto formy GM-CSF, aj keď z hľadiska najväčšieho komerčného využitia je najvýhodnejší rekombinantný GM-CSF, predovšetkým odvodený od E. coli.
Výraz „MGDF“, ako je tu použitý, zahrnuje prirodzene sa vyskytujúci MGDF, upravené formy prirodzene sa vyskytujúceho MGDF a takisto syntetické polypeptidy, ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu a glykozyláciu natoľko zodpovedajúcu aminokyselinovej sekvencii a glykozylácii prirodzene sa vyskytujúceho MGDF, aby mu umožnili mať biologickú aktivitu spočívajúcu v špecificky stimulujúcom raste, vývoji a/alebo produkcii megakaryocytov a/alebo krvných doštičiek.
Pri výhodnej realizácii je MGDF produktom expresie exogénnej DNA sekvencie, ktorá bola transfekovaná do eukaryotickej alebo prokaryotickej hostiteľskej bunky. To znamená, že pri výhodnej realizácii sa ako MGDF použije „rekombinantný MGDF“. Výhodným eukaryotickým hostiteľom sú cicavčie, veľmi výhodne CHO, bunky a výhodným prokaryotickým hostiteľom je baktéria, veľmi výhodne baktéria E. coli. Rekombinantný MGDF sa výhodne pripravuje pomocou spôsobov, ktoré budú ďalej opísané a ktoré je možné takisto nájsť v citovaných publikáciách týkajúcich sa klonovania a expresie MGDF.
Niektoré ďalšie výhodné MGDF molekuly majú tieto aminokyselinové sekvencie, ktoré znázorňuje obr. 29: MGDF 1-332 MGDF 1-191 MGDF 1-183 MGDF 1-174 MGDF 1-163 MGDF 1-153 MGDF 1-152 MGDF 1-151 MGDF 1-332 MGDF 1-191 MGDF 1-183 MGDF 1-174 MGDF 1-163 MGDF 1-153 MGDF 1-152 MGDF 1-151
V každom z uvedených príkladov môže N-koniec ďalej obsahovať Met-Lys.
V prípade vynálezu je možné takisto použiť rôzne analógy MGDF. Výraz „analóg MGDF“, ako je tu použitý, označuje MGDF s jednou alebo viacerými zmenami v aminokyselinovej sekvencii MGDF, ktoré majú za následok zmenu typu (N- alebo O- naviazanie), počet alebo oblasť miest na naviazanie glycidov. MGDF analóg(y) si zachovávajú) aspoň ekvivalentnú biologickú aktivitu v porovnaní s MGDF s prirodzenou sekvenciou (napríklad humánny MGDF) a môžu mať podstatne vyššiu aktivitu, ako bolo namerané v testoch stanovujúcich biologickú aktivitu. Výsledné analógy môžu mať menej alebo viac (výhodne viac) glycidových reťazcov ako prirodzený humánny/rekombinantný MGDF.
Do skupiny analógov použiteľných v rámci vynálezu je možné takisto zahrnúť analógy, ktoré majú aspoň jednu aminokyselinu vybiehajúcu z karboxylového konca MGDF a kde toto rozšírenie karboxylového konca poskytuje aspoň jedno ďalšie glycidové miesto. Karboxylový koniec MGDF sa bude líšiť v závislosti od konkrétnej použitej formy aminokyselina 1-332 z obr. 29 aminokyselina 1-191 z obr. 29 aminokyselina 1-183 z obr. 29 aminokyselina 1-174 z obr. 29 aminokyselina 1-163 z obr. 29 aminokyselina 1-153 z obr. 29 aminokyselina 1-152 z obr. 29 aminokyselina 1-151 z obr. 29 aminokyselina 1-332 z obr. 29 aminokyselina 1-191 z obr. 29 aminokyselina 1-183 z obr. 29 aminokyselina 1-174 z obr. 29 aminokyselina 1-163 z obr. 29 aminokyselina 1-153 z obr. 29 aminokyselina 1-152 z obr. 29 aminokyselina 1-151 z obr. 29
MGDF (napríklad MGDF 1-332 aminokyselín alebo MGDF 1-163 aminokyselín). Ďalšie glycidové miesto je možné dodať do karboxylového zvyšku MGDF druhov pridaním aminokyselín do karboxylového zvyšku, napríklad aminokyselín obsahujúcich aspoň jedno N- alebo O-naviazané glykozylačné miesto.
Vynález takisto zahrnuje chemicky modifikované MGDF kompozície. Pod pojmom chemická modifikácia sa všeobecne myslí MGDF produkt, v ktorom je uvedený MGDF proteín naviazaný na aspoň jednu polyetyténglykolovú molekulu (to znamená pegylátovaný MGDF). Na uskutočňovanie pegylácie MGDF je možné použiť ľubovoľnú, v danom odbore známu, pegylačnú reakciu. Pozri napríklad Focus on Growth Factors 3(2): 4- 10 (1992); EP 0 154 316; EP 0 401 384; a ďalšie tu citované publikácie, ktoré sa týkajú pegylácie. Výhodne sa na pegyláciu použije acylačná alebo alkylačná reakcia s reakčnou polyetylénglykolovou molekulou (alebo analogickým, reakčnou vodou rozpustným, polymérom).
Pri pegylácii, na ktorú sa použila acylačná reakcia, sa všeobecne aktívny esterový derivát polyetylénglykolu (PEG) uvedie do reakcie s MGDF proteinom. Na uskutočňovanie pegylácie MGDF je možné použiť ľubovoľnú známu alebo následne objavenú reakčnú PEG molekulu. Výhodným aktivovaným PEG esterom je PEG esterifikovaný na N-hydroxysukcínimid („NHS‘j. Pod výrazom „acylácia“, ako je tu uvedený, sa rozumejú napríklad nasledujúce typy väzieb medzi MGDF a vodou rozpustným polymérom, akým je PEG: amidová väzba, karbamátová väzba, uretánová väzba a pod. Pozri Bijoconjugate Chem. 5: 133 - 140 (1994). Reakčnými podmienkami môžu byť ľubovoľné, na pegyláciu vhodné, reakčné podmienky, ktoré sú v danom odbore známe, ale mali by sa vylúčiť také podmienky - napríklad teplota, rozpúšťadlo a pH - ktoré by inaktivovali MGDF druhy, ktoré majú byť modifikované.
Výsledkom pegylačnej acylácie bude zvyčajne polypegylátovaný MGDF produkt, v ktorom sú lyzínové epsilon-aminoskupiny pegylátované pomocou acylovej väzbovej skupiny. Spájacou väzbou bude výhodne amid. Výsledným produktom bude takisto výhodne v podstate len (napríklad > 95 %) mono-, di- alebo tri-pegylátovaný produkt. Ale v závislosti od špecifických použitých reakčných podmienok sa bude zvyčajne tvoriť aj príslušné množstvo druhov s vyššími stupňami pegylácie (maximálny počet lyzínových epsilon-aminoskupín plus jedna α-aminoskupina na N-konci MGDF). Ak je to žiaduce, je možné zo zmesi pomocou štandardných purifikačných techník, napríklad dialýzy, vysoľovania, ultrafiltrácie, ionexovej chromatografie, gélovej filtračnej chromatografie a elektroforézy, separovať čistejšie pegylátované druhy, predovšetkým nezreagované druhy.
Pegylácia alkyláciu zvyčajne zahrnuje uvedenie koncového aldehydového derivátu PEG do reakcie s proteinom, napríklad MGDF, v prítomnosti redukčného činidla. Alkylačnou pegyláciou je možné takisto získať polypegylátovaný MGDF. Okrem toho je možné manipulovať s reakčnými podmienkami tak, aby pegylácia prebehla v podstate len na α-aminoskupine N-konca MGDF druhov (to znamená, aby sa získali monopegylátované druhy). Exemplárne-redukčná alkylačná reakcia s MGDF, poskytujúca monopegylátovaný produkt, je znázornená na obr. 30. Tak v prípadne monopegylácie, ako aj v prípade polypegylácie, sú PEG skupiny výhodne naviazané na proteín cez -CH2-NH-skupinu. Pokiaľ ide o -CH2-skupinu, tento typ väzby je tu označovaný ako „alkylová“ väzba.
Derivatizáciou pomocou redukčnej alkylácie sa získa monopegylátovaný produkt využívajúci rôznu aktivitu rôz nych typov primárnych aminokyselín (lyzín versus N-koniec) dostupných na derivatizáciu pre MGDF. Reakcia sa uskutočňuje pri pH (pozri nižšie),ktorá umožní využiť výhody pKa diferencií medzi epsilon-aminoskupinami lyzínových zvyškov a α-aminoskupinami N-koncového zvyšku proteínu. Pomocou tejto selektívnej derivatizácie sa riadi naviazania vodou rozpustného polyméru, ktorý obsahuje reakčnú skupinu, napríklad aldehyd na proteín. Konjugácia s polymérom prebieha prevažne na N-konci proteínu a nedochádza k žiadnej podstatnejšej modifikácii ostatných reakčných skupín, napríklad aminoskupín v lyzínovom bočnom reťazci.
Takže pri výhodnej realizácii sa vynález týka pegylátovaného MGDF, kde sú PEG skupina alebo PEG skupiny naviazané cez acylovanú alebo alkylovanú skupinu. Ako už bolo diskutované, tieto produkty môžu byť polypegylátované alebo monopegylátované (napríklad obsahujúce 2-6, výhodne 2-5, PEG skupín). PEG skupiny sú zvyčajne naviazané na proteín cez a- alebo epsilon-aminoskupiny aminokyselín, ale takisto je potrebné zobrať do úvahy, že PEG skupiny môžu byť naviazané na ľubovoľnú aminoskupinu naviazanú na proteín, ktorá je dostatočne reaktívna na to, aby sa pri vhodných reakčných podmienkach naviazala na PEG skupinu.
Polyméme molekuly, použité v rámci acylačného aj alkylačného spôsobu, je možné zvoliť medzi vodou rozpustnými polymérmi a ich zmesami. Zvolený polymér by mal byť vodou rozpustný tak, aby sa proteín, na ktorý sa naviaže, nevyzrážal vo vodnom prostredí. Napríklad vo fyziologickom prostredí. Zvolený polymér by mal byť modifikovaný tak, aby mal jednu reakčnú skupinu, napríklad aktívnu esterovú skupinu, na acyláciu alebo aldehydovú skupinu na alkyláciu. Zvolený polymér by mal byť výhodne modifikovaný tak, aby mohol byť riadený stupeň polymerizácie. Výhodným reakčným PEG aldehydom je polyetylénglykolpropiónaldehyd, ktorý je vo vode stabilný, alebo jeho monoalkoxyderivát s 1 až 10 atómami uhlíka v alkoxyskupine alebo aryloxyderivát (pozri patent US 5 252 714). Polymér môže byť rozvetvený alebo nerozvetvený. Na terapeutickú realizáciu finálneho prípravku je výhodné, aby bol polymér farmaceutický prijateľný. Vodou rozpustný polymér je možné zvoliť zo skupiny tvorenej napríklad polyetylénglykolom, monometoxypolyetylén-glykolom, dextránom, poly(N-vinylpyrolidón)polyetylénglykolom, homopolymérmi propylénglykolu, kopolymérmi propylénoxidu a etylénoxidu, polyoxyetylátovanými polyolmi (napríklad glycerolom) a polyvinylalkoholom. Na ciele acylačných reakcií by mal mať zvolený polymér(y) jednu reakčnú esterovú skupinu. Na ciele redukčnej alkylácie by mal mať zvolený polymér(y) jednu reakčnú aldehydovú skupinu. Vodou rozpustný polymér by zvyčajne nemal byť zvolený z prirodzene sa vyvíjajúcich glykozylových zvyškov, pretože tie sa zvyčajne bežnejšie pripravujú pomocou cicavčích rekombinantných expresných systémov. Polymér môže mať ľubovoľnú molekulovú hmotnosť a môže byť rozvetvený alebo nerozvetvený.
Veľmi výhodným vodou rozpustným polymérom na ciele vynálezu je polyetylénglykol, skrátene PEG. Výraz „polyetylénglykol“, ako je tu použitý, zahrnuje všetky formy PEG, ktoré sa používajú na derivatizáciu ostatných proteínov, napríklad monoalkoxypolyetylénglykol s 1 až 10 atómami uhlíka v alkoxyzvyšku alebo aryloxypolyetylénglykol. Spôsoby prípravy pegylátovaného MGDF budú zvyčajne zahŕňať: (a) uvedenie MGDF peptidu do reakcie s polyetylénglykolom (napríklad reakčným esterovým alebo aldehydovým derivátom PEG) pri podmienkach, pri ktorých sa MGDF naviaže na aspoň jednu PEG skupinu; a (b) získanie reakčného produktu(ov). Optimálne reakčné podmienky na acylačné reakcie sa budú zvyčajne určovať prípad od prípadu na základe známych parametrov a požadovaného výsledku. Napríklad čím väčší pomer PEG : proteínu sa použije, tým väčšie je percento získaného polypegylátovaného produktu.
Ďalším dôležitým parametrom je molekulová hmotnosť polyméru. Zvyčajne platí, že čím väčšiu molekulovú hmotnosť má polymér, tým menej polymérnych molekúl sa môže naviazať na proteín. Pri optimalizácii týchto parametrov by malo byť podobným spôsobom zvážené rozvetvenie polyméru. Zvyčajne platí, že čím vyššia je molekulová hmotnosť (viac vetiev), tým vyšší je pomer polymér: proteín. Pre tu uvažované pegylačné reakcie je výhodnou priemernou molekulovou hmotnosťou približne 2 kDa až 100 kDa (výraz „približne“ označuje ±1 kDa). Výhodnou priemernou molekulovou hmotnosťou je približne 5 kDa až 50 kDa, najmä výhodne približne 12 kDa až 25 kDa, najvýhodnejšie 20 kDa. Pomer vodou rozpustného polyméru k MGDF proteínu sa bude zvyčajne pohybovať v rozmedzí od 1 : 1 do 100 : 1, výhodne (pre polypegyláciu) od 1 : 1 do 20 : 1 a (pre monopegyláciu) od 1 : 1 do 5 : 1.
Pri použití opísaných podmienok bude redukčná alkylácia poskytovať selektívne naviazanie polyméru na ľubovoľný MGDF proteín, ktorý má na N-konci a-aminoskupinu a poskytne v podstate homogénnu prípravu konjugátu monopolyméru a MGDF proteínu. Výraz „konjugát monopolyméru a MGDF proteínu“ označuje kompozíciu tvorenú jednou polymémou molekulou naviazanou na molekulu MGDF proteínu. Konjugát monopolyméru a MGDF proteínu bude mať výhodne poíymému molekulu situovanú na N-konci, ale nie na lyzínovej bočnej aminoskupine. Prípravok bude výhodne tvorený z viac ako 90 % konjugátom monopolyméru a MGDF proteínu a výhodne z viac ako 95 % tvorený konjugátom monopolyméru a MGDF proteínu, pričom zvyšok pozorovaných molekúl bude tvoriť nezreagované molekuly (to znamená proteín, ktorému chýba polymémy zvyšok). Uvedené príklady poskytujúce prípravok, ktorý je približne aspoň z 90 % tvorený konjugátom monopolyméru a proteínu a približne z 10 % nezreagovaným proteínom. Tento konjugát monopolyméru a proteínu má biologickú účinnosť.
Lipidovými vehikulami, použiteľnými v kompozíciách podľa vynálezu, sú záporne nabité lipozómy, ktoré sú schopné vzájomne reagovať s príslušným proteínom. Medzi lipozómy, o ktorých je možné uvažovať pri použití v rámci vynálezu, patria napríklad dioleoylfosfatidylglycerol (DOPG), dimyristoylfosfatidylglycerol (DMPG), dipalmitoylfosfatidylglycerol (DPPG), vaječný fosfatidylglycerol, dioleoylfosfatidyletanolamín (DOPE), vaječný fosfatidyletanolamín, kyselina dioleoylfosfatidová (DOPA), kyselina dimyristoylfosfatidová (DMPA), kyselina dipalmitoylfosfatidová (DPPA), dioleoylfosfatidylserín (DOPS), dimyristoylfosfatidylserín (DMPS), dipalmitoylfosfatidylserín (DPPS), vaječný fosfatidylserín, lyzofosfatidylglycerol, lyzofosfatidyletanolamín a lyzofosfatidylserín. V závislosti od konkrétneho použitého lipozómu by sa malo meniť množstvo použitého lipozómu.
Proteín: fosfolipidové kompozície výhodne zahrnujú pufrovacie činidlo na udržanie pH hodnoty roztoku v požadovanom rozmedzí. Výhodnými pufrovacími činidlami sú napríklad octan sodný, fosforečnan sodný a citrát sodný. Takisto je možné použiť zmesi týchto pufrovacích činidiel. Množstvo pufrovacieho činidla použiteľného v kompozícii závisí veľkou mierou od konkrétne zvoleného pufra a pH hodnoty roztoku. Napríklad octan je účinnejším pufrom pri pH 5, ako pri pH 6, takže v roztoku s pH 5 je možné použiť menej octanu ako v roztoku s pH 6. Výhodným pH rozmedzím pre kompozície podľa vynálezu je pH 3,0 až 7,5.
Kompozície podľa vynálezu môžu ďalej zahrnovať činidlo regulujúce izotonicitu, ktoré robí roztok izotonickým a vhodnejším na injektovanie. Najvýhodnejším činidlom je chlorid sodný v koncentrácii 0 až 150 mM.
Do rozsahu vynálezu takisto patria farmaceutické kompozície, ktoré obsahujú účinné množstvá polypeptidových produktov podľa vynálezu spoločne s farmaceutický prijateľnými riedidlami, konzervačnými látkami, solubilizátormi, emulgačnými činidlami, adjuvans a/alebo nosičmi. Tieto kompozície budú ovplyvňovať fyzikálny stav, stabilitu a biologickú dostupnosť proteínu. Pozri napríklad Re mingtons Pharmaceutical Sciences, 18. vydanie, 1435 - 1712 (Mack Publishing Co., Easton, PA., 1990). Účinné množstvo bude v konkrétnych prípadoch závisieť od mnohých rôznych faktorov, ktoré musí odborný lekár zobrať do úvahy. Medzi tieto faktory patrí napríklad požadovaný terapeutický výsledok, závažnosť stavu alebo choroby, ktorá má byť liečená, fyzický stav liečeného subjektu atď.
Pri výhodnej realizácii, zahrnujúcej od E. coli odvodený rhG-CSF, je použitým lipozómovým vehikulom DOPG pri DOPG : G-CSF pomere 50 : 1, pH 4,5, ktoré obsahuje 10 mM octanu sodného.
Pri výhodnej realizácii, zahrnujúcej od E. coli odvodený rhGM-CSF, je použitým lipozómovým vehikulom DMPG pri DMPG : GM-CSF pomere 17 : 1, pH 7,0, vo fosfátovom pufrovanom soľnom roztoku (PBS).
Pri výhodnej realizácii, zahrnujúcej od E. coli odvodený rhGM-CSF, ktorý je chemicky modifikovaný (tritetrapegylátovaný), je použitým lipozómovým vehikulom DMPG pri DMPG: PEG-G-CSF pomere 17 : 1 pH 4,5.
Pri výhodnej realizácii, zahrnujúcej od E. coli odvodený MGDF 1-163, je použitým lipozómovým vehikulom DMPG pri DMP G: MGDF pomere 100 : 1, pH 5,0 v 10 mM octanu sodného 5 % sorbitolu.
Pri výhodnej realizácii, zahrnujúcej od E. coli odvodený MGDF 1-163, ktorý bol chemicky modifikovaný (monopegylátovaný (20 kDa) redukčnou alkyláciou), je použitým lipozómovým vehikulom DMPG pri DMPG : MGDF pomere 100 : 1, pri pH 5,0 v 10 mM octanu sodného 5 % sorbitolu.
Pri výhodnej realizácii, zahrnujúcej od CHO odvodený MGDF 1-332, je použitým lipozómových vehikulom DMPG pri DMPG : MGDF pomere 100 : 1, pH 5,0 v 10 mM octanu sodného 5 % sorbitolu.
Aj keď bol vynález opísaný na príklade špecifických proteín: lipidových kompozícií a spôsobov liečenia, malo by byť odborníkovi v danom odbore zrejmé, že do rozsahu vynálezu takisto patrí mnoho príbuzných kompozícií a spôsobov ošetrenia.
Nasledujúce príklady majú len ilustratívny charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý’ je jednoznačne stanovený priloženými patentovými nárokmi.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Úlohou prvých experimentov bolo zistiť možnosti zabudovania rekombinantného humánneho G-CSF (rhG-CSF) do lipidového vehikula. Na prípravu thG-CSF sa použila rekombinantná DNA technológia, pri ktorej sa bunky E. coli transfekovali DNA sekvenciou kódujúcou humánny G-CSF spôsobom opísaným v patente US 4 810 643, Souza. rhG-CSF sa pripravili ako 4 mg/ml roztoku v nariedenej
HC1 pri pH 4,0. Všetky lipidy, ktoré poskytla spoločnosť Avani Polar Lipids (Alabaster, Ala) sa skladovali pri -20 °C pod dusíkom pri konečnej koncentrácii 100 mg/ml v chloroforme.
Príprava G-CSF: fosfolipidových komplexov
Pri príprave lipidových vehikúl, určených na kombinovanie s G-CSF, sa 30 μτηοΐ príslušného lipidu zaviedlo do sklenej skúmavky a vysušilo pri použití prúdu plynného dusíka, takže poskytlo tenkú fóliu. Tieto lipidové fólie sa sušili aspoň 2 hodiny pri vákuu a tým sa zbavili všetkých zvyškov chloroformu. Takto vysušené lipidové fólie sa hydratovali v 1 ml deionizovanej vody (ddH2O), fosfátom pufrovanom roztoku, pH 7,2 (Gibco/BLR „D-PBS“) alebo 15 mM NaCl. Vzorky sa potom sonifikovali v sonifikátore kúpeľového typu (Laboratory Supplies, Hicksville, N. Y.). V sonifikácii sa pokračovalo, až dokiaľ sa vzorky opticky nevyčerpali (zvyčajne 10-15 minút). Vzorky sa až do použitia skladovali pri 4 “C pod dusíkom. Konečná koncentrácia lipidov bola 30 mM. Alternatívne je možné lipidové vehikulá pripraviť vysúšaním 300 pmol lipidu pod dusíkom a vysúšaním pri vákuu opísaným spôsobom. Vysušené lipidové fólie sa hydrátovali v 10 ml príslušného, uvedeného, vodného roztoku. Vzorky sa potom mikrofluidizovali v laboratórnom emulgátore (Microfluidics Model 110S, Microfluidics, Inc. Cambridge, MA), pracujúcom pri 68,9 MPa. Každá vzorka sa mikroíluidizovala v desiatich cykloch. Mikrofluidizované vzorky sa potom skladovali pri 4 °C opísaným spôsobom.
G-CSF: fosfolipidové komplexy sa pripravili zmiešaním G-CSF (opísaným skôr) s príslušným lipidom (opísaným skôr). Na miešanie sa použilo vírenie, miešanie alebo mierne pretrepávanie. Na hodnotenie membránovej inzercie a stabilizácie proteínu sa použili rôzne moláme lipid: G-CSF pomery. Napríklad pri príprave 3 ml vzorky (vo vode), tvorenej 0,2 mg/ml G-CSF pri molárnom pomere lipid : G-CSF 40 : 1 sa 150 pl G-CSF zásobného roztoku zmiešalo so 44 μΐ lipidu (30 mM zásobného roztoku, pripraveného sonifikáciou vo vode) a vzorka sa doplnila do 3 ml vodou. Pred použitím alebo testovaním vzorky sa uskutočnila doporučená päťminútová inkubácia (ktorá nie je nevyhnutne nutná).
G-CSF je možné takisto zlúčiť s hydrátovaným lipidom pred mikrofluidizáciou. Následná mikrofluidizácia zmesou vedie k zabudovaniu G-CSF do lipidovcj membrány.
Analýza G-CSF;fosfolipidových komplexov
1. Tryptofánové emisné spektrá
V rhG-CSF sú dva tryptofánové zvyšky, ktoré sú pomerne citlivé na miestne okolité podmienky. Preto sa ukutočnila analýza, ktorá mala stanoviť rhG-CSF tryptofánovú fluorescenciu v prípade, kedy je rhG-CSF v kontakte s lipozómami. Modrý posun vo fluorescenčnom emisnom maxime dáva tušiť, že tryptofány sa nachádzajú v hydrofóbnejšom prostredí a rhG-CSF je teda zapuzdrený v lipidových membránach. Skvelým prehľadom tryptofánovej fluorescenčnej analýzy je Principles of Fluorescencie Microscopy, J. Lakowicz, kapitola 11 (Plénum Press, New York, 1983).
Tryptofánová fluorescencia G-CSF: lipidových komplexov (ktoré boli opísané) sa určovala excitáciou vzoriek pri 280 nm a súčasným skenovaním emisie od 285 nm do 420 nm v 1 nm prírastkoch, uskutočňovaným rýchlosťou Inm/s. Objem vzoriek bol 3 ml a konečná koncentrácia
G-CSF pre všetky vzorky bola 0,2 mg/ml. Pomery lipid : : G-CSF sa menili. Všetky fluorescenčné merania sa uskutočňovali na fluorometri PTI Alphascan fluorometer (South Brunswick, NJ). Všetky merania sa uskutočňovali pri 25 °C a táto teplota sa udržiavala pomocou kyvetového držiaka s vodným plášťom, spojeným s cirkulujúcim vodným kúpeľom. Získané emisné spektrá sa analyzovali pomocou softvéru, ktorý poskytla spoločnosť PTI.
Fluorescenčné spektrum rhG-CSF v prítomnosti a pri absencii malých unilamelámych vehikúl tvorených DOPG je znázornené na obr. 1. rhG-CSF mal emisné maximum pri 334 nm pri absencii DOPG vehikúl. V prítomnosti DOPG a pri lipid: proteínovom pomere 100 : 1, mala rhG-CSF tryptofánová fluorescencia modrý posun vo fluorescenčnom emisnom maxime na 327 nm a prudký nárast fluorescenčnej intenzity. Z nízkej vlnovej dĺžky fluorescenčnej emisie v prítomnosti DOPG vyplýva, že tryptofány sú v prostredí, ktoré je hydrofóbnejšie ako prostredia prirodzeného proteínu. Ako ukazuje obr. 2, fluorescenčný posun je závislý od molárneho pomeru DOPG : G-CSF a membránová inzercia je detegovateľná po dosiahnutí DOPG : G-CSF pomeru 10 : 1.
2. Jodidové zmierňovanie fluorescencie
Jodid je účinným kolíznym činidlom, zmierňujúcim tryptofánovú fluorescenciu, ktoré však nemôže prenikať lipidovými membránami, takže účinné zmiernenie tryptofánovej fluorescencie jodidom indikuje len zvyšky vystavené objemnému vodného rozpúšťadlu a nie proteínové tryptofány, ktoré sú maskované pred vodným rozpúšťadlom a tak chránené pre jodidovým zmiernením. Pri týchto experimentoch sa použila G-CSF a DOPG-G-CSF kompozícia (lipid : proteínový pomer 100 : 1). Po začiatočnom odčítaní (Fo) sa fluorescenčná intenzita merala po pridaní zvyšujúcich sa množstiev jodidu draselného (ΚΙ) (5M zásobný roztok). Tak vzorka, ako aj KI roztoky sa pripravili tak, aby obsahovali lmM Na2SO3 (konečná koncentrácia) spôsobom, ktorý opísal Lee a kol., Biochem. Biophys. Acta, 984: 174 - 182 (1989) a Le Doan a kol., Biochem. Biophys. Acta, 858: 1 - 5 (1986). Pridanie Na2SO3 bráni tvorbe I2, ktorý' sa môže rozdeliť do nepolámych úsekov proteínov a membrán. Získané dáta sa analyzovali pomocou Stern -
- Volmerovej rovnice (F/F = 1 + KKI[KI]), v ktorej Fo a F znamenajú fluorescenčnú intenzitu vzorky pri absencii, resp. v prítomnosti, KI, pri koncentrácii [ΚΙ], ΚΏ znamená Stern - Volmerovu tlmiacu konštantu pre KI tlmiaci G-CSF tryptofánové zvyšky; Lehrer, S. Biochemistry 10: 3254 -
- 3263 (1979).
Získané dáta sú vynesené v Stern - Volmerových grafoch zobrazených na obr. 3. V neprítomnosti DOPG vehikúl KI účinne tlmí rhG-CSF fluorescenciu. V prítomnosti DOPG majú dáta, vynesené v Stern - Volmerovom grafe, lineárny priebeh, čo naznačuje, že jodid má zlý prístup k obidvom tryptofánom. Získané dáta ukazujú, že tryptofánový zvyšok, ktorý je v neprítomnosti DOPG dostupný pre jodid, sa stáva v prítomnosti DOPG pre jodid nedostupným. Časť rhG-CSF, obsahujúca tento tryptofán, musí byť teda zapuzdrená v DOPG dvojvrstve.
3. Meranie energetického prenosu
Ako už bolo uvedené, medzi tryptofánovými donormi a lipidovými rozpustnými fluorescenčnými akceptormi, napríklad kyselinou pyréndekánovou, môže dochádzať k prenosu energie, pretože excitačné spektrum tejto sondy silne prekrýva emisné spektrum tryptofánu. Friere a kol., Bio chemistry 22: 1675 - 1680 (1983). Pri vniknutí proteínu do lipidových membrán spôsobí prenos energie z tryptofánu na pyrén stlmenie tryptofánovej fluorescencie. Pri tomto pokuse sa tryptofánová emisná intenzita rôznych lipid : G-CSF komplexov zaznamená pred (Fo) a po (F) prianí rôznych množstiev kyseliny pyréndekánovej (30 pg/ml) zásobného roztoku v tetrahydrofuráne). Vzorky sa počas pridávania kyseliny pyrendekánovej kontinuálne miešali, čím sa podporilo miešanie medzi kyselinou pyréndekánovou a vzorkou. Medzi pomerom F/Fo a množstvom energie, predchádzajúcim medzi G-CSF tryptofánmi a hydrofúbnym energetickým akceptorom, ktorým je kyselina pyréndekánová, je určitá úmera.
Obr. 4 znázorňuje profil útlmu pre rhG-CSF v prítomnosti DOPG (lipid :proteínový pomer 100 : 1) ako funkciu pridanej pyréndekánovej kyseliny. K útlmu dochádza už pri veľmi nízkych koncentráciách pyréndekánovej kyseliny (< 1 mol. %), takže vplyv fluorescenčnej sondy na štruktúru a chovanie membrány je minimálny. Vzhľadom nato, že sa dá očakávať, že pyréndekánová kyselina sa rýchlo rozdelí do lipidových dvojvrstiev, zo získaných dát vyplýva, že rhG-CSF je v DOPG membránach zapuzdrený dostatočne hlboko, aby umožnil účinný presun energie z tryptofánu na pyrénový akceptor. Energetický presun sa potvrdil analyzovaním excitačného spektra DOPG vehikúl, značených pyréndekánovou kyselinou v prítomnosti a pri absencii rhG-CSF.
Opísaná analýza ukázala, že rhG-CSF môže tesne reagovať s nenasýteným fosfolipidom, akým je napríklad DOPG. V prítomnosti DOPG vehikúl je rhG-CSF tryptofán chránený pred vodou rozpustným činidlom tlmiacim fluorescenciu, ale je prístupný na tlmenie spôsobené energetickým prenosom na hydrofóbnu fluorescenčnú sondu. Z výsledkov obidvoch analýz vyplýva, že rhG-CSF môže prenikať do membrán tvorených DOPG. Membránová inzercia je detegovateľná po dosiahnutí pomeru 10 : 1 (lipid : G-CSF) a toto číslo môže reprezentovať množstvo lipidov, ktoré obklopujú inzert proteínu.
Príklad 2
V tomto príklade sa schopnosť rhG-CSF vzájomne reagovať s ďalšími fosfolipidmi určuje na základe porovnania opísanej F/Fo intenzity a emisných maxím. V každom prípade bol molámy pomer lipid : rhG-CSF 100 : 1.
Obr. 5 znázorňuje F/Fo údaje pre rhG-CSF v neprítomnosti a v prítomnosti rôznych lipidov. Obr. 6 znázorňuje emisné maximá pre rovnaké kompozície. Z údajov na obr. 5 a obr. 6 vyplýva, že okrem DOPG môže rhG-CSF inzertovať do DMPG, DPPG a menej účinne do fosfatidyletanolamínov (PE) a fosfatidylserínov (PS). Okrem toho sa zistilo, že NG-DOPE (DOPE vzorka, v ktorej bola PE koncová skupina zápomeišia) poskytol zlepšenú inzerciu rhG-CSF ako DOPE.
DOPC, DMPC a DPPC sú neutrálne lipidy a tieto vehikulá majú malý alebo vôbec žiadny vplyv na emisné maximá a fluorescenčnú intenzitu rhG-CSF, z čoho vyplýva, že tu nedochádza k žiadnej vzájomnej reakcii medzi týmito fosfolipidmi (pozri obr. 5 a 6 a obr. 7, krivka 2).
Z uvedených údajov vyplýva, že proteín, ktorý je schopný predchádzať do roztaveného globulámeho stavu, môže inzertovať v rôznych lipidových vehikulách. Ale táto reakcia medzi rhG-CSF a lipidom prebehne len v prípade, že sa použije len záporne nabité lipidové vehikulum. Pokiaľ ide o tieto záporne nabité vehikulá, zdá sa, že vehikulá so zápomejšim nábojom poskytujú pevnejšie rhG-CSF : lipidové interakcie.
Príklad 3
V tomto príklade sa určoval vplyv DOPG : rhG-CSF interakcie na stabilitu proteínu. Meranie cirkulárneho dichroizmu sa uskutočňovalo na prístroji Jasco J-720, vybavenom Peltierovým typom kyvetového držiaku vybaveného termostatom a magnetickým miešadlom. Cirkulámy dichroizmus sa meral pri 222 nm pri použití konečnej rhG-CSF koncentrácie 80 gg/ml a pri pH 6,0. Meranie diferenčnej rastrovacej kalorimertrie sa uskutočňovalo na kalorimetri Microcal MC-2. Vzorky rhG-CSF (1 mg/ml vo vode) alebo DOPG : rhG-CSF (45 : 1 mol/mol vo vode) sa skenovali pri rýchlosti 90 °C/hod. Dáta boli uložené a analyzované pomocou softvéru Microcal.
Tepelne indukované zmeny v tx-helicite G-CSF je možné sledovať meraním cirkulárneho dichroizmu (222 nm), v závislosti od zvyšujúcej sa teploty. Tepelne indukované rozbalenie rhG-CSF pri pH 6,0 je znázornené na obr. 8. Krivka má pri teplotách približne 60 až 70 °C ostrý' prechod, ktorý vedie k strate α-halicity. Po tomto prechode sa rhG-CSF nevratne vyzráža z roztoku. Teplotné rozmedzie rozbalenia sa v podstate zhoduje s tavnou teplotou rhG-CSF pri pH 7,0, stanovenou diferenčnou rastrovacou kalorimetriou, ako ukazuje obr. 9.
DOPG : rhG-CSF vzorky naopak majú v závislosti od rastúcej teploty postupnú stratu α-helicity a na rozdiel od samotného rhG-CSF nie je očividné tepelne indukované rozbalenie DOPG : rhg-CSF (pozri obr. 8). Tento záver takisto potvrdzuje absencia tavného prechodu, ako ukázali výsledky diferenčnej rastrovacej kalorimetrie (obr. 9). Za povšimnutie stojí, že DOPG : rhG-CSF vzorky môžu po ohriatí na 95 °C opäť získať α-helicitu a je možné ich opakovane cyklizovať medzi 95 °C a 10 °C, pričom po ochladení sa v plnom rozsahu obnoví ich helicita (pozri obr. 10). Samotný rhG-CSF sa pri týchto podmienkach nevratne rozbalí a vyzráža z roztoku.
Takisto sa zisťoval vplyv DMPG a DPPG na G-CSF cirkulámy dichroizmus. Použil sa lipid : rhG-CSF pomer 150: 1 a rovnako ako v prípade DOPG, DMPG a DPPG stabilizovali sekundárnu štruktúru rhG-C SF (obr. 11 až 13).
Z uvedených údajov vyplýva, že vzájomná reakcia medzi rhG-CSF a DOPG, DMPG a DPPG zvyšuje stabilitu proteínu pri podmienkach, pri ktorých je samotný rhG-CSF nestabilný. Táto interakcia priamo stabillizuje sekundárnu a terciámu štruktúru rhG-CSF.
Príklad 4
V tomto príklade sa hodnotil vplyv rhG-CSF : DOPG interakcie na biologickú aktivitu rhG-CSF. In vitro aktivita rhG-CSF sa zisťovala pomocou G-CSF dependentného vyčerpania [H3j-tymidínu bunkami myšacej kostnej drene spôsobom, ktorý opísal Zsebo a kol., Immunobiology 172: 175 - 184 (1986). Každý test sa uskutočňoval trikrát. Pri stanovovaní in vivo aktivity sa určoval počet bielych krviniek (WBC) pri chrčkoch, ktorým sa subkutánne injektovalo 100 pg/kg rhG-CSF.
1. In vitro aktivita
A. Výsledné hodnoty pre špecifickú aktivitu rhG-CSF v neprítomnosti a v prítomnosti DOPG pre rhG-CSF a pre tepelne spracované DOPG : rhG-CSF vzorky sú zahrnuté v uvedenej tabuľke 1.
Tabuľka 1
Vzorka Špecifická aktlulta (U/sg/protein)
rhG-CSF Q. 66 * (X 09
rhG-CSF C ohriaty)- nedetekovateZM
DOPfi.rhG-CSF“ 0.61 ♦ 0.11
□OPGirhG CSF1· (ohriaty)- 0,52 ± o. oe
a Vzorka sa pred realizáciou testu inkubovala 10 minút pri 85 °C vo vodnom kúpeli b Pomer DOPG : rhG-CSF (mol/mol)
Ako ukazuje tabuľka 1, inzercia do DOPG dvoj vrstiev nemá nežiaduci vplyv na biologickú aktivitu rhG-CSF. Po desaťminútovej inkubácii pri 85 °C nebola pre vzorky rhG-CSF zistená špecifická biologická aktivita a došlo k vyzrážaniu proteínu. Vzorka DOPG : rhG-CSF si po podobnom ošetrení zachovala približne 85 % pôvodnej aktivity a po ochladení sa opäť úplne obnovila jeho sekundárna štruktúra.
B. Takisto sa študovala schopnosť rôznych lipidov stabilizovať rhG-CSF počas vymrazovania. Vzorky rhG-CSF v kombinácii s rôznymi lipidmi sa vymrazovali a pre takto lyofilizované vzorky sa určovala biologická aktivita (ako je opísané). DOPG, DMPG a DPPG, ak sa zmiešali s rhG-CSF, umožnili po vymrazení zachovať približne 100 % rhG-CSF biologickej aktivity (obr. 14). Samotný rhG-CSF lyofilizačný proces neprežil.
2. In vivo aktivita
Určila sa aktivita (počet WBC) rhG-CSF v neprítomnosti a prítomnosti lipidu. Aktivita sa merala po aplikácii subkutánej injekcie (rhG-CSF dávka 100 pg/kg) 0. deň. Analyzovalo sa päť rôznych lipidových: rhG-CSF komplexov a pre každý lipid: rhG-CSF komplex bolo zistené zachovanie in vivo aktivity (obr. 15 a 16).
Z uvedených štúdií vyplýva, že inzercia do záporne nabitých lipidových dvojvrstiev nemá nežiaduci vplyv na biologickú aktivitu rhG-CSF. Navyše sa zdá, že lipid chráni rhG-CSF počas lyofilizačného procesu.
Príklad 5
V tomto príklade sa zisťovala schopnosť chemicky modifikovaného G-CSF (pegylátovaného G-CSF (PEG-G-CSF)) a G-CSF, získaného ako produkt expresie eukaryotických hostiteľských buniek (CHO-G-CSF), vzájomne reagovať so záporne nabitými lipidovými vehikulami. V prípade CHO-G-CSF sa na stanovenie tejto schopnosti použilo porovnanie F/Fo intenzity a emisných maxím (ktoré bolo opísané v uvedenom príklade 1). V prípade PEG-G-CSF sa použila analýza cirkulárneho dichroizmu. V obidvoch prípadoch sa použil molámy lipid: proteínový pomer 100 : 1.
Použitý’ CHO-G-CSF sa pripravil pomocou rekombinantnej DNA technológie, pri ktorej sa do buniek vaječníka čínskeho chrčka (CHO) transfekovala DNA sekvencia kódujúca humánny G-CSF, pozri patent US 4 810 643 (Souza). CHO-G-CSF sa pripravil ako 0,6 mg/ml roztok v PBS, pH 7,0. Ukázalo sa, že CHO-G-CSF reaguje s DOPG podobným spôsobom ako rhG-CSF, pričom každá vzorka mala v prítomnosti DOPG zvýšenú fluorescenčnú intenzitu a takisto modrý posun v emisnom maxime (obr. 17 a 18). Takže DOPG interakcia nie je dôsledkom určitej vlastnosti rekombinantnej formy G-CSF.
SK 283596 Β6
Použitým PEG-G-CSF pri týchto experimentoch bol tritetrapegylátovaný, od E. coli odvodený, G-CS (na úpravu sa použil PEG 600). DMPG : PEG-G-CSF (17 : 1 mol/mol) vzorky sa pripravili opísanými spôsobmi. Ukázalo sa, že DMPG : PEG-G-CSF vzorky po hriatí v celom rozsahu obnovia svoju sekundárnu štruktúru (obr. 19). Napriek prítomnosti PEG molekúl bol derivatizovaný proteín schopný vzájomne reagovať s lipidom rovnakým spôsobom ako v prípade prirodzeného proteínu.
Opísané dáta ukazujú, že stabilizačné účinky súvisiace s G-CSF interakciou so záporne nabitým lipidovým vehikulom nie sú výsadou len rhG-CSF získaného expresiou prokaryotických hostiteľských buniek. Chemicky modifikovaný proteín, ktorý je schopný prechádzať do MGS a kontaktovať sa s lipozómovým vehikulom, tu PEG-G-CSF : DMPG, takisto má stabilizačné účinky.
Príklad 6
Tento príklad sa zaoberal štúdiami účinkov DMPG na GM-CSF. GM-CSF bol rekombinantný humánny GM-CSF, opísaný v patente US 5 047 504 (Boone) a pripravený ako 1 mg/ml roztok vo fosfátovom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS), pH 7,0. Použil sa pomer lipid : GM-CSF 17 ; 1 a tepelná stabilita sa merala pomocou opísanej analýzy cirkulámeho dichroizmu. DMPG a DPPG môžu poskytovať GM-CSF lepšiu tepelnú stabilitu, to znamená obnoviť po ohriati sekundárnu štruktúru (obr. 20a a 20b).
Z uvedeného vyplýva, že DMPG a DPPG predstavujú ďalšie príklady proteínov, ktoré sú schopné prechádzať do roztaveného globulárneho stavu a vzájomne reagovať so záporne nabitým lipidovým vehikulom, s cieľom poskytovať proteínu lepšiu tepelnú stabilitu.
Príklad 7
V tomto príklade sa na hodnotenie možnosti zvyšovať terapeutickú odpoveď na G-CSF po enterálnom podaní použil komplex DOPG : PEG-G-CSF. Na ciele tohto experimentu sa DOPG pripravil spôsobom uvedeným v príklade 1 a PEG-G-CSF spôsobom opísaným v príklade 5. 100 pmol lipidu (797 μΙ) sa vysušilo pri vákuu a k tejto vzorke sa potom pridal 1 ml milli Q vody, čím sa pripravil 100 mM roztok lipidu. Tento roztok sa 5 minút soniflkoval v sonifikačnom vodnom kúpeli (Model G 112SP1T od spoločnosti Lab. Supply Inc., Hicksville, NY) alebo dokiaľ sa lipidový roztok nevyčeril. Do 90 nmol prirodzeného rhG-CSF alebo PEG-G-CSF v 1 mM HC1 sa pridalo 9 pmol DOPG roztoku (90 μΐ). Roztok sa zvíril a 1 mM HC1 sa doplnil do konečného objemu 2 ml. Na ciele intraduodenálneho podania do tela potkana sa materiál umiestnil do osmotického čerpadla, ktoré sa implantovalo do tela zvieraťa. Testovaný materiál sa uvoľňoval počas 24 hodín.
Výsledky celkovej WBC analýzy uskutočňovanej pre zvieratá, ktorým bol podaný tak rhG-CSF ako aj PEG-G-CSF s lipidom a bez lipidu, sú znázornené na obr. 21. Obr. 21a ukazuje, že infúzia prirodzeného G-CSF nestimuluje WBC odpoveď v porovnaní s kontrolným vehikulom. Pridanie má malý vplyv na terapeutickú odpoveď živočíchov na rhG-CSF.
Odpoveď potkanov na pegylátovaný G-CSF je znázornená na obr. 21b je zrejmé, že samotný PEG-G-CSF stimuloval WBC odpoveď. Zvýšenie hladiny WBC trvalo 48 hodín a potom došlo opäť k postupnému zníženiu na normálnu hladinu. PEG-G-CSF formulovaný s DOPG takisto stimuluje WBC odpoveď a táto odpoveď je takmer dvakrát vyššia ako v prípade samotného PEG-G-CSF. Tieto výsled ky potvrdili hladiny PEG-G-CSF. Namerané v sére po infúzii (obr. 22).
Z uvedených dát vyplýva, že zahrnutie aniónového lipidu, napríklad DOPG, do orálnej formulácie PEG-G-CSF, ako sa zdá, zvyšuje terapeutickú odpoveď na derivatizovaný proteín. Mechanizmus, ktorým sa dosahuje toto zvýšenie odpovede, nie je doteraz známy.
Príklad 8
Tento príklad sa zaoberal štúdiami účinkov DMPG na MGDF. MGDF použitým pri týchto štúdiách bol rekombinantný humánny od E. coli odvodený MGDF 1-163, pripravený ako 1,0 mg/ml roztok v 10 mM octane sodnom, 5 % sorbitolu pri pH 5,0. Príprava DMPG : MGDF komplexov je opísaná v príklade 1.
Analýza DMPG: MGDF komplexov
1. Tryptofánové emisné spektrum
Na monitorovanie interakcie MGDF s DMPG vehikulami sa použil tryptofánový zvyšok v polohe 51 sekvencie MGDF. Tryptofánová fluorescencia DMPG : MGDF komplexov sa určovala spôsobom opísaným v príklade 1, pri koncentrácii MGDF 0,1 mg/ml. Fluorescenčné spektrum MGDF v prítomnosti a v neprítomnosti malých unilamelárnych vehikúl tvorených DMPG znázorňuje obr. 22. MGDF má pri neprítomnosti DMPG vehikula emisné maximum 336 nm. V prítomnosti DMPG pri lipid : proteínovom pomere 100 :1 má MGDF tryptofánová fluorescencia modrý posun vo fluorescenčnom emisnom maxime na 328 nm. Z nízkej vlnovej dĺžky fluorescenčnej emisie v prítomnosti DMPG vyplýva, že sa tryptofány nachádzajú v hydrofóbnejšom prostredí, ako je prostredie prirodzeného proteínu a ako ukazuje obr. 23, fluorescenčné posuny závisia od molámeho pomeru DMPG : MGDF, pričom membránová inzercia je detegovateľná po dosiahnutí molámeho DMPG : MGDF pomeru 8-30 : 1. Fluorescenčná zmena dosahuje maximum pri molámych pomeroch > 100 : 1 a MGDF má podstatne vyššiu afinitu pre DMPG, hneď ako pH hodnota klesne zo 7,0 na 5,0. Z toho vyplýva, že na zosilnenie alebo zoslabenie interakcie je možné použiť titráciu určitých aminokyselín (napríklad histidínu).
2. Jodidové tlmenie fluorescencie
V týchto experimentoch sa na testovanie jodidového tlmenia, uskutočňovaného spôsobom opísaným v príklade 1, použila MGDF a DPMG: MGDF kompozícia (100 : 1 DMPG : MGDF). Stem - Volmerove grafy sú znázornené na obr. 24. V neprítomnosti DPMG vehikúl KI podstatným spôsobom stlmilo MGDF fluorescenciu. V prítomnosti DMPG bol tryptofán pre jód neprístupný, čo naznačuje, že časť MGDF, ktorá obsahuje tento tryptofán, musí byť zapuzdrená v DMPG dvojvrstve. Uvedená analýza ukazuje, že rovnako ako v prípade G-CSF a GM-CSF môže MGDF úzko reagovať s nenasýteným fosfolipidom, akým je napríklad DMPG. V neprítomnosti DMPG vehikúl je MGDF tryptofán chránený pred vodou rozpustným činidlom, tlmiacim fluorescenciu. Zo získaných výsledkov vyplýva, že MGDF môže inzertovať do membrán tvorených DMPG. Membránová inzercia je detegovaná po dosiahnutí DMPG : MGDF pomeru 8:1.
Príklad 9
V tomto príklade sa zisťoval vplyv DMPG : MGDF interakcie na stabilitu proteínu. Hodnotila sa tepelná stabilita MGDF (±DMPG), stabilita MGDF (+DMPG) v prítomnosti močoviny a stabilita MGDF (+DMPG) pri skladovaní. V každej štúdii a použil molámy pomer DMPG : : MGDF 100: 1.
1. Tepelná stabilita
Cirkulámy dichroizmus (CD pri 222 nm) samotného MGDF alebo zavedeného do DMPG vehikulá sa monitoroval ako funkcia tepelnej cyklizácie medzi 95 °C a 10 °C, opísanej v príklade 2 a znázornenej na obr. 10. Percentá zvyšného CD označujú množstvo CD detegovaného (pri 10 °C) po každom cykle (jeden cyklus je 10 °C -> 95 °C -> -> 10 °C) v porovnaní s CD neohriatej vzorky zodpovedajúcej kompozície. Zatiaľ o MGDF stráca po troch ohrievacích cykloch viac ako 70 % svojej α-helicity, DMPG : : MGDF si pri rovnakých podmienkach zachováva svoju pôvodnú α-helicitu v celom rozsahu (pozri obr. 25).
2. Stabilita v prítomnosti močoviny
Močovina je chaotropným reakčným činidlom, ktoré môže rozbaliť a denaturovať proteíny. Na monitorovanie rovnovážnej denaturácie MGDF (±DMPG) sa použila fluorescencia, to znamená miera terciámej štruktúry a cirkulačný dichroizmus, to znamená miera sekundárnej štruktúry. Ako ukazuje obrázok 26 so stratou proteínovej terciámej štruktúry sú tryptofánové zvyšky odkrytej šie pre pôsobenie vodnej fázy a emisná vlnová dĺžka MGDF je posunutá k dlhším vlnovým dĺžkam. So stratou sekundárnej štruktúr)' sa stredná zvyšková elipticita (MRE) stáva menej zápornou. Pri neprítomnosti DMPG dochádza k 50 % strate terciárnej štruktúry približne pri 3M močovine. Zatiaľ čo v prítomnosti DMPG je na dosiahnutie 50 % straty terciámej štruktúry potrebná 8M močovina. Podobne 50 % strata MGDF MRE vyžaduje pri neprítomnosti DMPG 7M močovinu, zatiaľ čo v prítomnosti DMPG je potrebná na dosiahnutie 50 % straty 9M močovina.
3. Stabilita pri skladovaní
E. coli MGDF 1-163 (±DMPG) sa skladoval pri podmienkach zahrnutých v uvedenej tabuľke 2 a testoval sa veľkostne vylučujúcou chromatografiou (SEC) na stĺpci Toso-Haas G3000SWXL s mobilnou fázou, tvorenou 100 mM fosfátovým pufrom, 10 % etanolom, 0,2 % Tweenom-20, pH 6,9. Vzorky sa nariedili etanolom a Tweenom-20 na rovnakú koncentráciu ako v prípade mobilnej fázy a 10 - 20 pg vzorky a injektovali sa. Teplota stĺpca sa udržiavala na 40 °C. Všetok agregovaný MGDF, ktorý sa vytvoril, eluoval rýchlejšie ako neagregovaný proteín a jeho množstvo sa určilo tak, že sa zmerala plocha pod krivkou agregátovaného piku a monomémeho piku. Tento údaj je uvedený ako percento celkového MGDF v agregátovom piku.
Tabuľka 2
Vzorka Teplota X agregácle namerané SEC
5 týždňov 11 týždňov
FIGDF -60 U C. 2
4 eC 0. 4 0,6
37 C 18 39.2
DP1PG iMGDF -80 °C 0 0. 14
4 eC 0 0
37 eC 1. 9 2. 5
Ako ukazuje tabuľka 2, DMPG prudko znižuje tvorbu agregátov v dôsledku skladovania. DMPG je teda možné použiť na predĺženie času skladovateľnosti MGDF.
Z uvedených dát vyplýva, že interakcia MGDF s DPMG vehikulami zvyšuje stabilitu proteínu pri podmienkach, pri ktorých je samotný MGDF nestabilný. Interakcia priamo stabilizuje sekundárne a terciárne štruktúry MGDF v prítomnosti denaturačných činidiel, akým je napríklad močovina a podstatne predlžuje skladovateľnosť MGDF pri rôznych teplotách.
Príklad 10
V tomto príklade sa hodnotila schopnosť chemicky modifikovaného MGDF 1-163 (monopegylátovaného (20 kDa) MGDF 1-163 (PEG-MGDF)) vzájomne reagovať so záporne nabitými lipidovými proteínmi. V prípade PEG-MGDF sa táto schopnosť hodnotila na základe porovnania F/Fo intenzity a emisných maxím (ako j c to opísané v uvedených príkladoch 1 a 8). V každom prípade bol použitý molámym lipid : proteínovým pomerom pomer 100 : 1.
PEG-MGDF, použitím v týchto experimentoch, bol od E. coli odvodený MGDF 1-163, monopegylátovaný (20 kDa) redukčnou alkyláciou pomocou monometoxypolyetylénglykolaldehydu (MePEG) (priemerná molekulová hmotnosť 20 kDa). Homogenita PEG-MGDF konjugátov sa stanovila gélovou elektroforézou v nátrium dodecylsulfátpolyakrylamidovom géli pri použití 4 až 20 % prefabrikovaných gradienčných gélov (NOVEX). Získal sa jeden hlavný pás, zodpovedajúci polohe 46,9 kDa proteínu.
DMPG : PEG-MGDF (100 : 1 mol/mol) vzorky sa pripravili opísaným spôsobom. Zistilo sa, že DMPG : PEG-MGDF vzorky po zahriatí úplne obnovujú svoju sekundárnu štruktúru (obr. 27). Napriek prítomnosti PEG molekúl je derivatizovaný proteín schopný vzájomne reagovať s lipidom rovnakým spôsobom ako prirodzený proteín.
Uvedené dáta ukazujú, že posuny emisného maxima, dávané do súvislosti s MGDF interakciou so záporne nabitým lipidovým vehikulom, nie sú len výsadou MGDF získaného expresiou prokaiyotických hostiteľských buniek. Ako je možné demonštrovať na modifikovanom rhG-CSF DMPG : PEG-MGDF takisto mal emisné posuny, pričom z týchto výsledkov vyplýva, že chemicky modifikovaný MGDF môže inzertovať do membrán tvorených DMPG.
Príklad 11
V tomto príklade sa hodnotil vplyv DMPG : PEG-MGDF interakcie na problematickú adsorpciu MGDF na sklenené nádoby. 11 pg/ml [l25I]-PEG-MGDF sa skombinoval s rôznymi koncentráciami neoznačeného PEG-MGDF za vzniku konečných koncentrácií PEG-MGDF, ktoré sú naznačené na obr. 28. Tam, kde je to naznačené, bol DPMG súčasťou nariedenia (takisto pozri obr. 27). 1 ml prípravkov sa umiestnil do 3 m3 sklenených fľaštičiek (Kimble). Percento izolovaného PEG-MGDF sa zistilo sčítaním rádioaktívne značeného MGDF, izolovaného zo sklenených fľaštičiek po osemnásťhodinovej inkubácii pri izbovej teplote. Ako ukazuje obr. 28, pri nižších koncentráciách proteínu PEG-MGDF viditeľne adsorbuje na sklenené nádoby a adsorpcia je veľmi vysoká v rozmedzí 0,1 - 50 pg/ml. DPMG : PEG-MGDF vzorky sa v tomto rozmedzí, 0,1 - 50 pg/ml PEG-MGDF, na sklo väčšinou takmer neadsorbujú.
Príklad 12
V tomto príklade sa hodnotil vplyv DMPG : MGDF 1-163 a DMPG : PEG-MGDF 1-163 interakcie na biologickú aktivitu MGDF 1-163 a PEG-MGDF 1-163. MGDF 1-163 bol od E. coli odvodený MGDF 1-163 a lipid : proteínový pomer bol 100: 1. Určil sa počet krvných doštičiek pri myšiach, ošetrených 100 pg/kg a 300 pg/kg MGDF, PEG-MGDF, DMPG: MGDF alebo DMPG : PEG-MGDF, výsledky sú znázornené na obrázku 31. Naznačená koncentrácia každej formy sa raz denne podala subkutánne počas ôsmich dní normálnym samičkám Balb/c myší. Testované odbery sa získali z laterálneho rezu v chvostovej žile, 24 hodín po poslednej injekcii. Na analýzu krviniek sa použil analyzér Sysmex electronic blood celí (Baxtcr Diagnostics, Inc. Irvine, CA). Uvedené dáta predstavujú priemer výsledkov, získaný zo štyroch zvierat +/- štandardná chyba. Ďalšie parametre krvi, napríklad počet bielych krviniek alebo počet červených krviniek, neboli týmto ošetrením ovplyvnené (dáta nie sú uvedené). Výsledky naznačujú, že pegylácia od E. coli odvodeného MGDF 1-163 zvyšuje in vivo aktivitu molekuly. Dôležitejšie je, že uvedené štúdie ukazujú, že inzercia do záporne nabitých lipidových dvojvrsticv nemá nežiadúci vplyv na biologickú aktivitu rôznych foriem MGDF.
Sekvenčný protokol (1) údaje k SEQ ID NO:1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 1324 bázických párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDna (ix) ZNAKY:
(A) NÁZOV/KĽÚČ: CDS (B) POZÍCIA: 99..621 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:1:
CAGGGAQCCX CQCCAGCCAA OÄCACCCCGG CCXCAATOGA GCTOXCTGXi. TKSCTCCTCS 60
TGGTCATGCľ TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCO GCT CGT CCT 113
Sex Pro Ala Pro Pro
GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT 1 CGT GAC TCC CAT 5 GTC 161
Ala Cye A«p Leu Are Val Leu Ser Lys Leu Leu AXff Aep ser Kle val
10 15 20
CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TCC CCA CAG CTT CAC CCT TTQ CCT ACA 209
Leu Hil ser Arg Leu Ser Gin cy· Pro O1U Val KU Pro Leu Pro Thr
25 30 35
CCT GTC CTC CTC CCT GCT GTG GAC TTT AGC TIG GGA GAA TGG AAA ACC 257
Pro Val L«u Leu Pro Al* Val Aep Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr
40 45 50
CAG ATC GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT 30S
Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Aep íle Leu Gly Ala Val Thr Leu
55 60 «5
CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC act TGC 353
Leu Lau Glu Gly Val Met Al* Al* Axg Gly Gin L*u Gly Pro Thr Cy*
70 75 80 85
CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GCA CAG GTC CGT CTC CTC CTT 401
Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu
90 95 10«
GGG Gly GCC CTG CAG Ala Leu Oln 105 AGC Ser CTC CIT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AQ3 44»
Leu Leu Gly Thr 110 Gin Leu Pro Pro Gin 115 Gly Arg
ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC 497
Thr Thr Al* KÍ* Ly· Aep Pro Aa n Al* Tie Phe Leu Ser Phe Gin Kle
120 125 130
CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC 545
Leu L*u Arg Gly Ly. Val Arg Phe Leu Mak Leu Val Gly Gly Ser Thr
135 140 145
CTC TGC GTC ÄGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AQA AGC 593
Leu Cy« Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Al* Val Pro Ser Arg Thr
150 155 160 165
TCT CTA GTC CTC ACA CTC AAC CAG CTC C CAAACAGGAC TTCTCGATTG 641
Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu
TT3GJU3ACAA ACTTCACTGC CTCAOCCAGÄ ACTACTOGCT CTGGGCTTCT GAM3T90CAG 701 CAOGGATTCA GAGCCJAGXT TCCTGGTCTC CTGÄACCAAA CCTCCACGTC CCTGSACCKX 7 íl ATCCCCGGAT ACCTCAACAG GATACACGAA CTCTTGAATC CAÄCTCGTGC ACTCTTTCCT 821
GGACCCTCAC SCAOOACCCT AGGAGCCCCG CXCATTTCCT CAQGAACATC AflkClCACGC 881 TCCCTGCCAC GCAACCTCCA GCCTGGATAT TCTCCTTCCC CAACCCATCC TCCTACTOGA 941 CMSTATAOGC TCTTCCCTCT TCCACCCACC TTGCCCACCC CTSTGGTCCA GCTCCACCCC 1001 CTGCTTCCTO ACCCTTCTGC TCCAACSCCC ACCCCTACCA GCCCTCTTCT AAACACATCC 1061 TACACCCACT CCCAQAATCT GTCTCAGGAA GCGWAGCTT CTCAGACACT GCOGACATCA 1121 GCATTGTCTC GTGTACAGCT CCCTTCCCTG CÄGGCCCCCC CTQMAOACA ACTCGACAAG 1181 ATTTCCTACT TTCTCCTOAA ACCCAAAGCC CTQVTUMO GGATACACAB eXCTQAAXAG 1241 GGAATCATTT TTCACTGTAC ATTATAAACC TTCACAAGCT ΛΤΣΤΓΠΤΑΛ GCTATCAGCA 1301 ATACTCATCA GAGCAQCTAG CTCTTTGGTC TATmCTGC A 13« (1) údaje k SEQ ID NO:2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 174 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENICE: SEQ ID NO:2:
Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cya A* p Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu
1 5 10 13
Arg Asp Ser Hla Val Leu Hls Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val
20 25 30
Mls Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu
35 40 45
Gly Glu Trp Ly» Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Aep íle Leu
50 55 60
Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin
¢5 70 75 BO
Leu Gly Pro Thr Cy« Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin
85 90 9S
Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu
100 105 110
Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Aap Pro Asn AU íle Phe
115 120 125
Leu Sar Phe Gin Ki* Leu Leu Arg Gly Ly. Val Arg Phe Leu Mat Leu
130 135 140
Val ciy Gly Ser Thr Leu Cy« Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala
145 150 155 160
Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu
165 170

Claims (42)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Lipozóm-cytokínová kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje cytokín zmiešaný s napred pripraveným intaktným fosfolipidovým lipozómovým vehikulom, ktoré je tvorené negatívne nabitými fosfolipidmi, v pomere lipozómu ku cytokínu aspoň 25 : 1 (mol/mol) tak, že tvorí lipozóm-cytokínový komplex, v ktorom je len časť cytokínu inzertovaná do lipidovej časti lipozómového vehikula, lipozóm-cytokínový komplex je priamo stabilizovaný proti rozbaleniu sekundárnej štruktúry cytokínu a kompozícia má zlepšenú skladovateľnosť.
  2. 2. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že má pH hodnotu 3,0 až 7,5.
  3. 3. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že lipozómové vehikulum je zvolené z množiny pozostávajúcej z dioleoylfosfatidylglycerolu (DOPG), dimyristoylfosfatidylglycerolu (DMPG), dipalmitoylfosfatidylglycerolu (DPPG), vaječného fosfatidylglycerolu, dioleoylfosfatidyletanolamínu (DOPE), vaječného fosfatidyletanolamínu, kyseliny dioleoylfosfatidovej (DOPA), kyseliny dimyristoylfosfatidovej (DMPA), kyseliny dipalmitoylfosfatidovej (DPPA), diole
    170 oylfosfatidylserínu (DOPS), dimyristoylfosfatidylserínu (DMPS), dipalmitoylfosfatidylserínu (DPPS), vaječného fosfatidylserínu, lyzofosfatidylglycerolu, lyzofosfatidyletanolamínu a lyzofosfatidylserínu.
  4. 4. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že cytokínom je hematopoietický faktor.
  5. 5. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že hematopoietický faktor sa zvolí z množiny pozostávajúcej z G-CSF, GM-CSF a MGDF.
  6. 6. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 5, vyznačujúca sa tým, že hematopoietickým faktorom je G-CSF.
  7. 7. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že G-CSF prírodný humánny G-CSF je získaný ako produkt expresie prokaryotickej alebo eukaryotickej hostiteľskej bunky.
  8. 8. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že G-CSF je chemicky modifikovaný G-CSF.
  9. 9. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 8, vyznačujúca sa tým, že chemicky modifikovaným G-CSF je pegylovaný G-CSF.
  10. 10. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 5, vyznačujúca sa tým, že hematopoietickým faktorom je MGDF.
  11. 11. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým, že MGDF je prirodzený humánny MGDF alebo je získaný ako produkt prokaryotickej alebo eukaryotickej hostiteľskej bunky.
  12. 12. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 11, vyznačujúca sa tým, že MGDF má aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu aminokyseliny 1 až 163 z obr. 29 (SEQ ID No: 1 a 2).
  13. 13. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 11, vyznačujúca sa tým, že MGDF má aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu aminokyseliny 1 až 332 z obr. 29 (SEQ ID No:l a 2).
  14. 14. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým, že MGDF je chemicky modifikovaný MGDF.
  15. 15. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 14, vyznačujúca sa tým, že chemicky modifikovaným MGDF je pegylovaný MGDF (PEG-MGDF).
  16. 16. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 15, vyznačujúca sa tým, že PEG-MGDF je pegylovaný polyetylénglykolom.
  17. 17. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 16, vyznačujúca sa tým, že PEG-MGDF je monopegylovaný MGDF (mPEG-MGDF).
  18. 18. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 17, vyznačujúca sa tým, že PEG skupina je naviazaná na N-koniec MGDF.
  19. 19. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje farmaceutický prijateľný nosič.
  20. 20. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že proteínom jc z E. coli odvodený rhG-CSF, lipozómovým vehikulom je DOPG, kompozícia má pomer DOPG : rhG-CSF 50 : 1 a pH hodnotu 4,5 a obsahuje 10 mM octan sodný.
  21. 21. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že proteínom je z E. coli odvodený MGDF obsahujúci aminokyselinové sekvencie 1 až 163 z obr. 29 (SEQ ID No:l a 2), lipozómovým vehikulom je DMPG, kompozícia má pomer
    DMPG:MGDF 100 : 1 a pH hodnotu 5,0 a obsahuje 10 mM octan sodný a 5 % sorbitol.
  22. 22. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že proteínom je monopegylovaný z E. coli odvodený MGDF (mPEG-MGDF), lipozómovým vehikulom je DMPG, kompozícia má pomer DMPG : mPEG-MGDF 100 : 1 a pH hodnotu 5,0 a obsahuje 10 mM octan sodný a 5 % sorbitol.
  23. 23. Lipozóm-cytokínová kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že proteínom z CHO odvodený MGDF obsahujúci aminokyseliny 1 až 332 z obr. 29 (SEQ ID No:l a 2), lipozómovým vehikulom je DMPG, kompozícia má pomer DMPG : MGDF 100 : 1 a pH hodnotu 5,0 a obsahuje 10 mM octan sodný a 5 % sorbitol.
  24. 24. Spôsob prípravy lipozóm-cytokinovej kompozície podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa zmiešanie cytokínu s napred pripraveným intaktným fosfolipidovým lipozómovým vehikulom, pričom lipozómové vehikulum je záporne nabité, kompozícia má pomer lipozómu k cytokínu aspoň 25 : 1 (mol : mol), len časť cytokínu je inzertovaná do lipidovej časti lipozómového vehikuka, lipozómcytokínový komplex je priamo stabilizovaný proti rozbaleniu sekundárnej štruktúry cytokínu a kompozícia má zlepšenú skladovateľnosť; a získanie lipozóm-cytokínovej kompozície.
  25. 25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa t ý m , že kompozícia má pH hodnotu 3,0 až 7,5.
  26. 26. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa t ý m , že sa lipozómové vehikulum pripraví z lipidu, ktorý sa zvolí z množiny pozostávajúcej z dioleoylfosfatidylglycerolu (DOPG), dimyristoylfosfatidylglycerolu (DMPG), dipalmitoylfosfatidylglycerolu (DPPG), vaječného fosfatidylglycerolu, dioleoylfosfatidyletanolamínu (DOPE), vaječného fosfatidyletanolamínu, kyseliny dioleoylfosfatidovej (DOPA), kyseliny dimyristoylfosfatidovej (DMPA), kyseliny dipalmitoylfosfatidovej (DPPA), dioleoylfosfatidylserínu (DOPS), dimyristoylfosfatidylserínu (DMPS), dipalmitoylfosfatidylserínu (DPPS), vaječného fosfatidylserínu, lyzofosfatidylglycerolu, lyzofosfatidyletanolamínu a lyzofosfatidylserínu.
  27. 27. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa t ý m , že cytokínom je hematopoietický faktor.
  28. 28. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci sa t ý m , že sa hematopoietický faktor zvolí z množiny pozostávajúcej z G-CSF, GM-CSF a MGDF.
  29. 29. Spôsob podľa nároku 28, vyznačujúci sa t ý m , že hematopoietickým faktorom je G-CSF.
  30. 30. Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa t ý m , že G-CSF je prírodný humánny G-CSF alebo sa získa ako produkt expresie prokaryotickej alebo eukaryotickej hostiteľskej bunky.
  31. 31. Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa t ý m , že G-CSF je chemicky modifikovaný G-CSF.
  32. 32. Spôsob podľa nároku 31, vyznačujúci sa t ý m , že chemicky modifikovaným G-CSF je pegylovaný G-CSF.
  33. 33. Spôsob podľa nároku 28, vyznačujúci sa t ý m , že hematopoietickým faktorom je MGDF.
  34. 34. Spôsob podľa nároku 33, vyznačujúci sa t ý m , že MGDF je prírodný humánny MGDF alebo sa získa ako produkt expresie prokaryotickej alebo eukaryotickej hostiteľskej bunky.
  35. 35. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa t ý m , že MGDF má aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu aminokyseliny 1 až 163 z obr. 29 (SEQ ID No:l a 2).
  36. 36. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa t ý m , že MGDF má aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu aminokyseliny 1 až 332 z obr. 29 (SEQ ID No:l a 2).
  37. 37. Spôsob podľa nároku 35, vyznačujúci sa t ý m , že MGDF je chemicky modifikovaný MGDF.
  38. 38. Spôsob podľa nároku 37, vyznačujúci sa t ý m , že chemicky modifikovaným MGDF je pegylovaný MGDF (PEG-MGDF).
  39. 39. Spôsob podľa nároku 38, vyznačujúci sa t ý m , že PEG-MGDF je pegylovaný polyetylénglykolom.
  40. 40. Spôsob podľa nároku 39, vyznačujúci sa t ý m , že PEG-MGDF je monopegylovaný MGDF (mPEG-MGDF).
  41. 41. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa t ý m , že PĽG skupina je naviazaná na N-koniec MGDF.
  42. 42. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa t ý m , že kompozícia obsahuje farmaceutický prijateľný nosič.
SK1260-97A 1995-03-31 1996-03-28 Lipozóm-cytokínová kompozícia a spôsob jej prípravy SK283596B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/414,161 US5874075A (en) 1993-10-06 1995-03-31 Stable protein: phospholipid compositions and methods
PCT/US1996/004261 WO1996029989A1 (en) 1995-03-31 1996-03-28 Stable protein:phospholipid compositions and methods____________

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK126097A3 SK126097A3 (en) 1999-06-11
SK283596B6 true SK283596B6 (sk) 2003-10-07

Family

ID=23640216

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1260-97A SK283596B6 (sk) 1995-03-31 1996-03-28 Lipozóm-cytokínová kompozícia a spôsob jej prípravy

Country Status (24)

Country Link
US (1) US5874075A (sk)
EP (1) EP0817614B1 (sk)
JP (1) JP3856471B2 (sk)
KR (1) KR100228415B1 (sk)
CN (1) CN1241548C (sk)
AT (1) ATE222096T1 (sk)
BR (1) BR9607999A (sk)
CA (1) CA2215534C (sk)
CZ (1) CZ292788B6 (sk)
DE (1) DE69623003T2 (sk)
DK (1) DK0817614T3 (sk)
EA (1) EA000415B1 (sk)
ES (1) ES2177781T3 (sk)
HK (1) HK1006079A1 (sk)
HU (1) HU224691B1 (sk)
IL (1) IL117690A0 (sk)
NO (1) NO318235B1 (sk)
NZ (1) NZ306156A (sk)
PT (1) PT817614E (sk)
SK (1) SK283596B6 (sk)
TW (1) TW400236B (sk)
UA (1) UA62911C2 (sk)
WO (1) WO1996029989A1 (sk)
ZA (1) ZA962483B (sk)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6001968A (en) 1994-08-17 1999-12-14 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and compositions
US6429290B1 (en) 1994-08-17 2002-08-06 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and derivatives
KR100408229B1 (ko) * 1996-10-04 2003-12-01 암겐 인코포레이티드 Ｍｐｌ 리간드를 함유하는 제약학적 조성물
DE69825137T2 (de) * 1998-02-23 2005-07-21 Cilag Ag International Liposomale Erythropoietin-Dispersion
TR200101087T2 (tr) * 1998-10-16 2001-09-21 Biogen, Inc. İnterferon beta-füzyon proteinleri ve kullanımları
CN1329082C (zh) * 1998-10-16 2007-08-01 拜奥根Idec马萨诸塞公司 干扰素－β－1a的聚合物缀合物及其使用
WO2001012141A1 (fr) 1999-08-18 2001-02-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Stimulants pour la pousse de cheveux
PT1129720E (pt) 2000-02-29 2004-08-31 Pfizer Prod Inc Factor estimulador de colonias de granulocitos estabilizado
US6416745B1 (en) * 2001-05-03 2002-07-09 Block Drug Company, Inc. Dental composition for treating hypersensitive teeth
US7214660B2 (en) * 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7173003B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
KR100964411B1 (ko) 2002-01-18 2010-06-15 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 생물학적 활성 화합물과 컨쥬게이팅되는 잔기를 갖는 폴리알킬렌 글리콜
US20060193905A1 (en) * 2002-05-14 2006-08-31 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Direct cellular energy delivery system
NZ542094A (en) * 2003-03-14 2008-12-24 Neose Technologies Inc Branched polymer conjugates comprising a peptide and water-soluble polymer chains
SG155777A1 (en) 2003-04-09 2009-10-29 Neose Technologies Inc Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
WO2006127896A2 (en) * 2005-05-25 2006-11-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor ix
DE602004013769D1 (de) * 2003-04-15 2008-06-26 Opperbas Holding Bv Pharmazeutische zusammensetzung, enthaltend proteine und/oder polypeptide sowie kolloidpartikel
WO2005012484A2 (en) * 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US8633157B2 (en) * 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) * 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
EP1765853B1 (en) * 2004-01-08 2015-10-28 ratiopharm GmbH O-linked glycosylation of G-CSF peptides
US20070081986A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-12 Shunji Tomatsu Beta-glucuronidase with an attached short peptide of acidic amino acids
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
WO2006031811A2 (en) * 2004-09-10 2006-03-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
EP3061461A1 (en) * 2004-10-29 2016-08-31 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
ES2449195T3 (es) * 2005-01-10 2014-03-18 Ratiopharm Gmbh Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado
DE102005012457B3 (de) 2005-03-18 2006-08-31 Basf Coatings Ag Epoxid- und Silangruppen enthaltende Oligomere und Polymere, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
WO2006121569A2 (en) * 2005-04-08 2006-11-16 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
KR100770704B1 (ko) 2005-08-04 2007-10-29 삼성전자주식회사 픽쳐 스킵 방법 및 장치
US20070105755A1 (en) * 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
US20080274958A1 (en) * 2006-07-21 2008-11-06 Neose Technologies, Inc. Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
US8969532B2 (en) * 2006-10-03 2015-03-03 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography
MX2009003470A (es) * 2006-10-04 2009-04-14 Novo Nordisk As Azucares y glicopeptidos pegilados enlazados a glicerol.
NZ580030A (en) * 2007-04-03 2012-06-29 Biogenerix Ag Methods of treatment using glycopegylated g-csf
US20110177029A1 (en) * 2007-06-04 2011-07-21 Novo Nordisk A/S O-linked glycosylation using n-acetylglucosaminyl transferases
WO2008154639A2 (en) * 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
CN104689333B (zh) 2007-08-27 2018-05-29 拉蒂奥法姆有限责任公司 G-csf 缀合物的液体制剂
US8207112B2 (en) * 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
US9173890B2 (en) * 2007-09-20 2015-11-03 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Sustained release of Apo A-I mimetic peptides and methods of treatment
US7985727B1 (en) 2007-09-20 2011-07-26 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Apo A-I mimetic peptides and methods of treatment
US8101565B2 (en) 2007-09-20 2012-01-24 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Sustained release of Apo A-I mimetic peptides and methods of treatment
US8044021B2 (en) * 2007-09-20 2011-10-25 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Sustained release of apo A-I mimetic peptides and methods of treatment
US7985728B1 (en) 2007-09-20 2011-07-26 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Sustained release of Apo A-I mimetic peptides and methods of treatment
CN102037004A (zh) * 2008-01-08 2011-04-27 生物种属学股份公司 使用寡糖基转移酶的多肽的糖缀合
KR101582841B1 (ko) 2008-02-27 2016-01-11 노보 노르디스크 에이/에스 콘쥬게이트된 인자 ｖｉｉｉ 분자
SI2767546T1 (sl) 2011-02-07 2019-03-29 Cerenis Therapeutics Holding Sa Lipoproteinski kompleksi in izdelava ter uporaba le-teh
AU2012328524B2 (en) 2011-10-28 2017-05-18 Excelse Bio, Inc. Protein formulations containing amino acids
EP2819652A1 (en) 2012-02-27 2015-01-07 Epitarget As Use of a particulate immunomodulator in cancer therapy

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4515736A (en) * 1983-05-12 1985-05-07 The Regents Of The University Of California Method for encapsulating materials into liposomes
US4744989A (en) * 1984-02-08 1988-05-17 E. R. Squibb & Sons, Inc. Method of preparing liposomes and products produced thereby
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4810643A (en) * 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
EP0366770B1 (en) * 1988-05-16 1994-02-09 Vestar, Inc. Liposomes coupled to hormones
JPH0334920A (ja) * 1989-04-21 1991-02-14 Otsuka Pharmaceut Co Ltd リポソームに結合及至組合わされた生物活性化合物及びそれを含有する医薬
WO1991004019A1 (en) * 1989-09-12 1991-04-04 The Regents Of The University Of California Therapeutic peptides and proteins
JPH03127622A (ja) * 1989-10-09 1991-05-30 Green Cross Corp:The ｐＨ感受性リポソーム
US5225212A (en) * 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
JPH0482839A (ja) * 1990-07-20 1992-03-16 Green Cross Corp:The 蛋白質類・脂質小体複合体
JPH06247842A (ja) * 1993-02-23 1994-09-06 Green Cross Corp:The リポソーム組成物の製造方法
ATE222752T1 (de) * 1993-10-06 2002-09-15 Amgen Inc Stabile protein-phospholipid zusammensetzungen und verfahren

Also Published As

Publication number Publication date
HUP9801370A3 (en) 2000-10-30
CA2215534A1 (en) 1996-10-03
BR9607999A (pt) 1998-06-23
NZ306156A (en) 1999-02-25
CN1150756A (zh) 1997-05-28
AU688678B2 (en) 1998-03-12
IL117690A0 (en) 1996-07-23
PT817614E (pt) 2002-12-31
HUP9801370A2 (hu) 1998-10-28
UA62911C2 (en) 2004-01-15
DE69623003T2 (de) 2003-03-27
TW400236B (en) 2000-08-01
JPH11502851A (ja) 1999-03-09
US5874075A (en) 1999-02-23
EP0817614B1 (en) 2002-08-14
CZ291297A3 (cs) 1999-02-17
HK1006079A1 (en) 1999-02-12
ES2177781T3 (es) 2002-12-16
NO318235B1 (no) 2005-02-21
NO974323D0 (no) 1997-09-19
ZA962483B (en) 1996-10-03
AU5434196A (en) 1996-10-16
MX9707137A (es) 1997-11-29
HU224691B1 (hu) 2005-12-28
JP3856471B2 (ja) 2006-12-13
DK0817614T3 (da) 2002-10-07
EA000415B1 (ru) 1999-06-24
KR100228415B1 (ko) 1999-11-01
EA199700197A1 (ru) 1998-04-30
CA2215534C (en) 2003-05-20
WO1996029989A1 (en) 1996-10-03
DE69623003D1 (de) 2002-09-19
CZ292788B6 (cs) 2003-12-17
SK126097A3 (en) 1999-06-11
CN1241548C (zh) 2006-02-15
NO974323L (no) 1997-11-28
EP0817614A1 (en) 1998-01-14
ATE222096T1 (de) 2002-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK283596B6 (sk) Lipozóm-cytokínová kompozícia a spôsob jej prípravy
US7074755B2 (en) Erythropoietin conjugate compounds with extended half-lives
CA1283046C (en) Tumor necrosis factor formulation
US5900402A (en) Method of reducing side effects associated with administration of oxygen-carrying proteins
JP5563475B2 (ja) Ｐｅｇインターフェロン−ベータ製剤
CA2150939C (en) Stable protein: phospholipid compositions and methods
TW201138831A (en) Modified granulocyte colony stimulating factor (G-CSF)
AU688678C (en) Stable protein:phospholipid compositions and methods
MXPA97007137A (en) Stable protein compositions: fosfolipidos ymeto
EP2618830A1 (en) Formulations for bovine granulocyte colony stimulating factor and variants thereof