UA62911C2 - Protein-phospholipid composition and method for its manufacture - Google Patents
Protein-phospholipid composition and method for its manufacture Download PDFInfo
- Publication number
- UA62911C2 UA62911C2 UA97094746A UA97094746A UA62911C2 UA 62911 C2 UA62911 C2 UA 62911C2 UA 97094746 A UA97094746 A UA 97094746A UA 97094746 A UA97094746 A UA 97094746A UA 62911 C2 UA62911 C2 UA 62911C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- frrm
- scl
- protein
- specified
- differs
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 83
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 154
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 152
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 101
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims abstract description 30
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 83
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 81
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 43
- XQQUKAGHLDAJGO-UHFFFAOYSA-N 1-(2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)hexan-1-one Chemical group CCCCCC(=O)C1=C(O)C=C(OC)C=C1O XQQUKAGHLDAJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 37
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 37
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 27
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 12
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 9
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims description 9
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 8
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 8
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 claims description 5
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 claims description 5
- WKJDWDLHIOUPPL-JSOSNVBQSA-N (2s)-2-amino-3-({[(2r)-2,3-bis(tetradecanoyloxy)propoxy](hydroxy)phosphoryl}oxy)propanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC WKJDWDLHIOUPPL-JSOSNVBQSA-N 0.000 claims description 4
- BIABMEZBCHDPBV-MPQUPPDSSA-N 1,2-palmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-sn-glycerol) Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@@H](O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC BIABMEZBCHDPBV-MPQUPPDSSA-N 0.000 claims description 4
- ZPDQFUYPBVXUKS-YADHBBJMSA-N 1-stearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O ZPDQFUYPBVXUKS-YADHBBJMSA-N 0.000 claims description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 4
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 claims description 4
- DSNRWDQKZIEDDB-GCMPNPAFSA-N [(2r)-3-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-2-[(z)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC DSNRWDQKZIEDDB-GCMPNPAFSA-N 0.000 claims description 4
- CWRILEGKIAOYKP-SSDOTTSWSA-M [(2r)-3-acetyloxy-2-hydroxypropyl] 2-aminoethyl phosphate Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCCN CWRILEGKIAOYKP-SSDOTTSWSA-M 0.000 claims description 4
- 229960005160 dimyristoylphosphatidylglycerol Drugs 0.000 claims description 4
- BPHQZTVXXXJVHI-AJQTZOPKSA-N ditetradecanoyl phosphatidylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@@H](O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC BPHQZTVXXXJVHI-AJQTZOPKSA-N 0.000 claims description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims 3
- KLFKZIQAIPDJCW-HTIIIDOHSA-N Dipalmitoylphosphatidylserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KLFKZIQAIPDJCW-HTIIIDOHSA-N 0.000 claims 2
- MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 46
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 abstract description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 abstract description 8
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 abstract description 6
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 abstract 1
- 108091000099 cysteine desulfurase Proteins 0.000 description 69
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 22
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 18
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Substances [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 15
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 14
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 14
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 12
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 11
- PIMKEUIWMFJVNB-UHFFFAOYSA-N 10-pyren-1-yldecanoic acid Chemical compound C1=C2C(CCCCCCCCCC(=O)O)=CC=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 PIMKEUIWMFJVNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 10
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 8
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 8
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 7
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 6
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 6
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 6
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 6
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 6
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical group [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 5
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 5
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 5
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101001029765 Homo sapiens Fibromodulin Proteins 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- -1 glycol aldehydes Chemical class 0.000 description 4
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000004694 iodide salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000001748 luminescence spectrum Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 4
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 3
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 3
- 239000010408 film Substances 0.000 description 3
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 3
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- WTBFLCSPLLEDEM-JIDRGYQWSA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC WTBFLCSPLLEDEM-JIDRGYQWSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical class CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 2
- NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N Propionic aldehyde Chemical compound CCC=O NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical group [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940031098 ethanolamine Drugs 0.000 description 2
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 2
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000009207 exercise therapy Methods 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 2
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 2
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- GYSCBCSGKXNZRH-UHFFFAOYSA-N 1-benzothiophene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2SC(C(=O)N)=CC2=C1 GYSCBCSGKXNZRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 2,4-D Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- 241000182988 Assa Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000566113 Branta sandvicensis Species 0.000 description 1
- 101100287724 Caenorhabditis elegans shk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UNMYWSMUMWPJLR-UHFFFAOYSA-L Calcium iodide Chemical compound [Ca+2].[I-].[I-] UNMYWSMUMWPJLR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000288673 Chiroptera Species 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 101000616562 Danio rerio Sonic hedgehog protein A Proteins 0.000 description 1
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N Decanoic acid Natural products CCCCCCCCCC(O)=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000402754 Erythranthe moschata Species 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000000731 Fagus sylvatica Species 0.000 description 1
- 235000010099 Fagus sylvatica Nutrition 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 241001547860 Gaya Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 244000301682 Heliotropium curassavicum Species 0.000 description 1
- 235000015854 Heliotropium curassavicum Nutrition 0.000 description 1
- 101000891113 Homo sapiens T-cell acute lymphocytic leukemia protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108700022598 Ovis aries megapoietin Proteins 0.000 description 1
- 102100026459 POU domain, class 3, transcription factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710133394 POU domain, class 3, transcription factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 241001659863 Panna Species 0.000 description 1
- 235000008753 Papaver somniferum Nutrition 0.000 description 1
- 241000218180 Papaveraceae Species 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000289690 Xenarthra Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000027697 autoimmune lymphoproliferative syndrome due to CTLA4 haploinsuffiency Diseases 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N butyric aldehyde Natural products CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940046413 calcium iodide Drugs 0.000 description 1
- 229910001640 calcium iodide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N dimethyl(dioctadecyl)azanium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N dpph Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1[N]N(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007905 drug manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000001033 ether group Chemical group 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 210000004013 groin Anatomy 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 102000057296 human TAL1 Human genes 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000013554 lipid monolayer Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 229940067605 phosphatidylethanolamines Drugs 0.000 description 1
- 150000008106 phosphatidylserines Chemical class 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001583 poly(oxyethylated polyols) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000004353 relayed correlation spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 101150024950 sstT gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 229940081330 tena Drugs 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001757 thermogravimetry curve Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/196—Thrombopoietin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
- A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
- Y10S930/145—Colony stimulating factor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Цей винахід належить до структур білок : фосфоліпід, які застосовують для стабілізації вторинної та тритинної структур білків, що здатні до переходу у розплавлену сферичну структуру. Зокрема, цей винахід стосується композицій Ф - СКЛ (фактор, стимулюючий колонію зернистого лейкоциту) : фосфоліпід, які мають збільшену стійкість, показують збільшений строк зберігання і здатні до використання у високотемпературних технологіях виготовлення лікарських засобів і як нові наповнювачи.
Було виявлено, що деякі білки мають здатність до переходу у розплавлену сферичну структуру (РСО).
Див. Мап дег Сюоої, Р. Ссх., Майте 354 : 408 - 410 (1991). Білки у розплавленій сферичній структурі виявляють вторинну структуру, яка порівнянна зі структурою природного білка, однак у них відсутня стійка тритинна структура. Див. Ріїзуп єї. аі., РЕВ5 І ецеї5 262 :1, 20 - 24 (1990). У ряді випадків перехід у розплавлену сферичну структуру супроводжується розкриттям попередньо схованих гідрофобних ділянок білка. Шляхом розкриття критичних гідрофобних залишків РОС може бути посередником при агрегатуванні та осадженні білків. Конформацію РОС можна виявити шляхом порівняння кругового дихроїзму у далекій ультрафіолетовій (УФ) ділянці зі спектром ароматичних бокових ланцюгів (круговий дихроїзм у близькій Уф ділянці і флуоресценція). Розплавлена сферична структура виявляє спектральні зміни у ароматичній групі при відсутності змін кругового дихроїзму у далекій УФ - ділянці. Див. Вуснкома єї. аі.. РЕВ5 І ецегз 238: 231 - 234 (1988) ; Мап дег Соої Р. С, Маїшге 354 : 408 - 410 (1991).
Фактор, стимулюючий колонію зернистого лейкоциту (Ф - СКЛ), становить собою один з відомих білків, здатних до переходу у РОС перед агретуванням. Людський рекомбінантний Ф - СКЛ (рлф - СКЛ) селективно стимулює нейрофіли типу білих кров'яних клітин, що використовують для боротьби з інфекцією. За нашого часу рекомбінантний Ф - СКЛ, Ріідгазіїт, має перспективу для застосування у терапевтичних цілях. Структуру
Ф - СКЛ при різних умовах інтенсивно досліджували Ги еї. аї., У. Віої. Спет. Мої. 267 : 8770 - 8777 (1992).
Завдяки своїм гідрофобним характеристикам створення композицій, що містять Ф - СКЛ, з поширеним строком зберігання утруднено.
Композиції певних гідрофобних білків гублять активність із-за створення димеру і агрегатів вищого порядку (макродіапазону) при довгостроковому зберіганні. Протягом зберігання також трапляються інші хімічні зміни, наприклад, дезамінування та окиснення. Крім того, композиція, що містить Ф - СКЛ, повинна забезпечити захист проти денатурації і, зокрема, підтримку стійкості вторинної та тритинної структури білка.
Людський ФМ - СКЛ становить собою глікопротеїн з молекулярною вагою 22 кілодальтон (кДа), постійно потрібний для проліферації іп міго клітин - попередників макрофагів і зернистих лейкоцитів. Інші біологічні активності можуть включати регуляцію функціональної активності різновідностів зрілих клітин; див. (з0цд еї. а!., Маїиге 309 : 763 - 767 (1984), і збільшення хемотаксису у напрямку визнаних хемоатрактантів; див. УМіПатве еї. аі., Нетаїйоіоду, 4 ей. (1990). ФМ -СКЛ також стимулює виготовлення моноцитів і тому його можна використовувати для терапії моноцитових розладів, наприклад, моноцитопоетіну.
Людський ФМ - СКЛ можна одержувати і очищати із ряду джерел. Процедури виготовлення рекомбінантного людського ФМ - СКЛ первісно було описано Вигдезв5 еї. а!., Віоса 69 :1, 43 : 51 (1987). У патенті США Ме5 047 504, який у цьому описі є посиланням, наведено спосіб комерційно великомасштабного виготовлення ФМ - СКЛ у неглікозилованій формі, як продукт експресії прокаріотної клітини - хазяїна.
Фактор росту і розвитку мегакаріоцита (ФРРМ) становить собою нещодавно клонований цитокін, який певно є головним регулятором рівней циркулюючих тромбоцитів. Див. Вапієу Т. ОЮ. еї. аІ., Маїге 369 : 565 - 568 (1994); де Займаде Р. .. єї. аІ., Майте 369 : 533 - 538 (1994); Міуагаке Н. вї. аІ., Ехр. Нетай)/. 22 : 838 (1994);
Кшег О. 9/ еї. ам. РМАБ О5А, 91 ; 11104 - 11108 (1994). ФРРМ також має назви тромбопоетін (ТПО), трі - ліганд і мегапоетін. Зрілий людський ФРРМ становить собою білок, який має усього 332 амінокислоти.
Відповідна кДНК показана на Фіг.29 цього опису.
Рекомбінантний ФРРМ, виготовлений у клітинах яєчнику китайського хом'яка (ЯКХ) і клітинах Е.соїї, показав наявність біологічної активності, яка специфічно стимулює або збільшує кількість мегакаріоцитів і/або тромбоцитів іп мімо у мишок, пацюків і мавп. Див., наприклад, Нипі Р. еї аї., Віоой 84 (10 ) : ЗО0А (1994).
Молекули людського ФРРМ, які відсікнуті таким чином, щоб мати принаймні 151 амінокислоту, починаючи з амінокислоти, розташованої на позиції 1 (фіг.29), залишаються біологічно активними іп мімо. Також можливо видаляти до перших шести амінокислот на М - кінці білка послідовності людського ФРРМ, причому зазначений
ФРРМ утримується біологічно активним. Таким чином, здається, що біологічна активність утримується усередині амінокислот від 7 до 151 (включно) зрілої амінокислотної послідовності людського ФРРМ, показаної на Фіг.29.
Природний ФРРМ становить собою глікозиловану молекулу. Глікозилована структура природного ФРРМ пов'язана з двома ключовими доменами, які знаходяться у ФРРМ. Послідовність першого домену, що складається з перших приблизно 151 амінокислоти людського ФРРМ, відповідного" активній ділянці молекули, має помітну гомологію з еритропоетіном (ЕПО), цитокіном, здатним до стимулювання продукування еритроцитів, і має назву "ЕПО - подібний " домен людського ФРРМ. Решта амінокислот зрілого білка складає так званий домен "М -зв'язаного карбогідрату", оскільки вони включають більшість, а мабуть і усі сайти для М - зв'язаного глікозилування. У людському ФРРМ є шість М - зв'язаних сайтів глікозилування, які усі містяться у М -зв'язаному домені глікозилування. Обидва домени містять у собі О - зв'язані сайти глікозилування. У молекулі є приблизно 12 - 14 ОО - зв'язаних ланцюгів глікозилування. Експерименти з ДНК людського ФРРМ, рекомбінантно експресованого у клітини ЯКХ, свідчать про те, що у ЕПО -подібному домені принаймні два О - зв'язаних сайта на позиціях 1 (5еї) і 37 (ТНг) є глікозилованими.
Хоч білки, наприклад Ф - СКЛ і ФРРМ, можуть бути стабілізованими за певних зазначених умов, однак є необхідність збільшити строк зберігання цих та інших білків завдяки стабілізації вторинної і тритинної структури зазначених білків. Одним із шляхів стабілізації білків, який було випробувано у минулому, є використання ліпосом. Ліпосоми становлять собою повністю зачинені ліпідні двошарові мембрани, які утворені водонерозчиненими полярними ліпідами, зокрема, фосфоліпідами. Ліпосомні пухирці можуть мати єдиний мембранний подвійний шар (моношарові), або можуть мати багато мембранних подвійних шарів (мультишарові). Подвійний шар складається з двох ліпідних моношарів, які мають гідрофільну (полярну)
"головну" ділянку і гідрофобну (неполярну) "хвостову" ділянку, де гідрофобні хвости орієнтуються у напрямку до центру подвійного шару, тоді як гідрофільні голови орієнтуються у напрямку до водної фази. Стабільність, жорсткість і проникність ліпосом можуть бути змінені шляхом змінювання фосфоліпідного складу за рахунок зміни температури, приєднання стиролу або введення зарядженого амфіфілу. Основна структура ліпосом може бути виконана шляхом різних технологій, відомих у цій галузі.
У процесі свого утворення ліпосоми можуть утягнувати водні розчини до водних каналів і виділяти їх з різною інтенсивністю. На основі досліджень було встановлено, що ліпосоми можуть вводити ензими до клітин та змінювати їх метаболізм. (Див. Сгедогіадіє, Мем Епаді. У. Мей. 295 : 704 - 710, 765 - 770 (1976). Ліпосоми були провісниками відповіді на шляху пошуків цілевого доставляння лікарського засобу. У результаті була проведена велика кількість досліджень у фармацевтичній промисловості, включаючи використання ліпосом, як повільно висвободжаючих сховищ для ліків, вітамінів та білків, ізольованих усередині гідрофобних шарів або гідрофобного ядра ліпосоми.
Успішне використання ліпосом, як носіїв лікарських засобів, обмежено, оскільки досліджувачи, які спробували провести таке використання, зустріли деякі проблеми. Наприклад, ліпосоми відомі як міцні імунологічні додатки до затриманих антигенів і необхідно додержуватися обережності, коли ензими або інші білки ксеногенного походження затримуються у ліпосомах. Крім того, важко здійснювати контроль за швидкістю дифузій лікарського засобу. Це є функцією властивої нестабільності ліпосом і присутності певних компонентів крові, які прискорюють дифузію деяких ліків. Крім того, завдяки своїй природі деякі речовини погано утягнуються до ліпосом і, таким чином, швидко дифундують у кровообіг. Кінець кінцем, існує проблема дослідження будь-яких клітин або органу, крім печені або селезінки. Широкий огляд ліпосом, речовин, які упроваджувані у ліпосоми, і проблем, пов'язаних з використанням ліпосом, як носіїв ліків, наведен Стгедогу
Стедоїавдіз у розділі 14 "Ліпосоми" у книзі "Носії ліків у біології та медицині", с.287 - 341 (Асадетіс Ргезв, М.У., 1979).
Хоч було багато повідомлень, що стосувалися використання ліпосом як носіїв ліків, але у питанні, яке стосується використання ліпосом для збільшення строку зберігання терапевтичних пептидів або білків шляхом стабілізації структури пептиду і/або білка, нової інформації було небагато. У патенті РСТ/О590/05163 за назвою "Терапевтичні пептиди і білки" (Новієйег еї а!) описано застосування порожніх ліпосом як фармацевтично прийнятного розчинника для солюбілізації поліпептидів і/або білків з метою запобігання нагромадження поліпептидів і/або білків на поверхні поділу повітря/вода і запобігання адсорбції поліпептидів і/або білків на поверхні контейнера. Нозіеєїйег єї а). відкрили, що негативно заряджений фосфоліпід може бути додан до приблизно 50 молярних процентів і що фосфатидилхолін, нейтральний фосфоліпід, є переважною ліпосомою. Нозіейег єї аі, не розглядають розчинника, призначеного для стабілізування структури поліпептида і/або білка.
У патенті РСТ/О591/07694 (Нипд еї аІ.), що має назву " Виготовлення і характеристика ліпосомних композицій фактора некрозу новоутворень" описані молекули ліпофільного модифікованого фактора некрозу новоутворень (ГНН), які зв'язані з поверхнею або інкапсуловані усередині ліпосоми. Показано, що молекули ліпосомної ліпофільної ГНН мають підвищену стабільність іп мімо. Стабільність указує на зменшення або на тенденцію до зменшення здатності ГНН -ліпосоми перепускати ГНН у систему іп мімо. Найкращими ліпосомами були нейтральні ліпіди. Нипо єї а). не описують композиції ГНН, де наповнювачи справляють стабілізуючу дію на структуру білка.
У відомих літературних джерелах не можна знайти відомостей, що стосуються контактування білка, наприклад, Ф - СКЛ або ФРРМ з негативно зарядженим ліпідним пухирцем, що таким чином безпосередньо стабілізує білок, забезпечуючи захист проти термічно - індукованого агрегатування, денатурації, утрати активності і розгортання вторинної структури. Існує необхідність утворення таких композицій, які забезпечують перевагу у процесі операцій по виготовленню ліків, які потребують високих температур (наприклад, введення
Ф - СКЛ і ФРРМ у полімери), а також які можна використовувати як нові наповнювачи для засобів доставки ліків (наприклад, для орального введення пегілованого Ф - СКЛ). Цей винахід забезпечує створення зазначених композицій.
Винахід передбачає додавання до білка гідрофобних середовищ, наприклад, лізофосфоліпідів або інших ліпосом за умовами перебування у розплавленій сферичній структурі, які безпосередньо стабілізують вторинну і тритинну структуру білка, захищаючи, таким чином, білок від термічно індукованого агретування, денатурації і втрати активності. Зокрема, цей винахід спрямовано на утворення стійких композицій Ф -
СКЛ : фосфоліпід і ФРРМ : фосфоліпід. Дивовижно, що найкращі композиції Ф - СКЛ : фосфоліпід і ФРРМ : фосфоліпід можуть піддаватися циклічній обробці у діапазоні температур 10 - 9572 з повним відновлюванням вторинної структури білка після охолодження. Зазначені композиції придатні для використання у операціях, що пов'язані з технологією виготовлення ліків, що потребують високих температур, а також для використання як нових наповнювачів для засобів доставки ліків. Крім того, зазначені композиції мають продовжений строк зберігання у порівнянні з чистим білком, а взаємодія білка з пухирцем фосфоліпіду забезпечує відсутність адсорбції білка у скляні пробірки. У переважному варіанті виконання винаходу комплекс білок : фосфоліпід містить негативно заряджену ліпосому, яку вибирають із отаких речовин: діолеоїлфосфатидилгліцерин (ДОФГ), диміристоїлфосфатидилгліцерин (ДМФГ), дипальмітоїлфосфатидилгліцерин (ДПФГ),, монтежюфосфатидилгліцерин, діолег'лфосфатидилетаноламін (ДОФЕ), монтежюфосфатидил етанол амін, діолеглфосфатидилова кислота (ДОФК), диміристоїлфосфатидилова кислота (ДМФК), дипальмітоїлфосфатидилова кислота (ДПФЮК), діолеїлфосфатидилсерин (ДОФОС), диміристоїлфосфатидилсерин (ДМФО), монтежюфосфатидилсерин, лізофосфатидилгліцерин, лізофосфатидилетаноламін, лізофосфатидилсерин. Особливо найкращим є негативно заряджений ненагодований фосфоліпід ДОФГ. Крім того, винахід передбачає підтримування величини рн у діапазоні 3,0 - 7,5 і співвідношення ліпід : білок, що принаймні дорівнює 10 : 1. Додаткові елементи, що забезпечують найкращі варіанти цього винаходу, включають використання хімічно модифікованих білків у комплексі білок : фосфоліпід, а також використання одного або більш отаких елементів: агента, що регулює ізотонічність;
буферного агента і агента, що регулює рН. Специалістам у цій галузі зрозуміло, що винахід стосується стійких композицій білок : фосфоліпід, які містять різні комбінації зазначених додаткових елементів.
На Ффіг.1 зображено спектр флуоресцентного світіння у присутності рлф - СКЛ (крива 1) та при відсутності (крива 2) пухирців ДОФГ. Концентрація рлФ - СКЛ складає 0,2мг/мл. Співвідношення ДОФГ : рлф - СКЛ (крива 1) дорівнює 100 : 1 (моль : моль).
На Фіг.2 показан вплив збільшення співвідношення ліпід : білок на флуоресценцію рлФ - СКЛ. Бо становить собою первісну флуоресценцію (без ліпіду), а Е означає флуоресценцію після додавання ліпіду для досягнення наведеного молярного співвідношення ліпід : рлФ - СКЛ. На Ффіг.2 (а) показано співвідношення Б/Ро (А) і максимальна довжина хвилі світіння (В) для суміші ДОФГ : рлФ - СКЛ. На Фіг.2 (в) показано співвідношення РБ/Ео (А) і максимальна довжина хвилі світіння ( В) для суміші ДОФГ : рлф - СКЛ.
На Фіг.3 показані діаграми Штерна - Вольмера, що стосуються гасіння флуоресценції рлФ - СКЛ за допомогою йодиду кальцію (КІ) при відсутності (А) та у присутності (В) пухирців ДОФГ. Експерименти по гасінню виконували шляхом додавання аліквот КІ до рлФф - СКЛ (0,2мг/мл) ї ДОФГ : рлФф - СКЛ (100 1, моляр).
На Фіг.4 зображено гасіння флуоресценції триптофану рлф - СКЛ після додавання пірендеканової кислоти.
Довжина хвилі світіння дорівнювала 327нм. Співвідношення ДОФГ : рлФ - СКЛ дорівнювало 100: 1 (моляр).
На Фіг.5 зображена діаграма, що показує порівняння змін інтенсивності флуоресценції після додавання ліпіду для рлФ - СКЛ при відсутності і у присутності різних ліпідів. У кожному випадку співвідношення ліпід : білок дорівнювало 100 : 1 (моляр).
На Фіг.6 зображена діаграма, що показує порівняння зсувів максимумів світіння для рлф - СКЛ при відсутності та у присутності різних ліпідів. У кожному випадку співвідношення ліпід : білок дорівнювало 100: 1 (моляр).
На Фіг.7 показан вплив ДМФХ (крива 2), ДМФГ (крива 3), ДМФК (крива 4) на круговий дихроїзм (КД) рлфФ -
СКЛ (крива 1). У кожному випадку співвідношення ліпід : білок дорівнювало 50 :1 (моляр) у воді, рН - 6,0.
На Фіг.8 показан вплив збільшення температури на КД рлф - СКЛ (140 1, моляр) (крива 2). Концентрація рлФ - СКЛ дорівнювала 8Омкг/мл у воді, рН - 6,0. Температуру змінювали від 107"С до 90"С при швидкості зміни 100"С у годину.
На Фіг.9 показані термограми діференціального скануючого калориметрування для рлФф - СКЛ (крива 1) і
ДОФГ: рлФ - СКЛ (45 1, моляр) (крива 2). Концентрація рлФ - СКЛ у зразках дорівнювала 1мг/мл (рН - 7,0 у воді). Швидкість сканування дорівнювала 90"С у годину.
На Фіг.10 показан вплив циклічної зміни температури на КД рлф - СКЛ (крива 1) і ДОФГ: рлф - СКЛ (140: 1, моляр) (крива 2). Зразки швидко нагрівали до температури 957С та охолоджували до температури 10"С, як це показано стрілками. Концентрація рлф - СКЛ у зразках становила ЗОмг/мл, рН - 6,0.
На Фіг.11 показан вплив циклічної зміни температури на КД рлф - СКЛ (крива 1) і ДОФГ: рлф - СКЛ (150: 1, моляр) (крива 2). Зразки нагрівали до температури 95"С та охолоджували до температури 10760.
Концентрація рлфФ - СКЛ у зразках становила дЗОмкг/мл, рН - 6,0.
На Фіг.12 показан вплив циклічної зміни температури на КД рлф - СКЛ (крива 1) і ДОФГ: рлф - СКЛ (150: 1, моляр) (крива 2). Зразки нагрівали до температури 95"С та охолоджували до температури 10760.
Концентрація рлфФ - СКЛ у зразках становила дЗОмкг/мл, рН - 6,0.
На Ффіг.13 показана діаграма, що характеризує здатність різних ліпідів стабілізувати рлФ - СКЛ протягом процесів заморожування - сушіння. Співвідношення ліпід : білок становило 100 : 1 у кожному випадку.
Стабільність грунтувалась на затримці іп міго активності при аналізі костного мозку. Чистий рлф - СКЛ не зберігається при процесах заморожування - сушіння, таким чином, застосований контрольний зразок становить собою необроблений рлф - СКЛ при відсутності ліпіду.
На Ффіг.14 показан вплив різних ліпідів на активність рлФ - СКЛ іп мімо. Активність (згідно з лейкоцитарною формулою крові, ЛФК) вимірювали після внутрішньошкіряної ін'єкції, що вводили хом'якам. Доза рлф - СКЛ дорівнювала 100мкг/мл, коли співвідношення ліпід : білок дорівнювало 100: 1.
На Ффіг.15 показан вплив різних ліпідів на активність рлФ - СКЛ іп мімо. Активність (згідно з лейкоцитарною формулою крові, ЛФК) вимірювали після внутрішньошкіряної ін'єкції, що вводили хом'якам. Доза рлф - СКЛ дорівнювала 100мкг/мл, коли співвідношення ліпід ; білок дорівнювало 50: 1.
На Ффіг.16 зображена діаграма, яка показує результат порівняння зміни інтенсивності Е для ЯКХ - Ф - СКЛ при відсутності і у присутності ДОФГ при зміні рН. У кожному випадку співвідношення ліпід : білок дорівнювало 100: 1 (моляр).
На Фіг.17 наведен графік, що показує порівняння зсувів максимумів світіння для ЯХО - Ф - СКЛ при відсутності і у присутності ДОФГ при зміні рН. У кожному випадку співвідношення ліпід : білок дорівнювало 100 :1 (моляр).
На Фіг.18 показан вплив циклічної зміни температури на КД ПЕГ(поліетиленгліколь) - Ф-- СКЛ ( ) і ДМФГ:
ПЕГ- Ф- СКЛ (17 : 1, моляр) (---). Зразки нагрівали до 907С та охолоджували до 1070.
На Фіг.19 показано: (а) вплив циклічної зміни температури на КД ФМ - СКЛ у фізіологічному розчині з фосфатним буфером (ФБР), рН - 7,0. ФМ - СКЛ при температурі 107С () порівнюють з ФМ - СКЛ, який нагрівали до 90"С, а далі охолоджували до 107 (---); (б) вплив циклічної зміни температури на КД ДПФГ: ПЕГ - Ф- СКЛ (17 : 1, моляр). ДПФГ: ФМ - СКЛ при 107С ( ) порівнювали з ДПФГ : ФМ - СКЛ, що нагрівали до 907С, а далі охолоджували до 107С (---).
На Фіг.20 показано : (а) результати відгуку загальної ЛФК на внутрішньодуоденальне вливання рлФ - СКЛ у присутності та при відсутності ДОФГ. Доза рлф - СКЛ дорівнювала 75О0мкг/кг при співвідношенні ліпід : білок 100 : 1; (в) результати відгуку загальної ЛФК на внутрішньодуоденальне вливання ПЕГ - Ф - СКЛ при відсутності та у присутності ДОФГ. Доза ПЕГ - Ф - СКЛ дорівнювала 75О0мкг/кг при співвідношенні ліпід : білок 100:1.
На Фіг.21 показано вплив ДОФГ на рівні сироватки у ПЕГ - Ф - СКЛ після внутрішньодуоденального насосного вливання. Доза ПЕГ - ф - СКЛ дорівнювала 750мкг/кг при співвідношенні ліпід : білок 100: 1.
На Ффіг.22 зображено спектр флуоресцентного світіння ФРРМ при відсутності та у присутності пухирців
ДМФГ. Концентрація ФРРМ дорівнювала 0,1мг/мл. ФРРМ становив собою ФРРМ 1 - 163, виділений з клітин Е. соїї. Співвідношення ДМФГ : ФРРМ дорівнювало 100 : 1 (моль : моль).
На Ффіг.23 показано вплив збільшення співвідношення ліпід : білок на флуоресценцію ФРРМ. ФРРМ становив собою ФРРМ 1-163, виділений з клітин Е. соїї. Максимальну довжину хвиль світіння для сумішів
ДОФГ: ФРРМ при рнН 5,0 показано індексом (А), а при рН 7,0 - індексом (В).
На Фіг.24 показані графіки Штерна-Вольмера, що стосуються гасіння флуоресценції ФРРМ за допомогою
КІ при відсутності (А) та у присутності (В) пухирців ДОФГ. ФРРМ становив собою ФРРМ 1 - 163, виділений з клітин Е. соїї. Експерименти по гасінню виконували шляхом добавлення аліквотних проб КІ до ФРРМ (0,1мг/мл) | ДОФГ: ФРРМ (100: 1, моляр).
На Ффіг.25 показан вплив циклічної зміни температури на КД ФРРМ (А) та ДОФГ: ФРРМ (100: 1, моляр) (В).
ФРРМ становив собою ФРРМ 1 - 163, виділений з клітин Е. соїї. Процент залишкової спіральності відноситься до кількості, виявленій при температурі 10"С після кожного циклу (один цикл означає швидкий нагрів зразків до температури 957С та їх охолоджування до температури 10"С).
На Ффіг.26 показана ступінь денатурації ФРРМ (14уУ- ДМФГ) у присутності сечовини з різною концентрацією та зображено круговий дихроїзм СЕЗ (середня еліпсність залишків) для ФРРМ ( А ) ії ДМФГ : ФРРМ (В), а також максимальне флуоресцентне світіння ФРРМ (С) і ДМФГ : ФРРМ (Д), ФРРМ становить собою ФРРМ 1 - 163, виділений із клітин Е. соїї. Співвідношення ДМФГ : ФРРМ дорівнювало 100 : 1 (моль : моль).
На Фіг.27 дано графічне подавання максимума флуоресцентного світіння для (/- ДМФГ) і ПЕГ - ФРРМ (-/-
ДМФГ). ФРРМ становить собою ФРРМ 1-163, виділений із клітин Е. соїї, а ПЕГ - ФРРМ становить собою монопегілований ФРРМ 1-163, виділений із клітин Е. соїї. Співвідношення ДМФГ : ФРРМ і ДМФГ : ПЕГ -ФРРМ дорівнювало 100 :1 (моль : моль).
На Ффіг.28 показана ступінь адсорбції ПЕГ - ФРРМ (17/- ДМФГ) у скляні пробірки при різних концентраціях
ПЕГ - ФРРМ. ФРРМ становить собою ФРРМ 1 -163, виділений із клітин Е. соїї, а ПЕГ - ФРРМ становить собою монопегілований ФРРМ 1-163, виділений із клітин Е. соїї. Процент регенерації ПЕГ - ФРРМ (А) і ДМФГ: ПЕГ -
ФРРМ (В) був досліджений шляхом підрахунку кількості радіоміченого ФРРМ, регенерованого з скляних пробірок післі 18 - годинної інкубації при кімнатній температурі.
На Ффіг.29 показана послідовність ДНК і амінокислоти людського ФРРМ (5ЕО) 10. Мов: Ті 2), включаючи сигнальний пептид (амінокислоти від -21 до -1) і послідовність зрілої амінокислоти (1 - 332).
На Фіг.30 показан приклад відновленого алкілування сайт - специфічного ФРРМ у альфа - аміногрупі М - термінального залишку з використанням монометоксиполіетиленгліколевих альдегідів для одержання істотно монопегілованого продукту.
На Фіг.31 показана активність іп мімо ДМФГ : ФРРМ і ДМФГ: ПЕГ - ФРРМ у нормальних мишок, виходячи із підрахувань тромбоцитів. ФРРМ становить собою ФРРМ 1 - 163, виділений із клітин Е. соїї, а ПЕГ - ФРРМ становить собою монопегілований ФРРМ 1 - 163, виділений із клітин Е. соїї. Доза ДМФГ : ФРРМ і ДМФГ: ПЕГ -
ФРРМ дорівнювала 10Омкг/кг і ЗООмкг/кг, а співвідношення ліпід : білок дорівнювало 100 1.
Композиції згідно з даним винаходом більш детально описано у нижче наведеному розгляді і проілюстровано прикладами, які теж наведені нижче. Зазначені приклади показують різні аспекти цього винаходу і включають результати випробування стійкості та біологічної активності різних композицій білок : фосфоліпід. Несподівано, взаємодія білків з пухирцем ліпіду безпосередньо стабілізувала білкову структуру, стабілізуючи, таким чином, білок навіть за умовами, які викликають денатурацію білка при відсутності ліпіду.
Оральне введення хімічно модифікованої композиції Ф - СКЛ : фосфоліпід також наведено у цьому описі, використовуючи ф - СКЛ (як це описано вище), до якого прикріплені молекули поліетиленгліколю.
Для використання у цьому винаході призначені різні білки, що здатні до переходу у розплавлену сферичну структуру. Прикладами зазначених білків є цикотіни, включаючи різні гематопоетінові фактори, наприклад, раніш наведені Ф -СКЛ, ФМ - СКЛ, ФРРМ, М - СКЛ, інтерферони (альфа, бета, гамма), інтерлейкіни (1 - 11), еритропоетін (ЕПО), фактор росту нерва, фактор росту фібропласту, фактор стовбурових клітин, ВОМЕ, МТЗ, фактор росту виділених тромбоцитів і фактор росту новоутворювань (альфа, бета). Інші білки можуть бути оцінені по їх здатності до переходу у РОС. Якщо білок, про який іде мова, має здатність до переходу у РОС, тоді він далі може контактувати з негативно зарядженим пухирцем ліпосоми і можна оцінювати ефект стабілізування.
У загальному випадку Ф - СКЛ, що є придатним для використання у цьому винаході, може бути природного походження, виділеним у чистому виді із організмів ссавців або, у протилежному випадку, бути продуктом процесів хімічного синтезування або експресії екзогенних послідовностей ДНК прокаріотного або еукаріотного реципієнта, одержаних шляхом клонування геномної ДНК, або кДНК, або синтезу гена.
Придатними прокаріотними реципієнтами є різні бактеріальні клітини (наприклад, Е. соїї). Придатними еукаріотними реципієнтами є дріжджі (наприклад, 5. сегемівіає) і клітини ссавців (наприклад, яєчника китайського хом'яка, мавпи). У залежності від застосованого реципієнта продукт експресії ФМ - СКЛ може бути глікозилованим за допомогою ссавцевих або інших еукаріотних карбогідратів, або може бути неглікозилованим. У цьому винаході передбачено використання будь - якої або усіх отаких відів Ф - СКЛ, хоч найкращою формою за причинами найбільш комерційної придатності є рекомбінантний ФМ - СКЛ, особливо виділений із Е. соїїЇ.
Щоб Ф - СКЛ був хімічно модифікованим для використання в інтересах цього винаходу, він може бути природним людським Ф - СКЛ (плф - СКЛ) або продуктом придатка рекомобінантної нуклеїнової кислоти, наприклад, експресії прокаріотних або еукаріотних клітин - хазяїв. У загальному випадку передбачена хімічна модифікація становить собою прикріплення хімічної складової частини до самої молекули Ф - СКЛ. Стосовно до цього питання є огляд у статті Френкіса (Егепсів, "Роси оп Сгомп Еасіогв", З : 4 - 10 (Мау 1992) (Меаіїзвсгірі,
Моипіміеєж Соц, Епегп Ватеї І апе, Гопдоп, Ме20 ОГО, ОК), у якій описано модифікацію білка і злиті білки.
Також, наприклад, див. патент ЄПВ Ме0 401 384, який має назву "Хімічно модифікований фактор, стимулюючий колонію зернистого лейкоциту", у якому наведені речовини і способи одержання Ф - СКЛ, до якого прикріплені молекули поліетиленгліколю. Зазначене прикріплення може бути виконаним завдяки зв'язку безпосередньо з білком або з його складовою частиною, що діє як міст до активного агента. Для прикріплення найбільш стійким є ковалентний зв'язок. Хімічна модифікація може приймати участь у регулюючому, підтримуючому або розширюючому впливі Ф - СКЛ. Вона може, наприклад, впливати на регулювання кількості часу, що потрібен хімічно модифікованому Ф - СКЛ для досягнення кровообігу. Прикладом хімічного модифікатора є композиції поліетиленгліколю, включаючи його похідні.
Придатними для застосування у цьому винаході є будь-які препарати хімічно модифікованого ф - СКЛ, які дозволяють збільшувати ефективність його введення. Ефективність може бути визначена способами, відомими спеціалістам у цій галузі. Найкращими є пегіловані Ф - СКЛ, особливо пегіловані Ф - СКЛ, виділені із клітин Е. соїї, особливо найкращими є тритетрапегіловані Ф - СКЛ, виділені із Е. сої.
Було повідомлено, що ф - СКЛ є найбільш стійкими у кислому середовищі, незважаючи на той факт, що у діапазоні рН 2.95 - 5,0 відбувається структурна зміна, яка має наслідком послаблення тритинної структури і збільшення вмісту альфа - спіралі. Див. Мопйі еї аї., У. Ргоїєїп Спет. 10 : 359 - 367 (1991). Зазначена структурна зміна характерна для розплавленої сферичної структури (РОСС). Таким чином, як і у випадку створення композицій з іншими білками, здатними до переходу у РОСС, створення композицій з Ф - СКЛ повинно передбачати захист від термічно індукованого розгортання вторинної та тритинної структури з метою уникнення агрегування та денатурації.
ФМ - СКЛ, який є придатним для використання у цьому винаході, може бути природного походження, виділеним у чистому виді із організмів ссавців або бути продуктом експресії екзогенних послідовностей ДНК прокаріотного або еукаріотного реципієнтів, одержаних шляхом клонування геномної ДНК, або кДНнК, або синтезу гена. Придатними прокаріотними реципієнтами є різні бактеріальні клітини (наприклад, Е. соїЇ).
Придатними еукаріотними реципієнтами є дріжджі (наприклад, 5. сегемівіає) і клітини ссавців (наприклад, яєчника китайського хом'яка, мавпи). У залежності від застосованого реципієнта продукт експресії Ф - СКЛ може бути глікозилованим за допомогою ссавцевих або інших еукаріотних карбогідратів, або може бути неглікозилованим. У цьому винаході передбачено використання будь - якої або усіх отаких видів Ф - СКЛ, хоч найкращою формою за причинами найбільш комерційної придатності є рекомбінантний Ф - СКЛ, особливо виділений із Е. соїїЇ.
Термін "ФРРМ", що використовують у цьому описі, означає природний ФРРМ, усікання природного ФРРМ, а також неприродні поліпептиди, які мають амінокислотну послідовність та гліколізацію, що є достатньо ідентичними природному ФРРМ, що дозволяє мати біологічну активність, яка специфічно стимулює ріст, розвиток і/або вироблення мегакаріоцитів і/або тромбоцитів.
У найкращому варіанті ФРРМ є продуктом експресії послідовності екзогенної ДНК, яка трансфектована у еукаріотну або прокаріотну клітину -хазяїн; тобто, у найкращому варіанті ФРРМ становить собою "рекомбінантний ФРРМ". Найкращим еукаріотним хазяїном є клітини ссавців, особливо клітин ЯКХ, а найкращим прокаріотним хазяїном є бактерії, особливо Е. соїї. Рекомбінантний ФРРМ головним чином виготовляють згідно з операціями, які наведені у цьому описі і у публікаціях, цитуємих у цьому описі, що стосуються клонування і експресії ФРРМ.
Молекули деяких додаткових кращих ФРРМ мають отаки амінокислотні послідовності, які наведені на
Фіг.29:
ФРРМ 1-332 амінокислоти 1 - 332 на Фіг.29
ФРРМ 1-191 амінокислоти 1 - 191 на Фіг.29
ФРРМ 1-183 амінокислоти 1 - 183 на Фіг.29
ФРРМ 1-174 амінокислоти 1 - 174 на Фіг.29
ФРРМ 1-163 амінокислоти 1 - 163 на Фіг.29
ФРРМ 1-153 амінокислоти 1 - 153 на Фіг.29
ФРРМ 1-152 амінокислоти 1 - 152 на Фіг.29
ФРРМ 1-151 амінокислоти 1 - 151 на Фіг.29
ФРРМ 1-332 амінокислоти 1 - 332 на Фіг.29
ФРРМ 1-191 амінокислоти 1 - 191 на Фіг.29
ФРРМ 1-183 амінокислоти 1 - 183 на Фіг.29
ФРРМ 1-174 амінокислоти 1 - 174 на Фіг.29
ФРРМ 1-163 амінокислоти 1 - 163 на Фіг.29
ФРРМ 1-153 амінокислоти 1 - 153 на Фіг.29
ФРРМ 1-152 амінокислоти 1 - 152 на Фіг.29
ФРРМ 1-151 амінокислоти 1 - 151 на Фіг.29
У кожному із вищенаведених випадків на кінці послідовностей можуть бути включені амінокислоти Меї -
І ув.
У цьому винаході також передбачено використання різних аналогів ФРРМ. У значенні, яке використову ють у цьому описі, термін "аналог ФРРМ" відноситься до ФРРМ з однією або більше зміною у амінокислотній послідовності ФРРМ, що спричиняє зміну у типі (М - або О - зв'язок), кількості або розташуванні сайтів для прикріплення вуглеводу. Аналог(и) ФРРМ стримує(ють) принаймні еквівалентну біологічну активність порівняно з послідовностю природної ФРРМ (наприклад, ФРРМ людини) і може мати істотно більшу активність, як це було виміряно в аналізах на біологічну активність. Одержані у результаті аналоги ФРРМ можуть мати менше або більше (найкраще більше) вуглеводних ланцюгів, ніж природні людські/рекомбінантні
ФРРМ.
До аналогів, які використовують у цьому винаході, також включено аналоги, які мають одну або більше амінокислот, що відходять від карбоксикінця поліпептиду ФРРМ, де на протяжності карбоксикінця передбачено принаймні один додатковий вуглеводний сайт. Карбоксикінець поліпептиду ФРРМ змінюється залежно від певної форми використаного ФРРМ (наприклад, амінокислот ФРРМ 1 -132 або амінокислот ФРРМ 1 - 163). Додатковий вуглеводний сайт може бути додано до карбоксикінця поліпептиду будь-якого типу ФРРМ шляхом додання амінокислот до карбоксикінця поліпептиду, наприклад, амінокислот, які містять один або більше М - або О - зв'язаних сайтів глікозилування.
У цьому винаході також знайшли широке використання композиції на основі хімічно модифікованого
ФРРМ. Взагалі, передбачена хімічна модифікація становить собою продукт ФРРМ, у якому зазначений білок
ФРРМ зв'язан з принаймні однією молекулою поліетиленгліколю (тобто пегілованим ФРРМ). Пегілування
ФРРМ може бути виконано за допомогою будь-якої із відомих у цій галузі реакції пегілування. Див., наприклад : Босив ої СтгоуМйи Расіоїв З(2) : 4 - 10 (1992); патенти ЄПВ Ме0 154 316 та 0 401 384; та інші публикації, які наведені у цьому описі і які стосуються пегілування. Переважно пегілування виконують шляхом реакції ацилування або алкілування з молекулою реакційноздатного поліетиленгліколю або аналогічного реакційноздатного водорозчинного полімеру.
Пегілування за допомогою ацилування у загальному випадку включає реакцію активного ефірного деривату поліетиленгліколю (ПЕГ) з білком ФРРМ. Для здійснення пегілування ФРРМ можуть бути використані будь-які відомі або знайдені нещодавно молекули реакційноздатного ПЕГ. Найкращим ефіром активованого
ПЕГ є ПЕГ, який етерифікован до М - гідроксисукциниміду ("М - ГО"). У значенні, що використовують у цьому описі, термін "ацилування" передбачає включення без обмеження отаких типів зв'язків між ФРРМ і водорозчинним полімером, наприклад, ПЕГ : амід, карбамат, уретан та інші типи зв'язків. Див. Віосопійдаїе
Спет. 5: 133 -140 (1994). Умови проведення реакції можна вибирати із будь-яких відомих у техніці пегілування або із нещодавно відкритих, але необхідно уникати умови, наприклад, температуру, тип розчинника, рн, які можуть інактувати типи ФРРМ, що підлягають модифікації.
Пегілування за допомогою оацилування у загальному випадку спричиняє одержання продукту поліпегілованого ФРРМ, де лізинові епсілон - аміногрупи пегілують через ацилозв'язуючу групу. Найкращим сполучним зв'язком є амідний зв'язок. Також найкращим є те, щоб одержаний продукт був істотно тільки (наприклад, дорівнював або перевищував 9595) моно -, ди - або трипегілованим. Проте, деякі типи, що мають більш високий рівень пегілування (до максимального числа лізинових епсілон-амінокислотних груп ФРРМ їх одна альфа-аміногрупа НБ амінокінці ФРРМ), звичайно формуються у кількості, яка залежить від використанії специфічних умов реакції. При бажанні із суміші можна виділити більш очищен пегіловані зразки, зокрема зразки, що не прореагували, за допомогою стандартних способів очищення, включаючи серед інших діаліз, знесолювання ультрафільтрування, іоннообмінну хроматографію, гель - фільтрування електрофорез.
Пегілування за допомогою алкілування у загальному випадку включає реакцію кінцевого альдегідного деривату ПЕГ з білком, наприклад ФРРМ, у присутності відновника. Пегілування за допомогою алкілування може також привести до одержання поліпегілованого ФРРМ. Крім того, можливо маніпулювати умовами реакції, як це наведено у цьому описі, для сприяння пегілуванню головним чином, тільки у альфа- аміногрупі М - кінця зразків ФРРМ ( інакше кажучи, монопегілованих зразків). Ілюстративна реакція відновлювальногс алкілування ФРРМ для одержання монопегілованого продукту показана на Фіг.30, У будь - якому випадку монопегілування або поліпегілування групи ПЕГ переважно прикріплюються до білка через групу -СНо-МН -.
Відносно групи - СН»е - можна сказати, що у значенні, яке використовується у цьому описі, такий тип зв'язку має назву "алкільного".
Дериватизування через відновлювальне алкілування для одержання монопегілованого продукту використовує діференційну реакційну здатність різних типів первісних аміногруп (лізин відносно М-кінця), які придатні для дериватизування у ФРРМ. Зазначену реакцію виконують при величині рН (див, нижче), що дозволяє скористуватися різницями у значенні величини рКа між епсілон - аміногрупами лізинових залишків і рКа у альфа - аміногрупі М- кінцевого залишку білка. Завдяки подібному селективному дериватизуванню регулюється прикріплення водорозчинного полімеру, який містить реакційноздатну групу, наприклад альдегід, до білка : з'єднання з полімером має місце, головним чином, на М - кінці білка і не відбувається істотна модифікація інших реакційноздатних груп, наприклад, аміногруп з лізиновим боковим ланцюгом.
Таким чином, у переважному аспекті цей винахід належить до пегілованих ФРРМ, де ПЕГ - групаси) прикріплюється через ацилову або алкільну групи. Як показано вище, зазначені продукти можуть бути монопегілованими або поліпегілованими (наприклад, що містять 2 - 6, найкраще 2-5 груп). У загальному випадку, ПЕГ - групи прикріплюються до білка у альфа - або епсілон - групах амінокислот, але також передбачено, що ПЕГ - групи можуть бути прикріпленими до будь-якої аміногрупи, яка, у свою чергу, прикріплена до білка, який є істотно реакційноздатним, щоб бути прикріпленим до ПЕГ - групи при придатних умовах реакції.
Молекули полімеру, що використовують як при ацилуванні, так і при алкілуванні, можуть бути вибрані серед водорозчинних полімерів або їх суміші. Вибраний полімер повинен бути водорозчинним так, щоб білок, до якого він прикріплюється, не осаджувався у водному середовищі, наприклад у фізіологічному розчині.
Вибраний полімер повинен бути модифікованим таким чином, щоб мати одну реакційноздатну групу, наприклад активний ефір для ацилування або альдегід для алкілування. Найкраще, щоб ступінь полімерізації можна було регулювати, як це передбачено у існуючих способах. Найкращий реакційноздатний ПЕГ - альдегід становить собою поліетиленгліколь пропіональдегід, який є водорозчинним, або його моно - (С1 - С10) алкокси або арилокси похідні (див. патент США Ме5 252 714). Зазначений полімер може бути розгалуженим або нерозгалуженим. Найкраще, щоб для терапевтичного використання препарату кінцевого продукту полімер був фармацевтично придатним. Водорозчинний полімер може бути вибран із групи, що містить, наприклад поліетиленгліколь, монометоксиполіетиленгліколь, декстран, полі(М-вініл пірролідон) поліетиленгліколь, гомополімери поліетиленгліколю, кополімер оксид поліпропилену/оксид етилену, поліоксиетиловані поліоли (наприклад, гліцерин) і полівініловий спирт. Для здійснення реакції ацилування вибраний полімер(и) повинен мати одну реакційноздатну ефірну групу. Для даного відновлювального алкілування вибраний полімер(и) повинен мати одну реакційноздатну альдегідну групу. У загальному випадку, водорозчинний полімер не вибирають із природних глікозильних залишків, оскільки їх звичайно одержують більш зручно за допомогою систем рекомбінантної експресії ссавців. Полімер може мати будь-яку молекулярну вагу і може бути розгалуженим або нерозгалуженим.
Особливо кращим водорозчинним полімером для використання у цьому винаході є поліетиленгліколь
(скорочено ПЕГ). У значенні, яке використовується у цьому описі, термін поліетиленгліколь включає будь-які форми ПЕГ, що застосовують для дериватизування інших білків. Наприклад, моно - (С1 - С10) алкокси - або арилокси- поліетиленгліколь. Способи виготовлення пегілованого ФРРМ звичайно включають етапи (а) реагування поліпептиду ФРРМ з поліетиленгліколем (наприклад, з реакційноздатним ефіром або альдегідною похідною ПЕГ) за умовами, при яких ФРРМ прикріплюється до однієї або більше груп ПЕГ, і (б) одержання продукту(ів) реакції. У загальному випадку, оптимальні умови здійснення реакції ацилування визначають у залежності від конкретного випадку на основі відомих параметрів і бажаного результату. Наприклад, чим більше співвідношення ПЕГ : білок, тим більше процентний вміст поліпегілованого продукту.
Другим важливим параметром, який приймається до уваги, є молекулярна вага полімеру. Звичайно, чим вище молекулярна вага полімеру, тим менше кількість молекул полімеру, які можуть бути прикріпленими до білка. Таким же чином, відгалуження полімеру необхідно ураховувати при оптимізації зазначених параметрів.
Звичайно, чим вище молекулярна вага ( або більше бокових ланцюгів), тим більше співвідношення полімер : білок. У загальному випадку, для здійснення передбачених у цьому винаході реакцій пегілування найкраща середня молекулярна вага складає від приблизно 2кДа до приблизно 100кДа (термін "приблизно" означає ж/- 1кДа). Найкраща середня молекулярна вага складає від приблизно 5кДа до приблизно 50кДа, особливо найкраща від приблизно 12кДа до приблизно 25кДа і найбільш найкраща - 20кДа. Співвідношення водорозчинного полімеру і білка ФРРМ звичайно знаходиться у діапазоні від 1 : 1 до 100 : 1, найкраще ( для поліпегілування) у діапазоні від 1 : 1 до 20: 1 і (для монопегілування) у діапазонівіді!0: 1 до5:1.
Використовуючи зазначені вище умови, відновлювальне алкілування забезпечує селективне прикріплення полімеру до будь-якого білка ФРРМ, що має альфа-аміно групу на амінокінці, та забезпечує істотно гомогенне одержання кон'югату монополімер/білок ФРРМ. Термін "кон'югат монополімер/білок ФРРМ" використовується у цьому описі для позначення композиції, що складається із однієї молекули полімеру, яка прикріплена до молекули білка ФРРМ. Кон'югат монополімер/білок ФРРМ найкраще має молекулу полімеру, що розташована на М - кінці, але не на лізин аміно бокових групах. Найкраще, щоб препарат становив собою більше, ніж на 9095 кон'югат монополімер/білок ФРРМ, і особливо найкраще - більше, ніж на 9595 кон'югат монополімер/білок
ФРРМ, причому залишок молекул, які розглядають, не вступили до реакції ( тобто, білок, якому бракує частини полімеру). Нижченаведені приклади забезпечують одержання препарату, який становить собою принаймні приблизно на 9095 кон'югат монополімер/білок і приблизно на 1095 білок, який не вступив у реакцію. Кон'югат монополімер/білок має біологічну активність.
Ліпідні пухирці, які використовують у композиціях стосовно цього винаходу, становлять собою негативно заряджені ліпосоми, що здатні взаємодіяти з білком, про який йде мова. Специфічні ліпосоми, які передбачено використовувати у цьому винаході, включають діолеоїлфосфатидил гліцерин (ДОФГ), диміристоїлфосфатидилгліцерин (ДМФГ), дипальмітоїлфосфатидилгліцерин (ДПФГ),, монтежюфосфатидилгліцерин, діолегїлфосфатидил етанол амін (ДОФЕ), монтежюфосфатидилетаноламін, діолеглфосфатидилова кислота (ДОФК), диміристоїлфосфатидилова кислота (ДМФК), дипальмітоїлфосфатидилова кислота (ДПФЮК), діолеїлфосфатидилсерин (ДОФОС), диміристоїлфосфатидилсерин (ДМФС), дипальмітоїфосфатидилсерин (ДПФС), монтежюфосфатидилсерин, лізофосфатидилгліцерин, лізофосфатидилетаноламін, лізофосфатидилсерин. Залежно від специфічної ліпосоми, яку використовують, її кількість може змінюватись.
Композиції білок : фосфоліпід найкраще включають буферний агент для підтримування величини рн розчину у межах необхідного діапазону. Найкращі зазначені агенти включають ацетат натрію, фосфат натрію і цитрат натрію. Також можна використовувати суміші цих буферних агентів. Кількість буферного агента, який використовується у зазначеній композиції залежить, значною мірою, від певного буфера, який використовується, і від рН розчину. Наприклад, ацетат є більш ефективним буфером при рн, який дорівнює 5, ніж при рН, який дорівнює б, таким чином, менше ацетату може бути використано у розчині при рН, який дорівнює 5, ніж при рН, який дорівнює 6. Найкращим діапазоном величин рН для композицій відповідно до цього винаходу є діапазон величин рн, який складає 3,0 -7,5.
Композиції відповідно до цього винаходу можуть, крім того, включати агент, який регулює ізотонію, для того, щоб зробити розчин ізотонічним і більш сумісним для ін'єкції. Найбільш кращим агентом є хлорид натрію у межах діапазону концентрації, який складає 0-150мММ.
Цей винахід охоплює також фармацевтичні композиції, які містять ефективну кількість поліпептидних продуктів відповідно до цього винаходу разом з фармацевтично придатними розчинниками, консервантами, солюбілізаторами, емульсифікаторами, ад'ювантами і/або носіями. Зазначені композиції впливають на фізичний стан, стійкість та біопридатність білка. Дивись, наприклад, Нетіпдіоп5 Рпаптасеціїса! Зсіепсев, 181п
Еайоп, 1435 - 1712 (Маск Рибіїзпіпд Со., Еазіоп, РА., 1990), що використовується у цьому описі як посилання.
Ефективна кількість білюа у певному випадку залежить від різних факторів, які досвідчений у цій галузі фахівець бере до уваги, включаючи бажаний терапевтичний результат, серйозність стану або захворювання, яке необхідно вилікувати, фізичний стан суб'єкта і т.і.
У найкращому варіанті, який включає застосування рлф - СКЛ, одержаного із Е. соїї, використаний ліпосомний пухирець становить собою ДОФГ із співвідношенням ДОФГ : Ф - СКЛ, яке дорівнює 50: 1, при рН - 4,5, який містить 10мММ ацетату натрію.
У найкращому варіанті, який включає застосування рлФМ - СКЛ, одержаного із Е. соїї, використаний ліпосомний пухирець становить собою ДОФІГ із співвідношенням ДОФГ : ФМ - СКЛ, яке дорівнює 171, при рн 7,0, у фосфатному буферному фізіологічному розчині (ФБФР).
У найкращому варіанті, який включає застосування рлфФ - СКЛ, одержаного із Е. соїї, який був хімічно модифікован (пегілован), рлф - СКЛ є тритетрапегілованим, використаний ліпосомний пухирець становить собою ДОФІГ із співвідношенням ДОФГ : ПЕГ -ф - СКЛ, яке дорівнює 17:1, при рН 4.5.
У найкращому варіанті, який включає застосування ФРРМ 1 - 163, одержаного із Е. соїї, використаний ліпосомний пухирець становить собою ДОФГ із співвідношенням ДОФГ : ФРРМ, яке дорівнює 100 : 1, при рН 5,0, у 10мМ 595-ого сорбітолу ацетату натрію.
У найкращому варіанті, який включає застосування ФРРМ 1 - 163, одержаного із Е. соїї, який був хімічно модифікован (пегілован), ФРРМ є монопегілованим (20кДа) за допомогою відновлювального алкілування, використаний ліпосомний пухирець становить собою ДОФГ із співвідношенням ДОФГ : ФРРМ, яке дорівнює 100: 1, при рН 5,0, у 10мМ 595-ого сорбітолу ацетату натрію.
У найкращому варіанті, який включає застосування ФРРМ 1 - 332, одержаного із ЯКХ, використовуваний ліпосомний пухирець становить собою ДОФГ із співвідношенням ДОФГ : ФРРМ,, яке дорівнює 100 : 1, при рН 5,0, у 10мМ 595-ого сорбітолу ацетату натрію.
Хоч цей винахід був описан і проілюстрован відносно специфічних композицій білок : ліпід та способів лікування, фахівцям у цій галузі ясно, що може існувати цілий ряд родинних композицій і способів лікування, не виходячи за межі об'єму цього винаходу.
Отакі приклади ілюструють більш детально різні аспекти цього винаходу.
Приклад 1
Первісні експерименти виконували для дослідження можливості введення рекомбінантної Ф - СКЛ людини (рлф - СКЛ) у ліпідний пухирець, рлф - СКЛ виготовляли, використовуючи технологію одержання рекомбінантної ДНК, у якій клітини Е. соїї трансфектували в послідовність ДНК, що кодує Г-СКЛ людини, як це описано у патенті США Ме4, 810, 643 (винахідник - 5ойга). рлф - СКЛ виготовляли у вигляді розчину 4 мг/мл в розчиннику НСІ, рН - 4,0. Усі ліпіди були одержані за допомогою приладу Амапії Роїаг І іріа5 (Аіабавіег, Аа) і їх зберігали при температурі - 20"7С у азотній атмосфері при кінцевій концентрації, що дорівнювала 100 мг/мл у хлороформу.
Виготовлення комплексів Ф - СКЛ : Фосфоліпід
Для одержання ліпідних пухирців з метою об'єднання з Ф - СКЛ 30 мкмолей придатного ліпіду наливали у скляну пробірку і висушивали до стану тонкої плівки, використовуючи потік азоту. Ліпідні плівці висушували принаймні протягом двох годин у вакуумі з метою видалення будь-яких слідів хлороформу. Ліпідні плівці гідратували у їмл або дистильованої деіонізованої води (ддНгО), фосфатному буферному фізіологічному розчині, при рН 7.2 (Сірсо/ВвВІ "О-РВ5"), або у 150мМ МасСі. Потім зразки обробляли ультразвуком у спеціальному пристрою на зразок ванни (Гарогаюгу Зирріїєв, Ніскемійє, М.У.). Обробку ультразвуком продовжували, поки зразки не ставали оптично чистими (звичайно протягом 10-15 хвилин). До використання зразки зберігали при температурі 4"С у атмосфері азоту. Кінцева "ліпідна концентрація становила ЗОММ. У іншому випадку, ліпідні пухирці можна було виготовляти таким чином: 300 мкмолей ліпіду сушити у атмосфері азоту, а потім висушувати так, як це зазначено вище. Висушені ліпідні плівці гідратували у 10мММ придатного водного розчину, як це описано вище. Потім зразки мікрофлюїдизували у лабораторному емульсифікаторі (Місгойцідісв Моде! 1105, Місгойміаїсв, Іпсо. Саторпдде, МА), при тиску, що дорівнював 10 000 фунтів на дюйм? (приблизно 70 000кПа). Зазначені зразки піддавали повторному температурному циклуванню протягом 10 циклів. Далі мікрофлюїдизовані зразки зберігали при температурі 4"С, як це описано вище.
Комплекси Ф - СКЛ : фосфоліпід виготовляли шляхом змішування Ф - СКЛ (як це описано вище) з певним ліпідом (як це описано вище). Змішування виконували шляхом вихрового руху, збовтування або слабкої вібрації. Були виготовлені розчини з різним молярним співвідношенням ліпід : Ф - СКЛ з метою оцінки введення мембрани та стабілізації білка. Наприклад, для приготування З мл зразка (у воді), який становить собою 0,2мг/мл фФ - СКЛ при молярному співвідношенні ліпід : Ф - СКЛ, що дорівнює 40 : 1, 150мкл вихідного Ф - СКЛ з'єднують з 44 мкл ліпіду (ЗО мМ сировини, виготовленої у воді за допомогою ультразвукової обробки) і додають води до досягнення кінцевого об'єму зразка, що дорівнює З мл. Рекомендовано здійснювати інкубування (але необов'язково) протягом п'яти хвилин і воно було здійснено перед використанням або випробуванням зразка.
Г.- СКЛ можна також з'єднувати з гідратним ліпідом до здійснення операції мікрофлюїдизування.
Подальше мікрофлюїдизування сумішів, як описано вище, веде до введення Ф - СКЛ у ліпідну мембрану.
Аналіз комплексів Ф - СКЛ : Фосфопіпід 1. Спектр світіння триптофану.
Існує два залишки триптофану у рлфФ - СКЛ, які є досить чутливими до умов місцевого навколишнього середовища. Через те аналіз виконували з метою визначення флуоресценції триптофану рлФ - СКЛ коли рлФ - СКЛ контактує з ліпосомою. Блакитний зсув у максимумі флуоресцентного світіння підтверджує той факт, що триптофани знаходяться у більш гідрофобному навколишньому середовищі і тому рлФ - СКЛ був залитим у ліпідних мембранах. Добрий огляд, який стосується аналізу флуоресценції триптофану, зроблен .). І акомісг у роботі "Рііпсірієв ої Ріпогезсепсе Місгозсору, Спар 11 (Рієпит Ргезв, Мем/ Хогк, 1983).
Флуоресценцію триптофану комплексів Ф - СКЛ : ліпід (як це описано вище) аналізували шляхом збудження зразків при довжині хвилі, що дорівнювала 280нм, одночасному скануванні світіння у діапазоні від 285нм до 420нм з інтервалом нм і при швидкості сканування Інм/сек. Об'єм зразка становив Змл, а кінцева концентрація Ф - СКЛ для усіх зразків становила 0,2мг/мл. Співвідношення ліпід : Ф - СКЛ змінювали. Усі вимірювання флуоресценції здійснювали, використовуючи флуорометр типу РТІ АІрпазсап (Зошй Вгипвуліск,
МУ). Усі вимірювання виконували при температурі 25"С, причому зазначену температуру підтримували на цьому рівні, використовуючи резервуар з водяною оболонкою, який був з'єднай з водяною банею з циркулюючою водою. Спектр світіння знімали і аналізували, використовуючи математичне забезпечення, що постачає РТІ.
Спектр флуоресценції рлФ - СКЛ у присутності та при відсутності невеликих одношарових пухирців, які містять ДОФГ, показан на Фіг.1. рлФ - СКЛ має максимум світіння при довжині хвилі 334нм при відсутності пухирців ДОФГ. У присутності ДОФГ при співвідношенні ліпід : білок, що дорівнює 100 : 1, флуоресценція триптофану рлф.. - СКЛ має блакитний зсув при максимумі флуоресцентного світіння при довжині хвилі 327нмМ і різке збільшення інтенсивності флуоресценції. Невелика довжина хвилі флуоресцентного світіння у присутності ДОФГ дає можливість припустити, що триптофани знаходяться у більш гідрофобному навколишньому середовищі, ніж природний білок. Як показано на Ффіг.2, зсуви флуоресценції залежать від молярного співвідношення ДОФГ : фФ -СКЛ, а мембранна інсерція виявляється одразу, коли співвідношення
ДОФГ: Ф - СКЛ досягає 10: 1. 2. Експерименти по гасінню за допомогою йодиду.
Йодид становить собою ефективний гасник флуоресценції триптофану, але він не може проникати крізь ліпідні мембрани. Тому ефективне гасіння флуоресценції триптофану за допомогою йодидів свідчить про незахищеність залишків від водного розчинника, у той час, коли захист від йодидного гасіння є можливим при умові, що триптофани білка є виділеними із водного розчинника. У цих експериментах використовували Ф -
СКЛ і композицію ДОФГ : Ф - СКЛ (при співвідношенні ліпід : білок 100 : 1). Після того, як були зібрані і записані первісні відліки (Бо), вимірювали інтенсивність флуоресценції після додавання збільшеної кількості (5М) йодиду калію (КІ). Як зразок, так і розчини КІ готували таким чином, щоб вони містилиїмМ Ма5Оз (кінцева концентрація) згідно із способом, який описан І єє еї аі,. Віоспет. Віорпуз. Асіа. 984: 174 - 182 (1989) І Ге ЮОоап еї. аі,. Віоспет. Віорпувз. Асіа, 858 : 1 - 5 (1986). Додавання Маг»5Оз захищає від утворення !г, який може розподілятися на неполярні ділянки білків і мембран. Дані були проаналізовані за допомогою рівнення Штерна - Вольмера (Бо/Б - 1 - КкІКІЇ), де Ео і Е є інтенсивностями флуоресценції зразків при відсутності та у присутності, відповідно, КІ при концентрації (КІ| . Ккі становить собою постійну гасіння Штерна - Вольмера, яку використовують для розрахунку при аналізі гасіння залишків триптофану Ф - СКЛ за допомогою КІ.
Графіки, побудовані по даним рівнення Штерна - Вольмера, показані на Ффіг.3. При відсутності пухирців
ДОФГ флуоресценція рлФ - СКЛ ефективно гаситься за допомогою КІ. У присутності ДОФГ дані зазначеного графіка Штерна - Вольмера є лінійними, указуючи на те, що йодид має поганий доступ до обох триптофанів.
Дані показують, що залишок триптофану, який є йодид-доступним при відсутності ДОФГ, стає йодид - недоступним у присутності ДОФГ. Тому частина рлф - СКЛ, яка містить цей триптофан, повинна бути залита у бішар ДОФГ. 3. Вимірювання перенесення енергії
Як показано раніше, перенесення енергії може діятися між триптофановими донорами і ліпідними розчиненими флуоресцентними акцепторами, наприклад, пірендеканова кислота, оскільки спектр збудження цього зонда набагато перекриває спектр світіння триптофану. Див. ЕпПеге еї. аі., Віоспетівігу 22 : 1675 -1680 (1983). Якщо білок проникає у ліпідні мембрани, перенесення енергії із триптофану до пірена веде до гасіння флуоресценції триптофану. У цьому експерименті інтенсивність світіння триптофану різних комплеків ліпід: Ф - СКЛ записували перед (Ро) і після (Е) додатку різної кількості пірендекановой кислоти (ЗОмкг/мл вихідного розчину у тетрагідрофурані). З метою стимулювання утворення суміші пірендеканової кислоти і зразка їх постійно перемішували протягом додавання пірендеканової кислоти. Співвідношення Б/Бо є пропорційним кількості перенесення енергії яке має місце між триптофанами Ф - СКЛ і пірендекановою кислотою гідрофобного акцептора енергії.
На Ффіг.4 показан профіль гасіння для рлФ - СКЛ у присутності ДОФГ (при співвідношенні ліпід/білок, що дорівнює 100 : 1), як функція доданої пірендеканової кислоти. Гасіння здійснюється при дуже низьких концентраціях пірендеканової кислоти (менш 1 молевого процента), тому вплив флуоресцентного зонда на структуру і поведінку мембрани є мінімальним. Оскільки, як можна очікувати, пірендеканова кислота швидко поділяється на ліпідні бішари, зазначені дані показують, що рлф - СКЛ заливаються достатньо глибоко у мембрани ДОФГ, щоб дозволити ефективне перенесення енергії із триптофану до піренового акцептору.
Перенесення енергії підтверджується дослідженням спектру збудження пухирців міченого пірендекановою кислотою ДОФІГ у присутності і при відсутності рлФ -СКЛ.
Вищенаведений аналіз показує, що рлФ - СКЛ може тісно взаємодіяти з ненагодованим фосфоліпідом типу ДОФГ. У присутності пухирців ДОФГ, триптофан рлфФ - СКЛ є захищеним від водорозчинного гасника флуоресценції, але для гасіння через перенесення енергії до гідрофобного флуоресцентного зонда це має істотне значення. Узяті разом зазначені дані показують, що рлФ - СКЛ можуть включитися до мембран, що створені із ДОФГ. Інсерція до мембрани виявляється одразу після досягнення співвідношення ліпід : Ф - СКЛ, яке дорівнює 10 : 1, і це число може характеризувати число ліпідів, які оточують інсерційну ділянку білка.
Приклад 2
У цьому прикладі здатність рлФ - СКЛ до взаємодії з іншими фосфоліпідами визначали шляхом використання порівняння максимумів інтенсивності Ео/Е і світіння, як це описано вище. У кожному прикладі молярне співвідношення ліпід : рлФ - СКЛ дорівнювало 100 : 1. На Ффіг.5 показано дані про Р/Ео, що стосуються рлф - СКЛ у присутності і при відсутності різних ліпідів. На Фіг.б показано дані, що стосуються максимального світіння для вищезазначених композицій. Дані, що наведені на Фіг.5 і Фіг.б, показують, що крім включення до
ДОФГ, рлфФф - СКЛ можуть включатися до ДМФГ, ДПФІГ і з меншою ефективністю до фосфатидилетаноламінів (ФЕ) і фосфатидилсеринів (ФС) . Крім того, було знайдено, що МО (негативні) - ДОФЕ (зразок ДОФЕ, де головну групу ФЕ робили негативною) забезпечує більш підвищену інсерцію рлФ - СКЛ, ніж ДОФЕ.
ДОФХ, ДМФХ і ДПФХ є нейтральними ліпідами і ці пухирці мали невеликий, якщо мали взагалі, вплив на максимум світіння або інтенсивність флуоресценції рлФ - СКЛ, показуючи тим самим, що він не взаємодіє з зазначеними фосфоліпідами (див. Фіг.5 і 6 та криву 2 на Фіг.7).
Вищенаведені дані показують, що білок, здатний до переходу у розплавлену сферичну структуру, може включатися у пухирці різних ліпідів. Однак, зазначена взаємодія рлФ - СКЛ : ліпід стається тільки тоді, коли використовують негативно заряджені ліпідні пухирці. Здається, що серед негативно заряджених ліпідних пухирців, пухирці , що мають більший негативний заряд, забезпечують більш сильну взаємодію ліпід : рлФф -
СКЛ.
Приклад З
У цьому прикладі визначали вплив взаємодії ДОФГ : рлфФ - СКЛ відносно стійкості білка. Вимірювання кругового дихроїзму виконували на приладі давсо - 720 з приробленою термостатированою камерою для клітин типу Реег і магнітною мішалкою. Вимірювали круговий дихроїзм при довжині хвилі 222нм, використовуючи кінцеву концентрацію рлФ - СКЛ, що дорівнювала 80 мкг/мл при рН - 6,0. Калоріметричні вимірювання при диференційному скануванні виконували з застосуванням калоріметра Місгоса! МС - 2. Зразки рлф - СКЛ (мг/мл, у воді) або ДОФГ : рлф - СКЛ, у воді (45 : 1, моль : моль) сканували з швидкостю 907С у годину. Дані зберігали і аналізували, використовуючи програму математичного забезпечення Місгосаї).
Температурно-індуковані зміни у альфа - спіральності Ф - СКЛ можуть бути супроводжені вимірюванням кругового дихроїзму на довжині хвилі 222нм як функції підвищення температури. Термічно - індуковане розгортання рлф - СКЛ при рН - 6,0 показано на фіг.8. Крива показує, що вибуховий перехід здійснюється при температурі -607С - -70"С, що веде до утрати альфа - спіральності. Після зазначеного переходу рлф - СКЛ необоротньо осаджували із розчину. Температурний діапазон розгортання є аналогічним температурі плавлення рлф - СКЛ при рН - 7,0, як це визначено "за допомогою диференційно скануючої калоріметрії (див.
Фіг.9).
У протилежність цьому зразки ДОФГ : рлф - СКЛ показують поступову утрату альфа - спіральності при підвищенні температури і, на відміну від рлФ - СКЛ у чистому вигляді, температурно - індуковане розгортання
ДОФГ : рлф - СКЛ певно не є кооперативним (див. Фіг.8). Цей висновок також підтверджується відсутносте плавкого переходу, що демонструється за допомогою диференційної скануючої калоріметрії (Фіг.9). Цікаво, що зразки ДОФГ : рлФ - СКЛ можуть відновлювати альфа - спіральність після нагрівання до 95702 і можуть циклічно повторюватись у діапазоні 9570 - 1072 з повним відновлюванням спіральності після охолодження (див. Фіг.10). При цих умовах рлФ - СКЛ у чистому вигляді безповоротно розгортується і осаджується із розчину.
Були досліджені також впливи ДМФГ і ДПФГ на круговий дихроїзм Ф - СКЛ. Використовували співвідношення ліпід : рлФ - СКЛ, що дорівнювало 150 : 1, і як це було у випадку з ДОФГ, ДМФГ і ДПФГ також стабілізують вторинну структуру рлФ -СКЛ (фіг.11 - 13).
Зазначені дані показують, що взаємодія рлф - СКЛ з ДОФГ, ДМФІГ і ДПФГ підвищує стійкість білка при умовах, коли рлфФ - СКЛ у чистому вигляді є нестійким. Взаємодія безпосередньо стабілізує вторинну і тритинну структури рлФф - СКЛ.
Приклад 4
У цьому прикладі визначали вплив взаємодії рлфФ - СКЛ : ДОФГ відносно біологічної активності рлФ - СКЛ.
Активність рлФ - СКЛ іп міо аналізували, використовуючи залежність поглинання рлФ - СКЛ НІ -тимідину клітинами кісткового мозку мишок, як це описано 25еро еї аї., Іттипобріооду 172 - 175 - 184 (1986). Усі дослідження , що стосуються активності, виконували потрійно. Активність іп міо визначали шляхом внутрішньошкірної ін'єкції хом'яка (доза рлф - СКЛ дорівнює 100мкг/кг) і вимірювання числа білих кров'яних клітин (БКК). 1. Активність іп міт
А. Визначали питому активність рлф - СКЛ у присутності і при відсутності ДОФГ. Також досліджували термооброблені зразки рлф - СКЛ і ДОФГ: Ф - СКЛ. Одержані результати узагальнені у Таблиці 1.
Таблиця 1
Питома
Зразок активність (Од/мг/білок)
ДОФГ: рлф - СКЛУ (наїгрітий)? а Перед проведенням дослідження зразок інкубували протягом 10 хвилин при температурі 85"С у водяній бані. 6 Співвідношення ДОФГ : рлф - СКЛ дорівнює 50 : 1 (моль/моль).
Як показано у Таблиці 1, інсерція у бішари ДОФГ не має шкодливого впливу на біологічну активність рлф -
СКЛ. Після нагрівання до 857"С протягом 10 хвилин рлф - СКЛ має недетектовану активність і білкові осадження. Після аналогічної обробки ДОФГ : рлф - СКЛ зберігає активність, що дорівнює приблизно 8595 відносно активності ненагрітого рлФ - СКЛ і повністю відновлює вторинну структуру після охолодження.
Б. Також досліджували здатність різних ліпідів до стабілізування рлф - СКЛ при ліофілізації. Зразки рлф -
СКЛ у комбінації з різними ліпідами ліофілізували і аналізували, як це описано вище, з метою дослідження активності. ДОФГ, ДМФГ ії ДПФГ при перемішуванні з рлФ - СКЛ дозволяють досягнути приблизно 100- процентного зберігання біологічної активності рлФ - СКЛ після ліофілізації (див. Фіг.14). рлф - СКЛ у чистому вигляді не витримує процесу ліофілізації. 2. Активність іп мімо
Визначали активність (число БКК) рлФ - СКЛ при відсутності і у присутності ліпіду. Активність вимірювали після внутрішньошкірної ін'єкції (доза рлФ - СКЛ дорівнює 100мкг/кг) на нульовий день. Були проаналізовані п'ять різних комплексів ліпід : рлфФ - СКЛ і у кожному випадку комплекс ліпід : рлФ - СКЛ утримував активність їп мімо (Фіг.15 і 16).
Вищенаведені дослідження показують, що інсерція у негативно заряджені ліпідні бішари не має шкодливого впливу на біологічну активність рлф - СКЛ. Крім того, здається, що захисний ефект ліпіду захищає рлф - СКЛ у процесі ліофілізації.
Приклад 5
У цьому прикладі хімічно модифікований Ф - СКЛ (пегілований Ф - СКЛ (ПЕГ - Ф - СКЛ)) і Ф - СКЛ, одержаний як продукт експресії еукаріотних клітин -хазяїв (ЯКХ - Ф - СКЛ) були досліджені на їх здатність взаємодіяти з негативно зарядженими ліпідними пухирцями. Для ЯКХ -ф - СКЛ визначення робили з використанням порівнянь максимумів інтенсивності Р/Ко і світіння (як це описано у вищенаведеному прикладі 1). У кожному випадку молярне співвідношення ліпід : білок дорівнювало 100 : 1. Для ПЕГ - Ф - СКЛ визначення базувалося на аналізі кругового дихроїзму.
Застосований ЯКХ - Ф - СКЛ одержували, використовуючи технологію рекомбінантної ДНК, при якій клітини яєчнику китайського хом'яка (ЯКХ) трансфектували за допомогою послідовності ДНК, яка кодує Ф -
СКЛ людини, як це описано у патенті США Ме4 810 643 (винахідник - 5оига). ЯКХ - Ф - СКЛ виготовляли у вигляді розчину (0,бмг/мл, рН - 7,0). Було показано, що ЯКХ - Ф - СКЛ взаємодіє з ДОФГ таким же чином, як і рлф - СКЛ, причому кожний зразок має збільшену інтенсивність флуоресценції у присутності ДОФГ, а також блакитний зсув у максимумі світіння у присутності ДОФГ (Фіг.17 і 18). Таким чином, взаємодія ДОФГ не є слідством деякої особливості рекомбінантної форми ф - СКЛ.
ПЕГ - Ф - СКЛ, який застосовували у цих експериментах, становив собою тритетрапегілований Ф - СКЛ, виділений із клітин Е. соїї (використовуючи ПЕГ б 000). Зразки ДМФГ : ПЕГ -Ф - СКЛ (17 : 1, моль/моль) виготовляли за допомогою вищенаведених процедур. Було знайдено, що зразки ДМФГ : ПЕГ - Ф - СКЛ повністю відновлюють вторинну структуру після нагрівання (Фіг. 19). Незважаючи на присутність молекул ПЕГ, дериватизований білок мав здатність до взаємодії з ліпідом таким же чином, як і природний білок.
Вищенаведені дані показують, що ефекти стабілізування, пов'язані з взаємодією Ф - СКЛ з негативно зарядженим ліпідним пухирцем, не є особливостю тільки рлФ - СКЛ, одержаного як продукт експресії прокаріотної клітини - хазяїна. Хімічно модифікований білок, здатний до переходу у РОСС і який контактує з пухирцем ліпосоми, у даному випадку ПЕГ - ф - СКЛ : ДМФГ, також показав ефекти стабілізування.
Приклад 6
У цьому прикладі досліджували вплив ДМФГ і ДПФГ на ФМ - СКЛ. Зазначений ФМ - СКЛ становив собою рекомбінантний людський ФМ - СКЛ, описаний у патенті США Мо 5 047 504 ( винахідник - Воопе), який був виготовленим у вигляді розчину у фосфатному буферному фізіологічному розчині (ФБФ) (мг/мл), рН : 7,0.
Було використано співвідношення ліпід : ФМ - СКЛ, що дорівнювало 17 : 1. Теплову стійкість вимірювали, застосовуючи вищенаведений аналіз кругового дихроїзму. ДМФГ і ДПФГ можуть привести до кращої теплової стійкості ФМ - СКЛ, тобто до відновлювання вторинної структури після нагрівання (Ффіг.20а і 20в).
Ці дані характеризують інший приклад білка, здатного до переходу у розплавлену сферичну структуру, взаємодіючого з негативно зарядженим ліпідним пухирцем з метою забезпечення кращої теплової стійкості білка.
Приклад 7
У цьому прикладі комплекс ДОФГ : ПЕГ - Ф - СКЛ використовували для оцінки можливості збільшення терапевтичного ефекту, що справляє Ф - СКЛ після зовнішнього застосування. Для цього експерименту ДОФГ готували, як це описано у прикладі 1, а ПЕГ - Ф - СКЛ готували, як це описано у прикладі 5. 100мкМ ліпіду (797 мкл) зневоджували у вакуумі, а далі з метою одержання 100 мМ - ого розчину ліпіду додавали їмл води.
Зазначений розчин оброблювали ультразвуком протягом 5 хвилин у ультразвуковій водяній ванні (Модель с 1125Р1Т від лабораторії гар. Зирріу Іпс., Нікеуйе, М.У.) або доки ліпідний розчин не ставав прозорим.
Додавали 9УмкМ розчину ДОФГ (90мкл) до 90нМ природногорлФ - СКЛ або ПЕГ - ф - СКЛ у 1мМ Неї. Розчин завіхрювали і доводили до кінцевого об'єму, що дорівнював 2мл, за допомогою 1мМ Неї. Для внутрішньодуоденального застосування у пацюків речовину розміщували у осмотичний насос, який імплантували до тварини. Висвободження речовини відбувалося протягом 24 годин.
Результати загального аналіза БКК для тварин, які одержали як рлф - СКЛ, такі ПЕГ - Ф - СКЛ у присутності та при відсутності ліпіду, показані" на Фіг.21. На Фіг.21а показано, що вливання природного Ф -
СКЛ не дає можливості стимулювати реакцію БКК порівняно з векторним управлінням. Додаток робить невеликий вплив на терапевтичний відгук тварин на рлФ - СКЛ.
Реакція пацюків на пегілований Ф - СКЛ показана на Фіг.21 в. Можна бачити, що ф - СКЛ у чистому вигляді стимулює реакцію БКК. Ріст БКК продовжувався 48 годин перед тим, як повернутися на основну лінію. ПЕГ - Ф - СКЛ, рецептований за допомогою ДОФГ, також стимулює реакцію БКК, причому ця реакція приблизно у два раза більше ніж для чистого ПЕГ -Ф - СКЛ. Такі результати підтверджуються виміряними рівнями сироватки
ПЕГ - Ф - СКЛ після вливання.
Зазначені дані показають, що включення аніонного ліпіду, наприклад ДОФГ, до оральної композиції ПЕГ -
Ф - СКЛ певно збільшує терапевтичний відгук; що обумовлений дериватизованим білком. Заглиблений механізм цього явища у теперішній час ще не зрозуміло.
Приклад 8
У цьому прикладі досліджували вплив ДМФГ на ФРРМ. ФРРМ становив собою рекомбінантний людський
ФРРМ 1-163, одержаний з Е. соїї, виготовлений у вигляді 1,0мг/мл розчину у 10ММ ацетату натрію, 595 сорбітолу при рН - 5,0. Комплекси ДМФГ : ФРРМ готували так, як це описано у Прикладі 1.
Аналіз комплексів ДМФГ : ФРРМ 1. Спектр світіння триптофану
У ФРРМ є єдиний залишок триптофану (позиція 51), який використовували для контролю взаємодії ФРРМ з пухирцями ДМФГ. Флуоресценцію триптофану комплексів ДМФГ : ФРРМ аналізували так, як це описано у
Прикладі 1, використовуючи концентрацію ФРРМ, що дорівнювала 0,1мг/мл. Спектр флуоресценції ФРРМ у присутності та при відсутності невеликих одношарових пухирців, що містили ФРРМ, показан на Фіг.22. ФРРМ має максимум світіння на довжині хвилі З3бнм при відсутності пухирців ДМФГ. У присутності ДМФГ і при співвідношенні ліпід : білок 100 : 1 флуоресценція триптофану ФРРМ виявляє блакитний зсув у максимумі флуоресцентного світіння до 328нм. Низька довжина хвилі флуоресцентного світіння у присутності ДМФГ дає можливість припустити, що триптофани у навколишньому середовищі є більш гідрофобними , ніж природний білок. Як показано на Фіг.23, зсуви флуоресценції залежать від молярного співвідношення ДМФГ : ФРРМ, причому інсерцію у мембрану можливо виявити після того, як буде досягнено співвідношення ДМФГ : ФРРМ 8 - 30 : 1. Зміна флуоресценції є максимальною при молярному співвідношенні, що дорівнює або більше 100 :1ї
ФРРМ явно виявляє більш високу філогенетичну близькість для пухирців ДМФГ, коли величина рн зменшується з 7,0 до 5,0. Це дає можливість припустити, що титрування певних амінокислот (наприклад, гістаміну) можна використовувати для збільшення або ослаблення взаємодії. 2. Експерименти по гасінню за допомогою йодидів
У цих експериментах ФРРМ і композицію ДМФГ : ФРРМ (при співвідношенні ДМФГ і ФРРМ, яка дорівнювала 100 :1) використовували для проведення експериментів по гасінню за допомогою йодидів, як це описано у Прикладі 1. Діаграми Штерна - Вольмера показані на Фіг.24. При відсутності пухирців ДМФГ флуоресценцію ФРРМ ефективно гасять за допомогою КІ. У протилежність цьому у присутності ДМФГ триптофан не піддається впливу йодидів, указуючи на те, що ділянка ФРРМ, яка містить зазначений триптофан, повинна бути залитою у бішарі ДМФГ.
Вищенаведений аналіз показує, що як і у випадку з Ф - СКЛ і ФМ - СКЛ, ФРРМ може тісно взаємодіяти з ненагодованим фосфоліпідом типу ДМФГ. У присутності пухирців ДМФГ триптофан ФРРМ захищається від водорозчинного гасника флуоресценції. Узяті разом наведені дані показують, що ФРРМ може включатися у мембрани, що містять ДМФГ. Мембранну інсерцію можливо виявляти одразу ж після досягнення співвідношення ДМФГ : ФРРМ, яке дорівнює 8 : 1, і це число може означати число ліпідів, які оточують вставну ділянку білка.
Приклад 9
У цьому прикладі визначали вплив взаємодії ДМФГ : ФРРМ відносно стійкості білка. Оцінювали теплову стійкість, стійкість у присутності сечовини і стабільність терміну зберігання ФРРМ (ч147/- ДМФГ). При кожному дослідженні використовували молярне співвідношення ДМФГ : ФРРМ, що дорівнювало 100: 1. 1. Теплостійкість.
Відсліжували круговий дихроїзм (КД на довжині хвилі 222 нм) чистого ФРРМ або ФРРМ, який був включеним до пухирців ДМФГ, як функцію циклічної зміни температури між 9570 і 10"С, як це описано у
Приклвді З, Фіг.10. Процент КД, що залишився, відноситься до кількості виявленого КД (при 10"С) після кожного циклу (один цикл становить собою зміну температури від 10"С до 957 і знову до 10"С) порівняно з КД ненагрітого зразка композиції що вимірюється. Хоч ФРРМ після З клів нагріву втрачає більше 70905 своєї спіральності, комплекс ДФМГ : ФРРМ повністю відновлює свою первісну альфа-спірапьність при тих самих умовах (див. Фіг.25). 2. Стійкість у присутності сечовини
Сечовина є хаотропічним реагентом, який може розгортати і денатурувати білки. Рівновагове денатурування ФРРМ (ч/- ДМФГ) контролювали за допомогою флуоресценції, тобто вимірювали тритинну структуру, і за допомогою кругового дихроїзму, тобто вимірювали вторинну структуру. Як зображено на фіг. 26, по мірі втрати тритинної структури білка, залишки триптофану більше зазнають вплив водної фази і довжина хвилі світіння ФРРМ зрушується до більшої довжини хвилі; і по мірі втрати вторинної структури середня еліпсність залишку (СЕЗ) стає менш негативною, тоді як альфа - спіральність втрачується. При відсутності
ДМФГ 5095 втрат тритинної структури чиниться при кількості сечовини, що дорівнює приблизно ЗМ, у той час, коли потрібно ЗМ сечовини, щоб мати 5095 втрат зазначеної структури при відсутності ДМФГ. Аналогічно для одержання 50956 втрат СЕЗ ФРРМ потрібно 7М сечовини при відсутності ДМФГ порівняно з 9М сечовини у присутності ДМФГ. 3. Стабільність строку зберігання
ФРРМ 1 - 163, одержаний з Е. соїї (4/- ДМФГ), зберігали при умовах, що показані у нижченаведеній
Таблиці 2, а далі досліджували за допомогою ексклюзивної хроматографії (РЕХ), що виконували на колонці
Тозо - Нааз ЗО00О5МУХІ. з рухомою фазою, яка містить 100мМ фосфатного буферу, 1095 етанолу, 0,295 Тмееп - 20, при рН - 6,9. Зразки розчинювали за допомогою етанолу і Тмееп - 20 до тієї самої концентрації, що використовували у рухомій фазі, та у кожному досліді вводили 10-20мкг зразка. Температуру колонки підтримували на рівні 40"С. Будь - який агрегований ФРРМ, який формує елюати раніш ніж неагрегований білок і виражається кількостно шляхом вимірювання площі під кривой агрегатного шпиля і мономерного шпиля. Дані відповідають проценту загального ФРРМ у агрегатному шпилі.
Таблиця 2 до агретування, виміряний шляхом РЕХ
ФРРМ 7777/1771 8вос11Ї11111111111101111111111171Ї11111111021
С ис111111г1111111111041117 11111106 нниюньнннншЕ спини нишишишиш: х
ДМФОІОФРРМ 17777171 80111101 11111111041 вого висів 25С1С
Як показано у Таблиці 2, ДМФГ різко зменшує створення агрегатів при зберіганні. Таким чином, ДМФГ може бути використано для збільшення строку зберігання ФРРМ.
Зазначені дані показують, що взаємодія ФРРМ з пухирцями ДМФГ збільшує стійкість білка при умовах, коли чистий ФРРМ є нестійким. Взаємодія безпосередньо стабілізує вторинну і тритинну структури ФРРМ у присутності денатурантів типу сечовини і значно збільшує строк зберігання ФРРМ при різних температурах.
Приклад 10
У цьому прикладі досліджували хімічно модифікований ФРРМ 1-163 (монопегілований (20кДа) ФРРМ 1- 163 (ПЕГ - ФРРМ)) на його здатність до взаємодії з негативно зарядженими ліпідними пухирцями. Для визначення ПЕГ -ФРРМ використовували порівняння максимумів інтенсивності і світіння Р/Ро (як це описано у вищенаведених прикладах 1 і 8). У кожному випадку молярне співвідношення ліпід : білок дорівнювало 100: 1.
Застосований у цих експериментах ПЕГ - ФРРМ становив собою монопегілований (20кДа) ФРРМ 1 - 163, одержаний із клітин Е. соїї, використовуючи альдегід метокси поліетиленгліколю (МеПЕГ) (середня молекулярна вага 20кДа) через відновлювальне алкілування. Гомогенність кон'югатів ПЕГ - ФРРМ визначали за допомогою електрофорезу у натрій додецил сульфат поліакриламідному гелі з використанням 4 - 2095 градієнтних гелів промислового виробництва. Виявили одну головну смугу, що відповідає позиції білка з вагою 46,9кДа.
Далі за допомогою вищеописаних процедур готували зразки ДМФГ : ПЕГ -ФРРМ (100: 1, моль/моль). Було знайдено, що зразки ДМФГ : ПЕГ - ФРРМ повністю відновлювали вторинну структуру після нагрівання (Фіг.27).
Незважаючи на присутність молекул ПЕГ, дериватизований білок був здатним до взаємодії з ліпідом таким же чином, як і природний білок.
Ці дані показують, що зсуви максимумів світіння, пов'язані з взаємодією ФРРМ з негативно зарядженим ліпідним пухирцем не є особливостю тільки ФРРМ, одержаного як продукт експресії прокаріотних клітин - хазяїв. Як було показано для хімічно модифікованого рлф - СКЛ, ДМФГ : ФРРМ також показали зсуви світіння; дані показують, що хімічно модифікований ФРРМ може включатися у мембрани, які містять ДМФГ.
Приклад 11
У цьому прикладі оцінювали вплив ДМФГ : ПЕГ - ФРРМ відносно до проблеми адсорбції ФРРМ у скляні пробірки. Приблизно 11пг/мл (25І| - ПЕГ - ФРРМ комбінували з неміченим ПЕГ - ФРРМ різної концентрації з метою досягнення зафіксованої кінцевої концентрації ПЕГ - ФРРМ (див. Ффіг.28). У тих випадках, коли це зафіксовано, ДМФГ був включеним до процесу розчинення ( див. також Ффіг.27). 1мл препаратів розміщували у скляну пробірку з об'ємом Зсм3 (Кітріє). Процент відновлення ПЕГ - ФРРМ аналізували шляхом підрахунку кількості радіомічених ФРРМ, що були регенеровані із скляних пробірок після 18-ти годинного інкубування при кімнатній температурі. Як показано на Ффіг.28, ПЕГ - ФРРМ легко адсорбує до скляних контейнерів по мірі зменшування концентрації білка, причому адсорбція є особливо високою при концентрації, яка знаходиться у діапазоні 6,1 - ЗХОмкг/мл. У протилежність цьому зразки ДМФГ : ПЕГ - ФРРМ майже не мають адсорбції до скла у діапазоні концентрації ПЕГ - ФРРМ, що дорівнює 0,1 - 5Омкг/мл.
Приклад 12
У цьому прикладі визначали вплив взаємодії ДМФГ : ФРРМ 1 - 163 і ДМФГ : ПЕГ - ФРРМ 1-163 відносно біологічної активності ФРРМ 1 - 163 і ПЕГ - ФРРМ 1 - 163. ФРРМ 1-163 був виділеним із Е. соїї, співвідношення ліпід : білок дорівнювало 100 :1. Вимірювали кількість тромбоцитів із миші, у яку вводили 100мкг/кг і З0Омкг/кг
ФРРМ, ПЕГ - ФРРМ, ДМФГ : ФРРМ або ДМФГ : ПЕГ - ФРРМ. Одержані результати наведені на Ффіг.31.
Показану концентрацію кожного типу вводили внутрішньошкірно один раз у день протягом 8 діб до звичайної самки миші Ваїр/с. Протягом 24 годин після останньої ін'єкції збирали проби крові із невеликого поперечного розрізу у хвостовій вені. Клітини крові аналізували за допомогою електронного аналізатора клітин крові (Вахіег
Оіадпозіїсв, Іпс. Ігуіпе, СА). Дані становлять собою середню величину по показникам, одержаним від 4 тварин, т/- стандартне відхилення. На інші параметри клітин крові, наприклад, загальна кількість білих кров'яних клітин або кількість червоних кров'яних клітин, зазначені операції не впливали (дані не показані). Одержані результати свідчать, що пегілування ФРРМ 1 - 163, виділеного з Е. соїї, збільшувало активність іп мімо молекули. Більш важливим є те, що вищезазначені дослідження показують, що інсерція у бішари негативно зарядженого ліпіду не виявляє шкодливого впливу на біологічну активність типів різних ФРР М.
Список послідовностей (1) Загальна інформація () Заявник: АМОЕМ ІМС. (ї) Назва винаходу: стійкі композиції білок : фосфоліпід і способи їх одержання (ії) Кількість послідовностей: 2 (м) Адреса для листування: (А) Адресат: АМСЕМ ІМС. (В) Вулиця: 1840 Оенаміапа Огме (С) Місто: Тноизапа Оакв (0) Штат: Саїїогпіа (Е) Країна: ОБА (Р) Поштовий індекс: 91320-1789 (м) Комп'ютерні дані: (А) Тип носія: гибкий диск (В) Комп'ютер: ІВМ РС сумісний (С) Операційна система: РО-ЙО5/М5-0О5 (0) Математичне забезпечення: Раїепііп НеІєазе 41.0, Мегвіоп 21.25 (мі) Дані по заявці: (А) Номер заявки: (В) Дата подання: (С) Класифікація: (2) Інформація про послідовність 5ЕО ІЮ МО :1; () Характеристики послідовності : (А) Довжина : 1342 п.н. (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Нитковідність: однониткова (ОС) Топологія : лінійна (ії) Тип молекули: кКДНК (їх) Ознака (А) Назва/ключ: СО5 (В) Місцеположення: 99...621
(хі) Опис послідовності; 5БЕО ОО МО: 1: .
САСОСАСССА ОСССАСССАА САСАСССССС ССАСААТОСА ССТСАСТСАА ТТОСТоСТСС 60
ТОСТСАТОСТ ТСТОСТААСТ ССААСОСТАА СОСТОТСС АОС о ссс сст сстТ сст 113 бек Рго А1а Рго РІо 1 5
ОСТ ТТ САС СТО ССА СТО СТО АСТ'ААА СТО СТТ ССТ САС ТС САТ сте 161
Аіїа Сув АБр Печ Агуо Ма1ї Пец бех цу Пей бец Агу Авр бег Нів Уаї
СТТ САС АОС АСА СТО АСС САС ТОаС СсСА САС СТТ САС ССТ ТТО ССТ АсСА 209
Беч Ні бех Ак Гей Бек сіп Суз Рго біц Уа! Ніз Рго Пес Рко Тіх
ССтТ сто Сто Ста ССТ ОСТ СТО САС ТІТ АОС ТТ ОСА САА ТО ААА сс -257
Рго Маії реп Пец Рко Аза Уаї Авр Ріє бек Пец с1у сі Тгр Ццув Тих 80
САС АТО САС САС АСС АЛО СА САС САС АТ СТО СОА ОСА ОТО АС СІ 305
Сіп Меє біз бід ТК Був Аза біп Авр 1126 Бе біу А1а Чаї Тк Гец 60 65
СТО СТО САС ОА ОТО АТО ОСА ССА соб ОА САА ста озА СесС АСТ Тас . 353 ем без біб сСі1іу Уа1ї Мебс А1їа Аїа Аход сіу сіб без с1і1у Рго Трх Суз 70 75 80 85 сте тТсСА ТосС сто сто соб САС СТ ТСтТ ббА СА сто сот ст сте стТ 151
Без беї бек цей Гцеш біу біп Пец бек сСіу біп Маї Ат9 Гей Цец Пец 90 95 100 ооо ОСС сто САп АБС СТО СТ ОСА АСС САС СТ ССтТ СсСА САС ббС доб 449 сіу Аіїа Ппеч біп бек Печ Геч С1у Тік біп реч Рго Рко біп С1у Ах 105 110 115
АСС АСА ОСТ САС ААС САТ ССС ААТ СОС АТС ТТ СТО АСС ТТС САА САС 497
Тіг Таж Аза Нів був Ар Ркго Азп Аіа І1е Рбе цей бек Ре біп Нів 120 125 130
СТО СТО ССА СсА ААб ост СТ ТТ СТО АТО СТ СТА ССА соб ТОС АСС 645 їйеч БПеч Аго б1у ПЦув Уаї Аку Рбе це Мес печ Уві Сіу біу бек ТЕ 135 140 145
Ст ТаС сто Аа соб ССС СсСА ССС АСС АСА ОСТ ото СОС АС АбА АОС 593 реч Су Уа1ї,Ако Ак Аза Рго Руто Ту ТБі Аза уаї Рго Бех Акд Тік 150 155 160 155
ТТ СТА СТО СТО АСА СТО ААС ОСА СТО С САЛАСАСОАС ТТСТОЗАТТО 641
Бех рец Уаі цПец ТЕ Бей Аєп бім Ббеч 170
ТТССАСАСАА АСТТСАСТОС СТСАСССАСА АСТАСТСОСТ СТОСОСТІСТ СААСТОССАС 791
САСССАТТСА САСССААСАТ ТОСТОСТСТО СТОААССААА ССТОСАССТС ССТОСАССАА 761
АТССССОСАТ АССТСААСАС САТАСАСОАЛА СТОТТОААТО СААСТОСТОС АСТСТІТОСТ в21
ССАСССТСАС ССАСОСАСССТ АОСАСпССССа САСАТТТОСТ САПОААСАТС АСАСАСАСОС 81
ТСССТОССАС ССААССТОСА СССТОСАТАТ ТСТОСТТССС СЛАСССАТСС ТОСТАСТОСА 941
САСТАТАСОС ТСТТСССТСТ ТОСАСССАСС ТТОСССАСОС СТОТОСТОСА ОСТОСАСССС 1001
СТОСТІОСТО АСССТІСТОС ТССААССССС АССССТАССА ССССТСТІСТ АААСАСАТОС 1061
ТАСАСССАСТ СССАСААТСТ СТОСТСАССАА СССТАОСТТ СТОСАСАСАСТ ОСССАСАТСА 1121
ССАТІСТСТС ОТСТАСАССТ СССТТОССТО САССОСОССС СТОССАСАСА АСТОСАСАдО 1181
АТТТОСТАСТ ТІСТОСТОАА АСССАЛАССС СТОСТААААС СПАТАСАСАИ ПАСТОААвла 1241
ОЗААТСАТТТ ТІСАСТСТАС АТТАТАААСС ТІСАСААОСТ АТТТТТТТАА ССТАТСАССА 1301
АТАСТСАТСА САОСАОСТАС СТСТІТОСТО ТАТТТТСТаС А 1342 (2) Інформація про послідовність ЗЕО 10 МО : 2: (ї) Характеристики послідовності (А) Довжина: 174 п.н. (В) Тип: амінокислота (С) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: білок (х) 0/ Опис послідовності ЗЕО 10 МО :2: баг оВуо діа Рто Рго діа Субз Азр о Ббец Агу УА1 Грем Бех уз цем Бей 1 5 10 15
Агу Авробех Нів Уа) Пец Ніз бех Аку Бемш бек біп Сув Рто бій Маї
Ні Ро рез Рго ТБх Рко Уаі ви без Рко А1їя Уві Азр рве бек Гец
Сі Сі Тгр ув Трх біп Меї бії біо Так Туз Біа біп Кер 1 беч во
С1іУу Аїя Уаї ТІ Пец Пец Геч біц сСіу Ма1ї Меї дів діа Аг с1у с1п 65 79 15 80 реч біу Рго ТЬг Суз Пец бек Бек Гемш пе й1у Сіп йем чех с1Уу біп 85 90 95 туаї Аку реп Бей Ін біу діа пец б1ів бех Беи ви С1У Тис бід еч 100 105 119 рго Рго сіп Сіу Агу Те ТВт діа нів цуз АвроРго Азп Аза 116 Рье 115 120 125 рец бек Рье сіп Нін Пец рей Агу 03у Гуз Уаї Агу Рпе Пез Меє Сей 130 135 140
Уаї с1у С1у Беї Ті: Печ Сувз УМаї Агу Ак Азія Рго Рко ТЬг о Твг діа 145 150 155 160
Чаї Рго Бек Кс Ту бех Пец Уаії Сез Тйх Гец Асп сС35іч Беч 165 170
ФІГ. 1 25 . его 8
Її ш - г -
Е ' шй ш 5 ш -
ЖЕ х іо.
ЕЕ с 2
ЕЕ
З НТ о зо 350 а0о повжина хвилі ( нм )
. ФІГ. 2А 4 336 ач й й А 55а
З
5232 2 о х т» | Е , а а
З5О 5
КІ х - 2
І . - ОВ г 8 й о : 326 о 20 430 бо во
ДОФІ : рлф - СКЛ (моль : моль)
ФІГ. 28 4 з36 що л де В 134
З м п А зе : гг З50 Е й о я 2 с
Е
328 ї
А
. 526 о, : з2г4 що, 2о 240 во во
ДОФГ : рляф - СКЛ (моль : моль)
ФІГ. З ' 2.5 о в і г і. 2 а?
А , . . а . е -- ! а є -о
Ії а е е е о
В до? о 0909 й
І Яков о о о по Фу. 05 Обг 02
КІ, (М)
ФІГ. 4 о05 щш - (вч о о 05 молярний процент пірен деканової кислоти
ФІГ. 5 мії х ХІІ" т-О- 2 т, т" ч. - чи 7 п . що - т ше У й Що - ЧІ . - и шле Я й па Р - . ач 7 ч лі в ве щ Я: М По Ще Що вх, м -щ- «У ба сш. ше ни " 1
Чи Р т - тя з.
Н бух І би -1 т Й . ак л І ше . НИ м "ч " що "в ж -, т м ра КАТ шо РИ . їх. 7 7 У Щ
НК . кит ь ми нт Ки к М . " г 7 " що з, - а тк т .. Нм т 7 р 7 й а т І х - ще » - Же ана т с. щи" "т щ ? жі . М І а7 х. Щі що 07 ши ше ке ШИ мне й Ше Ме ще
УТ. - 41.1 ах м ц он щи КУ ШК з а. ах. пт, мн ЩО ЯМИ ши ши ЩО В в т т - ч. ЖІ т й 2 - 6-7 ня Де ще й 1 г. : лй т. - . а " - ти Є 7 а 7 - м - щи оч - ще пе? : п. . й т. - - . - г - І и як - -о вн - й . ге ни ше БИ Яр
Ще Си ші щ Е : ми -- ях тк -щк РИН мо .7 -- а . |; "т тю | -- ох її в; мн . . п -н; и й те . що - а й. і 1-41: АОС БОМ К ше ша г. ТИ КЕ м ях щі Ще х ще ША Є | о 2 ШИ те Нр ЩЕ М: тА ох т, Є ШО їм з .- час ме тк - іа . ча Так и пить КІ : й - ч і - шк є. У . 2 Вч ши у ши их - кі.
Ш щі ГІ ' та КІ РО ж ке тя " т щі ж 4 т "- се пн б," те их - п- Х, турні зх й я ШЕ МИ шк Р г ч : -х шен ще Неае ше Н 2" ї. тр , - . ет, тижки : м мч ета -л . -е ГУ пт ех Ш в Е ш ри 2 ГІ т-х щ-- ах й Ти шо ат що 7 У ит 2 шах Шк МИ - них ЩО ЛИ роОПІ чи ще ри нки ще ще АД Є ' ! й що Кк о ке щк ше ния 17 ще пк маш ще 1 г 1
Її нат ., ЩА ях що ІМ у. я Ат, г, , ж 1 - миши - - ш ш нн 1 95 ее в г шошож ох шк в оо в ж о д ч що ча - з; 8 в в а 8 с " ай що 2 як З Е с с х З
Ба « с -- її і-й с
Іще. в лІПІД -
ФІГ. 6
З40 не що щі ЩО щи з ть - . груд -7 -. «. бли -, : - 335 т 1 т" ж С ї, - "к . Кк
ЕТ шк -хи та т нет ха тя - - що" "7 у м . , і-ї 4 7 т п ще: ШЕ ШИ 7 се Ще ат и 1- че, у ве - 1 ' що ет а - 4. х " тк мо7 - "и - - кох вне ти - Сі « -е- - т. ша І й ги - та шк те ще Щи І
Раш лк 67 шк їз щ 1 та тк "ск . На Кк їй аа ШИ . ах Ще ч я . ще ! те шо М ГУ 1. 4 й ' м ет. и . Н би - . -- ач ще - чі т 0-42 - маки ШИН ж ШИ и й ж ти У. зх Ся не к. й : Й не
Мішкй а що чт Кк т" - пе і льш тк ч . І
Е 330 БП М шк нена но п НК НИ о І. їй шк " ' ше т 1 м ї ч « -
Ге тт м що БЕ - м 7 ие ще "ж т "7, ее т "7 т т т Те то й
Е г. ато ги льи ще що ' т щі . їх ' 07 ть Ш о гот Ше не Ди М я - 2. кг. . . є ах - г . ящя Що т щи . .- пи -х мч що А гаї і - ях пк Я РА - пи . м шо. -е ' 2 нище ще мае 717. | ТЯ " ІК. ТЕ шо - Й кан не й меч НМ М Ше Яр - р т. т, і - в, жи - Ге о т б я, ні т, - -. 7 тк - рРагшш м - - ба 71 - к т - - ш- - : - . й ш я, зи "--ї - Ше ти" у б 7 що х . з РІ й 7 | ! 5 т р -и : Ї, ча у Те, . й й і: и пі - щ зв, - аа є ї -. -;. -- я - т. е: -, Та 4 ре 1.1. ми ке й . и. мм Я Ук о Мч 11, в « - РИ Р ва т. . й . . . т ж їх шт . ни йе бу і ши ще Н цИ І й ц х . 7 Щ- 2 607 7 Що трі ОО ща - сне Що дя що МИ се ШИ
Н т. тить Да чи їз т: шт, ще 6.7 - пе Є - - 325 тп-, г. ць х 7 т- ре ме ре - Р що А т: не,
ГУ аа «а . «ек - Ту Ще ще Щ я "Кі . шк 1: - ГУ З «г гі "Кк 2. би ГО й нн - ша й и тд мч 5 - ри тах та боть, : пи Й « -ї ак ш п з тв ни . . И ми нщ . 1. й та е « т і що КИ - . НИ и - Н -Ї 4
Й , 7 ши . Й т щи ча - я я - « що шо хи - я с. и що т сим тв А шо т ех й ах ч. що -
Я -4| и у тн я: чт що Р на ще СИН ще т. Не - . ах " СИ ' г 2 " . шк та шо ши т сля: м: я т - мм І ши ші ма ШІ й Ен МИ М Ще К- Я: що М НЕ : с: ш й - т" - . : т й - ях ч я я шт г - б" ж х - ї " : я и т, "Си гуси . ч, ти : я Й - ї ша шк ч в м Бк ни ние м шк ' й щі |. . ще «- шк І. ШТ КІ щі й Ії бТх п 7 Ї тот є ота пешщ ЩЕ МНК йо: з - - . , МО . - і - - а тт, -- 4 і 1 ч й -к г -. "а Р тк. к я ще х. ит й КЕ Й 6-х , та т. и" ' ! . - че ї . - : ши .. «ат тяж ще р ша ' ат . к х і ' боїв ' т ші іт шо т-7 " 7 т". п а- а 320 п. т ЩІ я як «и ше ш- І
М щі ш-шш ш о ш Ге в т й хх м о В т о ці в 6 -
БЕ о с Во хе а 5 59 ча ча чн ща ще ща аа 5
С) в т не ліІПпІД
ФІГ. 7 ситет 03 шШ х.
Е т ж щ-
З КД (мграді | дя ран - ІК дих я Х в Гл ке Кит т х / х га Я сх / , Х у
З т Й ХХ і М х т и « - З / Я ї-у
Кей ри Х ик / у я вес хх / М ко / о -Й000є»О2 ча ! : щі зо час
ФІГ. 8
В
Я -а7065
Ж. с - « тп г 8 -165Ез6 в ра о ї 2 2 -2.82Е-6
В т -400Е.6 ;
Ю 20 5о 40 БО во 70 во во темлература (С)
ФІГ. 9 -000 панни пивна п -б6002 с чт
ГІ І
-0003 та
Ко. о
Ка! ' 2
З со г щ
З
Кв - т -0005
Ф Ю го зо 8 0806070 Во ев ою о температура (Со)
Р с - іє ді -
ФІГ. 10 ооо 5. -
ІФ)
Ж, о "Меше
З (в)
З
Б ес х х, о
Б. 2 5, зве аБес
ЗЛЕ : о Ще 2 о о во бо час (хв.)
ФІГ. 11
ІОСОєО
НИМИ Дддит тин
КД (мград) І ; -ІБООЕ»О2 | - 205 довжина хвилі (нм) 260
ФІГ. 12 (.ОО0Ех ОЇ
ВИПИВ панни
Д (мград) і і і
З я ши
ІЗОбЕО2 -і 205 , 2650 довжина хвилі (нм)
ФІГ. 13 от
Тит т и тки
Аа - ож . - ох х Залити с м «Щи пути. н ах - - киш М х щи 7 м кА ни ит, Сало я
І ний й . яти хх х п Тихі. ти у пр пошана НИШННИ пня чн тита а а ме ДР Я ен и и вок ж вия те и, гла у и т мА НИ Го щи «тт те, кю т. ш вч т, ЦО чих ни й, "а бал ше тина ап дти. й те п " мон . в ох; и АЗУТ Т- пити т пий те Ти заг. маних що б ту Ку о и и: РЕЛЕ ЧИЯ ман ст ме бат
Те меч ех и 0.5 7, Ен зни чи меч й ва пан пе синя Туя їх кН т нут хуй 7 їх
ГИ - ши А ше-а - ші мя « рота вла буки на їх жи -, от, чт -- ик: Вимог. соалзнитх і, - хх ма ім пе - т. ща» ши «є. пе и вану ми я . ї- -ї в тк, Лю АТ ча й Й ко - й є, м - . ень ли АНЯ РН
Я тес т. шк ва . лот и М "х. 2127. 5 я Роль окт -7 ччННя х - я тт 7 з, Б. « пн що зок, яю а мч иа - пт 47 - мч я ти. . вон, . А ан тю ию и п - . . . т. - є - ра и . здом акт пи че їй : я .- Тих А -
Р ста тка плит, их. -- . ши мс ев миши ше в -7. 7. і- г ж 5 ць - б т е -
Заміщений аркуш (Правило 26) ю о
Ко) о
Ф іх щі
ФІГ. 14
БО
40 у 5о0 К и їй / ї
З
"й Я че
І в о й 6) 25 5О 75 о час (год.) --Фф.скКд --- ДОФГ: Ф - СКЛ (100: 1) --- ДМФГ: ф - СКЛ (100: 1) -к- ДПФГ: ф - СКЛ (100: 1)
ФІГ. 15 5о аб
Зо з м
ІВ
Та) т о й о 25 5О 758 о час (год.) --Ф«- СКЛ --ДОФК: Фф - СКЛ (50: 1) -е- ДМФК - Г СКЛ (50: 1)
ФІГ. 16 пеДелеті и бабу - шого; ' е 1 - х т, рови чичи ня тумани пня ша " юю дм
ТИ
Є; пою 7 4 ТТ « кю дк яю
ГИ рити дом били тт 1 та т пити т. . м МК) ян г хг: Т. п ями та щі и Поин тату М Й
Е и А лати, ' ст без а 7 тт пт Ні .-- ит ява , . ти Ти з псдАаЙОтя ту у жа я « звати? пах дожити Фромм Й тя ше з й - хати меч ПР НИ о . чут ТО зни ян. 2 Охота битим и и ЧИ шпат бла ги пи Не «дети щу ія пт р 7. - т. т. си ши 07 раю т, т - . -7, її. очи бинт ц Я дитя 2 п а я 7 м е ГО к 7 пом А тт . й що ста - и . шо .. - а -.
ТТ. лан - . ті ще щу - т т шик і ПРИМ НИ шою 2 У г 4 х бою РО Я храк ке кох ох ж хи що - пише нн - пе а жим и очи !
Й . 3 . лях Р жи - Н - РОД ше - . вк й ще я - ла" - Ів т т щит, тк т. пн м ке Ка пк ри шт ни ни баг то я 1 - бої Ш " 7 " ті . нн чо мен я . арх . п . - . - т й Й дл. - й тя - . . щ ато ж ч що ше Й тр ге т. п ЧИЯ бах м - ту п ' . пн Кк й
ТО, м « шк міх т- Но ЧА т я та " ї, че . пиши кл - У а я т - . Й а й «ох їз ОЗ. - - м У и пиши - ТТ . з он ч т. - тя 7 й Й т й - шт пи чн иа "7 х Й й . ЕМ, я ,.11 тях - п Ин й т й о , ! ит, Й 2 ре нини
ВН -4,5 ЯКХ ф- СКЛ, рН - 3,3 ЯКХ Ф - СКЛ, рН - 7,0 з "п,
ФІГ. 17 таіюатт
Тіт, 350 т я - 2 т тя б ту г. То ги . ге є нич х ії ! в й пк
З щ- т по
Е що й
Е дн: в па ' . - . "ля
Фо З4о по т дити т
Е один ж г
Фі я тн
З ТІВ ще 5 за й ; вто ши шк ах пот миши 1 били У пн
Зо 6.
Ди ще : я , 2 ле ' - - ве ПОТ)
Те т, і шля ати АТ МТТО ох й де - я - ч- " -чв 330 МІ. ТІ: ни зт ол и Й І й І лит
Ж йод ПИ зе 1-1 - Клін би ЕЕ СН М ЗИ І БИ по ЕЕ сь рати, оо Бк і І Як еле «- : блін дик ШЕ и Я ні Тан --х они тої; охайний - м чу ма а у не ех ин а о НИ КМ ее НИ ОНИ Ка
АС Грант пи. цер що Й Тена
НИ ДОН ТІ т Пер есх тет ТЕН ЗЕД ово ШІ МИНА п ЕЕ Й мс 7 лам на М ях м панни тлу я рака НМ Р слий рлф - СКЛ, рН « 4,5 ч шк - -
Б'ЯКХ Ф - СКЛ, рН - 3,3 ЯКХ Ф - СКЛ,
О відсутність ліпіду ОВ ' тд
ГА оф
ФІГ. 18 1О00ЕчОЇ
НИ спини
КА (мград) і Ї
Чи Й 7 -й --800є»02 1 : 205 довжина хвилі (нм) 260
ФІГ. 19А
ОО»
ПИ сти
Н 4 ! ї
КД (мград) | і
І і і і, ! й ки
Її дк -мвоОєког 205 . довжина хвилі (нм) 250
ФІГ. 1983
І.ОООЕ КО й / -200оєог пт 2гО5 довжина хвилі (нм! Ро т ФІГ. 20А
У 40 і - є; о -2 х зе в) те - о 25 м в
КЗ гої І
У Ки Ї -П Ми т . ві Ів ния Ц с (хз) ово " -
Го и ш за, -. і.
І 1 насосне вливання . 8) 2 га Зв ав во 072 ва зв час (годин) --нобсій (засіб доставки ліків) --доза ф - СКЛ - 750 мкг/кг --2-- Доза Ф - СКЛ ї- ДОФІГ - 750 мкг/кг
ФІГ. 208 1 1 в в, 3041 7 чт х. ; Мечі зе т, - І м 2 ; ! Є,
Та : М вого й І | і: о 2 т х І ЗТ т
Е ІБ і ! рон І з ї її хо -й - А -
ФО 1 ї- в 5 насосне вливання о гг та зб ав БО те ва аб час (годин) : -ь- носій (засіб доставки ліків) -- доза Ф - СКЛ - 750 мкг/кг ---доза фФ - СКЛ дДОофг - 750 МКГ Кг
ФІГ. 21 ооо тп х -20900
Іт5Оо
З ІБО0О її я 12500
Ко
Що, в 100бо ї- о ж 7500 у 50Оо0 2500 о насосне вливання 0 0012 024 36 48 60 72 ві час (годину -- ПЕГ - Ф - СКЛ у чистому вигляді -4- ПЕГ - ф - СКЛ - ДОФІ
ФІГ. 22
Е й
Ф хе
Я Зоо ФК є Ве 5. вк. їі к ке 9
Б го
М щі
Га! це) т
В.
Е- ри щі - оо о зоо зо 400 довжина хвилі (нм)
ФІГ. 23
ЗО о
З
- ж 3546 м щі
Ж і; о 32 т
В із
Е зо
С
5 . з28 о и Ї що ДМФГ : ФРРМ (молярне) -5- рН БО -- рн То
"ФІГ, 24 о о
Ів со со о оо
А Ге ши. Ід о і со о во о о і2 о оо о о є о Б зов? о сг? е
І а й ! о пО5 0 оа5 дг
ІК (М) о ФРРМ «е ДМФГ : ФРРМ (100: 1)
- ФІГ. 25 я о - ОО ; г 8 о ка а (ак)
Ії ч "в 80 ;
І- ін щі м) -ї о ія -
Е бо е Ай -0 ц т г є 40 о «Фі ня о сі о
З 20 і 0 І 2 з 4 кількість циклів нагрівання -- ФРРМ 6 -- ДМФГ : ФРЕеМ
Ж ФІГ. 26
Я а 355 о
Еш з п- т---о й дого Б ж я. ня ; га -5000 в зав . ри. т Ше /
У 540 и в - щш зі їй Ос с 535 р їх 1- 5 2 шк а вт с В
З ЗО дви шк -ІБО0О -
У в 325 : 2 02 а в в юю сечовина (М)
ФІГ. 27 зза
Ко за з36 їй у пІх т п НК 330 в ш- ; Ме Т.х ще ще шк й 329 329 327 Не в и
ФфеРем о ПпПЕГ-ФРРМ пмМФг:ФРЕМ дм ФГО ПЕГ - ФРРМ
ФІГ. 28 по юс ат 90 щк
Е во
Ф
Ф
Фо й - та! 52 6о0
Зо ; 0 І І ІЮ оо концентрація ПЕГ - ФРРМ (мкг/мл)
Фіг. 29А 1 САСОСАСССАССССАСССААСАСАССССооСх аЗААТОСАССТОСАСТСААТТОСТОСТСО 53 -21 Мессі гетнкОісбецбецбез -14 70 стазтТсАтТОостТІСТОСТААСстТОСсААсСОостТААСОоСсТОоТоССсАССсСсСсоосТоеСстТеСстТОоСсттст 119 -11 чаз1удімеєгеипбецГейТнкАТалеєчрсец Нут ГецбекбегРгоА1аргоРкголіасСсув 7 120 САССТОССАСТОСТСАСТАААСТОСТТСОТОСАСТОССАТаРТССТТСАСАССАСАСТОСАОС 179
В АвррПепАкаЯча1ПречбегісузПепцецпАгоаАгрБегНівМма1т1ПеонізбегАгагецвзег 27 180 САВБТОСССАСАСОТТСАСССТТТОССТАСАССТОТОСТОСТОоССТаСТОТОСАСТТТАСС 239 2а сСіпсувркопіцуа1!Нізртобе)Руотпгегоуа1резбейРгтоА1іатуа1Авррпевехг 47 240 ТТОСОСАпААТОСААААСССАСАТОПАБОАСАССАСОСАСАССАСАТТСТасОсАОосСАстТо 299 48 БезбіубіпТткроувтикОотїамесс1Чс1і1зтйпхрузАзіабіпвА5ріі1іеєБеца1уА1таУаї 67 00 АСССТТСТОСТОСАСССАСТСАТОССАССАСССССАСААСТОССАСССАСТТОССТСТоА 359 68 ТнгоецресБеос1і1цбіума1Мекд1зА1адхасіусіпреосіуркотиксСувоецЗек 87 160 тесСстТостТоОбОсАССсТТТСТоОАСАССТОСОСТОТОСТОСтТРОвОоСсостТОосСАсвАоССстТе 419 в бекбеипезіусІіпречб5екбіубіпУазАка г ейБбецгецс1уАтТаБечбіпбекцеи 107 428 СсТтІСОААСССАОСТТССТАСАССССАООСАССАСАССТСАСААССАТСССААТОССАТОС 479 108 пепбіутнЕкСіпреорРгоРкобсі1пс1уАготТЕтТНгА1анізцузАзрегоАвпА1ат1е 127 180 ТТССТОАССТТССААСАССТОСТОСОАОВОоАААсСТОСОоТтТТоСтТОАТасСТТоТАСоАСсоС 539 128 вЕнебейбБесеРнесіпНівГО гц еплгоО1убувУуа1АгоРНеГгечМексеца1с1усіу 147 240 ТІСАСССТСТОСОТСАСОСОООССССАСССАССАСАОСТОТССССАССАСААССТСТСТА 599 148 б5егтпгГечсувуаіАгаАату Д1арРкорРсОоТаИстВгАзіауа1тРкобБекАкотікбекрец 167
СТССТСАСАСТОдДАССАССТОССАААСАОСАСТІСТОСАТТОТТОСАСАСАААСТТСАСТ 559
УуаїБентнкПепАвпоз1пепетодапАхоатТкЕбаего1уреспецо ТП гАпрРаеТНхХ 187
СССТСАСССАСААСТАСТООССТОСТОООСТТСТОДАСТОССАОСАСОСАТТСАСАСССААС 719
А1ахекаіалгтіктнгОо1убзекоіугезьечпузттрозпсіпо1іурРпеатгЧАїацув 207
ВРТССТООТСТОСТОААССАААССТОСАСОТСССТООАССАААТСССОСЗСАТАССТОААС 779 т1еРхкосі1іубеццбечзАкпо1пТтпеБекАауобетцечАБроїіпІ1еРгос1уТУкПечАвВц 227
АССАТАСАССААСТСТТОААТОСААСТООТОСАСТСТТТССТОСАСССТСАСССАСсоАСС 819
АгчІ1енівс1дБеоБепАзпо1УТиКАгобі1уречРПеРгоО1урРковекАкКадКатих 247
СТАВ АСССССООСАСАТТТССТСАСОАДАСАТСАБАСАСАСОСТОССТОССАСССААССТО 899
ГепбіуАз1авкольрі12ебекбего1утигбегтАзртнуІбіубвгтречРгОРІсСАВлЛІ ви 267
СВОССТООАТАТТСТССТТССССААСССАТССТОСТАСТООАСАСТАТАСОоСТСТТОССТ 959 біпРГОсС1утукБекРІтобекРтОоТиПкНіБРгОоРКкОотТнкОо1убіпТтУхТЬкСеченерко 2987 сттесдсссАассетТтосесАссосстотовтесАостІсАссСсСсСТостТСосСтТОАссстІСсТ 1019
БепрРгГОоОРкотТисгГепрРтоТтигРгоУуатуаїсіп'еНівєРто ецтіерРгоАБзрегобекс 307
ССТОССААСССССАССССТАССАВСССТСТТСТАААСАСАТССТАСАСССАСТСССАСААТ 1079
АіархотнеРсОоТтнНУуРкЕОотТнгбегЕгоБренренАазптігбегтуктигнівбексіпАаал 327
СТтОТСТСАОССААССОТААСОГТСТСАСАСАСТОСССАСАТСАОСАТТОТСТСОТОоТАСдо 1139
СецбексіпсіцбіувЕца стосстТТоесСстТосСАССССОССССТОСССАСААСТОСАСААсАТтТТосТАСТТТСТОоСТОо 1199
АААСССАААССССТОСТААААСССАТАСАСАСОСАСТОДАЛАСОСААТСАТТТТТСАСТОТ 1259
АСАТТАТАААССТТСАСААОСТАТТТТТТТААОСТАТСАОСААТАСТСАТСАСАОССАОССТ 1119
АпСТСТТТОСТСТАТТТТСТОСА 1342 І
ФІГ. 30
Мена" - о
Е 3 у
Ме на -МиНао зн-С-РЕб оо" масчивн з рНнІ-6
Мена вес МеН-Сно-РЕв 0о-
ФІГ. 31 ще
Ігри Щ лет «. 2 житі луг | 2
Проф п иа ШІ НЕК І 21 жо «І Д|яч Гея ке Як дани БМ ж н я ші оши ш ИШЕ щке . пт рел ко тя е м шва МІ ОК в. ше І 1 ши З
І щу ле вк со
Те Б ре -- 185. пр І ри Я ая МИ ЩЕ. . ТЕ, тий дк . що т що тав . - Ка
Кк: та вт їз; Іл шитх лени в . в.
Я Я Я вок; в
КВ ее Що кни ШЕ Й зар ши На о нене о саму ШЕ ДЯ МИ Я ЩО его ЩЕ кави ЩЕ Ба и М ВОДУ. ПИ м м о и и Ви М Ре ШИ ее о Дн М БЕН Е повних ШЕ я ЩЕ Ме ЩО ор В мання ЩО БЕ ЩО : п ря | ер р Я ри ние и Кс НИ ВО М Б ак М я ШИ НО «я я пз м нки с М А ШЕ АЕН о ше ще оди: М М ех ШО я вон Ши В ня р «ТЯ ит -Г| ГИ Еш ен МІ СИНИ М ее Га пк Мк - Е ват ще й Ге 4 І, х х п т Тед й ща т.
А Я Я с Я з ша м сша я М ан ни Дн В ЧЕ М пече НЕ ЗБАНН КВ
Вера Я ЩО рану ЩО НЯ ЩА Мох ШИ МЕНЯ М ААУ М за ЩЕ МОН
У ї Я КО М Бад вон Шо ис я і-й ги Ша «джу . ! т пит С. т І сті
Ре т: т ех Р ь 2 15 М шо. . - . чн -е асо т вт а т ж Ф в :бУдуУ Зх ВЕ: ж 5 я, 259 х "жив Ше в 5
Фо шое ш це ч-ео о за зви 58 588 В в 8 о. пет с
ОВО. а. ва. в. т ше в ше | г. в
Claims (46)
1. Композиція, яка містить білок, здатний до переходу у розплавлену сферичну структуру, змішану з інтактним фосфоліпідним ліпосомним пухирцем, яка відрізняється тим, що зазначений ліпосомний пухирець складається з негативно заряджених фосфоліпідів для утворення комплексу ліпосома-білок, де тільки частина білка введена до ліпідної частини ліпосомного пухирця.
2. Композиція згідно з п. 1, яка відрізняється тим, що зазначена композиція має рн, який дорівнює 3,0-7,5 і має співвідношення ліпід:білок, що дорівнює принаймні 10:1.
3. Композиція згідно з п. 1, яка відрізняється тим, що зазначений ліпосомний пухирець вибирають із групи, що містить: діолеоїлфосфатидилгліцерин (ДОФГ), диміристоїлфосфатидилгліцерин (ДМФГ), дипальмітоїлфосфатидилгліцерин (ДПФГ), монтежюфосфатидилгліцерин, діолеїлфосфатидилетаноламін (ДОФЕ), монтежюфосфатидилетаноламін, діолеїлфосфатидилова кислота (ДОФК), диміристоїлфосфатидилова кислота (ДМФК), дипальмітоїлфосфатидилова кислота (ДПФК), діолеїглфосфатидилсерин (ДОФС), диміристоїлфосфатидилсерин (ДМФОС), дипальмітоїлфосфатидилсерин (ДПФОС), монтежюфосфатидилсерин, лізофосфатидилгліцерин, лізофосфатидилетаноламін, лізофосфатидилсерин.
4. Композиція згідно з п. 1, яка відрізняється тим, що зазначений білок є цитокіном.
5. Композиція згідно з п. 4, яка відрізняється тим, що зазначений цитокін є кровотворним фактором.
6. Композиція згідно з п. 5, яка відрізняється тим, що зазначений кровотворний фактор вибирають із групи, що містить фактор, стимулюючий колонію гранулоцитів (Ф-СКЛ), гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор (ГМ-КСФ) і фактор росту і розвитку мегакаріоциту (ФРРМ).
7. Композиція згідно з п. 6, яка відрізняється тим, що зазначений кровотворний фактор є Ф-СКЛ.
8. Композиція згідно з п. 7, яка відрізняється тим, що зазначений Ф-СКЛ являє собою природний людський Ф- СКЛ або одержаний як продукт експресії прокаріотної або еукаріотної клітини-хазяїна.
9. Композиція згідно з п. 7, яка відрізняється тим, що зазначений Ф-СКЛ є хімічно модифікованим Ф-СКЛ.
10. Композиція згідно з п. 9, яка відрізняється тим, що хімічно модифікований Ф-СКЛ є пегілованим Ф-СКЛ.
11. Композиція згідно з п. 6, яка відрізняється тим, що зазначений кровотворний фактор є ФРРМ.
12. Композиція згідно з п. 11, яка відрізняється тим, що ФРРМ є природним людським ФРРМ або одержаний як продукт експресії прокаріотної або еукаріотної клітини-хазяїна.
13. Композиція згідно з п. 12, яка відрізняється тим, що зазначений ФРРМ має амінокислотну послідовність: ФРРМ 1-163 амінокислоти 1-163 на фіг.29.
14. Композиція згідно з п. 12, яка відрізняється тим, що зазначений ФРРМ має амінокислотну послідовність: ФРРМ 1-332 амінокислоти 1-332 на фіг. 29.
15. Композиція згідно з п. 11, яка відрізняється тим, що ФРРМ є хімічно модифікований ФРРМ.
16. Композиція згідно з п. 15, яка відрізняється тим, що зазначений хімічно модифікований ФРРМ є пегілованим ФРРМ (ПЕГ-ФРРМ).
17. Композиція згідно з п. 16, яка відрізняється тим, що зазначений ПЕГ-ФРРМ пегілований поліетиленгліколем.
18. Композиція згідно з п. 17, яка відрізняється тим, що зазначений ПЕГ-ФРРМ є монопегілованим ФРРМ (мПЕГ- ФРРМ).
19. Композиція згідно з п. 18, яка відрізняється тим, що ПЕГ-групу прикріпляють на її М-кінці.
20. Композиція згідно з п. 1, яка відрізняється тим, що зазначена композиція містить фармацевтично придатний носій.
21. Композиція згідно з п. 1, яка відрізняється тим, що зазначений білок являє собою людський рекомбінантний Ф-СКЛ (рлФ-СКЛ), виділений із Е. соїї, зазначений ліпосомний пухирець є ДОФГ, і зазначена композиція має співвідношення ДОФГ:рлФ-СКЛ, що дорівнює 501, має рН, що дорівнює 4,5 і містить 10мММ ацетату натрію.
22. Композиція згідно з п. 1, яка відрізняється тим, що зазначений білок є ФРРМ 1-163, виділений із Е. сої, зазначений ліпосомний пухирець є ДОФГ, і зазначена композиція має співвідношення ДОФГ-ФРРМ, що дорівнює 10021, рН, що дорівнює 5,0 і містить 10мМ ацетату натрію, 595 сорбітолу.
23. Композиція згідно з п. 1, яка відрізняється тим, що зазначений білок є монопегілованим ФРРМ, виділеним із
Е. соїї (мПЕГ-ФРРМ), зазначений ліпосомний пухирець являє собою ДМФГ, і зазначена композиція має співвідношення ДМФГ:"МПЕГ-ФРРМ, що дорівнює 100:1, має рН, що дорівнює 5,0 і містить 10мММ ацетату натрію, 595 сорбітолу.
24. Композиція згідно з п. 1, яка відрізняється тим, що зазначений білок є ФРРМ 1-332, виділеним із яєчника китайського хом'яка, зазначений ліпосомний пухирець є ДМФГ, і зазначена композиція має співвідношення ДМФГ:ФРРМ, що дорівнює 100:1, має рнН, що дорівнює 5,0, і містить 10мМ ацетату натрію, 595 сорбітолу.
25. Спосіб одержання композиції ліпосома:білок, який включає змішування білка, що є здатним до переходу у розплавлену сферичну структуру, з інтактним фосфоліпідним ліпосомним пухирцем, який відрізняється тим, що зазначений ліпосомний пухирець є негативно зарядженим таким чином, що тільки частина зазначеного білка введена у ліпідну частину зазначеного ліпосомного пухирця, і одержання зазначеної композиції ліпосома:білок.
26. Спосіб згідно з п. 25, яка відрізняється тим, що зазначена композиція має рН, що дорівнює 3,0-7,5 і має принаймні співвідношення ліпід:білок, що дорівнює 10:1.
27. Спосіб згідно з п. 25, який відрізняється тим, що зазначений ліпосомний пухирець одержують з ліпіду, що вибирають з групи, яка містить: діолеоїлфосфатидилгліцерин (ДОФГ), диміристоїлфосфатидилгліцерин (ДМФГ), дипальмітоїлфосфатидилгліцерин (ДПФГ), монтежюфосфатидилгліцерин, діолеїлфосфатидилетаноламін (ДОФЕ),
монтежюфосфатидилетаноламін, діолеїлфосфатидилова кислота (ДОФК), диміристоїлфосфатидилова кислота (ДМФК), дипальмітоїлфосфатидилова кислота (ДПФК), діолеїглфосфатидилсерин (ДОФС), диміристоїлфосфатидилсерин (ДМФОС), дипальмітоїлфосфатидилсерин (ДПФОС), монтежюфосфатидилсерин, лізофосфатидилгліцерин, лізофосфатидилетаноламін, лізофосфатидилсерин.
28. Спосіб згідно з п. 25, який відрізняється тим, що зазначений білок є цитокіном.
29. Спосіб згідно з п. 28, який відрізняється тим, що зазначений цитокін є кровотворним фактором.
30. Спосіб згідно з п. 29, який відрізняється тим, що зазначений кровотворний фактор вибирають із групи, що містить Ф-СКЛ, ГМ-КСФ і ФРРМ.
31. Спосіб згідно з п. 30, який відрізняється тим, що зазначений кровотворний фактор є Ф-СКЛ.
32. Спосіб згідно з п. 31, який відрізняється тим, що зазначений Ф-СКЛ є природним людським Ф-СКЛ або одержаний як продукт експресії прокаріотної або еукаріотної клітини-хазяїна.
33. Спосіб згідно з п. 31, який відрізняється тим, що зазначений Ф-СКЛ є хімічно модифікованим Ф-СКЛ.
34. Спосіб згідно з п. 33, який відрізняється тим, що хімічно модифікований Ф-СКЛ є пегілований Ф-СКЛ.
35. Спосіб згідно з п. 30, який відрізняється тим, що зазначений кровотворний фактор є ФРРМ.
36. Спосіб згідно з п. 35, який відрізняється тим, що ФРРМ є природним людським ФРРМ або одержаний як продукт експресії прокаріотної або еукаріотної клітини - хазяїна.
37. Спосіб згідно з п. 36, який відрізняється тим, що зазначений ФРРМ має амінокислотну послідовність: ФРРМ 1-163 амінокислоти 1-163 на фіг.29.
38. Спосіб згідно з п. 36, який відрізняється тим, що зазначений ФРРМ має амінокислотну послідовність: ФРРМ 1-332 амінокислоти 1-332 на фіг.29.
39. Спосіб згідно з п. 35, який відрізняється тим, що ФРРМ є хімічно модифікованим ФРРМ.
40. Спосіб згідно з п. 39, який відрізняється тим, що зазначений хімічно модифікований ФРРМ є пегілованим ФРРМ (ПЕГ-ФРРМ).
41. Спосіб згідно з п. 40, який відрізняється тим, що зазначений ПЕГ-ФРРМ пегілований поліетиленгліколем.
42. Спосіб згідно з п. 41, який відрізняється тим, що зазначений ПЕГ-ФРРМ є монопегілованим ФРРМ (мПЕГ- ФРРМ).
43. Спосіб згідно з п. 42, який відрізняється тим, що ПЕГ-групу прикріпляють на її М-кінці.
44. Спосіб згідно з п. 25, який відрізняється тим, що зазначена композиція містить фармацевтично придатний носій.
45. Спосіб згідно з п. 25, який відрізняється тим, що зазначене введення включає вставку частини зазначеного білка у ліпідний бішар зазначеного ліпідного пухирця.
46. Спосіб згідно з п. 25, який відрізняється тим, що зазначена композиція ліпосома:білок безпосередньо стабілізована проти розгортання вторинної структури зазначеного білка. А
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/414,161 US5874075A (en) | 1993-10-06 | 1995-03-31 | Stable protein: phospholipid compositions and methods |
| PCT/US1996/004261 WO1996029989A1 (en) | 1995-03-31 | 1996-03-28 | Stable protein:phospholipid compositions and methods____________ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA62911C2 true UA62911C2 (en) | 2004-01-15 |
Family
ID=23640216
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA97094746A UA62911C2 (en) | 1995-03-31 | 1996-03-28 | Protein-phospholipid composition and method for its manufacture |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5874075A (uk) |
| EP (1) | EP0817614B1 (uk) |
| JP (1) | JP3856471B2 (uk) |
| KR (1) | KR100228415B1 (uk) |
| CN (1) | CN1241548C (uk) |
| AT (1) | ATE222096T1 (uk) |
| BR (1) | BR9607999A (uk) |
| CA (1) | CA2215534C (uk) |
| CZ (1) | CZ292788B6 (uk) |
| DE (1) | DE69623003T2 (uk) |
| DK (1) | DK0817614T3 (uk) |
| EA (1) | EA000415B1 (uk) |
| ES (1) | ES2177781T3 (uk) |
| HK (1) | HK1006079A1 (uk) |
| HU (1) | HU224691B1 (uk) |
| IL (1) | IL117690A0 (uk) |
| NO (1) | NO318235B1 (uk) |
| NZ (1) | NZ306156A (uk) |
| PT (1) | PT817614E (uk) |
| SK (1) | SK283596B6 (uk) |
| TW (1) | TW400236B (uk) |
| UA (1) | UA62911C2 (uk) |
| WO (1) | WO1996029989A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA962483B (uk) |
Families Citing this family (52)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6429290B1 (en) | 1994-08-17 | 2002-08-06 | The Rockefeller University | OB polypeptides, modified forms and derivatives |
| US6001968A (en) | 1994-08-17 | 1999-12-14 | The Rockefeller University | OB polypeptides, modified forms and compositions |
| CN1142940C (zh) * | 1996-10-04 | 2004-03-24 | 安姆根有限公司 | 含有mpl配体的药物组合物 |
| DK0937456T3 (da) * | 1998-02-23 | 2004-11-08 | Cilag Ag Int | Liposomal dispersion af erytropoietin |
| PL206536B1 (pl) | 1998-10-16 | 2010-08-31 | Biogen Idec Inc | Kompozycja, kompozycja farmaceutyczna glikozylowanego interferonu-beta-1a, zastosowanie kompozycji glikozylowanego interferonu-beta-1a, sposób in vitro przedłużania aktywności glikozylowanego interferonu-beta-1a |
| CA2343094A1 (en) * | 1998-10-16 | 2000-04-27 | Biogen, Inc. | Interferon-beta fusion proteins and uses |
| WO2001012141A1 (fr) | 1999-08-18 | 2001-02-22 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Stimulants pour la pousse de cheveux |
| PT1129720E (pt) | 2000-02-29 | 2004-08-31 | Pfizer Prod Inc | Factor estimulador de colonias de granulocitos estabilizado |
| US6416745B1 (en) * | 2001-05-03 | 2002-07-09 | Block Drug Company, Inc. | Dental composition for treating hypersensitive teeth |
| US7173003B2 (en) * | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
| US7157277B2 (en) | 2001-11-28 | 2007-01-02 | Neose Technologies, Inc. | Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII |
| WO2004099231A2 (en) | 2003-04-09 | 2004-11-18 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
| US7214660B2 (en) * | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
| CA2952488C (en) * | 2002-01-18 | 2019-05-07 | Biogen Ma Inc. | Polyalkylene glycol with moiety for conjugating biologically active compounds |
| US20060193905A1 (en) * | 2002-05-14 | 2006-08-31 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Direct cellular energy delivery system |
| US7803777B2 (en) * | 2003-03-14 | 2010-09-28 | Biogenerix Ag | Branched water-soluble polymers and their conjugates |
| US8791070B2 (en) | 2003-04-09 | 2014-07-29 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor IX |
| WO2006127896A2 (en) * | 2005-05-25 | 2006-11-30 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor ix |
| AU2004229253B2 (en) * | 2003-04-15 | 2009-11-05 | Cantab Biopharmaceuticals Patents Limited | Pharmaceutical composition comprising proteins and/or polypeptides and colloidal particles |
| WO2005012484A2 (en) * | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Neose Technologies, Inc. | Antibody-toxin conjugates |
| US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
| US8633157B2 (en) * | 2003-11-24 | 2014-01-21 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin |
| US20060040856A1 (en) * | 2003-12-03 | 2006-02-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor IX |
| CN101072789B (zh) * | 2004-01-08 | 2013-05-15 | 生物种属学股份公司 | 肽的o-连接的糖基化 |
| US20070081986A1 (en) * | 2005-10-07 | 2007-04-12 | Shunji Tomatsu | Beta-glucuronidase with an attached short peptide of acidic amino acids |
| WO2006010143A2 (en) | 2004-07-13 | 2006-01-26 | Neose Technologies, Inc. | Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1] |
| EP1799249A2 (en) * | 2004-09-10 | 2007-06-27 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated interferon alpha |
| US20080176790A1 (en) * | 2004-10-29 | 2008-07-24 | Defrees Shawn | Remodeling and Glycopegylation of Fibroblast Growth Factor (Fgf) |
| MX2007008229A (es) * | 2005-01-10 | 2007-09-11 | Neose Technologies Inc | Factor estimulador de colonias de granulocitos glicopegilado. |
| DE102005012457B3 (de) | 2005-03-18 | 2006-08-31 | Basf Coatings Ag | Epoxid- und Silangruppen enthaltende Oligomere und Polymere, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
| US9187546B2 (en) * | 2005-04-08 | 2015-11-17 | Novo Nordisk A/S | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
| KR100770704B1 (ko) | 2005-08-04 | 2007-10-29 | 삼성전자주식회사 | 픽쳐 스킵 방법 및 장치 |
| US20070105755A1 (en) * | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
| WO2007056191A2 (en) | 2005-11-03 | 2007-05-18 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide sugar purification using membranes |
| EP2049144B8 (en) * | 2006-07-21 | 2015-02-18 | ratiopharm GmbH | Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences |
| EP2054521A4 (en) * | 2006-10-03 | 2012-12-19 | Novo Nordisk As | METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES |
| SI2068907T1 (en) * | 2006-10-04 | 2018-01-31 | Novo Nordisk A/S | Pegylated sugars and glycopeptides are associated with glycerol |
| JP2010523582A (ja) * | 2007-04-03 | 2010-07-15 | バイオジェネリクス アクチェンゲゼルシャフト | グリコｐｅｇ化ｇ−ｃｓｆを用いた治療方法 |
| EP2162535A4 (en) * | 2007-06-04 | 2011-02-23 | Novo Nordisk As | O-linked glycosylation using N-acetylglucosamine transferases |
| MX2009013259A (es) * | 2007-06-12 | 2010-01-25 | Novo Nordisk As | Proceso mejorado para la produccion de azucares de nucleotidos. |
| RS53404B (en) | 2007-08-27 | 2014-10-31 | Ratiopharm Gmbh | LIQUID FORMULATION OF G-CSF CONJUGATES |
| US8207112B2 (en) * | 2007-08-29 | 2012-06-26 | Biogenerix Ag | Liquid formulation of G-CSF conjugate |
| US8101565B2 (en) | 2007-09-20 | 2012-01-24 | Abbott Cardiovascular Systems Inc. | Sustained release of Apo A-I mimetic peptides and methods of treatment |
| US7985727B1 (en) | 2007-09-20 | 2011-07-26 | Abbott Cardiovascular Systems Inc. | Apo A-I mimetic peptides and methods of treatment |
| US9173890B2 (en) * | 2007-09-20 | 2015-11-03 | Abbott Cardiovascular Systems Inc. | Sustained release of Apo A-I mimetic peptides and methods of treatment |
| US7985728B1 (en) | 2007-09-20 | 2011-07-26 | Abbott Cardiovascular Systems Inc. | Sustained release of Apo A-I mimetic peptides and methods of treatment |
| US8044021B2 (en) * | 2007-09-20 | 2011-10-25 | Abbott Cardiovascular Systems Inc. | Sustained release of apo A-I mimetic peptides and methods of treatment |
| JP5647899B2 (ja) * | 2008-01-08 | 2015-01-07 | ラツィオファルム ゲーエムベーハーｒａｔｉｏｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ | オリゴサッカリルトランスフェラーゼを使用するポリペプチドの複合糖質化 |
| CN103497247A (zh) | 2008-02-27 | 2014-01-08 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 缀合的因子viii分子 |
| DK2767546T3 (en) | 2011-02-07 | 2019-02-04 | Cerenis Therapeutics Holding Sa | Lipoprotein complexes and their preparation and uses |
| EP3578203A1 (en) | 2011-10-28 | 2019-12-11 | Integritybio Inc. | Protein formulations containing amino acids |
| WO2013129935A1 (en) | 2012-02-27 | 2013-09-06 | Epitarget As | Use of a particulate immunomodulator in cancer therapy |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4515736A (en) * | 1983-05-12 | 1985-05-07 | The Regents Of The University Of California | Method for encapsulating materials into liposomes |
| US4744989A (en) * | 1984-02-08 | 1988-05-17 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Method of preparing liposomes and products produced thereby |
| US4766106A (en) * | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US4810643A (en) * | 1985-08-23 | 1989-03-07 | Kirin- Amgen Inc. | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
| DE68913003T2 (de) * | 1988-05-16 | 1994-06-09 | Vestar Inc | An hormone gekoppelte liposome. |
| JPH0334920A (ja) * | 1989-04-21 | 1991-02-14 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | リポソームに結合及至組合わされた生物活性化合物及びそれを含有する医薬 |
| AU6428890A (en) * | 1989-09-12 | 1991-04-18 | Regents Of The University Of California, The | Therapeutic peptides and proteins |
| JPH03127622A (ja) * | 1989-10-09 | 1991-05-30 | Green Cross Corp:The | ｐＨ感受性リポソーム |
| US5225212A (en) * | 1989-10-20 | 1993-07-06 | Liposome Technology, Inc. | Microreservoir liposome composition and method |
| JPH0482839A (ja) * | 1990-07-20 | 1992-03-16 | Green Cross Corp:The | 蛋白質類・脂質小体複合体 |
| JPH06247842A (ja) * | 1993-02-23 | 1994-09-06 | Green Cross Corp:The | リポソーム組成物の製造方法 |
| HUT72326A (en) * | 1993-10-06 | 1996-04-29 | Amgen Inc | Stable protein phospholipid compositions and methods |
-
1995
- 1995-03-31 US US08/414,161 patent/US5874075A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-03-27 IL IL11769096A patent/IL117690A0/xx unknown
- 1996-03-28 WO PCT/US1996/004261 patent/WO1996029989A1/en active IP Right Grant
- 1996-03-28 CA CA002215534A patent/CA2215534C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-03-28 BR BR9607999A patent/BR9607999A/pt active Search and Examination
- 1996-03-28 HU HU9801370A patent/HU224691B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-03-28 DE DE69623003T patent/DE69623003T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-03-28 JP JP52964596A patent/JP3856471B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-03-28 AT AT96911458T patent/ATE222096T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-03-28 SK SK1260-97A patent/SK283596B6/sk unknown
- 1996-03-28 DK DK96911458T patent/DK0817614T3/da active
- 1996-03-28 ZA ZA962483A patent/ZA962483B/xx unknown
- 1996-03-28 KR KR1019960705819A patent/KR100228415B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-03-28 PT PT96911458T patent/PT817614E/pt unknown
- 1996-03-28 CZ CZ19972912A patent/CZ292788B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-03-28 EP EP96911458A patent/EP0817614B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-28 UA UA97094746A patent/UA62911C2/uk unknown
- 1996-03-28 ES ES96911458T patent/ES2177781T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-28 NZ NZ306156A patent/NZ306156A/xx unknown
- 1996-03-28 EA EA199700197A patent/EA000415B1/ru unknown
- 1996-03-28 CN CNB961903325A patent/CN1241548C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-08 TW TW085112169A patent/TW400236B/zh not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-09-19 NO NO19974323A patent/NO318235B1/no unknown
-
1998
- 1998-06-15 HK HK98105290A patent/HK1006079A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA62911C2 (en) | Protein-phospholipid composition and method for its manufacture | |
| US7176278B2 (en) | Modified transferrin fusion proteins | |
| ES2299686T3 (es) | Procedimientos y composiciones para el transporte de oxigeno con alta afinidad por el oxigeno. | |
| US7906628B2 (en) | Targeting proteins to deliver therapeutic or diagnostic reagents | |
| EA004789B1 (ru) | Полимерные конъюгаты бета-1а-интерферона и их использование | |
| KR20090120453A (ko) | 산화질소-차단된 가교 사량체 헤모글로빈 | |
| Nho et al. | Peg-Bovine Hemoglobin: Safety en a Canine Dehydrated Hypovolemic-Hemorrhagic Shock Model | |
| JP5563475B2 (ja) | Ｐｅｇインターフェロン−ベータ製剤 | |
| EP2478914B1 (en) | Modified erythropoietin to which water-soluble long-chain molecule is added | |
| ES2395894T3 (es) | Hemoglobinas de mamífero compatibles con plasma sanguíneo, reticuladas y conjugadas con poli(óxidos de alquileno) como portadores de oxígeno médicos artificiales, su preparación y su uso | |
| TW201138831A (en) | Modified granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) | |
| CA2150939C (en) | Stable protein: phospholipid compositions and methods | |
| JP5798628B2 (ja) | ウシ顆粒球コロニー刺激因子のための製剤およびその変異体 | |
| US20040101964A1 (en) | Method of preparing virus vector | |
| Mishra et al. | Reverse biomembrane vesicles for effective controlled delivery of doxorubicin HCl | |
| Ji et al. | Intravenous Single and Two Week Repeated Dose Toxicity Studies of Rice Cells-derived Recombinant Human Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor on Rats | |
| WO2005046715A1 (ja) | 生理活性複合体 |